JP6212123B2 - 血栓溶解、フリーラジカル捕捉および血栓へのターゲティング機能を兼ねる新規化合物およびその製造方法と用途 - Google Patents
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Description
その中、NNはNOフリーラジカル捕捉活性を有するイミダゾリン類を表し、AA1は少なくとも3つの連結用基を有するリンカーを表し、AA2は血栓溶解活性を有するペプチドを表し、AA3は血栓へのターゲティングペプチドを表す。
そのうち、aa1およびaa2が、同時に存在することでも、aa1が存在するがaa2が存在しないことでも、または同時に存在しないことでもよい。同時に存在する時、aa1がR (Arg)で、且つaa2がG (Gly)、A (Ala)またはQ (Gln)であり、aa1が存在するがaa2が存在しない時、aa1がR (Arg)であり、aa3がS (Ser)、V (Val)、またはF (Phe)でもよい。
そのうち、aa1およびaa2が、同時に存在することでも、aa1が存在するがaa2が存在しないことでも、または同時に存在しないことでもよい。それらが同時に存在する時、aa1がR (Arg)で、且つaa2がG (Gly)、A (Ala)またはQ (Gln)であり、aa1が存在するがaa2が存在しない時、aa1がR (Arg)であり、aa3がS (Ser)、V (Val)、またはF (Phe)でもよい。aa1はR (Arg)が好ましく、aa2はG (Gly)が好ましく、且つaa3はV (Val)が好ましい。
そのうち、aa1およびaa2が、同時に存在することでも、aa1が存在するがaa2が存在しないことでも、または同時に存在しないことでもよい。それらが同時に存在する時、aa1がR (Arg)で、且つaa2がG (Gly)、A (Ala)またはQ (Gln)であり、aa1が存在するがaa2が存在しない時、aa1がR (Arg)であり、aa3がS (Ser)、V (Val)、またはF (Phe)でもよい。aa1はR (Arg)が好ましく、aa2はG (Gly)が好ましく、且つaa3はV (Val)が好ましい。
(1) NOフリーラジカル捕捉活性を有するイミダゾリン類(NN)、少なくとも3つの連結用基を有するリンカー(AA1)、血栓溶解活性を有するペプチド(AA2)及び血栓へのターゲティングペプチド(AA3)を提供する工程(そのうち、リンカーが第一連結用基、第二連結用基及び第三連結用基をもつ)
(2) 適当な反応条件下において、NOフリーラジカル捕捉活性を有するイミダゾリン類(NN)とリンカー(AA1)の第一連結用基をつなぎ、一般式IM−1の化合物を形成する工程
NN−AA1 (IM−1)
(3) 適当な反応条件下において、血栓溶解活性を有するペプチド(AA2)と一般式IM−1の化合物をつなぎ、一般式IM−2の化合物を形成する工程(そのうち、血栓溶解活性を有するペプチドの一端がリンカーの第二連結用基とつながる)
NN−AA1−AA2 (IM−2)
(4) 適当な反応条件下において、血栓へのターゲティングペプチド(AA3)と一般式IM−2の化合物をつなぎ、一般式Iの化合物を形成する工程(そのうち、血栓へのターゲティングペプチドの一端がリンカーの第三連結用基とつながる)を含み、そのうち、工程(3)と工程(4)の順序を交換してよい。
一つの実施態様として、本発明の製造方法におけるリンカーの第一連結用基がアミノ基であり、且つ前記第二および第三連結用基がカルボキシル基およびアミノ基から選ばれる。
(2) 1,3−ジオキソ−2−[(4−オキシ酢酸)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンとL−Lysリンカーの一つのアミノ基がつながり、PAK配列(配列番号1)を含むオリゴペプチド上のアミノ基とL−Lysリンカーのカルボキシル基がつながり、且つRGD配列(配列番号2)を含むオリゴペプチド上のカルボキシル基とL−Lysリンカーのもう一つのアミノ基がつながる(前記一般式I−2の化合物が示す通り)。
(1) 1,3−ジオキソ−2−(4−オキシ酢酸基−フェニル)−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンを製造する。
(2) 1,3−ジオキソ−2−[(4’−オキソアセチル−Lys−OMe)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン(Lysリンカーのカルボキシル基を保護基で保護する)を製造する。
(3) HCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−OBzl、HCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Val−ObzlまたはHCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Phe−Obzlを製造する。
(4) Boc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)を製造する。
(5) Boc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)を1,3−ジオキソ−2−[(4’−オキソアセチル−Lys−OMe)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンのリジンにつなぐことで1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンが得られる。
(6) HCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−OBzl、HCl・Arg(NO2)−Gly−Asp (OBzl)−Val−ObzlまたはHCl・Arg (NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Phe−Obzlをそれぞれ1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala− Lys(Z)]−Lys}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンとコンジュゲートすることで、1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc− Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys−Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン、1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]− Lys−Arg−(NO2)−Gly−Asp− (OBzl)−Val−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチル−イミダゾリンまたは1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Gly−Arg (NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys−Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Phe−OBzl}フェニル}− 4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンがそれぞれ得られる。
(7) 工程(6)で製造された化合物の保護基を除去することで、1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Gly−Arg−Pro−Ala−Lys]− Lys−Arg−Gly−Asp−Ser}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン、1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Gly−Arg−Pro− Ala−Lys]−Lys−Arg−Gly−Asp−Val}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンまたは1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Gly− Arg−Pro−Ala−Lys]−Lys−Arg−Gly−Asp−Phe}フェニル}− 4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンが得られる。
2−ニトロプロパン69 g (0.78 mol)をNaOH (6N)水溶液130 mlに入れ、氷塩浴で撹拌しながら1 h 以内でBr2 20 ml (0.38 mol)を滴下し、その後エタノール240 mLを加え、90℃で3 h還流させ、反応液を熱いうちに氷水800 mlに入れて、表記化合物55 g (81%)を濾過した。その化合物は無色のシート状結晶であり、Mpが110−112℃である。
2,3−ジメチル−2,3−ジニトロブタン7 g (40 mmol)およびNH4Cl 4 gをエタノール水溶液80 mL (50%)に懸濁して、氷浴で撹拌しながら3 h以内で亜鉛粉16 gを加えた。亜鉛粉の添加が完了した後、氷浴を外し、引き続き室温で3 h攪拌反応した後、反応液を吸引ろ過した。エタノール水溶液(50%)でケーキを繰り返し洗浄して、ろ液と洗浄液を合わせて、濃塩酸でpH=2になるように調整して、スラリ状になるまで減圧蒸発した。適量な炭酸カリウムを加え、均一に攪拌した後、クロロホルムを抽出剤として、ソックスレー抽出器により6 h抽出した。抽出液を少量になるまで減圧濃縮し、石油エーテルを加えた後、表記化合物2.60 g (44%)が析出した。その化合物は無色の結晶であり、Mpが157−159℃である。
p−ヒドロキシベンズアルデヒド1.22 g (10 mmol)と2,3−ジメチル−2,3−ジヒドロキシアミノブタン1.48g (10 mmol)をメタノール10 mLに溶かし、室温で8 h攪拌した後、TLCで原料スポットがなくなったことを確認した。吸引ろ過により表記化合物である無色の結晶1.29 g (51%)が得られた。EI−MS (m/z) 252 [M]+. 1H−NMR (DMSO−d6) δ(ppm) = 1.03 (s, 6H), 1.05 (s, 6H), 4.39 (s, 1H), 6.70 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 7.23 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 7.63 (s, 1H), 7.85(s, 2H)。
1,3−ジヒドロキシ−2−(4’−ヒドロキシフェニル)−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリジン504 mg (2 mmol)をメタノール30 mLに溶かし、PbO2 3 gを加え、室温で40 min攪拌し、TLCで原料スポットがなくなったことを確認した。吸引ろ過により固体を除去し、室温でろ液を減圧蒸発乾燥して、カラムクロマトグラフィーにより残存物を精製する(クロロホルム溶出)ことで、表記化合物である青色の固体260 mg (52%)が得られた。Mp 134−135℃,EI−MS (m/z) 249 [M]+. IR (KBr) 3250,1610,1500,1490, 840。
1,3−ジヒドロキシ−2−(4’−ヒドロキシフェニル)−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン250 mg(1 mmol)、ブロモ酢酸エチル0.32 mL及び水素化ナトリウム32 mgを無水THF 5 mLに溶かし、混合物を60℃で5時間攪拌し、TLCで原料スポットがなくなったことを確認した。室温で減圧ろ過し、ろ液を乾燥になるまで減圧濃縮して、カラムクロマトグラフィー(酢酸エチル:石油エーテル=1:5)により残存物を精製することで、目的化合物300 mg (90%)が得られた。Mp 107−109℃。
1,3−ジオキソ−2−(4’−オキシ酢酸エチル−フェニル)−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン33 mg (0.1 mmol)とメタノール3 mLの溶液にNaOH(2N)水溶液7滴を加え、室温で30 min攪拌し、TLCで原料スポットがなくなったことを確認した。反応液を減圧濃縮し、残存物をまず飽和食塩水2 mLで希釈して、さらに2N HClでpH 6になるまで調整し、その後酢酸エチルで3回(3 ml × 3)抽出した。合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで干燥しろ過して、室温でろ液を乾燥になるまで減圧濃縮することで、表記化合物である青色の結晶30 mg (99%)が得られた。Mp 155−157℃. EI−MS (m/z) 307 [M]+。
NOフリーラジカル捕捉活性を有するイミダゾリン類とリンカーとの組合せ:1,3−ジオキソ−2−[(4’−オキソアセチル−Lys−OMe)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン
1,3−ジオキソ−2−(4’−オキシ酢酸−フェニル)−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン307 mg(1 mmol)と無水THF 30 mlの溶液を氷浴で攪拌した。溶液にDCC 250 mg (1.2 mmol)とHOBt 135 mg (1 mmol)を加え、氷浴で10 min攪拌した。当該溶液にHCl・Lys(Boc)−Ome 300 mg (1 mmol)、N−メチルモルホリン122 mg (1 mmol)及び無水THF 6 mLで調製した溶液を加えた。得られた反応混合物を室温で24時間反応させた。TLC(酢酸エチル:石油エーテル = 2:1)でHCl・Lys(Boc)−Omeがなくなったことを確認した。反応混合物を乾燥になるまで減圧濃縮し、酢酸エチルにより残存物を溶解して、不溶物をろ過して取り除く。飽和重炭酸ナトリウム水溶液および飽和塩化ナトリウム水溶液で順次にろ液を洗浄した。分離した酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで干燥し、ろ過して、ろ液を37℃で減圧濃縮(以下、これらの操作を通常の処理と総称する)した。カラムクロマトグラフィーにより残存物を精製する(酢酸エチル:石油エーテル = 2:1)ことで、表記化合物である青色の固体433 mg(65%)が得られた。ESI−MS(m/z) 550 [M + H]+。
1,3−ジオキソ−2−[(4’−オキソアセチル−Nω−Boc−Lys−OMe)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン625 mg (1 mmol)を無水塩化水素−酢酸エチル液15mL (4N)に溶かし、室温で3時間攪拌し、TLC(CHCl3:MeOH, 20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。通常の方法により反応混合物を処理し、残存物を無水エチルエーテルで結晶化させ、表記化合物が得られた。
Boc−Ala 473 mg (2.5 mmol)を無水THF 10 mlに溶かす。氷浴において、HOBt 338 mg(2.5 mmol)、DCC 619 mg(3 mmol)及び無水THF 10 mLで調製した溶液を加えた。氷浴で反応混合物を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Lys(Z)−Obzl 936 mg (2.3 mmol)、N−メチルモルホリン232 mg (2.3 mmol)及び無水THF 6 mLで調製した溶液を加えた。得られた反応混合物を室温で24時間反応し、TLC (CHCl3:MeOH = 30:1)でHCl・Lys(Z)−OBzlがなくなったことを確認した。反応混合物を通常の処理で表記化合物である無色の固体1.204 g (97%)が得られた。Mp 88−90℃.
(外1)
=−29.2 (c = 0.1, MeOH). ESI−MS(m/z) 565 [M + Na]+。
Boc−Ala−Lys(Z)−OBzl 1.354 g (2.5 mmol)を無水塩化水素−酢酸エチル溶液約10 ml (4N)に溶かし、室温で3時間攪拌し、TLC(CHCl3:MeOH、30:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応混合液を室温で減圧濃縮し、残存物をさらに酢酸エチルで溶かし、室温で濃縮する。遊離した塩化水素(以下、これらの操作を通常の処理と総称する)が完全に除去されるまで、このように複数回繰り返した。残存物を無水エチルエーテルで結晶化させ、表記化合物が得られ、そのまま次の反応に用いられる。
Boc−Pro 538 mg (2.5 mmol)を適量の無水THFに溶かし、氷浴でHOBt 338 mg (2.5 mmol)、DCC 619 mg (3 mmol)の無水THF溶液を加え、20分間反応させた。当該溶液にHCl・Ala−Lys(Z)−Obzl 1.099 g (2.3 mmol)、N−メチルモルホリン232 mg(2.3 mmol)及び無水THF 10 mLで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH, 20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を通常の処理することで、表記化合物2.847 g (98%)が得られた。Mp 82−83℃.
(外2)
=−46.4 (c = 0.11, MeOH). ESI−MS(m/z) 661 [M + Na]+。
Boc−Pro−Ala−Lys(Z)−OBzl 1.596 g (2.5 mmol)を無水塩化水素−酢酸エチル液15 mL (4N)に溶かし、室温で3時間攪拌し、TLC(CHCl3:MeOH, 20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。通常の方法で反応混合物を処理することで、残存物を無水エチルエーテルで結晶化させ、表記化合物が得られ、そのまま次の反応に用いられる。
氷浴でBoc−Arg(NO2) 798 mg(2.5 mmol)、HOBt 338 mg (2.5 mmol)、DCC 619 mg (3 mmol)および無水THF 10 mLの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Pro−Ala−Lys(Z)−Obzl 1.322 g (2.3 mmol)、N−メチルモルホリン232 mg(2.3 mmol)と無水THF 5 mLで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH, 20:1) で原料スポットがなくなったことを確認した。通常の処理で、表記化合物1.642 g (85%)が得られた。Mp 84−85℃.
(外3)
=−65.0 (c = 0.13, MeOH). ESI−MS (m/z) 864 [M + Na]+。
Boc−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)−OBzl 2.099 g (2.5 mmol)を無水塩化水素−酢酸エチル液20 mL (4N) に溶かし、室温で3時間攪拌し、TLC(CHCl3:MeOH, 20:1) で原料スポットがなくなったことを確認した。通常の方法で反応混合物を処理することで、残存物を無水エチルエーテルで結晶化させ、表記化合物が得られ、そのまま次の反応に用いられる。
氷浴でBoc−Ala 473 mg(2.5 mmol)、HOBt 338 mg(2.5 mmol)、DCC 619 mg (3 mmol)および無水THF 10 mLの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)−OBzl 1.785 g(2.3 mmol)、N−メチルモルホリン232 mg(2.3 mmol)と無水THF 5 mLで調製した溶液を加え、24時間反応させることで、表記化合物1.802 g (86%)が得られた。Mp 87 − 89℃.
(外4)
=−63.9 (c = 0.12, MeOH). ESI−MS(m/e) 934 [M + Na]+。
Boc−Ala−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)−OBzl 921 mg(1 mmol)をメタノール3 mLに溶かし、氷浴でNaOH水溶液(2N)を加え、室温で30 min攪拌した。pH 12を保持し、氷浴で10 min攪拌し、TLCで原料スポットがなくなったことを確認した。2N HClでpH 7に調整して、反応液を減圧濃縮し、残存物を飽和食塩水2 mLで希釈して、2N HClでpH 2に調整し、酢酸エチルで3回抽出して(5 mL× 3)、合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、室温で減圧濃縮することで表記化合物である無色の固体767 mg (80%)が得られた。EI−MS (m/z) 830 [M − H]−。
氷浴でBoc−Asp(OBzl) 808 mg(2.5 mmol)、HOBt 338 mg(2.5 mmol)、DCC 619 mg(3 mmol)および無水THF 10 mLの溶液を20分間攪拌反応した。当該溶液にHCl・Ser(Bzl)−Obzl 740 mg (2.3 mmol)、N−メチルモルホリン232 mg (2.3 mmol)と無水THF 5 mLで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH, 20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を通常の処理することで表記化合物である無色の油状物1.29 g (95%)が得られた。ESI−MS(m/z) 591 [M + H] +。
Boc−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−OBzl 1.477 g (2.5 mmol)を無水塩化水素−酢酸エチル液(4N) 15 mL に溶かし、且つ室温で3時間攪拌して、TLC(CHCl3:MeOH, 20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応混合物を通常の処理することで、残存物を無水エチルエーテルで結晶化させ、表記化合物が得られ、そのまま次の反応に用いられる。
氷浴でBoc−Gly 438 mg (2.5 mmol)、HOBt 338 mg (2.5 mmol)、DCC 619 mg (3 mmol)および無水THF 10 mLの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−Obzl 1.212 g (2.3 mmol)、N−メチルモルホリン232 mg(2.3 mmol)と無水THF5 mLで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC (CHCl3:MeOH, 20:1) で原料スポットがなくなったことを確認した。反応混合物を通常の処理することで、表記化合物である無色の固体1.461 g (98%)が得られた。Mp 53 − 55℃.
(外5)
=−23.7 (c = 0.13, MeOH). ESI−MS (m/z) 649 [M + H]+。
Boc−Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−OBzl 1.619 g (2.5 mmol)を無水塩化水素−酢酸エチル液(4N) 15 mLに溶かし、室温で3時間攪拌して、TLC (CHCl3:MeOH, 20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。通常の方法で反応混合物を処理することで、残存物を無水エチルエーテルで結晶化させ、表記化合物が得られ、そのまま次の反応に用いられる。
氷浴でBoc−Arg(NO2) 798 mg(2.5 mmol)、HOBt 338 mg(2.5 mmol)、DCC 619 mg (3 mmol)及び無水THF 10 mLの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−Obzl 1.343 g(2.3 mmol)、N−メチルモルホリン232 mg (2.3 mmol)と無水THF 5 mLで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH, 20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。通常の処理で、表記化合物である無色の固体1.66 g (85%)が得られた。Mp 74 − 75℃.
(外6)
= −26.2 (c = 0.12, MeOH). ESI−MS(m/z) 872 [M + Na]+。
Boc−Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−OBzl 2.122 g (2.5 mmol)と塩化水素−酢酸エチル液(4N) 20 mLの混合物を室温で3時間攪拌し、TLC(CHCl3: MeOH, 20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。通常の方法で反応混合物を処理し、残存物を無水エチルエーテルで結晶化させることで、表記化合物が得られた。
氷浴でBoc−Asp(OBzl) 808 mg (2.5 mmol)、HOBt 338 mg (2.5 mmol)、DCC 619 mg (3 mmol)及び無水THF 10 mlの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・ Val−OBzl 558 mg (2.3 mmol)、N−メチルモルホリン232 mg (2.3 mmol)と無水THF 5 mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH, 20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を通常の処理することで表記化合物である無色の油状液体1.129 g (96%)が得られた。ESI−MS(m/z) 512 [M + H]+。
Boc−Asp(OBzl)−Val−OBzl 1.278 g (2.5 mmol)を無水塩化水素−酢酸エチル液(4N) 15 mlに溶かし、室温で3時間攪拌して、TLC (CHCl3:MeOH, 20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。通常の方法で反応混合物を処理し、残存物を無水エチルエーテルで結晶化させることで、表記化合物が得られ、そのまま次の反応に用いられる。
氷浴でBoc−Gly 438 mg (2.5 mmol)、HOBt 338 mg (2.5 mmol)、DCC 619 mg (3 mmol)および無水THF 10 mlの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Asp(OBzl)−Val−Obzl 1.03 g (2.3 mmol)、N−メチルモルホリン232 mg (2.3 mmol)と無水THF 5 mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH, 20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を通常の処理することで表記化合物である無色の固体1.242 g (95%)が得られた。Mp 66 − 68℃.
(外7)
=−43.8 (c= 0.11, MeOH). ESI−MS(m/z) 592 [M + Na]+。
Boc−Gly−Asp(OBzl)−Val−OBzl 1.421 g (2.5 mmol)を無水塩化水素−酢酸エチル液(4N)15 mL に溶かし、室温で3時間攪拌して、TLC(CHCl3:MeOH, 20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。通常の方法で反応混合物を処理することで、残存物を無水エチルエーテルで結晶化させ、表記化合物が得られ、そのまま次の反応に用いられる。
氷浴でBoc−Arg(NO2) 798 mg (2.5 mmol)、HOBt 338 mg (2.5 mmol)、DCC 619 mg (3 mmol)および無水THF 10 mlの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Gly−Asp(OBzl)−Val−Obzl 1.162 g (2.3 mmol)、N−メチルモルホリン232 mg (2.3 mmol)と無水THF 5 mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC (CHCl3:MeOH, 20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を通常の処理することで表記化合物である無色の固体1.523 g (86%)が得られた。Mp 107 − 109℃.
(外8)
=−38.0 (c= 0.12, MeOH). ESI−MS(m/z) 793 [M + Na]+。
Boc−Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Val−OBzl 1.925 g (2.5 mmol)を無水塩化水素−酢酸エチル液(4N) 20 mLに溶かし、室温で3時間攪拌して、TLC(CHCl3:MeOH, 20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。通常の方法で反応混合物を処理し、残存物を無水エチルエーテルで結晶化させることで、表記化合物が得られた。
氷浴でBoc−Asp(OBzl) 808 mg (2.5 mmol)、HOBt 338 mg (2.5 mmol)、DCC 619 mg (3 mmol)および無水THF 10 mlの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Phe−Obzl 668 mg (2.3 mmol)、N−メチルモルホリン232 mg(2.3 mmol)と無水THF 5 mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH, 20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。通常の処理で、表記化合物である無色の固体1.222 g (95%)が得られた。Mp 79 − 80℃.
(外9)
=−24.2 (c = 0.13, MeOH), ESI−MS(m/z) 561 [M + H]+。
Boc−Asp(OBzl)−Phe−OBzl 1.398 g (2.5 mmol)を無水塩化水素−酢酸エチル溶液(4N)15 mLに溶かし、室温で3時間攪拌して、TLC (CHCl3:MeOH, 20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。通常の方法で反応混合物を処理し、残存物を無水エチルエーテルで結晶化させることで、表記化合物が得られ、そのまま次の反応に用いられる。
氷浴でBoc−Gly 438 mg (2.5 mmol)、HOBt 338 mg (2.5 mmol)、DCC 619 mg (3 mmol)の無水THF溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Asp(OBzl)−Phe−Obzl 1.141 g (2.3 mmol)、N−メチルモルホリン232 mg (2.3 mmol)と無水THF 5 mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH, 20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応混合物を通常の処理することで、表記化合物である無色の固体1.29 g (91%)が得られた。Mp 70 − 71℃.
(外10)
=−22.5 (c = 0.14, MeOH). ESI−MS(m/z) 640 [M + Na] +。
Boc−Gly−Asp(OBzl)−Phe−OBzl 1.541 g (2.5 mmol)を無水塩化水素−酢酸エチル液(4N)15 mLに溶かし、室温で3時間攪拌して、TLC (CHCl3:MeOH, 20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。通常の方法で反応混合物を処理し、残存物を無水エチルエーテルで結晶化させることで、表記化合物が得られ、そのまま次の反応に用いられる。
氷浴でBoc−Arg(NO2) 798 mg (2.5 mmol)、HOBt 338 mg (2.5 mmol)、DCC 619 mg (3 mmol)および無水THF 10 mlの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Gly−Asp(OBzl)−Phe−Obzl 1.272 g (2.3 mmol)、N−メチルモルホリン232 mg (2.3 mmol)と無水THF 5 mLで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH, 20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応混合物を通常の処理することで、表記化合物である無色の固体1.637g (87%)が得られた。Mp 77 − 79℃.
(外11)
=−22.6 (c = 0.09, MeOH). ESI−MS(m/z) 841 [M + Na]+。
Boc−Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Phe−OBzl 2.045 g (2.5 mmol)を無水塩化水素−酢酸エチル液(4N)15 mLに溶かし、室温で3時間攪拌して、TLC(CHCl3:MeOH, 20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。通常の方法で反応混合物を処理し、残存物を無水エチルエーテルで結晶化させることで、表記化合物が得られた。
氷浴でBoc−Ala−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z) 821 mg(1 mmol)、HOBt 135 mg(1 mmol)、DCC 250 mg(1 mmol)および無水THF 10 mlの溶液を20分間攪拌した。当該溶液に1,3−ジオキソ−2−[(4’−オキソアセチル−Lys−OMe)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン480 mg(1 mmol)およびN−メチルモルホリン100 mg (1 mmol)と無水THF 5 mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH, 40:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を通常の処理することで表記化合物である青色の固体925 mg (83%)が得られた。Mp 179 − 182℃.
(外12)
=−34.3 (c = 0.14, MeOH), ESI−MS(m/z) 1275 [M + Na]+。IR (KBr) 3319, 2935, 1658, 1531, 1448, 1363, 1254, 1168, 1053, 835, 749, 540 cm−1。
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Ala−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]− Lys−OMe}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン1260 mg (1 mmol)をメタノール3 mLに溶かし、NaOH水溶液(2N)を加えて、室温で30 min攪拌した。pH 12を保持し、氷浴で10 min攪拌して、TLCで原料スポットがなくなったことを確認した。2N HClでpH 7に調整して、反応液を減圧濃縮し、残存物を飽和食塩水2 mLで希釈して、2N HClでpH 2に調整し、酢酸エチルで3回抽出した(5 mL× 3)。合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して、ろ液を室温で減圧濃縮することで、表記化合物である青色の固体945 mg (82%)が得られた。EI−MS (m/z) 1238 [M − H]−。
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Ala−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]− Lys}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン618 mg(0.5 mmol)、HOBt 69 mg (0.5 mmol)、DCC 126 mg (0.6 mmol)および無水THF 20 mLの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−Obzl 442 mg (0.5 mmol)、N−メチルモルホリン50 mg (0.5 mmol)及び無水THF 5 mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH, 20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応混合物を通常の処理することで、表記化合物である青色の固体300 mg (31%)が得られた。Mp 138 − 140℃.
(外13)
=−39.4 (c = 0.13, MeOH). ESI−MS(m/z) 1991 [M + H]+. IR(KBr) 3309, 2936, 1656, 1531, 1449, 1363, 1256, 836, 743, 697, 601 cm−1。
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Ala−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]− Lys}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン618 mg(0.5 mmol)、HOBt 69 mg (0.5 mmol)、DCC 126 mg (0.6 mmol)および無水THF 20 mLの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Val−Obzl 421 mg (0.5 mmol)、N−メチルモルホリン50 mg (0.5 mmol)及び無水THF 5 mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH, 20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応混合物を通常の処理することで、表記化合物である青色の固体389 mg (36%)が得られた。Mp 117 − 120℃.
(外14)
=−14.8 (c = 0.01, MeOH). ESI−MS(m/z) 1913 [M + H]+。IR(KBr) 3312, 2937, 1655, 1530, 1448, 1362, 1257, 835, 744, 697, 592 cm−1。
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc− Ala−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン618 mg(0.5 mmol)、HOBt 69 mg (0.5 mmol)、DCC 126 mg (0.6 mmol)および無水THF 20 mlの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Phe−OBzl 445 mg (0.5 mmol)、N−メチルモルホリン50 mg (0.5 mmol)及び無水THF 5 mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH, 20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応混合物を通常の処理することで、表記化合物である青色の固体320 mg (36%)が得られた。Mp 115 − 118℃.
(外15)
=−21.5 (c = 0.16, MeOH). ESI−MS(m/z) 1961 [M + H]+。IR(KBr) 3316, 2936, 1654, 1529, 1448, 1362, 1256, 1169, 742, 698, 593 cm−1。
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Ala−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]− Lys−Arg−(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−OBzl}フェニル}− 4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン199 mg (0.1 mmol)とトリフルオロ酢酸6 mLおよびトリフルオロメタンスルホン酸1.5 mLを混合し、1時間攪拌した後、TCL(CHCl3:MeOH, 1:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を減圧濃縮し、残存物を無水エチルエーテルで繰り返し洗浄した。減圧濃縮し、残存物を水で溶かした。25%アンモニア水でpH 8に調整し、Sephadex G10で脱塩し、C18カラムで精製し、回収したフラックションを凍結乾燥することで、表記化合物である青色の固体109 mg (85%)が得られた。Mp 134 − 135℃.
(外16)
=−39.7 (c = 0.12, MeOH). FT−MS(m/z) 1374.7290 [M + H]+, 2748.4580 [2M + H]+, 4122.1870 [3M + H]+, 5495.9160 [4M + H]+. g = 2.00779. IR(KBr) 3346, 3180, 2920, 1665, 1537, 1449, 1252, 1179, 1030, 837, 801, 720, 639, 518 cm−1。
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Ala− Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]− Lys−Arg−(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Val−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン190 mg(0.1 mmol)とトリフルオロ酢酸6 mLおよびトリフルオロメタンスルホン酸1.5 mLを混合し、1時間攪拌した後、TCL(CHCl3:MeOH, 1:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を減圧濃縮し、残存物を無水エチルエーテルで繰り返し洗浄した。減圧濃縮し、残存物を水で溶かした。25%アンモニア水でpH 8に調整し、Sephadex G10 で脱塩し、C18カラムで精製し、回収したフラックションを凍結乾燥することで、表記化合物である青色の固体96 mg (82%)が得られた。Mp 143 − 144℃.
(外17)
=−31.8 (c = 0.01, MeOH). FT−MS(m/z) 1386.7654 [M + H]+, 2772.5308, [2M + H]+, 4158.2962 [3M + H]+, 5544.0616 [4M + H]+. g = 2.00779. IR(KBr) 3349, 2942, 1659, 1539, 1394, 1250, 1030, 639 cm−1。
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Ala−Arg(NO2)−Pro−Ala− Lys(Z)]−Lys−Arg−(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Phe−OBzl}フェニル}− 4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン194 mg(0.1 mmol)とトリフルオロ酢酸6 mLおよびトリフルオロメタンスルホン酸1.5 mLを混合し、1時間攪拌した後、TCL(CHCl3:MeOH, 1:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を減圧濃縮し、残存物を無水エチルエーテルで繰り返し洗浄した。減圧濃縮し、残存物を水で溶かした。25%アンモニア水でpH 8に調整し、Sephadex G10 で脱塩し、C18カラムで精製し、回収したフラックションを凍結乾燥することで、表記化合物である青色の固体106 mg (81%)が得られた。Mp 96 − 97℃.
(外18)
=−44.4 (c = 0.15, MeOH). FT−MS (m/z) ESI−MS (m/z) 1444.7654 [M + H]+, ESI−MS(m/z) 2888.5308 [2M + H]+, 4332.2962 [3M + H]+, 5776.0616 [4M + H]+. g = 2.00789. IR(KBr) 3363, 1665, 1538, 1448, 1256, 1173, 1031, 640, 577, 518 cm−1。
氷浴でBoc−Gly 438 mg(2.5 mmol)、HOBt 338 mg(2.5 mmol)、DCC 619 mg (3 mmol)および無水THF 10 mlの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・ Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)−OBzl 1.785 g(2.3 mmol)、N−メチルモルホリン232 mg(2.3 mmol)と無水THF 5 mlで調製した溶液を加え、24時間反応させることで、表記化合物1.857 g (90%)が得られた。Mp 85 − 87℃.
(外19)
=−38.5 (c = 0.11, MeOH). ESI−MS (m/e) 920 [M + Na] +。
Boc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)−OBzl 907 mg(1 mmol)をメタノール3 mLに溶かし、氷浴でNaOH水溶液(2N)を加えて、室温で30 min攪拌した。pH 12を保持し、氷浴で10 min攪拌して、TLCで原料スポットがなくなったことを確認した。2N HClでpH 7に調整して、反応液を減圧濃縮し、残存物を飽和食塩水2 mLで希釈して、2N HClでpH 2に調整し、酢酸エチルで3回抽出した(5 mL × 3)。合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、室温で減圧濃縮することで、表記化合物である無色の固体785 mg (82%)が得られた。EI−MS (m/z) 816 [M − H]−。
氷浴でBoc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z) 817 mg (1 mmol)、HOBt 135 mg (1 mmol)、DCC 250 mg (1 mmol)および無水THF 10 mlの溶液を20分間攪拌した。当該溶液に1,3−ジオキソ−2−[(4’−オキソアセチル−Lys−OMe)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン480 mg(1 mmol)およびN−メチルモルホリン100 mg (1 mmol)と無水THF 5 mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH, 40:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を通常の処理することで、表記化合物である青色の固体680mg (52%)が得られた。Mp 79 − 82℃.
(外20)
=−12.3 (c = 0.14, MeOH), ESI−MS(m/z) 1261 [M + Na]+。IR (KBr) 3319, 2935, 1658, 1531, 1448, 1363, 1254, 1168, 1053, 835, 749, 540 cm−1。
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]− Lys−OMe}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン1260 mg (1 mmol)をメタノール3 mLに溶かし、NaOH水溶液(2N)を加えて、室温で30 min攪拌した。pH 12を保持し、氷浴で10 min攪拌して、TLCで原料スポットがなくなったことを確認した。2N HClでpH 7に調整して、反応液を減圧濃縮し、残存物を飽和食塩水2 mLで希釈して、2N HClでpH 2に調整し、酢酸エチルで3回抽出した(5 mL × 3)。合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して、ろ液を室温で減圧濃縮することで、表記化合物である青色の固体945 mg (82%)が得られた。EI−MS (m/z) 1223 [M − H]−。
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]− Lys}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン611 mg(0.5 mmol)、HOBt 69 mg (0.5 mmol)、DCC 126 mg (0.6 mmol)および無水THF 20 mLの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−Obzl 442 mg (0.5 mmol)、N−メチルモルホリン50 mg (0.5 mmol)及び無水THF 5 mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH, 20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応混合物を通常の処理することで、表記化合物である青色の固体500 mg (48%)が得られた。Mp 127 − 129℃.
(外21)
=−49.4 (c = 0.13, MeOH). ESI−MS(m/z) 1956 [M + H]+. IR(KBr) 3306, 2936, 1652, 1531, 1449, 1362, 1255, 1166, 742, 697, 592 cm−1。
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]− Lys}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン611 mg(0.5 mmol)、HOBt 69 mg (0.5 mmol)、DCC 126 mg (0.6 mmol)および無水THF 20 mLの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Val−Obzl 421 mg (0.5 mmol)、N−メチルモルホリン50 mg (0.5 mmol)及び無水THF 5 mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH, 20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応混合物を通常の処理することで、表記化合物である青色の固体392 mg (35%)が得られた。Mp 147 − 150℃.
(外22)
=−34.6 (c = 0.16, MeOH). ESI−MS(m/z) 1899 [M + Na]+。IR(KBr) 3311, 3068, 2937, 1661, 1531, 1451, 1395, 1254, 1163, 839, 743, 697, 596 cm−1。
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]− Lys}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン611 mg(0.5 mmol)、HOBt 69 mg (0.5 mmol)、DCC 126 mg (0.6 mmol)および無水THF 20 mLの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Phe−Obzl 445 mg (0.5 mmol)、N−メチルモルホリン50 mg (0.5 mmol)及び無水THF 5 mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC (CHCl3:MeOH, 20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応混合物を通常の処理することで、表記化合物である青色の固体336 mg (31%)が得られた。Mp 125 − 128℃.
(外23)
=−31.3 (c = 0.18, MeOH). ESI−MS(m/z) 1925 [M + H]+。IR(KBr) 3315, 2935, 1657, 1529, 1448, 1361, 1257, 1173, 834, 742, 698, 541 cm−1。
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]− Lys−Arg−(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン195 mg (0.1 mmol)とトリフルオロ酢酸 6 mLおよびトリフルオロメタンスルホン酸1.5 mLを混合し、1時間攪拌した後、TCL(CHCl3:MeOH, 1:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を減圧濃縮し、残存物を無水エチルエーテルで繰り返し洗浄した。減圧濃縮し、残存物を水で溶かした。25%アンモニア水でpH 8に調整し、Sephadex G10で脱塩し、C18カラムで精製し、回収したフラックションを凍結乾燥することで、表記化合物である青色の固体102 mg (82%)が得られた。Mp 142 − 145℃.
(外24)
=−29.7 (c = 0.14, MeOH). FT−MS(m/z) 1360.7133 [M + H]+, 2720.4266 [2M + H]+, 4080.1399 [3M + H]+, 5439.8532 [4M + H]+. g = 2.00779. IR(KBr) 3348, 3180, 2940, 1670, 1539, 1447, 1199, 1134, 1034, 836, 801, 721, 638 cm−1。
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]− Lys−Arg−(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Val−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン190 mg(0.1 mmol)とトリフルオロ酢酸6 mLおよびトリフルオロメタンスルホン酸1.5 mLを混合し、1時間攪拌した後、TCL(CHCl3:MeOH, 1:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を減圧濃縮し、残存物を無水エチルエーテルで繰り返し洗浄した。減圧濃縮し、残存物を水で溶かした。25%アンモニア水でpH 8に調整し、Sephadex G10で脱塩し、C18カラムで精製し、回収したフラックションを凍結乾燥することで、表記化合物である青色の固体99 mg (84%)が得られた。Mp 147 − 149℃.
(外25)
=−31.1 (c = 0.17, MeOH). FT−MS(m/z) 1372.7497 [M + H]+, 2744.4994 [2M + H]+, 4116.2491 [3M + H]+, 5487.9988 [4M + H]+. g = 2.00779. IR(KBr) 3338, 2960, 1662, 1539, 1451, 1392, 1251, 1170, 1030, 639, 519 cm−1。
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Gly−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]− Lys−Arg−(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Phe−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン192 mg(0.1 mmol)とトリフルオロ酢酸6 mLおよびトリフルオロメタンスルホン酸1.5 mLを混合し、1時間攪拌した後、TCL(CHCl3:MeOH, 1:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を減圧濃縮し、残存物を無水エチルエーテルで繰り返し洗浄した。減圧濃縮し、残存物を水で溶かした。25%アンモニア水でpH 8に調整し、Sephadex G10で脱塩し、C18カラムで精製し、回収したフラックションを凍結乾燥することで、表記化合物である青色の固体106 mg (81%)が得られた。Mp 84 − 85℃.
(外26)
=−54.1 (c = 0.15, MeOH). FT−MS (m/z) 1420.7497 [M + H]+, 2840.4994 [2M + H]+, ESI−MS FT−MS(m/z) 1420.7497 [M + H]+, 2840.4994 [2M + H]+, 4260.2491 [3M + H]+, 5679.9976 [4M + H]+. g = 2.00789. IR(KBr) 3344, 3080, 2930, 1666, 1535, 1392, 1250, 1181, 1030, 835, 800, 719, 638 cm−1。
Boc−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)−OBzl 850 mg(1 mmol)をメタノール3 mLに溶かし、氷浴でNaOH水溶液(2N)を加えて、室温で30 min攪拌した。pH 12を保持し、氷浴で10 min攪拌して、TLCで原料スポットがなくなったことを確認した。2N HClでpH 7に調整して、反応液を減圧濃縮し、残存物を飽和食塩水2 mLで希釈して、2N HClでpH 2に調整し、酢酸エチルで3回抽出した(5 mL × 3)。合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して、ろ液を室温で減圧濃縮することで、表記化合物である無色の固体742 mg (92%)が得られた。EI−MS (m/z) 849 [M − H]−。
氷浴でBoc−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z) 760 mg (1 mmol)、HOBt 135 mg (1 mmol)、DCC 250 mg (1 mmol)および無水THF 10 mLの溶液を20分間攪拌した。当該溶液に1,3−ジオキソ−2−[(4’−オキソアセチル−Lys−OMe)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン480 mg(1 mmol)およびN−メチルモルホリン100 mg (1 mmol)と無水THF 5 mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH, 40:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を通常の処理することで、表記化合物である青色の固体920 mg (83%)が得られた。Mp 72 − 76℃.
(外27)
=−32.7 (c = 0.13, MeOH), ESI−MS(m/z) 1204 [M + Na]+。IR (KBr) 3317, 2937, 1658, 1531, 1447, 1362, 1254, 1168, 1055, 835, 746, 697, 541, 460 cm−1。
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Arg(NO2)− Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys−OMe}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン1200 mg (1 mmol)をメタノール3 mLに溶かし、NaOH水溶液(2N)を加えて、室温で30 min攪拌した。pH 12を保持し、氷浴で10 min攪拌して、TLCで原料スポットがなくなったことを確認した。2N HClでpH 7に調整して、反応液を減圧濃縮し、残存物を飽和食塩水2 mLで希釈して、2N HClでpH 2に調整し、酢酸エチルで3回抽出した(5 mL × 3)。合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して、ろ液を室温で減圧濃縮することで、表記化合物である青色の固体899 mg (80%)が得られた。EI−MS (m/z) 1116 [M − H]−。
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン583 mg(0.5 mmol)、HOBt 69 mg (0.5 mmol)、DCC 126 mg (0.6 mmol)および無水THF 20 mLの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−Obzl 442 mg (0.5 mmol)、N−メチルモルホリン50 mg (0.5 mmol)及び無水THF 5 mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH, 20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応混合物を通常の処理することで、表記化合物である青色の固体421 mg (40%)が得られた。Mp 77 − 79℃.
(外28)
=−45.4 (c = 0.15, MeOH). ESI−MS(m/z) 1897 [M + H]+. IR(KBr) 3319, 2934, 1658, 1530, 1449, 1361, 1256, 834, 741, 698, 542 cm−1。
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc− Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン583 mg (0.5 mmol)、HOBt 69 mg (0.5 mmol)、DCC 126 mg (0.6 mmol)および無水THF 20 mLの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Val−Obzl 421 mg (0.5 mmol)、N−メチルモルホリン50 mg (0.5 mmol)及び無水THF 5 mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3: MeOH, 20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応混合物を通常の処理することで、表記化合物である青色の固体472 mg (42%)が得られた。Mp 107 − 109℃.
(外29)
=−28.8 (c = 0.11, MeOH). ESI−MS(m/z) 1820 [M + H]+。IR(KBr) 3314, 2938, 1658, 1531, 1448, 1362, 1258, 742, 698, 594 cm−1。
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc− Arg(NO2)− Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン583 mg(0.5 mmol)、HOBt 69 mg (0.5 mmol)、DCC 126 mg (0.6 mmol)および無水THF 20 mLの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Phe−Obzl 445 mg (0.5 mmol)、N−メチルモルホリン50 mg (0.5 mmol)及び無水THF 5 mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH, 20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応混合物を通常の処理することで、表記化合物である青色の固体420 mg (47%)が得られた。Mp 141 − 144℃.
(外30)
=−35.7 (c = 0.12, MeOH). ESI−MS(m/z) 1867 [M + H]+。IR(KBr) 3319, 2936, 1656, 1529, 1448, 1362, 1257, 1169, 834, 743, 698, 541 cm−1。
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys− Arg−(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン170 mg (0.1 mmol)とトリフルオロ酢酸6 mLおよびトリフルオロメタンスルホン酸1.5 mLを混合し、1時間攪拌した後、TCL(CHCl3:MeOH, 1:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を減圧濃縮し、残存物を無水エチルエーテルで繰り返し洗浄した。減圧濃縮し、残存物を水で溶かした。25%アンモニア水でpH 8に調整し、Sephadex G10で脱塩し、C18カラムで精製し、回収したフラックションを凍結乾燥することで、表記化合物である青色の固体102 mg (82%)が得られた。Mp 148 − 150℃.
(外31)
=−22.4 (c = 0.14, MeOH). FT−MS(m/z) 1303.6919 [M + H]+, 2606.3838, [2M + H]+, 3909.0757 [3M + H]+, 5211.7676 [4M + H]+. g = 2.00779. IR(KBr) 3344, 3080, 2930, 1666, 1535, 1392, 1250, 1181, 1030, 835, 800, 719, 638。
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys− Arg−(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Val−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン182 mg(0.1 mmol)とトリフルオロ酢酸6 mLおよびトリフルオロメタンスルホン酸1.5 mLを混合し、1時間攪拌した後、TCL(CHCl3:MeOH, 1:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を減圧濃縮し、残存物を無水エチルエーテルで繰り返し洗浄した。減圧濃縮し、残存物を水で溶かした。25%アンモニア水でpH 8に調整し、Sephadex G10で脱塩し、C18カラムで精製し、回収したフラックションを凍結乾燥することで、表記化合物である青色の固体99 mg (84%)が得られた。Mp 137 − 139℃.
(外32)
=−34.3 (c = 0.18, MeOH). FT−MS(m/z) ESI−MS(m/z) 1315.7282 [M + H]+, 2630.4564 [2M + H]+, 3945.1846 [3M + H]+, 5259.9128 [4M + H]+. g = 2.00779. IR(KBr) 3329, 2953, 1665, 1533, 1391, 1198, 1134, 834, 801, 720, 599 cm−1。
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Arg(NO2)−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys− Arg−(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Phe−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン187 mg(0.1 mmol)とトリフルオロ酢酸6 mLおよびトリフルオロメタンスルホン酸1.5 mLを混合し、1時間攪拌した後、TCL(CHCl3:MeOH, 1:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を減圧濃縮し、残存物を無水エチルエーテルで繰り返し洗浄した。減圧濃縮し、残存物を水で溶かした。25%アンモニア水でpH 8に調整し、Sephadex G10で脱塩し、C18カラムで精製し、回収したフラックションを凍結乾燥することで、表記化合物である青色の固体96 mg (81%)が得られた。Mp 99 − 100℃.
(外33)
=−24.7 (c = 0.14, MeOH). FT−MS (m/z) 1363.7282 [M + H]+, 2726.4564 [2M + H]+, 4089.1846 [3M + H]+, 5451.9128 [4M + H]+. g = 2.00789. IR(KBr) 3322, 3060, 2928, 1661, 1530, 1391, 1303, 1247, 641 cm−1。
Boc−Pro−Ala−Lys(Z)−OBzl 638 mg (1 mmol)をメタノール3 mLに溶かし、氷浴でNaOH水溶液(2N)を加えて、室温で30 min攪拌した。pH 12を保持し、氷浴で10 min攪拌した。TLCで原料スポットがなくなったことを確認し、2N HClでpH 7に調整した。反応液を減圧濃縮し、残存物を飽和食塩水溶液2 mLで希釈して、2N HClでpH 2に調整し、酢酸エチルで3回抽出した(5 ml × 3)。合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して、ろ液を室温で減圧濃縮することで、表記化合物である無色の固体509 mg (91.6%)が得られた。EI−MS (m/z) 547 [M − H]−。
氷浴でBoc−Pro−Ala−Lys(Z) 548 mg (1 mmol)、HOBt 135 mg (1 mmol)、DCC 250 mg (1 mmol)および無水THF 10 mLの溶液を20分間攪拌した。当該溶液に1,3−ジオキソ−2−[(4’−オキソアセチル−Lys−OMe)フェニル]−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン480 mg(1 mmol)およびN−メチルモルホリン100 mg (1 mmol)と無水THF 5 mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH, 40:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を通常の処理することで、表記化合物である青色の固体876 mg (87%)が得られた。Mp 77 − 80℃.
(外34)
=−12.6(c = 0.16, MeOH). ESI−MS(m/z) 1003 [M + Na]+。IR (KBr): 3315, 3069, 2937, 1671, 1531, 1449, 1394, 1364, 1302, 1167, 1132, 1054, 836, 743, 698, 596, 541, 458 cm−1。
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys−OMe}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン980 mg (1 mmol)をメタノール3 mLに溶かし、NaOH水溶液(2N)を加えて、室温で30 min攪拌した。pH 12を保持し、氷浴で10 min攪拌して、TLCで原料スポットがなくなったことを確認した。2N HClでpH 7に調整して、反応液を減圧濃縮し、残存物を飽和食塩水2 mLで希釈して、2N HClでpH 2に調整し、酢酸エチルで3回抽出した(5 mL × 3)。合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して、ろ液を室温で減圧濃縮することで、表記化合物である青色の固体867 mg (80%)が得られた。EI−MS (m/z) 965 [M − H]−。
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Pro− Ala−Lys(Z)]−Lys}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン483 mg(0.5 mmol)、HOBt 69 mg (0.5 mmol)、DCC 126 mg (0.6 mmol)および無水THF 20 mLの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−Obzl 442 mg (0.5 mmol)、N−メチルモルホリン50 mg (0.5 mmol)及び無水THF 5 mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH, 20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応混合物を通常の処理することで、表記化合物である青色の固体421 mg (42%)が得られた。Mp 97 − 100℃.
(外35)
=−42.5 (c = 0.14, MeOH). ESI−MS(m/z) 1697 [M + H]+. IR(KBr) 3298, 3070, 2935, 2869, 1642, 1534, 1450, 1369, 1253, 741, 697, 596 cm−1。
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン483 mg(0.5 mmol)、HOBt 69 mg (0.5 mmol)、DCC 126 mg (0.6 mmol)および無水THF 20 mLの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Val−Obzl 432 mg (0.5 mmol)、N−メチルモルホリン50 mg (0.5 mmol)及び無水THF 5 mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH, 20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応混合物を通常の処理することで、表記化合物である青色の固体357 mg (37%)が得られた。Mp 117 − 120℃.
(外36)
=−22.3 (c = 0.17, MeOH). ESI−MS(m/z) 1620 [M + H]+。IR(KBr) 3303, 3072, 2935, 1644, 1533, 1451, 1394, 1364,1255, 1167, 745, 697, 597 cm−1。
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン483 mg(0.5 mmol)、HOBt 69 mg (0.5 mmol)、DCC 126 mg (0.6 mmol)および無水THF 20 mLの溶液を20分間攪拌した。当該溶液にHCl・Arg(NO2)−Gly−Asp(OBzl)−Phe−Obzl 439 mg (0.5 mmol)、N−メチルモルホリン50 mg (0.5 mmol)及び無水THF 5 mlで調製した溶液を加え、室温で24時間反応させた。TLC(CHCl3:MeOH, 20:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応混合物を通常の処理することで、表記化合物である青色の固体472 mg (48%)が得られた。Mp 111 − 114℃.
(外37)
=−15.3 (c = 0.13, MeOH). ESI−MS(m/z) 1667 [M + H]+。IR(KBr) 3296, 3071, 2935, 1641, 1534, 1394, 1253, 1170, 834, 745, 697, 594 cm−1。
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys−Arg−(NO2)− Gly−Asp(OBzl)−Ser(Bzl)−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン169 mg (0.1 mmol)とトリフルオロ酢酸6 mLおよびトリフルオロメタンスルホン酸1.5 mLを混合し、1時間攪拌した後、TCL(CHCl3:MeOH, 1:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を減圧濃縮し、残存物を無水エチルエーテルで繰り返し洗浄した。減圧濃縮し、残存物を水で溶かした。25%アンモニア水でpH 8に調整し、Sephadex G10で脱塩し、C18カラムで精製し、回収したフラックションを凍結乾燥することで、表記化合物である青色の固体98 mg (80%)が得られた。Mp 127 − 128℃.
(外38)
=−22.4 (c = 0.13, MeOH). FT−MS(m/z) 1147.5907 [M + H]+, 2294.1814 [2M + H]+, 3440.7721 [3M + H]+, 4587.3628 [4M + H]+. g = 2.00779. IR(KBr) 3204, 1672, 1543, 1436,1199, 1133, 837, 801, 722, 598 cm−1。
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Pro−Ala−Lys(Z)]−Lys−Arg−(NO2)− Gly−Asp(OBzl)−Val−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン162 mg(0.1 mmol)とトリフルオロ酢酸6 mLおよびトリフルオロメタンスルホン酸1.5 mLを混合し、1時間攪拌した後、TCL(CHCl3:MeOH, 1:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を減圧濃縮し、残存物を無水エチルエーテルで繰り返し洗浄した。減圧濃縮し、残存物を水で溶かした。25%アンモニア水でpH 8に調整し、Sephadex G10で脱塩し、C18カラムで精製し、回収したフラックションを凍結乾燥することで、表記化合物である青色の固体96 mg (81%)が得られた。Mp 123 − 124℃.
(外39)
=−24.6 (c = 0.13, MeOH). FT−MS(m/z) 1159.6271 [M + H]+, 2318.2542 [2M + H]+, 3476.8813 [3M + H]+, 4635.5084 [4M + H]+. g = 2.00779. IR(KBr) 3388, 2959, 1666, 1540, 1494, 1198, 1134, 835, 801, 720, 598 cm−1。
氷浴で1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−{Nω−[Boc−Pro−Ala− Lys(Z)]−Lys−Arg−(NO2)− Gly−Asp(OBzl)−Phe−OBzl}フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン169 mg(0.1 mmol)とトリフルオロ酢酸6 mLおよびトリフルオロメタンスルホン酸1.5 mLを混合し、1時間攪拌した後、TCL(CHCl3:MeOH, 1:1)で原料スポットがなくなったことを確認した。反応化合物を減圧濃縮し、残存物を無水エチルエーテルで繰り返し洗浄した。減圧濃縮し、残存物を水で溶かした。25%アンモニア水でpH 8に調整し、Sephadex G10で脱塩し、C18カラムで精製し、回収したフラックションを凍結乾燥することで、表記化合物である青色の固体96 mg (81%)が得られた。Mp 153 − 154℃.
(外40)
=−12.6 (c = 0.16, MeOH). FT−MS (m/z) 1207.6271 [M + H]+, 2414.2542 [2M + H]+, 3620.8813 [3M + H]+, 4827.5084 [4M + H]+. g = 2.00789. IR(KBr) 3385, 2938, 1659, 1541, 1450, 1391, 1251, 1126, 963, 841, 599, 456 cm−1。
体重が250−300gである雄Wistarラットを術前12時間断食させ、自由に水を飲ませ、頸椎脱臼によって死亡させた。迅速的に開胸して胸部大動脈を取り、付着した結合組織を剥離して、血管を長さ3−5 mmの動脈輪に切断してかん流バスに置いた。バス内にKrebs−Henseleit液15 mlを満たし、37℃で定温して、95% O2−5%CO2ガスを導入した。動脈輪を固定するためのフックにテンショントランスデューサをつなぎ、2チャンネルレコーダーで血管運動曲線を描く。紙の速度が1 mm/minである。静止張力を1.0gに調整し、30 minバランスさせた後、終濃度が10−8 Mになるようにノルエピネフリンを投与することで、早期興奮作用を奏するように動脈収縮させた。ノルエピネフリンを洗い落として、30 minバランスさせ、終濃度が10−8 Mになるようにバスにノルエピネフリンを添加した。収縮張力がプラットフォームレベルで安定した後、バス内に生理食塩水(ブランク) 20 μlまたは化合物Ia−Ilのうちいずれか一つの生理食塩水溶液(終濃度が5×10−6 Mである) 20 μl、あるいはNOフリーラジカル捕捉剤(1,3−ジオキソ−2−(4’−オキシ酢酸−フェニル)−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリン、TMMZ)の生理食塩水溶液(終濃度が5×10−6 Mである)20 μlを入れた。安定した後、アセチルコリンの生理食塩水溶液 (終濃度が10−6 Mである) 20 μlを加えた。薬剤のNO捕捉能力は、アセチルコリンによる血管条の拡張が阻害される百分率で表す。試験結果を表1に示す。
試験例2 本発明化合物Ia〜Ilのオイグロブリン溶解試験
豚の血と3.8%クエン酸ナトリウム溶液を体積比9:1で混合し、直ちに3000 r/minの速度で10 min遠心分離することで、乏血小板血漿を分離した。50 mLの遠心管に豚の乏血小板血漿2 mLおよび超純水36 mLを入れた。遠心管1本につき酢酸(1%)0.4 mLを加え、十分に混合した。4℃の冷蔵庫に入れ、10 min冷凍して、3000 r/minの速度で10 min遠心分離した。遠心管を反転させて、液体が流れなくなった後、ろ紙で管内壁の液体を吸収した。遠心分離で得られたオイグロブリンを沈殿させ、約40 min凍結乾燥し、こすり落とした。オイグロブリン約35 mgを硼砂バッファー液(pH 9.28)7 mLに溶かした。1時間後オイグロブリンがほとんど溶解して、CaCl2溶液(25 mM) 0.7 mLを添加し、直ちに10 cm× 10 cmのガラスプレート上に厚さ約1 mmで敷いた。凝固した後、ピペットで生理食塩水10 μLまたは化合物Ia−Ilのうちいずれか一つの生理食塩水溶液(1 mM)10 μL、あるいはウロキナーゼの生理食塩水溶液 (0.8 mg/mL)10 μLを凝固プレート上に滴下した。両点の間の間隔が1.5 cmより大きく、1サンプル当たり3回滴下した。4時間後溶解円の直径を量り,示度を表2に示した。
試験例3 本発明化合物Ia〜Ilのin vitro血栓溶解試験
SDラット(オス、350 − 400 g)に1200 mg/kgの用量でウレタン溶液を腹腔内注射することで麻酔をかけた。麻酔されたラットを仰臥位で固定させ、右総頸動脈を分離した。近位端で動脈鉗子を挟み、近位端および遠位端でそれぞれ縫合糸を通した。遠位端の縫合糸を毛皮用止血鉗子によって締め、遠位端で挿管した。動脈鉗子を緩めて、全ての動脈血を排出し、あらかじめシリコンオイル化された50 mlの容器に入れた。垂直に固定されたカラスチューブ(長さ20 mm、内径4 mm、外径5 mm、チューブの底がゴム栓で密封されている)にラット動脈血0.8 mlを注入し、速やかにチューブ内にステンレス製の血栓固定ボルトを一つ挿した。当該血栓固定スクリューは直径が0.2 mmのステンレス糸で巻きついてなるものであり、スクリュー部の長さが18 mmであり、15周の螺旋を含む。螺旋の直径が1.8 mmであり、螺旋とつながる柄は、長さが7.0 mmであり、疑問符状を呈する。血液が凝固した40 min後、ガラスチューブの底部のゴム栓を開栓して、ピンセットによって血栓固定スクリューの柄を保持し、ガラスチューブから血栓に包まれた血栓固定スクリューを入念に取り出した。それを三回蒸留した水に懸濁することで、表面に浮いている血を取り除いた。1 h後取り出して、精確に重量を量った。血栓を8 mLの生理食塩水、あるいは化合物Ia−Ilのうちいずれか一つの生理食塩水溶液(濃度が100 nMである)、あるいはARPAK、またはGRPAK、またはRPAK、またはPAK(配列番号6、7、5、1)の生理食塩水溶液(濃度は100 nM)、あるいはウロキナーゼの生理食塩水溶液(100 IU/mL)に懸濁浸漬して、37℃で恒温したシェーカーの中で振動させた(63 r/min)。2 h後取り出して、正確に重量を量った。投与前後の血栓の質量差を求め、結果を表3に示す。
試験例4 本発明化合物Ia〜Ilのin vivo血栓溶解試験
SDラット(オス、220−230 g)に1200 mg/kgの用量でウレタン溶液を腹腔内注射することで麻酔をかけた。麻酔されたラットを仰臥位で固定させ、右総頸動脈を分離した。近位端で動脈鉗子を挟み、近位端および遠位端でそれぞれ縫合糸を通した。遠位端の縫合糸を毛皮用止血鉗子によって締め、遠位端で挿管した。動脈鉗子を緩めて、約1mlの動脈血を排出し、1mlの弾丸の中に入れた。垂直に固定されたカラスチューブ(長さ15 mm、内径2.5 mm、外径5.0 mm、チューブの底がゴム栓で密封されている) にラット動脈血0.1 mlを注入し、速やかにチューブ内にステンレス製の血栓固定ボルトを一つ挿した。当該血栓固定スクリューは直径が0.2 mmのステンレス糸で巻きついてなるものであり、スクリュー部の長さが12 mmであり、15周の螺旋を含む。螺旋の直径が1.0 mmであり、螺旋とつながる柄は、長さが7.0 mmであり、疑問符状を呈する。血液が凝固した15 min後、ガラスチューブの底部のゴム栓を開栓して、ピンセットによって血栓固定スクリューの柄を保持し、ガラスチューブから血栓に包まれた血栓固定スクリューを入念に取り出して、精確に重量を量った。
試験例5 本発明化合物Ia〜Ilのin vivo抗血栓試験
SDラット(オス、220−230 g)をランダムにグループ分けして、1グループにつき11匹である。一日安静飼育し、飼育を中止して一晩過ごした。ラットに生理食塩水(用量3 mL/kg)、あるいは化合物Ia−Ilのうちいずれか一つの生理食塩水溶液(用量0.1μmol/kg)、あるいは標的ペプチドRGDS、RGDVまたはRGDF(配列番号28、29、30)の生理食塩水溶液(用量10μmol/kg)、あるいはアスピリン(用量33 mg/kg)を胃内投与した。30分後、20%ウレタン溶液を利用してラットに麻酔をかけた後、右頸動脉と左頸静脈を分離した。挿管内にヘパリンナトリウムの生理食塩水溶液を満たした後、一端を左側の静脈に挿入し、他端では抗凝固のために注射器で規定量のヘパリンナトリウムを添加した後、右側の動脉に挿入した。血流は右側の動脉からポリエチレンチューブを通じて左側の静脈に流れ、15分後血栓がついた糸を取り出して重量を記録し、総重量から糸の重量を引いて血栓湿重量となる。試験結果を表5に示す。
脳卒中患者に対する本発明化合物の確実な治療効果を評価するための動物モデルの構築
(1)ここで記載されたラット実験プロトコールはジュネーブ動物実験ガイドに合致し、学校倫理委員会に認められている。体重280−305 gのクリーングレードの健康なオスSDラットはVital River実験動物センターから購入した。これらのラットは血栓の製造または脳卒中モデルの製造にランダムに用いられた。
(2)SDラットに用量400 mg/kg体重で10%抱水クロラール溶液を腹腔内注射することで、麻酔をかけた。頸動脈を分離し、新鮮な動脉血15 mLを取り、10μLごとに1.5 mLのEP管に入れて、形成された血栓をまず室温で2時間静置し、さらに−20℃の冷蔵庫内で22時間静置した。使用の際、生理食塩水0.5 mLを添加し、ガラス棒ですりつぶして、大きさが均一である血栓塊の生理食塩水懸濁液を調製し、血栓塊一つあたりの体積が約0.1 mm3である。
(3)SDラットに用量400 mg/kg体重で10%抱水クロラール溶液を腹腔内注射することで、麻酔をかけた。頸動脈を分離し、新鮮な動脉血15 mLを取り、10μLごとに1.5 mLのEP管に入れて、形成された血栓をまず室温で24時間静置した。使用の際、生理食塩水0.5 mLを添加し、ガラス棒ですりつぶして、大きさが均一である血栓塊の生理食塩水懸濁液を調製し、血栓塊一つあたりの体積が約0.1 mm3である。
(4)オスSDラットに用量400 mg/kg体重で10%抱水クロラール溶液を腹腔内注射することで、麻酔をかけた。頸部の真ん中から縦に切り目をつけ、右側の総頸動脈主幹(長さ約3 cm)を分離した。舌骨において結紮された外頸動脈の各ブランチを水平に分離して、頸部の膨れ上がる部位で内頸動脈を分離した。非侵襲的動脈鉗子によって内頸動脈の開口部位と総頸動脈の近位端をそれぞれ締めて、それに外頸動脈の遠位端を結紮した。外頸動脈の主幹において、血栓塊の生理食塩水懸濁液0.5 mLを入れたカテーテルを挿した。内頸動脈鉗子を緩めて、同時にカテーテル内の血栓塊の生理食塩水懸濁液0.5 mLをゆっくりと外頸動脈から内頸動脈を通じて近位端の大脳動脉に注入させた。その後、外頸動脈の近位端を結紮し、内頸動脈および総頸動脈の動脈鉗子を緩め、血流を回復させた。外頸静脈を分離し、外頸静脈から生理食塩水(ブランク)または本発明化合物の生理食塩水溶液を注入した。傷口を縫合し、感染を予防するために2万IUのペニシリンを筋肉注射した。これは脳卒中直後の治療モデルである。
(5)オスSDラットに用量400 mg/kg体重で10%抱水クロラール溶液を腹腔内注射することで、麻酔をかけた。頸部の真ん中から縦に切り目をつけ、右側の総頸動脈主幹(長さ約3 cm)を分離した。舌骨において結紮された外頸動脈の各ブランチを水平に分離して、頸部の膨れ上がる部位で内頸動脈を分離した。非侵襲的動脈鉗子によって内頸動脈の開口部位と総頸動脈の近位端をそれぞれ締めて、それに外頸動脈の遠位端を結紮した。外頸動脈の主幹において、血栓塊の生理食塩水懸濁液0.5 mLを入れたカテーテルを挿した。内頸動脈鉗子を緩めて、同時にカテーテル内の血栓塊の生理食塩水懸濁液0.5 mLをゆっくりと外頸動脈から内頸動脈を通じて近位端の大脳動脉に注入させた。その後、外頸動脈の近位端を結紮し、内頸動脈および総頸動脈の動脈鉗子を緩め、血流を回復させて、傷口を縫合した。感染を予防するために、2万IUのペニシリンを筋肉注射した。4時間、6時間または24時間後、尾静脈から生理食塩水(ブランク)または本発明化合物の生理食塩水溶液を注入した。これは脳卒中にかかった4時間、6時間および24時間後のラットの治療モデルである。
(1)ラットが脳卒中にかかった直後に本発明化合物の治療を受けること、ラットが脳卒中にかかった4時間後本発明化合物の治療を受けること、ラットが脳卒中にかかった6時間後本発明化合物の治療を受けることによって得られた治療効果とは、ラットが蘇った24時間後観察された行為である。前記行為には、歩き方、右瞼の垂下程度、尾の硬直程度、筋肉張力、頭部が偏る程度、手足の支持力および死亡状況が含まれる。
(2)ラットが脳卒中にかかった24時間後本発明化合物の治療を受けることによって得られた治療効果とは、24時間治療した後観察された行為である。前記行為には、歩き方、右瞼の垂下程度、尾の硬直程度、筋肉張力、頭部が偏る程度、手足の支持力および死亡状況が含まれる。
(3)一度で本発明化合物の治療を受けた脳卒中ラットの治療効果と一度で生理食塩水の治療を受けた脳卒中ラットを比較した。
(4)連続的な治療を受けた脳卒中ラットに対して、24時間につき尾静脈から本発明化合物の生理食塩水を注入し、翌日録画して比較した。
本発明化合物Ia〜Ilの前記動物モデルにおける試験結果は以下のとおりである。
本発明化合物のin vivo抗脳卒中活性は神経機能点数で表される。点数が低ければ、活性が強い。SDオスラット(250−300 g)に10%抱水クロラール(400 mg/kg)を腹腔内注射することで、麻酔をかけた。頸部の真ん中から少し右方へ離れた所で、縦に長さ約2 cmの切り目をつけて、胸鎖乳突筋の内側縁に沿って右総頸動脈、外頸動脈および内頸動脈を分離した。非侵襲的動脈鉗子によって内頸動脈の開口部位と総頸動脈の近位端をそれぞれ締めて、外頸動脈に小さな切り目をつけて、外頸動脈の遠位端を結紮した。総頸動脈の近位端の動脈鉗子を緩め、血10μlを取り、その後、さらに非侵襲的動脈鉗子によって総頸動脈の近位端を締めた。得られた血10μlを1 mLのEP管内に入れて、まず常温で30分間静置することで、血液を凝固させた。その後、−20℃の冷蔵庫に移して1時間静置し、血液凝塊をしっかりとさせた。1時間後血液凝塊を取り出し、生理食塩水1 mLを添加した。シャベルを使って、血液凝塊を比較的均一で細かい血栓につぶした後、細かい血栓の懸濁液を1 mLの注射器に移し、必要に備えた。ラットの内頸動脈鉗子を緩めて、同時に1 mLの注射器内の血栓懸濁液をゆっくりとラット外頸動脈から内頸動脈を通じて近位端のラット大脳に注入した。その後、外頸動脈の近位端を結紮し、内頸動脈と総頸動脈の動脈鉗子を緩め、血流を回復させた。ラットの総頸静脈を分離し、または直ちに静脈を結紮して、傷口のところに3滴のペニシリンを滴下し、傷口を縫合した。動物が蘇った後、偽手術群として、ウロキナーゼの生理食塩水溶液(陽性対照群、用量20000 IU/kg)を注入するか、生理食塩水(ブランク群、用量3 ml/kg)を注入するか、TMMZの生理食塩水溶液(成分対照群、用量1μmol/kg)を注入するか、あるいは血栓溶解ペプチドARPAK、GRPAK、RPAKまたはPAK(配列番号6、7、5、1)の生理食塩水溶液(成分対照群、用量1μmol/kg)を注入し、あるいは化合物Ia−Ilのうちいずれか一つの生理食塩水溶液(用量0.1μmol/kg)を注入した。ラットが蘇った24時間後、Zealonga法に基づき神経機能欠損程度を評価した。0点は神経機能欠損兆候がまったくないことを表し、1点は未損傷側の前肢が伸びられないことを表し、2点は未損傷側へ歩くことを表し、3点は未損傷側へ回って尾行するように歩くことを表し、4点は意識障害のため自主的に歩けないことを表し、5点は死亡したことを表す。試験結果を表6に示す。
試験例7 ラットが脳卒中にかかった直後に本発明化合物Ia〜Ilでの治療を受けた場合の脳梗塞体積試験
試験例6のラットが蘇った24時間後、神経機能欠損程度を評価した。その後、ウレタンで麻酔をかけた後、速やかに断頭し脳を取った。脳組織を−20℃の冷蔵庫で2時間置いて後、前頭極から合計6枚の約2mmの冠状連続的な切片を行った。その後、2%TTC溶液の中に置いて、37℃で30 min遮光してインキュベートした。そして、脳切片の色変化を観察したところ、正常脳組織がTTCにより赤色に染められたが、虚血脳組織、即ち梗塞脳組織が白色を呈する。その後、デジタルカメラで撮影し、SPSS統計ソフトで処理することで、冠状切片における梗塞脳組織の体積および正常脳組織の体積を計算した。試験結果を表7に示す。
化合物Ia〜Ilが前記試験で示した治療作用は用量依存関係を有することを説明するために、本発明はあらゆる試験結果を分析、比較および総合したうえで、化合物Ieを代表として選び、用量−効果関係試験が行われた。強調すべきこととして、試験例1−7においてIa〜Ilのほかの化合物とIeが類似したNOフリーラジカル捕捉、オイグロブリン溶解、血栓溶解、抗血栓、並びに脳卒中ラット治療などの効果を奏したので、Ia〜Ilのほかの化合物はIeと同様に用量依存的治療作用が得られるはずである。
試験例9 ラットが脳卒中にかかった4時間後1μmol/kgの本発明化合物Ieでの連続的な治療を6回受けた試験
治療効果は神経機能点数で表される。点数が低ければ、活性が強い。オスSDラットに用量400 mg/kg体重で10%抱水クロラール溶液を腹腔内注射することで、麻酔をかけた。頸部の真ん中から縦に切り目をつけ、右側の総頸動脈主幹(長さ約3 cm)を分離した。舌骨において結紮された外頸動脈の各ブランチを水平に分離して、頸部の膨れ上がる部位で内頸動脈を分離した。非侵襲的動脈鉗子によって内頸動脈の開口部位と総頸動脈の近位端をそれぞれ締めて、それに外頸動脈の遠位端を結紮した。外頸動脈の主幹において、血栓塊の生理食塩水懸濁液0.5 mLを入れたカテーテルを挿した。内頸動脈鉗子を緩めて、同時にカテーテル内の血栓塊の生理食塩水懸濁液0.5 mLをゆっくりと外頸動脈から内頸動脈を通じて近位端の大脳動脉に注入させた。その後、外頸動脈の近位端を結紮し、内頸動脈および総頸動脈の動脈鉗子を緩め、血流を回復させて、傷口を縫合した。感染を予防するために2万IUのペニシリンを筋肉注射した。4時間後尾静脈から化合物Ie(用量1μmol/kg,n = 11)の生理食塩水溶液、またはウロキナーゼ(用量20000 IU/kg、n = 6)の生理食塩水溶液、またはtPA(用量3 mg/kg、n = 6)の生理食塩水溶液を注入した。一日あたりラットの尾静脈から化合物Ieの生理食塩水溶液を一回注入して、6日連続して注入し、7日観察した。毎日自分で対照して、Zealonga法に基づき神経機能欠損程度を評価した。あるいは、一日あたりラットの尾静脈からウロキナーゼの生理食塩水溶液を一回注入して、2日連続して注入し、毎日自分で対照して、Zealonga法に基づき神経機能欠損程度を評価した。あるいは、一日あたりラットの尾静脈からtPAの生理食塩水溶液を一回注入して、2日連続して注入し、毎日自分で対照して、Zealonga法に基づき神経機能欠損程度を評価した。0点は神経機能欠損兆候がまったくないことを表し、1点は未損傷側の前肢が伸びられないことを表し、2点は未損傷側へ歩くことを表し、3点は未損傷側へ回って尾行するように歩くことを表し、4点は意識障害のため自主的に歩けないことを表し、5点は死亡したことを表す。試験結果を表9−1、9−2および9−3に示す。
表9−2のデータから分かるように、ラットが脳卒中にかかった4時間後、一日あたり用量20000 IU/kgのウロキナーゼでの治療を一回受けた場合、6匹のラットのうち2匹が48時間以内に死亡した。死亡したラットの死体を解剖したところ、いずれも臓器に出血現象が発見した。とりわけ、肺出血が酷かった。そこで、2回投与した後投与を終止させた。2回投与した後、神経機能欠損兆候が全くなくなるまたはやや神経機能欠損兆候が残るように好転したラットがいなかった。
表9−3のデータから分かるように、ラット脳卒中にかかった4時間後、一日あたり用量3mg/kgのtPAでの治療を一回受けた場合、6匹のラットのうち1匹が24時間以内に死亡した。死亡したラットの死体を解剖したところ、臓器に出血現象が発見した。とりわけ、肺出血が酷かった。そこで、2回投与した後投与を終止させた。2回投与した後、神経機能欠損兆候が全くなくなるように好転したラットがいなかった。やや神経機能欠損兆候が残るように好転したラットがいた。
表9−1、9−2および9−3のデータをまとめて分かるように、脳卒中にかかった4時間後のラットに対して、二日連続して治療したとしても、用量1μmol/kgの化合物Ieが用量20000 IU/kgのウロキナーゼおよび用量3mg/kgのtPAより優れる。
治療効果は神経機能点数で表される。点数が低ければ、治療効果が良い。オスSDラットに用量400 mg/kg体重で10%抱水クロラール溶液を腹腔内注射することで、麻酔をかけた。頸部の真ん中から縦に切り目をつけ、右側の総頸動脈主幹(長さ約3 cm)を分離した。舌骨において結紮された外頸動脈の各ブランチを水平に分離して、頸部の膨れ上がる部位で内頸動脈を分離した。非侵襲的動脈鉗子によって内頸動脈の開口部位と総頸動脈の近位端をそれぞれ締めて、それに外頸動脈の遠位端を結紮した。外頸動脈の主幹において、血栓塊の生理食塩水懸濁液0.5 mLを入れたカテーテルを挿した。内頸動脈鉗子を緩めて、同時にカテーテル内の血栓塊の生理食塩水懸濁液0.5 mLをゆっくりと外頸動脈から内頸動脈を通じて近位端の大脳動脉に注入させた。その後、外頸動脈の近位端を結紮し、内頸動脈および総頸動脈の動脈鉗子を緩め、血流を回復させて、傷口を縫合した。感染を予防するために2万IUのペニシリンを筋肉注射した。6時間後尾静脈から化合物Ie(用量1μmol/kg,n=11)の生理食塩水溶液、またはウロキナーゼ(用量20000 IU/kg,n = 6)の生理食塩水溶液、またはtPA(用量3 mg/kg,n = 6)の生理食塩水溶液を注入した。一日あたりラットの尾静脈から化合物Ieの生理食塩水溶液を一回注入して、6日連続して注入し、7日観察した。毎日自分で対照して、Zealonga法に基づき神経機能欠損程度を評価した。あるいは、一日あたりラットの尾静脈からウロキナーゼの生理食塩水溶液を一回注入して、2日連続して注入し、毎日自分で対照して、Zealonga法に基づき神経機能欠損程度を評価した。あるいは、一日あたりラットの尾静脈からtPAの生理食塩水溶液を一回注入して、2日連続して注入し、毎日自分で対照して、Zealonga法に基づき神経機能欠損程度を評価した。0点は神経機能欠損兆候がまったくないことを表し、1点は未損傷側の前肢が伸びられないことを表し、2点は未損傷側へ歩くことを表し、3点は未損傷側へ回って尾行するように歩くことを表し、4点は意識障害のため自主的に歩けないことを表し、5点は死亡したことを表す。試験結果を表10−1、10−2および10−3に示す。
表10−2のデータから分かるように、ラットが脳卒中にかかった6時間後、一日あたり用量20000 IU/kgのウロキナーゼでの治療を一回受けた場合、6匹のラットのうち4匹が24時間以内に死亡した。死亡したラットの死体を解剖したところ、いずれも臓器に出血現象が発見した。とりわけ、肺出血が酷かった。そこで、2回投与した後投与を終止させた。2回投与した後、1匹のラットが好転し神経機能欠損兆候が全くなくなって、1匹のラットが意識障害が残り、自主的に歩く兆候がない。
表10−3のデータから分かるように、ラット脳卒中にかかった6時間後、一日あたり用量3mg/kgのtPAでの治療を一回受けた場合、6匹のラットのうち2匹が24時間以内に死亡した。死亡したラットの死体を解剖したところ、いずれも臓器に出血現象が発見した。とりわけ、肺出血が酷かった。そこで、2回投与した後投与を終止させた。2回投与した後、神経機能欠損兆候が全くなくなるように好転したラットがいなかった。2匹が神経機能欠損兆候がやや残り、1匹が未損傷側へ回って尾行するように歩く兆候が残り、1匹が意識障害が残り、自主的に歩く兆候がない。
表10−1、10−2および10−3のデータをまとめて分かるように、脳卒中にかかった6時間後のラットに対して、二日連続して治療したとしても、用量1μmol/kgの化合物Ieが用量20000 IU/kgのウロキナーゼおよび用量3mg/kgのtPAより優れる。
治療効果は神経機能点数で表される。点数が低ければ、治療効果が良い。オスSDラットに用量400 mg/kg体重で10%抱水クロラール溶液を腹腔内注射することで、麻酔をかけた。頸部の真ん中から縦に切り目をつけ、右側の総頸動脈主幹(長さ約3 cm)を分離した。舌骨において結紮された外頸動脈の各ブランチを水平に分離して、頸部の膨れ上がる部位で内頸動脈を分離した。非侵襲的動脈鉗子によって内頸動脈の開口部位と総頸動脈の近位端をそれぞれ締めて、それに外頸動脈の遠位端を結紮した。外頸動脈の主幹において、血栓塊の生理食塩水懸濁液0.5 mLを入れたカテーテルを挿した。内頸動脈鉗子を緩めて、同時にカテーテル内の血栓塊の生理食塩水懸濁液0.5 mLをゆっくりと外頸動脈から内頸動脈を通じて近位端の大脳動脉に注入させた。その後、外頸動脈の近位端を結紮し、内頸動脈および総頸動脈の動脈鉗子を緩め、血流を回復させて、傷口を縫合した。感染を予防するために2万IUのペニシリンを筋肉注射した。6時間後尾静脈から化合物Ie (一回目の用量5 μmol/kg、n=12)の生理食塩水溶液を注入した。その後、一日あたりラットの尾静脈から化合物Ieの生理食塩水溶液(用量2 μmol/kg、n=12)を一回注入して、6日連続して注入し、7日観察した。毎日自分で対照して、Zealonga法に基づき神経機能欠損程度を評価した。0点は神経機能欠損兆候がまったくないことを表し、1点は未損傷側の前肢が伸びられないことを表し、2点は未損傷側へ歩くことを表し、3点は未損傷側へ回って尾行するように歩くことを表し、4点は意識障害のため自主的に歩けないことを表し、5点は死亡したことを表す。試験結果を表11に示す。
試験例12 ラットが脳卒中にかかった24時間後一回目5μmol/kgで、次に2μmol/kgで5回本発明化合物Ieでの治療を受けた場合の試験
治療効果は神経機能点数で表される。点数が低ければ、治療効果が良い。オスSDラットに用量400 mg/kg体重で10%抱水クロラール溶液を腹腔内注射することで、麻酔をかけた。頸部の真ん中から縦に切り目をつけ、右側の総頸動脈主幹(長さ約3 cm)を分離した。舌骨において結紮された外頸動脈の各ブランチを水平に分離して、頸部の膨れ上がる部位で内頸動脈を分離した。非侵襲的動脈鉗子によって内頸動脈の開口部位と総頸動脈の近位端をそれぞれ締めて、それに外頸動脈の遠位端を結紮した。外頸動脈の主幹において、血栓塊の生理食塩水懸濁液0.5 mLを入れたカテーテルを挿した。内頸動脈鉗子を緩めて、同時にカテーテル内の血栓塊の生理食塩水懸濁液0.5 mLをゆっくりと外頸動脈から内頸動脈を通じて近位端の大脳動脉に注入させた。その後、外頸動脈の近位端を結紮し、内頸動脈および総頸動脈の動脈鉗子を緩め、血流を回復させて、傷口を縫合した。感染を予防するために2万IUのペニシリンを筋肉注射した。24時間後尾静脈から化合物Ie (一回目の用量5 μmol/kg、n=12)の生理食塩水溶液を注入した。その後、一日あたりラットの尾静脈から化合物Ieの生理食塩水溶液(用量2 μmol/kg、n=12)を一回注入して、6日連続して注入し、7日観察した。毎日自分で対照して、Zealonga法に基づき神経機能欠損程度を評価した。0点は神経機能欠損兆候がまったくないことを表し、1点は未損傷側の前肢が伸びられないことを表し、2点は未損傷側へ歩くことを表し、3点は未損傷側へ回って尾行するように歩くことを表し、4点は意識障害のため自主的に歩けないことを表し、5点は死亡したことを表す。試験結果を表12に示す。
試験例13 ラットが脳卒中にかかった6時間後2μmol/kgの本発明化合物Ieでの治療を6回受けた場合の試験
治療効果は神経機能点数で表される。点数が低ければ、治療効果が良い。オスSDラットに用量400 mg/kg体重で10%抱水クロラール溶液を腹腔内注射することで、麻酔をかけた。頸部の真ん中から縦に切り目をつけ、右側の総頸動脈主幹(長さ約3 cm)を分離した。舌骨において結紮された外頸動脈の各ブランチを水平に分離して、頸部の膨れ上がる部位で内頸動脈を分離した。非侵襲的動脈鉗子によって内頸動脈の開口部位と総頸動脈の近位端をそれぞれ締めて、それに外頸動脈の遠位端を結紮した。外頸動脈の主幹において、血栓塊の生理食塩水懸濁液0.5 mLを入れたカテーテルを挿した。内頸動脈鉗子を緩めて、同時にカテーテル内の血栓塊の生理食塩水懸濁液0.5 mLをゆっくりと外頸動脈から内頸動脈を通じて近位端の大脳動脉に注入させた。上述した試験例と異なり、本試験例で使用される血栓塊は−24℃で保存した血栓により製造された血栓塊の生理食塩水懸濁液ではなく、室温で24時間静置したもっと陳旧性血栓により製造された、明らかに硬い血栓塊の生理食塩水懸濁液である。その後、外頸動脈の近位端を結紮し、内頸動脈および総頸動脈の動脈鉗子を緩め、血流を回復させて、傷口を縫合した。感染を予防するために2万IUのペニシリンを筋肉注射した。6時間後尾静脈から化合物Ie(一回目の用量5 μmol/kg、n=12)の生理食塩水溶液を注入した。その後、一日あたりラットの尾静脈から化合物Ieの生理食塩水溶液(用量2 μmol/kg)を一回注入して、6日連続して注入し、7日観察した。毎日自分で対照して、Zealonga法に基づき神経機能欠損程度を評価した。0点は神経機能欠損兆候がまったくないことを表し、1点は未損傷側の前肢が伸びられないことを表し、2点は未損傷側へ歩くことを表し、3点は未損傷側へ回って尾行するように歩くことを表し、4点は意識障害のため自主的に歩けないことを表し、5点は死亡したことを表す。試験結果を表13に示す。
表13のデータから分かるように、陳旧性血栓により誘導されたラット脳卒中6時間後のモデルにおいて、一日につき一回用量2μmol/kgの化合物Ieでの治療を6回連続して受けることで、確実な治療効果が得られた。6匹が死亡した以外、治療を受けた12匹のラットのうち、残った6匹のラットの中1匹が好転し、神経機能欠損兆候が全くなくなり、5匹がやや神経機能欠損兆候が残っていた。ここから、化合物Ieの連続的な治療は陳旧性脳卒中に確実な効果を有することが分かった。
強調すべきこととして、試験例1−7においてIa〜Ilのほかの化合物とIeが類似したNOフリーラジカル捕捉、オイグロブリン溶解、血栓溶解、抗血栓、並びに脳卒中ラット治療などの効果を奏したので、Ia〜Ilのほかの化合物はIeと同様に用量依存的治療作用が得られるはずである。
試験例14 本発明化合物Ia〜Ilの濃度1×10−6 M、1×10−9 Mおよび1×10−12 Mにおけるナノ構造試験
三回蒸留した水を利用して、本発明化合物Ia〜Ilをそれぞれ1×10−6 M、1×10−9 Mおよび1×10−12 Mの溶液に調製した。10 μLの溶液を吸い取って、銅メッシュの表面に滴下した。銅メッシュの下にろ紙を当てて、自然乾燥させた。透過電子顕微鏡(JEOL、JEM− 1230)により観察し、形態と粒子径を写真の形で記録した。
1.被験化合物:本発明化合物Ia〜Il。
2.試験方法:三回蒸留した水を利用して、被験化合物(Ia−Il)を1×10−6 M、1×10−9 Mおよび1×10−12 Mの溶液に調製した。微量の溶液(10 μL)を吸い取って、銅メッシュの表面に滴下した。銅メッシュの下にろ紙を当てて、自然乾燥させた。透過電子顕微鏡(JEOL、JEM− 1230)により形態と粒子径を観察し写真の形で記録した。
3.試験結果を図25−図36に示す。図25は本発明化合物Iaの1×10−6 M、1 × 10−9 Mおよび1 × 10−12 M水溶液におけるナノ構造であり、水溶液においてIaのナノ構造が直径3.1 nm〜86.1 nmのナノスフィアである。図26は本発明化合物Ibの1×10−6 M、1×10−9 Mおよび1×10−12 M水溶液におけるナノ構造であり、水溶液においてIbのナノ構造が直径4.3 nm〜297.9 nmのナノスフィアである。図27は本発明化合物Icの1×10−6 M、1×10−9 Mおよび1×10−12 M水溶液におけるナノ構造であり、水溶液においてIcのナノ構造がそれぞれ直径2.2 nm〜165.7 nmのナノスフィアである。図28は本発明化合物Idの1×10−6 M、1×10−9 Mおよび1×10−12 M水溶液におけるナノ構造であり、水溶液においてIdのナノ構造が直径16.2 nm〜201.2 nmのナノスフィアである。図29は本発明化合物Ieの1×10−6 M、1×10−9 Mおよび1×10−12 M水溶液におけるナノ構造であり、水溶液においてIeのナノ構造が直径3.3 nm〜138.9 nmのナノスフィアである。図30は本発明化合物Ifの1×10−6 M、1×10−9 Mおよび1×10−12 M水溶液におけるナノ構造であり、水溶液においてIfのナノ構造が直径3.6 nm〜82.4 nmのナノスフィアである。図31は本発明化合物Igの1×10−6 M、1×10−9 Mおよび1×10−12 M水溶液におけるナノ構造であり、水溶液においてIgのナノ構造が直径6.3 nm〜264.5 nmのナノスフィアである。図32は本発明化合物Ihの1×10−6 M、1×10−9 Mおよび1×10−12 M水溶液におけるナノ構造であり、水溶液においてIhのナノ構造が直径5.1 nm〜149.8 nmのナノスフィアである。図33は本発明化合物Iiの1×10−6 M、1×10−9 Mおよび1×10−12 M水溶液におけるナノ構造であり、水溶液においてIiのナノ構造が直径4.7 nm〜107.7 nmのナノスフィアである。図34は本発明化合物Ijの1×10−6 M、1×10−9 Mおよび1×10−12 M水溶液におけるナノ構造であり、水溶液においてIjのナノ構造が直径9.1 nm〜73.7 nmのナノスフィアである。図35は本発明化合物Ikの1×10−6 M、1×10−9 Mおよび1×10−12 M水溶液におけるナノ構造であり、水溶液においてIkのナノ構造が直径10.1 nm〜66.7 nmのナノスフィアである。図36は本発明化合物Ilの1×10−6 M、1×10−9 Mおよび1×10−12 M水溶液におけるナノ構造であり、水溶液においてIlのナノ構造が直径6.1 nm〜153.3 nmのナノスフィアである。
三回蒸留した水を利用して、化合物Ia−Ilを2.5 μMの溶液に調製した。10 μLの溶液を吸い取ってアプライし、solariX FT−ICR質量スペクトル(Bruker Daltonik)により分子間会合状態を観察し、データを記録した。結果を表14−表16に示す。
表14−表16はFT高分解能質量スペクトルにより測定した精確な質量データである。これらの質量データによれば、本発明化合物Ia−Ilは1×10−6 M、1×10−9および1×10−12 Mという三つの濃度で同時に2量体、3量体および4量体を検出したことが分かった。ここから分かるように、本発明化合物は水溶液において同時に2量体、3量体および4量体を形成できる。
質量スペクトルを視認化させるために、三回蒸留した水を利用して、化合物Ieをそれぞれ10.0 μM、1.0 μM、0.1 μM、0.01 μMの溶液に調製した。10 μLの溶液を吸い取ってアプライし、solariX FT−ICR質量スペクトル(Bruker Daltonik)により分子間会合状態を観察し、スペクトルを記録した。結果を図37−図40に示す。図37は本発明化合物Ieの濃度0.01 μMにおける高分解能FT− MS質量スペクトルであり、915.84146が2量体の三価イオンであり、1030.32114が3量体の四価イオンであり、1099.00914が4量体の五価イオンである。図38は本発明化合物Ieの濃度0.1 μMにおける高分解能FT−MS質量スペクトルであり、915.84124が2量体の三価イオンであり、1030.32208が3量体の四価イオンであり、1099.00829が4量体の五価イオンである。図39は本発明化合物Ieの濃度1 μMにおける高分解能FT− MS質量スペクトルであり、915.84095が2量体の三価イオンであり、1030.32067が3量体の四価イオンであり、1099.00914が4量体の五価イオンである。図40は本発明化合物Ieの濃度10 μMにおける高分解能FT− MS質量スペクトルであり、915.84163が2量体の三価イオンであり、1030.32067が3量体の四価イオンであり、1099.00914が4量体の五価イオンである。
ラット大脳全体を取り、50 mLの遠心管に置き、0.9% NaCl溶液10 mL添加し、ホモジネートして均一な懸濁物が得られた。その後、3000 rpmの条件で10 min遠心分離し、上澄み液5 mLを取り、さらにメタノール10 mLを添加して、均一に振盪した後、3000 rpmの条件で10 min遠心分離した。上澄み液を取り、減圧濃縮し蒸発乾燥させた。さらにメタノール1 mLを添加して、また12000 rpmの条件で10 min遠心分離することで上澄み液が得られた。当該上澄み液は化合物Ieで治療したラットの脳組織における代謝物の含有量の監視に用いられた。
高分解能FT− MSの測定結果によれば、脳に二つの代謝物M1およびM2があることが示された。そのうち、M1の[M+1]+が291.06971であり、分子式がC15H19O5N2である。M2の[M+1]+が307.04350であり、分子式がC15H19O4N2である(質量スペクトルの条件:アプライ量10 μL、電離モデルES+、コーン電圧30 V、移動相流速0.2 mL/min)。これらのデータから、代謝物M1およびM2が以下の化合物であると推定できる。
Claims (5)
- NOフリーラジカル捕捉活性を有するイミダゾリン類と、血栓溶解活性を有するペプチドと血栓へのターゲティングペプチドとがリンカーで連接されてなる三元コンジュゲートであって、
前記三元コンジュゲートは、1,3−ジオキソ−2−{4’−オキソアセチル−[N ω −(Gly−Arg−Pro−Ala−Lys)−Lys−Arg−Gly−Asp−Val]フェニル}−4,4,5,5−テトラメチルイミダゾリンである、前記三元コンジュゲート。 - 請求項1に記載の三元コンジュゲート及び医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
- 血栓溶解薬、NOフリーラジカル捕捉薬または抗血栓薬である請求項2に記載の医薬組成物。
- 脳卒中または脳梗塞を治療する医薬である請求項2に記載の医薬組成物。
- 発症時間が3時間を超える脳卒中または脳梗塞の治療に用いられる請求項4に記載の医薬組成物。
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