CN101318992A - 全碱性氨基酸寡肽及其铜络合物、其合成方法、自组装及应用 - Google Patents
全碱性氨基酸寡肽及其铜络合物、其合成方法、自组装及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了通式为H－(AA)m－OH(其中AA选自L－Arg或L－Lys残基中的一种；m为2－5的任意整数)的全碱性氨基酸寡肽以及通式为Cu(II)[H－(AA)m－OH]n(其中AA选自L－Arg或L－Lys残基中的一种；m为2－5的任意整数，n为1或2)的全碱性氨基酸寡肽铜络合物。本发明还公开了上述通式化合物的制备方法、它们作为抗血栓剂的应用。
Description
技术领域
本发明涉及寡肽及其铜络合物，尤其涉及全碱性氨基酸寡肽及其铜络合物、其合成方法、自组装为纳米颗粒，本发明还涉及所述的全碱性氨基酸寡肽及其铜络合物作为抗血栓药物的应用，属于生物医药领域。
背景技术
血管栓塞性疾病对心脑血管疾病的高死亡率负最重要的责任。血栓形成是血管栓塞性疾病发病的最重要的病因。目前临床使用的治疗急性血栓栓塞性疾病的链激酶、尿激酶和重组组织型纤溶酶原激活剂等药物普遍存在全身出血倾向和免疫原性反应，寻找安全有效的溶血栓药物是新药研究的热点之一。
在天然氨基酸中，L-Arg和L-Lys是碱性氨基酸。已知这两种碱性氨基酸有一些重要的生物活性。例如，在NO合成酶的作用下，L-Arg的胍基被氧化释放NO。NO具有舒血管活性和抗血小板聚集活性，赖氨酸抑制细胞黏附。
发明内容
本发明目的之一提供一类全碱性氨基酸寡肽及其铜络合物。
本发明目的之二是提供一种制备上述全碱性氨基酸寡肽及其铜络合物的方法。
本发明目的之一是通过以下技术方案来实现的：
全碱性氨基酸寡肽(通式I化合物)：
H-(AA)m-OH(通式I)，其中AA选自L-Arg或L-Lys残基中的一种；m为2-5的任意整数。
全碱性氨基酸寡肽与铜的络合物(通式II化合物)：
Cu(II)[H-(AA)m-OH]n(通式II)，其中AA选自L-Arg或L-Lys残基中的一种；m为2-5的任意整数，n为1或2。
本发明人认识到，重复结构单元获得的结构会导致活性增强，例如寡肽重复序列的生物活性往往强于母体肽，寡肽与过渡金属(如Cu)的络合物的生物活性往往强于肽配体。基于上述的认识，本发明人将L-Arg或L-Lys自身偶联成为全L-Arg或全L-Lys寡肽(本发明统称全碱性氨基酸寡肽)，所获得的全碱性氨基酸寡肽更具有较好的舒血管活性和抗血栓功效。本发明将全L-Arg或全L-Lys寡肽与Cu(II)络合，所获得的全精氨酸寡肽铜络合物或全赖氨酸寡肽铜络合物更具有较好的舒血管活性和抗血栓功效。
本发明目的之二是通过以下技术方案来实现的：
将L-Arg或L-Lys按照常规方法自身偶联成2-5个重复单元的全L-Arg或全L-Lys寡肽；在按照常规方法与铜(II)络合，得到全精氨酸寡肽铜络合物或全赖氨酸寡肽铜络合物。
本发明在大鼠颈动静脉旁路插管模型上评价了通式I化合物和通式II化合物的抗血栓活性，使用扫描电镜考察了它们自组装为纳米颗粒的现象。试验结果表明，本发明通式I化合物或通式II化合物均具有优秀的抗血栓活性。
附图说明
图1全精氨酸寡肽及铜(II)配合物的合成路线；i)二环己基羰二亚胺(DCC)、羟基苯并三氮唑(HOBt)、N-甲基吗啉(NMM)；ii)氯化氢/乙酸乙酯溶液(4N)；iii)三氟乙酸/三氟甲磺酸(4/1)；iv)pH 8-9。
图2全赖氨酸寡肽及铜(II)配合物的合成路线；i)DCC、HOBt、NMM；ii)氯化氢/乙酸乙酯溶液(4N)；iii)H2、Pd/C；iv)pH 8-9。
图3H-Lys-Lys-OH(5)的扫描电镜图。
图4Cu(II)[H-Lys-Lys-OH](5-Cu)的扫描电镜图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。应当指出，这些实施例仅仅是本发明的例证，不应理解为对本发明的限制。
实施例1制备H-Arg-Arg-OH(该化合物的编号为1)
1)制备Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl
将654mg(1.53mmol)Boc-Arg(Tos)-OH溶于6ml无水THF，冰浴下往得到的溶液中加入206mg(1.5mmol)N-羟基苯并三氮唑(HOBt)，并使完全溶解。10分钟后滴加入371mg(1.8mmol)二环己基羰二亚胺(DCC)无水THF溶液。得到反应液(I)，待用。冰浴下将884mg(1.5mmol)Tos·H-Arg(Tos)-OBzl溶于9ml无水THF中，然后用N-甲基吗啉(NMM)，调pH 7-8。搅拌35分钟，得到反应液(II)，待用。
冰浴下把反应液(I)加入反应液(II)中，先冰浴下搅拌1h，再室温搅拌36h，TLC(氯仿/甲醇，5∶1)显示Tos·H-Arg(Tos)-OBzl消失。减压滤除二环己基脲(DCU)，滤液减压浓缩至干。残留物用15ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用饱和NaHCO3水溶液洗、饱和NaCl水溶液洗、5％KHSO4水溶液洗和饱和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，得到620mg(50％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/z)829[M+H]+.
2)制备H-Arg-Arg-OH
将104mg(0.125mmol)Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl置于100ml茄形瓶中，冰浴下滴加入4ml CF3CO2H后再滴加入1mlCF3SO3H，进行二次脱除保护基，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示原料点消失，加入100ml乙醚搅拌，弃去乙醚层，残渣用石油醚捣磨得30mg(72％)标题化合物，为黄色粉末。ESI-MS(m/z)331[M+H]+.[α]D20＝1.6(c＝1.0，H2O)
实施例2制备Cu(II)[H-Arg-Arg-OH](该化合物的编号为1-Cu)
将20mg(0.06mmol)H-Arg-Arg-OH溶于1ml蒸馏水中，加入10mg(0.06mmol)CuCl2.H2O，用NaOH(2N)水溶液调PH＝9，溶液变蓝，生成少许气泡，减压抽气，室温搅拌8小时，TLC(纯水)显示H-Arg-Arg-OH消失。减压滤除Cu(OH)2，滤液为蓝色，减压浓缩减少水分，用SephdexG10除盐，洗脱剂为蒸馏水。收集蓝色组分冻干，得18mg蓝色粉末。ESI-MS(m/z)423[M+63Cu]+.[α]D20＝-14.7(c＝1.0，H2O).
实施例3制备Cu(II)[H-Arg-Arg-OH]2(该化合物的编号为1’-Cu)
将20mg(0.06mmol)H-Arg-Arg-OH溶于1ml蒸馏水中，加入10mg(0.06mmol)CuCl2·H2O，用NaOH(2N)水溶液调PH＝9，溶液变蓝，生成少许气泡，减压抽气，室温搅拌8小时，TLC(纯水)显示H-Arg-Arg-OH消失。减压滤除Cu(OH)2，滤液为蓝色，减压浓缩减少水分，用SephdexG10除盐，洗脱剂为蒸馏水。收集蓝色组分，冻干得5mg蓝色粉末。ESI-MS(m/z)362[M+1/263Cu]+.[α]D20＝-111.8(c＝1.0，H2O).
实施例4制备H-Arg-Arg-Arg-OH(该化合物的编号为2)
1)制备HCl·H-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl
将424mg(0.5mmol)Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBz l置于50ml茄形瓶中，冰浴下滴加入2ml 4mol/l氯化氢-乙酸乙酯溶液，冰浴搅拌2小时，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示原料点消失，减压浓缩除去乙酸乙酯，残留物反复加少量乙醚进行减压浓缩以除去氯化氢气。最后加少量乙醚将残留物研磨成209mg(100％)标题化合物，为白色粉末，直接用于下一步反应。
2)制备Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl
将655mg(1.53mmol)Boc-Arg(Tos)-OH溶于6ml无水THF，冰浴下往得到的溶液中加入206mg(1.5mmol)HOBt，并使完全溶解。10分钟后滴加入371mg(1.8mmol)DCC的无水THF溶液。得到反应液(I)，待用。冰浴下将1.147g(1.5mmol)HCl·H-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl溶于12ml无水THF中，然后用N-甲基吗啉(NMM)，调pH 7-8。搅拌35分钟，得到反应液(II)，待用。
冰浴下把反应液(I)加入反应液(II)中，先冰浴下搅拌1h，再室温搅拌36h，TLC(氯仿/甲醇，5∶1)显示HCl·H-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl消失。减压滤除DCU，滤液减压浓缩至干。残留物用15ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用饱和NaHCO3水溶液洗、饱和NaCl水溶液洗、5％KHSO4水溶液洗和饱和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，得到1.069g(62％)标题化合物，为黄色粉末。ESI-MS(m/z)1161[M+Na]+.
3)制备H-Arg-Arg-Arg-OH
将114mg(0.1mmol)Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl置于100ml茄形瓶中，冰浴下滴加入4ml CF3CO2H后再滴加入1ml CF3SO3H，进行二次脱除保护基，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示原料点消失，加入100ml乙醚搅拌，弃去乙醚层，残渣用石油醚捣磨得39mg(79％)标题化合物，为黄色粉末。
ESI-MS(m/z)244[1/2(M+2H)]+.[α]D20＝1.7(c＝1.0，H2O).
实施例5制备Cu(II)[H-Arg-Arg-Arg-OH](该化合物编号为2-Cu)
将20mg(0.04mmol)H-Arg-Arg-Arg-OH溶于1ml蒸馏水中，加入7mg(0.04mmol)CuCl2·H2O，用NaOH(2N)水溶液调PH＝9，溶液变蓝，生成少许气泡，减压抽气，室温搅拌8小时，TLC(纯水)显示H-Arg-Arg-Arg-OH消失。减压滤除Cu(OH)2，滤液为蓝色，减压浓缩减少水分，用SephdexG10除盐，洗脱剂为蒸馏水。收集蓝色组分，冻干得20mg(93％)蓝色粉末。ESI-MS(m/z)543[M+63Cu]+.[α]D20＝7.6(c＝1.0，H2O).
实施例6制备H-Arg-Arg-Arg-Arg-OH(该化合物的编号为3)
1)制备HCl·H-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl
将569mg(0.5mmol)Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl冰浴下滴加入6ml 4mol/l氯化氢-乙酸乙酯溶液，冰浴搅拌2小时，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示原料点消失，减压浓缩除去乙酸乙酯，残留物反复加少量乙醚进行减压浓缩以除去氯化氢气。最后加少量乙醚将残留物研磨成537mg(100％)标题化合物，为白色固体粉末，直接用于下一步反应。ESI-MS(m/z)1039[M+H]+.
2)制备Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl
将209mg(0.51mmol)Boc-Arg(Tos)-OH溶于10ml无水DMF，冰浴下往得到的溶液中加入69mg(0.5mmol)HOBt，并使完全溶解。10分钟后滴加入124mg(0.6mmol)DCC无水DMF溶液。得到反应液(I)，待用。冰浴下将537g(0.5mmol)HCl·H-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl溶于10ml无水DMF中，然后用N-甲基吗啉(NMM)，调pH 7-8。搅拌35分钟，得到反应液(II)，待用。
冰浴下把反应液(I)加入反应液(II)中，先冰浴下搅拌1h，再室温搅拌36h，TLC(氯仿/甲醇，5∶1)显示HCl·H-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl消失。减压滤除DCU，滤液吹干。残留物用30ml氯仿溶解。得到的溶液依次用饱和NaHCO3水溶液洗、饱和NaCl水溶液洗、5％KHSO4水溶液洗和饱和NaCl水溶液洗。氯仿层用无水Na2SO4干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，得到311mg(43％)标题化合物，为黄色粉末。ESI-MS(m/z)1470[M+Na]+.
3)制备H-Arg-Arg-Arg-Arg-OH
将207mg(0.14mmol)Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl置于250ml茄形瓶中，冰浴下滴加入8ml CF3CO2H后再滴加入2mlCF3SO3H，进行二次脱除保护基，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示原料点消失，加入250ml乙醚搅拌，弃去乙醚层，残渣用石油醚捣磨得72mg(80％)标题化合物，为黄色固体粉末。ESI-MS(m/z)643[M]+.[α]D20＝-2.4(c＝1.0，H2O).
实施例7制备Cu(II)[H-Arg-Arg-Arg-Arg-OH](该化合物的编号为3-Cu)
将20mg(0.03mmol)H-Arg-Arg-Arg-Arg-OH溶于1ml蒸馏水中，加入5mg(0.03mmol)CuCl2·H2O，用NaOH(2N)水溶液调PH＝9，溶液变蓝紫，生成少许气泡，减压抽气，室温搅拌8小时，TLC(纯水)显示H-Arg-Arg-Arg-Arg-OH消失。减压滤除Cu(OH)2，滤液为蓝色，减压浓缩减少水分，用SephdexG10除盐，洗脱剂为蒸馏水。收集蓝色组分，冻干得16mg蓝色粉末。ESI-MS(m/z)717[M+63Cu-4H]+.[α]D20＝190.2(c＝1.0，H2O).
实施例8制备Cu(II)[H-Arg-Arg-Arg-Arg-OH]2(该化合物的编号为3’Cu)
将20mg(0.03mmol)H-Arg-Arg-Arg-Arg-OH溶于1ml蒸馏水中，加入5mg(0.03mmol)CuCl2·H2O，用NaOH(2N)水溶液调PH＝9，溶液变蓝紫，生成少许气泡，减压抽气，室温搅拌8小时，TLC(纯水)显示H-Arg-Arg-Arg-Arg-OH消失。减压滤除Cu(OH)2，滤液为蓝色，减压浓缩减少水分，用SephdexG10除盐，洗脱剂为蒸馏水。收集紫色组分，冻干得4mg紫色粉末。ESI-MS(m/z)730[M+3/263Cu-6H]+.[α]D20＝2.8(c＝1.0，H2O).
实施例9制备H-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-OH(该化合物的编号为4)
1)制备HCl·H-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl
将145mg(0.1mmol)Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl冰浴下滴加入2ml 4mol/l氯化氢-乙酸乙酯溶液，冰浴搅拌2小时，TLC(氯仿/甲醇，30∶1)显示原料点消失，减压浓缩除去乙酸乙酯，残留物反复加少量乙醚进行减压浓缩以除去氯化氢气。最后加少量乙醚将残留物研磨成138mg(100％)标题化合物，为白色粉末，直接用于下一步反应。ESI-MS(m/z)1349[M+H]+.
2)制备Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl
将218mg(0.51mmol)Boc-Arg(Tos)-OH溶于6ml无水DMF，冰浴下往得到的溶液中加入69mg(0.5mmol)HOBt，并使完全溶解。10分钟后滴加入124mg(0.6mmol)DCC的无水DMF溶液。得到反应液(I)，待用。冰浴下将692mg(0.5mmol)HCl·H-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl溶于7ml无水DMF中，然后用NMM调pH 7-8。搅拌35分钟，得到反应液(II)，待用。
冰浴下把反应液(I)加入反应液(II)中，先冰浴下搅拌1h，再室温搅拌36h，TLC(氯仿/甲醇，5∶1)显示HCl·H-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl消失。减压滤除DCU，滤液吹干。残留物用35ml氯仿溶解。得到的溶液依次用饱和NaHCO3水溶液洗、饱和NaCl水溶液洗、5％KHSO4水溶液洗和饱和NaCl水溶液洗。氯仿层用无水Na2SO4干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，得到615mg(70％)标题化合物，为黄色粉末。ESI-MS(m/z)1781[M+Na]+.
3)制备H-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-OH
将176mg(0.1mmol)Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl置于250ml茄形瓶中，冰浴下滴加8ml CF3CO2H后再滴加2ml CF3SO3H，进行二次脱除保护基，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示原料点消失，加入250ml乙醚搅拌，弃去乙醚层，残渣用石油醚捣磨得63mg(80％)标题化合物，为黄色粉末。ESI-MS(m/z)400[1/2(M+2H)]+.[α]D20＝-30.5(c＝1.0，H2O).
实施例10制备Cu(II)[H-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-OH](该化合物的编号为4-Cu)
将20mg(0.03mmol)H-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-OH溶于1ml蒸馏水中，加入5mg(0.05mmol)CuCl2·H2O，用NaOH(2N)水溶液调PH＝9，溶液变蓝紫，生成少许气泡，减压抽气，室温搅拌8小时，TLC(纯水)显示H-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-OH消失。减压滤除Cu(OH)2，滤液为蓝色，减压浓缩减少水分，用SephdexG10除盐，洗脱剂为蒸馏水。收集紫色组分，冻干得4mg紫色粉末。ESI-MS(m/z)856[M+63Cu-4H]+.[α]D20＝-142.5(c＝1.0，H2O).
实施例11制备Cu(II)[H-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-OH]2(该化合物的编号为4’Cu)
将20mg(0.03mmol)H-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-OH溶于1ml蒸馏水中，加入5mg(0.05mmol)CuCl 2·H2O，用NaOH(2N)水溶液调PH＝9，溶液变蓝紫，生成少许气泡，减压抽气，室温搅拌8小时，TLC(纯水)显示H-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-OH消失。减压滤除Cu(OH)2，滤液为蓝色，减压浓缩减少水分，用SephdexG10除盐，洗脱剂为蒸馏水。收集蓝色组分，冻干得16mg蓝色粉末。ESI-MS(m/z)901[M+7/463Cu-7H]+.[α]D20＝-17.8(c＝1.0，H2O).
实施例12制备Cu(II)[H-Arg-OH](该化合物的编号为R-Cu)
将20mg(0.11mmol)H-Arg-OH溶于1ml蒸馏水中，加入20mg(0.11mmol)CuCl2·H2O，用NaOH(2N)水溶液调PH＝9，溶液变蓝，生成少许气泡，减压抽气，室温搅拌8小时，TLC(纯水)显示Arg消失。减压滤除Cu(OH)2，滤液为蓝色，减压浓缩减少水分，用SephdexG10除盐，洗脱剂为蒸馏水。收集蓝色样品组分，冻干分别得23mg蓝色粉末(95％)。ESI-MS(m/z)221[M+3/463Cu]+.[α]D20＝-48.2(c＝1.0，H2O)
实施例13制备H-Lys-Lys-OH(该化合物的编号为5)
1)制备Boc-Lys(2-Cl-Z)-Lys(Z)-OBzl
将635mg(1.53mmol)Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH溶于6ml无水THF，冰浴下往得到的溶液中加入206mg(1.5mmol)HOBt，并使完全溶解。10分钟后滴加入371mg(1.8mmol)DCC无水THF溶液。得到反应液(I)，待用。冰浴下将811mg(1.5mmol)Tos·H-Lys(Z)-OBzl溶于8ml无水THF中，然后用NMM调pH 7-8。搅拌35分钟，得到反应液(II)，待用。
冰浴下把反应液(I)加入反应液(II)中，先冰浴下搅拌1h，再室温搅拌36h，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示Tos·Lys(Z)-OBzl消失。减压滤除DCU，滤液减压浓缩至干。残留物用15ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用饱和NaHCO3水溶液洗、饱和NaCl水溶液洗、5％KHSO4水溶液洗和饱和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，得到1.15g(100％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/z)789[M+Na]+.
2)制备HCl·Lys(2-Cl-Z)-Lys(Z)-OBzl
将766mg(1.0mmol)Boc-Lys(2-Cl-Z)-Lys(Z)-OBzl冰浴下滴加入7ml 4mol/l氯化氢-乙酸乙酯溶液，冰浴搅拌2小时，TLC(氯仿/甲醇，20∶1)显示原料点消失，减压浓缩除去乙酸乙酯，残留物反复加少量乙醚进行减压浓缩以除去氯化氢气。最后加少量乙醚将残留物研磨成703mg(100％)标题化合物，为白色固体粉末，直接用于下一步反应。ES I-MS(m/z)668[M+H]+.
3)制备H-Lys-Lys-OH
将703mg(1.0mmol)HCl·Lys(2-Cl-Z)-Lys(Z)-OBzl置于50ml茄形瓶中，用乙醇/水(1∶1)溶解，加70mgPd/C(10％)、通H2(0.02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C，滤液减压浓缩至干，残留物反复用石油醚研磨，得274mg(100％)标题化合物，为白色固体粉末。ESI-MS(m/z)275[M+H]+.[α]D20＝47.5(c＝1.0，H2O)
实施例14制备Cu(II)[H-Lys-Lys-OH](该化合物的编号为5-Cu)
将50mg(0.18mmol)H-Lys-Lys-OH溶于2ml蒸馏水中，加入31mg(0.18mmol)CuCl2·H2O，用NaOH(2N)水溶液调PH＝9，溶液变蓝，生成少许气泡，减压抽气，室温搅拌8小时，TLC(纯水)显示Lys-Lys消失。减压滤除Cu(OH)2，滤液为深蓝色，减压浓缩减少水分，用SephdexG10除盐，洗脱剂为蒸馏水。收集馏份冻干得62mg(100％)蓝色粉末。ESI-MS(m/z)318[M+3/463Cu-3H]+.[α]D20＝142.6(c＝1.0，H2O)
实施例15制备H-Lys-Lys-Lys-OH(该化合物的编号为6)
1)制备Boc-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(Z)-OBzl
将635mg(1.53mmol)Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH溶于6ml无水THF，冰浴下往得到的溶液中加入206mg(1.5mmol)HOBt，并使完全溶解。10分钟后滴加入371mg(1.8mmol)DCC的无水THF溶液。得到反应液(I)，待用。冰浴下将1001mg(1.5mmol)HCl·Lys(2-Cl-Z)-Lys(Z)-OBzl溶于10ml无水THF中，然后用NMM调pH 7-8。搅拌35分钟，得到反应液(II)，待用。
冰浴下把反应液(I)加入反应液(II)中，先冰浴下搅拌1h，再室温搅拌36h，TLC(氯仿/甲醇，20∶1)显示HCl·Lys(2-Cl-Z)-Lys(Z)-OBzl消失。减压滤除DCU，滤液减压浓缩至干。残留物用25ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用饱和NaHCO3水溶液洗、饱和NaCl水溶液洗、5％KHSO4水溶液洗和饱和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，得到1.571g(100％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/z)1085[M+Na]+.
2)制备HCl·H-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(Z)-OBz l
将1.062g(1.0mmol)Boc-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(Z)-OBzl冰浴下滴加入10ml 4mol/l氯化氢-乙酸乙酯溶液，冰浴搅拌2小时，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示原料点消失，减压浓缩除去乙酸乙酯，残留物反复加少量乙醚进行减压浓缩以除去氯化氢气。最后加少量乙醚将残留物研磨成969mg(97％)标题化合物，为白色固体粉末，直接用于下一步反应。ESI-MS(m/z)963[M+H]+.
4)制备H-Lys-Lys-Lys-OH
将945mg(1.0mmol)HCl·H-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(Z)-OBzl置于50ml茄形瓶中，用乙醇/水(1∶1)溶解，加95mgPd/C(10％)、通H2(0.02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C，滤液减压浓缩至干，残留物反复用石油醚研磨，得381mg(95％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/z)403[M+H]+。[α]D 20＝-1.9(c＝1.0，H2O)
实施例16制备Cu(II)[H-Lys-Lys-Lys-OH](该化合物的编号为6-Cu)
将50mg(0.12mmol)H-Lys-Lys-Lys-OH溶于2ml蒸馏水中，加入21mg(0.12mmol)CuCl2·H2O，用NaOH(2N)水溶液调PH＝9，溶液变紫，生成少许气泡，减压抽气，室温搅拌8小时，TLC(纯水)显示Lys-Lys-Lys消失。减压滤除Cu(OH)2，滤液为紫红色，减压浓缩减少水分，用SephdexG10除盐，洗脱剂为蒸馏水。收集馏份冻干，得57mg(98％)紫色粉末。ESI-MS(m/z)446[M+63Cu]+.[α]D 20＝-123.0(c＝1.0，H2O)
实施例17制备H-Lys-Lys-Lys-Lys-OH(该化合物的编号为7)
1)制备Boc-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(Z)-OBzl
将635mg(1.53mmol)Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH溶于6ml无水THF，冰浴下往得到的溶液中加入206mg(1.5mmol)HOBt，并使完全溶解。10分钟后滴加入371mg(1.8mmol)DCC的无水THF溶液。得到反应液(I)，待用。冰浴下将1.499g(1.5mmol)HCl·H-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(Z)-OBzl溶于15ml无水THF中，然后用NMM调pH 7-8。搅拌35分钟，得到反应液(II)，待用。
冰浴下把反应液(I)加入反应液(II)中，先冰浴下搅拌1h，再室温搅拌36h，TLC(氯仿/甲醇，20∶1)显示HCl·H-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(Z)-OBzl消失。减压滤除DCU，滤液减压浓缩至干。残留物用30ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用饱和NaHCO3水溶液洗、饱和NaCl水溶液洗、5％KHSO4水溶液洗和饱和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，得到2.041g(99％)标题化合物，为白色粉末。ESI-MS(m/z)1383[M+Na]+.
2)制备HCl·H-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(Z)-OBzl
将1.360g(1.0mmol)Boc-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(Z)-OBzl冰浴下滴加入14ml 4mol/l氯化氢-乙酸乙酯溶液，冰浴搅拌2小时，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示原料点消失，减压浓缩除去乙酸乙酯，残留物反复加少量乙醚进行减压浓缩以除去氯化氢气。最后加少量乙醚将残留物研磨成1.257g(97％)标题化合物，为无色固体粉末，直接用于下一步反应。ESI-MS(m/z)1261[M+H]+.
3)制备H-Lys-Lys-Lys-Lys-OH
将1.297g(1.0mmol)HCl·H-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(Z)-OBzl置于50ml茄形瓶中，用乙醇/水(1∶1)溶解，加130mg Pd/C(10％)、通H2(0.02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C，滤液减压浓缩至干，残留物反复用石油醚研磨，得532mg(100％)标题化合物，为无色固体粉末。ESI-MS(m/z)531[M+H]+。[α]D 20＝-73.7(c＝1.0，H2O)
实施例18制备Cu(II)[H-Lys-Lys-Lys-Lys-OH](该化合物的编号为7-Cu)
将50mg(0.09mmol)H-Lys-Lys-Lys-Lys-OH溶于2ml蒸馏水中，加入16mg(0.09mmol)CuCl2·H2O，用NaOH(2N)水溶液调PH＝7，溶液变蓝，生成少许气泡，减压抽气，室温搅拌8小时，TLC(纯水)显示H-Lys-Lys-Lys-Lys-OH消失。减压滤除Cu(OH)2，滤液为蓝色，减压浓缩减少水分，用SephdexG10除盐，洗脱剂为蒸馏水。收集馏份冻干，得55mg(100％)蓝色粉末。ESI-MS(m/z)593[M+3/263Cu-6H]+.[α]D 20＝13.8(c＝1.0，H2O)
实施例19制备Cu(II)[H-Lys-Lys-Lys-Lys-OH]2(该化合物的编号为7’-Cu)
将50mg(0.09mmol)H-Lys-Lys-Lys-Lys-OH溶于2ml蒸馏水中，加入16mg(0.09mmol)CuCl2·H2O，用NaOH(2N)水溶液调PH＝9，溶液变紫，生成少许气泡，减压抽气，室温搅拌8小时，TLC(纯水)显示H-Lys-Lys-Lys-Lys-OH消失。减压滤除Cu(OH)2，滤液为紫色，减压浓缩减少水分，用SephdexG10除盐，洗脱剂为蒸馏水。收集馏份冻干，得55mg(100％)紫色粉末。ESI-MS(m/z)575[M+63Cu]+.[α]D 20＝7.3(c＝1.0，H2O)
实施例20制备H-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-OH(该化合物的编号为8)
1)制备Boc-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(Z)-OBzl
将635g(1.53mmol)Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH溶于6ml无水THF，冰浴下往得到的溶液中加入206mg(1.5mmol)HOBt，并使完全溶解。10分钟后滴加入371mg(1.8mmol)DCC的无水THF溶液。得到反应液(I)，待用。冰浴下将1.944g(1.5mmo])HCl·H-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(Z)-OBzl溶于20ml无水THF中，然后用NMM调pH 7-8。搅拌35分钟，得到反应液(II)，待用。
冰浴下把反应液(I)加入反应液(II)中，先冰浴下搅拌1h，再室温搅拌36h，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示HCl·H-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(Z)-OBzl消失。减压滤除DCU，滤液减压浓缩至干。残留物用35ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用饱和NaHCO3水溶液洗、饱和NaCl水溶液洗、5％KHSO4水溶液洗和饱和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，得到2.387g(96％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/z)1680[M+Na]+。
2)制备HCl·H-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(Z)-OBzl
将1.657g(1.0mmol)Boc-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(Z)-OBzl冰浴下滴加入17ml 4mol/l氯化氢-乙酸乙酯溶液，冰浴搅拌2小时，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示原料点消失，减压浓缩除去乙酸乙酯，残留物反复加少量乙醚进行减压浓缩以除去氯化氢气。最后加少量乙醚将残留物研磨成1.514g(95％)标题化合物，为无色粉末，直接用于下一步反应。ESI-MS(m/z)1558[M+H]+.
3)制备H-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-OH
将1.557g(1.0mmol)HCl·H-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(Z)-OBzl置于50ml茄形瓶中，用乙醇/水(1∶1)溶解，加156mgPd/C(10％)、通H2(0.02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C，滤液减压浓缩至于，残留物反复用石油醚研磨，得473mg(72％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/z)659[M+H]+.[α]D 20＝-20.2(c＝1.0，H2O).
实施例21制备Cu(II)[H-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-OH](该化合物的编号为8-Cu)
将20mg(0.03mmol)H-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-OH溶于1ml蒸馏水中，加入5mg(0.03mmol)CuCl2·H2O，用NaOH(2N)水溶液调PH 9，溶液变紫，生成少许气泡，减压抽气，室温搅拌8小时，TLC(纯水)显示H-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-OH消失。减压滤除Cu(OH)2，滤液为紫色，减压浓缩减少水分，用SephdexG10除盐，洗脱剂为蒸馏水。收集馏份冻干，得21mg(99％)紫色粉末。ESI-MS(m/z)760[M+7/463Cu-7H]+。[α]D 20＝-38.8(c＝1.0，H2O)
实施例22制备Cu(II)[H-Lys-OH](该化合物的编号为K-Cu)
将20mg(0.14mmol)H-Lys-OH溶于1ml蒸馏水中，加入23mg(0.14mmol)CuCl2·H2O，用NaOH(2N)水溶液调PH＝9，溶液变蓝绿，生成少许气泡，减压抽气，室温搅拌8小时，TLC(纯水)显示Lys消失。减压滤除Cu(OH)2，滤液为蓝色，减压浓缩减少水分，用SephdexG10除盐，洗脱剂为蒸馏水。收集组分冻干得14mg绿色粉末。ESI-MS(m/z)197[M+3/463Cu-3H]+，[α]D 20＝-12.7(c＝1.0，H2O).
实施例23制备Cu(II)[H-Lys-OH]2(该化合物的编号为K2Cu)
将20mg(0.14mmol)Lys溶于1ml蒸馏水中，加入23mg(0.14mmol)CuCl2·H2O，用NaOH(2N)水溶液调PH＝9，溶液变蓝绿，生成少许气泡，减压抽气，室温搅拌8小时，TLC(纯水)显示Lys消失。减压滤除Cu(OH)2，滤液为蓝色，减压浓缩减少水分，用SephdexG10除盐，洗脱剂为蒸馏水。收集得两种组分冻干得10mg蓝色固体粉末。ESI-MS(m/z)351[2M+63Cu-4H]+.[α]D 20＝-1.7(c＝1.0，H2O).
试验例1本发明化合物抗血栓活性测定试验
1)实验动物
SD雄性大鼠，体重200-220g(购自北京大学医学部实验动物部，许可证号为医动字第01-3056)。
2)实验材料
聚乙烯管(外径1.6mm及1.3mm两种)、肝素(50IU/ml)、氨基甲酸乙酯(乌拉坦)。
3)测定方法与结果
雄性SD大鼠(体重200g至220g)腹腔注射戊巴比妥钠溶液进行麻醉，分离出右颈总动脉和左颈外静脉，在聚乙烯管的中段放入事先称重的6cm长的丝线，以肝素生理盐水(50IU/kg)充满聚乙烯管，将一端插入左颈外静脉，用注射器将生理盐水(3ml/kg)，阿司匹林的生理盐水溶液(20mg/kg)，本发明实施例所制备的化合物(注：编号与实施例的编号相对应)的生理盐水溶液(10nmol/kg)的生理盐水溶液从另一端缓慢注入聚乙烯管中，此时管中原有的肝素已被推入左颈外静脉中，管内大部分为被测化合物溶液，然后将注射药物端插入右颈总动脉。血液从右颈总动脉经聚乙烯管流向左颈外静脉，15min后中断血流，取出丝线称重，总重量减去丝线重量即为血栓湿重，统计各组的血栓湿重的均值和标准差并作t检验，结果如表1。
表1本发明寡肽1-8及铜络合物(1-8)-Cu的抗血栓活性
n＝10，NS＝22.6±4.80，a)与NS比P＜0.01，b)与生理盐水比P＜0.05，1-8及(1-8)-Cu的剂量为10-8mol/kg；＊剂量为10-6mol/kg.
试验例2本发明化合物在大鼠抗血栓模型上的量效关系
按照试验例1的方法，本发明测定了H-Arg-Arg-OH(1)和H-Arg-Arg-Arg-OH(2)在10nmol/kg、1nmol/kg和0.1nmol/kg三种剂量下的抗血栓活性。结果见表2。
表2.本发明化合物1和2在三种剂量下的抗血栓活性
n＝10，NS＝22.6±4.80，a)与1nmol/kg剂量组比P＜0.01；b)与生理盐水比P＜0.05，给药剂量3ml/kg
试验例3本发明寡肽1-8及(1-8)-Cu固体状态的纳米粒测定
按照扫描电镜的测定要求，将本发明实施例所制备的寡肽(编号：1-8)或(1-8)-Cu的水溶液，置于铜网上挥发干后测定1-8及(1-8)-Cu组装的纳米球。结果表明，1-8及它们的铜络合物固体在扫描电镜下可以看到均匀的粒状态。这里给出的是代表性化合物H-Lys-Lys-OH(5)和Cu(II)[H-Lys-Lys-OH](5-Cu)的扫描电镜图(图3、图4)
Claims (6)
1、下述通式I化合物：H-(AA)m-OH，其中AA选自L-Arg或L-Lys残基中的一种；m为2-5的任意整数。
2、下述通式II化合物：Cu(II)[H-(AA)m-OH]n，其中AA选自L-Arg或L-Lys残基中的一种；m为2-5的任意整数，n为1或2。
3、一种治疗抗血栓的药物组合物，含有有效量的权利要求1通式I化合物和药学上可接受的载体或辅料。
4、一种治疗抗血栓的药物组合物，含有有效量的权利要求2通式II化合物和药学上可接受的载体或辅料。
5、权利要求1所述通式I化合物在制备治疗抗血栓药物中的用途。
6、权利要求2所述通式II化合物在制备治疗抗血栓药物中的用途。
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