JP6335279B2

JP6335279B2 - 式ｘ１−ｇｑｒｅｔｐｅｇａｅａｋｐｗｙ−ｘ２の環状ペプチドを含んでなる医薬組成物および体外肺処置のための使用

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Publication number: JP6335279B2
Application number: JP2016509416A
Authority: JP
Inventors: フィッシャー，ヘンドリック; ピーチュマン，ヘルムート; ジェーンツォツォス，スーザン; フィッシャー，ベルナルド; ルーカス，ルドルフ
Original assignee: アペプティコフオルシユングウントアントウィクラングゲーエムベーハー
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Filing date: 2014-04-18
Publication date: 2018-05-30
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Description

本発明は、移植前に肺機能を調整／改善するための体外肺処置方法に関する。

肺移植では、レシピエントの生活の質、さらには生存期間を向上させため、罹患肺の一部または全部を死亡したドナー由来の健康な肺に置き換える。肺移植の最も一般的な適応症は、気腫を含む慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症および嚢胞性線維症である。他の適応症としては、α１アンチトリプシン欠損症による気腫、特発性肺動脈高血圧症およびサルコイドーシスが挙げられる。肺のドナーおよびレシピエントの平均年齢はそれぞれ約３５歳および５０歳である。未補正基準生存率は成人肺移植について３か月で約９０％、１０年で約３０％の範囲である。全生存期間の中央値（または「ハーフライフ（half-life）」）は現在約５．５年である。最初の３０日以内および最初の１年以内の成人レシピエントにおける肺移植後の死の主な原因は移植不全および非サイトメガロウイルス感染症である。１年後は、閉塞性細気管支炎（ＢＯＳ）が罹患率および死亡率の別の主な危険因子となる（Am J Respir Crit Care Med. 2011 Nov 1;184(9):1055-61）。

重篤な虚血期間の後、器官への血液供給が回復すると、再灌流障害（ＲＩ）と呼ばれる器官の実質性の傷害や機能不全が生ずる。虚血再灌流障害（ＩＲＩ）は臓器移植、主要組織の切除およびショック状態において散見される。肺保存の改良や外科技術および周術期ケアの改善にも関わらず、虚血再灌流が誘発する肺傷害は、肺移植後初期の罹患率および死亡率の重要な原因であり続けている。症候群は典型的には移植後最初の７２時間以内に生じ、非特異的肺胞損傷、肺浮腫および低酸素血症により特徴付けられる。臨床スペクトルは、胸部Ｘ線のわずかな浸潤物と関連する軽度の低酸素血症から、陽圧換気、薬物療法および場合により体外式膜型人工肺を必要とする非常に重篤な状態まで及び得る（King RC et al, Ann Thorac Surg. 2000 Jun;69(6):1681-5）。この症候群を言い表すのに多くの用語が使用されているが、死や７２時間を超える長期間の人工呼吸器使用を頻繁に招く最も重症型の傷害に起因する一次移植不全とともに、虚血再灌流障害が最も一般的に使用される。術後早期の著しい罹患率や死亡率に加えて、深刻な虚血再灌流障害は、長期にわたる移植片機能不全の原因となり得る急性拒絶反応のリスクの増加とも関連している（Fiser SM et al, Ann Thorac Surg. 2002 Apr;73(4):1041-7; discussion 1047-8）。

ＩＲＩは、状態についての主要な基準としての貧酸素化により特徴づけられ、また、病理学でびまん性肺胞障害（ＩＤＡＤ）により明らかとなったような、低肺コンプライアンス、間質／肺胞浮腫、胸部Ｘ線写真上の肺浸潤、肺血管抵抗の増加、肺内シャントおよび急性肺胞傷害により特徴づけられる。臨床的には、患者は、長期通気、ＩＣＵおよび病院全体の長期滞在、医療費の増大ならびに罹患および死亡のリスクの増加に直面する。

肺移植は、医療管理が無効である終末期肺疾患患者のための療法の中心となっている。しかしながら、肺移植を待つ患者の数は提供可能なドナーの数をはるかに上回っている。世界的に、脳死ドナーから提供される肺のわずか１５〜２０％しか使用されず、一方で、ドナー選択の基準を満たさないことから８０％の肺が却下されている。ドナー肺の損傷は、移植後の移植片機能不全および移植不全を招く貧ガス交換または胸部Ｘ線浸潤物等の臨床所見により明らかとなる。ドナー肺の数を増やすための方法が多数提唱されている。肺移植については、生存する血縁肺ドナープログラムと関係しているものもあれば、最終的にドナーの不足を緩和するための方法として非心拍ドナーを重視するものもある。いくつかのセンターでは生存する血縁ドナーが成功裏に使用され、非心拍ドナーの使用もヒトにおいて実行可能であることが示されているが、技術的、医学的および倫理的な配慮から、これらの方法は全体的に少数の患者に限られたままである。

過去１０年にわたり拡張されたドナー肺の使用が全体的な肺移植活動を徐々に増加させているにも関わらず、いくつかの研究では、これらの進歩的な肺の使用が長期ＩＣＵ滞在、初期罹患率の上昇および１年での肺活量測定の悪化を招くことが示されている（Kawut SM et al, Transplantation. 2005 Feb 15;79(3):310-6; Pierre AF et al, J Thorac Cardiovasc Surg. 2002 Mar;123(3):421-7; 4, 5）。

よって、各ドナーを個別に慎重に検討し、また、拡張された移植用のドナー肺を選択することを受け入れるリスクと順番待ちの間にレシピエントが死亡するリスクとを常に比較検討すべきである。ドナー肺の正確な評価は、安全に移植に使用できる肺を選択することに重要な要素である。残念ながら、現在の臨床ドナー選択基準を用いる移植後の結果の予測は不正確であり、胸部Ｘ線評価や気管支鏡検査の所見等の評価はかなり主観的である。移植後の結果の決定における臨床パラメータの不確かさは、認識されていない、深刻な原発性移植片機能不全（ＰＧＤ）を招く傷害を有する肺を使用することにつながることがある。さらに重要なことには、もし臓器をより詳細に評価することが可能であれば、現在移植用として臨床的に却下されている肺の約４０％を安全に利用できると推定されている（Ware LB et al, Lancet. 2002 Aug 24;360(9333):619-20）。これらの肺は利用可能なドナー肺を著しく増加させるであろう。

心拍停止後のドナーからの肺を使用するという概念に基づいて、「生体内（in vivo）」では評価することができない肺の肺機能を評価するために、「生体外（ex vivo）」灌流（ＥＶＬＰ）技術を使用することができる。６０〜９０分の短期間の「生体外」評価の後、提供された肺をヒト肺移植に成功裏に用い得る（Steen S et al, Ann Thorac Surg. 2007 Jun;83(6):2191-48; Ingemansson R et al, Ann Thorac Surg. 2009 Jan;87(1):255-60）。

他の研究でもまた、動物モデルおよび臨床的に不適合なヒト肺において肺機能を評価するために、適切な溶液での短期間「生体外」灌流の実行可能性が実験に基づいて示されている（Rega FR et al, Ann Surg. 2003 Dec;238(6):782-92; Erasmus ME et al, Transpl Int. 2006 Jul;19(7):589-93; Egan TM et al, Ann Thorac Surg. 2006 Apr;81(4):1205-1310-12）。

このＥＶＬＰ技術とそれに続く肺移植の概念は、臨床現場へも成功裏に伝達されている。しかしながら、現在までＥＶＬＰは「生体外」でドナー肺機能を評価することのみに使用され、ＥＶＬＰはドナー肺を再調整するため、および／または治療的に有効な薬剤を肺に投与するためには用いられていない。

本明細書に例示されるペプチドはすでに医薬として以下に開示されている：
−ＷＯ２００６／０１３１８３（肺表面活性物質を伴うペプチドの投与）、
−ＷＯ２０１０／０９９５５６（透過性亢進の処置）、
−ＷＯ２０１１／０８５４２３（肺内または非経口投与）、
−Parastoo et al, J.Med.Chem. 2010, 53, 8021-8029（Ａ５４９細胞におけるアミロライド感受性ナトリウム流の活性化）。
しかしながら、体外肺処置についてはこれらのいずれの文献にも記載されていない。

Vadasz et al, Crit Car Med 2008, vol 36 no. 5, 1543-1550およびElia et al, Am J Resp and Crit Car Med 2003, vol 168,Nr. 9, 1043-1050には動物モデルが記載され、ここでは、使用するペプチドの活性を示すために体外で肺が処置されている。肺機能を改善するための体外処置やこのように処置された肺をレシピエントに移植することについては示されておらず、意図もされていない。さらに、これらの文献に従って使用された肺は、上皮／内皮バリアの損傷により再植え込み（re-implantation）に適していない。

今般、驚くべきことに、植え込み前にドナー肺を「生体外で」灌流し、通気してもよいこと、そして、このように生体外で処置された肺を生物活性化合物を投与することにより植え込み前に調整し、移植前の肺の換気性能を向上させてもよいことが見出された。

１つの面において、本発明によれば、下記式：
Ｘ₁−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹ−Ｘ₂ Ｉ
［式中、
Ｘ₁は、天然または非天然アミノ酸、特にはＣ、ＫＳＰ、Ｋ、オルニチン、４−アミノブタン酸、β−アラニンのアミノ酸（配列）から選択される天然または非天然アミノ酸を含んでなる、１〜４個、特には１〜３個のアミノ酸（配列）を含んでなり、かつ、
Ｘ₂は、天然アミノ酸、特にはＣ、Ｄ、ＧおよびＥの群から選択される天然アミノ酸から選択される１つのアミノ酸を含んでなり、かつ、
Ｘ₁は、左側の最初の位置にＮ末端アミノ酸を含んでなり、かつ、Ｘ₂は、右側の最後の位置にＣ末端アミノ酸を含んでなる。］
のアミノ酸配列の環状化合物で肺を生体外で処置することを含んでなる、体外で肺機能を調整／改善する方法が提供される。

本発明の方法におけるアミノ酸配列として有用な天然アミノ酸は知られており、例えば、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｕ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒを含んでなる。

本発明の方法におけるアミノ酸配列として有用な非天然アミノ酸は、下記を含んでなる：
−天然アミノ酸の主要構造を有するが、αアミノ酸とは異なるアミノ酸、
−Ｄ型の天然アミノ酸、すなわち天然Ｌ型以外のものであり、つまり、アルキル基がＬ配置ではなくＤ配置にある天然アミノ酸、
−２〜１２、例えば２〜６の炭素原子、少なくとも１つのアミノ基（例えば、１つまたは２つ）および少なくとも１つのカルボキシ基（例えば、１つまたは２つ）、加えて所望により天然アミノ酸にも存在する置換基、例えば、ＯＨ、−ＣＯＮＨ₂、−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ₂）ＮＨ₂、ＳＨ、（Ｃ_1-4）アルキル−Ｓ−、フェニル、ヘテロシクリル（例えば、５または６員環を含んでなり、Ｎ、Ｏ、Ｓから選択され、好ましくはＮである少なくとも１つの異種原子（例えば、１つまたは２つ）を含んでなり、これらはフェニル等のさらなる環とアニールされていてもよく、例えば、プロリニル、インドリル、イミダゾリルを含んでなる）を含んでなる非天然アミノ酸。

本発明の方法におけるアミノ酸配列の非天然アミノ酸は、オルニチン、４−アミノ酪酸、β−アラニンを含んでなる。

別の面において、式Ｉのアミノ酸配列の環状化合物は、
−配列番号１：
シクロ（ＣＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＣ）
［式中、両末端のシステイン残基はジスルフィド架橋を形成する。］の配列；
−配列番号２：
シクロ（ＫＳＰＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＥ）
［式中、Ｎ末端のリジン残基のε−炭素原子に結合しているアミノ基とＣ末端のグルタミン酸残基のγ−炭素に結合している側鎖カルボキシル基との間でアミド結合が形成される。］の配列；
−配列番号３：
シクロ（ＫＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＧ）
［式中、Ｎ末端のリジン残基の側鎖のε−炭素原子に結合しているアミノ基とＣ末端のグリシン残基のカルボキシル基との間でアミド結合が形成される。］の配列；
−配列番号４：
シクロ（オルニチン−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＧ）
［式中、Ｎ末端のオルニチン残基の側鎖のδ−炭素に結合しているアミノ基とＣ末端のグリシン残基のカルボキシル基との間でアミド結合が形成される。］の配列；
−配列番号５：
シクロ（４−アミノブタン酸−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＤ）
［式中、Ｎ末端の４−アミノブタン酸残基のアミノ基とＣ末端のアスパラギン酸残基のβ−炭素に結合している側鎖カルボキシル基との間でアミド結合が形成される。］の配列；および
−配列番号６：
シクロ（β−アラニン−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＥ）
［式中、Ｎ末端のβ−アラニン残基（３−アミノプロパン酸残基）のアミノ基とＣ末端のグルタミン酸残基のγ−炭素に結合している側鎖カルボキシル基との間でアミド結合が形成される。］の配列
を含んでなる。
配列番号７：
シクロ（ＣＧＱＲＥＡＰＡＧＡＡＡＫＰＷＹＣ）
［式中、両末端のシステイン残基の間でジスルフィド架橋が形成される。］の配列は比較のためだけに製造されたものであって、本発明の部分を形成するものではない。

本発明による方法において有用な環状化合物は、本明細書おいて「本発明の（による）環状化合物」とも表され、いずれの形態、例えば、遊離形態および塩形態の化合物を含んでなり、例えば、生物学的環境においては、通常、本発明の化合物は塩の形態である。

さらなる面において、本発明の環状化合物は、塩の形態である。

このような塩としては、好ましくは、薬学的に許容可能な塩を含んでなるが、例えば、製造／単離／精製を目的とする、薬学的に許容されない塩も含まれる。

生物学的環境において、本発明の環状化合物の塩は、通常、塩酸塩である。

遊離形態の本発明の環状化合物は、塩形態の対応する環状化合物に変換してもよく、逆の場合も同様である。

本発明の環状化合物は、異性体および異性体混合物、例えば、光学異性体の形態で存在してよい。本発明の環状化合物は、例えば不斉炭素原子を含んでいてもよく、それゆえ、エナンチオマー、ジアステレオ異性体およびこれらの混合物、例えばラセミ化合物の形態で存在することができる。本発明の環状化合物は、本発明の環状化合物におけるこのような不斉炭素原子の各置換基に関して、（Ｒ）−、（Ｓ）−または（Ｒ，Ｓ）−配置、好ましくは（Ｒ）−または（Ｓ）−配置で存在していてもよい。異性体混合物は、適宜、例えば、純粋な異性体を得るための従来法に従って、例えばこれに類似的に、分離されてもよい。本発明は、いずれの異性体形態およびいずれの異性体混合物の本発明の化合物を含んでなる。天然アミノ酸の場合は、置換基の配置が、通常天然アミノ酸でみられるものである。

本発明の環状化合物は、適宜、例えば、従来法または本明細書に記載される方法、例えば固相ペプチド合成に従って、例えばこれに類似的に、そして場合により、ジイソプロピルカルボジイミドおよび／またはＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール等の適当なカップリング剤およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等の適当な溶媒を用いる、２−クロロトリチルクロリド樹脂についてのフルオレニルメトキシカルボニル／ｔ−ブチル保護方法に従って、製造してもよい。保護されたアミノ酸は、Ｃ末端アミノ酸から開始するペプチド鎖に続けて連結されてもよい。フルオレニルメトキシカルボニル保護基の脱保護は、塩基、例えばピペリジン（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等の適当な溶媒中の２０％ピペリジン等）を用いて行ってよい。（部分的に）保護されていてもよい完成したペプチドの樹脂からの切り出しは、適宜、例えば、適当な溶媒、例えば、ＣＨ₂Ｃｌ₂等のハロゲン化炭化水素中の酢酸等の酸（例えば、酢酸およびＣＨ₂Ｃｌ₂の１：１の混合物中）により行ってよい。

システイン含有ペプチドの場合、樹脂からの切り出しの後、側鎖の脱保護は、必要に応じて、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）等の強酸、例えば、９５％ＴＦＡ／５％Ｈ₂Ｏを用いて行ってよい。ジスルフィド結合を得るための環化は、例えば、ｐＨ８．５にて９０時間の粗直鎖ペプチドのエアレーションにより達成可能な、末端システイン残基の酸化により行ってよい。得られた粗ペプチド生成物は、ＲＰ−Ｃ１８−シリカゲルカラム等の適当なカラムでのクロマトグラフィー、例えば、逆相中圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＭＰＬＣ）により、５％〜４０％アセトニトリル水の勾配等の溶出勾配を便利に用いて精製してもよい。トリフルオロ酢酸対イオンは、例えば、ＬｅｗａｔｉｔＭＰ６４カラム等のカラム上で、例えば、酢酸により置換されてもよい（酢酸型）。水での最終洗浄の後、酢酸塩としての精製されたペプチドは、凍結乾燥されてよく、淡色、例えば、白色の粉末の形態で得られてよい。

システイン不含ペプチドの場合、環化工程は、適宜、例えば、樹脂から切り出した後、部分的に保護されたままの直鎖ペプチドに行ってもよい。システイン不含ペプチドの選択的環化の後、必要に応じて、ＴＦＡにおいて側鎖の脱保護を行ってもよい。精製工程は、例えば、クロマトグラフィーを介して（例えば、分取ＲＰ−ＭＰＬＣにより）行ってもよい。このようにして得られたペプチドにおいて、トリフルオロ酢酸イオンの酢酸による置換を例えば上記のように行ってもよい。ペプチドの酢酸型の凍結乾燥は、例えば、システイン含有ペプチドと同様に行ってもよい。

得られたペプチドの分子量は、エレクトロスプレーイオン化質量分析またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより確認してもよい。例えば、分析高速液体クロマトグラフィーにより、純度を決定してもよい。

本発明の環状化合物（例えば、式Ｉの化合物を含む）は、興味深い薬理活性を示し、それゆえ、医薬として有用である。例えば、実施例に示される試験結果により、本発明の環状化合物を吸入適用すると、動的肺コンプライアンスおよび動静脈ｐＯ₂の差のΔｐＯ₂の双方が肺で改善されることが示された。また、本発明の環状化合物が投与されると細胞ナトリウムイオン電流が増強されることが示された。驚くべきことに、配列番号７のアミノ酸配列を有する化合物におけるアミノ酸配列は配列番号１〜６のアミノ酸配列を有する化合物と比べてむしろ類似であるにも関わらず、配列番号７のアミノ酸配列を有する化合物は、配列番号１〜６のアミノ酸配列を有する化合物が良好な活性を示したアッセイにおいて活性を示さなかった。

従って、本発明の環状化合物は、例えば移植前、体外での肺機能を調整／改善に適応される。

驚くべきことに、最良の状態での本発明の環状化合物の投与は、吸入投与、例えば、それぞれ吸入投与に適した投与、すなわち、肺組織へ噴霧（スプレー）することにより行うことができることが見出された。

驚くべきことに、本発明の、例えば、配列番号１〜６のアミノ酸配列（の１つ）を有する環状化合物の肺組織を通しての血中への能動または受動輸送は、望ましくなく、起こるべきではないことが見出されたが、これは、もし環状化合物が、肺組織の表面上に隔離され、頂端配向のアミロライド感受性ナトリウムイオンチャネルを活性化できるように経口吸入を通して肺気腔に達すると、本発明の、例えば、配列番号１〜６のアミノ酸配列の環状化合物の生理学的有効性に大いに寄与することが見出されたためである。

そのために、まず、本発明の、例えば、配列番号１〜６のアミノ酸配列（の１つ）の環状化合物は、水溶液を得るために水に溶解し、得られた溶液を、例えば不純物を除去するために濾過してもよい。得られた濾液は、例えば保管形態が望まれる場合は凍結乾燥してもよい。驚くべきことに、このようにして得られた凍結乾燥された本発明の環状化合物は長期間安定である。凍結乾燥物の安定性は２〜８℃で２４か月間および２５℃、６０％相対湿度で６か月間の後に決定した。そのために、通常の研究室での分析方法、例えば、目視検査や逆相ＨＰＬＣを使用した。

２〜８℃で２４か月の保管の後、パッチクランプ実験により生物学的活性も決定した。凍結乾燥物は記載の条件下で安定であることが分かり、外観は変化せず、式Ｉの環状ペプチドの含有量および純度は同等であればわずかな変動を示すのみであった。また、生物学的活性も実質的に変わらぬままであった。

配列番号１のアミノ酸配列を有する環状化合物の水溶液の安定性試験を以下の表に示す。

ネブライザーを用いて式Ｉ、すなわち配列番号１のアミノ酸配列の環状化合物の水溶液をエアロゾルに変換した。水溶液を３つの異なるネブライザーに供した後、液滴の粒径を測定し、以下の表に示す。

適切な実験により、エアロゾルとして吸入した後、式Ｉの環状化合物は肺組織に存在するが、血中には事実上存在しない証拠が提供された。注射投与によれば、式Ｉの環状化合物は主に血中に存在することが見出された。

吸入／スプレーによる、例えば、エアロゾルの形態での投与について、第一の溶解工程からの水溶液または水に再溶解された得られた凍結乾燥物を、例えばネブライザーの使用によりスプレー（噴霧）に供し、エアロゾルを得る。驚くべきことに、本発明の、例えば、配列番号１〜６のアミノ酸配列（の１つ）の環状化合物の水溶液は、また、通常使用される安定化剤および／または補助剤を添加せずとも予想以上に長時間安定であることを見出した。また、溶解された本発明の環状化合物を含んでなる蒸発液滴のサイズも有利な影響を与えることが示された。例えば、好ましい態様において、特に良い結果を得るためには、噴霧された液滴（の多く）の液滴サイズは５μｍを超えない（上限）。液滴サイズの適当な下限は単に液滴の実施可能性に依存する。

肺移植をシミュレーションする体外系におけるブタ肺の肺機能に対する本発明の、特には配列番号１のアミノ酸配列を有する環状化合物の影響についての試験において、図２Ａおよび図２Ｂに示されるように、吸入／スプレーによる投与を通して、すなわち、エアロゾルの使用により、動的肺適合や動静脈ｐＯ₂の差のΔｐＯ₂が改善されることが示された。

別の面において、本発明によれば、例えば、式Ｉのペプチドの少なくとも１つを含んでなる医薬組成物であって、エアロゾルを得るためにスプレー（吸入）することに適している、またはスプレー（吸入）に適したエアロゾルの製造に適している形態であり、液滴のサイズが５μｍを超えない、医薬組成物が提供される。

驚くべきことに、本発明により提供されるエアロゾルは、安定化剤も他の補助剤も必要とされない。

図１は、配列番号１〜６のアミノ酸配列の環状ペプチドの適用される濃度に依存した活性を示す。ｘ軸は、配列番号１〜６の環状タンパク質の濃度をｎＭ（対数目盛り）で示し、ｙ軸はナトリウムイオン電流を％で示す。図２は、肺移植をシミュレーションする体外での肺灌流（ex vivo）における配列番号１のペプチドの吸入適用の結果を示す。図２Ａにおいて、ｘ軸には時点Ｔ１〜Ｔ４を（１時間ごとに測定を行った）、ｙ軸にはコンプライアンスを示し、図２Ｂにおいては、ｘ軸には再び時点Ｔ１〜Ｔ４を、ｙ軸には動静脈ｐＯ₂の差のΔｐＯ₂を示す。測定は配列番号１のペプチドの吸入投与後、１時間ごとに１回行った。対照として注入用水（ＷＦＩ）を用いた。グループごとに８回の実験の平均を示す。

以下の実施例においていずれの温度も℃（セ氏温度）示す。

実施例１：ペプチド合成
いずれのペプチドも、２−クロロトリチルクロリド樹脂上でフルオレニルメトキシカルボニル／ｔ−ブチル保護方法に従って固相ペプチド合成により合成した。ジイソプロピルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールをカップリング試薬として使用した。カップリング工程はいずれもＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドにおいて行った。保護されたアミノ酸はＣ末端アミノ酸から開始するペプチド鎖に続けて結合させた。フルオレニルメトキシカルボニルの脱保護は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンにおいて行った。完成した部分的に保護されたペプチドの樹脂からの切り出しは、酢酸およびジクロロメタンの１：１の混合物において行った。システイン含有ペプチドの場合、樹脂からの切り出しの後、側鎖の脱保護を９５％トリフルオロ酢酸、５％水において行い、その後、ｐＨ８．５にて９０時間、粗直鎖ペプチドのエアレーションにより達成可能な末端システイン残基の酸化により環化を行った。粗ペプチド生成物を、ＲＰ−Ｃ１８−シリカゲルカラムでの逆相中圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＭＰＬＣ）により、５％〜４０％アセトニトリルの勾配で精製した。最後に、トリフルオロ酢酸対イオンを、ＬｅｗａｔｉｔＭＰ６４カラム上で、酢酸により置換した（酢酸型）。水での最終洗浄の後、酢酸塩としての精製されたペプチドを凍結乾燥し、白色から灰白色の粉末として得た。システイン不含ペプチドの場合、２−クロロトリチルクロリド樹脂から切り出した後、環化工程を部分的に保護された直鎖ペプチドに行った。システイン不含ペプチドの選択的環化の後、トリフルオロ酢酸において側鎖の脱保護を行い、その後、分取ＲＰ−ＭＰＬＣクロマトグラフィーによりトリフルオロ酢酸イオンの酢酸による置換とペプチドの酢酸型の凍結乾燥をシステイン含有ペプチドと同様に行った。ペプチドの分子量はエレクトロスプレーイオン化質量分析またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより確認し、それらの純度は分析高速液体クロマトグラフィーにより決定した。

配列番号１のペプチドの純度は９６．３％であった。ｍ／ｚ（ＥＳＩ）１９２４．２（Ｍ＋＋１）。
配列番号２のペプチドの純度は９６．３％であった。ｍ／ｚ（ＥＳＩ）１９２４．２（Ｍ＋＋１）。
配列番号３のペプチドの純度は９８．８％であった。ｍ／ｚ（ＥＳＩ）１８８８．２（Ｍ＋＋１）。
配列番号４のペプチドの純度は９７．４％であった。ｍ／ｚ（ＥＳＩ）１８７３．４（Ｍ＋＋１）。
配列番号５のペプチドの純度は１００％であった。ｍ／ｚ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）１９０１．６（Ｍ＋＋１）。
配列番号６のペプチドの純度は１００％であった。ｍ／ｚ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）１９０２．７（Ｍ＋＋１）。
配列番号７のペプチドの純度は９５％であった。ｍ／ｚ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）１７７８．０２（Ｍ＋＋１）。

実施例２：本発明の環状化合物の生物活性の評価
実験は、８０〜９０代継代のヒト上皮細胞系統Ａ５４９（ＡＴＴＡＣＮｒ．ＣＣＬ−１８５）について行った。細胞は、１０％ウシ胎児血清を補充し、１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するダルベッコ変法イーグル培地／栄養混合物Ｆ−１２ハムで増殖させた。いずれの培養培地もシグマ−アルドリッチＧｍｂＨ（セントルイス、ＭＯ）より購入した。

配列番号１〜７のペプチドのナトリウムイオン電流に対する生物活性をＡ５４９細胞についてプレーティング後２４〜４８時間、室温（１９〜２２度）で試験した。電流はホールセル様式でのパッチクランプ法で記録した。培養された細胞を有するガラスカバー片を１ｍｌ容量のチャンバーに写し、倒立顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ａｘｉｏｖｅｒｔ１００）のステージに載せた。チャンバーは、以下の組成（ｍＭ）：１４５ＮａＣｌ、２．７ＫＣｌ、１．８ＣａＣｌ₂、２ＭｇＣｌ₂、５．５グルコースおよび１０ＨＥＰＥＳであり、１ＭＮａＯＨ溶液でｐＨ７．４に調整したバス溶液を１ｍｌ含有する。マイクロピペットをフレーミング・ブラウンマイクロピペットプラー（Ｐ８７、サッター・インスツルメンツ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて薄壁のホウケイ酸ガラスキャピラリー（ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ・インコーポレイテッド、ＦＬ、ＵＳＡ）から引いて、マイクロフォージ（ナリシゲ、東京、日本）で磨き、抵抗が２．０〜３．５ＭΩの範囲の電極を得た。ピペット溶液は、ｍＭで：１３５メタンスルホン酸カリウム、１０ＫＣｌ、６ＮａＣｌ、１Ｍｇ₂ＡＴＰ、２Ｎａ₃ＡＴＰ、１０ＨＥＰＥＳおよび０．５ＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）を含有し、１ＭＫＯＨ溶液でｐＨ７．２に調整した。ピペットおよびバス溶液のための化学物質はシグマ−アルドリッチ（ウイーン、オーストリア）により供給された。電気生理学的測定はＡｘｏｐａｔｃｈ２００Ｂパッチクランプ増幅器（アクソン・インスツルメンツ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて行った。容量過渡をキャンセルし、直列抵抗を補償した。ホールセル電流は５ｋＨｚのフィルターを通し、１０ｋＨｚでサンプリングした。データ取得および保管はｐＣＬＡＭＰ１０．０ソフトウェアを備えるＰＣ（アクソン・インスツルメンツ、ＣＡ、ＵＳＡ）に直接処理させた。

ＧΩ−シール形成の後、５分の平衡期間に次いで、２０ｍＶずつ増加する−１００および＋１００ｍＶの間の保持電位（Ｅｈ）（各Ｅｈで１分間）で対照を記録した。その後、蒸留水で調製されたストック溶液のアリコートを累積的にバス溶液に添加し、配列番号１〜６のペプチドの濃度を３．５〜２４０ｎＭの範囲とした。洗浄相は約１分続けた。定常状態に達した後、同一実験プロトコールを各濃度のペプチドに対し、対照記録の間に適用した。濃度反応曲線およびＥＣ５０値を適合させ、−１００ｍＶのＥｈで記録された電流をＳｉｇｍａＰｌｏｔ９．０を用いて評価した。ＥＣ５０の差についてはスチューデントのｔ検定を用いて統計的有意性（Ｐ＜０．０５）を計算した。イオン選択性の評価については、配列番号１〜７のペプチドの添加前に、ナトリウムイオン電流を１０〜１００μＭのアミロライド塩酸塩水和物により阻止した。これに続く１０ｍＭ塩化テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）の添加は、観察されるすべての電流の増加がカリウム電流によるものであるのかどうかを示した。これらの実験もＥｈ＝−１００ｍＶで行った。

ホールセル記録を用いてパッチクランプアッセイにおいて測定されたナトリウムイオン電流に対する配列番号１〜７のペプチドの影響を決定した結果を、ホールセル記録様式を用いるＡ５４９細胞系統でのパッチクランプアッセイにおける細胞ナトリウムイオン電流に対する配列番号１〜７のペプチドの活性を記載する表１に示す。アッセイにおける各ペプチドの活性については、各ペプチドについて、最大活性（すなわち、電流の最大増加、Ｉ）の５０％が観察される効果濃度であるＥＣ₅₀（ｎＭ）で表す。

配列番号１〜６のペプチドについて、ホールセル様式を用いる細胞系統Ａ５４９でのパッチクランプアッセイから得られた用量反応曲線を、ナトリウムイオン電流に対する配列番号１〜６のペプチドの濃度反応曲線を示す図１に示す。最大ナトリウムイオン電流を１００％に設定した。配列番号１〜６のすべてのペプチドについて、１２０ｎＭのペプチド濃度で最大効果が観察された。配列番号７のペプチドは活性を示さなかった。

実施例３：脱グリコシル化細胞表面に対する配列番号１〜７のペプチドの影響
上記のホールセル様式実験において、パッチクランプ測定の直前に、Ａ５４９細胞を酵素「ＰＮＧａｓｅＦ」（ペプチド−Ｎ⁴−（Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニル）アスパラギンアミダーゼＦ）１００ユニットで１〜５分間インキュベートし、１ｍＬバスのチャンバーに移す前に、培養された細胞を有するカバーガラス片を外液ですすいだ。対照の記録後、２４０ｎＭの配列番号１〜７のアミノ酸配列のペプチドをバス溶液に添加した。対照条件下で前処置をせず、引き続いて配列番号１〜７のペプチドを添加する細胞と、ＰＮＧａｓｅＦによる前処置を伴う細胞からホールセル電流をＥｈ＝−１００ｍＶで記録した。

ホールセル様式におけるパッチクランプアッセイを用いる脱グリコシル化実験の結果を、配列番号１〜７のペプチドによるナトリウムイオン電流の活性化に対するＡ５４９細胞の脱グリコシル化の影響を示す表２に示す。ホールセル電流はＥｈ＝−１００ｍＶで記録した。バス溶液中の配列番号１〜７のペプチド濃度は２４０ｎＭであった。

表２の結果は、パッチクランプアッセイの前、ＰＮＧａｓｅＦでのＡ５４９細胞の前処置は、配列番号１〜６のペプチドのナトリウム電流を増加させる能力を無効にすることを明確に示した。ペプチドをバス溶液に添加せず、−１００ｍＶの保持電位での対照条件では、非処置細胞においてもＰＮＧａｓｅＦで前処置した細胞においてもナトリウムイオン電流が２５．４ｐＡであった。非処置細胞においては、バス溶液へ配列番号１〜６のペプチドを添加し（最終濃度２４０ｎＭ）、−１００ｍＶの保持電位で、感受性ナトリウムイオン電流は１，０００ｐＡ以上となった。配列番号７のペプチドは活性を示さなかった。

実施例４：ブタへの肺移植実験
脳死ブタを仰向けにし、縦胸骨切開を行った。心膜と両胸膜腔を開いた。下および上大静脈を包囲した。右心室排出管で巾着縫合により流入カテーテルを肺動脈に置いた。下および上大静脈を接続させることにより流入閉塞を、大動脈をクランプすることにより排出閉塞を得た。その後、流入カテーテルを通して、冷等張保護溶液（５０ｍｌ／ブタのｋｇ体重、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、塩化物イオン、デキストラン、グルコース、緩衝液イオンを含んでなる）の順行性の流れで肺を保護した。左心耳の切断により排出を生じさせた。その間に肺を５０％酸素に曝し、氷スラッシュを両胸膜腔と縦隔に入れた。

外植技術は、まとめると、以下の工程に従って、心臓と食道を採取した。
ａ）気管の両側の胸腔に渡る軟組織を切開する。
ｂ）両肺間膜の切断（非常に深く、困難な露出）、その後、それぞれ、下部胸部下行大動脈または食道のＶＣＩの切断。
ｃ）残存する縦隔接着の鈍的分離。
ｄ）ホッチキスでの気管閉鎖前のドナー肺の完全拡張。

外植の後、肺をガーゼで包み、低カリウム−デキストラン−細胞外溶液で満たした断熱アイスバッグに入れ、４℃で１８〜２４時間保存した。温度プローブを容器に沈め、冷蔵庫に入れた。

生体外肺調整のために、ＥＶＬＰ技術を用いた（血管外肺灌流）。ＥＶＬＰ技術では、ドナー肺をポンプ、ベンチレーターおよびフィルターから構成される回路に置いた。ＥＶＬＰ技術では、温度を３７℃まで上昇させることができる。ＥＶＬＰ技術では、酸素を肺に送達するためにベンチレーターを用いる。ポンプは、ヒトアルブミンおよび栄養素を含有する細胞外溶液とともに肺を灌流するために用いる。ＥＶＬＰの間、肺の機能は、鍵となる指標に関して定期的に評価することができる。

実験ブタ肺移植実験については、ＥＶＬＰ回路を２．０リットルのヒトアルブミン溶液でプライムした。この細胞外溶液は最適な膠質浸透圧を有した。回路を脱気した後、肺と接続するまでプライム物質を２０℃で循環させた。ヘパリン、セフロキシム、メチルプレドニゾロンを灌流液に添加した。

ブタドナー肺の準備は、左心房を副子固定して開き、閉鎖された灌流回路を維持するために、左心房（ＬＡ）カフに組み込まれた圧力監視付きカテーテルを有するシラスティックの漏斗状のチューブに縫い付けることで開始した。確実かつ十分な排水の流出を達成するために、そのチューブを、連続する５−０ｍモノフィラメント縫合糸を使用し、ＬＡカフに固定し吻合した。同型のカニューレを肺動脈（ＰＡ）の挿管のために使用し、必要に応じてＰＡサイズに合わせるために調整した。５００ｍｌ緩衝細胞外溶液を用いてバックテーブル逆行流を行った。ドナー肺をＥＶＬＰ回路にのせる前に、気道を洗浄するために気管を開き、直接気管支の吸出しを行った。気管内チューブ（サイズ８ｍｍＩ．Ｄ．）を気管に導入し、臍帯テープでしっかりと固定した。その後、肺をＥＶＬＰ回路ユニットに移した。最初に、ＰＡカニューレを脱気させるために、ＬＡカニューレと回路を接続し、逆流をゆっくりと開始した。脱気が完了次第、ＰＡカニューレを回路に接続し、１５０ｍｌ／分の順行性の流れを灌流液を用いて室温で開始した。次の３０分で、灌流の温度を段階的に３７℃に上昇させた。温度が３２〜３４℃に到達次第、ドナーブタ肺の機械的通気をベンチレーターにより開始し、灌流液の流速を段階的に上昇させた。

ＥＶＬＰガスの流れは、肺へ酸素を供給し、ガス変換器膜により二酸化炭素を流入灌流液に提供し（８６％Ｎ₂、６％Ｏ₂、８％ＣＯ₂）、流入灌流液ｐＣＯ₂を３５〜４５ｍｍＨｇに維持するために開始される（０．５Ｌ／分のガス流で開始し、流入灌流液ｐＣＯ₂に基づいて滴定）。肺が十分に拡張されると、標準単一液体噴霧系を用いて、単回投与量のＡＰ３０１（５ｍｌ水中、１ｍｇ／ｋｇ）を、ＥＶＬＰ回路系により通気され、灌流されたドナーブタ肺に適用した。

ＥＶＬＰ実験の間、灌流を定期的に評価した。以下の機能パラメータは毎時間測定し、記録した。
−肺動脈流（ＰＡＦ）：Ｌ／分
−（平均）肺動脈圧（ＰＡＰ）：ｍｍＨｇ
−左心房圧（ＬＡＰ）：ｍｍＨｇ
−肺血管抵抗（ＰＶＲ＝［ＰＡＰ−ＬＡＰ］×８０／ＰＡＦ）：ダイン／秒／ｃｍ−５
−気道の中圧、最高圧およびプラトー圧（ｍＡｗＰ、ピークＡｗＰ、プラトーＡｗＰ）：ｃｍＨ₂Ｏ
−動的コンプライアンス（ｍＬ／ｃｍＨ₂Ｏ）
−灌流液ガス分析−流入（ＰＡ）および流出（ＰＶ）ｐＯ₂、ｐＣＯ₂およびｐＨ。

結果
本研究は、肺移植をシミュレーションする体外系における肺機能に対する配列番号１のペプチドの影響を評価した。研究の結果によれば、図２Ａおよび図２Ｂに示されるように、吸入適用すると、配列番号１のペプチドで処置された肺において動的肺コンプライアンスや動静脈ｐＯ₂の差のΔｐＯ₂の双方が改善されることが示された。

配列番号７のペプチドを肺適用しても、肺機能に対する影響を改善しなかった。

実施例５：ブタへの肺移植実験
実施例４による配列番号１のペプチドでのドナー肺の前処置の後、肺をレシピエントブタに再植え込みした。移植された肺を再灌流した直後、配列番号１のペプチドを投与した。

第６肋骨間空で左開胸を行い、左肺の肺門の準備をした。左肺動脈も左心房も隠れているので左側の半奇静脈を切開し、切断した。切開後、ＯＰ領域への露出を容易にするために結紮した末端を引っ張った。右肺動脈および気管支を囲んだ。血管クランプを用いて左肺切除術を行った。植込みの直前に、メチルプレドニゾロンの単回静脈投与量（５００〜１０００ｍｇ）およびヘパリンの低投与量（１００ＩＵ／ｋｇ、上記参照）を適用した。その後、気管支吻合のための４−０ＰＤＳならびに肺動脈および左心房吻合のための５−０プロレンを用いてドナー肺を再植え込みした。ブタには、右肺にさらなる葉（静脈葉）が左心房への２つの静脈とともに存在する（静脈葉への１つの個別の静脈、主要の右下葉静脈の幹から発生する１つのさらなる静脈）。ドナーの左心房において、バックテーブル分離の間にこれらの静脈を縫合により閉じ、筋心房カフ／縫合線を実現化した。左心房の左部分を個別にクランプするのは、サテンスキー鉗子のための右平面を探すのが困難なため危険である。左心房のクランプにブタがほとんど耐えられず、よって、クランプは心房吻合完了後直ちに開放し、右天然肺の後毛細管の肺動脈圧を低減させるべきである。この後、気管支吻合を行った。動脈吻合を、ドナーの主肺動脈のレシピエント肺動脈幹へのパッチにより行い、幅広い吻合と右心室への大きな流出領域を確実にした。

血管吻合終了後、標準的な方法において植え込まれた肺を逆行、その後順行で流した。その後、動脈クランプを部分的に１０分間開放し、制御された再灌流を提供した。

再灌流まで局所的低体温を継続するよう注意を払った。移植された肺への通気は標準様式により再灌流の間に開始した。ネブライザーによる配列番号１のペプチドの投与（５ｍｌ水中、1 mg/kg）は、関連グループのレシピエント動物への通気の開始時に開始した。

再植え込み後、胸部は開いたままにし、移植された肺をプラスティックバッグで覆った。

左ドナー肺を２４時間のさらなる期間について評価した。

以下のパラメータで評価した：
酸素化パラメータによる移植片機能の機能評価：動脈血ガス分析および左肺静脈からの選択的血液ガス分析を２時間ごとに２４時間行った。呼吸指数を計算した：ＲＩ＝ＰａＯ₂／ＦｉＯ₂。
肺コンプライアンスを麻酔ベンチレータの圧力および容量データから計算した。
湿／乾重量比の測定による血管外肺水の評価による移植片機能の評価。
血行動態測定（オンライン測定）による移植片機能の機能評価および肺血管抵抗（ＰＶＲ）：肺動脈圧（ＰＡＰ）を含む血行動態を継続的に測定した。心拍出量（ＣＯ）は、スワン−ガンツカテーテルを用いて測定した。肺血管抵抗は以下の式で計算する：ＰＶＲ（ダイン．秒−１．ｃｍ−５）＝（ＰＡＰ−ＬＡＰ）×８０／ＣＯ。

結果
本研究は、再植え込み後の肺機能に対する配列番号１のペプチドの影響を評価した。

配列番号１のペプチドでドナー肺を前処置することにより、当初の移植片機能およびガス交換を改善し、肺浮腫の発症を低減し、虚血再灌流障害により誘発される移植された肺の機能不全の割合を低減した。

Claims

下記式：
Ｘ₁−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹ−Ｘ₂ Ｉ
［式中、
Ｘ₁は、天然または非天然アミノ酸を含んでなる、１〜４個、特には１〜３個のアミノ酸（配列）を含んでなり、かつ、
Ｘ₂は、天然アミノ酸から選択される１つのアミノ酸を含んでなる。］
のアミノ酸配列の環状化合物を用いて肺を生体外で処置することを含んでなる、体外でドナー肺の機能を改善する方法。
式Ｉの化合物中のＸ₁が、Ｃ、ＫＳＰ、Ｋ、オルニチン、４−アミノブタン酸およびβ−アラニンを含んでなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
Ｘ₂が、Ｃ、Ｄ、ＧおよびＥの群から選択される１つのアミノ酸を含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
環化が、Ｘ₁における最初のアミノ酸残基とＸ₂における最後のアミノ酸残基との間で生じる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
環化が、アミド結合またはジスルフィド架橋により生じる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
式Ｉの化合物が、
−配列番号１：
シクロ（ＣＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＣ）
［式中、両末端のシステイン残基がジスルフィド架橋を形成する。］；
−配列番号２：
シクロ（ＫＳＰＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＥ）
［式中、Ｎ末端のリジン残基のε−炭素原子に結合しているアミノ基とＣ末端のグルタミン酸残基のγ−炭素に結合している側鎖カルボキシル基との間でアミド結合が形成される。］；
−配列番号３：
シクロ（ＫＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＧ）
［式中、Ｎ末端のリジン残基の側鎖のε−炭素原子に結合しているアミノ基とＣ末端のグリシン残基のカルボキシル基との間でアミド結合が形成される。］；
−配列番号４：
シクロ（オルニチン−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＧ）
［式中、Ｎ末端のオルニチン残基の側鎖のδ−炭素に結合しているアミノ基とＣ末端のグリシン残基のカルボキシル基との間でアミド結合が形成される。］；
−配列番号５：
シクロ（４−アミノブタン酸−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＤ）
［式中、Ｎ末端の４−アミノブタン酸残基のアミノ基とＣ末端のアスパラギン酸残基のβ−炭素に結合している側鎖カルボキシル基との間でアミド結合が形成される。］；および
−配列番号６：
シクロ（β−アラニン−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＥ）
［式中、Ｎ末端のβ−アラニン（３−アミノプロパン酸）残基のアミノ基とＣ末端のグルタミン酸残基のγ−炭素に結合している側鎖カルボキシル基との間でアミド結合が形成される。］
からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
式Ｉの環状化合物が、塩の形態である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
式Ｉ［式中、Ｘ₁およびＸ₂は請求項１〜７のいずれか一項において定義された通りである。］の環状化合物がスプレーにより投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
式Ｉ［式中、Ｘ₁およびＸ₂は請求項１〜７のいずれか一項において定義された通りである。］の環状化合物がネブライザーの使用により投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。