CN105188734A

CN105188734A - 含有式x1-gqretpegaeakpwy-x2的环肽的冻干物

Info

Publication number: CN105188734A
Application number: CN201480023380.9A
Authority: CN
Inventors: B·费希尔; R·鲁卡斯
Original assignee: Apeptico Forschung und Entwicklung GmbH
Current assignee: Apeptico Forschung und Entwicklung GmbH
Priority date: 2013-04-23
Filing date: 2014-04-18
Publication date: 2015-12-23
Anticipated expiration: 2034-04-18
Also published as: DK2988768T3; JP2016518376A; JP6567502B2; IL242075B; EP2988768A1; ES2876404T3; CA2907693A1; CN105188734B; EP2988768B1; KR20160002813A; US20160083431A1; EA038363B1; CA2907693C; WO2014173842A1; US10711041B2; AU2014257678A1; KR102217476B1; EA201592019A1

Abstract

不含添加剂和/或稳定剂的冻干物形式的式(I)X₁-GQRETPEGAEAKPWY-X₂的环肽及其应用。其中X₁包含具有1至4个残基的氨基酸(序列)，所述氨基酸包括天然氨基酸或非天然氨基酸，而X₂包含天然氨基酸，并且其中X₁含有在左侧位置1中的N-末端氨基酸，而X₂含有在右侧最终位置的C-末端氨基酸。

Description

含有式X1-GQRETPEGAEAKPWY-X2的环肽的冻干物

技术领域

本发明涉及一种药学适用的冻干物，其被指定用于向哺乳动物的肺(例如人)的肺给药。

背景技术

药学活性成分的活性本质上相当取决于这些活性成分如何分别进入机体或进入待治疗器官的方式。

给药药物最常见的方式是肠胃外给药。即，将药物通过皮肤注射(例如直接到血流)到肌肉内或直接到皮肤下。

另一种摄取药物的常见形式包括在口服给药到胃肠道中。在药物中所含的活性成分在胃肠道中释放出来，并经由再吸收至机体内而到达血液和器官。

药物还可以通过皮肤或粘膜给药。

作为注射供替代的选择，建议使用口服吸入的方法。由此，药物以粉末形式以及可能到达具有呼吸空气的肺室的液滴形式被递送至口腔和咽，。由此，这些药物经由肺组织被递送到血液中并因此被全身性供给到机体。

然而，现今药物的口服吸入仍然提出了大量的技术问题。特别的是，仅经由口服吸入而施用的具有高分子量的活性成分(例如蛋白质)非常有限。在雾化或喷雾过程中，作为活性成分的蛋白被热和压力物理性损坏或失活。在口服吸入前和口服吸入期间的储存期间，活性蛋白成分是相当不稳定的。此外，这种肽活性成分可能已在肺部气室(LuftraumderLunge)被降解。

为了解决在蛋白质吸入剂型中的这一问题，开发了高度多样化的药物制剂。因此，为实现所需的溶解特性，为保证稳定性，为保护蛋白质的活性，这种蛋白质吸入剂型可含有如钙盐或钠盐的盐、稳定剂和表面活性剂、特定的缓冲混合物、脂类外加剂和其他。制备蛋白质药物过程中的其他外加剂包含例如白蛋白、渗透剂、抗氧化剂、用于避免聚集和沉淀的化学物质、脂质体、明胶、藻酸盐、糖等。

因此，所生产的和药用加工用于吸入的肽和蛋白质剂继而有意或无意地经由肺组织达到血液中，并且可在血液中被检测到。

总之，目前国际上只有两种注册的吸入用蛋白质/肽基药物，即(脱氧核糖核酸酶)和(胰岛素)。为了保证活性和稳定性，这些制剂含有例如盐(分别地为氯化钠、氯化钙，或柠檬酸钠、甘露醇、甘油、氢氧化钠)。

用于生产人类医药用途用蛋白质/肽制剂的常规技术方式是用于除水的冷冻干燥(例如JPharmSci.2009年9月；98(9):2886-908)。然而，在这些现有技术的方法中，为了确保肽的稳定性和活性而加入了如例如二糖的助剂(AllisonSD等人,ArchBiochemBiophys.1999年5月15日；365(2):289-98)。除此之外，经证明将聚乙二醇(PEG)结合到肽和蛋白质上以分别在除水后冷冻干燥期间保证活性和稳定性(Roberts等人,AdvDrugDelivRev.2002年6月17日；54(4):459-76,2002年，Morris等人,AntimicrobAgentsChemother.2012年6月；56(6):3298-308.doi:10.1128/AAC.06335-11)以及避免被蛋白水解过程降解(Lee等人,RegulPept.2009年1月8日；152(1-3):101-7；Baginski等人,PharmRes.2012年6月；29(6):1425-34)或有利地影响分子质量(Veronese和Pasut,DrugDiscovToday.2005年11月1日；10(21):1451-8；Patton和Byron,NatRevDrugDiscov.2007年1月；6(1):67-74)是成功的。

现今，令人惊讶地发现了不含添加剂的对肺功能具有积极影响的特定肽的应用形式，该应用形式变得明显及其合适。

发明内容

一方面，本发明提供了式X₁-GQRETPEGAEAKPWY-X₂(I)的环肽，其为不含添加剂和/或稳定剂的冻干物的形式，其中

X₁包含具有1至4个、特别是1至3个残基的氨基酸(序列)，所述氨基酸包含天然或非天然氨基酸，特别是选自氨基酸(序列)C(Cys)、KSP(Lys-Ser-Pro)、K(Lys)、鸟氨酸、4-氨基丁酸、β-丙氨酸，和

X₂包含天然氨基酸，特别是选自C(Cys)、D(Asp)、G(Gly)和E(Glu)的组，并且其中

X₁包含在左侧位置1的N-末端氨基酸和X₂包含在末端右侧位置的C-末端氨基酸。

本发明提供的冻干物在本文中也指，，本发明(在本发明内、根据本发明)的冻干物“。根据本发明的冻干物中的肽在本文中也指，，本发明(在本发明内、根据本发明)的肽“。

本发明的冻干物中可存在一种或几种式I的环肽，因此优选地为仅存在一种式I的肽。

式I的环状化合物是具有下列氨基酸序列的环化化合物

X₁-Gly-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr-X₂I,

其中X₁和X₂如上定义。

式I的新型化合物也是本发明的目的。

式I化合物中的环可由键合两种式I化合物的氨基酸残基中的适当取代基而形成，例如由酰胺键或二硫键，因此所述环优选地包含至少15个、更优选地为至少17个、高达19或20个，例如17至19个氨基酸残基，其以环元件存在于式I的化合物中。

优选地，环的形成通过X₁内氨基酸中(优选地在X₁的位置1的氨基酸中)适当取代基和X₂内适当取代基之间的键而形成。

在本发明式I的氨基酸序列中可使用的天然氨基酸是已知的，并且包含例如G(Gly)、A(Ala)、V(Val)、L(Leu)、I(Ile)、M(Met)、P(Pro)、F(Phe)、W(Trp)、S(Ser)、T(Thr)、N(Asn)、Q(Gln)、C(Cys)、U(Sec)、Y(Tyr)、D(Asp)、E(Glu)、H(His)、K(Lys)、R(Arg)。

在本发明式I的氨基酸序列中可使用的非天然氨基酸包括

(i)具有天然氨基酸原则上的化学结构，但不同于α-氨基酸的氨基酸，

(ii)D构型(即不同于天然L-构型)的天然氨基酸，即存在于D-构型中而不存在于L-构型中位于位置2碳原子上的烷基基团的天然氨基酸，，

(iii)非天然氨基酸，例如不同于上面(i)和(ii)所定义的，包含2至12个(例如2至6个)碳原子，至少一个氨基基团(例如一个或两个)，和至少一个羧基基团(例如一个或两个)，任选地除了在天然氨基酸中存在的取代基，例如OH、-CONH₂、-NH-C(＝NH₂)NH₂、SH、(C_1-4)烷基-S-、苯基、杂环基(例如包含5或6环元件并包含至少一个选自N、O、S(优选地为N)的杂原子(例如一个或两个))之外、任选地与另一个如苯基(例如包括脯氨酰、吲哚基、咪唑基)的环稠合。

本发明式I的非天然氨基酸包括鸟氨酸、4-氨基丁酸、β-丙氨酸。

另一方面，本发明式I的环状化合物包含

-具有氨基酸序列SEQIDNO:1的化合物

环(CGQRETPEGAEAKPWYC)

其中二硫键形成于两个末端半胱氨酸残基之间；

-具有氨基酸序列SEQIDNO:2的化合物

环(KSPGQRETPEGAEAKPWYE)

其中酰胺键形成于连接到N末端赖氨酸残基的ε-碳原子的氨基基团和连接到C末端谷氨酸残基的γ-碳原子的侧链羧基基团之间；

-具有氨基酸序列SEQIDNO:3的化合物

环(KGQRETPEGAEAKPWYG)

其中酰胺键形成于连接到N末端赖氨酸残基侧链的ε-碳原子的氨基基团和C末端甘氨酸残基的羧基基团之间；

-具有氨基酸序列SEQIDNO:4的化合物

环(鸟氨酸-GQRETPEGAEAKPWYG)

其中酰胺键形成于连接到N末端鸟氨酸残基侧链的δ-碳原子的氨基基团和C末端甘氨酸残基的羧基基团之间；

-具有氨基酸序列SEQIDNO:5的化合物

环(4-氨基丁酸-GQRETPEGAEAKPWYD)

其中酰胺键形成于N-末端4-氨基丁酸残基的氨基基团和连接到C-末端天冬氨酸残基的β-碳原子的侧链羧基基团之间；

和

-具有氨基酸序列SEQIDNO:6的化合物

环(β-丙氨酸-GQRETPEGAEAKPWYE)

其中酰胺键形成于N-末端β-丙氨酸(3-氨基丙酸残基)残基的氨基基团和连接到C-末端谷氨酸残基的γ-碳原子的侧链羧基基团之间。

式I的化合物以及氨基酸序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6的化合物中，除了导致环形成的键，氨基酸通常如肽般连接。

本文中式I的环状化合物也指“本发明(在本发明内、根据本发明)的环状化合物”，并且包括任何形式的式I的化合物，例如，游离形式和盐的形式，在生物环境中式I的化合物通常以盐的形式存在。

在另一个方面，在本发明的冻干物中的式I化合物为盐的形式。

这样的盐优选地包括药学上可接受的盐，尽管包括药学上不可用的盐，例如为制备/分离/纯化目的。

在生物环境中的式I的化合物的盐通常是盐酸盐。

游离形式的本发明式I的环状化合物可被转化成盐形式的式I的环状化合物且反之亦然。

本发明式I的环状化合物可以为异构体和异构体混合物的形式；例如光学异构体。式I的环状化合物可包含，例如不对称碳原子并由此可以为对映体、非对映体及其混合物的形式，例如外消旋体。式I的环状化合物可存在于(R)-、(S)-或(R,S)-构型中，优选地在不对称碳原子上各个有关取代基的(R)-或(S)-构型中。可对异构体混合物进行适当分离，如根据例如类似于常规方法以得到纯的异构体。本发明包含任何异构体形式和任何异构体混合物形式的式I的环状化合物。在天然氨基酸的情况下，取代基的构型通常和天然氨基酸中一样。

例如可以根据例如类似于常规方法，或如本文所规定的(例如通过固相肽合成)，任选地根据采用适当的偶合剂(诸如二异丙基碳二亚胺和/或N-羟基苯并三唑和适当溶剂(如N,N-二甲基甲酰胺))对2-氯三苯甲基氯树脂的芴甲氧羰基/叔丁基保护策略来适当制备本发明的环状化合物。可将受保护的氨基酸从C末端的氨基酸开始相继偶合在肽链上。可以用碱(如哌啶(诸如适当溶剂中20％哌啶，如N,N-二甲基甲酰胺))对芴甲氧羰基保护基团进行脱保护。可以在酸的辅助下(诸如适当溶剂中的乙酸，如卤代烃(例如CH₂Cl₂)，例如乙酸和CH₂Cl₂的1:1混合物)将完全、任选地(部分)受保护的肽从树脂上裂解适当地下来。

在含有半胱氨酸的肽的情况下，从树脂裂解后，如果需要的话，可以进行侧链的脱保护，例如用强酸，如三氟乙酸(TFA)，例如95％TFA/5％H₂O。可以通过氧化末端半胱氨酸残基来进行环化以获得二硫键的环化，例如通过在pH为8.5对天然线性肽进行90小时充气而得到。可以对所得的天然肽产物进行纯化，例如通过色谱法，例如通过在诸如RP-C18硅胶柱的适当柱上的反相介质压力液相色谱法(RP-MPLC)，方便地采用诸如5％至40％梯度的乙腈水溶液的梯度洗脱液。可以用醋酸置换三氟乙酸反离子，例如在诸如LewatitMP64柱(乙酸盐形式)的柱上。随着在水中的最终洗涤，可以对如乙酸盐的经过纯化的肽进行冻干，并且可以获得浅色的形式，例如白色粉末。

在无半胱氨酸的肽的情况下，从树脂的裂解之后，例如仍对部分被保护的线性肽酌情进行环化步骤。在对无半胱氨酸的肽进行选择性环化后，如果需要可以在TFA中进行侧链脱保护。例如，可以通过如利用制备性RP-MPLC的色谱法进行纯化步骤。例如，如上所述，可以用乙酸盐从由此获得的肽中置换三氟乙酸根离子。例如，对于含有半胱氨酸的肽，可以对肽的乙酸盐形式进行冷冻干燥。

所得的肽的分子量可以通过电喷雾离子化质谱法或MALDI-TOF-MS进行证实。例如可以通过分析型高效液相色谱法来确定纯度。

式I的环状化合物包含具有氨基酸序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6的化合物。例如从HazemiP.,TzotzosS.,FischerB.,AndavanG.S.B.,FischerH.,PietschmannH,LucasR.和Lemmens-GruberR.在2010年11月25日发表于JMedChem.中第53卷22期的第8021至8029页的“EssentialstructuralfeaturesofTNF-αlectin-likedomainderivedpeptidesforactivationofamiloride-sensitivesodiumcurrentinA549cells”可以认为这些化合物活化“阿米洛利敏感上皮钠通道(ENaC)”并且因此对肺部的疾病治疗是有用的。阿米洛利敏感钠离子通道(ENaC)的活化涉及经由肺组织转运钠离子。形成了导致被动被动式液体转运的渗透梯度。如果该方式转移到肺部，阿米洛利敏感钠离子通道的活化例如可用于减缓肺部积水，例如在肺水肿的情况下。

在开发本发明的过程中，经发现，经由肺组织主动或被动转运本发明式I的环肽(其中X₁和X₂如上所述，例如具有氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6)而进入血液是不被期望的并且不应发生的，因为其实质上有助于具有氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的环肽的生理活性，如果这些环状化合物经由口服吸入到达肺部气室以致沉积到肺组织的表面并由此激活定向尖端的阿米洛利敏感钠离子通道。

令人惊奇的显示出(实施例10)，在吸入通过加入水从根据本发明的冻干物制备的气雾剂之后，本发明的肽无法在血液中检测到。

通常而言，吸入剂型是为了经由肺组织吸入肺后的逾越(übertreten)而开发或已经被开发，从而可避免肠胃外注射。以往的吸入药物的靶标即为全身性活性。通过将试剂分布于血液中，分子进入各组织和器官。但是，全身性应用的实质性缺点是机体中对器官和组织的广谱毒性和副作用，这与待治疗的疾病是不相关的。

当给药水性气雾剂时，与根据本发明制备的冻干物相比，所述肽进入激活钠通道的空气和肺部上皮之间的屏障。由此，在本发明的肽在肺部的上皮组织，，局部“发挥作用，而不是全身发挥作用。肽经由肺组织的步骤是不被期望的且也不会发生。

与从文献中已知的肽制剂相比，通过由本发明的冻干物制备的不含有添加剂的水性气雾剂来避免所吸入的肽经由肺部扩散至血液中是可以成功的。由此，获得了可以避免可能的全身性毒性的特征的肽的极其积极的效果--同时在肺以外的其他器官。

否则，提供了很大药用益处的官场非作用个可由此被排除出去。通过在肺部内表面局部给药而不向血液中扩散，相比于全身性施用，显著降低活性的试剂是必要的。

此外，令人惊讶地，在根据本发明的包含式I的环肽、特别是没有添加剂的氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的环肽的冻干物中，在超过数月甚至数年几乎可以排除其化学和生物不稳定性是明显的。即明显的是，本发明的式I的环肽(如氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的那些)的化学结构和生物活性没有被损坏，令人惊奇地其还不含有通常使用的添加剂和/或稳定剂。

给药本发明式I的环肽(特别是吸入用氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6)后明显的是环肽被构成为以溶解的形式(即在水溶液中)可长时间稳定而仍然无需添加剂，例如在用于喷雾的装置(喷雾器)的储存容器中。此外已经证明，可以以SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的环肽在转变为吸入形式后不会被破坏并由此保持全部活性的方式制备本发明式I的(特别是本发明氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的)环肽，而令人惊讶地是仍然无需加入通常使用的添加剂和/或稳定剂。

为了制备本发明式I的(例如至少一种)肽(特别是适于喷雾形式的SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的肽)的溶液，可以将这些肽溶解在水中，并将所获得的溶液进行冻干，例如无需其他添加剂，如例如通常使用的添加剂和/或稳定剂，由此获得粉末。在冷冻干燥之前，任选地将溶液进行过滤以便去除浑浊物。

另一方面，本发明提供了据本发明的冻干物在制备适于喷雾的气雾剂中的应用，特别地所述气雾剂无需添加剂和/或稳定剂的气雾剂。

根据本发明的冻干物的应用在本文中也指，，根据本发明的应用“。

现已发现，式I的肽，特别是冻干形式的SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的那些肽，在冷却环境稳定至少24个月，并在室温下稳定至少6个月，所述气雾剂甚至无需加入其他通常的添加剂和/或稳定剂。

可以将根据本发明的冻干物溶解在水中以用于给药，从而获得气雾剂，例如含有或不含有添加剂，例如不含添加剂，例如用于直接制备气雾剂，或用于作为溶液储存，例如在储存容器中。

另一方面，本发明提供了冻干物的应用，其中式I的肽(其中X₁和X₂如上所述)存在于水溶液中，特别地无需添加剂和/或稳定剂。

明显惊奇和有利的是，由此溶解的式I的环肽(其中X₁和X₂如上所述)，特别是氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的环肽，至少7天内在溶液中是稳定，这说明当环肽转变为可吸入形态时，其生物活性甚至在没有加入其他通常的添加剂和/或稳定剂的情况下没有减弱。

应用根据本发明的环肽(特别是氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6)后，结果是肽溶液被构成为可被转变为(例如以可将环肽喷雾的喷雾器的方式)气雾剂的方式。由此，结果是获得了直径小于或等于5μm的气雾剂粒子。

此外，变得明显的是，主要包含直径≤5μm的液滴的气雾剂特别适于给药，因为其结果是气雾剂进入肺部的气室。液滴尺寸的下限仅仅受液滴尺寸的可行性影响。

另一方面，本发明提供了冻干物用于制备气雾剂的应用，其中粒子尺寸为直径≤5μm。

另一方面，本发明提供了根据本发明的冻干物的应用，其以将由冻干物所制备的吸入形式的气雾剂用于改善/调节肺功能为特点。

另一方面，本发明提供了由根据本发明的冻干物所制备的气雾剂的应用，特别是将没有添加剂的气雾剂用于改善肺功能，例如用于治疗肺水肿。

以及另一方面，

用于改善肺功能的方法，例如用于治疗肺水肿，以将根据本发明的没有添加剂的气雾剂以吸入形式给药至患者为特点；

以及另一方面，

根据本发明的冻干物在改善/调节肺功能的应用，或用与改善/调节肺功能的吸入剂。

适当剂量取决于各种因素，例如，从式I的环状化合物的化学性质和药物动力学性质中，个别宿主(例如其体重)，患者的年龄和个体病情以及疾病的性质和严重程度。然而，一般而言，为了在大多数哺乳动物(例如人类)中获得令人满意的结果，一个人(每日)可以服用(ausgehen)的剂量为(约)0.1mg/kg体重到大概(约)200mg/kg，例如1mg/kg体重至100mg/kg体重，例如多次(例如多达4次(部分)剂量)给药会带来成功的结果。儿童通常获得成人剂量的一半。

进一步的研究表明，通过离体处理供体肺，即移植到患者体内之前，以式I的环肽(其中X₁和X₂定义如上，特别是具有SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的氨基酸序列的)令人惊讶地改善/调节肺功能。从而显示出，如果在移植前以本发明的冻干物的气雾剂(特别是无添加剂的气雾剂)来处理待移植的肺，可实现显著的改善。

另一方面，本发明提供了调节/改善肺功能的体外方法，其以用水溶性气雾剂对供体肺进行离体进行喷雾为特征，特别地水溶性气雾剂是由根据本发明的冻干剂无需添加剂和/或稳定剂的条件而制成。

在随后将肺移植到接受者之后，还(仍然)可对其进行处理。

由此得到如图1中所示的结果。气雾剂中的根据本发明式I的环肽浓度由此为从5nM至约150nM。

附图说明

图1显示了依赖浓度的具有氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的环肽的活性。x轴上以nM(对数标度)表明SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的环蛋白的浓度，y轴以％表明钠离子电流。

图2显示了模拟肺移植在体外的肺灌注(体外、离体)期间吸入式应用SEQIDNO:1的环肽的结果。在图2A中，x轴上的时间点T1到T4表示吸入式应用SEQIDNO:1的肽后(每次1小时)进行的测量。y轴表示顺从性；而在图2B中，x轴还表示时间点T1到T4，而y轴是动静脉氧分压差ΔpO₂。以注射用水(WFI)作为对照。显示了每组8个实验的平均值。

图3显示了具有氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:7的肽的冷冻干燥周期，以℃计(y轴)的固定样本温度(Fachtemperatur)(实线)和产物温度(Produkttemperatur)(虚线)和以分钟计(x轴)的时间来绘制。

图4示意性显示了按照图式的用于在冷阱中压缩气雾剂的实验组件，其中

1表示装有冰和盐的聚苯乙烯容器

2表示具有溶解肽(对照物质)的小试管

3表示喷雾器

4表示储存室，和

5控制模块。

图5显示了具有氨基酸序列SEQIDNO:1的环肽的气雾剂的平均粒子尺寸分布，以2个不同的喷雾器(类型(TYP)A和类型(TYP)B)生产。以激光衍射的方式进行测定(流速：15L/min)。误差指示＝SD。线条显示了在气雾剂中直径≤5μm的粒子的各自部分。绘制以μm计的液滴的尺寸的x周，和以％计的累积量y轴。

图6显示了具有氨基酸序列SEQIDNO:1的环肽的气雾剂在各自位置的呼吸模拟器中的分布：

1＝吸入过滤器

2＝呼气过滤器

3＝过滤器连接件

4＝喷雾器Y件(包括单向阀的)

5＝喷雾器中的残余物

由此使用两个喷雾器，类型(TYP)A和类型(TYP)B。

具体实施方式

实施例1

肽合成

根据以下步骤制备肽：

将氨基酸按顺序进行偶合；从固相上选择性裂解；纯化、冻干和选择性环化；保护基团的裂解；纯化和冷冻干燥；分析研究。

根据芴甲氧羰基/叔丁基保护策略以载体(2-氯三苯甲基氯树脂)上固相肽合成的形式完全自动化制备本发明的所有环肽、氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的肽以及具有氨基酸序列SEQIDNO:7的肽。二异丙基碳二亚胺和N-羟基苯并三唑被作为偶联剂。所有偶合步骤在作为溶剂的N,N-二甲基甲酰胺中进行。由此将被保护的氨基酸相继偶合到作为原始材料的各自的C末端的氨基酸上。在N,N-二甲基甲酰胺中的20％哌啶中对芴甲氧羰基进行脱保护。在乙酸和二氯甲烷的1:1混合物中将完全、部分被保护的肽从树脂上裂解下来。

在含有半胱氨酸的肽的情况下，从树脂裂解后，在95％三氟乙酸、5％H₂O中进行侧链脱保护，然后通过氧化末端半胱氨酸残基进行环化，对末端半胱氨酸残基的氧化是通过在pH8.5下对天然线性肽进行90小时的透气而实现的。可以利用反相介质压力液相色谱法(RP-MPLC)在RP-C18硅胶柱上以5％至40％梯度的乙腈对天然肽产物进行纯化。最后，在LewatitMP64柱(乙酸形式)上以醋酸置换三氟乙反离子。在水中进行最后洗涤后，对如乙酸盐的纯化的肽进行冻干，并且获得白色至灰白色的粉末。

在无半胱氨酸的肽的情况下，从载体(树脂)的裂解之后对被部分保护的线性肽进行环化步骤。在对无半胱氨酸的肽进行选择性环化后，在三氟乙酸中进行侧链脱保护，然后进行制备性RP-MPLC，对于含半胱氨酸的肽类，以醋酸盐置换三氟乙酸根离子并对醋酸盐形式的肽进行冻干。

随后，对SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的环状蛋白质利用反相HPLC进行关于纯度和质量的分析。

SEQID1的环状蛋白质的纯度是96.3％.m/z(ESI)1924.2(M++1)。

SEQID2的环状蛋白质的纯度是96.3％.m/z(ESI)1924.2(M++1)。

SEQID3的环状蛋白质的纯度是98.8％.m/z(ESI)1888.2(M++1)。

SEQID4的环状蛋白质的纯度是97.4％.m/z(ESI)1873.4(M++1)。

SEQID5的环状蛋白质的纯度是99％.m/z(MALDI-TOF)1901.6(M++1)。

SEQID6的环状蛋白质的纯度是99％.m/z(MALDI-TOF)1902.7(M++1)。

SEQID7的环状蛋白质的纯度是95％.m/z(MALDI-TOF)1778.02(M++1)。

具有氨基酸序列SEQIDNO:7序列的化合物

环(CGQREAPAGAAAKPWYC)

其中二硫键形成于两个末端半胱氨酸残基之间，明显不具有生物活性且用于对比目的。

实施例2

阿米洛利敏感钠离子通道的电生理研究(EnaC)

宏观钠离子电流来自利用“膜片钳”技术以全细胞模式(Konfiguration)的人体上皮细胞A549(Hamill等人,PflugersArch.1981,391(2):85-100.,1981)。对于“全细胞”模式中的电流，采用以下电解液和电极溶液：

电解液：135mM甲磺酸钠、10mMNaCl、2.7mMKCl、1.8mMCaCl₂、2mMMgCl₂、5.5mM葡萄糖和10mMHEPES,pH为7.4。

电极溶液：120mM甲磺酸钾、15mMKCl、6mMNaCl、1mMMg₂ATP、2mMNa₃ATP、10mMHEPES和0.5mMEGTA(pH为7.2)。

将其上具有培养细胞的盖玻片转移到固定在显微镜平台上1ml1ml容量的腔室中(Axiovert100，400倍放大)，并且将细胞与上述电解液混合(superfundiert)。继而以适当细胞(贴附在盖玻片上)对电流进行推导。对此，对填充有电解质溶液的微电极(具有约1-3μm的所定义的热抛光的顶部开口的玻璃毛细管-对应于3-5MΩ的电极顶部电阻)进行连接，且将膜吸入以在膜和电极间形成，，千兆欧姆密封“从而使漏电流减少到最小。在“全细胞”模式中，在电极顶部下的膜破裂，以便能够对流经细胞所述离子通道的电流进行测量。接收到，，千兆欧姆密封“后，经由前置放大器(CV-4探头，AxonInstruments)和放大器(Axopatch1D，AxonInstr.)产生所定义的膜控制电位，并对由此流经离子通道的电流进行测量。

脉冲程序为至-100mV下对细胞膜进行5秒的超极化，然后从20mV到+100mV进行逐步去极化。

在加入环状蛋白前(对照)和加入环状蛋白后进行步骤。利用PCLAMP6.0程序对由此获得的电流进行记录和分析。由此，从之前记录的电流中减去在阿米洛利的存在下得到的电流，可以确定经由上皮细胞钠通道的阿米洛利敏感钠电流的结果。

表1中列出了测定的结果，其中显示了SEQID1至SEQID7的环状蛋白对细胞阿米洛利敏感型钠离子电流的活性。各个肽的活性表示为EC₅₀(以nM计)。EC₅₀为测量到50％的最大活性时的(即在电流强度I的平均最大增加)时，有效浓度。

表1

环状蛋白	EC₅₀(nM)
		SEQ ID NO:1	54
SEQ ID NO:2	56
		SEQ ID NO:3	38
SEQ ID NO:4	45
		SEQ ID NO:5	24
SEQ ID NO:6	19
		SEQ ID NO:7	无活性

在图1中，绘制了依赖于浓度的环状蛋白SEQID1至SEQID7的活性。最大活性以100％表示。

显示于表1和图1中的研究表明具有氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的环肽在生物学上是有活性的，然而结构上显示出一定相似性的具有氨基酸序列SEQIDNO:7的环肽是没有活性的。

实施例3

冻干物的制备

对式I的环肽的稳定存储形式进行工业范围的开发。由此，将SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的环肽，以及如SEQIDNO:7的环肽以0.1mg/ml至100mg/ml的量溶解于纯水中，并经由具有0.2μm的孔尺寸的过滤器过滤除去浊度、污染物和可能菌性

过滤后，将溶于纯水的环肽分装到玻璃或塑料的安瓿中，并且以冷冻干燥(冻干)的方式将其转变成稳定的粉末。

因此获得了表2中所描述的冻干参数和图3中所描述的冻干周期。

表2

作为冷冻干燥的结果，得到具有氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的环肽的各个白色粉末。

实施例4

在室温和冰箱中储存后对实施例2的冻干物的稳定性研究

在工业规模上对氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的环肽的冻干物的稳定性进行研究。由此，将冻干物在2至8℃下储存长达24个月并且在25℃以及60％相对湿度下储存长达6个月。稳定性在次期间的不同时间点被调查。特别地，对环肽的外观、含量以及纯度进行了研究。对此采用了验室常用的分析程序，例如目测检查和反相HPLC。

此外，在2至8℃储存24个月后，利用通过膜片钳实验对生物活性进行测定。由此，在“膜片钳”技术的“全细胞”模式中对A549细胞的宏观电流进行推导，如在，，阿米洛利敏感的钠离子通道(ENaC)的电生理研究“中所描述的。

表3中列出了分别在时间点T＝0和6个月之后(T＝6M)或24个月之后(T＝24M)，具有氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的环肽的各个冻干物的稳定性研究结果。在此期间，外观没有改变。环肽含量以及纯度仅有小幅波动。

表3

具有氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的环肽的各个冻干物由此在2至8℃稳定长达24个月，在25℃/60％相对湿度稳定长达6个月。

利用膜片钳实验测量的生物活性显示，氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的环肽之一的各个冻干物，在2至8℃储存24个月后仍是完全有活性的。

实施例5

制备氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的环肽的吸入前水溶液

为预先制备氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的环状蛋白的给药，将根据实施例2在冷冻干燥期间得到的各个稳定白色粉末溶解到所定义体积的纯水中，以得到在0.1mg/ml至100mg/ml范围的浓度。然后将SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的环状蛋白的所得溶液转移至喷雾器的储存容器中。由此获得溶解于澄清溶液中的SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的环肽。

实施例6

吸入前氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的环肽在溶解后制剂中有关稳定性的研究

由于实践原因，氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的环肽的水溶液往往不是在其制备为吸入剂型后直接使用。出于这个原因，示范性地研究了水溶液的稳定性。因此，将即用溶液在2至8℃下存储于实验室常用的注射器中7天，，或将即用溶液在25℃下存储于在喷雾器的容器中24小时。特别地，对SEQIDNO:1的环状蛋白的外观、含量及其纯度进行了研究。因此所使用的方法是实验室常用的分析方法，例如目测检查，以及利用反相HPLC的分析。

表4中列出了具有氨基酸序列SEQIDNO:1的环肽的水溶液稳定性的研究结果。外观在所有期间内有没改变。环肽含量以及纯度仅有小幅波动。

表4

因此，吸入用氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的环肽的水溶液在2至8℃下实验室常用注射器中可稳定7天，或在25℃下喷雾器的容器中可稳定至少24小时。

实施例7

在转变成气雾剂过程中氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的环肽在溶解后制剂中有关稳定性的研究

由于蛋白质和肽在一些情况下相当不稳定，对转变为气雾剂过程中氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的环肽在溶解后的制剂中是否保持稳定进行了研究。对此，将环肽如实施例4中所描述溶解于水中。将环肽的水溶液填充到喷雾器的储存容器后，将其转化成气雾剂。为此使用了，，网式“喷雾器。将从喷雾器传递出的气雾剂收集在如图4所示的冷阱中。利用膜片钳方法确定所收集的气雾剂的生物活性。由此，在“膜片钳”技术的“全细胞”模式中对A549细胞的宏观电流进行推导，如在，，阿米洛利敏感的钠离子通道(ENaC)的电生理研究“中所描述的。

利用反相HPLC/MS来确定压缩气雾剂的化学稳定性。

示例性地显示了在转变成气雾剂的过程中氨基酸序列SEQIDNO:1的环肽在溶解后的制剂中保持了其生物稳定性以及化学稳定性。

实施例8

氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的环肽的气雾剂的理化性质

利用将水溶液转变为气雾剂的喷雾器，还可将氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的环肽的水溶液转变为气雾剂。该气雾剂可以以有关平均液滴尺寸和气雾剂液滴的尺寸分布为特征。对此，采用了药典中所描述的传统的方法。该分析方法，在具体构成中使用多级冲击器、，，下一代冲击器“。由此，经由一系列筛板输送气雾剂，其中随着各个板的层次，孔的直径逐渐减少且孔的数量逐渐增加。在另一个分析方法(激光衍射测试)中，利用激光来确定液滴尺寸。在这些测试过程中确定了2个重要参数，一方面是所有液滴的平均直径，另一方面是直径≤5μm的液滴量。在文献中直径被描述为一种限制，据此吸入的气雾剂粒子实际上到达肺中。

已经广泛知晓的是实践中只有一部分所生成的气雾剂对患者具有生物利用度。因此，为确定对患者具有生物利用度的气雾剂的量，利用呼吸模拟器进行了试验。为研究粒子尺寸并实施呼吸呼吸模拟器，采用了来自氨基酸序列SEQIDNO:1的环肽的水溶液的气雾剂。利用不同喷雾器类型以产生气雾剂。喷雾器A和B被称为，，网式喷雾器“。

气雾剂中直径≤5μm的液滴的量在所有喷雾器中为至少50％，见表5和图5，其中表示并显示了生成于3个不同的喷雾器的氨基酸序列SEQIDNO:1的环肽的气雾剂的特征。

表5

此外，可证明由喷雾器产生的氨基酸序列SEQIDNO:1的环肽的水溶液的气雾剂的主要部分对于吸入具有生物有效性，如以，，吸入过滤器“处的环状蛋白的定量验证所绘制的图6所示。无生物利用度的气雾剂部分明显较少(图6)。

实施例9

肠胃外给药后血液中的氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的环肽的证明

在狗和大鼠中对肠胃外给药后血液中的氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的环肽进行示例性证明。对此示范性地，将氨基酸序列SEQIDNO:1的环肽的水溶液以推注的方式静脉给药至实验动物(25mg/kg体重)。在施用到静脉终止后立刻收集血液，并利用常规实验室反相HPLC/MS来测定氨基酸序列SEQIDNO:1的环状蛋白的浓度。结果列在表6中，其中表示了施用于静脉后氨基酸序列SEQIDNO:1的环肽的血浆浓度。

表6

实施例10

作为气雾剂吸入后在肺组织中的氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的环肽的证明

在大鼠的肺组织中对氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的环肽进行示例性证明。对此，示范性地，以喷雾器从氨基酸序列SEQIDNO:1的环肽的水溶液制备气雾剂。气雾剂被实验动物吸入(72mg/kg体重)。在气雾剂吸入终止之后，对实验动物的肺组织以及血液进行检验。利用反相HPLC/MS对氨基酸序列SEQIDNO:1的环肽的浓度进行测定。示范性地，总共吸入72mg/kg体重后，可在肺组织中检测到1.2μg/g浓度的氨基酸序列SEQIDNO:1的环肽。相比之下，在血液中检测不到氨基酸序列SEQIDNO:1的环肽可以达到0.1μg/ml的检测限。

实施例11

氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:7的肽对去糖基化细胞表面的作用

全细胞实验中，将A549细胞与100个单位的酶“PNGaseF”(肽-N⁴-(N-乙酰基-β-D-葡糖)天冬酰胺酰胺酶F)培养1-5分钟后立即进行膜片钳测量，并且在将具有培养细胞的盖玻片在转移到1ml容积的腔室之前以外部溶液对其进行漂洗。在对照记录之后，将240nM的氨基酸序列SEQIDNO:1的肽加入到电解液中。在Eh＝-100mV记录下对照条件下未进行任何预处理的细胞的总细胞电流、加入肽SEQIDNO:1至SEQIDNO:7的肽的细胞的总细胞电流以及以PNGaseF进行预处理的细胞的总细胞电流进行记录。表7中示出了全细胞模式中利用片钳试验的去糖基化实验结果，其中表明了去糖基化A549细胞利用SEQIDNO:1至SEQIDNO:7的肽对激活钠离子电流活化的作用。在Eh＝-100mV记录全细胞电流。电解液中SEQIDNO:1至SEQIDNO:7的肽的浓度为240nM。

表7

膜片钳试验前以PNGaseF(处理)对细胞进行预处理减小氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的肽的能力从而增强了钠电流。在-100mV控制电位并且无需向电解液加入肽的对照条件下，未经处理的细胞和没有以PNGaseF进行预处理的细胞中的钠电流均为25.4pA。未经处理的细胞中，在-100mV的控制电位下，向电解液加入氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的肽(终浓度240nM)形成超过1000pA的显著钠离子电流。相比之下，氨基酸序列SEQIDNO:7的肽显示无活性。

实施例12

使用猪的肺移植实验

将脑死亡猪成成背卧位，并进行纵向胸骨切开术。将心包和两个胸膜腔都打开。结扎上、下腔静脉。将内流导管通过右心室排出段上的荷包缝合的方式插入肺动脉。通过结扎使上、下腔静脉中向内的血流得到闭合，将动脉夹紧来闭合向外的血流。然后通过内流导管用顺行冲洗的冷等渗保存溶液(每公斤猪体重50ml，含有钾离子、钠离子、镁离子、钙离子、氯离子、葡聚糖、葡萄糖、缓冲剂离子)保存肺。左心耳的切口导致血液外流。在此期间，用50％的氧气进行肺换气，并且将碎冰放置在两个胸膜腔和纵隔膜中。

移出技术是根据以下步骤整块切取心脏和食管：

a)清除气管两侧桥接至胸腔的软组织。

b)横切两个经肺韧带(非常深，难以暴露)，然后分别横切VCI、下部胸降主动脉或食管。

c)钝性分离剩余纵膈粘连。

d)在使用吻合器关闭气管前完成对供体肺的充气。

移出后，将肺包裹在纱布中放置于填充有低钾葡聚糖细胞外溶液的隔热冰袋中，并在4℃下储存18至24小时。温度探针浸没在放置在冰箱中的容器中。

对于离体肺调节，采用了EVLP技术(血管外肺灌注)。EVLP技术中，将供体肺放置在泵、通气机和过滤器构成的回路。EVLP技术，温度可升高到37℃。在EVLP技术中，通气机用于向肺部传递氧气。泵用于对肺灌注含有人体白蛋白和营养的细胞外溶液。在EVLP期间，可以定期对肺功能的关键指标进行评估。

对于实验性猪肺移植实验，以2.0升人体白蛋白溶液填装EVLP回路。这种细胞外溶液具有最佳胶体渗透压。对回路进行脱气后，将其连接到肺部前在20℃下使填装物循环。将肝素、头孢呋辛、甲泼尼龙添加到灌注液中。

猪供体肺的处理以缝合漏斗形硅橡胶管与内置于左心房(LA)套囊缝合在一起开始，以便用夹板将LA固定为开放状态并保持灌注回路封闭。

利用连续5-0单纤丝线缝合将该管牢固地接合于LA套囊以提供可靠和有效的外流途径。将相同类型的插管用于肺动脉(PA)的插管，根据需求修整至匹配PA尺寸。用500ml的缓冲细胞外液进行表背逆行冲洗。将供体肺安装至EVLP回路中前，将气管打开并进行直接支气管抽吸来清理呼吸道。将内切气管导管(尺寸8mmI.D.)插入气管并用脐带胶带固定牢固。此后，将肺转移到EVLP回路单元。首先，将LA插管连接至回路并启动缓慢逆流以对PA插管进行脱气。一旦脱气完成后，将PA插管连接到回路并在室温下以启动150ml/min的灌注液启动顺行流动。在接下来的30分钟内将灌注液的温度逐渐升高至37℃。当达到32-34℃的温度时，通气机开始对供体猪肺进行机械通气并且逐渐增加灌注流速。

启动EVLP气流向肺供应氧气并经由气体交换膜向流入灌流液(86％N2、6％O2、8％CO2)提供二氧化碳(以0.5L/min的气体流开始并基于流入灌流液的pCO2进行滴定)以保持35至45毫米汞柱范围的流入灌流液pCO2。在肺被完全扩展后，将采用标准的单液体雾化系统的单剂量AP301的(1mg/kg在5ml的Aqua中)应用于由EVLP回路系统通气和灌注的供体猪肺。

EVLP实验过程中，不对灌注进行评估。每小时测量并记录以下功能参数：

·肺动脉流(PAF)：L/min

·(平均值)肺动脉压(PAP)：毫米汞柱

·左心房压(LAP)：毫米汞柱

·肺血管阻力(PVR＝[PAP-LAP]×80/PAF)：dynes/sec/cm-5

·平均值，峰值和平衡气道压(mAwP、peakAwP、platAwP)：cmH2O

·动态顺应性(mL/cmH2O)

·灌流液气体分析-流入(PA)和流出(PV)PO2，PCO2和pH值。

结果

这项研究在模拟肺移植的体外系统中评估了具有氨基酸序列SEQIDNO:1的肽对肺功能的作用。如图2A和图2B所示，研究结果表明在吸入应用后动态肺顺应性和动静脉氧分压差ΔpO2均在使用具有氨基酸序列SEQIDNO:1的肽治疗的肺部中得到改善。

SEQIDNO:7的肽的肺部应用对肺功能没有提供改善作用。

Claims

1.一种式X₁-GQRETPEGAEAKPWY-X₂(I)的环肽，其为不含添加剂和/或稳定剂的冻干物的形式，其中

X₁包含具有1至4个残基的氨基酸(序列)，所述氨基酸包括天然氨基酸或非天然氨基酸，和

X₂包含天然氨基酸，并且其中

X₁包含在左侧位置1的N-末端氨基酸，而X₂包含在最终右侧位置的C-末端氨基酸。

2.根据权利要求1所述的冻干物，其中在式I中的X₁选自氨基酸(序列)C(Cys)、KSP(Lys-Ser-Pro)、K(Lys)、鸟氨酸、4-氨基丁酸、β-丙氨酸。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的冻干物，其中在式I中的X₂选自C(Cys)、D(Asp)、G(Gly)和E(Glu)的组。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的冻干物，其中式I的环状化合物选自以下氨基酸序列的肽：

-SEQIDNO:1

环(CGQRETPEGAEAKPWYC)

其中二硫键形成于两个末端半胱氨酸残基之间；

-SEQIDNO:2

环(KSPGQRETPEGAEAKPWYE)

-SEQIDNO:3

环(KGQRETPEGAEAKPWYG)

-SEQIDNO:4

环(鸟氨酸-GQRETPEGAEAKPWYG)

-SEQIDNO:5

环(4-氨基丁酸-GQRETPEGAEAKPWYD)

其中酰胺键形成于N-末端4-氨基丁酸残基的氨基基团和连接到C-末端天冬氨酸残基的β-碳原子的侧链羧基基团之间；和

-SEQIDNO:6

环(β-丙氨酸-GQRETPEGAEAKPWYE)

其中酰胺键形成于N-末端β-丙氨酸(3-氨基丙酸)残基的氨基基团和连接到C-末端谷氨酸残基的γ-碳原子的侧链羧基基团之间。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的冻干物，其中式I的环状化合物是盐的形式。

6.根据权利要求1至5任一项所述冻干物在制备适用于喷涂的气雾剂中的应用，所述气雾剂特别是没有添加剂和/或稳定剂的气雾剂。

7.根据权利要求6所述的应用，其中式I的肽存在于水溶液，特别是没有添加剂和/或稳定剂的水溶液中，其中X₁和X₂如权利要求1至5中任一项所定义。

8.根据权利要求6或7任一项所述的应用，其中气雾剂中待喷雾的粒子尺寸为直径≤5μm。

9.根据权利要求8所述的应用，其中所述粒子尺寸为直径≤5μm。

10.根据权利要求6至9任一项所述的应用，其特征在于由冻干物所制备的所述气雾剂以吸入的形式用于改善/调节肺功能。

11.一种调节/改善肺功能的体外方法，其特征在于以水溶性气雾剂对供体肺进行离体喷涂，特别地所述水溶性气雾剂由根据权利要求1至5的冻干物在无需添加剂和/或稳定剂的条件下而制成。