CN101597322B - Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg的17种类似物，其合成及在医学中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明以Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg为先导结构，通过变换其C端氨基酸得到17种具有抗血栓活性的多肽。本发明公开了这些多肽及其合成方法。本发明的多肽的分子式为Tyr-Ile-Gly-Ser-AA，其中，AA选自缬氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、半胱氨酸、精氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基。本发明通过SD大鼠颈动静脉旁路模型评价了这17种多肽的抗血栓活性，试验结果表明，本发明多肽化合物具有优秀的抗血栓活性，临床上可作为抗血栓剂应用。

Description

Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg的17种类似物,其合成及在医学中的应用

技术领域

本发明涉及多肽，尤其涉及以Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg为先导结构，变换C端氨基酸得到的具有抗血栓活性的多肽，本发明还涉及该多肽的合成方法以及它们作为抗血栓剂的应用，属于生物医药领域。

背景技术

细胞黏附在细胞黏附性疾病(癌转移、血栓形成、化学致炎和骨质疏松)的发展过程中起关键作用。Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg是基底膜蛋白的一个片段，是Laminin受体的配基，与正常细胞或肿瘤细胞表面的整合素也有很强结合能力，可参与细胞黏附过程。按照这种知识，发明人认识到Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg有能力与Arg-Gly-Asp肽竞争血小板表面的整合素受体，抑制血栓形成。发明人提出对Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg的羧端进行修饰，寻找具有优秀抗血栓活性的Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg类似物。

发明内容

本发明目的之一是提供一类具有抗血栓活性的多肽；

本发明目的之二是提供一种合成上述具有抗血栓活性的多肽的方法。

本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

具有抗血栓活性的多肽，其分子式为Tyr-Ile-Gly-Ser-AA，其中AA选自赖氨酸残基(Lys)，脯氨酸残基(Pro)，缬氨酸残基(Val)，丙氨酸残基(Ala)，甘氨酸残基(Gly)，苯丙氨酸残基(Phe)，色氨酸残基(Trp)，异亮氨酸残基(Ile)，丝氨酸残基(Ser)，苏氨酸残基(Thr)，酪氨酸残基(Tyr)，蛋氨酸残基(Met)，半胱氨酸残基(Cys)，精氨酸残基(Arg)，天冬酰胺残基(Asn)，谷胺酰胺残基(Gln)或谷氨酸残基(Glu)。

一种合成上述具有抗血栓活性多肽的方法，包括：

(1)将酪氨酸转变为Boc-Tyr；

(2)将赖氨酸，脯氨酸，缬氨酸，丙氨酸，甘氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，异亮氨酸，O-苄基丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，蛋氨酸，半胱氨酸，精氨酸，天冬酰胺，谷胺酰胺或谷氨酸转变为苄酯；

(3)Boc-Tyr与异亮氨酸苄酯缩合制备Boc-Tyr-Ile-OBzl；

(4)将Boc-Tyr-Ile-OBzl转变为Boc-Tyr-Ile；

(5)将Boc-Tyr-Ile-OBzl与甘氨酸苄酯缩合制备Boc-Tyr-Ile-Gly-OBzl；

(6)将Boc-Tyr-Ile-Gly-OBzl转变为Boc-Tyr-Ile-Gly；

(7)将Boc-Ser(Bzl)与步骤(2)所制备的L-氨基酸苄酯转变为Boc-Ser(Bzl)-AA-Obzl，其中AA选自赖氨酸，脯氨酸，缬氨酸，丙氨酸，甘氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，蛋氨酸，半胱氨酸，精氨酸，天冬酰胺，谷胺酰胺或谷氨酸残基；

(8)将步骤(7)所制备的Boc-Ser(Bzl)-AA-OBzl转变为HCl·Ser(Bzl)-AA-OBzl；

(9)在DCC、HoBt存在下，将Boc-Tyr-Ile-Gly与步骤(8)所制备的HCl·Ser(Bzl)-AA-OBzl偶联得到Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-AA-OBzl；

(10)在氯化氢/乙酸乙酯存在下将Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-AA-OBzl转变为HCl·Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-AA-Obzl，用Pd/C催化HCl·Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-AA-OBzl氢解得到Tyr-Ile-Gly-Ser-AA；其中，所述的AA赖氨酸残基，脯氨酸残基，缬氨酸残基，丙氨酸残基，甘氨酸残基，苯丙氨酸残基，色氨酸残基，异亮氨酸残基，苏氨酸残基，酪氨酸残基，丝氨酸残基，精氨酸残基，天冬酰胺残基，谷胺酰胺残基或谷氨酸残基；

(11)在三氟醋酸和三氟加磺酸存在下，将Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Cys-OBzl或Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Met-OBzl分别转变为Tyr-Ile-Gly-Ser-Cys或Tyr-Ile-Gly-Ser-Met。

上述方法中，步骤(1)中优选在NaOH、(Boc)₂O和二氧六环存在下将酪氨酸转变为Boc-Tyr；

步骤(2)中优选在对甲苯磺酸，苄醇和环己烷存在下，将赖氨酸，脯氨酸，缬氨酸，丙氨酸，甘氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，异亮氨酸，O-苄基丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，蛋氨酸，半胱氨酸，精氨酸，天冬酰胺，谷胺酰胺或谷氨酸转变为苄酯。

步骤(3)中优选在DCC和HOBt存在下，Boc-Tyr与异亮氨酸苄酯缩合制备Boc-Tyr-Ile-OBzl。

步骤(4)中优选在NaOH、甲醇存在下，将Boc-Tyr-Ile-OBzl转变为Boc-Tyr-Ile。

步骤(5)中优选在DCC、HoBt存在下，将Boc-Tyr-Ile-OBzl与甘氨酸苄酯缩合制备Boc-Tyr-Ile-Gly-OBzl。

步骤(6)中优选在NaOH、甲醇存在下，将Boc-Tyr-Ile-Gly-OBzl转变为Boc-Tyr-Ile-Gly；

步骤(7)中优选在DCC、HoBt存在下，将Boc-Ser(Bzl)与步骤(2)所制备的L-氨基酸苄酯转变为Boc-Ser(Bzl)-AA-Obzl，其中AA选自赖氨酸，脯氨酸，缬氨酸，丙氨酸，甘氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，蛋氨酸，半胱氨酸，精氨酸，天冬酰胺，谷胺酰胺或谷氨酸残基；

步骤(8)中优选在氯化氢/乙酸乙酯存在下，将步骤(7)所制备的Boc-Ser(Bzl)-AA-OBzl转变为HCl·Ser(Bzl)-AA-OBzl；

本发明的再一目的是提供一种治疗血栓的药用组合物，该药用组合物由治疗上有效剂量的本发明多肽化合物与药学上可接受的溶剂所组成，即将有效量的本发明多肽化合物与药学上可接受的溶剂配伍后，按本领域常规的制剂方法将其制备成任意一种适宜的药物组合物。通常该组合物适合于口服给药或注射给药，也适合其他的给药方法。根据不同的给药方法，本发明药物组合物可以含有0.1％-99％重量，优选10-60％重量的本发明化合物。

本发明通过SD大鼠颈动静脉旁路模型评价了通式化合物Tyr-Ile-Gly-Ser-AA的抗血栓活性，试验结果表明，本发明多肽化合物具有优秀的抗血栓活性，临床上可作为抗血栓剂应用。

附图说明

图1本发明多肽化合物的合成路线图，其中，所述的AA选自赖氨酸残基，脯氨酸残基，缬氨酸残基，丙氨酸残基，甘氨酸残基，苯丙氨酸残基，色氨酸残基，异亮氨酸残基，苏氨酸残基，酪氨酸残基，丝氨酸残基，精氨酸残基，天冬酰胺残基，谷胺酰胺残基或谷氨酸残基。

图2本发明多肽化合物的合成路线图，其中，所述的AA选自蛋氨酸残基或半胱氨酸残基。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1  制备Boc-L-Tyr

冰浴下将4g(0.02mol)L-Tyr溶于10mlNaOH水溶液(2N)，往该溶液中加g(2.2mmol)(Boc)₂O与5ml1，4-二氧六环的溶液，反应化合物搅拌并不断减压抽去反应过程中生成的CO₂。约需48小时后TLC检测到反应完成，减压除去1，4-二氧六环，残留无先用饱和KHSO₄水溶液调pH2，然后用乙酸乙酯萃取三次，合并的乙酸乙酯层用饱和NaCl水溶液洗三次后用无水NaSO₄干燥过夜，过滤，滤也减压浓缩得到的无色固体用乙酸乙酯-石油醚重结晶。收率：88％。

实施例2  制备L-氨基酸苄脂通法

将20mmolL-氨基酸和30ml苯甲醇在100ml圆底烧瓶中搅拌使溶解。然后加3.78g(22mol)对甲苯磺酸，90℃搅拌。用环己烷共沸带出反应过程中生成的水。24小时后TLC检测原料点基本消失，停止加热，冷却，冰浴搅拌下加入大量乙醚，析出氨基酸苄酯对甲苯磺酸盐。产率在86％-96％之间。依此通法合成了缬氨酸苄酯、丙氨酸苄酯、色氨酸苄酯、O-苄基丝氨酸苄酯、苯丙氨酸苄酯、异亮氨酸苄酯、甘氨酸苄酯、蛋氨酸苄酯、谷氨酸双苄酯、脯氨酸苄酯、苏氨酸苄酯和酪氨酸苄酯。

实施例3  制备Boc-Tyr-Ile-OBzl

将635mg(2.25mmol)Boc-Tyr溶于6ml无水THF，冰浴下往得到的溶液中加入350mg(2.59mmol)N-羟基苯并三氮唑(HOBt)，并使完全溶解。10分钟后滴加入535mg(2.59mmol)二环己基羰二亚胺(DCC)无水THF溶液。得到反应液(I)，待用。冰浴下将888mg(2.25mmol)异亮氨酸苄酯对甲苯磺酸盐溶于8ml无水THF中，然后用N-甲基吗啉(NMM)，调pH 7-8。搅拌35分钟，得到反应液(II)，待用。

冰浴下把反应液(I)加入反应液(II)中，先冰浴下搅拌1 h，再室温搅拌36h。TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示Tos·Ile-OBzl消失。减压滤除二环己基脲(DCU)，滤液减压浓缩至干。残留物用15ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用饱和NaHCO₃水溶液洗、饱和NaCl水溶液洗、5％KHSO₄水溶液洗和饱和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，得到标题化合物1.15g(100％)，为无色粉末。ESI-MS(m/z)484[M+H]⁺。

实施例4  制备Boc-Tyr-Ile

将767mg(1.0mmol)Boc-Tyr-Ile-OBzl溶于10ml甲醇。冰浴下将得到的溶液用NaOH(2N)水溶液调pH12并搅拌3h，TLC(氯仿/甲醇，20∶1)显示Boc-Tyr-Ile-OBzl消失。反应混合物用饱和KHSO₄水溶液调pH7，减压浓缩除甲醇。残留物用饱和KHSO₄水溶液调pH2，用乙酸乙酯萃取(30ml×5)。合并的乙酸乙酯相用饱和NaCl水溶液洗至中性，无水Na₂SO₄干燥2-3h。减压过滤，滤液减压浓缩至干，得标题化合物677mg(100％)，为无色固体粉末。ESI-MS(m/z)394[M-H]^-。

实施例5  制备Boc-Tyr-Ile-Gly-OBzl

将1.0g(2.53mmol)Boc-Tyr-Ile溶于10ml无水THF，冰浴下往得到的溶液中加入206mg(1.5mmol)HOBt，并使完全溶解。10分钟后滴加入371mg(1.8mmol)DCC无水THF溶液。得到反应液(I)，待用。冰浴下将855mg(2.53mmol)Gly-OBzl对甲苯磺酸盐溶于8ml无水THF中，然后用NMM调pH8。搅拌35分钟，得到反应液(II)，待用。

冰浴下把反应液(I)加入反应液(II)中，先冰浴下搅拌1h，再室温搅拌36h，TLC(氯仿/甲醇，20∶1)显示Gly-OBzl对甲苯磺酸盐消失。减压滤除DCU，滤液减压浓缩至干。残留物用25ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用饱和NaHCO₃水溶液洗、饱和NaCl水溶液洗、5％KHSO₄水溶液洗和饱和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，得到标题化合物1.34(98％)，为无色固体粉末。ESI-MS(m/z)541[M+H]⁺。

实施例6  制备Boc-Tyr-Ile-Gly

将0.808g(1.87mmol)Boc-Tyr-Ile-Gly-OBzl溶解在10ml甲醇中，0℃下加入1.5mol/l的NaOH水溶液，调节pH11，搅拌反应0.5h，TLC检测反应结束。加饱和KHSO₄调节pH7，滤除析出的盐，滤液减压蒸馏除去全部甲醇，残留水溶液继续用KHSO₄调节pH值到2，用乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯层合并，用饱和NaCl萃洗三次，无水NaSO₄干燥3小时，过滤，滤液减压浓缩除去乙酸乙酯，得到目标化合物0.834g(99％)。ESI-MS(m/z)452[M-H]^-。

实施例7制备Boc-Ser(Bzl)-AA-OBzl

将0.590g(2.0mmol)Boc-Ser(Bzl)溶解在6ml无水THF中，0℃下加入0.270g(2.0mmol)HOBt和0.45g(2.2mmol)DCC。搅拌10分钟后加入0.539g(2.0mmol)Arg(NO₂)-OBzl的无水THF溶液。反应混合物用NMM调节pH9，0℃搅拌24小时。停止反应，过滤除去DCU。滤液减压浓缩，残留物溶于乙酸乙酯中，得到的溶液依次用饱和NaHCO₃水溶液、5％KHSO₄水溶液和饱和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯层用无水NaSO₄干燥3小时。滤除NaSO₄，滤液减压浓缩除去乙酸乙酯。残留物用柱层析分离(CHCl₃∶CH₃OH，30∶1)，得到目标化合物0.969g(95％)。ESI-MS(m/z)511[M+H]⁺。以此通法合成了Boc-Ser(Bzl)-Gly-OBzl，Boc-Ser(Bzl)-Ala-OBzl，Boc-Ser(Bzl)-Pro-OBzl，Boc-Ser(Bzl)-Val-OBzl，Boc-Ser(Bzl)-Ile-OBzl，Boc-Ser(Bzl)- Lys(Z)-OBzl，Boc-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OBzl，Boc-Ser(Bzl)-Gln-OBzl，Boc-Ser(Bzl)- Asn-OBzl，Boc-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-OBzl，Boc-Ser(Bzl)-TYr-OBzl，Boc-Ser(Bzl)-Phe- OBzl，Boc-Ser(Bzl)-Arg(NO₂)-OBzl，Boc-Ser(Bzl)-Thr-OBzl，Boc-Ser(Bzl)-Trp-OBzl，Boc-Ser(Bzl)-Met-OBzl和Boc-Ser(Bzl)-Cys-OBzl。

实施例8  制备HCl·H-Ser(Bzl)-AA-OBzl通法

将0.969g(1.9mmol)Boc-Ser(Bzl)-AA-OBzl溶解在15ml 6N氯化氢-乙酸乙酯溶液中，室温搅拌2小时，TLC检测原料点消失，减压抽去乙酸乙酯，反复加少量乙醚进行减压抽气以除去产品中的酸气，最后加少量乙醚将产品研磨成固体粉末，直接用于下一步反应。用此通法合成了HCl·H-Ser(Bzl)-Gly-OBzl，HCl·H-Ser(Bzl)-Ala-OBzl，HCl·H-Ser(Bzl)-Pro-OBzl，HCl·H-Ser(Bzl)-Val-OBzl，HCl·H-Ser(Bzl)-Ile-OBzl，HCl·H-Ser(Bzl)-Lys(Z)-OBzl，HCl·H-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)- OBzl，HCl·H-Ser(Bzl)-Gln-OBzl，HCl·H-Ser(Bzl)-Asn-OBzl，HCl·H-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)- OBzl，HCl·H-Ser(Bzl)-TYr-OBzl，HCl·H-Ser(Bzl)-Phe-OBzl，HCl·H-Ser(Bzl)-Arg(NO₂)-OBzl，HCl·H-Ser(Bzl)-Thr-OBzl，HCl·H-Ser(Bzl)-Trp-OBzl，HCl·H-Ser(Bzl)-Met-OBzl和HCl·H-Ser(Bzl)-Cys-OBzl。

实施例9  制备Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-AA-OBzl通法

用实施例3的缩合方法，将实施例6得到的Boc-Tyr-Ile-Gly与实施例8得到的HCl·H-Ser(Bzl)-AA-OBzl转变为Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Cys-OBzl，Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)(Bzl)-Gly-OBzl，Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Ala-OBzl，Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser-(Bzl)-Pro-OBzl，Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Val-OBzl，Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Ile-OBzl，Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Lys(Z)-OBzl，Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Glu-OBzl，Boc- Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Gln-OBzl，Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Asn-OBzl，Boc- Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Ser-OBzl，Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Tyr-OBzl，Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Phe-OBzl，Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Arg(NO2)-OBzl，Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Thr-OBzl，Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Trp-OBzl和Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Met-OBzl。

实施例10  制备HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-AA-OBzl的通法

用实施例8的方法，将实施例9中得到的化合物全部脱去Boc保护基，得到相应的HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Cys-OBzl， HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)(Bzl)-Gly- OBzl，HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Ala-OBzl，HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser- (Bzl)-Pro-OBzl，HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Val-OBzl，HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Ile-OBzl，HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Lys(Z)-OBzl，HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Glu-OBzl，HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Gln-OBzl，HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Asn-OBzl，HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Ser-OBzl，HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Tyr-OBzl，HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Phe-OBzl，HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Arg(NO2)-OBzl，HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Thr-OBzl，HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Trp-OBzl和HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Met-OBzl。

实施例11  制备HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-AA通法

先将HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-AA-OBzl溶于乙醇，再加入反应原料1/3量的Pd/C，搅拌下减压排出反应瓶中的空气，通入氢气置换，反复置换3次后，通氢气室温搅拌24小时，TLC(展开剂CHCl₃∶MeOH∶冰醋酸＝10∶1∶1滴)显示HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-AA-OBzl消失。停止反应，滤除Pd/C，滤渣用无水乙醇冲洗三次，滤液减压浓缩，得标题化合物HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Cys，HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)(Bzl)-Gly，HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Ala，HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser-(Bzl)-Pro，HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Val，HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Ile，HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Lys(Z)，HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Glu，HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Gln，HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Asn，HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Ser，HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Tyr，HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Phe，HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Arg(NO₂)，HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Thr，HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Trp和HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Met。

实施例12  制备HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser-Met和HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser-Cys

将200mg Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Met-OBzl或者200mg Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Cys(Bu^t)-OBzl溶于4ml三氟醋酸中，加入1ml三氟甲磺酸和1ml苯甲醚，0℃冰浴条件下搅拌反应1小时，减压抽气5分钟，一次性加入100ml乙醚，析出的产品固体粉末使用Sephadex G 10进行分离纯化，得到目标化合物约180mg(90％)。

实施例13 HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser-Ile的数据

280mg(93.3％)；Mp 114-115℃；ESI-MS(m/e)362[M-H]^-； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=-16.38(c=0.1,C{H}_3\mathrm{OH}).$

¹HNMR(500MHZ，DMSO-d₆)：δ/ppm＝8.57(d，J＝7.76，4H)，8.23(s，3H)，7.93(t，J＝16.9Hz，1H)，7.03(d，J＝8.3Hz，2H)，6.70(d，J＝10Hz，2H)，4.25(m，1H)，4.02(s，2H)，3.58(d，J＝5.55Hz，2H)，3.44(m，2H)，1.50(m，3H)，1.10(m，7H)，0.886(m，2H).¹³C-NMR(DMSO-d6，75MHz)δ＝173.1，171.0，170.3，156.9，130.9，115.7，62.2，57.6，55.3，37.2，36.9，25.1，24.8，25.1，24.8，15.7，11.7，11.5。

实施例14 HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser-Val的数据

244mg(96％)； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=-7.19(c=0.1,C{H}_3\mathrm{OH});$ ESI-MS(m/z)537[M-H]^-；Mp 95-96℃。¹HNMR(500MHZ，DMSO-d₆)：δ/ppm＝8.58(d，J＝5，2H)，8.24(m，3H)7.03(d，J＝10，2H)6.69(d，J＝5，1H)7.04(m，2H)6.7(m，2H)4.74(m，1H)4.39(m，1H)4.28(m，1H)4.03(m，1H)3.59(m，2H)2.08(m，1H)1.53(m，1H)0.90(m，12H)，¹³CNMR(DMSO-d6，75MHz)δ：：173.2，171.0，170.4，169.1，168.9，156.9，130.9，129.9，115.7，62.2，57.9，57.7，57.5，56.4，55.4，36.7，30.2，24.8，19.5，19.0，18.4，14.5，11.5。

实施例15 HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser-Pro的数据

244mg(96％)；ESI-MS(m/z)533[M-H]^- ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=-16.14(c=0.1,C{H}_3\mathrm{OH});$ Mp 133-135℃；¹HNMR(500MHZ，DMSO-d：δ/ppm＝9.38(s，1H)，8.61(d，J＝9.4，1H)，8.28(s，1H)，7.08(m，3H)，6.72(m，3H)，4.59(m，2H)4.28(m，3H)4.14(m，1H)，4.08(m，2H)，3.83(m，3H)，3.44(m，6H)，2.10(m，1H)，1.91(m，4H)，1.55(m，4H)，1.11(m，1H)，0.88(m，6H)，¹³C NMR(75MHz，D₂O)：δ＝173.9，173.6，173.3，172.4，171.1，169.5，156.9，131.0，130.8，115.7，61.7，57.6，56.4，42.3，37.2，36.9，25.8，24.8。

实施例16 HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser-Gly的数据

220mg(96.9％)；ESI-MS(m/z)495[M-H]^-；Mp 102-103℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=-6.14(c=0.1,C{H}_3\mathrm{OH}).$ ¹HNMR(500MHZ，DMSO-d₆)：δ/ppm＝8.88(d，J＝6Hz，2H)，8.04(m，4H)7.13(d，J＝10Hz，2H)7.09(d，J＝4Hz，2H)7.02(m，2H)6.8(m，2H)4.14(m，1H)4.59(m，1H)4.18(m，1H)4.03(m，1H)3.29(m，2H)2.38(m，1H)1.53(m，1H)0.98(m，12H)，¹³CNMR(DMSO-d6，75MHz)δ：：172.2，171.1，170.4，169.1，152.9，153.9，139.2，129.9，115.7，62.2，57.9，57.7，57.5，54.4，55.4，37.7，30.2，25.8，19.5，19.9，18.8，14.5，10.9。

实施例17 HCl.H-Tyr-Ile-Gly-Ser-Tyr的数据

1.61g(94％)；ESI-MS(m/z)881[M-H]^-； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=-17.30(c=0.1,C{H}_3\mathrm{OH});$ Mp 134-135℃.。¹HNMR(500MHZ，DMSO-d：δ/ppm＝8.32(m，2H)，7.0(m，3H)，6.70(m，4H)，4.35(m，3H)，3.62(m，2.H)，3.0(m，2H)，2.77(m，2H)，1.91(s，1H)，1.74(m，1H)，1.49(m，1H)，1.23(t，1H)，1.10(m，1H)，0.88(m，5H)。.¹³CNMR(DMSO-d6，75MHz)δ：173.1，171.1，170.1，168.9，168.7，156.9，130.9，130.5，115.7，115.4，59.8，57.6，55.46，54.5，42.4，37.3，36.9，14.5。

实施例18 HCl.H-Tyr-Ile-Gly-Ser-Thr的数据

220mg(96.9％)；ESI-MS(m/z)539[M-H]^-；Mp 189-190℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=-27.16(c=0.1,C{H}_3\mathrm{OH}),$ ¹HNMR(500MHZ，DMSO-d₆)：δ/ppm＝8.61(d，J＝8.55，2H)，8.33(m，1H)8.16(m，2H)，8.03(m，1H)，7.07(m，2H)，6.70(d，J＝8.45，2H)4.25(m，2H)，3.56(m，5H)，3.42(m，3H)，2.00(d，J＝7.6，1H)，1.91(s，1H)，1.05(m，4H)，0.89(m，3H)，0.86(m，3H)。

实施例19 HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser-Ala的数据

220mg(96.9％)；ESI-MS(m/z)509[M-H]^-；Mp 98-99℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=-28.29(c=0.1,C{H}_3\mathrm{OH}).$ ¹HNMR(500MHZ，DMSO-d：δ/ppm＝9.02(m，2H)，7.43(m，4H)，7.10(m，2H)，4.33(m，3H)，3.98(m，3H)，3.34(m，4H)，2.72(m，2H)，1.31(s，4H)，1.74(m，5H)，1.39(m，2H)，1.31(t，1H)，1.10(m，2H)，0.88(m，5H)。.¹³CNMR(DMSO-d6，75MHz)δ：171.1，170.6，169.1，168.9，158.7，156.9，140.9，131.5，125.7，114.3，59.7，59.0，56.6，55.5，42.3，37.3，36.0，14.1。

实施例20 HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser-Asp的数据

290mg(96.6％)；ESI-MS(m/z)552[M-H]^-；Mp 123-124℃， ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=-28.29(c=0.1,C{H}_3\mathrm{OH}).$ ¹HNMR(500MHZ，DMSO-d₆)：δ/ppm＝9.37(m，1H)，8.57(d，J＝8.7，1H)，8.23(m，3H)，8.08(m，3H)，7.03(m，2H)，6.72(m，2H)，4.36(m，1H)，4.06(m，1H)3.88(m，2H)，3.32(m，18)，2.80(m，2H)，0.90(m，6H)。

实施例21 HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser-Glu的数据

240mg(92.6％)；ESI-MS(m/z)567[M-H]^-； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=9.21(c=0.1,C{H}_3\mathrm{OH});$ Mp 107-108℃。¹HNMR(500MHZ，DMSO-d₆)：δ/ppm：8.33(s，1H)，8.23(s，1H)，8.14(d，J＝1.46，1H)，7.04(d，J＝1.43，2H)6.70(d，J＝7.5，2H)，4.39(m，3H)，4.06(m，1H)，3.88，(m，3H)，3.58(m，3H)，2.89(s，1H)，2.26(m，1H)，1.51(s，1H)，1.11(m，2H)，0.89(m，5H)。¹³C-NMR(DMSO-d₆，75MHz)δ＝174.2，173.4，172.7，171.1，170.4，169.0，156.9，131.0，115.7，62.2，55.5，53.0，42.3，37.2，36.6，30.5，26.8，24.8，14.5，11.5。

实施例22 HCl.H-Tyr-Ile-Gly-Ser-Phe的数据

215mg(93％)；ESI-MS(m/z)585[M-H]^-； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=-7.85(c=0.1,C{H}_3\mathrm{OH});$ Mp 120-122℃。¹HNMR(500MHZ，DMSO-d：δ/ppm＝8.49(m，2H)，7.38(m，1H)，7.13(m，3H)，7.01(m，1H)，6.11(m，1H)，4.15(m，3H)，3.72(m，1.H)，3.01(m，1H)，2.97(m，1H)，1.41(s，2H)，1.52(m，1H)，1.40(m，1H)，1.13(t，1H)，1.10(m，1H)，0.88(m，5H)。.¹³CNMR(DMSO-d6，75MHz)δ：183.2，179.3，170.1，163.9，162.3，140.9，130.4，130.0，125.3，115.4，57.7，56.8，56.4，55.5，47.4，35.3，34.4，13.5。

实施例23 HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser-Met的数据

205mg(90％)；ESI-MS(m/z)569[M-H]^-； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=-50.12(c=0.1,C{H}_3\mathrm{OH});$ Mp 114-116℃。¹HNMR(500MHZ，DMSO-d：δ/ppm＝8.98(s，1H)，8.77(d，J＝7.2，1H)，8.87(s，1H)，7.08(m，2H)，6.96(m，1H)，4.59(m，1H)，4.39(m，1H)，4.55(m，2H)，4.32(m，2H)，3.63(m，4H)，3.24(m，6H)，2.10(m，2H)，1.90(m，3H)，1.52(m，3H)，1.11(m，1H)，0.98(m，6H)，¹³C NMR(75MHz，D₂O)：δ＝172.4，171.9，171.1，170.6，170.1，166.3，161.6，141.0，135.8，135.7，61.7，53.6，52.1，49.3，37.2，37.0，25.1，24.8。

实施例24 HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser-Trp的数据

211mg(90％)；ESI-MS(m/z)624[M-H]^-； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=-10.00(c=0.1,C{H}_3\mathrm{OH});$ Mp 105-107℃。¹HNMR(500MHZ，DMSO-d₆)：δ/ppm：9.43(s，1H)，8.32(s，1H)，8.18(d，J＝2.46Hz，1H)，7.64(d，J＝2.95Hz，1H)，6.70(d，J＝4.5，2H)，5.39(m，3H)，4.26(m，2H)，4.72，(m，1H)，3.25(m，1H)，3.09(s，4H)，2.36(m，1H)，1.59(s，2H)，1.10(m，2H)，0.89(m，5H)。¹³C-NMR(DMSO-d₆，75MHz)δ＝184.5，176.3，173.9，172.1，171.8，163.0，138.0，132.4，123.6，115.7，67.2，57.5，54.7，51.0，47.7，37.6，33.3，32.7，27.8，26.1，14.4，12.2。

实施例25 HCl.H-Tyr-Ile-Gly-Ser-Gln的数据

207mg(91％)；ESI-MS(m/z)566[M-H]^-； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=-7.00(c=0.1,C{H}_3\mathrm{OH});$ Mp 172-173℃，ESI-MS(m/z)  624[M-H]^- ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=-10.00(c=0.1,C{H}_3\mathrm{OH}),$ Mp  105-107℃。¹HNMR(500MHZ，DMSO-d₆)：δ/ppm：8.78.(s，1H)，8.52(s，1H)，8.64(d，J＝5.63Hz，1H)，7.74(d，J＝3.85Hz，1H)，6.40(d，J＝3.5Hz，1H)，5.39(m，3H)，4.73，(m，1H)4.19(m，2H)，3.37(m，2H)，3.09(s，3H)，2.16(m，2H)，1.59(s，2H)，1.10(m，3H)，0.89(m，5H)。¹³C-NMR(DMSO-d₆，75MHz)δ＝188.0，179.3，175.9，172.9，170.8，169.0，148.0，132.9，130.6，125.7，67.2，57.5，54.7，51.9，48.7，37.6，32.3，32.1，27.2，24.1，15.4，12.0。

实施例26 HCl.H-Tyr-Ile-Gly-Ser-Ser的数据

207mg(91％)；ESI-MS(m/z)525[M-H]^-； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=-1.31(c=0.1,C{H}_3\mathrm{OH});$ Mp 99-100℃。¹HNMR(500MHZ，DMSO-d₆)：δ/ppm：8.83(s，1H)，8.33(s，1H)，8.04(d，J＝2.46，1H)，7.04(d，J＝1.45，1H)6.70(d，J＝4.5，3H)，5.89(m，2H)，4.46(m，2H)，3.72，(m，3H)，3.65(m，2H)，3.09(s，2H)，2.66(m，1H)，1.53(s，3H)，1.10(m，2H)，0.89(m，5H)。¹³C-NMR(DMSO-d₆，75MHz)δ＝181.2，173.3，172.9，172.1，170.8，164.0，136.9，133.0，120.6，105.7，68.2，55.5，53.9，45.3，37.7，34.6，30.3，26.1，27.8，14.4，11.2。

实施例27 HCl.H-Tyr-Ile-Gly-Ser-Cys的数据

160mg(91％)；ESI-MS(m/z)54 1[M-H]^-； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=-44.20(c=0.1,C{H}_3\mathrm{OH});$ Mp 172-173℃。¹HNMR(500MHZ，DMSO-d₆)：δ/ppm＝9.17(m，1H)，8.47(d，J＝4.7，1H)，8.44(m，3H)，8.08(m，2H)，7.01(m，3H)，6.73(m，2H)，4.36(m，2H)，4.06(m，1H)3.88(m，1H)，3.39(m，1 8H)，3.06(m，3H)，0.90(m，6H)。

实施例28 HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg的数据

160mg(91％)；ESI-MS(m/z)594[M-H]^-， ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=-11.00(c=0.1,C{H}_3\mathrm{OH});$ Mp 116-117℃。¹HNMR(500MHZ，DMSO-d：δ/ppm＝9.33(s，1H)，8.81(d，J＝3.4，1H)，8.21(s，1H)，8.08(m，1H)，6.62(m，2H)，4.68(m，2H)4.18(m，3H)4.23(m，2H)，4.10(m，2H)，3.43(m，3H)，3.39(m，6H)，2.17(m，1H)，1.96(m，4H)，1.51(m，2H)，1.11(m，1H)，0.88(m，6H)，¹³C NMR(75MHz，D₂O)：δ＝173.9，173.6，173.3，172.4，171.1，169.5，156.9，131.0，132.8，105.7，61.7，56.4，50.6，42.3，37.9，34.1，25.1，27.3。

实施例29 HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser-Lys的数据

211mg(90％)；ESI-MS(m/z)624[M-H]^-； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=-10.00(c=0.1,C{H}_3\mathrm{OH});$ Mp 105-107℃。¹HNMR(500MHZ，DMSO-d₆)：δ/ppm：9.43(s，1H)，8.32(s，1H)，8.18(d，J＝2.46Hz，1H)，7.64(d，J＝2.95Hz，1H)，6.70(d，J＝4.5，2H)，5.39(m，3H)，4.26(m，2H)，4.72，(m，1H)，3.25(m，1H)，3.09(s，4H)，2.36(m，1H)，1.59(s，2H)，1.10(m，2H)，0.89(m，5H)。¹³C-NMR(DMSO-d₆，75MHz)δ＝188.5，179.4，173.3，176.9，170.8，163.0，138.0，132.3，121.6，115.4，64.2，54.5，54.0，51.4，47.9，34.6，33.5，32.9，27.6，26.2，14.5，12.1。

实验例1  本发明多肽化合物HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser-AA抗血栓活性评价

1)受试样品：

本发明实施例所制备的多肽化合物HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser-AA，分别用生理盐水配成所需浓度(100nmol/kg)浓度。

2)实验动物：

雄性SD大鼠，体重250g左右。

3)主要器械：

眼科剪，止血钳，弯镊，手术线，插管(自制)，Satorus光电分析天平

4)主要试剂：

肝素钠120(IU/mg)购自sigma公司；乌拉坦，北京化学试剂公司；生理盐水，批号04010462，双鹤药业。

实验方法：

实验原理：建立颈总动脉-颈外静脉体外循环旁路，形成血小板血栓，来观察药物对大鼠体内血栓形成的影响。动脉血流中的血小板，当接触到丝线的接触面时粘附于线上，血小板粘附聚集功能收到抑制时，形成血栓的重量就轻。因而，可以用来评价化合物的抗血小板和抗栓活性。

段较粗的插管中。实验操作：SD大鼠(雄性，200～210g)按1200mg/kg剂量腹腔注射乌拉坦溶液进行麻醉。麻醉大鼠仰卧位固定，分离右颈总动脉，左侧静脉端，各自于近心端夹动脉夹，近心端和远心端分别穿入手术线，将远心端的手术线于皮毛用止血钳夹紧，准备在远心端插管。插管为硅烷化过的聚乙烯胶管，分三段，中段为聚乙烯胶管，长60.0mm，内径3.5mm；两端为相同的聚乙烯管，管长100.0mm，内径1.0mm，外径2.0mm该管的一端拉成尖管(用于插入大鼠颈动脉或静脉)，外径为1.0mm。将编好号的干净青霉素小瓶中分别装入6cm长的黑色手术线，称重；然后取出丝线，按照编号放入准备好的插管的中

用注射器通过尖管端将管中注满肝素生理盐水溶液(50IU/kg)，然后将插管的静脉端插入大鼠左侧颈静脉，将计算量的肝素缓缓注入大鼠体内，夹闭右侧颈动脉夹，动脉远心端结扎，将插馆的动脉端插入分离好的大鼠右颈动脉，打开动脉夹，使血液开始循环。并同时开始计时。此过程中插管中央的粗管中的丝线上会因为血液循环而产生血栓。

计时开始15分钟后，剪断动静脉插管，停止循环，用眼科镊小心取出丝线，在滤纸上轻轻蘸掉血滴，放入事先称重好的青霉素小瓶中，精确称重并记录。计算出血栓的湿重。每个药品重复10次给药。统计各组的血栓湿重(X±SD)，并做t检验。

表1本发明化合物在100nmol/kg剂量的抗血栓活性(血栓重X±SDmg)

注：n＝10；阿司匹林剂量为12mg/kg；HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser-AA剂量为100nmol/kg；统计方法：t检验。

本发明挑选HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser-Gln和HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser-Asn进行量效关系评价。实验结果见表2。

表2不同剂量HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser-Gln和HCl·H-Tyr-Ile-Gly-Ser-Asn的抗血栓活性

注：n＝10；统计学方法：t检验.YIGSQ，YIGSN浓度降低10倍和100倍时，与NS比较P＜0.01，仍有显著性差异。

实验结果表明，本发明多肽化合物具有优秀的抗血栓活性。

Claims (10)

1.具有抗血栓活性的多肽，其特征在于：其分子式为Tyr-Ile-Gly-Ser-AA，

其中，AA为色氨酸残基。

2.一种合成权利要求1所述的多肽的方法，包括：

(1)将酪氨酸转变为Boc-Tyr；

(2)将色氨酸转变为苄酯；

(3)将Boc-Tyr与异亮氨酸苄酯缩合制备得到Boc-Tyr-Ile-OBzl；

(4)将Boc-Tyr-Ile-OBzl转变为Boc-Tyr-Ile；

(5)将Boc-Tyr-Ile-OBzl与甘氨酸苄酯缩合制备Boc-Tyr-Ile-Gly-OBzl；

(6)将Boc-Tyr-Ile-Gly-OBzl转变为Boc-Tyr-Ile-Gly；

(7)将Boc-Ser(Bzl)与步骤(2)所制备的L-氨基酸苄酯转变为Boc-Ser(Bzl)-AA-OBzl；其中AA为色氨酸残基；

(8)在氯化氢/乙酸乙酯存在下，将步骤(7)所制备的Boc-Ser(Bzl)-AA-OBzl转变为HCl·Ser(Bzl)-AA-OBzl；

(9)在DCC、HoBt存在下，将步骤(6)所制备的Boc-Tyr-Ile-Gly与步骤(8)所制备的HCl·Ser(Bzl)-AA-OBzl偶联得到Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-AA-OBzl；

(10)在氯化氢/乙酸乙酯存在下将Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-AA-OBzl转变为HCl·Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-AA-OBzl，用Pd/C催化HCl·Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-AA-OBzl氢解得到Tyr-Ile-Gly-Ser-AA；其中，所述的AA为色氨酸残基。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中在NaOH、(Boc)₂O和二氧六环存在下将酪氨酸转变为Boc-Tyr；步骤(2)中在对甲苯磺酸，苄醇和环己烷存在下，将色氨酸转变为苄酯。

4.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(3)中在DCC和HOBt存在下，将Boc-Tyr与异亮氨酸苄酯缩合制备Boc-Tyr-Ile-OBzl。

5.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(4)中在NaOH、甲醇存在下，将Boc-Tyr-Ile-OBzl转变为Boc-Tyr-Ile。

6.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(5)中在DCC、HoBt存在下，将Boc-Tyr-Ile-OBzl与甘氨酸苄酯缩合制备Boc-Tyr-Ile-Gly-OBzl。

7.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(6)中在NaOH、甲醇存在下，将Boc-Tyr-Ile-Gly-OBzl转变为Boc-Tyr-Ile-Gly。

8.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(7)中在DCC、HoBt存在下，将Boc-Ser(Bzl)与步骤(2)所制备的L-氨基酸苄酯转变为Boc-Ser(Bzl)-AA-OBzl，其中AA为色氨酸残基。

9.一种治疗血栓的药物组合物，由治疗上有效量的权利要求1所述的多肽和药学上可接受的溶剂组成。

10.权利要求1所述的多肽在制备治疗血栓的药物中的用途。

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