CN102485748B - 具有靶向性溶血栓活性的寡肽、其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了通式6a-f(式中n＝6、8、10、12、14和16)代表的6种靶向性溶血栓寡肽，提供了它们的制备方法，进一步提供了它们在大鼠颈动静脉旁路插管血栓模型上的溶血栓、抗血栓作用，以及自主装性能。结果表明这6种新型化合物不但具有优秀的溶血栓作用，而且在相同剂量下具有抗血栓活性，这说明本发明中的化合物在溶解血栓的同时有预防新血栓形成的作用优势，从而提示6a-f代表的6种寡肽在临床应用中具有更好的前景。
Figure DSA00000376099500011

Description

具有靶向性溶血栓活性的寡肽、其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及了通式6a-f代表的具有靶向性溶血栓活性的寡肽及其制备方法，进一步涉及它们在大鼠动静脉旁路插管血栓模型上的溶血栓和抗血栓作用及应用，本发明属于生物医药领域。
背景技术
P6A(ARPAK)为纤维蛋白β链降解产物之一，具有溶血栓活性。在P6A的代谢研究中发现了代谢产物PAK。在大鼠动静脉旁路插管溶血栓模型上，PAK的溶血栓活性比母体P6A强。按照一般的认识，多肽在体内都会迅速降解。通过PAK的结构修饰延缓体内降解速率和提高溶血栓活性，是寡肽溶血栓药物研究的重要途径。通过RGD的结构修饰延缓体内降解速率和提高抗血栓活性，是寡肽抗血栓药物研究的重要途径。通过PAK和RGD相结合的结构修饰延缓体内降解速率和提高溶血栓活性，是具有溶血栓和抗血栓双重作用的寡肽药物研究的重要途径。按照一般的认识，含多肽的两亲性分子，例如脂肪醇链修饰的多肽，在适当的条件下通过分子间非共价键相互作用可发生自组装，形成纳米结构。借助纳米结构可改善多肽在体内的输送、延缓多肽在体内的降解速率和提高多肽的体内活性。根据这些认识，发明人提出了本发明。
发明内容
本发明的一个目的是提供具有靶向性溶血栓活性的寡肽。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一类具有靶向性溶血栓活性的寡肽，如通式6a-f所示：
Figure BSA00000376099800011
其中n＝6、8、10、12、14或16。
本发明的另一个目的是提供一种制备所述具有靶向性溶血栓活性的寡肽的方法，包括如下步骤：
1)按照现有液相合成技术，逐步接肽合成Boc-Pro-Ala-Lys(Z)；
2)Boc-Asp(OBzl)与饱和脂肪醇缩合后再脱去侧链保护基得到Boc-Asp-OCH2(CH2)nCH3，其中n＝6、8、10、12、14或16；
3)按照现有液相合成技术，逐步接肽合成Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl；
4)将Boc-Asp-OCH2(CH2)nCH3与Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl缩合反应后脱去N端保护基得到Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)nCH3；
5)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)与Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)nCH3缩合反应后，依次脱去C端保护基、侧链保护基和N端保护基得到目标化合物。
其中所述N端保护基是对多肽的N端进行保护时常用的保护基团，例如可以是叔丁氧羰基(Boc)；所述C端保护基是对多肽的C端进行保护时常用的保护基团，例如可以是甲氧基(OMe)、苄氧基(OBzl)；所述侧链保护基是对多肽侧链进行保护时常用的保护基团，例如可以是苄基(Bzl)、苄氧基(OBzl)、硝基(NO2)、苄氧羰基(Z)；所述液相合成技术及涉及的保护、缩合、脱保护的过程是本领域的常规并公知的技术。
其中缩合反应是在二环己基碳二亚胺(DCC)存在下于无水THF中进行；脱去N端保护基如Boc是在含氯化氢的乙酸乙酯中进行；脱去C端保护基如OBzl是在甲醇中进行皂化；脱去侧链保护基如Z、OBzl、NO2是在甲醇中发生氢解。
该制备方法可以用图1的路线概括，具体的，所述方法包括：
1)在DCC存在下Boc-Pro在无水THF中HONp脱水形成Boc-Pro-ONp；
2)在含水的二氧六环中Boc-Pro-ONp与L-Ala缩合为Boc-Pro-Ala；
3)在DCC和HOBt存在下Boc-Pro-Ala在无水THF中与Lys(Z)-OBzl缩合为Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl；
4)在甲醇中将Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl皂化为Boc-Pro-Ala-Lys(Z)；
5)在DCC存在下Boc-Asp(OBzl)在无水THF中与饱和脂肪醇缩合为Boc-Asp(OBzl)-OCH2(CH2)nCH3；
6)在甲醇中Boc-Asp(OBzl)-OCH2(CH2)nCH3氢解为Boc-Asp-OCH2(CH2)nCH3；
7)在DCC和HOBt存在下Boc-Arg(NO2)在无水THF中与Gly-OBzl缩合为Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl；
8)在甲醇中将Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl皂化为Boc-Arg(NO2)-Gly；
9)在DCC和HOBt存在下Boc-Asp(OBzl)在无水THF中与Phe-OBzl缩合为Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl；
10)在含氯化氢的乙酸乙酯中Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl脱除Boc生成Asp(OBzl)-Phe-OBzl；
11)在DCC和HOBt存在下Boc-Arg(NO2)-Gly在无水THF中与Asp(OBzl)-Phe-OBzl缩合为Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl；
12)在含氯化氢的乙酸乙酯中Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl脱除Boc生成Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl；
13)在DCC和HOBt存在下Boc-Asp-OCH2(CH2)nCH3在无水THF中与Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl缩合为Boc-Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)nCH3；
14)在含氯化氢的乙酸乙酯中Boc-Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)nCH3脱除Boc生成Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)nCH3；
15)在DCC和HOBt存在下Boc-Pro-Ala-Lys(Z)在无水THF中与Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)nCH3缩合为Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)nCH3；
16)在甲醇中Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)nCH3氢解为Boc-Pro-Ala-Lys-Asp(Arg-Gly-Asp-Phe)-OCH2(CH2)n-CH3；
17)在含氯化氢的乙酸乙酯中Boc-Pro-Ala-Lys-Asp(Arg-Gly-Asp-Phe)-OCH2(CH2)nCH3脱Boc生成Pro-Ala-Lys-Asp(Arg-Gly-Asp-Phe)-OCH2(CH2)n-CH3。
本发明的又一个目的是提供所述具有靶向性溶血栓活性的寡肽在制备抗血栓药物中的应用。
通过实验来评价本发明通式6a-f所示的寡肽在大鼠颈动静脉旁路插管血栓模型上的溶血栓、抗血栓作用，以及自主装性能。结果表明这6种新型化合物不但具有优秀的溶血栓作用，而且在相同剂量下具有抗血栓活性，这说明本发明中的化合物在溶解血栓的同时有预防新血栓形成的作用优势，从而提示6a-f代表的6种寡肽在临床应用中具有更好的前景。
附图说明
图1为本发明具有靶向性溶血栓活性的寡肽的合成路线。其中i)DCC，HONp，NaHCO3和Ala；ii)DCC，HOBt，NMM；iii)NaOH水溶液；iv)Pd/C，H2；v)氯化氢/乙酸乙酯溶液(4N)。
图2为本发明寡肽6e在水溶液中形成的纳米球的代表性透射电镜照片。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
实施例1制备Boc-Asp(OBzl)-OCH2(CH2)6CH3(1a)
将1.615g(5.0mmol)Boc-Asp(OBzl)用20ml无水THF溶解。向得到的溶液中加入0.810g(6.0mmol)N-羟基苯并三氮唑(HOBt)。10分钟后，在冰浴下加入1.236g(6.0mmol)二环己基羰二亚胺(DCC)与25ml无水THF的溶液，得到反应液(I)。把0.780g(6.0mmol)CH3(CH2)6CH2OH溶于10ml无水THF得到反应液(II)。冰浴下将反应液(II)加入反应液(I)中，然后室温搅拌12小时，TLC(石油醚/乙酸乙酯，15∶1)显示Boc-Asp(OBzl)消失。反应液过滤，滤除二环己基脲(DCU)。滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，除去THF。残留物用200ml乙酸乙酯重新溶解并置于250ml分液漏斗中，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液和饱和氯化钠水溶液分别萃洗三遍。乙酸乙酯相用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，残留物经柱层析纯化，得到0.980g(45％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：436[M+H]+.
实施例2制备Boc-Asp(OBzl)-OCH2(CH2)8CH3(1b)
按照实施例1的方法由1.615g(5.0mmol)Boc-Asp(OBzl)和0.948g(6.0mmol)CH3(CH2)8CH2OH制得1.213g(52％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：486[M+Na]+.
实施例3制备Boc-Asp(OBzl)-OCH2(CH2)10CH3(1c)
按照实施例1的方法由1.615g(5.0mmol)Boc-Asp(OBzl)和1.116g(6.0mmol)CH3(CH2)10CH2OH制得1.230g(50％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：514[M+Na]+.
实施例4制备Boc-Asp(OBzl)-OCH2(CH2)12CH3(1d)
按照实施例1的方法由1.615g(5.0mmol)Boc-Asp(OBzl)和1.284g(6.0mmol)CH3(CH2)12CH2OH制得1.349g(52％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：542[M+Na]+.
实施例5制备Boc-Asp(OBzl)-OCH2(CH2)14CH3(1e)
按照实施例1的方法由1.615g(5.0mmol)Boc-Asp(OBzl)和1.452g(6.0mmol)CH3(CH2)14CH2OH制得1.426g(52％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：548[M+H]+.
实施例6制备Boc-Asp(OBzl)-OCH2(CH2)16CH3(1f)
按照实施例1的方法由1.615g(5.0mmol)Boc-Asp(OBzl)和1.620g(6.0mmol)CH3(CH2)16CH2OH制得1.512g(53％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：576[M+H]+.
实施例7制备Boc-Asp-OCH2(CH2)6CH3(2a)
将0.980g(2.25mmol)Boc-Asp(OBzl)-OCH2(CH2)6CH3置于50ml茄形瓶中，用甲醇溶解，加49mg Pd/C(5％)，通H2(0.02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压浓缩至干，得0.680g(90％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：344[M-H]-.
实施例8制备Boc-Asp-OCH2(CH2)8CH3(2b)
按照实施例7的方法1.213g(2.62mmol)Boc-Asp(OBzl)-OCH2(CH2)8CH3制得0.902g(95％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：372[M-H]-.
实施例9制备Boc-Asp-OCH2(CH2)10CH3(2c)
按照实施例7的方法1.230g(2.51mmol)Boc-Asp(OBzl)-OCH2(CH2)10CH3制得0.953g(97％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：400[M-H]-.
实施例10制备Boc-Asp-OCH2(CH2)12CH3(2d)
按照实施例7的方法1.349g(2.60mmol)Boc-Asp(OBzl)-OCH2(CH2)12CH3制得1.002g(92％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：428[M-H]-.
实施例11制备Boc-Asp-OCH2(CH2)14CH3(2e)
按照实施例7的方法1.426g(2.60mmol)Boc-Asp(OBzl)-OCH2(CH2)14CH3制得1.132g(97％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：456[M-H]-.
实施例12制备Boc-Asp-OCH2(CH2)16CH3(2f)
按照实施例7的方法1.512g(2.63mmol)Boc-Asp(OBzl)-OCH2(CH2)16CH3制得1.193g(96％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：484[M-H]-.
实施例13制备Boc-Pro-ONp
将1.0g(4.65mmol)Boc-Pro-OH置于50ml茄形瓶中，加入20ml无水四氢呋喃溶解，冰浴搅拌，形成溶液A。将711mg(5.12mmol)HONp置于25ml三角瓶中，加入8ml无水四氢呋喃溶解，形成溶液B。将溶液B滴加至冰浴搅拌下的溶液A中，得到溶液C。将1.05g(5.12mmol)DCC加入溶液C中，冰浴搅拌3小时，期间任冰浴自行融化，不再加冰。反应混合物过滤，滤除生成的DCU，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩。减压浓缩的残留物用40ml乙酸乙酯溶解。溶液置于50ml分液漏斗中，以饱和碳酸氢钠水溶液萃洗三遍，TLC确认酯层无Boc-Pro-OH后，乙酸乙酯层用饱和氯化钠水溶液洗至中性，分出乙酸乙酯层并置于50ml茄形瓶中用旋转蒸发仪减压浓缩，得到黄色油状产物。
实施例14制备Boc-Pro-Ala
将油状Boc-Pro-ONp置于50ml茄形瓶中，加入15ml二氧六环溶解，得到溶液A。将496mg(5.58mmol)L-Ala-OH及468mg(5.581mmol)碳酸氢钠固体置于25ml茄形瓶中，加入8ml水溶解，用单通抽出CO2，得到溶液B。将溶液B滴加至搅拌下的溶液A中，并随时用NMM调节pH至8-9，持续搅拌12小时，分别在第1，3，及6小时抽除CO2。TLC检测确认Boc-Pro-ONp消失后，反应混合物用饱和硫酸氢钾水溶液调节至pH＝7后用旋转蒸发仪减压浓缩，得到的油状物加1ml水稀释后，继续滴加饱和硫酸氢钾水溶液酸化至pH＝2。得到的水溶液置于50ml分液漏斗中，用氯仿萃取三次。合并氯仿层，并用饱和氯化钠水溶液洗涤至中性。分出氯仿层，加入无水硫酸钠干燥过夜。过滤，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩至干，得到黄色固体1.202g(90％)。ESI-MS(m/e)：285[M-H]-.
实施例15制备Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将1.202g(4.2mmol)Boc-Pro-Ala-OH溶于20ml无水THF，冰浴下往得到的溶液中加入0.544g(4.0mmol)N-羟基苯并三氮唑(HOBt)，并使完全溶解。10分钟后加入1.030g(5.0mmol)二环己基羰二亚胺(DCC)。得到反应液(I)，搅拌35分钟，待用。冰浴下把2.169g(4.0mmol)TosH·H-Lys(Z)-OBzl悬浮于20ml无水THF中，1ml N-甲基吗啉(NMM)调pH 8-9，得到反应液(II)。冰浴下把反应液(II)滴加到反应液(I)中，先冰浴下搅拌1小时，再室温搅拌12小时，TLC(石油醚/乙酸乙酯，1∶1)显示TosH·H-Lys(Z)-OBzl消失。滤除二环己基脲(DCU)，滤液减压浓缩除去THF。残留物用150ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液和饱和氯化钠水溶液分别萃洗三遍。乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥过液、抽滤得滤液减压浓缩至干，残留物经柱层析纯化，得到1.536g(60％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：639[M+H]+.
实施例16制备Boc-Pro-Ala-Lys(Z)
将1.536g(2.4mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl溶于15ml甲醇。冰浴下将得到的溶液用NaOH(2N)水溶液调pH＝12并搅拌2小时，TLC(石油醚/乙酸乙酯，1∶1)显示Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反应混合物用饱和硫酸氢钾溶液调pH＝7，减压浓缩除甲醇。残留物用饱和硫酸氢钾溶液调pH＝2，用乙酸乙酯萃取(30ml×3)。合并的乙酸乙酯相用饱和氯化钠水溶液洗至中性，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液减压浓缩至干，得1.142g(87％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：547[M-H]-.
实施例17制备Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl
按照实施例15的方法，由1.600g(5.0mmol)Boc-Arg(NO2)-OH和2.026g(6.0mmol)TosH·H-Gly-OBzl制得2.24g(96％)标题化合物，为淡黄色油状体。ESI-MS(m/e)：467[M+H]+
实施例18制备Boc-Arg(NO2)-Gly-OH
按照实施例16的方法，Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl 2.24g(4.8mmol)皂化得1.713g(95％)标题化合物，为淡黄色油状物。ESI-MS(m/e)：375[M-H]-
实施例19制备Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl
按照实施例15的方法，由1.620g(5.0mmol)Boc-Asp(OBzl)-OH和2.568g(6.0mmol)TosH·H-Phe-OBzl制得2.548g(91％)标题化合物，为淡黄色油状物。ESI-MS(m/e)：561[M+H]+
实施例20制备Asp(OBzl)-Phe-OBzl
将2.548g(4.6mmol)Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl溶于25ml 4N氯化氢-乙酸乙酯溶液中并室温搅拌2小时，TLC(氯仿/甲醇，30∶1)显示Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl消失。减压浓缩除去乙酸乙酯，残留物反复加少量乙醚进行减压浓缩以除去氯化氢。最后加少量乙醚将残留物研磨成1.904mg(92％)目标化合物，为黄色油状物。ESI-MS(m/e)：413[M+H]+.
实施例21制备Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl
按照实施例15的方法，由1.715g(4.56mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-OH和1.904g(4.14mmol)HCl·H-Asp(OBzl)-Phe-OBzl反应，经柱层析纯化，制得1.930g(57％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：771[M+H]+
实施例22制备Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl
按照实施例20的方法，1.930g(2.4mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl制得1.64g(95％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：671[M+H]+.
实施例23制备Boc-Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)6CH3(3a)
按照实施例15的方法由0.680g(2.03mmol)Boc-Asp-OCH2(CH2)6CH3和1.213g(1.69mmol)Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl制得1.008mg(57％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：1057[M+H]+.
实施例24制备Boc-Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)8CH3(3b)
按照实施例15的方法由0.902g(2.48mmol)Boc-Asp-OCH2(CH2)8CH3和1.486g(2.07mmol)Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl制得1.222mg(55％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：1074[M+H]+.
实施例25制备Boc-Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)10CH3(3c)
按照实施例15的方法由0.953g(2.44mmol)Boc-Asp-OCH2(CH2)10CH3和1.458g(2.03mmol)Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl制得1.296mg(58％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：1102[M+H]+.
实施例26制备Boc-Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)12CH3(3d)
按照实施例15的方法由1.002g(2.39mmol)Boc-Asp-OCH2(CH2)12CH3和1.429g(1.99mmol)Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl制得1.393g(62％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：1130[M+H]+.
实施例27制备Boc-Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)14CH3(3e)
按照实施例15的方法由1.132g(2.53mmol)Boc-Asp-OCH2(CH2)14CH3和1.515g(2.11mmol)Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl制得1.294mg(53％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：1158[M+H]+.
实施例28制备Boc-Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)16CH3(3f)
按照实施例15的方法由1.193g(1.87mmol)Boc-Asp-OCH2(CH2)16CH3和1.120g(1.56mmol)Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl制得1.072mg(58％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：1186[M+H]+.
实施例29制备Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)6CH3(4a)
按照实施例20的方法，1.008g(0.96mmol)Boc-Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)6CH3制得0.863g(95％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：947[M+H]+.
实施例30制备Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)8CH3(4b)
按照实施例20的方法，1.222g(1.14mmol)Boc-Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)8CH3制得1.020g(92％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：974[M+H]+.
实施例31制备Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)10CH3(4c)
按照实施例20的方法，1.296g(1.18mmol)Boc-Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)10CH3制得1.063g(90％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：1002[M+H]+.
实施例32制备Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)12CH3(4d)
按照实施例20的方法，1.393g(1.24mmol)Boc-Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)12CH3制得1.152g(91％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：1030[M+H]+.
实施例33制备Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)14CH3(4e)
按照实施例20的方法，1.294g(1.12mmol)Boc-Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)14CH3制得1.065g(90％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：1058[M+H]+.
实施例34制备Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)16CH3(4f)
按照实施例20的方法，1.072g(0.91mmol)Boc-Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)16CH3制得0.898g(92％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：1086[M+H]+.
实施例35制备
Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)6CH3(5a)
按照实施例15的方法由0.598g(1.09mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)和0.863g(0.91mmol)Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)6CH3反应，经柱层析纯化得0.319mg(24％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：1477[M+H]+.Mp：149.7-149.8℃.
Figure BSA00000376099800101
(c＝0.50，CH3OH).IR(KBr)：3306.76，3064.25，2930.64，1734.08，1646.69，1540.40，1456.08，1396.43，1258.87，1172.22，741.70，698.61.1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝8.47(m，2H)，8.27-8.17(m，4H)，7.99(d，J＝6.0Hz，2H)，7.84(m，1H)，7.79(m，1H)，7.34-7.19(m，20H)，5.12-5.00(m，6H)，4.72(m，1H)，4.59-4.50(m，2H)，4.28(m，3H)，4.09(m，1H)，3.97(m，2H)，3.77-3.64(m，2H)，3.27(m，1H)，3.14(m，2H)，3.03-2.97(m，4H)，2.74-2.59(m，4H)，2.02(m，1H)，1.76-1.69(m，5H)，1.50-1.13(m，34H)，0.84(m，3H).
实施例36制备Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)8-CH3(5b)
按照实施例15的方法由0.690g(1.26mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)和1.020g(1.05mmol)Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)8CH3反应，经柱层析纯化得0.332mg(22％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：1505[M+H]+.Mp：147.6-147.9℃.
Figure BSA00000376099800111
(c＝0.45，CH3OH).IR(KBr)：3306.64，3065.56，2928.52，2856.31，1736.21，1666.00，1530.64，1458.34，1400.43，1253.79，1154.63，737.84698.28.1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝8.44-8.36(m，2H)，8.27-8.17(m，4H)，7.98(d，J＝6.9Hz，1H)，7.84(d，J＝7.8Hz，1H)，7.77(d，J＝6.6Hz，1H)，7.34-7.19(m，20H)，5.13-5.00(m，6H)，4.73(m，1H)，4.60-4.47(m，2H)，4.28(m，3H)，4.08(m，1H)，3.97(m，2H)，3.72(m，2H)，3.27(m，1H)，3.14(m，2H)，3.04-2.94(m，4H)，2.76-2.56(m，4H)，2.02(m，1H)，1.79-1.65(m，5H)，1.50-1.12(m，38H)，0.83(m，3H).
实施例37制备Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)10CH3(5c)
按照实施例15的方法由0.697g(1.27mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)和1.063g(1.06mmol)Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)10CH3反应，经柱层析纯化得0.325mg(20％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：1533[M+H]+.Mp：150.9-151.1℃.
Figure BSA00000376099800112
(c＝0.65，CH3OH).IR(KBr)：3299.26，3068.33，2927.58，2855.01，1739.90，1638.96，1540.60，1455.98，1397.72，1260.50，1171.39，737.23，697.82.1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝8.45-8.38(m，2H)，8.28-8.18(m，4H)，7.99(d，J＝6.9Hz，1H)，7.85(d，J＝7.2Hz，1H)，7.78(d，J＝7.2Hz，1H)，7.34-7.20(m，20H)，5.12-5.50(m，6H)，4.77-4.70(m，1H)，4.59-4.47(m，2H)，4.36-4.28(m，3H)，4.08(m，1H)，3.97(m，2H)，3.73(m，2H)，3.42-3.38(m，1H)，3.27(m，2H)，3.11(m，2H)，3.03-2.89(m，4H)，2.75-2.55(m，4H)，2.05(m，1H)，1.77-1.64(m，5H)，1.50-1.22(m，42H)，0.85(m，3H).
实施例38制备Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)12CH3(5d)
按照实施例15的方法由0.737g(1.34mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)和1.152g(1.12mmol)Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)12CH3反应，经柱层析纯化得0.262mg(15％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：1561[M+H]+.Mp：149.7-150.1℃.
Figure BSA00000376099800121
(c＝0.45，CH3OH).IR(KBr)：3297.16，3060.16，2921.23，2847.67，1740.30，1637.61，1540.73，1454.26，1397.05，1262.20，1168.22，739.16，694.21.1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝8.44-8.36(m，2H)，8.27-8.17(m，4H)，7.99(d，J＝6.6Hz，1H)，7.85(d，J＝7.2Hz，1H)，7.78(m，1H)，7.34-7.19(m，20H)，5.11-5.50(m，6H)，4.72(m，1H)，4.59-4.49(m，2H)，4.27(m，3H)，4.08(m，1H)，3.96(m，2H)，3.72(m，2H)，3.27(m，1H)，3.14(m，2H)，3.01(m，4H)，2.74-2.58(m，4H)，2.03(m，1H)，1.76-1.69(m，5H)，1.50-1.11(m，46H)，0.83(m，3H).
实施例39制备
Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)14CH3(5e)
按照实施例15的方法由0.664g(1.21mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)和1.065g(1.01mmol)Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)14CH3反应，经柱层析纯化得0.289mg(18％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：1589[M+H]+.Mp：151.1-151.4℃.(c＝0.60，CH3OH).IR(KBr)：3298.51，3060.16，2925.71，2851.76，1734.08，1638.06，1540.79，1456.22，1397.36，1260.72，1171.94，743.25，698.30.1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝8.44-8.36(m，1H)，8.25-8.17(m，3H)，8.00-7.98(d，J＝6.6Hz，1H)，7.85(d，J＝7.8Hz，1H)，7.78(m，1H)，7.34-7.19(m，20H)，5.11-5.00(m，6H)，4.72(m，1H)，4.58-4.44(m，2H)，4.28(m，3H)，4.11(m，1H)，3.97(m，2H)，3.72(m，2H)，3.27(m，1H)，3.14(m，2H)，2.97(m，4H)，2.74-2.58(m，4H)，2.02(m，1H)，1.76-1.69(m，5H)，1.50-1.02(m，50H)，0.84(m，3H).
实施例40制备
Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)16CH3(5f)
按照实施例15的方法由0.546g(0.99mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)和0.898g(0.83mmol)Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)16CH3反应，经柱层析纯化得0.241mg(18％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：1617[M+H]+.Mp：151.2-151.4℃.
Figure BSA00000376099800123
(c＝0.45，CH3OH).IR(KBr)：3296.99，3060.16，2925.20，2851.76，1732.99，1638.78，1539.37，1455.78，1397.48，1260.61，1173.10，735.07，694.21.1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝8.44-8.36(m，1H)，8.25-8.17(m，4H)，7.98(d，J＝6.6Hz，1H)，7.84(d，J＝7.5Hz，1H)，7.78(m，1H)，7.34-7.19(m，20H)，5.12-5.00(m，6H)，4.72(m，1H)，4.59-4.50(m，2H)，4.28(m，3H)，4.11(m，1H)，3.96(m，2H)，3.71(m，2H)，3.27(m，1H)，3.14(m，2H)，2.97(m，4H)，2.74-2.58(m，4H)，2.02(m，1H)，1.79-1.69(m，5H)，1.50-1.12(m，54H)，0.85(m，3H).
实施例41制备Boc-Pro-Ala-Lys-Asp(Arg-Gly-Asp-Phe)-OCH2(CH2)6CH3
按照实施例7的方法0.319g(0.22mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)6CH3制得0.167g(68％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：1116[M-H]-.
实施例42制备Boc-Pro-Ala-Lys-Asp(Arg-Gly-Asp-Phe)-OCH2(CH2)8CH3
按照实施例7的方法0.332g(0.22mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)8CH3制得0.176g(70％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：1144[M-H]-.
实施例43制备Boc-Pro-Ala-Lys-Asp(Arg-Gly-Asp-Phe)-OCH2(CH2)10CH3
按照实施例7的方法0.326g(0.21mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)10CH3制得0.170g(69％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：1172[M-H]-.
实施例44制备Boc-Pro-Ala-Lys-Asp(Arg-Gly-Asp-Phe)-OCH2(CH2)12CH3
按照实施例7的方法0.262g(0.17mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)12CH3制得0.145g(71％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：1200[M-H]-.
实施例45制备Boc-Pro-Ala-Lys-Asp(Arg-Gly-Asp-Phe)-OCH2(CH2)14CH3
按照实施例7的方法0.289g(0.18mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)14CH3制得0.159g(72％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：1228[M-H]-.
实施例46制备Boc-Pro-Ala-Lys-Asp(Arg-Gly-Asp-Phe)-OCH2(CH2)16CH3
按照实施例7的方法0.241g(0.15mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)16CH3制得0.132g(70％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：1256[M-H]-.
实施例47制备Pro-Ala-Lys-Asp(Arg-Gly-Asp-Phe)-OCH2(CH2)6CH3(6a)
按照实施例20的方法，0.167g(0.15mmol)Boc-Pro-Ala-Lys-Asp(Arg-Gly-Asp-Phe)-OCH2(CH2)6CH3制得0.124g(81％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：1018[M+H]+.Mp：168.9-169.1℃.
Figure BSA00000376099800141
(c＝0.40，CH3OH).IR(KBr)：3265.46，3060.59，2928.86，1733.77，1568.87，1541.02，1456.55，1396.09，1222.87，702.38.1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝12.76-12.49(s，1H)，10.21-10.09(s，1H)，8.86(d，J＝6.6Hz，1H)，8.68-8.01(m，10H)，7.80(s，1H)，7.50-7.23(m，9H)，4.76-4.54(m，2H)，4.40-4.28(m，5H)，4.10-3.97(m，3H)，3.72-3.71(m，2H)，3.17-2.86(m，7H)，2.73-2.66(m，5H)，2.42-2.30(m，2H)，1.99-1.86(m，3H)，1.71-1.52(m，10H)，1.34-1.03(m，15H)，0.85(m，3H).
实施例48制备Pro-Ala-Lys-Asp(Arg-Gly-Asp-Phe)-OCH2(CH2)8CH3(6b)
按照实施例20的方法，0.176g(0.15mmol)Boc-Pro-Ala-Lys-Asp(Arg-Gly-Asp-Phe)-OCH2(CH2)8CH3制得0.125g(80％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：1046[M+H]+.Mp：170.9-171.2℃.(c＝0.50，CH3OH).IR(KBr)：3274.03，3063.71，2926.67，1733.71，1654.59，1540.93，1456.38，1395.41，1223.90，698.30.1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝12.47(s，2H)，10.07(s，1H)，8.85(d，J＝6.6Hz，1H)，8.48-8.01(m，11H)，7.80(s，1H)，7.49-7.23(m，9H)，4.59-4.57(m，2H)，4.38-4.27(m，5H)，3.99(m，3H)，3.71(m，2H)，3.17-2.89(m，6H)，2.73-2.66(m，5H)，2.40-2.32(m，2H)，1.99-1.87(m，3H)，1.71-1.52(m，9H)，1.34-1.04(m，19H)，0.84(m，3H).
实施例49制备Pro-Ala-Lys-Asp(Arg-Gly-Asp-Phe)-OCH2(CH2)10CH3(6c)
按照实施例20的方法，0.170g(0.14mmol)Boc-Pro-Ala-Lys-Asp(Arg-Gly-Asp-Phe)-OCH2(CH2)10CH3制得0.117g(78％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：1074[M+H]+.Mp：172.5-173.1℃.(0.50，CH3OH).IR(KBr)：3274.08，3060.16，2925.67，1733.64，1653.41，1557.94，1541.11，1454.26，1392.96，1225.43，698.30.1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝12.48(s，1H)，10.18(s，1H)，8.85(d，J＝6.9Hz，1H)，8.69-7.98(m，10H)，7.83(s，1H)，7.66-6.92(m，9H)，4.82-4.55(m，2H)，4.40-4.28(m，5H)，3.99(m，3H)，3.72(m，2H)，3.22-2.88(m，7H)，2.73-2.66(m，5H)，2.35-2.30(m，2H)，2.07-1.87(m，3H)，1.71-1.53(m，10H)，1.35-1.04(m，23H)，0.84(m，3H).
实施例50制备Pro-Ala-Lys-Asp(Arg-Gly-Asp-Phe)-OCH2(CH2)12CH3(6d)
按照实施例20的方法，0.145g(0.12mmol)Boc-Pro-Ala-Lys-Asp(Arg-Gly-Asp-Phe)-OCH2(CH2)12CH3制得0.108g(82％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：1102[M+H]+.Mp：175.1-175.6℃.
Figure BSA00000376099800151
(c＝0.50，CH3OH).IR(KBr)：3265.35，3061.96，2925.18，1733.76，1654.31，1540.78，1458.34，1392.96，1225.43，698.30.1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝12.35(s，1H)，10.14(s，1H)，8.86(d，J＝6.9Hz，1H)，8.42-7.98(m，10H)，7.84(s，1H)，7.69-6.92(m，9H)，4.62-4.54(m，2H)，4.38-4.21(m，5H)，4.10-3.97(m，3H)，3.72(m，2H)，3.22-2.87(m，7H)，2.73-2.66(m，5H)，2.35-2.31(m，2H)，2.06-1.87(m，3H)，1.71-1.53(m，10H)，1.35-0.98(m，27H)，0.87-0.83(m，3H).
实施例51制备Pro-Ala-Lys-Asp(Arg-Gly-Asp-Phe)-OCH2(CH2)14CH3(6e)
按照实施例20的方法，0.159g(0.13mmol)Boc-Pro-Ala-Lys-Asp(Arg-Gly-Asp-Phe)-OCH2(CH2)14CH3制得0.122g(83％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：1130[M+H]+.Mp：173.4-174.1℃.
Figure BSA00000376099800152
(c＝0.55，CH3OH).IR(KBr)：3272.64，3060.16，2925.02，1732.12，1662.43，1542.10，1456.28，1396.20，1230.79，701.07.1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝12.32(s，1H)，10.14(s，1H)，8.86(d，J＝6.9Hz，1H)，8.49-8.02(m，10H)，7.82(s，1H)，7.53-7.23(m，9H)，4.61-4.54(m，2H)，4.37-4.27(m，5H)，4.04-3.98(m，3H)，3.72(m，2H)，3.19-2.89(m，7H)，2.72-2.63(m，5H)，2.42-2.33(m，2H)，1.99-1.86(m，4H)，1.70-1.52(m，10H)，1.34-1.03(m，32H)，0.84(m，3H).
实施例52制备Pro-Ala-Lys-Asp(Arg-Gly-Asp-Phe)-OCH2(CH2)16CH3(6f)
按照实施例20的方法，0.132g(0.11mmol)Boc-Pro-Ala-Lys-Asp(Arg-Gly-Asp-Phe)-OCH2(CH2)16CH3制得0.108g(85％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：1158[M+H]+.Mp：177.9-178.4℃.
Figure BSA00000376099800153
(c＝0.55，CH3OH).IR(KBr)：3253.00，3056.07，2924.34，2847.67，1733.52，1654.29，1540.95，1456.47，1396.28，1224.68，698.30.1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝12.39(s，1H)，10.18(s，1H)，8.86(d，J＝6.6Hz，1H)，8.43-7.99(m，10H)，7.84(s，1H)，7.53-7.23(m，9H)，4.61-4.54(m，2H)，4.40-4.25(m，5H)，4.04-3.99(m，3H)，3.71(m，2H)，3.18-2.89(m，7H)，2.73-2.64(m，5H)，2.40-2.31(m，2H)，1.99-1.87(m，3H)，1.71-1.52(m，10H)，1.36-1.07(m，36H)，0.84(m，3H).
实验例16a-f静脉注射给药的体内溶血栓活性试验
将200-220g雄性SD大鼠用20％乌拉坦溶液(6ml/kg，i.p.)进行麻醉。麻醉大鼠仰卧位固定，分离右颈总动脉，于近心端夹动脉夹，近心端和远心端分别穿入手术线，将远心端的手术线于皮毛用止血钳夹紧，在远心端插管，松开动脉夹，放出约1ml动脉血并装在1ml的EP管中。往垂直固定的玻璃管(长15mm，内径2.5mm，外径5.0mm，管底用胶塞密封)中注入0.1ml大鼠动脉血液，往管内迅速插入一支不锈钢质料的血栓固定螺栓。该血栓固定螺旋用直径为0.2mm的不锈钢丝绕成，螺旋部分长12mm，含15个螺圈，螺圈的直径为1.0mm，托柄与螺旋相连，长7.0mm，呈问号型。血液凝固15分钟后，打开玻璃管底部的胶塞，用镊子固定血栓固定螺旋的托柄，从玻璃管中取出被血栓包裹的血栓固定螺旋，精确称重。
旁路插管由3段构成，中段为聚乙烯胶管，长60mm，内径3.5mm，两端为相同的聚乙烯管，长100mm，内径1mm，外径2mm，该管的一端拉成尖管(用于插入大鼠颈动脉或静脉)，外径1mm，另一端的外部套一段长7mm，外径3.5mm的聚乙烯管(加粗，用于插入中段的聚乙烯胶管内)。3段管的内壁均硅烷化。将血栓包裹的血栓固定螺旋放入中段聚乙烯胶管内，胶管的两端分别与两根聚乙烯的加粗端相套。用注射器通过尖管端将管中注满肝素生理盐水溶液(50IU/kg)备用。
分离大鼠的左颈外静脉，近心端和远心端分别穿入手术线，在暴露的左颈外静脉上小心地剪一斜口，将上面制备好的旁路管道的尖管由斜口插入左颈外静脉开口的近心端，同时远离旁路管中段(含精确称重的血栓固定螺旋)内血栓固定螺旋的托柄。用注射器通过另一端的尖管推入准确量的肝素生理盐水(50IU/kg)，此时注射器不撤离聚乙烯管，用止血钳夹住注射器与聚乙烯管之间的软管。在右颈总动脉的近心端用动脉夹止血，在离动脉夹不远处将右颈总动脉小心地剪一斜口。从聚乙烯管的尖部拔出注射器，将聚乙烯管的尖部插入动脉斜口的近心端。旁路管道的两端都用4号手术缝线与动静脉固定。
用头皮针将生理盐水(3ml/kg)，尿激酶的生理盐水溶液(20000IU/kg)或不同浓度化合物的生理盐水溶液通过旁路管的中段(含精确称重的血栓固定螺旋)，刺入远离血栓固定螺旋的近静脉处，打开动脉夹，使血流通过旁路管道从动脉流向静脉，此即大鼠动静脉旁路溶栓模型，缓慢将注射器中的液体注入到血液中(约6min)，使生理盐水(空白对照)，尿激酶(阳性对照)或本发明的化合物通过血液循环，按静脉-心脏-动脉的顺序作用到血栓上。从开始注射时计时，1小时后从旁路管道中取出血栓固定螺旋，精确称重。计算每只大鼠旁路管道中血栓固定螺旋给药前后的质量差，统计并评价化合物的体内溶栓活性。结果表明，6a-f有优秀的体内溶栓活性(表1)。
表1.1.0nmol/kg 6a-f经静脉注射给药的溶血栓活性a
Figure BSA00000376099800171
a)n＝12，尿激酶剂量为20000U/kg；b)与生理盐水组比，P＜0.01.
实验例26e静脉注射给药的溶血栓量效关系
用实验例1的方法，选取1nmol/kg、0.1nmol/kg、0.01nmol/kg和0.001nmol/kg四种剂量考察6e的剂量效应关系。结果表明，6e的体内溶栓作用显示剂量依赖性(表2)。
表2静脉注射6e的量效关系a
Figure BSA00000376099800172
a)n＝12；b)与生理盐水及0.1nmol/kg 6e组比较，P＜0.01；c)与生理盐水及0.01nmol/kg和0.001nmol/kg 6e组比较，P＜0.01；d)与生理盐水组比较，P＜0.01.
实验例36a-f静脉注射给药的抗血栓活性试验
插管由3段构成，中段长80mm，内径3.5mm，两端为相同的聚乙烯管，长100mm，内径1mm，外径2mm，该管的一端拉成尖管(用于插入大鼠颈动脉或静脉)，3段管的内壁均硅烷化。将提前称重的长60mm的丝线放入中段聚乙烯粗管内，粗管的两端分别与两根聚乙烯细管的未拉细端相套(其中一段将丝线压住0.5mm固定)。用注射器通过尖管端将管中注满肝素生理盐水溶液(50IU/kg)备用。
将200-220g雄性SD大鼠用20％乌拉坦溶液(6ml/kg，i.p.)进行麻醉。麻醉大鼠仰卧位固定，分离出大鼠的左颈外静脉，近心端和远心端分别穿入手术线，结扎远心端，在暴露的左颈外静脉上小心地剪一斜口，将上面制备好的旁路管道的未压线端尖管由斜口插入左颈外静脉开口的近心端，用注射器通过另一端的尖管推入准确量的肝素生理盐水(50IU/kg)，此时的注射器用装有生理盐水，阿司匹林的生理盐水溶液或不同浓度化合物的生理盐水溶液的注射器代替，缓慢推入准确量的液体，随后分离右颈总动脉，于近心端夹动脉夹，近心端和远心端分别穿入手术线，结扎远心端，在离动脉夹不远处将右颈总动脉小心地剪一斜口。从聚乙烯管的尖部拔出注射器，将聚乙烯管的尖部插入动脉斜口的近心端。旁路管道的两端都用4号手术缝线与动静脉固定。打开动脉夹，使血流通过旁路管道从动脉流向静脉，此即大鼠动静脉旁路抗栓模型。从开始循环时计时，15分钟后从旁路管道中取出挂有血栓的丝线，精确称重，丝线前后的质量差即为血栓湿重，统计并评价化合物的体内抗栓活性。结果表明，6a-f有优秀的抗血栓活性(表3)。
表3 1nmol/kg 6a-f经静脉注射给药的抗血栓活性a
Figure BSA00000376099800181
Figure BSA00000376099800191
a)n＝12；b)与生理盐水组比，P＜0.01.
实验例46e静脉注射给药的抗血栓量效关系
用实验例3的方法，选取1nmol/kg、0.1nmol/kg和0.01nmol/kg三种剂量考察6e的剂量效应关系。结果表明，6e的体内抗栓作用显示剂量依赖性(表4)。
表46e静脉注射给药的量效关系a
Figure BSA00000376099800192
a)n＝12；b)与生理盐水及0.1nmol/kg 6e组比，p＜0.01；c)与生理盐水及0.01nmol/kg 6e组比，p＜0.01；d)与生理盐水组比，p＜0.01.
实验例5 6a-f的体外溶血栓活性试验
雄性SD大鼠，250±10g，称重，腹腔注射20％乌拉坦麻醉，仰卧位固定。分离出大鼠的右颈总动脉，于近心端夹动脉夹，近心端和远心端分别穿入手术线，结扎远心端，在离动脉夹不远处将右颈总动脉小心地剪一斜口，插入己硅烷化的一端拉成尖管的聚乙烯管，松开动脉夹，每次放出约5ml动脉血并装在5ml的己硅烷化的EP管中，大约可放3次。用己硅烷化的5ml注射器往每个垂直固定的玻璃管(长18mm，内径4mm，外径5.5mm，管底用胶塞密封)中注入0.1ml大鼠动脉血液，往管内迅速插入一支不锈钢质料的血栓固定螺栓。该血栓固定螺旋用直径为0.2mm的不锈钢丝绕成，螺旋部分长20mm，螺圈的直径为1.0mm，托柄与螺旋相连，长7.0mm，呈问号型。血液凝固40分钟后，打开玻璃管底部的胶塞，用镊子固定血栓固定螺旋的托柄，从玻璃管中取出被血栓包裹的血栓固定螺旋，悬挂浸入盛有8ml高纯水的西林瓶中，浸泡1小时，除去浮血，取出蘸干，精确称重，记录。再将血栓固定螺旋悬挂浸入盛有8ml一定浓度的化合物溶液的西林瓶中，37℃摇床孵育2小时，取出蘸干，再精确称重，记录。血栓固定螺旋前后的质量差即为血栓减重，统计并评价化合物的体内溶栓活性。血栓减重用均值和标准差
Figure BSA00000376099800193
表示。结果表明，6a-f有优秀的体外溶栓活性(表5)。
表5.10nM 6a-f的体外溶血栓活性a
Figure BSA00000376099800201
a)n＝6；b)与生理盐水组比，P＜0.01
实验例66e的体外溶血栓量效关系
用实验例5的方法，选取10nM、1nM、0.1nM和0.01nM四个浓度考察6e的浓度效应关系。结果表明，6e的体外溶栓作用显示浓度依赖性(表6)。
表66e体外溶栓的浓度效应关系a
Figure BSA00000376099800202
a)n＝6；b)与生理盐水及1nM 6e组比，p＜0.01；c)与生理盐水及0.1nM6e组比，p＜0.01；
d)与生理盐水及0.01nM 6e组比，p＜0.01；e)与生理盐水组比，p＞0.05.
实验例76a-f的纳米球
1)水溶液中6a-f纳米球的粒径
先测得6a-f在水溶液中的临界胶束浓度为1×10-12mg/ml。然后在Nano-ZS90纳米粒度测定仪上测定6a-f在1×10-12mg/ml的粒径。结果表明，6a-f在水溶液中可组装为纳米球，粒径为182至343nm(表7)。
表76a-f在水溶液中形成的纳米球的粒径
Figure BSA00000376099800211
2)6a-f的纳米球的形态
将6a-f配成浓度为1×10-12mg/ml的水溶液，然后将此溶液滴在铜网上，挥发干溶剂后在JEM-1230透射电子显微镜下观察纳米球的形态。测定表明，6a-f形成规则的纳米球。6e的透射电子显微镜照片作为代表，用图2描述。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一类具有靶向性溶血栓活性的寡肽，如通式6a-f所示：
Figure FDA00003480079600011
其中n=6、8、10、12、14或16。
2.一种制备权利要求1所述的具有靶向性溶血栓活性的寡肽的方法，包括如下步骤：
1)按照现有液相合成技术，逐步接肽合成Boc-Pro-Ala-Lys(Z)；
2)Boc-Asp(OBzl)与饱和脂肪醇缩合后再脱去侧链保护基得到Boc-Asp-OCH2(CH2)nCH3，其中n=6、8、10、12、14或16；
3)按照现有液相合成技术，逐步接肽合成Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)–Phe-OBzl；
4)将Boc-Asp-OCH2(CH2)nCH3与Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl缩合反应后脱去N端保护基得到Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)–Phe-OBzl]-OCH2(CH2)nCH3；
5)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)与Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)nCH3缩合反应后，依次脱去C端保护基、侧链保护基和N端保护基得到目标化合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其中缩合反应是在二环己基碳二亚胺存在下于无水THF中进行；脱去N端保护基Boc是在含氯化氢的乙酸乙酯中进行；脱去C端保护基OBzl是在甲醇中进行皂化；脱去侧链保护基Z、OBzl、NO2是在甲醇中发生氢解。
4.根据权利要求2所述的制备方法，包括如下步骤：
1)在DCC存在下Boc-Pro在无水THF中HONp脱水形成Boc-Pro-ONp;
2)在含水的二氧六环中Boc-Pro-ONp与L-Ala缩合为Boc-Pro-Ala;
3)在DCC和HOBt存在下Boc-Pro-Ala在无水THF中与Lys(Z)-OBzl缩合为Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl;
4)在甲醇中将Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl皂化为Boc-Pro-Ala-Lys(Z);
5)在DCC存在下Boc-Asp(OBzl)在无水THF中与饱和脂肪醇缩合为Boc-Asp(OBzl)-OCH2(CH2)nCH3;
6)在甲醇中Boc-Asp(OBzl)-OCH2(CH2)nCH3氢解为Boc-Asp-OCH2(CH2)nCH3;
7)在DCC和HOBt存在下Boc-Arg(NO2)在无水THF中与Gly-OBzl缩合为Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl;
8)在甲醇中将Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl皂化为Boc-Arg(NO2)-Gly;
9)在DCC和HOBt存在下Boc-Asp(OBzl)在无水THF中与Phe-OBzl缩合为Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl;
10)在含氯化氢的乙酸乙酯中Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl脱除Boc生成Asp(OBzl)-Phe-OBzl;
11)在DCC和HOBt存在下Boc-Arg(NO2)-Gly在无水THF中与Asp(OBzl)-Phe-OBzl缩合为Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl;
12)在含氯化氢的乙酸乙酯中Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl脱除Boc生成Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl;
13)在DCC和HOBt存在下Boc-Asp-OCH2(CH2)nCH3在无水THF中与Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl缩合为Boc-Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)nCH3;
14)在含氯化氢的乙酸乙酯中Boc-Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)nCH3脱除Boc生成Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)nCH3;
15)在DCC和HOBt存在下Boc-Pro-Ala-Lys(Z)在无水THF中与Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)nCH3缩合为Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)nCH3;
16)在甲醇中Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Asp[Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl]-OCH2(CH2)nCH3氢解为Boc-Pro-Ala-Lys-Asp(Arg-Gly-Asp-Phe)-OCH2(CH2)n-CH3;
17)在含氯化氢的乙酸乙酯中Boc-Pro-Ala-Lys-Asp(Arg-Gly-Asp-Phe)-OCH2(CH2)nCH3脱Boc生成Pro-Ala-Lys-Asp(Arg-Gly-Asp-Phe)-OCH2(CH2)n-CH3。
5.权利要求1所述的具有靶向性溶血栓活性的寡肽在制备抗血栓药物中的应用。
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