JP6567502B2 - 式ｘ１−ｇｑｒｅｔｐｅｇａｅａｋｐｗｙ−ｘ２の環状ペプチドを含有する凍結乾燥物 - Google Patents

Description

本発明は、哺乳動物、例えば、ヒト、の肺への投与に向けられた薬学的に許容可能な凍結乾燥物に関する。

薬学的な有効成分の活性は、これらの有効成分が体内または処置される器官にそれぞれ到達する方法にむしろ本質的に依存する。

最も一般的な医薬の投与方法は非経口投与である。医薬は皮膚を通して、例えば、血流や筋肉に直接または皮膚下に直接注入される。

医薬摂取の他の一般的な形態は胃や腸管への経口投与からなる。医薬に含まれる有効成分は胃や腸管において遊離され、吸収を介して体内、血中および器官に達する。

医薬はまた皮膚または粘膜を通して投与され得る。

注入に代わるものとして、経口吸入の方法が提案された。それによれば、医薬は粉末の形態や呼吸空気とともに肺空間に到達可能な液滴の形態で口や咽頭に送達される。そこからこれらの医薬は肺組織を通して血液に送達され、ひいては全身的に体内に供給される。

しかしながら、医薬の経口吸入は、今日でもなお実質的な技術的問題をもたらす。特に、例えばタンパク質等の高分子量を有する有効成分は経口吸入による適用が非常に限られている。噴霧化またはスプレーするプロセスの間の加熱および加圧により、有効成分としてのタンパク質は損傷を受けるか、あるいは物理的に不活性化される。有効なタンパク質成分は経口吸入前の保管および経口吸入中の保管の双方でむしろ不安定である。加えて、このようなペプチド有効成分は肺気腔ですでに分解されることがある。

このようなタンパク質の吸入用製剤においてこれを解消するために、多種多様な医薬処方物が開発された。従って、このようなタンパク質の吸入用製剤は、所望の溶解特性を実現するため、安定性を保証するため、タンパク質の活性を保護するために、カルシウムまたはナトリウム塩のような塩、安定化剤および界面活性剤、特定の緩衝液混合物、脂質混合物およびその他を含み得る。タンパク質医薬の生産における他の混合物としては、例えば、アルブミン、浸透物質、抗酸化剤、凝集および沈殿を妨げるための化学物質、リポソーム、ゼラチン、アルギン酸塩、糖類等を含む。

このように製造され、薬学的に処理された吸入用ペプチドおよびタンパク質製剤はその後肺組織を通して意図的にまたは偶然に血液に到達し、そこで検出され得る。

要約すると、国際的に登録されたタンパク質／ペプチドに基づく吸入用医薬は現時点で２つ、すなわち、プルモザイム（商標）（デオキシリボヌクレア−ゼ）およびエクスベラ（商標）（インスリン）のみである。活性や安定性を保証するために、これらの製剤は、例えば塩（それぞれ、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、またはクエン酸ナトリウム、マンニトール、グリセロール、水酸化ナトリウム）を含有する。

ヒト医薬用のタンパク質／ペプチド処方物の製造のため通常の技術的手段としては水分除去のための凍結乾燥がある（例えば、J Pharm Sci. 2009 Sep;98(9):2886-908）。しかしながら、これらの最新式の処理の間には、ペプチドの安定性や活性を確保するために例えば、二糖のような補助剤が添加される。(Allison SD et al, Arch Biochem Biophys. 1999 May 15;365(2):289-98)。さらに、凍結乾燥中の水分除去後の活性や安定性を確保するため（Roberts et al, Adv Drug Deliv Rev. 2002 Jun, 17;54(4):459-76 2002, Morris et al, Antimicrob Agents Chemother. 2012 Jun;56(6):3298-308. doi: 10.1128/AAC.06335-11）やタンパク質分解プロセスによる分解を妨げるため（Lee et al, Regul Pept. 2009 Jan 8;152(1-3):101-7; Baginski et al, Pharm Res. 2012 Jun;29(6):1425-34)または分子量に好ましい影響を与えるため（Veronese & Pasut, Drug Discov Today. 2005 Nov 1;10(21):1451-8; Patton & Byron, Nat Rev Drug Discov. 2007 Jan;6(1):67-74）には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をペプチドおよびタンパク質に結合させることにより成功することがそれぞれ証明されている。

今般、驚くべきことに、肺の機能に好ましい影響を与えるいくつかのペプチドについて添加剤を伴わない適用形態が見出され、この適用形態が非常に適切であることが明らかとなった。

１つの面において、本発明によれば、下記式の環状ペプチド：
Ｘ₁−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹ−Ｘ₂ Ｉ
［式中、
Ｘ₁は、特にはＣ（Ｃｙｓ）、ＫＳＰ（Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）、Ｋ（Ｌｙｓ）、オルニチン、４−アミノ酪酸、β−アラニンのアミノ酸（配列）から選択される天然および非天然アミノ酸を含んでなる、１〜４、特には１〜３個のアミノ酸（配列）を含んでなり、かつ、
Ｘ₂は、特にはＣ（Ｃｙｓ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ｇ（Ｇｌｙ）およびＥ（Ｇｌｕ）の群から選択される天然アミノ酸を含んでなり、かつ、
Ｘ₁は、左側の１位にＮ末端アミノ酸を含んでなり、かつ、Ｘ₂は、右側の位置の最後にＣ末端アミノ酸を含んでなる。］
であって、添加剤および／または安定化剤を伴わない凍結乾燥物の形態である環状ペプチドが提供される。

本発明により提供される凍結乾燥物は、本明細書において「本発明の（本発明の下での、本発明による）凍結乾燥物」とも表される。本発明による凍結乾燥物におけるペプチドは、本明細書において「本発明の（本発明の下での、本発明による）ペプチド」とも表される。

本発明の凍結乾燥物において、１またはいくつかの式Ｉの環状ペプチドが存在してもよく、好ましくは、式Ｉのペプチドが１つのみ存在する。

式Ｉの環状化合物は、下記のアミノ酸配列を有する化合物が環状化されたものである：
Ｘ₁−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−
Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｘ₂ Ｉ
［式中、Ｘ₁およびＸ₂は上記で定義された通りである。］

式Ｉの新規化合物も本発明の対象である。

式Ｉの化合物における環は、式Ｉの化合物の２つのアミノ酸残基における２つの適当な置換基の間の結合、例えば、アミド結合またはジスルフィド架橋により形成され得、その際、環は、好ましくは、少なくとも１５、より好ましくは少なくとも１７、最大１９または２０、例えば、１７〜１９の、環員として式Ｉの化合物に存在するアミノ酸残基を含んでなる。

好ましくは、環の形成は、Ｘ₁におけるアミノ酸、好ましくは、Ｘ₁における１位のアミノ酸における適当な置換基と、Ｘ₂における適当な置換基との間の結合により形成される。

本発明の式Ｉのアミノ酸配列に用いられ得る天然アミノ酸は知られており、例えば、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ａ（Ａｌａ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｍ（Ｍｅｔ）、Ｐ（Ｐｒｏ）、Ｆ（Ｐｈｅ）、Ｗ（Ｔｒｐ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｎ（Ａｓｎ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ｕ（Ｓｅｃ）、Ｙ（Ｔｙｒ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｈ（Ｈｉｓ）、Ｋ（Ｌｙｓ）、Ｒ（Ａｒｇ）を含んでなる。

本発明の式Ｉのアミノ酸配列に用いられ得る非天然アミノ酸は、下記を含んでなる：
（ｉ）原則として天然アミノ酸の化学構造を有するが、αアミノ酸とは異なるアミノ酸、
（ｉｉ）Ｄ型の天然アミノ酸、すなわち天然Ｌ型以外のものであり、つまり、２位のＣ原子にあるアルキル基がＬ配置ではなくＤ配置で存在する天然アミノ酸、
（ｉｉｉ）例えば、上記の（ｉ）および（ｉｉ）で定義されたもの以外の非天然アミノ酸であって、２〜１２、例えば２〜６の炭素原子、少なくとも１つのアミノ基（例えば、１つまたは２つ）および少なくとも１つのカルボキシ基（例えば、１つまたは２つ）、加えて所望により天然アミノ酸にも存在する置換基、例えば、ＯＨ、−ＣＯＮＨ₂、−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ₂）ＮＨ₂、ＳＨ、（Ｃ_1-4）アルキル−Ｓ−、フェニル、ヘテロシクリル（例えば、５または６員環を含んでなり、Ｎ、Ｏ、Ｓから選択され、好ましくはＮである少なくとも１つの異種原子（例えば、１つまたは２つ）を含んでなり、これらはフェニル等のさらなる環とアニールされていてもよく、例えば、プロリル、インドリル、イミダゾリルを含んでなる）を含んでなるもの。

本発明の式Ｉの非天然アミノ酸は、オルニチン、４−アミノ酪酸、β−アラニンを含んでなる。

さらなる面において、本発明の式Ｉの環状化合物は、
−配列番号１：
シクロ（ＣＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＣ）
［式中、両末端のシステイン残基の間でジスルフィド架橋が形成される。］のアミノ酸配列を有する化合物；
−配列番号２：
シクロ（ＫＳＰＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＥ）
［式中、Ｎ末端のリジン残基のε−炭素原子に結合しているアミノ基とＣ末端のグルタミン酸残基のγ−炭素原子に結合している側鎖カルボキシ基との間でアミド結合が形成される。］のアミノ酸配列を有する化合物；
−配列番号３：
シクロ（ＫＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＧ）
［式中、Ｎ末端のリジン残基の側鎖のε−炭素原子に結合しているアミノ基とＣ末端のグリシン残基のカルボキシ基との間でアミド結合が形成される。］のアミノ酸配列を有する化合物；
−配列番号４：
シクロ（オルニチン−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＧ）
［式中、Ｎ末端のオルニチン残基の側鎖のδ−炭素原子に結合しているアミノ基とＣ末端のグリシン残基のカルボキシ基との間でアミド結合が形成される。］のアミノ酸配列を有する化合物；
−配列番号５：
シクロ（４−アミノ酪酸−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＤ）
［式中、Ｎ末端の４−アミノ酪酸残基のアミノ基とＣ末端のアスパラギン酸残基のβ−炭素原子に結合している側鎖カルボキシ基との間でアミド結合が形成される。］のアミノ酸配列を有する化合物；および
−配列番号６：
シクロ（β−アラニン−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＥ）
［式中、Ｎ末端のβ−アラニン残基（３−アミノプロパン酸残基）のアミノ基とＣ末端のグルタミン酸残基のγ−炭素原子に結合している側鎖カルボキシ基との間でアミド結合が形成される。］のアミノ酸配列を有する化合物
を含んでなる。

式Ｉの化合物および配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列の化合物において、アミノ酸は、環形成に導く結合を除いて、通常のペプチドのように連結される。

式Ｉの環状化合物は、本明細書において「本発明の（本発明の下での、本発明による）環状化合物」とも表され、いずれの形態（例えば、遊離形態および塩形態）の式Ｉの環状化合物を含んでなる。生物学的環境においては、通常、式Ｉの化合物は塩の形態で存在する。

さらなる面において、本発明の凍結乾燥物における式Ｉの化合物は、塩の形態である。

このような塩としては、好ましくは、薬学的に許容可能な塩を含んでなるが、例えば、製造／単離／精製を目的とする、薬学的に許容されない塩も含まれる。

生物学的環境において、式Ｉの化合物の塩は、通常、塩酸塩である。

遊離形態の本発明の式Ｉの環状化合物は、塩形態の本発明の式Ｉの環状化合物に変換してもよく、逆の場合も同様である。

本発明の式Ｉの環状化合物は、異性体および異性体混合物、例えば、光学異性体の形態であってよい。式Ｉの環状化合物は、例えば不斉炭素原子を含んでいてもよく、それゆえ、エナンチオマー、ジアステレオ異性体およびこれらの混合物、例えばラセミ化合物の形態にすることができる。式Ｉの環状化合物は、不斉炭素原子の個々の置換基に関して、（Ｒ）−、（Ｓ）−または（Ｒ，Ｓ）−配置、好ましくは（Ｒ）−または（Ｓ）−配置で存在していてもよい。異性体混合物は、適切には、例えば、純粋な異性体を得るための従来法に従って、例えばこれに類似的に、分離されてもよい。本発明は、いずれの異性体形態およびいずれの異性体混合物の形態の式Ｉの環状化合物を含んでなる。天然アミノ酸の場合は、置換基の配置が、通常天然アミノ酸でみられるものである。

本発明の環状化合物は、適宜、例えば、従来法または本明細書に記載される方法、例えば固相ペプチド合成に従って、例えばこれに類似的に、そして場合により、ジイソプロピルカルボジイミドおよび／またはＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール等の適当なカップリング剤およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等の適当な溶媒を用いる、２−クロロトリチルクロリド樹脂についてのフルオレニルメトキシカルボニル／ｔ−ブチル保護方法に従って、製造してもよい。保護されたアミノ酸は、Ｃ末端アミノ酸から開始するペプチド鎖に続けて連結されてもよい。フルオレニルメトキシカルボニル保護基の脱保護は、塩基、例えばピペリジン（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等の適当な溶媒中の２０％ピペリジン等）を用いて行ってよい。（部分的に）保護されていてもよい完成したペプチドの樹脂からの切り出しは、適宜、例えば、適当な溶媒、例えば、ＣＨ₂Ｃｌ₂等のハロゲン化炭化水素中の酢酸等の酸（例えば、酢酸およびＣＨ₂Ｃｌ₂の１：１の混合物中）の補助により行ってよい。

システイン含有ペプチドの場合、樹脂からの切り出しの後、側鎖の脱保護は、必要に応じて、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）等の強酸、例えば、９５％ＴＦＡ／５％Ｈ₂Ｏを用いて行ってよい。ジスルフィド結合を得るための環化は、例えば、ｐＨ８．５にて９０時間の粗直鎖ペプチドのエアレーションにより達成可能な、末端システイン残基の酸化により行ってよい。得られた粗ペプチド生成物は、ＲＰ−Ｃ１８−シリカゲルカラム等の適当なカラムでのクロマトグラフィー、例えば、逆相中圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＭＰＬＣ）により、アセトニトリル−水勾配５％〜４０％の勾配等の溶出勾配を便利に用いて精製してもよい。トリフルオロ酢酸対イオンは、例えば、Ｌｅｗａｔｉｔ ＭＰ６４カラム等のカラム上で、例えば、酢酸により置換されてもよい（酢酸型）。水での最終洗浄の後、精製されたペプチドは、酢酸塩として凍結乾燥されてよく、淡色、例えば、白色の粉末の形態で得られてよい。

システイン不含ペプチドの場合、環化工程は、適宜、例えば、樹脂から切り出した後、部分的に保護されたままの直鎖ペプチドに行ってもよい。システイン不含ペプチドの選択的環化の後、必要に応じて、ＴＦＡにおいて側鎖の脱保護を行ってもよい。精製工程は、例えば、クロマトグラフィーを介して（例えば、分取ＲＰ−ＭＰＬＣにより）行ってもよい。このようにして得られたペプチドにおいて、トリフルオロ酢酸イオンの酢酸による置換を例えば上記のように行ってもよい。ペプチドの酢酸型の凍結乾燥は、例えば、システイン含有ペプチドと同様に行ってもよい。

得られたペプチドの分子量は、エレクトロスプレーイオン化質量分析またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより確認してもよい。例えば、分析高速液体クロマトグラフィーにより、純度を決定してもよい。

式Ｉの環状化合物は、配列番号１、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列を有する化合物を含んでなる。このような化合物は、例えば、Hazemi P., Tzotzos, S. Fischer B., Andavan, G.S.B., Fischer H., Pietschmann H, Lucas, R. and Lemmens-Gruber, R. in J Med Chem. 2010 November 25, 53(22): 8021−8029, "Essential structural features of TNF-α lectin-like domain derived peptides for activation of amiloride-sensitive sodium current in A549 cells"により、「アミロライド感受性上皮性ナトリウムチャネル（ＥＮａＣ）」を活性化し、よって、肺における疾患の処置に有用であることが知られている。アミロライド感受性ナトリウムイオンチャネル（ＥＮａＣ）の活性化により、肺組織を通してナトリウムイオンが輸送されるようになる。浸透勾配が形成されると受動水輸送が引き起こされる。このモデルを肺に当てはめると、アミロライド感受性ナトリウムイオンチャネルの活性化は、例えば肺浮腫の場合の肺における水の蓄積の低減に用いられ得る。

本発明の開発の過程で、本発明の式Ｉ［式中、Ｘ₁およびＸ₂は上記で定義された通りである。］の、例えば、配列番号１〜６のアミノ酸配列を有する環状ペプチドの肺組織を通しての血中への能動または受動輸送は、望ましくなく、起こるべきではないことが見出されたが、これは、もし配列番号１〜６のアミノ酸配列を有する環状ペプチドが、肺組織の表面に沈着し、頂端配向のアミロライド感受性ナトリウムイオンチャネルを活性化できるように経口吸入を通して肺の空間に達すると、配列番号１〜６のアミノ酸配列を有する環状ペプチドの生理学的活性に実質的に寄与するためである。

驚くべきことに、本発明による凍結乾燥物から水の添加により調製されたエアロゾルの吸入後、本発明のペプチドは血中で検出されなかったことが示された（実施例１０）。

吸入製剤は、過去および現在において通常、肺組織を通した吸入の後、血流へと通り過ぎるように開発されており、それゆえ、できる限り非経口注入が避けられている。これまでの吸入医薬の標的は主に全身作用である。血中における薬剤の分布を通して、分子は各組織や器官に到達する。しかしながら、全身適用の実質的不利益は、処置すべき疾患と関係がない身体の器官や組織での毒性や副作用に関して非常に幅広い。

これとは対照的に、本発明の凍結乾燥物から製造された水性エアロゾルを投与すると、ペプチドは空気と肺上皮の間のバリアに到達し、ナトリウムチャネルを活性化する。本発明のペプチドはこのようにして肺の上皮組織へ「局所的に」作動し、全身的ではない。肺組織を通してのペプチドのステップは望ましくないが、起こらない。

文献で知られているペプチド処方物とは対照的に、本発明の凍結乾燥物から製造され、かつ、添加剤を含有しない水性エアロゾルによれば、吸入されたペプチドが肺を通して血中に広がることを避けることに成功した。これにより、肺以外の他の器官に対しても、ペプチドに見込まれる全身性の毒性特性を避けることができるという、非常に好ましい効果が得られる。別の方法で通常の副作用を取り除いてもよく、これにより優れた薬効が提供される。血中へ拡散させることなく内側肺表面へ局所投与することにより、全身適用と比較して必要とされる活性物質が著しく少なくなる。

さらにまた、驚くべきことに、式Ｉの環状ペプチド、特には、配列番号１〜６のアミノ酸配列の環状ペプチドを、添加剤を伴わずに含んでなる本発明による凍結乾燥物において、化学的かつ生物学的な不安定性を事実上数か月から数年にかけて排除できることが明らかとなった。すなわち、本発明の式Ｉの環状ペプチド、例えば、配列番号１〜６のアミノ酸配列の環状ペプチド、の化学構造および生物学的活性は、驚くべきことに一般的に使用される添加剤および／または安定化剤を伴わないにも関わらず損傷を受けないことが明らかとなった。

本発明の式Ｉ、特には配列番号１〜６のアミノ酸配列の環状ペプチドを吸入で投与すると、環状ペプチドは、例えば、スプレー用装置（ネブライザー）の保管容器において、添加剤を伴わなくとも、溶解された形態、すなわち水溶液において長時間安定であるように構成されることが明らかとなった。加えて、本発明の式Ｉの、特には本発明の配列番号１〜６のアミノ酸配列の環状ペプチドは、吸入形態への変換の際、驚くべきことに一般的に使用される添加剤および／または安定化剤を伴わなくとも、配列番号１〜６の環状タンパク質が損傷を受けず、よって十分に活性が維持されるような方法で製造することができることが分かった。

例えば、スプレーすることに適切な形態である、本発明の式Ｉ、特には配列番号１〜６のペプチドの少なくとも１つの溶液の製造に関し、これらのペプチドは水に溶解させてよく、得られた溶液は、例えば、一般的に使用される添加剤および／または安定化剤等としてのさらなる添加剤を伴わずに凍結乾燥させてもよく、それにより粉末を得ることができる。凍結乾燥の前に、混濁物を除去するために溶液を濾過してもよい。

本発明のさらなる面によれば、スプレーすることに適したエアロゾル、特には添加剤および／または安定化剤を伴わないエアロゾルの製造のための、本発明による凍結乾燥物の使用が提供される。

本発明による凍結乾燥物の使用は、本明細書において「本発明による（の）使用」とも表される。

このような凍結乾燥形態の式Ｉ、特には、配列番号１〜６のペプチドは、通常の添加剤および／または安定化剤を添加しなくても、低温環境で少なくとも２４か月および室温で少なくとも６か月安定であることを見出した。

本発明による凍結乾燥物は、エアロゾルを直接調製するために、または溶液として保管（例えば、保管容器において）するために、例えば、添加剤を伴い、または伴わずに、例えば、添加剤を伴わずに、エアロゾルを得るために投与用水に溶解させてもよい。

さらなる面において、本発明によれば、式Ｉ［式中、Ｘ₁およびＸ₂は上記で定義された通りである。］のペプチドが、特には、添加剤および／または安定化剤を伴わずに、水溶液に存在する凍結乾燥物の使用が提供される。

驚くべきことに、有利には、このように溶解された式Ｉ［式中、Ｘ₁およびＸ₂は上記で定義された通りである。］、特には、配列番号１〜６のアミノ酸配列の環状ペプチドは、溶液において少なくとも７日間安定であり、すなわち、環状ペプチドの生物学的活性は、吸入形状に変換する際に、通常の添加剤および／または安定化剤を添加しなくても減少しないことが明らかとなった。

本発明、特には、配列番号１〜６のアミノ酸配列の環状ペプチドを適用すると、ペプチドの溶液は、例えば環状ペプチドをスプレーするネブライザーにより、エアロゾルへ変換することができるように構成されることが分かった。それにより、エアロゾル粒子は５μｍ以下の直径を有するように得られることが分かった。

さらにまた、≦５μｍの直径を有する液滴を主に含んでなるエアロゾルは、結果としてエアロゾルが肺の空間に到達するため、特に投与に適していることが明らかとなった。液滴サイズの下限は単に実施可能な液滴サイズに従う。

さらなる面において、本発明によれば、粒径が≦５μｍの直径を有するエアロゾルの製造のための凍結乾燥物の使用が提供される。

さらなる面において、本発明によれば、凍結乾燥物から製造されるエアロゾルが、吸入剤の形態で肺機能を改善および／または調整するために用いられることを特徴とする、本発明による凍結乾燥物の使用が提供される。

さらなる面において、本発明によれば、本発明による凍結乾燥物から製造されるエアロゾル、特には添加剤を伴わないエアロゾルの肺機能の改善のため、例えば、肺浮腫の処置のための使用が提供され、
さらなる面において、添加剤を伴わない本発明による凍結乾燥物を吸入剤の形態で患者に投与することを特徴とする、肺機能を改善するため、例えば、肺浮腫を処置するための方法が提供され、および
さらなる面において、肺機能を改善／調整するために、または、肺機能を改善／調整するために吸入するために使用するための本発明による凍結乾燥物が提供される。

適当な投与量は、異なる因子、例えば、式Ｉの環状化合物の化学的性質および薬物動態特性、個々の宿主、例えば、その体重、年齢、および患者の個々の状態、ならびに疾患の性質および重篤度に依存する。しかしながら、一般的に、大型哺乳動物、例えばヒトにおける満足できる結果については、例えば数回、例えば４回までの（部分）投薬で投与される、（およそ）０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約（およそ）２００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、１ｍｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重までの（１日）投与量が、満足できる結果をもたらし得る。子供は通常、成人の投与量の半分が与えられる。

本研究ではさらに、驚くべきことに、生体外でドナー肺を、すなわち、患者への移植前、式Ｉの環状ペプチド［式中、Ｘ₁およびＸ₂は上記で定義された通りである。］、特には、配列番号１〜６のアミノ酸配列を有する環状ペプチドで処置することにより、肺機能が改善／調整されることが示された。これにより、移植される肺が移植前に本発明の凍結乾燥物由来のエアロゾル（特には、添加剤を伴わない）で処置されると著しい改善が達成されることが示された。

さらなる面において、本発明によれば、ドナー肺に、本発明による凍結乾燥物から、特には添加剤および／または安定化剤を伴わずに製造される水性エアロゾルを生体外でスプレーすることを特徴とする、肺機能を調整／改善するための体外方法が提供される。

肺の処置はまた、受容者において移植がなされた後にも行うことができる。

よって、図１に示されるような結果が得られた。それによるエアロゾル中の本発明による式Ｉの環状ペプチドの濃度は５ｎＭ〜およそ１５０ｎＭであった。

図１は、配列番号１〜６のアミノ酸配列を有する環状ペプチドの濃度依存的な活性を示す。ｘ軸は、配列番号１〜６の環状タンパク質の濃度をｎＭ（対数目盛り）で示し、ｙ軸はナトリウムイオン流を％で示す。 図２は、肺移植をシミュレーションする体の外（体外（extra-corporal）、生体外（ex vivo））での肺灌流における配列番号１の環状ペプチドの吸入適用の結果を示す。図２Ａにおいて、ｘ軸には時点Ｔ１〜Ｔ４を示し、配列番号１のペプチドの吸入適用後（１時間に１度）測定を行った。ｙ軸にはコンプライアンスをプロットし、図２Ｂにおいては、ｘ軸には再び時点Ｔ１〜Ｔ４を、ｙ軸には動静脈ｐＯ₂の差のΔｐＯ₂をプロットする。対照として注入用水（ＷＦＩ）を用いた。グループごとに８回の実験の平均を示す。 図３は、配列番号１〜７のアミノ酸配列を有するペプチドの凍結乾燥サイクルを示し、パネル温度（実線）および生成物温度（点線）は℃で（ｙ軸）、時間は分で（ｘ軸）プロットする。 図４は、冷却トラップにおいてエアロゾルを濃縮するための実験用アセンブリを図式的に示す。ここで、 １は、氷と塩が充填されたポリスチレン容器を示し、 ２は、溶解されたペプチド（対照物質）を有する小チューブを示し、 ３は、ネブライザーを示し、 ４は、保管空間を示し、かつ ５は、対照モジュールを示す。 図５は、２つの異なるネブライザー（Ａ型およびＢ型）から生産される、配列番号１のアミノ酸配列を有する環状ペプチドのエアロゾルの平均粒径分布を示す。レーザー回析（流速：１５Ｌ／分）により決定を行った。エラーバーが示すもの＝ＳＤ。線はエアロゾル中、≦５μｍの直径を有する粒子の個々の部分を示す。ｘ軸には液滴サイズをμｍで、ｙ軸には累積量を％でプロットする。 図６に、呼吸模擬装置における配列番号１のアミノ酸配列を有する環状ペプチドのエアロゾルの各場所：１＝吸入フィルター２＝呼気フィルター３＝フィルター接続部４＝ネブライザーＹ部（一方向弁を含む）５＝ネブライザー中の残留物（Ａ型およびＢ型の２種のネブライザーを用いた。）での分布を示す。

実施例１：ペプチド合成
ペプチドは、以下の工程に従って製造された：
アミノ酸の連続的結合；固相からの選択的切り出し；精製および凍結乾燥、選択的環化；保護基の開裂；精製および凍結乾燥；解析調査。

すべての本発明の環状ペプチド、配列番号１〜６のアミノ酸配列のペプチドおよび配列番号７のアミノ酸配列を有するペプチドは、担体（２−クロロトリチルクロリド樹脂）上で固相合成の形式のフルオレニルメトキシカルボニル／ｔ−ブチル保護方法に従って完全自動で製造した。ジイソプロピルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールをカップリング試薬として使用した。カップリング工程はいずれも溶媒としてのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドにおいて行った。それにより、保護されたアミノ酸は出発物質として使用されたＣ末端アミノ酸にそれぞれ連続的に結合させた。フルオレニルメトキシカルボニルの脱保護は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンにおいて行った。完成された部分的に保護されたペプチドの樹脂からの切り出しは、酢酸およびジクロロメタンの１：１の混合物において行った。

システイン含有ペプチドの場合、担体（樹脂）からの切り出しの後、側鎖の脱保護を９５％トリフルオロ酢酸において行い、その後すぐに、塩基ｐＨ（８．５）にて９０時間、粗直鎖ペプチドのエアレーションにより達成可能な末端システイン残基の酸化により環化を行った。粗環状ペプチドを、ＲＰ−Ｃ１８−シリカゲルカラムでの逆相中圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＭＰＬＣ）により、５％〜４０％アセトニトリル／水の勾配で精製した。最後に、トリフルオロ酢酸イオンを、Ｌｅｗａｔｉｔ ＭＰ６４カラム上で、酢酸により置換した（酢酸型）。水での洗浄の後、精製されたペプチドを酢酸塩として凍結乾燥し、白色から灰白色の粉末として得た。

システイン不含ペプチドの場合、担体（樹脂）から切り出した後、環化工程を部分的に保護された直鎖ペプチドに行った。システイン不含ペプチドの選択的環化の後、トリフルオロ酢酸において側鎖の脱保護を行い、その後、分取ＲＰ−ＭＰＬＣクロマトグラフィーによりトリフルオロ酢酸イオンの酢酸による置換と酢酸型の凍結乾燥をシステイン含有ペプチドと同様に行った。

その後、配列番号１〜６の環状タンパク質について逆相ＨＰＬＣにより純度および質量に関する分析を行った。

配列番号１の環状タンパク質の純度は９６．３％であった。ｍ／ｚ（ＥＳＩ）１９２４．２（Ｍ＋＋１）。
配列番号２の環状タンパク質の純度は９６．３％であった。ｍ／ｚ（ＥＳＩ）１９２４．２（Ｍ＋＋１）。
配列番号３の環状タンパク質の純度は９８．８％であった。ｍ／ｚ（ＥＳＩ）１８８８．２（Ｍ＋＋１）。
配列番号４の環状タンパク質の純度は９７．４％であった。ｍ／ｚ（ＥＳＩ）１８７３．４（Ｍ＋＋１）。
配列番号５の環状タンパク質の純度は９９％であった。ｍ／ｚ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）１９０１．６（Ｍ＋＋１）。
配列番号６の環状タンパク質の純度は９９％であった。ｍ／ｚ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）１９０２．７（Ｍ＋＋１）。
配列番号７の環状タンパク質の純度は９５％であった。ｍ／ｚ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）１７７８．０２（Ｍ＋＋１）。

配列番号７：
シクロ（ＣＧＱＲＥＡＰＡＧＡＡＡＫＰＷＹＣ）
のアミノ酸配列を有する化合物［式中、両末端のシステイン残基の間でジスルフィド架橋が形成される。］は生物学的に不活性であることが明らかとなったため、比較目的で使用した。

実施例２：アミロライド感受性上皮性ナトリウムチャネル（ＥＮａＣ）の電気生理学的試験
巨視的ナトリウムイオン電流は、「パッチクランプ」技法による「ホールセル」コンフィギュレーションにおけるヒト肺上皮細胞Ａ５４９に由来した（Hamill et al, Pflugers Arch. 1981, 391(2):85-100., 1981）。「ホールセル」コンフィギュレーションにおける電流については以下のバスおよび電極溶液を使用した：
バス溶液：１３５ｍＭメタンスルホン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ₂、２ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５．５ｍＭグルコールおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４。
電極溶液：１２０ｍＭメタンスルホン酸カリウム、１５ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ Ｍｇ₂ＡＴＰ、２ｍＭ Ｎａ３ＡＴＰ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび０．５ｍＭ ＥＧＴＡ（ｐＨ７．２）。

カバーガラスとその上の培養された細胞を１ｍｌの容量の試験バスに移し、顕微鏡台に固定し（Ａｘｉｏｖｅｒｔ１００、４００倍拡大）、細胞を上記バス溶液で灌流した。次いで、（カバーガラスに付着した）適当な細胞から電流を推測した。このため、電解質溶液（約１〜３μｍの規定の加熱研磨された先端開口部を有するガラス毛管が３〜５ＭΩの電極先端部の電気抵抗に対応する）を充填した微小電極を取り付け、膜を吸引し、それにより、リーク電流を最少にするため、膜と電極との間に「ギガオームシール」を形成させた。「ホールセル」コンフィギュレーションでは、細胞のすべてのイオンチャネルを通して流れる電流の測定を可能にするために、電極先端部の下の膜を破壊した。「ギガオームシール」を得ると、規定の膜保持電位が前置増幅器（ＣＶ−４ Ｈｅａｄｓｔａｇ、アクソン・インスツルメンツ）および増幅器（Ａｘｏｐａｔｃｈ １Ｄ、アクソン・インスツルメンツ）を通して生じ、それによりイオンチャネルを通して流れる電流が測定される。

パルスのプロトコールは、５秒間の−１００ｍＶの細胞膜の過分極および続く２０ｍＶずつの＋１００ｍＶへの段階的な脱分極から構成された。

このプロトコールは、環状タンパク質添加の前（対照）および後に行った。このようにして得られた電流をプログラムＰＣＬＡＭＰ６．０により記録し、分析した。このため、アミロライド存在下で得られた電流を先に記録した電流から差し引き、その結果、上皮ナトリウムチャネルによるアミロライド感受性ナトリウム電流を決定することができた。

測定の結果としては、細胞のアミロライド感受性ナトリウムイオン電流に対する配列番号１〜７の環状タンパク質の活性を示す表１に概要を示す。個々のペプチドの活性はＥＣ₅₀（ｎＭ）として示す。ＥＣ５０は、最大活性（すなわち、電流の強さＩの最大増加）の５０％が測定される効果濃度である。

図１では、配列番号１〜７の環状タンパク質の活性を濃度依存的にプロットする。最大活性は１００％で示した。

表１および図１に示される試験は、配列番号１〜６のアミノ酸配列を有する環状ペプチドは生物学的に活性であり、一方、配列番号７のアミノ酸配列を有する環状ペプチドは、構造的にはある程度似ているが不活性であることを示す。

実施例３：凍結乾燥物の製造
式Ｉの環状ペプチドの安定保管形態の開発を技術的規模で行った。そのため、配列番号１〜６の環状ペプチドと配列番号７の環状ペプチドを純水に０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの量で溶解し、混濁物、汚染、滅菌されていない可能性のあるものを除去するために細孔径０．２μｍのフィルターにより濾過した。

濾過後、純水に溶解された環状ペプチドをガラスまたはプラスチックのアンプルに分注し、フリーズドライ（凍結乾燥）により安定な粉末に変換した。それにより、表２に記載される凍結乾燥パラメータおよび図３に記載される凍結乾燥サイクルが得られた。

凍結乾燥の結果、配列番号１〜６のアミノ酸配列を有する環状ペプチドについてそれぞれ白色粉末が得られた。

実施例４：実施例２の凍結乾燥物の室温および冷蔵庫保管後の安定性試験
配列番号１〜６のアミノ酸配列の環状ペプチドの凍結乾燥物の安定性試験を技術的規模で行った。そのため、２〜８℃で２４か月までと、２５℃、相対湿度６０％で６か月まで凍結乾燥物の保存を行った。安定性はこの期間の異なる時点で試験を行った。特に、環状ペプチドの外観、含有量、純度について試験を行った。そのために、例えば、目視検査や逆相ＨＰＬＣ等の研究室で一般的な分析方法を用いた。

加えて、２〜８℃で２４か月保管後、パッチクランプ実験により生物学的活性を決定した。それにより、Ａ５４９細胞の巨視的電流を、下記「アミロライド感受性ナトリウムイオンチャネル（ＥＮａＣ）の電気生理学的試験」で記載される「パッチクランプ」技法の「ホールセル」コンフィギュレーションにおいて推測した。

表３に、配列番号１〜６のアミノ酸配列を有する環状ペプチドのそれぞれの凍結乾燥物の、それぞれ、時点Ｔ＝０および６か月後（Ｔ＝６Ｍ）または２４か月後（Ｔ＝２４Ｍ）での安定性試験の結果の概要を示す。全時点で外観は変化しなかった。環状ペプチドの含有量と純度はわずかな変動を示すのみである。

配列番号１〜６のアミノ酸配列の環状ペプチドの凍結乾燥物はそれぞれ２〜８℃で２４か月までと２５℃／６０％相対湿度で６か月までの間安定である。

パッチクランプ実験により測定された生物学的活性によれば、配列番号１〜６のアミノ酸配列の環状ペプチドのそれぞれの凍結乾燥物は２〜８℃で２４か月の保存後であっても十分に活性であることが明らかとなった。

実施例５：吸入前の配列番号１〜６のアミノ酸配列の環状ペプチドの水溶液の製造
配列番号１〜６のアミノ酸配列の環状タンパク質の投与用プレ製剤について、実施例２に従って凍結乾燥により得られた安定白色粉末をそれぞれ規定容積の純水に溶解し、０．１ｍｇ／ｍｌおよび１００ｍｇ／ｍｌの間の濃度で得た。得られた配列番号１〜６の環状タンパク質の溶液はその後ネブライザーの保管容器に移した。配列番号１〜６の環状ペプチドを水に溶解することにより透明な溶液を得た。

実施例６：溶解製剤における配列番号１〜６のアミノ酸配列の環状ペプチドの吸入後の安定性についての試験
実用的な理由から、配列番号１〜６のアミノ酸配列の環状ペプチドの水溶液は、吸入用に製造した後、直接使用できるとは限らない。このような理由から、水溶液の安定性を実験的に試験した。よって、すぐに使える溶液を、研究室で一般的に使用されるシリンジにおいて２〜８℃で７日間、あるいは、ネブライザーの容器において２５℃で２４時間のいずれかで保存した。特に、配列番号１の環状タンパク質の外観、含有量および純度を試験した。よって、使用する方法は、例えば、目視検査や逆相ＨＰＬＣによる分析として研究室で一般的に用いられる分析方法を用いた。

配列番号１のアミノ酸配列を有する環状ペプチドの水溶液の安定性試験の結果を表４に示す。全時点で外観は変化しなかった。環状ペプチドの含有量と純度はわずかな変動を示すのみである。

よって、吸入用の配列番号１〜６のアミノ酸配列の環状ペプチドの水溶液は、研究室で一般的に使用されるシリンジにおいて２〜８℃で７日間安定であり、ネブライザーの容器において２５℃で少なくとも２４時間安定である。

実施例７：溶解された製剤における配列番号１〜６のアミノ酸配列の環状ペプチドのエアロゾルへの変換の間の安定性に関する試験
タンパク質およびペプチドは予想以上に不安定であることがあるため、溶解された製剤における配列番号１〜６のアミノ酸配列の環状ペプチドがエアロゾルへの変換の間、安定性が維持されるか否かを試験した。そのために、実施例４に記載されるように環状ペプチドを水に溶解した。ネブライザーの保管容器に充填した後、環状ペプチドの水溶液をエアロゾルに変換した。これには「メッシュ式」ネブライザーを使用した。ネブライザーから排出されるエアロゾルを図４に示すような冷却トラップに回収した。回収されたエアロゾルの生物学的活性をパッチクランプ法により決定した。それにより、Ａ５４９細胞の巨視的電流を、下記「アミロライド感受性ナトリウムイオンチャネル（ＥＮａＣ）の電気生理学的試験」で記載される「パッチクランプ」技法の「ホールセル」コンフィギュレーションにおいて推測した。

濃縮されたエアロゾルの化学的安定性を逆相ＨＰＬＣ／ＭＳにより決定した。

溶解された製剤における配列番号１のアミノ酸配列の環状ペプチドは、エアロゾルへの変換の間、その生物学的および化学的安定性が維持されることを実験的に示すことができた。

実施例８：配列番号１〜６のアミノ酸配列の環状ペプチドのエアロゾルの物理化学的特性
水溶液をエアロゾルに変換するネブライザーにより、配列番号１〜６のアミノ酸配列の環状ペプチドの水溶液もエアロゾルに変換することができる。このようなエアロゾルは中間液滴サイズおよびエアロゾル液滴のサイズ分布に関して特徴づけることができる。これには薬局方にも記載される従来法を使用する。分析方法の１つとしてカスケードインパクター、実際の構成には「次世代インパクター」を使用する。それにより、穴の直径を板ごとに小さくしていき、穴の量を増やす一連の篩板を通してエアロゾルを処理する。他の分析方法、レーザー回析測定では、レーザーにより液滴サイズを測定する。これらの測定の間に決定される２つの重要なパラメータのうち、一方はすべての液滴の直径のメジアン、他方は≦５μｍの直径を有する液滴の量である。文献には、吸入されたエアロゾル粒子が実際に肺に到達する限界としての直径が記載されている。

実際に生成されたエアロゾルから一部のみが患者に利用可能であることが漫然と知られている。よって、使用者に利用可能なエアロゾルの量を決定するために呼吸模擬装置で試験を行った。粒径を試験し、呼吸模擬装置を実行するために、配列番号１のアミノ酸配列の環状ペプチドの水溶液からのエアロゾルを使用した。エアロゾルを生成するために異なるネブライザー型を使用した。ネブライザーＡおよびＢはいわゆる「メッシュ式ネブライザー」である。

３つの異なるネブライザーから生成される、配列番号１のアミノ酸配列の環状ペプチドのエアロゾルの特性を示す表５および図５を参照すると、エアロゾル中、≦５μｍの直径を有する液滴の量はすべてのネブライザーにおいて少なくとも５０％であった。

さらにまた、「吸入フィルター」での環状タンパク質の定量的検証が記載される図６に示されるように、ネブライザーにより生成された、配列番号１のアミノ酸配列の環状ペプチドの水溶液のエアロゾルの主な部分は吸入に利用可能である。利用可能でないエアロゾルの部分は極めて少ない（図６）。

実施例９：非経口投与後の血中の 配列番号１〜６のアミノ酸配列の環状ペプチドの証明
非経口投与後の血中の配列番号１〜６のアミノ酸配列の環状ペプチドの実験的証明をイヌおよびラットにおいて行った。その実験のために、ボーラスとして配列番号１のアミノ酸配列の環状ペプチドの水溶液（２５ｍｇ／ｋｇ体重）を実験動物に静脈内投与した。静脈内適用終了の直後、血液を採取し、配列番号１のアミノ酸配列の環状タンパク質の濃度を研究室で一般的な逆相ＨＰＬＣ／ＭＳにより決定した。結果は、静脈内適用後の配列番号１のアミノ酸配列の環状ペプチドの血漿濃度を示す表６に示す。

実施例１０：エアロゾルとして吸入後の肺組織における配列番号１〜６のアミノ酸配列の環状ペプチドの証明
配列番号１〜６のアミノ酸配列の環状ペプチドの証明はラットの肺組織において行うことができる。その実験のために、配列番号１のアミノ酸配列の環状ペプチドの水溶液からネブライザーを用いてエアロゾルを生産した。エアロゾルは実験動物に吸入させた（７２ｍｇ／ｋｇ体重）。エアロゾル吸入の終了後、実験動物の肺組織を血液について検討を行った。逆相ＨＰＬＣ／ＭＳにより配列番号１のアミノ酸配列の環状ペプチドの濃度を決定した。代表的に、配列番号１のアミノ酸配列の環状ペプチドは、合計で７２ｍｇ／ｋｇ体重の吸入後、１．２μｇ／ｇの濃度で肺組織において検出することができた。対照的に、配列番号１のアミノ酸の環状ペプチドは検出限界０．１μｇ／ｍｌまで血中では検出することができなかった。

実施例１１：脱グリコシル化細胞表面に対する配列番号１〜７のアミノ酸配列のペプチドの影響
ホールセル実験において、パッチクランプ測定の直前に、Ａ５４９細胞を酵素「ＰＮＧａｓｅ Ｆ」（ペプチド−Ｎ⁴−（Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニル）アスパラギンアミダーゼＦ）、１００ユニットで１〜５分間インキュベートし、１ｍＬバスのチャンバーに移す前に、培養された細胞を有するカバーガラスを外液ですすいだ。対照の記録後、２４０ｎＭの配列番号１のアミノ酸配列のペプチドをバス溶液に添加した。対照条件下で前処置をせず、引き続いて配列番号１〜７のアミノ酸配列のペプチドを添加する細胞と、ＰＮＧａｓｅ Ｆによる前処置を伴う細胞から総細胞電流をＥｈ＝−１００ｍＶで記録した。ホールセル様式におけるパッチクランプアッセイ使用の下での脱グリコシル化実験の結果を、配列番号１〜７のアミノ酸配列のペプチドによるナトリウム電流の活性化に対するＡ５４９細胞の脱グリコシル化の影響を示す表７に示す。ホールセル電流はＥｈ＝−１００ｍＶで記録した。バス溶液中の配列番号１〜７のアミノ酸配列のペプチド濃度は２４０ｎＭであった。

パッチクランプアッセイの前にＰＮＧａｓｅ Ｆを伴う細胞（処置）は、配列番号１〜６のアミノ酸配列のペプチドのナトリウム電流を増加させる能力を低下させた。ペプチドをバスに添加しない制御条件の下、−１００ｍＶの保持電位では、非処置細胞においてもＰＮＧａｓｅ Ｆで前処置した細胞においてもナトリウム電流が２５．４ｐＡであった。非処置細胞においては、バス溶液へ配列番号１〜６のアミノ酸配列のペプチドを添加し（最終濃度２４０ｎＭ）、−１００ｍＶの保持電位で、ナトリウム電流は著しく１，０００ｐＡ以上となった。対照的に、配列番号７のアミノ酸配列のペプチドは活性を示さなかった。

実施例１２：ブタへの肺移植実験
脳死ブタを仰向けにし、垂直胸骨切開を行った。心膜と両胸膜腔を開いた。下および上大静脈を包囲した。右心室排出管における巾着縫合により流入カテーテルを肺動脈に挿入した。下および上大静脈を接続させることにより流入閉塞を、大動脈をホチキスでとめることにより排出閉塞を得た。その後、流入カテーテルを通して、冷等張保護溶液（５０ｍｌ／ブタのｋｇ体重、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、塩化物イオン、デキストラン、グルコース、緩衝液イオンを含んでなる）で予防的にすすぐことにより肺を保護した。左心管の切断により排出を生じさせた。その間に肺を５０％酸素に曝し、氷スラッジを両胸膜腔と縦隔に入れた。

外植技術は、要すると、以下の工程に従って、心臓と食道を除去した。
ａ）気管の両側の胸腔に渡る軟組織を切開する。
ｂ）両肺間膜の切断（非常に深く、困難な露出）、その後、それぞれ、下部胸部上行大動脈または食道のＶＣＩの切断。
ｃ）残存する縦隔接着の鈍的分離。
ｄ）クリップでの気管閉鎖前のドナー肺の完全拡張。

外植の後、肺をガーゼで包み、アイスバッグに入れ、低カリウム−デキストラン−細胞外溶液で満たし、４℃で１８〜２４時間保存した。

生体外肺調整のために、ＥＶＬＰ技術を用いた（血管外肺灌流）。ＥＶＬＰ技術では、ドナー肺をポンプ、エアレーターおよびフィルターから構成される循環に入れる。ＥＶＬＰ技術では、温度を３７℃まで上昇させることができる。ＥＶＬＰ技術では、酸素を肺に送達するためにエアレーターを用いる。ポンプは、ヒトアルブミンおよび栄養素を含有する細胞外溶液とともに肺を灌流するためにポンプを用いる。ＥＶＬＰの間、肺の機能は、鍵となる指標に関して定期的に評価することができる。

実験ブタ肺移植実験については、ＥＶＬＰ循環を２．０リットルのヒトアルブミン溶液でプライムした。この細胞外溶液は最適な膠質浸透圧を有した。循環を通気した後、肺と接続するまでプライム物質を２０℃で循環させた。ヘパリン、セフロキシム、メチルプレドニゾロンを灌流液に添加した。

ブタ由来のドナー肺の処理は、左心房を開いて副子固定し、閉鎖された灌流循環を維持するために、左心房カフ（ＬＡ）に組み込まれた圧力監視付きカテーテルを有するシラスティックの漏斗状のチューブに縫い付けることで開始した。

確実かつ十分な排水の排出を達成するために、そのチューブを、進行中の５−０ｍモノフィラメント糸の使用の下で、ＬＡカフに固定し吻合した。同型のカニューレを肺動脈（ＰＡ）の貫通のために使用し、必要に応じてＰＡサイズに調整するために修正を加えた。５００ｍｌ緩衝細胞外溶液の使用の下で、逆行性バックテーブルリンスを行った。気道を洗浄するために、ドナー肺をＥＶＬＰ循環に固定する前に、気管を開き、直接気管支の吸出しを行った。気管内チューブ（サイズ８ｍｍ Ｉ．Ｄ．）を気管に導入し、臍帯バンドでしっかりと固定した。その後、肺をＥＶＬＰ循環ユニットに移した。最初に、ＰＡカニューレを通気させるために、ＬＡカニューレと循環を接続し、逆流をゆっくりと開始した。通気が完了次第、ＰＡカニューレを循環に接続し、１５０ｍｌ／分の順行性の流れを灌流液を用いて室温で開始した。次の３０分で、灌流の温度を段階的に３７℃に上昇させた。温度が３２〜３４℃に到達次第、エアレーション速度と灌流液の流速を段階的に上昇させることにより、ブタのドナー肺の機械的エアレーションを開始した。

ＥＶＬＰガスの流れは、開始される（０．５Ｌ／分のガス流で開始し、流入灌流液ｐＣＯ₂に基づいて滴定）ガス変換器膜により、肺へ酸素を運び、二酸化炭素を流入灌流液へ送達し（８６％Ｎ₂、６％Ｏ₂、８％ＣＯ₂）、流入灌流液圧（ｐＣＯ₂）は３５〜４５ｍｍ Ｈｇに維持される。肺が十分に拡張されると、単純液体標準ネブライザー系使用の下で、単回投与量のＡＰ３０１（５ｍｌ水中、１ｍｇ／ｋｇ）をＥＶＬＰ系スイッチングにより、ブタのドナー肺に与え、換気し、通過させた。

ＥＶＬＰ実験の間、血流を定期的に決定した。以下の機能パラメータは毎時間測定し、記録した。
−肺動脈流（ＰＡＦ）：Ｌ／分
−（平均）肺動脈圧（ＰＡＰ）：ｍｍＨｇ
−左心房圧（ＬＡＰ）：ｍｍＨｇ
−肺血管抵抗（ＰＶＲ＝［ＰＡＰ−ＬＡＰ］×８０／ＰＡＦ）：ダイン／秒／ｃｍ−５
−気道の中圧、最高圧およびプラトー圧（ｍＡｗＰ、ピークＡｗＰ、プラトーＡｗＰ）：ｃｍ Ｈ₂Ｏ
−動的コンプライアンス（ｍＬ／ｃｍ Ｈ₂Ｏ）
−灌流ガス分析−流入（ＰＡ）および流出（ＰＶ）ｐＯ₂、ｐＣＯ₂およびｐＨ。

結果
本研究は、肺移植をシミュレーションする体外系における肺機能に対する配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドの影響を評価する。研究の結果によれば、図２Ａおよび図２Ｂに示されるように、吸入を通して投与すると、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドで処置された肺において動的肺適合や動静脈ｐＯ₂の差のΔｐＯ₂の双方が改善されることが示された。

配列番号７のアミノ酸配列を有するペプチドを使用しても肺に対する影響を改善しないことが示された。

Claims (9)

1. 下記式の環状ペプチド：
   Ｘ_１−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹ−Ｘ_２ Ｉ
   ［式中、
   Ｘ_１は、天然および非天然アミノ酸を含んでなる、１〜４個のアミノ酸（配列）を含んでなり、かつ、
   Ｘ_２は、天然アミノ酸を含んでなり、かつ、
   Ｘ_１は、左側の１位にＮ末端アミノ酸を含んでなり、かつ、Ｘ_２は、右側の位置の最後にＣ末端アミノ酸を含んでなる。］
   を含有し、添加剤および安定化剤を伴わない吸引用の水性エアロゾルの形態である医薬であって、
   前記式Ｉの環状ペプチドは、酢酸塩の形態であり、
   前記水性エアロゾルは、添加剤および安定化剤を伴わない、酢酸塩の形態である式Ｉの環状ペプチドの凍結乾燥物を含有し、
   前記添加剤および安定化剤は、凍結乾燥時および噴霧時の加熱および加圧に対して、ペプチドの化学構造および生物学的活性を維持するためのものである、医薬。
2. 式Ｉ中のＸ_１が、Ｃ（Ｃｙｓ）、ＫＳＰ（Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）、Ｋ（Ｌｙｓ）、オルニチン、４−アミノ酪酸、β−アラニンのアミノ酸（配列）から選択される、請求項１に記載の医薬。
3. 式Ｉ中のＸ_２が、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ｇ（Ｇｌｙ）およびＥ（Ｇｌｕ）の群から選択される、請求項１または２に記載の医薬。
4. 式Ｉの環状化合物が、
   −配列番号１：
   シクロ（ＣＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＣ）
   ［式中、両末端のシステイン残基の間でジスルフィド架橋が形成される。］；
   −配列番号２：
   シクロ（ＫＳＰＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＥ）
   ［式中、Ｎ末端のリジン残基のε−炭素原子に結合しているアミノ基とＣ末端のグルタミン酸残基のγ−炭素原子に結合している側鎖カルボキシ基との間でアミド結合が形成される。］；
   −配列番号３：
   シクロ（ＫＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＧ）
   ［式中、Ｎ末端のリジン残基の側鎖のε−炭素原子に結合しているアミノ基とＣ末端のグリシン残基のカルボキシ基との間でアミド結合が形成される。］；
   −配列番号４：
   シクロ（オルニチン−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＧ）
   ［式中、Ｎ末端のオルニチン残基の側鎖のδ−炭素原子に結合しているアミノ基とＣ末端のグリシン残基のカルボキシ基との間でアミド結合が形成される。］；
   −配列番号５：
   シクロ（４−アミノ酪酸−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＤ）
   ［式中、Ｎ末端の４−アミノ酪酸残基のアミノ基とＣ末端のアスパラギン酸残基のβ−炭素原子に結合している側鎖カルボキシ基との間でアミド結合が形成される。］；および
   −配列番号６：
   シクロ（β−アラニン−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＥ）
   ［式中、Ｎ末端のβ−アラニン残基（３−アミノプロパン酸残基）のアミノ基とＣ末端のグルタミン酸残基のγ−炭素原子に結合している側鎖カルボキシ基との間でアミド結合が形成される。］
   のアミノ酸配列のペプチドから選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬。
5. スプレーされるエアロゾルの粒径が、≦５μｍの直径を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬。
6. 肺機能を改善するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬。
7. 肺浮腫の治療のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬。
8. 請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬が含有する水性エアロゾルの調製方法であって、
   添加剤および安定化剤を伴わない、酢酸塩の形態である請求項１に定義される前記式Ｉの環状ペプチドの凍結乾燥物を水に溶解する工程、および
   得られた水溶液を、添加剤および安定化剤を伴わずに、スプレーする工程を含む、調製方法。
9. 請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬を、ドナー肺に生体外でスプレーする、肺機能を改善するための体外方法。