CN105884862B - RGD四肽修饰的β-咔啉酰-色氨酸，其制备，纳米结构，活性及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了RGD四肽修饰的β‑咔啉酰‑色氨酸，公开了它们的制备方法，公开了它们的纳米结构，公开了它们抗肿瘤细胞粘附的作用，公开了它们抗肿瘤细胞侵袭的作用，公开了它们抗肿瘤细胞迁移的作用，公开了它们的抗肿瘤作用，进一步公开了它们抑制肿瘤向肺转移的作用。因而本发明公开了它们在医学中的应用。

Description

RGD四肽修饰的β-咔啉酰-色氨酸，其制备，纳米结构，活性及 应用

技术领域

本发明涉及下面结构的RGDV/F/S修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸，结构中的RGDV/F/S代表Arg-Gly-Asp-Val(RGDV)，Arg-Gly-Asp-Phe(RGDF)和Arg-Gly-Asp-Ser(RGDS)三种四肽，涉及它们的制备方法，涉及它们的纳米结构，涉及它们抗肿瘤细胞粘附的作用，涉及它们抗肿瘤细胞侵袭的作用，涉及它们抗肿瘤细胞迁移的作用，涉及它们的抗肿瘤作用，进一步涉及它们抑制肿瘤向肺转移的作用。因而本发明涉及它们在医学中的应用。本发明属于生物医药领域。

背景技术

恶性肿瘤严重威胁人类的健康。除了自身对肿瘤患者的预后恶劣之外，恶性肿瘤并发的炎症、血栓和转移进一步恶化患者的预后。例如，超过90％以上的恶性肿瘤患者都是死于肿瘤转移。肿瘤转移依赖于4个因素：1)肿瘤细胞表面形成微血栓，逃避巨噬细胞吞噬，通过血液循环迁移到远端；2)迁移到远端的肿瘤细胞粘附到血管壁；3)细胞粘附到血管壁的肿瘤细胞通过侵袭出血管而进入正常组织。

由于现有抗肿瘤药物不具备抗转移作用，所以疗效不理想。发明同时具有抗肿瘤和抗肿瘤转移作用的药物是临床的迫切需求。

RGD四肽，即RGDS，RGDF和RGDV是整合素α_Vβ₃的阻断剂，具有抗血栓和抗细胞粘附活性。RGDS则具备抗肿瘤细胞迁移作用。申请人曾经把RGD四肽与雌激素偶联，制备没有凝血副作用的抗骨质疏松剂。申请人曾经把RGD四肽与四氢-β-咔啉-3-羧酸偶联制备高效的抗血栓剂。申请人也曾经用氨基酸修饰四氢-β-咔啉-3-羧酸、β-咔啉-3-羧酸及1-位取代的β-咔啉-3-羧酸，包括1-位取代的四氢-β-咔啉-3-羧酸或1-位取代的β-咔啉-3-羧酸制备高效的抗血栓剂或抗肿瘤剂。尽管发明人付出了大量研究精力，筛选了数百种化合物，一直没有得到同时具有抗肿瘤和抗肿瘤转移作用的化合物。

发明人在分析数百种化合物的结构及活性变化的基础上，认识到用Arg-Gly-Asp-Val(RGDV)，Arg-Gly-Asp-Phe(RGDF)和Arg-Gly-Asp-Ser(RGDS)三种四肽修饰1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸，形成下面结构的化合物会同时具有抗肿瘤和抗肿瘤转移作用。基于这个认识，发明人提出了本发明。

发明内容

本发明的第一个内容是提供下面结构的RGDV/F/S修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸，结构中的RGDV/F/S代表Arg-Gly-Asp-Val(RGDV)，Arg-Gly-Asp-Phe(RGDF)和Arg-Gly-Asp-Ser(RGDS)三种四肽。

本发明的第二个内容是提供RGDV/F/S修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸的制备方法，该方法由以下步骤构成：

(1)室温下，L-Trp-OMe与1，3-二羟基丙酮在稀盐酸条件下反应48h，过滤得到滤饼。滤饼溶解于二氧六环，得到的溶液在冰盐浴下用2N的NaOH水溶液调节pH至12，反应10h，得到1-乙酰基-β-咔啉酰-3-羧酸；

(2)1-乙酰基-β-咔啉酰-3-羧酸与L-Trp-OBzl反应并皂化制备1-乙酰基-β-咔啉酰-3-色氨酸；

(3)Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl，Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl，Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl与1-乙酰基-β-咔啉酰-3-色氨酸偶联，制备Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl，Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl和Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸；

(4)将Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl，Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl和Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸脱保护，制备RGDV/F/S修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸。

本发明的第三个内容是评价RGDV/F/S修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸对荷S180小鼠肿瘤增长的抑制作用。

本发明的第四个内容是评价RGDV/F/S修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸抗肿瘤细胞粘附，侵袭和迁移的作用。

本发明的第五个内容是评价RGDV/F/S修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸的抗肿瘤转移作用。

附图说明

图1.RGDV/F/S修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸的合成路线.i)CH₃OH，SOCl₂；ii)DHA，HCl；iii)2N NaOH，二氧六环；iv)Trp-OBzl，DCC，HOBt，NMM；v)2N NaOH，THF；vi)DCC，HOBt，NMM；TFA/TFSA。

图2.RGDS修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸(左)，RGDV修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸(中)和RGDF修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸(右)在纯水溶液中1×10^-9M浓度下的透射电镜照片。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备1-乙酰基-β-咔啉-3-羧酸甲酯

称取5g L-Trp-OMe于100ml茄瓶中，加入10ml 37℃温水搅拌溶解，加入3.3g 1，3-二羟基丙酮。室温反应36h，离心，弃去水层，沉淀晾干，得到1g(收率20％)标题化合物，为棕色固体，待用。ESI-MS(m/e)：257[M+H]⁺。

实施例2制备1-乙酰基-β-咔啉-3-羧酸

称取5g 1-乙酰基-β-咔啉-3-羧酸甲酯于250ml茄瓶中，加入二氧六环溶解，冰浴缓慢加入2N NaOH水溶液调节pH12，反应13h。反应液用饱和KHSO₄水溶液调节pH8，减压浓缩。残留物用饱和KHSO₄调节pH2，有机层用乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩，得到4g(80％)标题化合物，为棕黄色固体。ESI-MS(m/e)：241[M-H]^-。

实施例3制备1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸苄酯

称取2g 1-乙酰基-β-咔啉-3-羧酸，用10ml无水THF溶解，冰浴下加入2g DCC，1.2gHOBt，搅拌30min，得溶液A。3.2g Trp-OBzl溶于15ml无水THF，缓慢加入N-甲基吗啉调节溶液pH9，得溶液B。冰浴下将B液缓慢加入A液当中，用N-甲基吗啉调节pH9，反应12h，TLC显示原料消失(石油醚∶丙酮＝4∶1)。反应混合物过滤，滤液减压浓缩，残留物用乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩，得到的4.38g糖浆状产物用石油醚/丙酮体系干柱层析纯化(石油醚/丙酮＝4/1)得到2g(46％)标题化合物，为黄色固体产率。ESI-MS(m/e)：531[M+H]⁺。

实施例4制备1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸

称取2g 1-乙酰基-β-咔啉-3-酰基-Trp-OBzl，无水THF溶解。冰浴下加入2N NaOH水溶液，调节pH12，反应1.5h。TLC显示原料点消失(石油醚/丙酮＝2/1)，反应液用饱和KHSO₄水溶液调节pH8，减压浓缩，残留物用饱和KHSO₄调节pH2，有机层用乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩，得到1.5g(90％)1化合物，为黄色固体。ESI-MS(m/e)：529[M-H]^-。

实施例5制备Arg-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl

1)制备Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl

按照实施例3的方法由10g(31.0mmol)Boc-Arg(NO₂)与10g(29.67mmol)TosH·Gly-OBzl反应，用二氯甲烷-甲醇(二氯甲烷∶甲醇＝30∶1)纯化得10.65g，(73％)标题化合物，ESI-MS(m/e)：467.6[M+H]⁺。

2)制备Boc-Arg(NO₂)-Gly

按照实施例4的方法，由6g(12.9mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl得到4.13g(86％)标题化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/e)：375[M-H]^-。

3)制备Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl

按照实施例3的方法，由3.8g(11.8mmol)Boc-Asp(OBzl)和4.7g(12.4mmol)TosH·Val-OBzl反应，得3.9g(65％)标题化合物，ESI-MS(m/e)：513.5[M+H]⁺。

4)制备HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl

将3.9g(7.6mmol)Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl置于250ml茄瓶中，冰浴搅拌下加入100ml氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M)，瓶口加干燥管，冰浴搅拌1小时，TLC显示原料完全消失，反应结束。减压抽干反应液，加少量干燥乙酸乙酯，再抽干，重复3次；加少量无水乙醚，减压抽干，重复3次，得3g(97％)标题化合物，ESI-MS(m/e)：413.1[M+H]⁺。

5)制备Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl

按照实施例3的方法，由4.8g(12.77mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly和6g(15.1mmol)HCl·Asp(OBzl)Val-OBzl反应得6.56g(57％)标题化合物，ESI-MS(m/e)：770[M+H]⁺。

6)制备HCl·Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl

将4.90g Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl置于250ml茄瓶中，冰浴搅拌下加入120ml氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M)，瓶口加干燥管，冰浴搅拌1小时，TLC显示原料完全消失，反应结束。减压抽干反应液，加少量干燥乙酸乙酯，再抽干，重复3次；加少量无水乙醚，减压抽干，重复3次，制得3.87g(90％)标题化合物。ESI-MS(m/e)：669[M-H]^-。

实施例6制备Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl

1)制备Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl

按照实施例3的方法，由2.0g(6.2mmol)Boc-Asp(OBzl)与2.52g(11.2mmol)TosH·Phe-OBzl得到3.5g(56％)标题化合物，ESI-MS(m/e)：560[M+H]⁺。

2)制备HCl·Asp(OBzl)-Phe-OBzl

将3.5g(6.3mmol)Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl置于250ml茄瓶中，冰浴搅拌下加入120ml氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M)，瓶口加干燥管，冰浴搅拌1小时，TLC显示原料完全消失，反应结束。减压抽干反应液，加少量干燥乙酸乙酯，再抽干，重复3次；加少量无水乙醚，减压抽干，重复3次，制得2.42g(84％)标题化合物，ESI-MS(m/e)：460[M+H]⁺。

3)制备Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl

按照实施例3的方法，由6g(18.12mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly与8.49g(18.12mmol)HCl·Asp(OBzl)Phe-OBzl得11.52g(82％)标题化合物，ESI-MS(m/e)：819[M+H]⁺。

4)制备HCl·Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl

将4.64g(6.0mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl置于250ml茄瓶中，冰浴搅拌下加入120ml氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M)，瓶口加干燥管，冰浴搅拌1小时，TLC显示原料完全消失，反应结束。减压抽干反应液，加少量干燥乙酸乙酯，再抽干，重复3次；加少量无水乙醚，减压抽干，重复3次，制得900mg(98％)标题化合物，ESI-MS(m/e)：719[M+H]⁺。

实施例7制备HCl·Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl

1)制备Boc-Asp(OBzl)-Ser-OBzl

按照实施例3的方法，由(9.5g，41.12mmol)Boc-Leu和17.5g(39.06mmol)HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl得14.62g(61％)标题化合物，ESI-MS(m/e)：625.3[M+H]⁺。

2)制备HCl·Asp(OBzl)-Ser-OBzl

将3.50g(7.00mmol)Boc-Asp(OBzl)-Ser-OBzl置于250ml茄瓶中，冰浴搅拌下加入120ml氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M)，瓶口加干燥管，冰浴搅拌1小时，TLC显示原料完全消失，反应结束。减压抽干反应液，加少量干燥乙酸乙酯，再抽干，重复3次；加少量无水乙醚，减压抽干，重复3次，制得2.53g(90％)，标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：400.5[M+H]⁺。

3)制备Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl

按照实施例3的方法，由2.5g(7.55mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly和3.04g(7.92mmol)HCl·Asp(OBzl)-Ser-OBzl得到3.56g(71％)标题化合物.ESI-MS(m/e)：756[M-H]^-。

4)制备HCl·Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl

将2.0g(2.64mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl置于250ml茄瓶中，冰浴搅拌下加入120ml氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M)，瓶口加干燥管，冰浴搅拌1小时，TLC显示原料完全消失，反应结束。减压抽干反应液，加少量干燥乙酸乙酯，再抽干，重复3次；加少量无水乙醚，减压抽干，重复3次，制得1.5g(83％)标题化合物，ESI-MS(m/e)：658[M+H]⁺。

实施例8制备1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酰-Arg-Gly-Asp-Val(2a)

1)制备1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酰-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl

按照实施例3的方法，由590mg(1.34mmol)1-乙酰基-β-咔啉-3-酰基-Trp与670mg(1.65mmol)HCl·Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl得250mg(19％)标题化合物，为淡黄色固体。ESI-MS(m/e)：1092[M+H]⁺。

2)制备1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酰-Arg-Gly-Asp-Val

称取200mg 1-乙酰基-β-咔啉-3-酰基-Trp-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl于250ml茄瓶中，冰浴搅拌下依次加入4ml三氟甲磺酸和1ml三氟乙酸，冰浴搅拌1小时，反应结束。冰浴搅拌下加入50ml无水乙醚，析出黄色絮状固体，离心，乙醚洗3次，得黄色固体，冰浴下将其溶于2ml蒸馏水，滴加1％氨水调至pH＝5，减压过滤除去不溶物，滤液减压浓缩，残留物经C18柱层析纯化(甲醇∶水＝8∶1)，得20mg(11％)标题化合物，为淡黄色固体。ESI-MS(m/e)：865[M-H]^-.Mp：234-236℃；[α]_D ²⁵＝-18.6(c＝0.04，CH₃OH).¹H NMR(800MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝12.18(s，1H)，10.89(s，1H)，9.05(s，1H)，8.64(d，J＝8.0Hz，1H)，8.56(d，J＝16.0Hz，lH)，8.49(d，J＝24Hz，1H)，8.44(d，J＝8.0Hz，1H)，7.85(m，2H)，7.68(d，J＝8Hz，1H)，7.63(d，J＝8Hz，1H)，7.31(m，3H)，7.05(m，1H)，7.02(m，1H)，6.97(m，lH)，6.87(m，1H)，4.94(m，1H)，4.41(m，1H)，4.35(m，2H)，4.04(m，2H)，3.45(m，4H)，3.29(m，1H)，2.66(s，3H)，2.59(m，1H)，2.51(m，1H)，2.42(m，2H)，2.29(m，1H)，2.03(m，1H)，1.92(s，2H)，1.27(m，4H)，0.87-0.83(m，6H)；HPLC纯度：95.4％，乙腈∶水＝6∶4。波长280nm，流速0.8ml/min。

实施例9制备1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酰-Arg-Gly-Asp-Phe(2b)

1)制备1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酰-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl

按照实施例3的方法，由512mg(1.16mmol)1-乙酰基-β-咔啉-3-酰基-Trp与922mg(1.22mmol)HCl·Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl得200mg(16％)标题化合物，为淡黄色固体。ESI-MS(m/e)：1141[M+H]⁺。

2)制备1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酰-Arg-Gly-Asp-Phe

按照实施例8的方法，由200mg1-乙酰基-β-咔啉-3-酰基-Trp-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl得到30mg(19％)标题化合物，为淡黄色固体产品。ESI-MS(m/e)：914[M-H]^-.Mp：204.8-206.2℃；[α]_D ²⁵＝-19.8(c＝0.04，CH₃OH)，¹H NMR(800MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝12.18(s，1H)，10.89(s，1H)，9.05(s，1H)，8.62(d，J＝8.0Hz，1H)，8.55(d，J＝8.0Hz，1H)，8.50(d，J＝8Hz，1H)，8.38(m，1H)，7.84(d，J＝8Hz，1H)，7.68(d，J＝8Hz，1H)，7.63(m，1H)，7.32(m，4H)，7.19(m，5H)，7.15(m，2H)，6.87(m，1H)，4.93(m，1H)，4.38(m，2H)，4.21(m，1H)，3.98(m，1H)，3.58(m，2H)，3.11(m，1H)，3.02(m，1H)，2.94(m，2H)，2.89(m，1H)，2.77(s，3H)，2.66(m，4H)，2.29(m，1H)，1.67(m，1H)，1.53(m，1H)，1.46(m，1H)，1.27(m，2H)，0.87(m，1H)；HPLC纯度：95.8％，乙腈∶水＝1∶1。波长280nm，流速1.1ml/min。

实施例10制备1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酰-Arg-Gly-Asp-Ser(2c)

1)制备1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酰-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl

按照实施例3的方法，由700mg(1.59mmol)1-乙酰基-β-咔啉-3-酰基-Trp于100ml茄瓶中，冰浴下与HCl·Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl 1.1g(1.59mmol)反应，12hTLC监测。二氯-甲醇(二氯甲烷∶甲醇∶冰醋酸＝15∶1∶0.1)监测Rf＝0.35。二氯甲烷-甲醇(二氯∶甲醇＝35∶1)系统湿柱层析纯化得300mg淡黄色固体(产率17.64％)。ESI-MS(m/e)：1080[M+H]⁺。

2)制备1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酰-Arg-Gly-Asp-Ser

按照实施例8的方法，由200mg1-乙酰基-β-咔啉-3-酰基-Trp-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl得到20mg(13％)标题化合物，为淡黄色固体。ESI-MS(m/e)：855[M-H]^-.Mp：182.3-184℃；[α]_D ²⁵＝-24.7(c＝0.08，CH₃OH)，¹H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝12.19(s，1H)，10.97(s，1H)，9.08(s，1H)，8.70(m，2H)，8.66(d，J＝6.0Hz，1H)，8.60(d，J＝6Hz，1H)，8.44(d，J＝6Hz，1H)，7.83(d，J＝6Hz，1H)，7.65(m，3H)，7.39(m，4H)，7.03(m，1H)，6.97(m，1H)，4.97(m，1H)，4.38(m，2H)，4.36(m，2H)，4.28(m，1H)，3.87(m，2H)，3.55(m，4H)，2.98(m，1H)，2.78(m，2H)，2.69(s，3H)，2.30(m，1H)，1.92(m，2H)，1.57(m，4H)，1.29(s，1H)；HPLC纯度：95.2％，乙腈∶水＝1∶1.2。波长280nm，流速1ml/min。

实验例1测定化合物2a-c的透射电镜照片

将化合物2a-c按照1×10^-9M的浓度配置化合物的纯水溶液，均匀的铺在铜网上，在透射电镜(TEM，JEM-1230，JEOL)下观察化合物的纳米结构。得到的照片如图2。结果表明，化合物2a-c在水中均可形成纳米颗粒。RGDS修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸形成的纳米颗粒的直径为18-36nm，RGDV修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸的纳米颗粒的直径为17-47nm，和RGDF修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸的纳米颗粒的直径为16-56nm。

实验例2测定化合物2a-c的细胞毒作用

1)本发明的化合物2a-c用含0.1％DMSO的培养基配制成所需浓度；

2)实验用的肿瘤细胞为SH-SY5Y(人神经母细胞瘤细胞)，HL60(人早幼粒细胞白血病细胞)，HeLa(人宫颈癌细胞)，S180(鼠腹水瘤细胞)，HeCaT(人永生化表皮细胞)；

3)HL60和S180细胞株采用RPMI-1640培养基进行培养。HeLa、SH-SY5Y、HeCaT三株细胞采用DMEM培养基进行培养。培养基中均含10％经灭活的胎牛血清和1×10⁵U/L青霉素和100mg/L链霉素。

4)贴壁细胞的培养方法：分别将处于对数生长期且生长状态良好的HeLa、SH-SY5Y、HeCaT细胞以5×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μL，37.5℃、5％CO₂培养箱中培养8-10h，按预设的浓度梯度加入受试样品(受试样品经过预先灭菌)，对照组加入等体积的溶解样品的溶剂。继续培养48h(24h观察细胞状态)，每孔加25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，置于37℃孵育四个小时，排枪小心吸去上清液后每孔加入100μL的二甲基亚砜(DMSO)，振荡约15min溶解沉淀。立即于酶标仪上检测O.D.(吸光度)值，波长490nm。

5)悬浮细胞的培养方法：分别将处于对数生长期且生长状态良好的HL60和S180细胞以5×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μL，37.5℃、5％CO₂培养箱中培养8-10h，按预设的浓度梯度加入受试样品(受试样品经过预先灭菌)，对照组加入等体积的溶解样品的溶剂。继续培养48h(24h观察细胞状态)，每孔加25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，置于37℃孵育4h，离心，3000rpm，5min，排枪小心吸去上清液后每孔加入100μL的二甲基亚砜(DMSO)，振荡约15min溶解沉淀。立即于酶标仪上检测O.D.(吸光度)值，波长490nm。

6)按照以下计算公式求出每个样品浓度下的样品对肿瘤细胞的抑制率：

生长抑制率＝[(空白组平均O.D.值一样品组平均O.D.值)/空白组平均O.D.值]×100％，每个浓度下实验重复三次，取平均值。平均抑制率对药物浓度作图，并求出IC₅₀值(半数抑制浓度)，结果列入表1。化合物2a-c抑制5种肿瘤细胞增殖的IC₅₀均大于100μM，没有细胞毒作用。

表1 化合物2a-c抑制肿瘤细胞增殖的IC₅₀

实验例3评价化合物2a-c的抗肿瘤活性

受试化合物：1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸苄酯，化合物2a-c；

阳性对照药：阿霉素；

实验动物：ICR小鼠，雄性，体重20±2g(x±SD)；北京维通利华动物实验技术有限公司提供。给药组每组12只小鼠，空白及阳性对照组每组各15只小鼠。

瘤源：小鼠S180肉瘤，北京大学医学部动物实验中心提供，自行传代维持。

溶剂：受试化合物悬浮于0.5％羧甲基纤维素钠(CMCNa)溶液。阿霉素溶于生理盐水。

化合物2a-c组的S180小鼠口服给药，每天给药一次，剂量为0.1μmol/kg，连续给药10天。阴性对照组的S180小鼠口服生理盐水，每次0.2mL/只，连续给10天。阳性对照组的S180小鼠腹腔注射阿霉素，每天给药一次，剂量为2μmol/kg，连续给药10天。

采用自行传代的S180腹水瘤模型小鼠，取小鼠腹水S180瘤液，离心、去除杂质后，接种于健康小鼠腋下，构建S180实体瘤模型：在无菌条件下，处死腹水瘤小鼠，于75％酒精中浸泡10min消毒，取出小鼠于表面皿中晾干酒精，打开腹腔，抽取接种7天后生长旺盛S180腹水瘤瘤液，用生理盐水稀释成(瘤液∶生理盐水＝1∶2)的液体，混合，离心5min(1000转)，去除细胞碎片，取细胞液于生理盐水中，用新鲜配制的0.2％台盼蓝染色，混匀后按细胞计数方法计数，染蓝色者为死细胞，不染色者为活细胞，按如下公式计算细胞浓度和细胞存活率；

细胞浓度＝4大方格内活细胞数/4×10⁴×稀释倍数＝细胞数/mL；

细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％；

将存活率大于90％的瘤液用匀浆法制备成1×10⁷个/mL的细胞悬液，于健康小鼠腋皮下接种0.2mL/只，小鼠体重为20±2g。

每天观察各给药组动物的反应：小鼠的自主活动能力、精神状态、毛发颜色、呼吸状态、饮食情况、粪便性状。

每组连续给药7天后，于第8天称取小鼠体重，乙醚麻醉并脱颈椎处死，然后用镊子固定小鼠右腋肿瘤生长部位，剪开皮肤使肿瘤完全暴露，钝性剥离，称瘤重，以表示，结果列入表2。数据统计均采用t检验和方差分析。

可以看出，在阿霉素的给药剂量为2μmol/kg，化合物2a-c的给药剂量为0.1μmol/kg时对治疗小鼠的瘤重有等同的影响。可见，化合物2a-c的抗肿瘤作用比阿霉素强20倍。

表2 化合物2a-c对S180荷瘤小鼠瘤重的影响

n＝12；a)与生理盐水组比P＜0.01，与阿霉素比P＞0.05.

实验例4化合物2a-c抗肿瘤细胞粘附的活性

1)受试样品

化合物2a-c用含0.1％DMSO的DMEM培养基配制成100μM浓度。

2)细胞株

高转移的HCC-LM3细胞。

3)主要试剂

DMEM培养基干粉：购自Gibco公司；

PBS缓冲液：每1L溶液中含有NaCl 8.2g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄·H₂O 1.56g、KH₂PO₄0.2g，PH值7.4；

胎牛血清：购自Hyclone公司；

0.25％胰酶溶液：购自Hyclone公司；

青霉素、链霉素：购自石药集团中诺药业(石家庄)有限公司；

MTT(四噻唑蓝)：购自solarbio公司，溶于PBS溶液中，制成5mg/mL的溶液，过滤除菌后使用，避光保存；

DMSO(二甲基亚砜)：购自Hyclone公司；

Fn(人纤维连接蛋白)：购自Sigma公司。

4)实验方法

用PBS配制100μg/mL的Fn溶液，按100μL/孔加入96孔培养板中，将培养板置于4℃冰箱过夜。次日，吸除未包被的Fn溶液，用PBS洗一次，每孔加入含2％FBS的PBS溶液30μL封板，在37℃和5％CO₂的培养箱中孵育3小时，弃去各孔溶液。将生长状态良好、处于对数生长期的HCC-LM3细胞以5×10⁴个/mL的密度接种于包被Fn的96孔板中，每孔100μL，同时加入25μL2a-c的溶液，使其终浓度为20nM，在37℃、5％CO₂培养箱中培养2小时，用PBS洗去未粘附的细胞，弃去PBS后每孔加25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育4个小时，小心除去上清液后每孔加入100μL的DMSO，振荡约10min溶解沉淀，立即于酶标仪570nm波长下检测O.D.(吸光度)值。粘附抑制率的计算公式如下：粘附抑制率(％)＝[1-(2a-c组细胞OD值/空白组细胞OD值)]×100％；实验数据统计均采用t检验和方差分析，粘附抑制率以表示。

6)实验结果

化合物2a-c的抗细胞粘附实验结果列入表3。从结果中可以看出，化合物2a-c在2μM时有较弱的抗HCC-LM3细胞与FN粘附的作用，当浓度增大到20μM时，化合物2a-c抗HCC-LM3细胞与FN粘附的作用明显增强。

表3 化合物2a-c的体外抗肿瘤细胞粘附评价

实验例5化合物2a-c抗肿瘤细胞侵袭的活性

1)化合物2a-c用含0.1％DMSO的DMEM培养基配制成浓度为100μM的溶液。

2)细胞为高转移HCC-LM3。

3)基质胶为matrigel。

4)实验方法

将冻存于-20℃冰箱的基质胶matrigel 4℃过夜，变成液态；取720μL无血清DMEM培养基，加入180μL Matrigel，混匀，加入至Transwell小室的聚碳酸酯膜上室，100μL/个，放入37℃和5％CO₂培养箱中孵育5h。吸除小室中残留液体，每孔加入50μL DMEM培养基，37℃和5％CO₂培养箱中孵育30min。

HCC-LM3细胞消化之后，用无血清DMEM培养基洗3次，计数，配成细胞悬液，密度为2×10⁵个/mL。每孔加入100μL细胞悬液，同时加入25μL化合物2a-c的溶液，使其终浓度为20μM。空白对照加25μL含0.1％DMSO的DMEM培养基配制的溶液。下室加入600μL无血清DMEM培养基，在37℃和5％CO₂培养箱中培养48小时。

用棉签擦去基质胶和上室内的细胞之后，用4％的多聚甲醛固定细胞30min。吸除固定液，用PBS洗3次，用0.1％的结晶紫染液染色30min。吸除染色液，用PBS洗3次。

在每个小室选取9个大致相同的视野观察，拍照，计数。实验数据统计均采用t检验和方差分析，侵袭的细胞数以均值±SD表示。

5)结果见表4。可以看出，化合物2a-c的浓度为20μM时与空白对照组相比，具有明显的抗HCC-LM3细胞侵袭作用。与发明人公开的Lys-Glu抑制SACC-LM细胞侵袭的有效浓度为1mM相比，化合物2a-c的有效浓度降低了50倍。

表4 化合物2a-c浓度为20μM时的体外抗肿瘤细胞侵袭活性

n＝9；a)与空白对照组比p＜0.01。

实验例6化合物2a-c抗肿瘤细胞迁移的活性

1)化合物2a-c用含0.1％DMSO的DMEM培养基配制成浓度为100μM的溶液。

2)细胞为高转移HCC-LM3。

3)实验方法

HCC-LM3细胞消化之后，用无血清DMEM培养基洗3次，计数，配成细胞悬液，密度为5×10⁵个/mL。每孔加入100μL细胞悬液，同时加入25μL同时加入25μL化合物2a-c的溶液，使其终浓度为20μM。空白对照加25μL含0.1％DMSO的DMEM培养基配制的溶液。下室加入600μL无血清DMEM培养基，在37℃和5％CO₂培养箱中培养8小时。

用棉签擦去上室内的细胞之后，用4％的多聚甲醛固定细胞30min。吸除固定液，用PBS洗3次，用0.1％的结晶紫染液染色30min。吸除染色液，用PBS洗3次。

在每个小室选取9个大致相同的视野观察，拍照，计数。实验数据统计均采用t检验和方差分析，侵袭的细胞数以均值±SD表示。

4)结果见表5。可以看出，在20μM浓度下化合物2a-c与空白对照组比，发生迁移的细胞数均显著减少，说明在该条件下化合物2a-c具有明显的抗HCC-LM3细胞迁移作用。与发明人公开的Lys-Glu抑制HCC-LM3细胞迁移的有效浓度为1mM相比，化合物2a-c的有效浓度降低了50倍。

表5 20μM化合物2a-c的体外抗肿瘤细胞迁移活性

n＝9；a)与空白对照组组比p＜0.01.

实验例7化合物2a-c抗肿瘤转移的活性

受试化合物化合物2a-c

阳性对照药阿霉素

实验动物C57BL/6小鼠，SPF级，雄性C57BL小鼠，体重18-20g，6-8周，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。接种C57BL/6小鼠的瘤源为Lewis小鼠肺癌细胞(LLC)，由体外细胞培养，自行传代维持。

化合物2a-c加入少量的吐温80润湿助溶，逐渐加入0.5％CMCNa水溶液至所需要浓度即可。

化合物2a-c组小鼠口服给药。每天给药一次，给药剂量为0.1μmol/kg，连续给药10天。阴性对照组小鼠口服生理盐水。每天给药一次，剂量为0.2mL/只，连续给10天。阳性对照剂量为以腹腔注射阿霉素。每天给药一次，给药剂量为2μmol/kg，连续给药10天。

动物模型

1)Lewis小鼠肺癌细胞(LLC)，购自ATCC。选用DMEM培养，其中含10％经灭活的胎牛血清和1×10⁵U/L青霉素和100mg/L链霉素培养LLC细胞。按照贴壁细胞培养方法，每两天传代一次，富集细胞。

2)待细胞生长状态良好、处于对数生长期时，消化细胞。用生理盐水调整细胞浓度至1×10⁷/mL，胎盘蓝(Tryanblue)拒染实验示活细胞数＞95％。取近交系C57BL/6小鼠，雄性，左手固定小鼠，用75％乙醇消毒小鼠右前肢腋窝皮肤，右手持ImL无菌注射器于小鼠腋部皮下注射瘤细胞悬液0.2mL/只(含肿瘤细胞数约为2×10⁶/mL)。接种后8-10天可以生长成绿豆粒大的肿瘤，给药备用。

3)取接种8-10天生长良好的Lewis肺癌荷瘤小鼠，颈椎脱臼，用75％乙醇浸泡消毒10min，在超净工作台上剥离瘤体，选择生长良好的瘤组织，在无菌平皿中剪碎，放置于玻璃组织匀浆器内，按瘤块重(g)：生理盐水体积(mL)为1∶3的比例加入4℃预冷的生理盐水轻轻研磨，制成细胞悬液，过200目尼龙网制成单细胞悬液，用生理盐水调整细胞浓度至1×10⁷/mL，胎盘蓝(Tryanblue)拒染试验示活细胞数＞95％。

4)取近交系C57BL/6小鼠，雄性，左手固定小鼠，用75％乙醇消毒小鼠右前肢腋窝皮肤，右手持1mL无菌注射器于小鼠腋部皮下注射瘤细胞悬液0.2mL(含肿瘤细胞数约为2×10⁶/mL)。接种后8-10天可以生长成绿豆粒大的肿瘤，测量肿瘤体积，按肿瘤平均体积分组进行给药。

5)每天观察各给药组小鼠的自主活动能力、精神状态、毛发颜色、呼吸状态、饮食情况、粪便性状。

6)每组连续给药10天后，于第11天称取小鼠体重，乙醚麻醉并脱颈椎处死小鼠，然后用镊子固定小鼠右腋肿瘤生长部位，剪开皮肤使肿瘤完全暴露，钝性剥离，称重，以表示。

7)用镊子固定小鼠右腋部位，剪开皮肤使双肺完全暴露，钝性剥离双肺，称重，并迅速放入生理盐水中保存。统计双肺的瘤节转移数和转移例数。

8)实验结果列入表6和表7。从表6可知，在0.1μmol/kg的给药剂量下，化合物2a-c有效地抑制Lewis瘤生长。剂量比阿霉素低20倍时，化合物2a-c抑制Lewis瘤生长的活性与阿霉素没有统计学差异。可见，化合物2a-c抑制Lewis瘤生长的活性是阿霉素的20倍。从表7可知，在0.1μmol/kg的给药剂量下，化合物2a-c有效地减少瘤节转移例数和转移个数。

表6 化合物2a-c抑制Lewis肺癌的活性

n＝12；a)与生理盐水组比P＜0.01，与阿霉素组比P＞0.05。

表7 化合物2a-c在Lewis肺癌转移模型中的转移瘤节和转移例数

n＝12；a)与生理盐水组比P＜0.01。

Claims (5)

1.下式结构的RGDV/F/S修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸，

式中RGDV/F/S代表Arg-Gly-Asp-Val,Arg-Gly-Asp-Phe和Arg-Gly-Asp-Ser三种四肽。

2.权利要求1的RGDV/F/S修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸的制备方法,该方法由以下步骤构成:

(1)室温下,L-Trp-OMe与1,3-二羟基丙酮在稀盐酸条件下反应48h,过滤得到滤饼，滤饼溶解于二氧六环,得到的溶液在冰盐浴下用2N的NaOH水溶液调节pH至12,反应10h,得到1-乙酰基-β-咔啉酰-3-羧酸；

(2)1-乙酰基-β-咔啉酰-3-羧酸与L-Trp-OBzl反应并皂化制备1-乙酰基-β-咔啉酰-3-色氨酸；

(3)Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl,Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl,Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl与1-乙酰基-β-咔啉酰-3-色氨酸偶联,制备Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl,Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl和Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸；

(4)将Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl,Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl和Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸脱保护,制备权利要求1的RGDV/F/S修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸。

3.权利要求1的RGDV/F/S修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸的纳米颗粒。

4.权利要求1的RGDV/F/S修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸在制备抗肿瘤药物中的应用。

5.权利要求1的RGDV/F/S修饰的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸在制备抗肿瘤转移药物中的应用。