KR102113501B1 - 식 ｘ₁－ｇｑｒｅｔｐｅｇａｅａｋｐｗｙ－ｘ₂의 고리 펩티드를 포함하는 제약 조성물 및 체외 폐 치료를 위한 사용 - Google Patents

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Abstract

식 X1-GQRETPEGAEAKPWY-X2의 아미노산 서열의 고리 화합물로 폐의 생체외 처리에 의해서 체외 방식으로 폐기능을 조정/개선하는 방법(여기서 X1은 천연 또는 비천연 아미노산을 포함하는 1 내지 4 멤버를 가진 아미노산(서열)을 포함하고, X2는 천연 아미노산으로부터 선택된 하나의 아미노산을 포함한다), 및 흡입을 위한 에어로졸을 얻기 위한 분무에 적합한, 또는 흡입에 적합한, 분무시 에어로졸을 얻기 위한 분무의 준비에 적합한 형태로 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 정의된 식 I의 펩티드를 포함하는 제약 조성물.

Description

식 Ｘ₁－ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹ－Ｘ₂의 고리 펩티드를 포함하는 제약 조성물 및 체외 폐 치료를 위한 사용{PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING A CYCLIC PEPTIDE OF FORMULA X₁－GQRETPEGAEAKPWY－X₂ AND USE FOR EXTRACORPOREAL LUNG TREATMENT}
본 발명은 이식 전에 폐기능을 조정/개선하기 위한 체외 폐 치료를 위한 과정에 관한 것이다.
폐의 경우 삶의 질을 높이거나 심지어 수혜자의 생존 기간을 늘리기 위해서 이식 부분이나 질환이 있는 전체 폐가 사망한 기증자의 건강한 폐로 대체된다. 폐 이식에서 가장 흔한 처방은 폐기종, 특발성 폐섬유화증 및 낭성 섬유증을 포함하는 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)이다. 다른 처방은 알파1-항-트립신 결핍 폐기종, 특발성 폐동맥 고혈압, 및 사르코이드증을 포함한다. 폐 기증자 및 수혜자의 평균 연령은 각각 35세 및 50세 근처이다. 조정되지 않은 비교평가를 위한 생존율은 성인 폐 이식시 3개월 약 90%이고 10년 약 30%이다. 전체 평균 생존율(또는 "반감기")는 현재 약 5.5년이다. 30일 이내 및 최초 1년 내에 성인 수혜자에서 폐 이식 후 사망의 주요 원인은 이식편 부전과 비-시토메갈로바이러스 감염이다. 1년 후에는 폐쇄성세기관지염(BOS)이 이환율 및 사망률의 또 다른 주요 위험 요인이 된다(Am J Respir Crit Care Med. 2011 Nov 1;184(9):1055-61).
임계 허혈 기간 후 장기에 혈액 공급의 회복은 재관류 손상(RI)이라고 하는 장기의 실질 손상 및 기능부전을 가져온다. 허혈 재관류 손상(IRI)은 장기 이식, 중요 장기 절제 및 쇼크시에 주로 보인다. 폐 보존 개선 및 수술 기술과 수술 도중 관리의 개선에도 불구하고 허혈 재관류-유도 폐 손상은 폐 이식 후 조기 이환율 및 사망률의 중요한 원인으로 남아있다. 이 증후군은 전형적으로 이식 후 최초 72시간 이내에 발생하며, 비특이적 폐포 손상, 폐부종 및 저산소증을 특징으로 한다. 임상 스펙트럼은 흉부 엑스선 상의 적은 침윤과 관련된 경증 저산소증에서부터 양압 환기, 약물 요법, 및 때로 체외 막 산소처리를 요하는 매우 심한 상태까지의 범위일 수 있다(King RC et al, Ann Thorac Surg. 2000 Jun;69(6):1681-5). 이 증후군을 설명하기 위해 많은 용어가 사용되었지만 허혈 재관류 손상이 가장 흔히 사용되며, 이때는 가장 심한 형태의 손상으로 인한 1차 이식편 부전이 있고, 이것은 빈번히 사망이나 72시간을 넘는 연장된 기계적 환기를 초래한다. 조기 수술 후 기간 내의 유의한 이환율 및 사망률에 더하여, 중증 허혈 재관류 손상은 또한 급성 거부반응의 증가된 위험과 관련될 수 있으며, 이것은 장기간의 이식편 기능부전을 초래할 수 있다(Fiser SM et al, Ann Thorac Surg. 2002 Apr;73(4):1041-7; discussion 1047-8).
IRI는 이 상태에 대한 주 기준으로서 불량한 산소처리를 특징으로 하며, 또한 낮은 폐 순응성, 간질/폐포 부종, 흉부 방사선사진 상의 폐 침윤, 증가된 폐 혈관 내성, 폐내 션트 및 급성 폐포 손상을 특징으로 하는데, 이것은 병리학 상의 확산성 폐포 손상(IDAD)에 의해서 드러난다. 임상적으로 환자는 연장된 환기, 연장된 ICU 및 종합병원 입원, 증가된 의료 비용, 및 이환율과 사망률의 증가된 위험에 직면한다.
폐 이식은 의학적 관리가 어려운 말기 폐질환으로 고통받는 환자를 위한 주된 요법이 된다. 그러나, 폐 이식을 위해 등록된 환자의 수는 이용가능한 기증자를 훨씬 초과한다. 전세계적으로 뇌사 기능자로부터 제공된 폐의 단지 15 내지 20%만이 사용되며, 80%의 폐는 기증자 선택 기준을 충족하지 못하므로 거부된다. 기증자 폐의 손상은 불량한 가스 교환이나 흉부 엑스선 침윤과 같은 임상 소견에 의해서 나타나며, 이것은 이식편 기능부전 및 이식 후 부전을 초래할 수 있다. 기증자 폐의 수를 증가시키기 위해 많은 전략이 대두되었다. 일부 폐 이식은 살아있는 관련된 폐 기증자 프로그램과 연계되지만, 다른 것은 기증자의 부족을 해소하는데 궁극적으로 도움을 주는 전략으로서 심장 박동을 멈춘 기증자에게 집중된다. 살아있는 관련된 기증자의 것이 동일한 센터에서 성공적으로 사용되었고, 심장 박동을 멈춘 기증자의 것이 사람에게 사용가능한 것으로 나타났지만, 전체적인 이들 전략은 기술적, 의학적 및 윤리적 고려사항으로 인해 소수의 환자에게 제한적으로 적용되었다.
기증자 폐의 확장된 사용이 지난 10년에 걸친 전체적인 폐 이식 활동의 점진적 증가를 초래했지만, 일부 연구는 이들 폐의 관대한 사용이 더 긴 ICU 입원, 더 높은 조기 사망률 및 악화된 1년차 폐활량측정을 초래할 수 있음을 증명했다(Kawut SM et al, Transplantation. 2005 Feb 15;79(3):310-6; Pierre AF et al, J Thorac Cardiovasc Surg. 2002 Mar;123(3):421-7; 4, 5).
따라서, 각 기증자는 개별적으로 주의깊게 고려되며, 이식을 위해 확장된 기증자 폐를 선택하는데 있어서 고려할 수 있는 위험이 대기 목록에 올라가 있는 수혜자의 사망 위험과 항상 견주어져야 한다. 기증자 폐의 정확한 평가는 이식에 안전하게 사용될 수 있는 장기를 선택하는 핵심 요소이다. 불행하게도 현재 임상 기증자 선택 기준을 사용한 이식 후 결과 예측은 부정확하며, 흉부 방사선사진 평가 및 기관지내시경 소견과 같은 일부 기준은 아주 주관적이다. 이식 후 결과를 결정하는데 있어서 임상 변수의 부정확성은 때로 알아차리지 못한 손상을 가진 폐의 사용을 초래하고, 이것은 심각한 1차 이식편 기능부전(PGD)을 초래한다. 더 중요한 것은 이식에 대해 현재 임상적으로 거부된 폐의 약 40%가 장기의 더 상세한 평가가 가능했다면 안전하게 이용되었을 거라는 점이다(Ware LB et al, Lancet. 2002 Aug 24;360(9333):619-20). 이들 폐는 총 기증자 폐 이용율을 유의하게 증가시킬 것이다.
심정지 후 기증자로부터의 폐를 사용하기 위한 일반적인 아이디어에 기초하여 "생체외" 재관류(EVLP) 기술이 "생체내" 평가될 수 없는 폐의 폐기능을 평가하기 위해 사용될 수 있다. "생체외" 평가의 60 내지 90분의 짧은 기간 후, 기증된 폐가 사람 폐 이식에 성공적으로 사용될 수 있다(Steen S et al, Ann Thorac Surg. 2007 Jun;83(6):2191-48;Ingemansson R et al, Ann Thorac Surg. 2009 Jan;87(1): 255-60).
다른 연구들도 또한 동물 모델과 임상적으로 부적합한 사람 폐에서 폐기능을 평가하기 위해서 충분한 용액을 사용한 단기 "생체외" 관류의 가능성을 실험적으로 증명했다(Rega FR et al, Ann Surg. 2003 Dec;238(6):782-92; Erasmus ME et al, Transpl Int. 2006 Jul;19(7):589-93; Egan TM et al, Ann Thorac Surg. 2006 Apr; 81(4):1205-1310-12).
폐 이식이 뒤따르는 EVLP 기술의 이 개념은 임상 실습에도 성공적으로 전달되었다. 그러나, 현재까지 EVLP는 기증자의 폐기능을 "생체외" 평가하는데만 사용되고 있고, EVLP는 기증자의 폐를 재조정하고 및/또는 폐에 치료 활성 약물을 투여하기 위해서는 사용된적이 없다.
여기 예시된 펩티드는 하기 간행물에 이미 제약으로서 개시된다:
- WO 2006/013183(폐 계면활성제와 함께 펩티드의 투여),
- WO 2010/099556(과투과성의 치료),
- WO 2011/085423, (폐 또는 비경구 용도) 설명됨,
- Parastoo et al, J.Med.Chem. 2010, 53, 8021-8029(A549 세포에서 아밀로라이드-감응 나트륨 흐름의 활성화).
그러나, 체외 폐 치료는 이들 간행물 중 어느 것에도 설명되지 않는다.
Vadasz et al, Crit Car Med 2008, vol 36 no. 5, 1543-1550 및 Elia et al, Am J Resp and Crit Car Med 2003, vol 168,Nr. 9, 1043-1050에서 동물 모델이 설명되는데, 여기서 폐는 사용된 펩티드의 활성을 나타내기 위해 체외 방식으로 치료된다. 폐기능과 그렇게 치료된 폐의 수혜자에의 이식을 개선하기 위한 체외 치료는 제시되지도 의도되지도 않는다. 더욱이, 이들 간행물에 따라서 사용된 폐는 상피/내피 장벽으로 인해 재이식에 부적합하다.
이제 놀랍게도 기증자의 폐가 이식 전에 "생체외" 관류되고 환기될 수 있다는 것과 이러한 생체외 치료된 폐는 이식 전 폐의 환기 성능을 개선하기 위해 생체활성 화합물의 투여에 의해서 이식 전에 조정될 수 있다는 것이 발견되었다.
한 양태에서, 본 발명은 식 I의 아미노산 서열의 고리 화합물로 폐를 생체외 치료하는 것을 포함하는 체외 방식으로 폐기능을 조정/개선하는 방법을 제공한다:
X1-GQRETPEGAEAKPWY-X2 ( I)
여기서
X1은 천연 또는 비천연 아미노산을 포함하여 1 내지 4, 특히 1 내지 3 멤버의 아미노산(서열)을 포함하며, 특히 아미노산(서열) C, KSP, K, 오르니틴, 4-아미노 부탄산, β-알라닌으로부터 선택되고,
X2는 천연 아미노산, 특히 C, D, G 및 E 그룹으로부터 선택된 하나의 아미노산을 포함하고,
여기서 X1은 처음 왼쪽 위치에 있는 N-말단 아미노산을 포함하고, X2는 마지막 오른쪽 위치에 있는 C-말단 아미노산을 포함한다.
본 발명의 방법의 아미노산 서열에 유용한 천연 아미노산은 알려져 있으며, 예를 들어 G, A, V, L, I, M, P, F, W S, T, N, Q, C, U, Y, D, E, H, K, R을 포함한다.
본 발명의 방법의 아미노산 서열에 유용한 비천연 아미노산은 다음을 포함한다:
- 천연 아미노산의 주 화학 구조를 갖지만 알파 아미노산이 상이한 아미노산,
- D-형태, 즉 천연 L-형태 이외의 다른 천연 아미노산, 즉 알킬기가 L-형태로 존재하지 않고 D-형태로 존재하는 천연 아미노산,
- 예를 들어 피롤린일 , 인돌일 , 이미다졸일을 포함하는 페닐과 같은 다른 고리와 선택적으로 융합된, 선택적으로 천연 아미노산에도 존재하는 치환체, 예를 들어 OH, - CONH 2 ,-NH- C(=NH 2 )NH 2 , SH , (C 1- 4 )알킬 -S-, 페닐, N, O, S로부터 선택된, 바람직하게 N인, 적어도 하나의 헤테로원자, 예를 들어 하나 또는 2개의 N을 포함하며, 예를 들어 5 또는 6 고리 멤버를 포함하는 헤테로시클릴에 더하여, 2 내지 12, 예컨대 2 내지 6 탄소 원자, 적어도 하나, 예를 들어 하나 또는 2개의 아미노기, 및 적어도 하나, 예를 들어 하나 또는 2개의 카복시기를 포함하는 비천연 아미노산.
본 발명의 방법의 아미노산 서열의 비천연 아미노산은 오르니틴, 4-아미노부티르산, β-알라닌을 포함한다.
다른 양태에서, 식 I의 아미노산 서열의 고리 화합물은 다음을 포함한다:
- 서열 SEQ ID NO:1
시클로(CGQRETPEGAEAKPWYC)
여기서 양 말단 시스테인 잔기기 이황화 브릿지를 형성한다;
- 서열 SEQ ID NO:2
시클로(KSPGQRETPEGAEAKPWYE)
여기서 아미드 결합이 N-말단 리신 잔기의 ε-탄소 원자에 부착된 아미노기와 C-말단 글루탐산 잔기의 γ-탄소에 부착된 측쇄 카복실기 사이에 형성된다;
- 서열 SEQ ID NO:3
시클로(KGQRETPEGAEAKPWYG)
여기서 아미드 결합이 N-말단 리신 잔기의 측쇄의 ε-탄소 원자에 부착된 아미노기와 C-말단 글리신 잔기의 카복실기 사이에 형성된다;
- 서열 SEQ ID NO:4
시클로(오르니틴-GQRETPEGAEAKPWYG)
여기서 아미드 결합이 N-말단 오르니틴 잔기의 측쇄의 δ-탄소에 부착된 아미노기와 C-말단 글리신 잔기의 카복실기 사이에 형성된다;
- 서열 SEQ ID NO:5
시클로(4-아미노부탄산-GQRETPEGAEAKPWYD)
여기서 아미드 결합이 N-말단 4-아미노부탄산 잔기의 아미노기와 C-말단 아스파르트산 잔기의 β-탄소에 부착된 측쇄 카복실기 사이에 형성된다; 및
- 서열 SEQ ID NO:6
시클로(β-알라닌-GQRETPEGAEAKPWYE)
여기서 아미드 결합이 N-말단 β-알라닌(3-아미노프로판산) 잔기의 아미노기와 C-말단 글루탐산 잔기의 γ-탄소에 부착된 측쇄 카복실기 사이에 형성된다.
서열 SEQ ID NO:7
시클로(CGQREAPAGAAAKPWYC)
여기서 이황화 브릿지가 양 말단 시스테인 잔기 사이에 형성되며, 이 서열은 단지 비교를 위해 제조되었고, 본 발명의 일부를 형성하지 않는다.
본 발명에 따른 방법에서 유용한 고리 화합물은 본원에서 "본 발명의(에 따른) 고리 화합물(들)"이라고 지칭되며, 예를 들어 자유 형태 및 염 형태 등, 어떤 형태의 화합물을 포함하고, 예를 들어 생물학적 환경에서 본 발명의 화합물은 통상 염의 형태로 존재한다.
다른 양태에서, 본 발명의 고리 화합물은 염의 형태이다.
이러한 염은 바람직하게 제약학적으로 허용되는 염을 포함하지만, 예를 들어 제조/분리/정제 목적을 위한 제약학적으로 허용되지 않는 염들도 포함된다.
생물학적 환경에서 본 발명의 고리 화합물의 염은 통상 염산염이다.
본 발명의 고리 화합물은 자유 형태에서 염 형태의 상응하는 고리 화합물로 전환될 수 있으며, 그 반대도 가능하다.
본 발명의 고리 화합물은 이성질체 및 이들의 혼합물, 예를 들어 광학 이성질체의 형태로 존재할 수 있다. 본 발명의 고리 화합물은, 예를 들어 비대칭 탄소 원자를 함유할 수 있고, 따라서 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체 및 이들의 혼합물, 예를 들어 라세메이트의 형태로 존재할 수 있다. 본 발명의 고리 화합물은 본 발명의 고리 화합물에 있는 이러한 비대칭 탄소 원자에서의 치환체에 관하여 각각 (R)-, (S)- 또는 (R,S)-형태, 바람직하게 (R)- 또는 (S)-형태로 존재할 수 있다. 이성질체 혼합물은 적절하게, 예를 들어 종래의 방법에 따라서, 예를 들어 유사한 방법으로 분리될 수 있으며, 이로써 순수한 이성질체가 얻어진다. 본 발명은 어떤 이성질체 형태 및 어떤 이성질체 혼합물인 본 발명의 화합물을 포함한다. 천연 아미노산의 경우 치환체의 형태는 천연 아미노산에서와 같다.
본 발명의 고리 화합물은 적절하게, 예를 들어 종래의 방법에 따라서, 예를 들어 유사한 방법으로, 또는 본원에 명시된 대로, 예를 들어 고체상 펩티드 합성에 의해서, 선택적으로 적절한 커플링제, 예컨대 디이소프로필 카보디이미드 및/또는 N-하이드록시벤조트리아졸 및 적절한 용매, 예를 들어 N,N-디메틸포름아미드를 사용하여 2-클로로트리틸클로라이드 수지 상에서 플루오렌일메톡시카보닐/t-부틸 보호 전략에 따라서 제조될 수 있다. 보호된 아미노산은 C-말단 아미노산에서 시작하여 펩티드 사슬에 연속 커플링될 수 있다. 플루오렌일메톡시카보닐-보호된 기로부터의 탈보호는 적절한 용매 중에서 피페리딘과 같은 염기를 사용하여, 예컨대 N,N-디메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘을 사용하여 수행될 수 있다. 수지로부터 완료된, 선택적으로(부분적으로) 보호된 펩티드의 절단은 적절하게, 예를 들어 할로겐화 탄화수소, 예컨대 CH2Cl2와 같은 적절한 용매 중에서 아세트산과 같은 산을 사용하여, 예를 들어 아세트산과 CH2Cl2의 1:1 혼합물에서 수행될 수 있다.
시스테인-함유 펩티드의 경우, 수지로부터의 절단 후, 필요하다면 측쇄 탈보호가, 예를 들어 트리플루오로아세트산(TFA)과 같은 강산을 사용하여, 예를 들어 95% TFA/5% H2O에서 수행될 수 있다. 이황화 결합을 얻기 위한 고리화는 말단 시스테인 잔기의 산화에 의해서 수행될 수 있으며, 예를 들어 90시간 동안 pH 8.5에서 조 선형 펩티드의 공기처리에 의해 달성될 수 있다. 얻어진 조 펩티드 생성물은, 예를 들어 크로마토그래피에 의해서, 예를 들어 RP-C18-실리카겔 칼럼과 같은 적절한 칼럼에서 역상 중간 압력 액체 크로마토그래피(RP-MPLC)에 의해서, 5% 내지 40% 수성 아세토니트릴의 구배와 같은 용출 구배를 편리하게 사용하여 정제될 수 있다.
트리플루오로아세테이트 카운터 이온은, 예를 들어 Lewatit MP64 칼럼(아세테이트 형태)과 같은 칼럼에서 아세테이트로 치환될 수 있다. 물로 최종 세척 후, 아세테이트 염으로서 정제된 펩티드는 동결건조될 수 있고, 흰색과 같은 연한 색의 분말 형태로 얻어질 수 있다.
시스테인-무함유 펩티드의 경우, 고리화 단계가 적절하게, 예를 들어 수지로부터 절단 후 부분적으로-보호된 선형 펩티드 상에서 수행될 수 있다. 시스테인-무함유 펩티드의 선택적 고리화 후, 필요하다면 TFA에서 측쇄 탈보호가 수행될 수 있다. 정제 단계는, 예를 들어 크로마토그래피를 통해서, 예를 들어 예비 RP-MPLC에 의해서 수행될 수 있다. 이렇게 얻어진 펩티드로부터 아세테이트에 의한 트리플루오로아세테이트 이온의 치환이, 예를 들어 상기 설명된 대로 수행될 수 있다. 또한, 펩티드의 아세테이트 형태의 동결건조가, 예를 들어 시스테인-함유 펩티드에 대한 것처럼 수행될 수 있다.
얻어진 펩티드의 분자 질량은 전자분무 이온화 질량분광기 또는 MALDI-TOF-MS에 의해서 확인될 수 있다. 순도는, 예를 들어 분석 고성능 액체 크로마토그래피에 의해서 결정될 수 있다.
예를 들어 식 I의 화합물을 포함하는 본 발명의 고리 화합물은 흥미로운 약학적 활성을 나타내며, 따라서 제약으로서 유용하다. 예를 들어, 실시예에서 나타낸 연구 결과는 본 발명의 고리 화합물의 흡입 적용시 역학적 폐 순응성과 동맥-정맥 pO2 차이인 ΔpO2가 폐에서 모두 개선된 것을 증명했다. 또한, 본 발명의 고리 화합물을 투여했을 때 세포 나트륨 이온 전류가 증진되었던 것으로 나타났다. 놀랍게도 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6을 가진 화합물과 비교하여 아미노산 서열 SEQ ID NO:7을 가진 화합물에서 다소 유사한 아미노산 서열에도 불구하고, 아미노산 서열 SEQ ID NO:7을 가진 화합물은 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6을 가진 화합물이 우수한 활성을 나타냈던 분석에서 활성을 나타내지 않았다.
따라서, 본 발명의 고리 화합물은, 예를 들어 이식 전에 폐기능을 체외 방식으로 조정/개선하기 위해 처방된다.
놀랍게도 본 발명의 고리 화합물의 투여는 흡입 투여에 의해, 예를 들어 흡입 투여에 적합한 투여, 즉 폐 조직 위에 무화(분무)에 의해 잘 수행될 수 있는 것으로 판명되었다.
놀랍게도 폐 조직을 통해 혈액으로 본 발명의, 예를 들어 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6(중 하나)을 가진 고리 화합물의 능동적 또는 수동적 수송은 바람직하지 않고 일어나지 않아야 하는 것으로 판명되었는데, 고리 화합물이 경구 흡입을 통해 폐 기공에 도달해서 폐 조직의 표면 위에 고립되어 정점-배향된 아밀로라이드-감응 나트륨 이온 채널을 활성화할 수 있다면, 그것은 본 발명의, 예를 들어 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 고리 화합물의 생리학적 효능에 상당한 정도로 기여하기 때문이다.
이것을 위하여, 먼저 본 발명의, 예를 들어 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SDQ ID NO:6(중 하나)의 고리 화합물을 물에 용해하여 수성 용액을 얻고, 예를 들어 불순물을 제거하기 위해, 얻어진 용액을 선택적으로 여과한다. 얻어진 여과액은, 예를 들어 저장 형태가 바람직한 경우에는 선택적으로 동결건조된다. 놀랍게도 이렇게 얻어진 본 발명의 동결건조된 고리 화합물은 장기간 동안 안정한 것으로 판명되었다. 상대습도 60%에서 2 내지 8℃에서 최대 24개월 및 25℃에서 최대 6개월 후 동결건조물의 안정성이 결정되었다. 이것을 위하여, 일반적인 실험실 분석 방법, 예를 들어 육안 검사 및 역상 HPLC가 사용되었다.
또한, 2 내지 8℃에서 24개월 저장 후 패치 클램프 실험을 통해 사멸된 생물학적 활성을 결정했다. 동결건조물은 설명된 조건에서 안정한 것으로 판명되었고, 외형은 변화가 없었으며, 식 I의 고리 펩티드의 함량 및 순도는 아주 적은 변동을 나타냈다. 또한, 생물학적 활성은 실질적으로 변화 없이 유지되었다.
아미노산 서열 SEQ ID NO:1을 가진 고리 화합물의 수성 용액의 안정성 조사 결과가 아래 표에 제시된다.
변수 실험실 주사기
온도 2 내지 8℃ 		분무기 저장 탱크
온도 25℃
T=0 T=7일 T=0 T=24일
외형 투명한 용액 투명한 용액
양/함량 25mg/ml 25mg/ml
순도 96.3% 96.2% 96.6% 96.5%
분무기의 도움하에 식 I의, 즉 아미노산 서열 SEQ ID NO:1의 고리 화합물의 수성 용액을 에어로졸로 전환했다. 수성 용액을 3개의 상이한 분무기로 분무한 후 소적의 입자 크기를 측정했고, 이것은 아래 표에 제시된다.
분무기 평균입자직경 φ≤ 5μm의 입자량
타입 A 4.7μm 50%
타입 B 3.3μm 70%
타입 C 3.7μm 65%
에어로졸로서 흡입 후 폐 조직에 식 I의 고리 화합물이 존재했지만 혈액에는 실질적으로 존재하지 않았다는 증거가 적절한 실험에 의해서 제공될 수 있다. 비경구 투여에서는 식 I의 고리 화합물이 혈액에 존재했다는 것이 판명되었다.
예를 들어 에어로졸 형태로 흡입/분무에 의한 투여를 위해, 제1 용해 단계로부터의 수성 용액이나, 또는 물에 재용해된 얻어진 동결건조물이 에어로졸을 얻기 위해, 예를 들어 분무기를 사용하여 분무(무화)될 수 있다. 놀랍게도, 예를 들어 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6(중 하나)의 본 발명의 고리 화합물의 수성 용액은 또한 일반적으로 사용되는 안정제 및/또는 보조제의 첨가 없이도 다소 오랜 시간 동안 안정하다는 것이 판명되었다. 또한, 본 발명의 용해된 고리 화합물을 포함하는 증발된 소적의 크기도 유익한 영향을 가질 수 있는 것으로 판명되었다. 예를 들어, 바람직한 구체예에서, (대부분의) 무화된 소적의 소적 크기는 5μm(상한)를 초과하지 않으며, 이로써 특히 성공적인 결과가 얻어질 수 있다. 소적 크기의 적합한 하한은 소적의 실현가능성에만 의존한다.
도 2a 및 도 2b에 도시된 대로, 폐 이식을 모사한 체외 시스템에서 돼지 폐의 폐기능에 대한, 특히 SEQ ID NO:1을 가진 본 발명의 고리 화합물의 효과에 따른 연구에서, 흡입/분무에 의한, 즉 에어로졸의 사용에 의한 투여를 통해서 역학적 폐 순응성뿐만 아니라 동맥-정맥 pO2 차이인 ΔpO2가 개선되었다는 것이 나타났다.
다른 양태에서, 본 발명은 에어로졸을 얻기 위한 분무(흡입)에 적합한, 또는 에어로졸의 제조에 적합한 형태로, 한, 예를 들어 적어도 하나의 식 I의 펩티드를 포함하는 제약 조성물을 제공하며, 이 에어로졸은 분무(흡입)에 적합하고, 예를 들어 소적의 크기가 5μm를 초과하지 않는다.
본 발명에 의해서 제공된 에어로졸에서는 안정제나 다른 보조제의 존재가 필요하지 않다는 것이 놀라웠다.
도 1은 적용된 농도에 의존하는 형태로 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 고리 펩티드의 활성을 나타낸다. SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 고리 단백질의 nM(로그 규모) 농도가 x-축에 표시되고, y-축은 나트륨 이온 전류 %이다.
도 2는 폐 이식을 모사한, 체외 폐 관류(생체외) 동안 SEQ ID NO:1의 펩티드의 흡입 적용 결과를 나타낸다. 도 2a에서 x-축에는 시간 포인트 T1 내지 T4가 표시되며, 여기서 측정은 매시간 이루어졌고, y-축에는 순응성이 표시된다. 도 2b에서 x-축에는 다시 시간 포인트 T1 내지 T4가 표시되고, y-축에는 동맥-정맥 pO2 차이 ΔpO2가 표시된다. 측정은 펩티드 SEQ ID NO:1의 흡입 투여 후 매시간 1회 수행되었다. 주사용수(WFI)가 대조군으로 사용되었다. 그룹당 8회 실험의 평균을 나타낸다.
다음의 실험에서 모든 온도는 ℃이다(섭씨).
실시예 1
펩티드 합성
모든 펩티드는 2-클로로트리틸클로라이드 수지 상에서 플루오렌일메톡시카보닐/t-부틸 보호 전략에 따라서 고체상 펩티드 합성에 의해서 합성했다. 디이소프로필 카보디이미드와 N-하이드록시벤조트리아졸을 커플링 시약으로 사용했다. 모든 커플링 단계는 N,N-디메틸포름아미드에서 수행되었다. 보호된 아미노산은 C-말단 아미노산에서 시작하여 펩티드 사슬에 연속 커플링되었다. 플루오렌일메톡시카보닐의 탈보호를 N,N-디메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘에서 수행했다. 수지로부터 완료된, 부분적으로-보호된 펩티드의 절단을 아세트산과 디클로로메탄의 1:1 혼합물에서 수행했다. 시스테인-함유 펩티드의 경우, 수지로부터의 절단 후 측쇄 탈보호를 95% 트리플루오로아세트산 5% 물에서 수행하고, 이어서 말단 시스테인 잔기의 산화에 의한 고리화를 90시간 동안 pH 8.5에서 조 선형 펩티드의 공기처리에 의해서 달성했다. 조 펩티드 생성물을 5%-40% 아세토니트릴의 구배로 RP-C18-실리카 겔 칼럼에서 역상 중간 압력 액체 크로마토그래피(RP-MPLC)에 의해서 정제했다. 마지막으로, 트리플루오로아세테이트 카운터-이온을 Lewatit MP64 칼럼(아세테이트 형태)에서 아세테이트로 치환했다. 물에서 마지막 세척 후, 아세테이트 염으로서 정제된 펩티드를 동결건조해서 흰색 내지 회백색 분말을 얻었다. 시스테인-무함유 펩티드의 경우, 2-클로로트리틸클로라이드 수지로부터 절단 후 부분적으로-보호된 선형 펩티드에서 고리화 단계를 수행했다. 시스테인-무함유 펩티드의 선택적 고리화, 트리플루오로아세트산에서 측쇄 탈보호, 이어서 예비 RP-MPLC 후, 아세테이트로 트리플루오로아세테이트의 치환 및 펩티드의 아세테이트 형태의 동결건조를 시스테인-함유 펩티드와 마찬가지로 수행했다. 펩티드의 분자 질량을 전자분무 이온화 질량분광기 또는 MALDI-TOF-MS로 확인했고, 순도를 분석 고성능 액체 크로마토그래피로 결정했다. 펩티드 SEQ ID NO:1의 순도는 96.3%였다. m/z (ESI) 1924.2 (M++1). 펩티드 SEQ ID NO:2의 순도는 96.3%였다. m/z (ESI) 1924.2 (M++1). 펩티드 SEQ ID NO:3의 순도는 98.8%였다. m/z (ESI) 1888.2 (M++1). 펩티드 SEQ ID NO:4의 순도는 97.4%였다. m/z (ESI) 1873.4 (M++1). 펩티드 SEQ ID NO:5의 순도는 100%였다. m/z (MALDI-TOF) 1901.6 (M++1). 펩티드 SEQ ID NO:6의 순도는 100%였다. m/z (MALDI-TOF) 1902.7 (M++1). 펩티드 SEQ ID NO:7의 순도는 95%였다. m/z (MALDI-TOF) 1778.02 (M++1).
실시예 2
본 발명의 고리 화합물의 생체활성의 평가
계대 80-90의 사람 상피 셀라인 A549(ATTAC Nr. CCL-185)에 대해 실험을 수행했다. 세포를 10% 태아 소 혈청으로 보충된 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 듈베코 변형 이글 배지/영양 혼합물 F12 Ham에서 성장시켰다. 모든 배양 배지는 Sigma-Aldrich GmbH(미주리 세인트루이스)에서 구입했다.
나트륨 이온 전류 상에서 펩티드 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:7의 생체활성을 평판 후 24 내지 48시간에 실온(19-22℃)에서 A549 세포에서 연구했다. 전-세포 방식으로 패치 클램프 방법을 사용하여 전류를 기록했다. 배양된 세포가 있는 유리 커버 슬립을 1mL 용량의 챔버로 옮겨서 반전 현미경 대(Zeiss, Axiovert 100) 위에 장착했다. 챔버는 다음 조성의 욕 용액 1mL를 함유했다(mM 단위): 145 NaCl, 2.7 KCl, 1.8 CaCl2, 2 MgCl2, 5.5 글루코오스 및 10 HEPES, 1M NaOH 용액으로 pH 7.4로 조정. Flaming Brown 마이크로피펫 풀러(P87, Sutter Instruments, 미국 캘리포니아)로 얇은 벽의 붕규산염 유리 모세관(World Precision Instruments, Inc., 미국 플로리다)으로부터 마이크로피펫을 풀링하고 마이프로포지(Narishige, 일본 도쿄) 위에서 폴리싱하여 2.0 내지 3.5MΩ 범위의 전극 저항을 얻었다. 피펫 용액은 다음을 함유했다(mM 단위): 135 칼륨메탄설포네이트, 10 KCl, 6 NaCl, 1 Mg2ATP, 2 Na3ATP, 10 HEPES 및 0.5 EGTA(에틸렌글리콜테트라아세트산), 1M KOH 용액으로 pH 7.2로 조정. 피펫 및 욕 용액의 화학제품은 Sigma-Aldrich(오스트리아 비에나)에서 공급받았다. Axopatch 200B 패치 클램프 증폭기(Axon Instruments, 미국 캘리포니아)를 사용하여 전기생리학 측정을 수행했다. 커패시티 트랜지언트를 취소하고, 직렬 저항을 보상했다. 전 세포 전류를 5kHz에서 필터링하고 10kHz에서 샘플링했다. 데이터 취득 및 저장은 pCLAMP 10.0 소프트웨어(Axon Instruments, 미국 캘리포니아)가 장착된 PC에서 직접 처리했다.
GΩ-시일 형성 후, 5분의 평형 기간 후에 20mV 증분씩 -100mV에서 +100mV까지 고정 전위(Eh)에서 각 Eh에서 1분 동안 대조군 기록했다. 다음에, 증류수로 스톡 용액의 알리쿼트를 제조하고, 이것을 욕 용액에 누적 첨가하여, 펩티드 SEQ ID NO:1 내지 6의 3.5 내지 240nM 범위의 농도를 만들었다. 세척 단계를 약 1분 지속했다. 정류 상태에 도달한 후, 대조군 기록 동안 동일한 실험 프로토콜을 펩티드의 각 농도에 적용했다. SigmaPlot 9.0을 사용하여 -100mV의 Eh에서 기록된 전류에 대해 농도 반응 곡선과 EC50 값을 피팅하고 추산했다. 스튜던트 t-테스트에 의해서 통계적 유의성(P<0.05)에 대해 EC50의 차이를 계산했다. 이온 선택성의 평가를 위해, 10 내지 100μM 아밀로라이드 염산염 수화물로 나트륨 이온 전류를 차단한 후, 펩티드 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:7을 첨가했다. 이어서 10mM 테트라에틸암모늄 클로라이드(TEA)의 첨가는 전류의 어떤 관찰된 증가가 칼륨 전류 때문이었는지의 여부를 나타냈다. 이들 실험을 Eh = -100mV에서도 수행했다.
전 세포 기록을 사용하여 패치 클램프 분석에서 측정된 나트륨 이온 전류에 대한 펩티드 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:7의 효과를 결정한 결과가 표 1에 제시되며, 이것은 전 세포 기록 방식을 사용하여 A549 셀라인을 사용한 패치 클램프 분석에서 세포 나트륨 이온 전류에 대한 펩티드 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:7의 활성을 설명한다. 이 분석에서 각 펩티드의 활성은 각 펩티드에 대해 EC50(nM 단위)로 표시되며, 여기서 EC50은 최대 활성(즉, 전류 I의 최대 증가)의 50%가 관찰되는 유효 농도이다.
펩티드 EC 50 (nM)
SEQ ID 1 54
SEQ ID 2 56
SEQ ID 3 38
SEQ ID 4 45
SEQ ID 5 24
SEQ ID 6 19
SEQ ID 7 활성 없음
펩티드 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6에 대해 전 세포 방식을 사용하여 셀라인 A549를 사용한 패치 클램프 분석으로부터 얻어진 용량 반응 곡선이 도 1에 도시되며, 나트륨 이온 전류에서 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 펩티드의 농도 반응 곡선을 볼 수 있다. 최대 나트륨 이온 전류를 100%로 설정했다. SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 모든 펩티드에 대해 최대 효과는 120nM 펩티드 농도에서 관찰될 수 있었다. 펩티드 SEQ ID NO:7은 활성을 나타내지 않았다.
실시예 3
탈글리코실화 세포 표면에서 펩티드 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:7의 효과
상기 설명된 것과 같은 전 세포 방식 실험에서, A549 세포를 패치 클림프 측정 직전에 효소 "PNGase F"(펩티드-N 4-(N-아세틸-β-D-글루코사미닐)아스파라긴 아미다아제 F) 100 유닛과 함께 1-5분 동안 인큐베이션하고, 배양된 세포가 있는 유리 커버 슬립을 외부 용액으로 헹군 후 1mL 욕의 챔버로 옮겼다. 대조군 기록 후, 240nM 펩티드 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:7을 욕 용액에 첨가했다. 전 세포 전류를 대조군 조건에서 펩티드 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:7의 첨가 후 어떤 전처리 없이 또한 PNGase F로 전처리하여 세포로부터 Eh = -100mV에서 기록했다.
전 세포 방식의 패치 클램프 분석을 사용한 탈글리코실화 실험의 결과가 표 2에 제시되며, SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:7의 펩티드에 의한 나트륨 이온 전류의 활성화에 대한 A549 세포의 탈글리코실화의 효과가 표시된다. 전 세포 전류는 Eh = -100mV에서 기록되었다. 욕 용액 중 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:7의 펩티드의 농도는 240nM였다.
대조군/펩티드 PNGase F로 전처리 PNGase F로 전처리 하지 않음
대조군 25.4 pA (n = 16)
SEQ ID NO　:1 19.6 pA (n = 3) 1073.3 ± 15.1 pA
(n = 10)
SEQ ID NO　:2 21.3 pA (n = 3)
SEQ ID NO　:3 20.6 pA (n = 3)
SEQ ID NO　:4 22.5 pA (n = 3)
SEQ ID NO　:5 22.4 pA (n = 3)
SEQ ID NO　:6 19.9 pA (n = 3)
SEQ ID NO　:7 활성 없음 활성 없음
표 4의 결과는 패치 클램프 분석 전 PNGase F에 의한 A549 세포의 전처리 는 나트륨 전류를 증진시키는 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 펩티드의 능력을 없앴 다. -100mV의 고정 전위에서 욕 용액에 펩티드를 첨가하지 않은 대조군 조건에서는 나트륨 이온 전류가 처리되지 않은 세포와 PNGase F로 전처리된 세포에서 모두 25.4pA였다. 미처리 세포에서 -100mV의 고정 전위에서 욕 용액에 펩티드 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 첨가(최종 농도 240nM)는 1,000pA 초과의 민감한 나트륨 이온 전류를 가져왔다. SEQ ID NO:7의 펩티드는 활성을 나타내지 않았다.
실시예 4
돼지에서 폐 이식 실험
뇌사 돼지를 양와위로 해서 종방향 흉골절개술을 수행했다. 심낭과 양쪽 흉강을 개방했다. 상대정맥과 하대정맥을 빙둘렀다. 우측 환기 유출관에서 펄스-스트링을 통해 유입 카테터를 폐동맥에 배치했다.
상대정맥과 하대정맥을 결찰하여 유입 폐색을, 대동맥을 클램핑해서 유출 폐색을 얻었다. 다음에, 유입 카테터를 통해서 차가운 등장 보존 용액(돼지 체중 kg당 50mL, 칼륨 이온, 나트륨 이온, 마그네슘 이온, 칼슘 이온, 염화물 이온, 덱스트란, 글루코오스, 완충 이온 함유)을 전방 플러싱해서 폐를 보존했다. 좌측 심이를 절개하여 유출을 제공한다. 이 기간 동안 50% 산소로 폐를 환기하고, 양쪽 흉강과 종격에 얼음 슬러시를 두었다.
다음 단계에 따라서 심장과 식도에서 통틀어 수거하는 외식 기술을 행했다:
a) 기도 양측 흉강에서 연조직을 절개한다.
b) 양측 폐 인대를 가로절단하고(아주 깊게, 심한 노출), VCI, 흉부 하행 대동맥 및 식도를 각각 가로절단한다.
c) 나머지 종격 유착부로부터 무디게 분리한다.
d) 기증자 폐를 완전히 들어낸 후 스테플러로 기관을 폐쇄한다.
외식 후, 폐를 거즈로 감싸서 저칼륨 덱스트란 세포외 용액으로 채운 차폐된 아이스백에 넣고 18 내지 24시간 동안 4℃에 보관했다. 온도 프로브를 용기에 잠기게 하고, 이것을 냉장고에 넣어 두었다.
생체외 폐 조정을 위해서 EVLP 기술(혈관외 폐 관류)을 사용했다. EVLP 기술에서는 기증자 폐를 펌프, 환기장치 및 필터로 이루어진 회로에 배치한다. EVLP 기술에서는 온도가 최대 37℃까지 증가될 수 있다. EVLP에서는 환기장치를 사용하여 산소를 폐로 송달한다. 펌프를 사용해서 사람 알부민과 영양분을 함유하는 세포외 용액을 폐에 관류시킨다. EVLP 동안 중요 지표에 대해 규칙적으로 폐기능이 평가될 수 있다.
돼지 폐 이식 실험을 위해서 EVLP 회로를 사람 알부민 용액 2.0 리터로 초회 자극했다. 이 세포외 용액은 최적의 콜로이드 삼투 압력을 가졌다. 회로를 탈기한 후, 폐와 연결될 때까지 초회 자극 용액을 20℃에서 순환시켰다. 헤파린, 세푸록심 메틸프레드니솔론을 관류액에 첨가했다.
깔대기 모양 실라스틱 관을 봉합하는 것으로 돼지 기증자 폐의 준비를 시작했고, 좌심방(LA) 커프에 압력 모니터 카테터를 내장하여 LA를 개방된 상태로 지탱하고 닫힌 관류 회로를 유지했다. 신뢰할만한 유효한 유출 배액을 제공하기 위해서 이어진 5-0 모노필라멘트 봉합사를 사용해서 이 관을 LA 커프에 단단히 문합시켰다. PA 크기와 일치하도록 손질한 동일한 종류의 캐뉼라를 사용해서 폐동맥(PA)에 캐뉼라를 삽입했다. 완충된 세포외 용액 500mL를 사용하여 백테이플 역행 플러시를 수행했다. EVLP 회로에 기증자 폐의 장착 전에 기관을 개방하고, 직접 기관지 흡인을 수행하여 기도를 정화했다. 기관내 튜브(크기 8mm I.D.)를 기관에 삽입해서 탯줄 테이프로 확실히 고정했다. 이후 폐를 EVLP 회로 유닛으로 옮겼다. 먼저, LA 캐뉼라를 회로에 연결하고 느린 역행 흐름을 개시하여 PA 캐뉼라를 탈기했다. 일단 탈기가 완료된 후, PA 캐뉼라를 회로에 연결하고, 실온에서 150mL/분의 관류액으로 전방 흐름을 개시했다. 다음에, 관류액의 온도를 다음 30분에 걸쳐서 37℃까지 점진적으로 증가시켰다. 32-34℃의 온도에 도달했을 때 기증자 돼지 폐의 기계적 환기를 환기장치를 사용하여 시작하고, 관류액 유속을 점진적으로 증가시켰다.
EVLP 가스의 흐름은 폐에 산소를 공급하며, 이것은 가스 교환 막을 통해 유입 관류액(86% N2, 6% O2, 8% CO2)에 이산화탄소를 제공하며, 이로써 35-45mmHg에서 유입 관류액 pCO2를 유지했다(0.5L/분 가스 흐름에서 시작하여 유입 관류액 pCO2에 기초하여 적정한다). 폐가 완전히 팽창되었을 때 AP301의 단일 용량(1mg/kg, 5mL Aqua 중에)을 표준 단일 액체 분무 시스템을 사용하여 EVLP 회로 시스템에 의해서 환기되고 관류된 기증자 돼지 폐에 적용했다.
EVLP 실험 동안 관류를 일정하게 평가했다. 다음의 기능 변수를 측정했고, 시간:폐 동맥 흐름(PAF)을 L/min 단위로 기록했다.
* (평균) 폐 동맥압(PAP): mmHg
* 좌심방 압력(LAP): mmHg
* 폐 혈관 저항성(PVR = [PAP-LAP] x 80 / PAF): dynes/sec/cm-5
* 평균, 최고 및 평탄 기도 압력(mAwP, peak AwP, platAwP): cmH2O
* 역학적 순응성(mL/cmH2O)
* 관류액 가스 분석 - 유입(PA) 및 유출(PV) PO2, PCO2 및 pH.
결과
이 연구는 폐 이식을 모사한 체외 시스템에서 폐기능에 대한 펩티드 SEQ ID NO:1의 효과를 평가했다. 연구 결과는 흡입 적용시 역학적 폐 순응성과 동맥-정맥 pO2 차이 ΔpO2가 도 2a 및 2b에 도시된 대로 SEQ ID NO:1의 펩티드로 치료된 폐에서 개선된 것을 증명했다.
SEQ ID NO:7의 펩티드의 폐 적용은 폐기능에 대한 개선 효과를 제공하지 않았다.
실시예 5
돼지에서 폐 이식 실험
실시예 4로부터 펩티드 SEQ ID NO:1로 기증자 폐의 전처리 후에 폐를 수혜자 돼지에 재이식했다. 이식된 폐의 재관류 직후 SEQ ID NO:1을 투여했다.
6번째 늑골내 공간을 통한 좌측 개흉술을 행하고, 좌측 문을 준비했다. 좌측 반기정맥을 절개 가로절단하고, 좌측 폐동맥과 좌심방을 은폐했다. 절개 후 결찰된 단부를 잡아당겨 OP 필드의 노출을 촉진할 수 있다. 우측 폐동맥과 기관지를 빙둘렀다. 좌측 폐절제를 혈관 클램프를 사용하여 수행했다. 이식 직전에 메틸프레드니솔론(500-1000mg)의 단일 정맥내 용량과 저 용량의 헤파린(100 IU/kg, 상기 참조)을 적용했다. 다음에, 기증자 폐를 기관지 문합을 위해 4-0 PDS를, 폐 동맥 및 좌심방 문합을 위해 5-0 Prolene를 사용하여 재이식했다. 돼지에서 우측 폐의 추가의 우측 폐엽(대정맥엽)에는 좌심방을 향한 2개의 정맥이 있다(하나는 대정맥엽을 위한 별도의 정맥이고, 하나는 주 우측 하부엽 정맥의 몸통에서 발생한 추가 정맥이다). 기증자 좌심방에서 이들 정맥은 근육 동맥 커프/봉합 라인의 가능성을 달성하기 위해 백테이블 분리 동안 봉합에 의해서 닫혀졌다. 좌심방의 좌측 부분의 별도의 클램핑은 중요한데, Satinsky 클램프를 위한 우측 평면을 찾는 것이 어렵기 때문이다. 좌심방의 클램핑은 돼지에서 잘 관용되지 않으며, 따라서 클램핑은 우측 자생 폐의 모세관 후 폐압을 감소시키기 위해 동맥 문합 완료 직후 해제되어야 한다. 이후 기관지 문합이 이어졌다. 동맥 문합은 폭넓은 문합과 우심실을 위한 큰 유출 영역을 보장하기 위해 수혜자 폐 몸통에서 기증자의 주요 폐 동맥과 같이 수행되었다.
혈관 문합 완료 후, 이식된 폐를 후방에서, 그리고 이어서 전방에서 표준 방식으로 플러싱했다. 이후, 동맥 클램프를 부분적으로 10분 동안 해제하여 제어된 재관류를 제공했다. 재관류시까지 국소 저체온이 계속되도록 주의했다. 표준 방식에 의해서 재관류 동안 이식된 폐에 환기를 시작했다. 관련된 그룹의 수혜자 동물에서 환기 시작시 분무(5mL Aqua 중 1mg/kg)에 의한 펩티드 SEQ ID NO:1의 투여를 시작했다.
재이식 후 흉부를 개방된 채로 유지했고, 이식된 폐는 플라스틱 백으로 덮었다.
24시간의 추가 기간 동안 좌측 기증자 폐를 평가했다. 다음의 변수가 평가되었다:
산소화 변수에 의한 이식편 기능의 기능적 평가: 동맥 혈중 가스 분석은 물론 좌측 폐 정맥으로부터 선택적 혈중 가스 분석을 24시간 동안 2시간마다 수행했다. 호흡 지수는 RI= PaO2/FiO2로 계산되었다.
마취 환기장치의 압력 및 부피 데이터로부터 폐 순응성이 계산되었다. 습윤/건조 중량 비율을 측정함으로써 혈관외 폐 수분의 추정에 의해 이식편 기능을 평가했다.
혈류역학적 측정(온라인 측정) 및 폐 혈관 저항성(PVR)에 의한 이식편 기능의 기능적 평가: 폐 동맥압(PAP)을 포함하는 혈류역학을 연속 측정했다. 심장 출력(CO)을 Swan-Ganz 카테터를 사용하여 측정했다. 폐 혈관 저항성은 다음의 식에 의해서 계산된다: PVR (dynes.sec-1.cm-5) = (PAP - LAP) x 80 / CO.
결과
이 연구는 재이식 후 폐기능에 대한 펩티드 SEQ ID NO:1의 효과를 평가했다.
펩티드 SEQ ID NO:1을 사용한 기증자 폐의 전처리는 개선된 초기 이식편 기능 및 가스 교환, 폐 부종의 감소된 전개 및 이식된 폐의 허혈 재관류 손상 유도 기능부전의 감소된 비율을 가져왔다.
<110> APEPTICO Forschung und Entwicklung GmbH <120> Process for extracorporeal lung treatment <130> A 18067 <150> EP 13164828.9 <151> 2013-04-23 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cyclized compound having a disulphide bridge <220> <221> DISULFID <222> (1)..(17) <400> 1 Cys Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr 1 5 10 15 Cys <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cyclized compound having an amide bond formed between the amino group attached to the epsilon-C atom of the lysine residue and the side chain carboxyl group attached to the gamma-C of the glutamic acid residue <400> 2 Lys Ser Pro Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro 1 5 10 15 Trp Tyr Glu <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cyclized compound having an amide bond formed between the amino group attached to the epsilon-C atom of the side chain of the lysine residue and the carboxyl group of the glycine residue <400> 3 Lys Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr 1 5 10 15 Gly <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cyclized compound having an amide bond formed between the amino group attached to the delta-C of the side chain of the ornithine residue and the carboxyl group of the glycine residue <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> X = ornithine <400> 4 Xaa Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr 1 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cyclized compound having an amide bond formed between the amino group of the 4-aminobutanoic acid residue and the side chain carboxyl group attached to the beta-C of the aspartic acid residue <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> X = 4-aminobutanoic acid <400> 5 Xaa Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr 1 5 10 15 Asp <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cyclized compound having an amide bond formed between the amino group of the beta-alanine residue and the side chain carboxyl group attached to the gamma-C of the glutamic acid residue <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> X = beta-alanine <400> 6 Xaa Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr 1 5 10 15 Glu <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cyclized compound having a disulphide bridge <220> <221> DISULFID <222> (1)..(17) <400> 7 Cys Gly Gln Arg Glu Ala Pro Ala Gly Ala Ala Ala Lys Pro Trp Tyr 1 5 10 15 Cys <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cyclized compound of formula I <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> X = selected from Cys; Lys-Ser-Pro; Lys; ornithine, 4-amino butanoic acid; beta-alanine <220> <221> MOD_RES <222> (17) <223> X = selected from Cys; Asp; Gly; Glu <400> 8 Xaa Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr 1 5 10 15 Xaa

Claims (12)

  1. 식 I: X1-GQRETPEGAEAKPWY-X2의 아미노산 서열의 고리 화합물로 기증자의 폐를 생체외 처리하는 단계를 포함하는 체외 방식으로 기증자의 폐기능을 개선하는 방법으로서,
    여기서
    X1은 1 내지 4 개의 천연 또는 비천연 아미노산을 포함하는 아미노산(서열)을 포함하고,
    X2는 천연 아미노산으로부터 선택된 하나의 아미노산을 포함하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 식 I의 화합물에서 X1은 C, KSP, K, 오르니틴, 4-아미노 부탄산 및 β-알라닌을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, X2는 C, D, G 및 E의 군으로부터 선택된 하나의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 고리화는 X1의 첫 번째 아미노산 잔기와 X2의 마지막 아미노산 잔기 사이에서 행해지는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 고리화는 아미드 결합을 통해서 또는 이황화 브릿지를 통해서 행해지는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 식 I의 화합물은 다음으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법:
    - 서열 SEQ ID NO:1
    시클로(CGQRETPEGAEAKPWYC)
    여기서 양 말단 시스테인 잔기기 이황화 브릿지를 형성한다;
    - 서열 SEQ ID NO:2
    시클로(KSPGQRETPEGAEAKPWYE)
    여기서 아미드 결합이 N-말단 리신 잔기의 ε-탄소 원자에 부착된 아미노기와 C-말단 글루탐산 잔기의 γ-탄소에 부착된 측쇄 카복실기 사이에 형성된다;
    - 서열 SEQ ID NO:3
    시클로(KGQRETPEGAEAKPWYG)
    여기서 아미드 결합이 N-말단 리신 잔기의 측쇄의 ε-탄소 원자에 부착된 아미노기와 C-말단 글리신 잔기의 카복실기 사이에 형성된다;
    - 서열 SEQ ID NO:4
    시클로(오르니틴-GQRETPEGAEAKPWYG)
    여기서 아미드 결합이 N-말단 오르니틴 잔기의 측쇄의 δ-탄소에 부착된 아미노기와 C-말단 글리신 잔기의 카복실기 사이에 형성된다;
    - 서열 SEQ ID NO:5
    시클로(4-아미노부탄산-GQRETPEGAEAKPWYD)
    여기서 아미드 결합이 N-말단 4-아미노부탄산 잔기의 아미노기와 C-말단 아스파르트산 잔기의 β-탄소에 부착된 측쇄 카복실기 사이에 형성된다; 및
    - 서열 SEQ ID NO:6
    시클로(β-알라닌-GQRETPEGAEAKPWYE)
    여기서 아미드 결합이 N-말단 β-알라닌(3-아미노프로판산) 잔기의 아미노기와 C-말단 글루탐산 잔기의 γ-탄소에 부착된 측쇄 카복실기 사이에 형성된다.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 식 I의 고리 화합물은 염의 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, X1 및 X2가 제 1 항 또는 제 2 항에 정의된 대로인 식 I의 고리 화합물이 분무에 의해서 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, X1 및 X2가 제 1 항 또는 제 2 항에 정의된 대로인 식 I의 고리 화합물이 분무기를 사용하여 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제1항에 있어서,
    상기 X1은 1 내지 3 개의 천연 또는 비천연 아미노산을 포함하는 아미노산(서열)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
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