CN105188735A - 包含式x1-gqretpegaeakpwy-x2的环肽的药物组合物及其体外处理肺的用途 - Google Patents

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Abstract

一种以式I：X1-GQRETPEGAEAKPWY-X2的氨基酸序列的环化化合物处理离体肺来体外调节/改善体外肺功能的方法，其中X1包含具有1至4个残基的氨基酸(序列)，所述氨基酸包含天然或非天然氨基酸，而X2包含选自天然氨基酸的一种氨基酸；和一种药物组合物，其包含如权利要求1至7中任一项所定义的式I的肽，其为适合于喷雾以获得用于吸入的气雾剂的形式，或为适合于制备喷雾剂以在喷雾时获得适合于吸入的气雾剂的形式。

Description

包含式X1-GQRETPEGAEAKPWY-X2的环肽的药物组合物及其体外处理肺的用途
技术领域
本发明涉及一种体外处理肺方法从而在移植前调节/改善肺功能。
背景技术
在肺移植中，部分或整个病变的肺被替换为已故的捐赠者的健康肺来提高生活质量，甚至延长接受者的生存时间。肺移植最常见的适应症是慢性阻塞性肺疾病(COPD)，包括肺气肿、原发性肺纤维化和囊性纤维化。其他适应症包括α1-抗胰蛋白酶缺乏症肺气肿、原发性肺动脉高压和肉样瘤病。肺供体和接受者的平均年龄分别是约35和50岁。成人肺移植的未调整的基准存活率介于3个月时约90％和10年时约30％。总体平均生存期(或“半衰期”)一般地为约5.5年。，在肺移植后的成年接受者在前30天内和在第1年内的主要死亡原因是移植失败和非巨细胞病毒感染。1年后，闭塞性细支气管炎(BOS)成为发病率和死亡率的另一个主要危险因素(AmJRespirCritCareMed.2011年11月1日；184(9):1055-61)。
关键时期缺血后对器官恢复血液供应导致了器官的实质损伤和功能障碍，其被称为再灌注损伤(RI)。缺血再灌注损伤(IRI)在器官移植、主要脏器切除和休克中是常见的。尽管在肺保存的精细化方面以及手术技术和围术期护理的改进方面，缺血再灌注引起的肺损伤仍然是肺移植后早期发病率和死亡率的重要原因。该综合征通常会在移植后的前72小时内发生，并以非特异性肺泡损伤、肺水肿和低氧血症为特征。临床谱的范围可从与在胸部X光片上的一些浸润相关的轻度低氧血症到需要正压通气、药物治疗和偶尔体外膜肺氧合的非常严重情况(KingRC等人,AnnThoracSurg.2000年6月；69(6):1681-5)。一些术语已被用于描述这种综合征，但缺血再灌注损伤是最常用的，其具有归因于常常导致72小时后死亡或延长的机械通气的损伤的最严重形式的原发性移植失败。除了早期术后阶段的显著发病率和死亡率，严重缺血再灌注损伤还可与可导致长期移植肺功能障碍的急性排斥反应的增加的风险相关(FiserSM等人,AnnThoracSurg.2002年4月；73(4):1041-7；讨论1047-8)。
IRI以不良氧合为特征作为主要的条件标准，还以如由病理学上弥漫性肺泡损伤(IDAD)所揭示的低肺部顺应性、间质/肺泡水肿、胸部射线照片上的肺部浸润、增加的肺血管阻力、肺内分流和急性肺泡损伤为特点。在临床上，患者面临着长期通气、长期停留在ICU和医院总体内、增加的医疗费用和增加的发病率和死亡率的风险。
对于临床管理，肺移植已成为治疗患有难治性末期肺部疾病患者的主要依靠。然而，列出的肺移植患者的数量大大超过了可用的供体。全世界只有15至20％的脑死亡供体所提供的肺被使用，而80％的肺因为不符合供体的选择标准而被拒绝。诸如可导致移植后移植肺功能障碍和失败的不良气体交换或胸部X光浸润的临床发现显示出供体肺损伤。许多策略都提倡增加供体肺的数量。一些肺移植与活体亲属肺供体项目有关，而另一些则主要集中在非心脏跳动供体为策略来最终帮助减轻供体的缺乏。虽然活体亲属非供体已经在一些中心成功地使用，并且非心脏跳动供体的使用已被证明在人类中是可行的，整体而言这些策略由于技术、医学和伦理方面的考虑仍然仅限于少数病人。
虽然在过去10年里，扩大的供体肺的使用已导致整体肺移植活性逐渐增加，一些研究已经表明，这些肺的大量使用可导致更长的ICU入住时间，较高的早期死亡率和在第一年时较差的肺活量测定(KawutSM等人,Transplantation.2005年2月15日；79(3):310-6；PierreAF等人,JThoracCardiovascSurg.2002年3月；123(3):421-7；4,5)。
因此，分别对每个供体进行认真考虑，其在选择用于移植的扩大的供体肺可能承担的风险，应总是与在等候名单上的接受者死亡的风险进行权衡。供体肺的准确评估是选择可安全用于移植的器官的关键因素。不幸的是，使用目前的临床供体选择标准的移植后结果的预测是不准确的，而如胸部射线照片评价和支气管镜检查的发现的一些标准是相当主观的。在确定移植后结果中临床参数的不准确性偶尔导致使用了具有导致严重的原发性移植肺功能障碍(PGD)的无法识别的损伤的肺。更重要的是，据估计，如果更详细的器官评价是可能的，约40％当前临床上拒绝移植的肺可能已被安全地使用(WareLB等人,Lancet.2002年8月24日；360(9333):619-20)。这些肺会显著增加总供体肺的可用性。
基于使用来自心脏骤停后供体的肺的一般思路，可使用“离体”灌注(EVLP)技术来评估肺的肺功能，否则不能“体内”评价。经过60到90分钟短时间的“离体”评估后，捐赠的肺可成功地用于人体肺移植(SteenS等人,AnnThoracSurg.2007年6月；83(6):2191-48；IngemanssonR等人,AnnThoracSurg.2009年1月；87(1):255-60)。
其他研究也以实验的方式地展示了以充足的溶液进行短期“离体”灌注以便评估动物模型中肺功能和临床上不匹配人类肺中肺功能的可行性(RegaFR等人,AnnSurg.2003年12月；238(6):782-92；ErasmusME等人,TransplInt.2006年7月；19(7):589-93；EganTM等人,AnnThoracSurg.2006年4月；81(4):1205-1310-12)。
这种EVLP技术后进行肺移植的设想已经成功地转移到临床实践中。然而，目前为止EVLP仅被用于评价“离体”供体肺功能，并且EVLP尚未用于再调节供体肺和/或将治疗性活性药物给药到肺部。
本文中例举的肽已作为药品被公开于：
-WO2006/013183(肽与肺表面活性物质一起给药)，
-WO2010/099556(高通透性的治疗)，
-WO2011/085423所描述的(肺或胃肠外应用)，
-Parastoo等人，J.Med.Chem.2010,53,8021-8029(A549细胞中阿米洛利敏感钠流的激活)。
然而，任何这些出版物没有描述体外处理肺。
Vadasz等人2008年在CritCarMed的36卷第5期的1543-1550页和在Elia等人2003年在AmJRespandCritCarMed的168卷第9期的1043-1050页中描述了动物模型，其中，为了显示所使用的肽的活性对肺进行体外处理。没有表明或意图用于改善肺功能的体外处理和将由此处理的肺移植进接受者。此外，由于上皮/内皮屏障的损坏，根据这些出版物所使用的肺不适合重新植入。
令人惊奇地发现，在植入前可对供体肺进行“离体”灌注和通气，由此可在植入前通过给药生物活性化合物对离体处理的肺进行调节以在移植前改进肺的换气性能。
发明内容
一方面，本发明提供了一种体外调节/改善肺功能的方法，其包括以式I的氨基酸序列的环化化合物处理离体肺：
X1-GQRETPEGAEAKPWY-X2I
其中
X1包含具有1至4个、特别是1至3个残基的氨基酸(序列)，所述氨基酸包含天然或非天然氨基酸，特别是选自氨基酸(序列)C、KSP、K、鸟氨酸、4-氨基丁酸、β-丙氨酸，和
X2包含选自天然氨基酸的一种氨基酸，特别是选自C、D、G和E的组一种氨基酸，
并且其中
X1包含在其第一左侧位置的N-末端氨基酸和X2包含在其最后右侧位置的C-末端氨基酸。
在本发明的方法中的氨基酸序列中有用的天然氨基酸是已知的，并且包括例如G、A、V、L、I、M、P、F、WS、T、N、Q、C、U、Y、D、E、H、K、R。
在本发明的方法中的氨基酸序列中有用的非天然氨基酸包括
-具有天然氨基酸的主要结构、但不同于α-氨基酸的氨基酸，
-D形式(即不同于天然L-形式)的天然氨基酸，即烷基基团不在L-构型，而在D-构型中的天然氨基酸，
-包含2至12个(例如2至6个)碳原子，至少一个氨基基团(例如一个或两个)，和至少一个羧基基团(例如一个或两个)的非天然氨基酸，例如任选地除了在天然氨基酸中存在的取代基，如例如OH、-CONH2、-NH-C(＝NH2)NH2、SH、(C1-4)烷基-S-、苯基、杂环基(例如包含5或6环元件并包含至少一个选自N、O、S(优选地为N)的杂原子(例如一个或两个N)，任选地与另一个例如苯基(例如包括脯氨酸基、吲哚基、咪唑基)的环稠合。
在本发明的方法中的氨基酸序列中的非天然氨基酸包括鸟氨酸、4-氨基丁酸、β-丙氨酸。
另一方面，式I的氨基酸序列的环化化合物包括
-SEQIDNO:1序列
环(CGQRETPEGAEAKPWYC)
其中两个末端半胱氨酸残基形成二硫键；
-SEQIDNO:2序列
环(KSPGQRETPEGAEAKPWYE)
其中酰胺键形成于连接到N末端赖氨酸残基的ε-碳原子的氨基基团和连接到C末端谷氨酸残基的γ-碳原子的侧链羧基基团之间；
-SEQIDNO:3序列
环(KGQRETPEGAEAKPWYG)
其中酰胺键形成于连接到N末端赖氨酸残基的侧链ε-碳原子的氨基基团和C末端甘氨酸残基的羧基基团之间；
-SEQIDNO:4序列
环(鸟氨酸-GQRETPEGAEAKPWYG)
其中酰胺键形成于连接到N末端鸟氨酸残基的侧链δ-碳原子的氨基基团和C末端甘氨酸残基的羧基基团之间；
-SEQIDNO:5序列
环(4-氨基丁酸-GQRETPEGAEAKPWYD)
其中酰胺键形成于N-末端4-氨基丁酸残基的氨基基团和连接到C-末端天冬氨酸残基的β-碳原子的侧链羧基基团之间；
和
-SEQIDNO:6序列
环(β-丙氨酸-GQRETPEGAEAKPWYE)
其中酰胺键形成于N-末端β-丙氨酸(3-氨基丙酸)残基的氨基基团和连接到C-末端谷氨酸残基的γ-碳原子的侧链羧基基团之间。
SEQIDNO:7序列
环(CGQREAPAGAAAKPWYC)
其中在两个末端半胱氨酸残基之间形成的二硫键被制备仅用于比较，并不成为本发明的一部分。
在根据本发明的方法中有用的环化化合物在在本文中也被特指称为“(根据)本发明的环化的化合物”，并且包括任何形式的化合物，例如，游离形式和盐的形式，例如在生物环境中的本发明的化合物通常是盐的形式。
在另一个方面，本发明的环化化合物是盐的形式。
这样的盐优选地包括药学上可接受的盐，尽管包括药学上不可接受的盐，例如用于制备/分离/纯化目的。
在生物环境中的本发明的环化化合物的盐通常是盐酸盐。
游离形式的本发明的环化化合物可被转化成盐的形式的相应环化化合物；反之亦然。
本发明的环化化合物可以以异构体和其混合物的形式存在；例如光学异构体。本发明的环化化合物，例如可含有不对称碳原子并因此可存在于对映体或非对映体及其混合物的形式中，例如外消旋体。本发明的环化化合物可存在于(R)-、(S)-或(R,S)-构型中，优选地为在关于在本发明的环化化合物中的这种不对称碳原子上的各个取代基的(R)-或(S)-构型中。可对异构体混合物进行适当分离，如根据例如类似地常规方法，以得到纯的异构体。本发明包括任何异构体形式和任何异构体混合物的本发明的化合物。在天然氨基酸的情况下，取代基的构型和天然氨基酸中一样。
可适当制备本发明的环化化合物，例如根据例如类似地常规方法，例如或如本文所规定的，例如通过固相肽合成，任选地根据使用适当的偶合剂对2-氯三苯甲基氯树脂的芴甲氧羰基/叔丁基保护策略，如二异丙基碳二亚胺和/或N-羟基苯并三唑和适当溶剂，例如N,N-二甲基甲酰胺。受保护的氨基酸可从C末端的氨基酸开始相继偶合在肽链上。芴甲氧羰基保护基团的脱保护可使用碱实现，例如哌啶，如在合适溶剂中的20％哌啶，如N,N-二甲基甲酰胺。可以在酸的辅助下(诸如适当溶剂中的乙酸，如卤代烃(例如CH2Cl2)，例如乙酸和CH2Cl2的1:1混合物)将完全、任选地(部分)受保护的肽从树脂上裂解适当地下来。
在含有半胱氨酸的肽的情况下，从树脂裂解后，如果需要的话，可以进行侧链脱保护，例如用强酸，如三氟乙酸(TFA)，例如95％TFA/5％H2O。可以通过氧化末端半胱氨酸残基来进行环化以获得二硫键的环化，例如通过在pH为8.5对天然线性肽进行90小时的充气而得到。可以对所得的天然肽产物进行纯化，例如通过色谱法，例如通过在诸如RP-C18硅胶柱的适当柱上的反相介质压力液相色谱法(RP-MPLC)，方便地采用诸如5％至40％梯度的乙腈水溶液的梯度洗脱液。可以用醋酸置换三氟乙酸反离子，例如在诸如LewatitMP64柱(乙酸盐形式)的柱上。随着在水中的最终洗涤，可以对如乙酸盐的经过纯化的肽进行冻干，并且可以获得浅色的形式，例如白色粉末。
在无半胱氨酸的肽的情况下，从树脂的裂解之后，例如仍对部分被保护的线性肽酌情进行环化步骤。在对无半胱氨酸的肽进行选择性环化后，如果需要可以在TFA中进行侧链脱保护。例如，可以通过如利用制备性RP-MPLC的色谱法进行纯化步骤。例如，如上所述，可以用乙酸盐从由此获得的肽中置换三氟乙酸根离子。例如，对于含有半胱氨酸的肽，可以对肽的乙酸盐形式进行冷冻干燥。
所得的肽的分子量可以通过电喷雾离子化质谱法或MALDI-TOF-MS进行证实。例如，可以通过分析型高效液相色谱法来确定纯度。
本发明的环化化合物，例如包括式I的化合物，显示出令人感兴趣的药理活性，并由此作为药物是有用的。例如，如示例中所示的研究结果表明，吸入性应用根据本发明的环化化合物后，肺中的动态肺顺应性和动静脉氧分压差ΔpO2均有改善。还显示出当给药本发明的环化化合物时，增强了细胞钠离子电流。令人惊奇的是，尽管与具有氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的化合物相比，与具有氨基酸序列SEQIDNO:7的化合物中的氨基酸序列相当相似，具有氨基酸序列SEQIDNO:7的化合物在试验中没有表现出活性，其中具有氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的化合物表现出良好活性。
因此，本发明的环化化合物被指示为例如在移植前用于体外调节/改善肺功能。
惊奇地发现，本发明的环化化合物最好通过吸入给药的方式进行给药，例如足够分别吸入给药给药，即雾化(喷雾)到肺组织。
惊奇地发现，本发明的环化化合物(例如氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6(之一))通过肺组织被主动或被动转运至血液中是不被期望也不应该发生的，因为发现了如果环化化合物经由口腔吸入到达肺空腔而分离到肺组织表面，由此会激活定向尖端的阿米洛利敏感钠离子通道，在很大程度上有助于如氨基酸序列SEQID1至SEQID6的本发明的环化化合物的生理有效性。
为此，将如氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6(之一)的本发明的环化化合物首先溶解在水中以得到水溶液，并任选地对得到的溶液进行过滤，如以便除去杂质。任选地，对得到的滤液进行冻干，例如用于需要存储形式的情况。令人惊奇的发现，由此得到的经过冻干的本发明的环化化合物在长时间内是稳定的。在相对湿度60％、2至8℃下的24个月和在25℃下长达6个月后对该冻干物的稳定性进行测定。为此，采用如肉眼观察和反相HPLC的常用实验室分析方法。
在2至8℃下存储24个月后，还通过膜片钳实验来测定模(die)生物活性。经证明，所述冻干物在所述条件下是稳定的，其外观没有改变，甚至连式I的环化肽的含量和纯度也仅表现出小差异。而且生物活性基本保持不变。
下表列出了具有氨基酸序列SEQIDNO:1的环化化合物的水溶液的稳定性研究。
用喷雾器的辅助下，将式I的环化化合物(即氨基酸序列SEQIDNO:1的环化化合物)的水溶液转移至喷雾器中。在将水性溶液转移至3个不同的喷雾器后，测量液滴的粒径并列于下表：
可通过适当的实验提供式I的环化化合物在作为气雾剂被吸入后存在于肺组织而几乎不存在于血液中的证据。通过肠胃外给药，发现式I的环化化合物主要存在于血液中。
对于通过如气雾剂形式的吸入/喷雾而给药，对来自第一溶解步骤的水溶液或复溶于水的所获得的冻干物进行喷雾(雾化)以得到例如通过使用喷雾器的气雾剂。令人惊奇地发现，即使不加入通常使用的稳定剂和/或助剂，本发明如氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6(之一)的环化化合物的水溶液也可稳定相当长的时间。还发现，包含经过溶解的本发明环化化合物的汽化液滴的尺寸也可具有有利的影响。例如在优选实施方式中，(大部分)雾化液滴的液滴尺寸不超过5μm(上限值)，以便获得特别地成功结果。液滴尺寸的合适下限仅依赖液滴的可行性。
例如如图2A和图2B中所示，通过研究显示出本发明的环化化合物(特别是具有氨基酸序列SEQIDNO:1的环化化合物)提高了对通过以如利用喷雾器的吸入/喷涂给药而模拟肺移植的体外系统中猪肺的肺功能、动态肺一致性以及动静脉氧分压差ΔpO2的效果，。
另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包括例如至少一种式I的肽，其为适合于喷雾(吸入)以得到气雾剂的形式，或为适合于制备适合于喷雾(吸入)的气雾剂的形式，例如其中液滴的尺寸不超过5μm。
令人惊讶的是，在由本发明提供的气雾剂中，不需要稳定剂或其他助剂的存在。
附图说明
图1显示了依赖于所应用浓度的氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的环肽的活性。x轴上以nM(对数标度)表示SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的环蛋白的浓度，y轴以％表示钠离子电流。
图2显示了模拟肺移植在体外肺灌注(离体)期间吸入式应用SEQIDNO:1的肽的结果。
图2A中，x轴时间点T1到T4表示每小时进行的测试，而y轴表示顺从性；而在图2B中，x轴还表示时间点T1到T4，而y轴是动静脉氧分压差ΔpO2。在吸入给药肽SEQIDNO:1后每小时进行一次测量。注射用水(WFI)被用作对照。显示了每组8次实验的平均值。
具体实施方式
在下面的实施例中，所有的温度均为℃(摄氏度)。
实施例1
肽合成
利用依据对2-氯三苯甲基氯树脂的芴甲氧羰基/叔丁基保护策略的固相肽合成来合成所有肽。二异丙基碳二亚胺和N-羟基苯并三唑作为偶联剂。所有偶合步骤在N,N-二甲基甲酰胺中进行。受保护的氨基酸可从C末端的氨基酸开始相继偶合至肽链上。芴甲氧羰基的脱保护可在20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺中进行。来自树脂的被完全、部分保护的肽的裂解是在乙酸和二氯甲烷的1:1混合物中进行的。在含有半胱氨酸的肽的情况下，从树脂裂解后，在95％三氟乙酸、5％H2O中进行侧链脱保护，然后通过氧化末端半胱氨酸残基进行环化，对末端半胱氨酸残基的氧化是通过在pH8.5下对天然线性肽进行90小时的透气而实现的。可以利用反相介质压力液相色谱法(RP-MPLC)在RP-C18硅胶柱上以5％至40％梯度的乙腈对天然肽产物进行纯化。最后，在LewatitMP64柱(乙酸形式)上以醋酸置换三氟乙反离子。自水中进行最后洗涤后，对如乙酸盐的纯化的肽进行冻干，并且获得白色至灰白色的粉末。在无半胱氨酸的肽的情况下，从2-氯三苯甲基氯树脂的裂解之后对被部分保护的线性肽进行环化步骤。在对无半胱氨酸的肽进行选择性环化后，在三氟乙酸中进行侧链脱保护，然后进行制备性RP-MPLC，对于含半胱氨酸的肽类，以醋酸盐置换三氟乙酸根离子并对醋酸盐形式的肽进行冻干。所得的肽的分子量可以通过电喷雾离子化质谱法或MALDI-TOF-MS得以证实，其纯度可通过分析型高效液相色谱法得以确定。
肽SEQIDNO:1的纯度是96.3％.m/z(ESI)1924.2(M++1)。
肽SEQIDNO:2的纯度是96.3％.m/z(ESI)1924.2(M++1)。
肽SEQIDNO:3的纯度是98.8％.m/z(ESI)1888.2(M++1)。
肽SEQIDNO:4的纯度是97.4％.m/z(ESI)1873.4(M++1)。
肽SEQIDNO:5的纯度是100％.m/z(MALDI-TOF)1901.6(M++1)。
肽SEQIDNO:6的纯度是100％.m/z(MALDI-TOF)1902.7(M++1)。
肽SEQIDNO:7的纯度是95％.m/z(MALDI-TOF)1778.02(M++1)。
实施例2
在本发明的环状化合物的生物活性的评估
在人上皮细胞系A549(ATTACNr.CCL-185)的第80-90代进行实验。细胞生长于补充有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉的达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基/哈姆F12营养混合物(DMEM/F12)中。所有的培养基购自Sigma-Aldrich公司(密苏里州圣路易斯)。
室温(19-22℃)下，在种植后24至48小时后的A549细胞上研究肽SEQIDNO:1至SEQIDNO:7对钠离子电流的生物活性。以膜片钳方法在全细胞模式中记录电流。将具有培养细胞的盖玻片转移到安装在倒置显微镜平台上1ml容量的腔室中(Zeiss，Axiovert100)。腔室中含有1ml的以下组合物(以mM计)的电解液：145NaCl、2.7KCl、1.8CaCl2、2MgCl2、5.5葡萄糖和10HEPES，用1M的NaOH溶液调节pH至7.4。以火焰布朗(FlamingBrown)微量吸液管拉出器(87页，SutterInstruments，CA，美国)将微量吸液管从薄壁硼硅玻璃毛细管(WorldPrecisionInstruments公司，佛罗里达州，美国)中拉出，并用抛光仪(NARISHIGE，东京，日本)进行抛光以获得范围在2.0至3.5兆欧的电极电阻。吸液管溶液含有(以mM计)：135甲烷磺酸钾、10KCl、6NaCl、1Mg2ATP、2Na3ATP、10HEPES和0.5EGTA(乙二醇四乙酸)，用1MKOH溶液调节pH至7.2。用于吸液管和电解液的化学品由Sigma-Aldrich公司(维也纳，奥地利)提供。以Axopatch200B膜片钳放大器(AxonInstruments，CA，美国)进行电生理测量。取消容量瞬变，同时补偿串联电阻。在5KHz下对全细胞电流进行过滤并在10KHz下进行采样。在配备有pCLAMP10.0软件(AxonInstruments，CA，美国)的PC上直接处理数据采集和存储。
形成GΩ-密封后，5分钟的平衡时间之后在-100至+100mV范围在各个控制电位以每分钟递增20mV的多个控制电位处(Eh)进行对照记录。然后，将用蒸馏水配制的储藏液的等分试样逐渐增加地加入到电解液中，产生3.5至240nM范围浓度的肽SEQID1至6。洗入(wash-in)相持续约1分钟。达到稳定状态后，对各浓度的肽以及对照记录过程中应用相同的实验方案。对浓度-响应曲线和EC50值进行拟合和估计用于以SIGMAPLOT9.0在-100mV的Eh上记录的电流。以学生T检验计算EC50中差异的统计学显著性(P<0.05)。对于离子选择性的评价，在添加肽SEQIDNO:1至SEQIDNO:7之前，用10至100μM阿米洛利盐酸盐水合物阻断钠离子电流。继而加入的10mM氯化四乙铵(TEA)显示了电流中任何观察到的增加是否归因于钾电流。在Eh＝-100mV时也进行这些实验。
表1中显示了确定肽SEQIDNO:1至SEQIDNO:7对采用全细胞记录的膜片钳试验中测量出钠离子电流的作用的结果，表1列出了肽SEQIDNO:1至SEQIDNO:7对采用全细胞记录模式以A549细胞系进行的膜片钳试验中的细胞钠离子电流的活性。试验中的各个肽的活性表示为各个肽的EC50(以nM计)，其中EC50为观察到最大活性的50％(即在电流I中的最大增加)时的有效浓度。
表1
肽 EC50(nM)
SEQ ID 1 54
SEQ ID 2 56
SEQ ID 3 38
SEQ ID 4 45
SEQ ID 5 24
SEQ ID 6 19
SEQ ID 7 无活性
图1中显示了从对肽SEQIDNO:1至SEQIDNO:6采用全细胞记录模式以细胞系A549进行的膜片钳试验中得到的剂量-响应曲线，其中可以看出SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的肽对于钠离子电流的浓度-响应曲线。将最大钠离子电流设定为100％。对于SEQID1至SEQID6的所有肽，可以在120nM的肽浓度下观察到最大效应。
肽SEQIDNO:7显示无活性。
实施例3
肽SEQIDNO:1至SEQIDNO:7对去糖基化细胞表面的作用
在如上所述的全细胞模式的实验中，在将膜片钳测量之前当即将A549细胞与100个单位的酶“PNGaseF”(肽-N4-(N-乙酰基-β-D-葡萄糖胺基)天冬酰胺酰胺酶F)培养1-5分钟，并且在将具有经过培养的细胞的盖玻片转移到1ml电解液的腔室前以外部溶液对其进行漂洗。在对照记录之后，将240nM的肽SEQIDNO:1至SEQIDNO:7加入到电解液中。
在Eh＝-100mV下，记录对照条件下未经任何预处理的细胞、继而加入肽SEQIDNO:1至SEQIDNO:7的细胞以及用PNGaseF预处理的细胞的全细胞电流。
表2中呈现了在全细胞模式中采用膜片钳试验的去糖基化实验的结果，其中显示了利用SEQIDNO:1至SEQIDNO:7的肽对A549细胞进行去糖基化对激活钠离子电流的作用。在Eh＝-100mV时记录全细胞电流。电解液中SEQIDNO:1至SEQIDNO:7的肽的浓度为240nM。
表2
表2中的结果清楚地显示出在膜片钳试验前以PNGaseF对A549细胞进行预处理，破坏SEQIDNO:1至SEQIDNO:6的肽的能力从而增强了钠电流。在-100mV的控制电位并且无需向电解液加入肽的对照条件下，未经处理的细胞和没有以PNGaseF进行预处理的细胞中的钠离子电流均为25.4pA。未经处理的细胞中，在-100mV的控制电位下，向电解液加入肽SEQIDNO:1至SEQIDNO:6(终浓度240nM)导致超过1000pA的敏感钠离子电流。SEQIDNO:7的肽显示无活性。
实施例4
猪的肺移植实验
将脑死亡猪成背卧位，并进行纵向胸骨切开术。将心包和两个胸膜腔都打开。结扎上、下腔静脉。将内流导管通过右心室流出段上的荷包(purse-string)放置于肺动脉内。
通过结扎使上、下腔静脉中向内的血流得到闭合，将动脉夹紧来闭合向外的血流。然后通过内流导管用顺行冲洗的冷等渗保存溶液(每公斤猪体重50ml，含有钾离子、钠离子、镁离子、钙离子、氯离子、葡聚糖、葡萄糖、缓冲剂离子)保存肺。左心耳的切口导致血液外流。在此期间，用50％的氧气进行肺换气，并且将碎冰放置在两个胸膜腔和纵隔膜中。
移出技术是根据以下步骤整块切取心脏和食管。
a)清除气管两侧桥接至胸腔的软组织。
b)横切两个经肺韧带(非常深，难以暴露)，然后分别横切VCI、下部胸降主动脉和食管。
c)钝性分离剩余纵膈粘连。
d)在使用吻合器关闭气管前完成对供体肺的充气。
移出后，将肺包裹在纱布中放置于填充有低钾葡聚糖细胞外溶液的隔热冰袋中，并在4℃下储存18至24小时。温度探针浸没在放置在冰箱中的容器中。
对于离体肺调节，采用了EVLP技术(血管外肺灌注)。EVLP技术中，将供体肺放置在泵、通气机和过滤器构成的回路。EVLP技术，温度可升高到37℃。在EVLP技术中，通气机用于向肺部传递氧气。泵用于对肺灌注含有人体白蛋白和营养的细胞外溶液。在EVLP期间，可以定期对肺功能的关键指标进行评估。
对于实验性猪肺移植实验，以2.0升人体白蛋白溶液填装EVLP回路。这种细胞外溶液具有最佳胶体渗透压。对回路进行脱气后，将其连接到肺部前在20℃下使填装物进行循环。将肝素、头孢呋辛甲泼尼龙添加到灌注液中。
猪供体肺的制备以将漏斗形硅橡胶管与内置于左心房(LA)套囊缝合在一起开始，以便用夹板将LA固定为开放状态并保持灌注回路封闭。利用连续5-0单纤丝线缝合将该管牢固地接合于LA套囊以提供可靠和有效的外流途径。将相同类型的插管用于肺动脉(PA)的插管，根据需求修整至匹配PA尺寸。用500ml的缓冲细胞外液进行表背逆行冲洗。将供体肺安装至EVLP回路中前，将气管打开并进行直接支气管抽吸来清理呼吸道。将内切气管导管(尺寸8mmI.D.)插入气管并用脐带胶带固定牢固。此后，将肺转移到EVLP回路单元。首先，将LA插管连接至回路并启动缓慢逆流以对PA插管进行脱气。一旦脱气完成后，将PA插管连接到回路并在室温下以150ml/min的灌注液启动顺行流动。在接下来的30分钟内将灌注液的温度逐渐升高至37℃。当达到32-34℃的温度时，通气机开始对供体猪肺进行机械通气并且逐渐增加灌注流速。
启动EVLP气流向肺供应氧气并经由气体交换膜向流入灌流液(86％N2、6％O2、8％CO2)提供二氧化碳(以0.5L/min的气体流开始并基于流入灌流液的pCO2进行滴定)以保持35至45毫米汞柱范围的流入灌流液pCO2。在肺被完全扩展后，将采用标准的单液体雾化系统的单剂量AP301(1mg/kg在5ml的Aqua中)应用于由EVLP回路系统通气和灌注的供体猪肺。
EVLP实验过程中，不断对灌注进行评估。每小时测量并记录以下功能参数：肺动脉流(PAF)：L/min
·(平均值)肺动脉压(PAP)：毫米汞柱
·左心房压(LAP)：毫米汞柱
·肺血管阻力(PVR＝[PAP-LAP]×80/PAF)：dynes/sec/cm-5
·平均值，峰值和平衡气道压(mAwP、peakAwP、platAwP)：cmH2O
·动态顺应性(mL/cmH2O)
·灌流液气体分析-流入(PA)和流出(PV)PO2，PCO2和pH值。
结果
这项研究在模拟肺移植的体外系统中评估了肽SEQIDNO:1对肺功能的作用。
如图2A和图2B所示，研究结果表明在吸入应用时动态肺顺应性和动静脉氧分压差ΔpO2均在使用SEQIDNO:1的肽治疗的肺部中得到改善。
SEQIDNO:7的肽的肺部应用对肺功能没有提供改善作用。
实施例5
猪的肺移植试验
从实施例4以肽SEQIDNO:1对供体肺进行预处理后，将肺重新植入到受体猪。对移植肺进行再灌注后立即给药肽SEQIDNO:1。
在第六肋间的位置进行左侧开胸手术，准备左侧肺门。剥离并横切左侧的半奇静脉，由于其隐藏了左肺动脉和左心房。剥离后，可拉起结扎端以便于暴露手术区域。结扎右肺动脉和支气管。使用血管钳进行左全肺切除。施用单次静脉剂量的甲基强的松龙(500至1000毫克)和低剂量的肝素(100IU/kg，见上文)后即刻进行植入。利用用于支气管接合的4-0PDS和用于肺动脉和左心房接合的5-0聚丙烯缝线将供体肺再次植入。猪体内，右肺上还有额外的具有两条进入左心房的静脉的肺叶(静脉叶)(1条静脉叶的单独静脉，1条起源于右侧下叶静脉主干的额外静脉)。在供体左心房中，在背表分离期间通过缝合闭合这些静脉以实现肌肉心房套囊/缝合线的可能性。分别夹紧左心房的左部是至关重要的，因为很难找到用于Satinsky夹钳的右侧面。猪对左心房的夹紧的耐受性较差，因此在完成心房接合后应立即释放夹钳，以减少右侧原生肺的毛细血管后肺动脉压力。然后进行支气管接合。在受体肺动脉干上用供体的肺动脉主干贴剂进行动脉接合，以确保广泛的接合并为右心室确保较大流出区域。
完成对血管接合后，以标准方式对植入的肺进行逆行冲洗，然后顺行冲洗。此后，部分释放动脉钳10分钟以提供受控的再灌注。
再灌注前小心继续保持局部低温。在再灌注过程中以标准模式对移植肺进行通气。在相关组的受体动物体内，在通气的起始阶段以雾化吸入(1mg/kg在5ml的Aqua中)开始给药肽SEQIDNO:1。
在重新植入后胸部保持开放，并且用塑料袋覆盖移植的肺。
在额外24小时的时间内对左侧供体肺进行评价。
评估了以下参数：
通过氧化参数对移植功能进行功能性评估：24小时内每2小时从左侧肺静脉进行动脉血气分析以及选择性血气分析。计算呼吸指数：RI＝PaO2/FiO2。
肺顺应性通过麻醉通气机的压力和体积数据计算出来。
移植肺功能的评估通过测量湿/干重比来估算血管外肺水。
通过血液动力学测量(在线测量)和肺血管阻力(PVR)对移植功能进行功能性评价：对包括肺动脉压(PAP)的血液动力学进行了连续测量。通过利用Swan-Ganz导管对心输出量(CO)测量。肺血管阻力由以下公式计算：PVR(dynes.sec-1.cm-5)＝(PAP-LAP)×80/CO。
结果
这项研究评估了重新植入后肽SEQIDNO:1对肺功能的作用。
以肽SEQIDNO:1对供体肺进行预处理改善了初始移植功能和气体交换，减缓了肺水肿的进展并降低了由移植肺的功能障碍引起的缺血再灌注损伤的速率。

Claims (11)

1.一种体外调节/改善肺功能的方法，包括以式I的氨基酸序列的环化化合物处理离体肺：
X1-GQRETPEGAEAKPWY-X2I
其中
X1包含具有1至4个、特别是1至3个残基的氨基酸(序列)，所述氨基酸包含天然或非天然氨基酸，和
X2包含选自天然氨基酸的一种氨基酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在式I的化合物中的X1选自包含C、KSP、K、鸟氨酸、4-氨基丁酸、β-丙氨酸的组。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中X2包含选自C、D、G和E的组的一种氨基酸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在X1中的第一个氨基酸残基和X2中的最后一个氨基酸残基之间发生环化。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中通过酰胺键或通过二硫键发生环化。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中式I的化合物选自由以下组成的组：
-SEQIDNO:1
环(CGQRETPEGAEAKPWYC)
其中两个末端半胱氨酸残基形成二硫键；
-SEQIDNO:2
环(KSPGQRETPEGAEAKPWYE)
其中酰胺键形成于连接到N末端赖氨酸残基的ε-碳原子的氨基基团和连接到C末端谷氨酸残基的γ-碳原子的侧链羧基基团之间；
-SEQIDNO:3
环(KGQRETPEGAEAKPWYG)
其中酰胺键形成于连接到N末端赖氨酸残基的侧链ε-碳原子的氨基基团和C末端甘氨酸残基的羧基基团之间；
-SEQIDNO:4
环(鸟氨酸-GQRETPEGAEAKPWYG)
其中酰胺键形成于连接到N末端鸟氨酸残基的侧链δ-碳原子的氨基基团和C末端甘氨酸残基的羧基基团之间；
-SEQIDNO:5
环(4-氨基丁酸-GQRETPEGAEAKPWYD)
其中酰胺键形成于N-末端4-氨基丁酸残基的氨基基团和连接到C-末端天冬氨酸残基的β-碳原子的侧链羧基基团之间；
和
-SEQIDNO:6
环(β-丙氨酸-GQRETPEGAEAKPWYE)
其中酰胺键形成于N-末端β-丙氨酸(3-氨基丙酸)残基的氨基基团和连接到C-末端谷氨酸残基的γ-碳原子的侧链羧基基团之间。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中式I的所述环化化合物是盐的形式。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中通过喷雾给药式I的环化化合物，其中X1和X2是如权利要求1至7任一项中所定义的。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中通过使用喷雾器给药式I的环化化合物，其中X1和X2是如权利要求1至7任一项中所定义的。
10.一种药物组合物，其包含如权利要求1至7任一项中所定义的式I的肽，其为适合于喷雾以获得用于吸入的气雾剂的形式，或为适合于制备喷雾剂以在喷雾时获得适合于吸入的气雾剂的形式。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其中液滴的尺寸≤5μm。
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