CN103665107A - 同时具溶血栓、清除自由基和血栓靶向功能的新颖化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种同时具有溶血栓、清除自由基和血栓靶向/抗血栓三种功能的新颖化合物及其制备方法和用途。本发明以连接臂将溶血栓肽、自由基清除剂和血栓靶向/抗血栓肽组合在一起形成三元缀合物，得到集跨血脑屏障、溶血栓、清除自由基、血栓靶向/抗血栓等作用于一体的所述化合物。本发明还涉及含有所述化合物的药物组合物，其中所述化合物形成纳米球结构。本发明化合物具有较高的清除NO自由基活性、优异的溶血栓活性和血栓靶向/抗血栓活性。本发明化合物还具有优异的抗缺血性中风活性，可制备成治疗脑梗塞的临床药物。

Description

同时具溶血栓、清除自由基和血栓靶向功能的新颖化合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种同时具有溶血栓、清除NO自由基和血栓靶向/抗血栓三种功能的新颖化合物及其制备方法和用途。本发明进一步涉及以含有羧基和氨基的连接臂将含PAK(Pro-Ala-Lys)序列的溶血栓寡肽、1-(4-氧乙酰基-苯基)-3，3，4，4-四甲基-咪唑啉及含RGD(Arg-Gly-Asp)序列的血栓靶向肽/抗血栓寡肽连接在一起形成的“含PAK序列肽/咪唑啉/含RGD序列肽”的新颖三元缀合物。本发明还涉及包含所述化合物的用于清除NO自由基、溶血栓、血栓靶向/抗血栓和治疗中风/脑梗塞的药物组合物。本发明同时还涉及所述化合物的制备方法。
背景技术
在全球范围内，血栓性疾病的发病率和死亡率都居首位。冠状动脉血栓，导致心梗。脑血管栓塞，导致脑梗，也就是临床上的缺血性中风。心梗患者既可以静脉注射溶栓药物，也可以施以搭桥手术。必须指出，给心梗患者静脉注射溶栓药物的正面结果是缺血再灌注。由于缺血再灌注过程中产生大量NO自由基，所以溶栓过程与心肌损伤及患者死亡相联系。这是目前溶栓治疗心梗的严重问题。目前，脑梗治疗面临的问题更复杂。例如现有溶栓药物都不能有效地跨过血脑屏障，以至于静脉注射溶栓药物对脑梗患者的疗效极其有限。又例如目前还没有适宜的手术可以救治脑梗患者。同样，给脑梗患者静脉注射溶栓药物即使有正面结果，缺血再灌注过程中也会产生大量NO自由基，使溶栓过程与脑组织损伤及患者死亡相联系。这是目前溶栓治疗脑梗的严重问题。再者，中风患者的临床治疗面临四个难题：1)除tPA(tissue-type plasminogen activator，组织型纤溶酶原激活剂)外，没有其它药物可对中风患者显示疗效；2)tPA治疗只在患者中风3小时之内显示疗效，即tPA只有3小时治疗黄金期；3)tPA治疗通常引起全身出血；4)tPA治疗无法避免缺血再灌注过程中产生的大量NO自由基对患者造成的脑组织损伤及患者死亡。只有解决了这四个难题，中风患者的临床治疗才可能获得实质性突破。
在中国专利申请公布号CN102807604和CN102807605的申请案中，公开了Nα-(1，3-二氧-4，4，5，5-四甲基咪唑啉-2-苯基-4’-氧乙酰基)-nω-脂肪酰基-Lys-Arg-Gly-Asp-Val和Nα-(1，3-二氧-4，4，5，5-四甲基咪唑啉-2-苯基-4’-氧乙酰基)-nω-脂肪酰基-Lys-Arg-Gly-Asp-Phe两种化合物。这两种化合物是将具清除NO自由基活性的咪唑啉与含RGD序列(Arg-Gly-Asp)的抗血栓寡肽以赖氨酸组合。与本发明的化合物不同，此两种化合物中没有连接溶栓肽。由是此两种化合物没有溶血栓作用，不适用于制备溶血栓药物，且不适用于治疗缺血性中风的患者。
为解决上述问题，需要一种同时具有溶血栓、清除NO自由基和血栓靶向/抗血栓作用的新颖化合物。并且，这样的新颖化合物要能够有在患者中风3小时之后显示疗效，即不受使用tPA的3小时治疗黄金期的限制；没有tPA样的全身出血反应；且能够清除缺血再灌注过程中产生的大量NO自由基。
发明内容
本发明提供一种集跨血脑屏障、溶血栓、抗血栓和清除NO自由基活性作用于一体的三元缀合物，其中所述三元是指具清除NO自由基活性的咪唑啉类、具溶血栓活性肽及血栓靶向肽，其通过适合的连接臂连接在一起。
具体而言，本发明之三元缀合物可以式I化合物表示：
Figure BSA00000860797200021
其中，NN代表具清除NO自由基活性的咪唑啉类；AA1代表具有至少三个连接用基团的连接臂；AA2代表具溶血栓活性肽；AA3代表血栓靶向肽。
可用于本发明的咪唑啉类包含Nitronyl Nitroxides(NN)类咪唑类氮氧自由基，其能够清除NO，还具有清除氧自由基的功能，对氧自由基损伤的细胞有很强的保护作用。本发明的具清除NO自由基活性的咪唑啉类，较佳是1，3-二氧基-2-[(4-氧乙酸)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉，其具有突出的化学稳定性和物理，即不仅可用于与溶血栓活性肽及血栓靶向肽缀合的任何化学反应，而且在储存过程中不容易分解，因而可满足制剂需求。
可用于本发明的连接臂具有至少三个连接用基团，例如：羧基和氨基，用以将咪唑啉类、具溶血栓活性肽、血栓靶向肽这三者连接在一起。本发明的连接臂可为天然氨基酸，例如：L-Lys、L-Asp和L-Glu。当用于本发明的连接臂(AA1)具有三个以上的连接用基团时，可接一个以上的NN、AA2、或AA3；其中两个以上的NN、AA2、或AA3可为相同或不同。例如，当AA1有四个连接用基团时，可接一个NN、两个AA2、和一个AA3；此时两个AA2可为相同或不同的溶血栓活性肽。
可用于本发明的具溶血栓活性肽可为含PAK(Pro-Ala-Lys)序列、AKP(Ala-Lys-Pro)序列或KAP(Lys-Ala-Pro)序列的寡肽或包含以PAK序列、AKP序列或KAP序列为结构单元的重复序列肽。寡肽是指分子量在1000道尔顿(D)以下的小分子肽，一般由3至8个氨基酸组成。本发明的具溶血栓活性寡肽可为含PAK序列、AKP序列或KAP序列的三肽至八肽，较佳为含PAK序列、AKP序列或KAP序列的三肽至五肽。举例来说，可用于本发明的含PAK序列、AKP序列或KAP序列的寡肽可为PAK、RPAK(Arg-Pro-Ala-Lys)、ARPAK(Ala-Arg-Pro-Ala-Lys)、GRPAK(Gly-Arg-Pro-Ala-Lys)、QRPAK(Gln-Arg-Pro-Ala-Lys)、AKP、KAP、KPAK(Lys-Pro-Ala-Lys)、PAKP(Pro-Ala-Lys-Pro)、AKPAK(Ala-Lys-Pro-Ala-Lys)或PAKPA(Pro-Ala-Lys-Pro-Ala)。举例来说，可用于本发明的以PAK序列、AKP序列或KAP序列为结构单元的重复序列肽可为在中国专利申请公布号CN101190941的申请案中公布的一系列具有溶血栓活性的肽，包含以PAK为结构单元合成的重复序列肽(PAK)2、(PAK)3、(PAK)4、(PAK)5和(PAK)6；以AKP为结构单元合成的重复序列肽(AKP)2、(AKP)3、(AKP)4、(AKP)5和(AKP)6；及以KPA为结构单元合成的重复序列肽(KPA)2、(KPA)3、(KPA)4、(KPA)5和(KPA)6。
可用于本发明的血栓靶向/抗血栓肽可为含RGD序列(Arg-Gly-Asp)的寡肽。含RGD序列的寡肽可为RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser)、RGDV(Arg-Gly-Asp-Val)和RGDF(Arg-Gly-Asp-Phe)等RGD四肽。纤维蛋白原(Fibrinogen，Fg)和活化血小板膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)IIb/IIIa受体的特异性结合是各种生理性诱导剂引起血小板聚集的最终共同通道，在血栓形成中起着重要作用。而RGD序列则是配体Fg和活化GPIIb/IIIa受体结合的活性位点，具有活化血小板靶向性。含RGD序列的结构物可竞争性地抑制和阻断Fg和GPIIb/IIIa受体的结合，从而阻断血小板聚集和血栓的形成，使含RGD的寡肽成为有效的血栓靶向分子与抗血栓剂。
另外，可用于本发明的血栓靶向肽可为在中国专利申请公布号CN101190940的申请案中公开的一系列有靶向抗血栓活性的多肽，包含对RGD肽与YIGS(Tyr-Ile-Gly-Ser)肽进行缀合式修饰而得的多肽。这些修饰而得的多肽可为YIGSRRGDS、YIGSRRGDV、YIGSRRGDF、YIGSRYIGSK、YIGSRYIGSR、YIGSKRGDS、YIGSKRGDF、YIGSKRGDV、YIGSKYIGSK、YIGSKYIGSR、RGDSRGDS、RGDVRGDV、RGDFRGDF、RGDSYIGSR、RGDSYIGSK、RGDVYIGSR、RGDVYIGSK、RGDFYIGSR、或RGDFYIGSK。
在一较佳实施例中，本发明化合物中具清除NO自由基活性的咪唑啉类为1，3-二氧基-2-[(4-氧乙酸)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉；具溶血栓活性肽为含PAK序列(Pro-Ala-Lys)的寡肽；且血栓靶向肽为含RGD序列(Arg-Gly-Asp)的寡肽。据此，本发明提供了一种集跨血脑屏障、溶血栓、抗血栓和清除NO自由基活性作用于一体的“含PAK序列肽/咪唑啉/含RGD序列肽”三元缀合物。
在一实施例中，本发明化合物中具清除NO自由基活性的咪唑啉类为1，3-二氧基-2-[(4-氧乙酸)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉；连接臂为L-Lys；具溶血栓活性肽为含PAK序列(Pro-Ala-Lys)的寡肽；且血栓靶向肽为含RGD序列(Arg-Gly-Asp)的寡肽。其中，含PAK序列的寡肽可为ARPAK五肽、GRPAK五肽、RPAK四肽或PAK三肽；且含RGD序列的寡肽可为RGD四肽，例如RGDS、RGDV或RGDF。当以L-Lys为连接臂时，本发明化合物可为以下通式I-1或I-2：
Figure BSA00000860797200041
其中aa1和aa2可为同时存在、aa1存在但aa2不存在、或同时不存在；当其同时存在时，aa1为R(Arg)，且aa2为G(Gly)、A(Ala)或Q(Gln)；当aa1存在但aa2不存在时，aa1为R(Arg)；aa3可为S(Ser)，V(Val)，或F(Phe)。
以通式I-1化合物为例，在一较佳实施例中，本发明化合物可为如以下通式I-1-1表示的ARPAK/咪唑啉/RGD三元缀合物；在另一较佳实施例中，本发明化合物可为如以下通式I-1-2表示的GRPAK/咪唑啉/RGD三元缀合物；在又一较佳实施例中，本发明化合物可为如以下通式I-1-3表示的RPAK/咪唑啉/RGD三元缀合物；且在再一较佳实施例中，本发明化合物可为如以下通式I-1-4表示的PAK/咪唑啉/RGD三元缀合物：
Figure BSA00000860797200042
aa3可为S(Ser)，V(Val)，或F(Phe)，且较佳为V(Val)。
以通式I-2化合物为例，本发明化合物可较佳为以下通式I-2-1、I-2-2、I-2-3或I-2-4：
aa3可为S(Ser)，V(Val)，或F(Phe)，且较佳为V(Val)。
另一实施例中，本发明化合物中具清除NO自由基活性的咪唑啉类为1，3-二氧基-2-[(4-氧乙酸)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉；连接臂为L-Asp；具溶血栓活性肽为含PAK序列(Pro-Ala-Lys)的寡肽；且所述血栓靶向肽为含RGD序列(Arg-Gly-Asp)的寡肽。当以L-Asp为连接臂时，本发明化合物可为以下通式I-3或I-4：
Figure BSA00000860797200052
其中aa1和aa2可为同时存在、aa1存在但aa2不存在、或同时不存在；当其同时存在时，aa1为R(Arg)，且aa2为G(Gly)、A(Ala)或Q(Gln)；当aa1存在但aa2不存在时，aa1为R(Arg)；aa3可为S(Ser)，V(Val)，或F(Phe)。aa1较佳为R(Arg)；aa2较佳为G(Gly)；且aa3较佳为V(Val)。
以通式I-3化合物为例，本发明化合物可较佳为以下通式I-3-1、I-3-2、I-3-3或I-3-4：
Figure BSA00000860797200061
aa3可为S(Ser)，V(Val)，或F(Phe)，且较佳为V(Val)。
以通式I-4化合物为例，本发明化合物可较佳为以下通式I-4-1、I-4-2、I-4-3或I-4-4：
Figure BSA00000860797200062
aa3可为S(Ser)，V(Val)，或F(Phe)，且较佳为V(Val)。
又一实施例中，本发明化合物中具清除NO自由基活性的咪唑啉类为1，3-二氧基-2-[(4-氧乙酸)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉；连接臂为L-Glu；具溶血栓活性肽为含PAK序列(Pro-Ala-Lys)的寡肽；且血栓靶向肽为含RGD序列(Arg-Gly-Asp)的寡肽。当以L-Glu为连接臂时，本发明化合物可为以下通式I-5或I-6：
Figure BSA00000860797200071
其中aa1和aa2可为同时存在、aa1存在但aa2不存在、或同时不存在；当其同时存在时，aa1为R(Arg)，且aa2为G(Gly)、A(Ala)或Q(Gln)；当aa1存在但aa2不存在时，aa1为R(Arg)；aa3可为S(Ser)，V(Val)，或F(Phe)。aa1较佳为R(Arg)；aa2较佳为G(Gly)；且aa3较佳为V(Val)。
以通式I-5化合物为例，本发明化合物可较佳为以下通式I-5-1、I-5-2、I-5-3或I-5-4：
Figure BSA00000860797200072
aa3可为S(Ser)，V(Val)，或F(Phe)，且较佳为V(Val)。
以通式I-6化合物为例，本发明化合物可较佳为以下通式I-6-1、I-6-2、I-6-3或I-6-4：
Figure BSA00000860797200081
aa3可为S(Ser)，V(Val)，或F(Phe)，且较佳为V(Val)。
又一方面，本发明还涉及一种药物组合物，包含前述的本发明化合物，及药学上可接受的载剂。本发明药物组合物较佳是包含前述通式I-1、I-2、I-3、I-4、I-5、或I-6的化合物。本发明药物组合物更佳是包含通式I-1-1、I-1-2、I-1-3或I-1-4的化合物。当本发明药物组合物包含通式I-1-1、I-1-2、I-1-3或I-1-4的化合物时，这些化合物在药物组合物中可形成二聚体、三聚体或四聚体结构，并且可形成直径为2nm至300nm的纳米球。在本发明药物组合物中，所述纳米球结构更佳是具有2nm至100nm的直径。纳米药学的一个公知的事实是，直径小于100nm的纳米球在血液在输送不易被巨噬细胞吞噬，容易跨过毛细血管壁。这些性能使得本发明的化合物可跨过血脑屏障。本发明药物组合物可作为溶血栓药物，用于治疗心肌梗塞(Mmyocardial infarction)、中风(Ischemic stroke)、静脉栓塞(Deep vein thrombosis)、肺栓塞(Pulmonary embolism)、周边动脉阻塞性疾病(Peripheral arterial occlusive disease)、静脉导管阻塞(occludedcentral vascular access devices)、动静脉廔管及分流管阻塞(Clotted arteriovenous fistulaand shunts)、和颈动脉狭窄(Carotid Stenosis)等疾病。本发明药物组合物亦可作为清除NO自由基药物，用于治疗神经退化疾病(Neurodegenerative diseases)，例如阿尔茨海默氏病(Alzheimer′s disease)、帕金森氏症(Parkinson′s disease)、运动神经元病(motorneuron diseases)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis)、噪声聋(Noise-induced hearing loss)、卢贾里格症(Lou Gehrig′s disease、或亨廷顿病性痴呆(Huntington′s disease)；用于治疗心血管疾病(Cardiovascular disease)，例如动脉粥样硬化(Atherosclerosis)、冠心病(Coronary heart disease)、或心肌梗死(Myocardial infarction)；用于治疗精神疾病，例如躁郁症(Bipolar disorder)、精神分裂症(Schizophrenia)、或自闭症(Autism)；及用于治疗高地综合症(Altitude sickness)、糖尿病、类风湿性关节炎、创伤性脑损伤(Traumatic brain injury)、癌症、X染色体易裂症(Fragile X syndrome)、镰刀型红血球疾病(Sickle Cell Disease)、扁平苔藓(Lichen planus)、白斑病(Vitiligo)、或慢性疲劳症候群(Chronic fatigue syndrome)等疾病。本发明药物组合物还可作为血栓靶向/抗血栓药物，用于治疗血小板增多症(Thrombocytosis)、骨髓增生性疾病(myeloproliferative disease)、真性红细胞增多症(Polycythemia vera)、或布卡综合征(Budd-Chiari syndrome)等疾病。本发明药物组合物也可作为治疗中风或脑梗药物，更佳用于治疗发病超过3小时、4小时、6小时和24小时的中风或脑梗，且以连续给药方式来治疗。本发明药物组合物/化合物同时具有清除NO自由基、溶血栓、和抗血栓/血栓靶向的功能，因此能够在患者中风3小时之后仍然保持疗效，即不受使用tPA的3小时治疗黄金期的限制；不会造成tPA样的全身出血反应；和能够清除缺血再灌注过程中产生的大量NO自由基，使患者在治疗时脑神经组织免受损伤。本发明药物组合物中，所述化合物的纳米结构可达成跨过血脑屏障、溶血栓、血栓靶向/抗血栓和清除缺血再灌注过程中产生的NO自由基的作用最大化。
本发明药物组合物可为任何一种临床可接受的适宜制剂，例如，可以是注射制剂(粉针、冻干粉针、水针、输液等)、片剂、口服液、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊或滴丸等；其中，药学上可接受的载剂可为木糖醇、甘露醇、乳糖、果糖、葡聚糖、葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮、低分子右旋糖酐、氯化钠、葡萄糖酸钙或磷酸钙中的一种或几种。另外，本发明药物组合物还可包含辅料，所述的辅料可以是抗氧络合剂、填充剂、骨架材料等。
再一方面，本发明还涉及前述式I化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)提供具清除NO自由基活性的咪唑啉类(NN)、具有至少三个连接用基团的连接臂(AA1)、具溶血栓活性肽(AA2)及血栓靶向肽(AA3)，其中连接臂具有第一连接用基团、第二连接用基团及第三连接用基团；
(2)在适当反应条件下，连接具清除NO自由基活性的咪唑啉类(NN)与连接臂(AA1)的第一连接用基团，形成通式IM-1化合物：
NN-AA1(IM-1)：
(3)在适当反应条件下，连接具溶血栓活性肽(AA2)与通式IM-1化合物，其中具溶血栓活性肽的一端与连接臂的第二连接用基团相连接，形成通式IM-2化合物：
NN-AA1-AA2(IM-2)；及
(4)在适当反应条件下，连接血栓靶向肽(AA3)与通式IM-2化合物，其中血栓靶向肽的一端与连接臂的第三连接用基团相连接而形成通式I化合物；
其中步骤(3)与步骤(4)的顺序可以交换。
本发明的制备方法，在步骤(1)更包含将连接臂(AA1)的第二和第三连接用基团以保护基保护，且将具溶血栓活性肽(AA2)和血栓靶向肽(AA3)上除连接用一端外的活性基团以保护基保护；步骤(3)更包含先将受保护的第二连接用基团去保护，再将具溶血栓活性肽与去保护的第二连接用基团相连接；步骤(4)更包含先将受保护的第三连接用基团去保护，再将血栓靶向肽与去保护的第三连接用基团相连接；且步骤(4)后更包含将具溶血栓活性肽(AA2)和血栓靶向肽(AA3)上受保护的活性基团去保护。利用加上保护基和去除保护基的技术，可以控制NN、AA2和AA3与连接臂连接的次序和位置；待组合完成后再将其它活性基团上的保护基去保护。适当反应条件是指多肽合成中的常规条件。可用于本发明制备方法的NO自由基活性的咪唑啉类(NN)、具有至少三个连接用基团的连接臂(AA1)、具溶血栓活性肽(AA2)及血栓靶向肽(AA3)与前述用于本发明式I化合物中的定义相同。
本发明制备方法可由以下更详细的说明来进一步了解。
在一实施例中，本发明制备方法的连接臂的第一连接用基团为氨基，且所述第二和第三连接用基团选自羧基和氨基。
本发明制备方法的较佳实施例中，具清除NO自由基活性的咪唑啉类为1，3-二氧基-2-[(4-氧乙酸)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉；连接臂为L-Lys；具溶血栓活性肽为含PAK序列(Pro-Ala-Lys)的寡肽；且血栓靶向肽为含RGD序列(Arg-Gly-Asp)的寡肽。当以L-Lys为连接臂时，可有以下两种接合方式：
(1)1，3-二氧基-2-[(4-氧乙酸)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉与L-Lys连接臂的一氨基相连接；含PAK序列的寡肽上的羧基与L-Lys连接臂的另一氨基相连接；且含RGD序列的寡肽上的氨基与L-Lys连接臂的羧基相连接(如前述通式I-1化合物所示)；或
(2)1，3-二氧基-2-[(4-氧乙酸)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉与L-Lys连接臂的一氨基相连接；含PAK序列的寡肽上的氨基与L-Lys连接臂的羧基相连接；且含RGD序列的寡肽上的羧基与L-Lys连接臂的另一氨基相连接(如前述通式I-2化合物所示)。
以通式I-1化合物为例，当制备通式I-1-1、I-1-2、I-1-3或I-1-4化合物时，本发明制备方法可为图1-4所示的合成路线。图1为制备通式I-1-1化合物的合成路线图；图2为制备通式I-1-2化合物的合成路线图；图3为制备通式I-1-3化合物的合成路线图；图4为制备通式I-1-4化合物的合成路线图。图1至图4中，aa3如前所述，可为S(Ser)，V(Val)，或F(Phe)。以通式I-1-2化合物为例，本发明的制备方法说明如下：
(1)制备1，3-二氧基-2-(4-氧乙酸基-苯基)-4，4，5，5-四甲基咪唑啉；
(2)制备1，3-二氧基-2-[(4’-氧乙酰基-Lys-OMe)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉(在Lys连接臂的羧基以保护基保护)；
(3)制备HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl，HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-Obzl或HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-Obzl；
(4)制备Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)；
(5)将Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)连接到1，3-二氧基-2-[(4’-氧乙酰基-Lys-OMe)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉的赖氨酸上得到1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉；
(6)将HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl，HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-Obzl或HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-Obzl分别与1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉相缀合分别得到1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉，1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(NO2)-Gly-Asp-(OBzl)-Val-OBzl}苯基}-4，4，5，5-四甲基-咪唑啉或1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉；
(7)将步骤(6)所制备的化合物脱去保护基，得到1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Gly-Arg-Pro-Ala-Lys]-Lys-Arg-Gly-Asp-Ser}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉，1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Gly-Arg-Pro-Ala-Lys]-Lys-Arg-Gly-Asp-Val}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉或1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Gly-Arg-Pro-Ala-Lys]-Lys-Arg-Gly-Asp-Phe}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉。
在制备通式I-1-1、I-1-3、和I-1-4化合物时，则是将步骤(4)中的“Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)”置换为“Boc-Ala-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)”、“Boc-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)”、和“Boc-Pro-Ala-Lys(Z)”来执行上述的制程步骤。
含PAK序列的寡肽与含RGD序列的寡肽可依组合设计的需要，在适当位置的活性基团上以保护基保护，以选择序列的一端(含可与连接臂接合的活性基团)来和连接臂的活性基团结合。组合含PAK序列的寡肽与含RGD序列的寡肽的步骤可以交换顺序，例如，先与含RGD序列的寡肽组合，再与含PAK序列的寡肽组合。
活性基团包含氨基或羧基等可进行缩合反应的基团。氨基的保护基可为苄氧羰基(CBz)、叔丁氧羰基(Boc)、9-芴甲氧羰基(Fmoc)、苄基(Bn)或对甲氧苯基(PMP)。羧基的保护基可为甲基酯(OMe)、苄基酯(OBn)、苄甲基酯(OBzl)、叔丁基酯(OBUT)、或硅基酯(OSi(CH3)3)。
以通式I-2化合物为例，当制备通式I-2-1、I-2-2、I-2-3或I-2-4化合物时，本发明制备方法可为图5-8所示的合成路线。图5为制备通式I-2-1化合物的合成路线图；图6为制备通式I-2-2化合物的合成路线图；图7为制备通式I-2-3化合物的合成路线图；图8为制备通式I-2-4化合物的合成路线图。图5至图8中，aa3如前所述，可为S(Ser)，V(Val)，或F(Phe)。在合成通式I-2-1、I-2-2、I-2-3或I-2-4化合物时，可先制备1，3-二氧基-2-[(4’-氧乙酰基-Lys-OMe)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉，然后将含RGD序列的寡肽的C端与Lys连接臂的氨基先组合；最后将含PAK序列的寡肽的N端与去保护后的连接臂的羧基组合。
在另一实施例中，本发明制备方法的具清除NO自由基活性的咪唑啉类为1，3-二氧基-2-[(4-氧乙酸)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉；连接臂为L-Asp；具溶血栓活性肽为含PAK序列(Pro-Ala-Lys)的寡肽；血栓靶向肽为含RGD序列(Arg-Gly-Asp)的寡肽；且其中1，3-二氧基-2-[(4-氧乙酸)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉与L-Asp连接臂的氨基相连接；含PAK序列的寡肽上的氨基与L-Asp连接臂的一羧基相连接；且含RGD序列的寡肽上的氨基与L-Asp连接臂的另一羧基相连接(如前述通式I-3或I-4化合物所示)。
以通式I-3化合物为例，当制备通式I-3-1、I-3-2、I-3-3或1-3-4化合物时，本发明制备方法可为图9-12所示的合成路线。图9为制备通式I-3-1化合物的合成路线图；图10为制备通式I-3-2化合物的合成路线图；图11为制备通式I-3-3化合物的合成路线图；图12为制备通式I-3-4化合物的合成路线图。图9至图12中，aa3如前所述，可为S(Ser)，V(Val)，或F(Phe)。在合成通式I-3-1、I-3-2、I-3-3或I-3-4化合物时，可先制备1，3-二氧基-2-[(4’-氧乙酰基-Asp-OMe)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉，然后将含PAK序列的寡肽的N端与Asp连接臂的一羧基先组合；最后将含RGD序列的寡肽的N端与去保护后的Asp连接臂的另一羧基组合。
以通式I-4化合物为例，当制备通式I-4-1、I-4-2、I-4-3或I-4-4化合物时，本发明制备方法可为图13-16所示的合成路线。图13为制备通式I-4-1化合物的合成路线图；图14为制备通式I-4-2化合物的合成路线图；图15为制备通式I-4-3化合物的合成路线图；图16为制备通式I-4-4化合物的合成路线图。图13至图16中，aa3如前所述，可为S(Ser)，V(Val)，或F(Phe)。在合成通式I-4-1、I-4-2、I-4-3或I-4-4化合物时，可先制备1，3-二氧基-2-[(4’-氧乙酰基-Asp-OMe)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉，然后将含RGD序列的寡肽的N端与Asp连接臂的一羧基先组合；最后将含PAK序列的寡肽的N端与去保护后的Asp连接臂的另一羧基组合。
在又一实施例中，本发明制备方法的具清除NO自由基活性的咪唑啉类为1，3-二氧基-2-[(4-氧乙酸)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉；连接臂为L-Glu；具溶血栓活性肽为含PAK序列(Pro-Ala-Lys)的寡肽；且血栓靶向肽为含RGD序列(Arg-Gly-Asp)的寡肽；且其中1，3-二氧基-2-[(4-氧乙酸)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉与L-Glu的氨基相连接；含PAK序列的寡肽上的氨基与L-Glu连接臂的一羧基相连接；且含RGD序列的寡肽上的氨基与L-Glu连接臂的另一羧基相连接(如前述通式I-5或I-6化合物所示)。
以通式I-5化合物为例，当制备通式I-5-1、I-5-2、I-5-3或I-5-4化合物时，本发明制备方法可为图17-20所示的合成路线。图17为制备通式I-5-1化合物的合成路线图；图18为制备通式I-5-2化合物的合成路线图；图19为制备通式I-5-3化合物的合成路线图；图20为制备通式I-5-4化合物的合成路线图。图17至图20中，aa3如前所述，可为S(Ser)，V(Val)，或F(Phe)。在合成通式I-5-1、I-5-2、I-5-3或I-5-4化合物时，可先制备1，3-二氧基-2-[(4’-氧乙酰基-Glu-OMe)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉，然后将含RGD序列的寡肽的N端与Glu连接臂的一羧基先组合；最后将含PAK序列的寡肽的N端与去保护后的Glu连接臂的另一羧基组合。
以通式I-6化合物为例，当制备通式I-6-1、I-6-2、I-6-3或I-6-4化合物时，本发明制备方法可为图21-24所示的合成路线。图21为制备通式I-6-1化合物的合成路线图；图22为制备通式I-6-2化合物的合成路线图；图23为制备通式I-6-3化合物的合成路线图；图24为制备通式I-6-4化合物的合成路线图。图21至图24中，aa3如前所述，可为S(Ser)，V(Val)，或F(Phe)。在合成通式I-6-1、I-6-2、I-6-3或I-6-4化合物时，可先制备1，3-二氧基-2-[(4’-氧乙酰基-Glu-OMe)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉，然后将含PAK序列的寡肽的N端与Glu连接臂的一羧基先组合；最后将含RGD序列的寡肽的N端与去保护后的Glu连接臂的另一羧基组合。
前述制备方法中含PAK序列的寡肽可为ARPAK(Ala-Arg-Pro-Ala-Lys)，GRPAK(Gly-Arg-Pro-Ala-Lys)，QRPAK(Gln-Arg-Pro-Ala-Lys)，RPAK(Arg-Pro-Ala-Lys)或PAK(Pro-Ala-Lys)；且含RGD序列的寡肽可为RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser)、RGDV(Arg-Gly-Asp-Val)或RGDF(Arg-Gly-Asp-Phe)。
本发明的化合物或药物组合物在大鼠体内NO清除活性试验中表明，具有较高的清除NO自由基活性；在体内外溶血栓和抗血栓活性试验中表明，具有优异的溶血栓和抗血栓活性；在大鼠体内抗中风活性试验中证明，可以有效地保护中风大鼠的神经功能，具有优异的抗中风活性；在中风大鼠大脑梗死体积试验中表明，可以有效地可以降低中风大鼠大脑梗死体积。
附图说明
图1为本发明化合物一实施例(通式I-1-1化合物)的合成路线图；
图2为本发明化合物一实施例(通式I-1-2化合物)的合成路线图；
图3为本发明化合物一实施例(通式I-1-3化合物)的合成路线图；
图4为本发明化合物一实施例(通式I-1-4化合物)的合成路线图；
图5为本发明化合物一实施例(通式I-2-1化合物)的合成路线图；
图6为本发明化合物一实施例(通式I-2-2化合物)的合成路线图；
图7为本发明化合物一实施例(通式I-2-3化合物)的合成路线图；
图8为本发明化合物一实施例(通式I-2-4化合物)的合成路线图；
图9为本发明化合物一实施例(通式I-3-1化合物)的合成路线图；
图10为本发明化合物一实施例(通式I-3-2化合物)的合成路线图；
图11为本发明化合物一实施例(通式I-3-3化合物)的合成路线图；
图12为本发明化合物一实施例(通式I-3-4化合物)的合成路线图；
图13为本发明化合物一实施例(通式I-4-1化合物)的合成路线图；
图14为本发明化合物一实施例(通式I-4-2化合物)的合成路线图；
图15为本发明化合物一实施例(通式I-4-3化合物)的合成路线图；
图16为本发明化合物一实施例(通式I-4-4化合物)的合成路线图；
图17为本发明化合物一实施例(通式I-5-1化合物)的合成路线图；
图18为本发明化合物一实施例(通式I-5-2化合物)的合成路线图；
图19为本发明化合物一实施例(通式I-5-3化合物)的合成路线图；
图20为本发明化合物一实施例(通式I-5-4化合物)的合成路线图；
图21为本发明化合物一实施例(通式I-6-1化合物)的合成路线图；
图22为本发明化合物一实施例(通式I-6-2化合物)的合成路线图；
图23为本发明化合物一实施例(通式I-6-3化合物)的合成路线图；
图24为本发明化合物一实施例(通式I-6-4化合物)的合成路线图；
图25为本发明化合物Ia在1×10-6M，1×10-9M和1×10-12M水溶液中的纳米结构；
图26为本发明化合物Ib在1×10-6M，1×10-9M和1×10-12M水溶液中的纳米结构；
图27为本发明化合物Ic在1×10-6M，1×10-9M和1×10-12M水溶液中的纳米结构；
图28为本发明化合物Id在1×10-6M，1×10-9M和1×10-12M水溶液中的纳米结构；
图29为本发明化合物Ie在1×10-6M，1×10-9M和1×10-12M水溶液中的纳米结构；
图30为本发明化合物If在1×10-6M，1×10-9M和1×10-12M水溶液中的纳米结构；
图31为本发明化合物Ig在1×10-6M，1×10-9M和1×10-12M水溶液中的纳米结构；
图32为本发明化合物Ih在1×10-6M，1×10-9M和1×10-12M水溶液中的纳米结构；
图33为本发明化合物Ii在1×10-6M，1×10-9M和1×10-12M水溶液中的纳米结构；
图34为本发明化合物Ij在1×10-6M，1×10-9M和1×10-12M水溶液中的纳米结构；
图35为本发明化合物Ik在1×10-6M，1×10-9M和1×10-12M水溶液中的纳米结构；
图36为本发明化合物Il在1×10-6M，1×10-9M和1×10-12M水溶液中的纳米结构；
图37为本发明化合物Ie在0.01μM浓度下的高分辨FT-MS质谱图；
图38为本发明化合物Ie在0.1μM浓度下的高分辨FT-MS质谱图；
图39为本发明化合物Ie在1μtM浓度下的高分辨FT-MS质谱图；
图40为本发明化合物Ie在10μM浓度下的高分辨FT-MS质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
制备具清除NO自由基活性的咪唑啉类：1，3-二氧基-2-[(4-氧乙酸)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪 唑啉
实施例1制备2，3-二甲基-2，3-二硝基丁烷
69g(0.78mol)2-硝基丙烷加入130ml NaOH(6N)水溶液中，在冰盐浴搅拌下滴加20ml(0.38mol)Br2，1h内滴加完，然后加入240mL乙醇，90℃回流3h，将反应液乘热倒入800ml冰水中，滤得55g(81％)标题化合物，为无色片状结晶，Mp110-112℃.
实施例2制备2，3-二甲基-2，3-二羟胺基丁烷
将7g(40mmol)2，3-二甲基-2，3-二硝基丁烷和4g NH4Cl混悬于80mL乙醇水溶液(50％)中，冰浴下搅拌，在3h内加入16g锌粉。锌粉加完后，撤去冰浴，继续室温搅拌反应3h，然后将反应液抽滤。滤饼用乙醇水溶液(50％)反复洗涤，合并滤液及洗涤液，用浓盐酸调节pH＝2，减压蒸至泥浆状。加入适量碳酸钾，拌匀后，使用索氏提取器，氯仿为提取剂，抽提6h，提取液减压浓缩至少量，加入石油醚后析出2.60g(44％)标题化合物，为无色晶体。Mp157-159℃.
实施例3制备1，3-二羟基-2-(4’-羟基苯基)-4，4，5，5-四甲基咪唑烷
1.22g(10mmol)对羟基苯甲醛与1.48g(10mmol)2，3-二甲基-2，3-二羟胺基丁烷溶于10mL甲醇中，室温搅拌8h后，TLC显示原料点消失。抽滤得到1.29g(51％)标题化合物，为无色晶体。EI-MS(m/z)252[M]+.1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)＝1.03(s，6H)，1.05(s，6H)，4.39(s，1H)，6.70(d，J＝6.9Hz，2H)，7.23(d，J＝6.9Hz，2H)，7.63(s，1H)，7.85(s，2H)。
实施例4制备1，3-二羟基-2-(4’-羟基苯基)-4，4，5，5-四甲基咪唑啉
将504mg(2mmol)1，3-二羟基-2-(4’-羟基苯基)-4，4，5，5-四甲基咪唑烷溶解于30mL甲醇中，加入3gPbO2，室温搅拌40min，TLC显示原料点消失。抽滤除去固体，滤液室温下减压蒸干，残留物柱层析纯化(氯仿洗脱)，260mg(52％)标题化合物，为蓝色固体。Mp134-135℃，EI-MS(m/z)249[M]+.IR(KBr)3250，1610，1500，1490，840。
实施例5制备1，3-二氧基-2-(4’-氧基乙酸乙酯-苯基)-4，4，5，5-四甲基咪唑啉
将250mg(1mmol)1，3-二羟基-2-(4’-羟基苯基)-4，4，5，5-四甲基咪唑啉、0.32mL溴代乙酸乙酯及32mg氢化钠溶于5mL无水THF中，混合物60℃搅拌5小时，TLC显示原料点消失。室温下减压过滤，滤液减压浓缩至干，残留物柱层析(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶5)纯化，得到300mg(90％)目标化合物.Mp107-109℃。
实施例6制备1，3-二氧基-2-(4’-氧乙酸-苯基)-4，4，5，5-四甲基咪唑啉(TMMZ)
向33mg(0.1mmol)1，3-二氧基-2-(4’-氧基乙酸乙酯-苯基)-4，4，5，5-四甲基咪唑啉与3mL甲醇的溶液中加7滴NaOH(2N)水溶液，室温搅拌30min，TLC显示原料点消失。将反应液减压浓缩，残留物先加2mL饱和食盐水稀释，再用2N HCl调pH6，然后用乙酸乙酯萃取3次(3ml×3)，合并的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液室温下减压浓缩至干，得30mg(99％)标题化合物，为蓝色晶体。Mp155-157℃.EI-MS(m/z)307[M]+。
组合具清除NO自由基活性的咪唑啉类与连接臂：1，3-二氧基-2-[(4’-氧乙酰基-Lys-OMe)苯 基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉
实施例7制备1，3-二氧基-2-[(4’-氧乙酰-Nω-Boc-Lys-OMe)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉
将307mg(1mmol)1，3-二氧基-2-(4’-氧乙酸-苯基)-4，4，5，5-四甲基咪唑啉与30ml无水THF的溶液在冰浴下搅拌。向溶液加250mg(1.2mmol)DCC及135mg(1mmol)HOBt，冰浴下搅拌10min。向该溶液加由300mg(1mmol)HCl·Lys(Boc)-OMe，122mg(1mmol)N-甲基吗啉及6mL无水THF配制的溶液。得到的反应混合物室温反应24小时。TLC(乙酸乙酯∶石油醚＝2∶1)显示HCl·Lys(Boc)-OMe消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。滤液依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗。分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液37℃减压浓缩(这些操作在下文中统称常规处理)，残留物柱层析纯化(乙酸乙酯∶石油醚＝2∶1)，得433mg(65％)标题化合物，为蓝色固体。ESI-MS(m/z)550[M+H]+。
实施例8制备1，3-二氧基-2-[(4’-氧乙酰-Lys-OMe)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉
将625mg(1mmol)1，3-二氧基-2-[(4’-氧乙酰-Nω-Boc-Lys-OMe)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉溶于15mL无水氯化氢-乙酸乙酯液(4N)，室温搅拌3小时，TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。反应混合物按常规方法处理，残留物用无水乙醚析晶，得标题化合物。
制备具溶血栓活性肽：适当保护的ARPAK
实施例9制备Boc-Ala-Lys(Z)-OBzl
将473mg(2.5mmol)Boc-Ala溶于10ml无水THF。冰浴下往里加由338mg(2.5mmol)HOBt，619mg(3mmol)DCC及10mL无水THF配制的溶液。反应混合物冰浴下搅拌20分钟。向该溶液中加由936mg(2.3mmol)HCl·Lys(Z)-OBzl，232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉先及6mL无水THF配制的溶液。得到的反应混合物室温反应24小时，TLC(CHCl3∶MeOH＝30∶1)显示HCl·Lys(Z)-OBzl消失。反应混合物按常规处理得1.204g(97％)标题化合物，为无色固体。(c＝0.1，MeOH).ESI-MS(m/z)565[M+Na]+。
实施例10制备HCl·Ala-Lys(Z)-OBzl：
将1.354g(2.5mmol)Boc-Ala-Lys(Z)-OBzl溶于约10ml无水氯化氢-乙酸乙酯溶液(4N)，室温搅拌3小时，TLC(CHCl3∶MeOH，30∶1)显示原料点消失。反应混合液在室温下减压浓缩，残留物再用乙酸乙酯溶解并室温下浓缩，如此反复数次，直至除净游离的氯化氢(这些操作在下文中统称常规处理)。残留物用无水乙醚析晶，得标题化合物，直接用于下步反应。
实施例11制备Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将538mg(2.5mmol)Boc-Pro溶于适量无水THF，冰浴下加入338mg(2.5mmol)HOBt，619mg(3mmol)DCC的无水THF溶液，反应20分钟。向该溶液加由1.099g(2.3 mmol)HCl·Ala-Lys(Z)-OBzl，232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉及10mL无水THF配制的溶液，室温反应24小时。TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。反应化合物按常规处理，得2.847g(98％)标题化合物.
Figure BSA00000860797200181
(c＝0.11，MeOH).ESI-MS(m/z)661[M+Na]+。
实施例12制备HCl·Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将1.596g(2.5mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl溶于15mL无水氯化氢-乙酸乙酯液(4N)，室温搅拌3小时，TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。反应混合物按常规方法处理，残留物用无水乙醚析晶，得标题化合物，直接用于下步反应。
实施例13制备Boc-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
冰浴下将798mg(2.5mmol)Boc-Arg(NO2)，338mg(2.5mmol)HOBt，619mg(3mmol)DCC和10mL无水THF的溶液搅拌20分钟。向该溶液中加由1.322g(2.3mmol)HCl·Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl，232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉与5mL无水THF配制的溶液，室温反应24小时。TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。按常规处理，得1.642g(85％)标题化合物.
Figure BSA00000860797200182
(c＝0.13，MeOH).ESI-MS(m/z)864[M+Na]+。
实施例14制备HCl·Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将2.099g(2.5mmol)Boc-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl溶于20mL无水氯化氢-乙酸乙酯液(4N)，室温搅拌3小时，TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。反应混合物按常规方法处理，残留物用无水乙醚析晶，得标题化合物，直接用于下步反应。
实施例15制备Boc-Ala-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
冰浴下将473mg(2.5mmol)Boc-Ala，338mg(2.5mmol)HOBt，619mg(3mmol)DCC和10mL无水THF的溶液搅拌20分钟。向该溶液中加由1.785g(2.3mmol)HCl·Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl，232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉与5mL无水THF配制的溶液，反应24小时得1.802g(86％)标题化合物.
Figure BSA00000860797200191
(c＝0.12，MeOH).ESI-MS(m/e)934[M+Na]+。
实施例16制备Boc-Ala-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)
将921mg(1mmol)Boc-Ala-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl溶于3mL甲醇中，冰浴下加入NaOH水溶液(2N)，室温下搅拌30min，保持pH12，冰浴下搅拌10min，TLC显示原料点消失。用2N HCl调pH7，将反应液减压浓缩，残留物加2mL饱和食盐水稀释，用2NHCl调pH2，用乙酸乙酯萃取3次(5mL×3)，合并的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，室温下减压浓缩得767mg(80％)标题化合物，为无色固体.EI-MS(m/z)830[M-H]-。
制备血栓靶向/抗血栓肽：适当保护的RGDS，RGDV，RGDF
实施例17制备Boc-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl
冰浴下将808mg(2.5mmol)Boc-Asp(OBzl)，338mg(2.5mmol)HOBt，619mg(3mmol)DCC和10mL无水THF的溶液搅拌反应20分钟。向该溶液加由740mg(2.3mmol)HCl·Ser(Bzl)-OBzl，232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉与5mL无水THF配制的溶液，室温反应24小时。TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。反应化合物按常规处理，得1.29g(95％)标题化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/z)591[M+H]+。
实施例18制备HCl·Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl
将1.477g(2.5mmol)Boc-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl溶于15mL无水氯化氢-乙酸乙酯液(4N)并室温搅拌3小时，TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。反应混合物按常规方法处理，残留物用无水乙醚析晶，得标题化合物，直接用于下步反应。
实施例19制备Boc-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl
冰浴下将438mg(2.5mmol)Boc-Gly，338mg(2.5mmol)HOBt，619mg(3mmol)DCC和10mL无水THF的溶液搅拌20分钟。向该溶液中加由1.212g(2.3mmol)HCl·Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Obzl，232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉与5mL无水THF配制的溶液，室温反应24小时。TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。反应混合物按常规处理，得1.461g(98％)标题化合物，为无色固体。
Figure BSA00000860797200201
(c＝0.13，MeOH).ESI-MS(m/z)649[M+H]+。
实施例20制备HCl·Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl
将1.619g(2.5mmol)Boc-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl溶于15mL无水氯化氢-乙酸乙酯液(4N)，室温搅拌3小时，TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。反应混合物按常规方法处理，残留物用无水乙醚析晶，得标题化合物，直接用于下步反应。
实施例21制备Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl
冰浴下将798mg(2.5mmol)Boc-Arg(NO2)，338mg(2.5mmol)HOBt，619mg(3mmol)DCC及10mL无水THF的溶液搅拌20分钟。向该溶液加由1.343g(2.3mmol)HCl·Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl，232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉与5mL无水THF配制的溶液，室温反应24小时。TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。按常规处理，得标题化合物1.66g(85％)，为无色固体。
Figure BSA00000860797200202
(c＝0.12，MeOH).ESI-MS(m/z)872[M+Na]+。
实施例22制备HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl
将2.122g(2.5mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl与20mL氯化氢-乙酸乙酯液(4N)的混合物室温搅拌3小时，TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。反应混合物按常规方法处理，残留物用无水乙醚析晶，得标题化合物。
实施例23制备Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl
冰浴下将808mg(2.5mmol)Boc-Asp(OBzl)，338mg(2.5mmol)HOBt，619mg(3mmol)DCC及10ml无水THF的溶液搅拌20分钟。向该溶液加由558mg(2.3mmol)HCl·Val-OBzl，232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉与5ml无水THF配制的溶液，室温反应24小时。TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。反应化合物按常规处理，得1.129g(96％)标题化合物，为无色油状液体。ESI-MS(m/z)512[M+H]+。
实施例24制备HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl
将1.278g(2.5mmol)Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl溶于15ml无水氯化氢-乙酸乙酯液(4N)，室温搅拌3小时，TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。反应混合物按常规方法处理，残留物用无水乙醚析晶，得标题化合物，直接用于下步反应。
实施例25制备Boc-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl
冰浴下将438mg(2.5mmol)Boc-Gly，338mg(2.5mmol)HOBt，619mg(3mmol)DCC和10mL无水THF的溶液搅拌20分钟。向该溶液加由1.03g(2.3mmol)HCl·Asp(OBzl)-Val-Obzl，232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉与5mL无水THF配制的溶液，室温反应24小时。TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。反应化合物按常规处理，得1.242g(95％)标题化合物，为无色固体。
Figure BSA00000860797200211
(c＝0.11，MeOH).ESI-MS(m/z)592[M+Na]+。
实施例26制备HCl·Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl
将1.421g(2.5mmol)Boc-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl溶于15mL无水氯化氢-乙酸乙酯液(4N)，室温搅拌3小时，TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。反应混合物按常规方法处理，残留物用无水乙醚析晶，得标题化合物，直接用于下步反应。
实施例27制备Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl
冰浴下将798mg(2.5mmol)Boc-Arg(NO2)，338mg(2.5mmol)HOBt，619mg(3mmol)DCC和10mL无水THF的溶液搅拌20分钟。向该溶液加由1.162g(2.3mmol)HCl·Gly-Asp(OBzl)-Val-Obzl，232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉与5mL无水THF配制的溶液，室温反应24小时。TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。反应化合物按常规处理，得1.523g(86％)标题化合物，为无色固体。
Figure BSA00000860797200212
(c＝0.12，MeOH).ESI-MS(m/z)793[M+Na]+。
实施例28制备HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl
将1.925g(2.5mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl溶于20mL无水氯化氢-乙酸乙酯液(4N)，室温搅拌3小时，TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。反应混合物按常规方法处理，残留物用无水乙醚析晶，得标题化合物。
实施例29制备Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl
冰浴下将808mg(2.5mmol)Boc-Asp(OBzl)，338mg(2.5mmol)HOBt，619mg(3mmol)DCC和10mL无水THF的溶液搅拌20分钟。向该溶液加由668mg(2.3mmol)HCl·Phe-OBzl，232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉与5mL无水THF配制的溶液，室温反应24小时。TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。按常规处理，得标题化合物1.222g(95％)，为无色固体。
Figure BSA00000860797200221
(c＝0.13，MeOH)，ESI-MS(m/z)561[M+H]+。
实施例30制备HCl·Asp(OBzl)-Phe-OBzl
将1.398g(2.5mmol)Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl溶于15mL无水氯化氢-乙酸乙酯溶液(4N)，室温搅拌3小时，TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。反应混合物按常规方法处理，残留物用无水乙醚析晶，得标题化合物，直接用于下步反应。
实施例31制备Boc-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl
冰浴下将438mg(2.5mmol)Boc-Gly，338mg(2.5mmol)HOBt，619mg(3mmol)DCC的无水THF溶液搅拌20分钟。向该溶液加由1.141g(2.3mmol)HCl·Asp(OBzl)-Phe-OBzl，232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉与5mL无水THF配制的溶液，室温反应24小时。TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。反应混合物按常规处理，得1.29g(91％)标题化合物，为无色固体。
Figure BSA00000860797200222
(c＝0.14，MeOH).ESI-MS(m/z)640[M+Na]+。
实施例32制备HCl·Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl
将1.541g(2.5mmol)Boc-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl溶于15mL无水氯化氢-乙酸乙酯液(4N)，室温搅拌3小时，TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。反应混合物按常规方法处理，残留物用无水乙醚析晶，得标题化合物，直接用于下步反应。
实施例33制备Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl
冰浴下将798mg(2.5mmol)Boc-Arg(NO2)，338mg(2.5mmol)HOBt，619mg(3mmol)DCC和10mL无水THF的溶液搅拌20分钟。向该溶液加由1.272g(2.3mmol)HCl·Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl，232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉与5mL无水THF配制的溶液，室温反应24小时。TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。反应混合物按常规处理，得1.637g(87％)标题化合物，为无色固体。
Figure BSA00000860797200231
(c＝0.09，MeOH).ESI-MS(m/z)841[M+Na]+。
实施例34制备HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl
将2.045g(2.5mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl溶于15mL无水氯化氢-乙酸乙酯液(4N)，室温搅拌3小时，TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。反应混合物按常规方法处理，残留物用无水乙醚析晶，得标题化合物。
制备ARPAK/咪唑啉/RGD三元缀合物(通式I-1-1化合物).Ia，Ib，Ic
实施例35制备1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Ala-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-OMe}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉
冰浴下将821mg(1mmol)Boc-Ala-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)，135mg(1mmol)HOBt，250mg(1mmol)DCC和10mL无水THF的溶液搅拌20分钟。向该溶液加由480mg(1mmol)1，3-二氧基-2-[(4’-氧乙酰基-Lys-OMe)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉和100mg(1mmol)N-甲基吗啉与5mL无水THF配制的溶液，室温反应24小时。TLC(CHCl3∶MeOH，40∶1)显示原料点消失。反应化合物按常规处理，得925mg(83％)标题化合物，为蓝色固体。
Figure BSA00000860797200232
Figure BSA00000860797200233
(c＝0.14，MeOH)，ESI-MS(m/z)1275[M+Na]+。IR(KBr)3319，2935，1658，1531，1448，1363，1254，1168，1053，835，749，540cm-1。
实施例36制备1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Ala-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉
冰浴下将1260mg(1mmol)1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Ala-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-OMe}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉溶于3mL甲醇中，加入NaOH水溶液(2N)，室温下搅拌30min。保持pH12，冰浴下搅拌10min，TLC显示原料点消失。用2N HCl调pH7，将反应液减压浓缩，残留物用2mL饱和食盐水稀释，用2N HCl调pH2，用乙酸乙酯萃取3次(5mL×3)。合并的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液室温下减压浓缩，得945mg(82％)标题化合物，为蓝色固体。EI-MS(m/z)1238[M-H]-。
实施例37制备1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Ala-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉
冰浴下将618mg(0.5mmol)1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Ala-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉，69mg(0.5mmol)HOBt，126mg(0.6mmol)DCC和20mL无水THF的溶液搅拌20分钟。向该溶液加由442mg(0.5mmol)HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl，50mg(0.5mmol)N-甲基吗啉及5mL无水THF配制的溶液，室温反应24小时。TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。反应混合物按常规处理，得300mg(31％)标题化合物，为蓝色固体。
Figure BSA00000860797200241
Figure BSA00000860797200242
(c＝0.13，MeOH).ESI-MS(m/z)1991[M+H]+.IR(KBr)3309，2936，1656，1531，1449，1363，1256，836，743，697，601cm-1。
实施例38制备1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Ala-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉
冰浴下将618mg(0.5mmol)1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Ala-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉，69mg(0.5mmol)HOBt，126mg(0.6mmol)DCC和20mL无水THF的溶液搅拌20分钟。向该溶液加由421mg(0.5mmol)HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl，50mg(0.5mmol)N-甲基吗啉及5mL无水THF配制的溶液，室温反应24小时。TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。反应混合物按常规处理，得389mg(36％)标题化合物，为蓝色固体。
Figure BSA00000860797200243
(c＝0.01，MeOH).ESI-MS(m/z)1913[M+H]+。IR(KBr)3312，2937，1655，1530，1448，1362，1257，835，744，697，592cm-1。
实施例39制备1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Ala-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉
冰浴下将618mg(0.5mmol)1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Ala-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉，69mg(0.5mmol)HOBt，126mg(0.6mmol)DCC和20ml无水THF的溶液搅拌20分钟。向该溶液加由445mg(0.5mmol)HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl，50mg(0.5mmol)N-甲基吗啉及5mL无水THF配制的溶液，室温反应24小时。TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。反应混合物按常规处理，得320mg(36％)标题化合物，为蓝色固体。(c＝0.16，MeOH).ESI-MS(m/z)1961[M+H]+。IR(KBr)3316，2936，1654，1529，1448，1362，1256，1169，742，698，593cm-1。
实施例40制备1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-[Nω-(Ala-Arg-Pro-Ala-Lys)-Lys-Arg-Gly-Asp-Ser]苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉(Ia)
冰浴下将199mg(0.1mmol)1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Ala-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉与6mL三氟乙酸和1.5mL三氟甲磺酸混合，搅拌1小时后TCL(CHCl3∶MeOH，1∶1)显示原料点消失。反应化合物减压浓缩，残留物用无水乙醚反复洗涤，减压浓缩，残留物用水溶解，用25％氨水调pH8，用Sephadex G10除盐，用C18柱纯化，收集的馏分冻干，得109mg(85％)标题化合物，为蓝色固体。
Figure BSA00000860797200251
(c＝0.12，MeOH).FT-MS(m/z)1374.7290[M+H]+，2748.4580[2M+H]+，4122.1870[3M+H]+，5495.9160[4M+H]+.g＝2.00779.IR(KBr)3346，3180，2920，1665，1537，1449，1252，1179，1030，837，801，720，639，518cm-1。
实施例41制备1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-[Nω-(Ala-Arg-Pro-Ala-Lys)-Lys-Arg-Gly-Asp-Val]苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉(Ib)
冰浴下将190mg(0.1mmol)1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Ala-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉与6mL三氟乙酸和1.5mL三氟甲磺酸混合，搅拌1小时后TCL(CHCl3∶MeOH，1∶1)显示原料点消失。反应化合物减压浓缩，残留物用无水乙醚反复洗涤，减压浓缩，残留物用水溶解，用25％氨水调pH8，用Sephadex G10除盐，用C18柱纯化，收集的馏分冻干，得96mg(82％)标题化合物，为蓝色固体。
Figure BSA00000860797200252
(c＝0.01，MeOH).FT-MS(m/z)1386.7654[M+H]+，2772.5308，[2M+H]+，4158.2962[3M+H]+，5544.0616[4M+H]+.g＝2.00779.IR(KBr)3349，2942，1659，1539，1394，1250，1030，639cm-1。
实施例42制备1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-[Nω-(Ala-Arg-Pro-Ala-Lys)-Lys-Arg-Gly-Asp-Phe]苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉(Ic)
冰浴下将194mg(0.1mmol)1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Ala-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉与6mL三氟乙酸和1.5mL三氟甲磺酸混合，搅拌1小时后TCL(CHCl3∶MeOH，1∶1)显示原料点消失。反应化合物减压浓缩，残留物用无水乙醚反复洗涤，减压浓缩，残留物用水溶解，用25％氨水调pH8，用Sephadex G10除盐，用C18柱纯化，收集的馏分冻干，得106mg(81％)标题化合物，为蓝色固体。
Figure BSA00000860797200261
(c＝0.15，MeOH).FT-MS(m/z)ESI-MS(m/z)1444.7654[M+H]+，ESI-MS(m/z)2888.5308[2M+H]+，4332.2962[3M+H]+，5776.0616[4M+H]+.g＝2.00789.IR(KBr)3363，1665，1538，1448，1256，1173，1031，640，577，518cm-1。
制备具溶血栓活性肽：适当保护的GRPAK
实施例43制备Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
冰浴下将438mg(2.5mmol)Boc-Gly，338mg(2.5mmol)HOBt，619mg(3mmol)DCC和10mL无水THF的溶液搅拌20分钟。向该溶液中加由1.785g(2.3mmol)HCl·Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl，232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉与5mL无水THF配制的溶液，反应24小时，得1.857g(90％)标题化合物.
Figure BSA00000860797200262
(c＝0.11，MeOH).ESI-MS(m/e)920[M+Na]+。
实施例44制备Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)
将907mg(1mmol)Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl溶于3mL甲醇中，冰浴下加入NaOH水溶液(2N)，室温下搅拌30min，保持pH12，冰浴下搅拌10min，TLC显示原料点消失。用2N HCl调pH7，将反应液减压浓缩，残留物加2mL饱和食盐水稀释，用2NHCl调pH2，用乙酸乙酯萃取3次(5mL×3)，合并的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，室温下减压浓缩得785mg(82％)标题化合物，为无色固体.EI-MS(m/z)816[M-H]-。
制备GRPAK/咪唑啉/RGD三元缀合物(通式I-1-2化合物)：Id，Ie，If
实施例45制备1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-OMe}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉
冰浴下将817mg(1mmol)Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)，135mg(1mmol)HOBt，250mg(1mmol)DCC和10mL无水THF的溶液搅拌20分钟。向该溶液加由480mg(lmmol)1，3-二氧基-2-[(4’-氧乙酰基-Lys-OMe)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉和100mg(1mmol)N-甲基吗啉与5mL无水THF配制的溶液，室温反应24小时。TLC(CHCl3∶MeOH，40∶1)显示原料点消失。反应化合物按常规处理，得680mg(52％)标题化合物，为蓝色固体。
Figure BSA00000860797200271
Figure BSA00000860797200272
(c＝0.14，MeOH)，ESI-MS(m/z)1261[M+Na]+。IR(KBr)3319，2935，1658，1531，1448，1363，1254，1168，1053，835，749，540cm-1.
实施例46制备1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉
冰浴下将1260mg(1mmol)1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-OMe}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉溶于3mL甲醇中，加入NaOH水溶液(2N)，室温下搅拌30min。保持pH12，冰浴下搅拌10min，TLC显示原料点消失。用2N HCl调pH7，将反应液减压浓缩，残留物用2mL饱和食盐水稀释，用2N HCl调pH2，用乙酸乙酯萃取3次(5mL×3)。合并的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液室温下减压浓缩，得945mg(82％)标题化合物，为蓝色固体。EI-MS(m/z)1223[M-H]-。
实施例47制备1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉
冰浴下将611mg(0.5mmol)1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉，69mg(0.5mmol)HOBt，126mg(0.6mmol)DCC和20mL无水THF的溶液搅拌20分钟。向该溶液加由442mg(0.5mmol)HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl，50mg(0.5mmol)N-甲基吗啉及5mL无水THF配制的溶液，室温反应24小时。TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。反应混合物按常规处理，得500mg(48％)标题化合物，为蓝色固体。
Figure BSA00000860797200273
(c＝0.13，MeOH).ESI-MS(m/z)1956[M+H]+.IR(KBr)3306，2936，1652，1531，1449，1362，1255，1166，742，697，592cm-1。
实施例48制备1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉
冰浴下将611mg(0.5mmol)1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉，69mg(0.5mmol)HOBt，126mg(0.6mmol)DCC和20mL无水THF的溶液搅拌20分钟。向该溶液加由421mg(0.5mmol)HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl，50mg(0.5mmol)N-甲基吗啉及5mL无水THF配制的溶液，室温反应24小时。TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。反应混合物按常规处理，得392mg(35％)标题化合物，为蓝色固体。(c＝0.16，MeOH).ESI-MS(m/z)1899[M+Na]+。IR(KBr)3311，3068，2937，1661，1531，1451，1395，1254，1163，839，743，697，596cm-1。
实施例49制备1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉
冰浴下将611mg(0.5mmol)1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉，69mg(0.5mmol)HOBt，126mg(0.6mmol)DCC和20mL无水THF的溶液搅拌20分钟。向该溶液加由445mg(0.5mmol)HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl，50mg(0.5mmol)N-甲基吗啉及5mL无水THF配制的溶液，室温反应24小时。TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。反应混合物按常规处理，得336mg(31％)标题化合物，为蓝色固体。
Figure BSA00000860797200282
(c＝0.18，MeOH).ESI-MS(m/z)1925[M+H]+。IR(KBr)3315，2935，1657，1529，1448，1361，1257，1173，834，742，698，541cm-1。
实施例50制备1，3-二氧基-2-{4’--[Nω-(Gly-Arg-Pro-Ala-Lys)-Lys-Arg-Gly-Asp-Ser]苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉(Id)
冰浴下将195mg(0.1mmol)1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉与6mL三氟乙酸和1.5mL三氟甲磺酸混合，搅拌1小时后TCL(CHCl3∶MeOH，1∶1)显示原料点消失。反应化合物减压浓缩，残留物用无水乙醚反复洗涤，减压浓缩，残留物用水溶解，用25％氨水调pH8，用Sephadex G10除盐，用C18柱纯化，收集的馏分冻干，得102mg(82％)标题化合物，为蓝色固体。
Figure BSA00000860797200283
(c＝0.14，MeOH).FT-MS(m/z)1360.7133[M+H]+，2720.4266[2M+H]+，4080.1399[3M+H]+，5439.8532[4M+H]+.g＝2.00779.IR(KBr)3348，3180，2940，1670，1539，1447，1199，1134，1034，836，801，721，638cm-1。
实施例51制备1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-[Nω-(Gly-Arg-Pro-Ala-Lys)-Lys-Arg-Gly-Asp-Val]苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉(Ie)
冰浴下将190mg(0.1mmol)1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉与6mL三氟乙酸和1.5mL三氟甲磺酸混合，搅拌1小时后TCL(CHCl3∶MeOH，1∶1)显示原料点消失。反应化合物减压浓缩，残留物用无水乙醚反复洗涤，减压浓缩，残留物用水溶解，用25％氨水调pH8，用Sephadex G10除盐，用C18柱纯化，收集的馏分冻干，得99mg(84％)标题化合物，为蓝色固体。
Figure BSA00000860797200291
(c＝0.17，MeOH).FT-MS(m/z)1372.7497[M+H]+，2744.4994[2M+H]+，4116.2491[3M+H]+，5487.9988[4M+H]+.g＝2.00779.IR(KBr)3338，2960，1662，1539，1451，1392，1251，1170，1030，639，519cm-1。
实施例52制备1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-[Nω-(Gly-Arg-Pro-Ala-Lys)-Lys-Arg-Gly-Asp-Phe]苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉(If)
冰浴下将192mg(0.1mmol)1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉与6mL三氟乙酸和1.5mL三氟甲磺酸混合，搅拌1小时后TCL(CHCl3∶MeOH，1∶1)显示原料点消失。反应化合物减压浓缩，残留物用无水乙醚反复洗涤，减压浓缩，残留物用水溶解，用25％氨水调pH8，用Sephadex G10除盐，用C18柱纯化，收集的馏分冻干，得106mg(81％)标题化合物，为蓝色固体。 (c＝0.15，MeOH).FT-MS(m/z)1420.7497[M+H]+，2840.4994[2M+H]+，ESI-MSFT-MS(m/z)1420.7497[M+H]+，2840.4994[2M+H]+，4260.2491[3M+H]+，5679.9976[4M+H]+.g＝2.00789.IR(KBr)3344，3080，2930，1666，1535，1392，1250，1181，1030，835，800，719，638cm-1。
制备具溶血栓活性肽：适当保护的RPAK
实施例53制备Boc-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)
将850mg(1mmol)Boc-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl溶于3mL甲醇中，冰浴下加入NaOH水溶液(2N)，室温搅拌30min，保持PH12，冰浴搅拌10min，TLC显示原料点消失。用2N HCl调pH7，将反应液减压浓缩，残留物加2mL饱和食盐水稀释，用2N HCl调pH2，用乙酸乙酯萃取3次(5mL×3)，合并的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液室温下减压浓缩得742mg(92％)标题化合物，为无色固体。EI-MS(m/z)849[M-H]-。
制备RPAK/咪唑啉/RGD三元缀合物(通式I-1-3化合物)：Ig，Ih，Ii
实施例54制备1，3-二氧基-2-{4’-{Nω-[Boc-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-OMe}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉
冰浴下将760mg(1mmol)Boc-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)，135mg(1mmol)HOBt，250mg(1mmol)DCC和10mL无水THF的溶液搅拌20分钟。向该溶液加由480mg(1mmol)1，3-二氧基-2-[(4’-氧乙酰基-Lys-OMe)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉和100mg(1mmol)N-甲基吗啉与5mL无水THF配制的溶液，室温反应24小时。TLC(CHCl3∶MeOH，40∶1)显示原料点消失。反应化合物按常规处理，得920mg(83％)标题化合物，为蓝色固体。
Figure BSA00000860797200301
Figure BSA00000860797200302
(c＝0.13，MeOH)，ESI-MS(m/z)1204[M+Na]+。IR(KBr)3317，2937，1658，1531，1447，1362，1254，1168，1055，835，746，697，541，460cm-1.
实施例55制备1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉
冰浴下将1200mg(1mmol)1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-OMe}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉溶于3mL甲醇中，加入NaOH水溶液(2N)，室温下搅拌30min。保持pH12，冰浴下搅拌10min，TLC显示原料点消失。用2NHCl调pH7，将反应液减压浓缩，残留物用2mL饱和食盐水稀释，用2N HCl调pH2，用乙酸乙酯萃取3次(5mL×3)。合并的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液室温下减压浓缩，得899mg(80％)标题化合物，为蓝色固体。EI-MS(m/z)1116[M-H]-。
实施例56制备1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉
冰浴下将583mg(0.5mmol)1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉，69mg(0.5mmol)HOBt，126mg(0.6mmol)DCC和20mL无水THF的溶液搅拌20分钟。向该溶液加由442mg(0.5mmol)HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl，50mg(0.5mmol)N-甲基吗啉及5mL无水THF配制的溶液，室温反应24小时。TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。反应混合物按常规处理，得421mg(40％)标题化合物，为蓝色固体。
Figure BSA00000860797200311
Figure BSA00000860797200312
(c＝0.15，MeOH).ESI-MS(m/z)1897[M+H]+.IR(KBr)3319，2934，1658，1530，1449，1361，1256，834，741，698，542cm-1。
实施例57制备1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉
冰浴下将583mg(0.5mmol)1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉，69mg(0.5mmol)HOBt，126mg(0.6mmol)DCC和20mL无水THF的溶液搅拌20分钟。向该溶液加由421mg(0.5mmol)HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl，50mg(0.5mmol)N-甲基吗啉及5mL无水THF配制的溶液，室温反应24小时。TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。反应混合物按常规处理，得472mg(42％)标题化合物，为蓝色固体。
Figure BSA00000860797200313
Figure BSA00000860797200314
(c＝0.11，MeOH).ESI-MS(m/z)1820[M+H]+。IR(KBr)3314，2938，1658，1531，1448，1362，1258，742，698，594cm-1。
实施例58制备1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉
冰浴下将583mg(0.5mmol)1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉，69mg(0.5mmol)HOBt，126mg(0.6mmol)DCC和20mL无水THF的溶液搅拌20分钟。向该溶液加由445mg(0.5mmol)HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl，50mg(0.5mmol)N-甲基吗啉及5mL无水THF配制的溶液，室温反应24小时。TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。反应混合物按常规处理，得420mg(47％)标题化合物，为蓝色固体。
Figure BSA00000860797200315
(c＝0.12，MeOH).ESI-MS(m/z)1867[M+H]+。IR(KBr)3319，2936，1656，1529，1448，1362，1257，1169，834，743，698，541cm-1。
实施例59制备1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-[Nω-(Arg-Pro-Ala-Lys)-Lys-Arg-Gly-Asp-Ser]苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉(Ig)
冰浴下将170mg(0.1mmol)1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉与6mL三氟乙酸和1.5mL三氟甲磺酸混合，搅拌1小时后TCL(CHCl3∶MeOH，1∶1)显示原料点消失。反应化合物减压浓缩，残留物用无水乙醚反复洗涤，减压浓缩，残留物用水溶解，用25％氨水调pH8，用Sephadex G10除盐，用C18柱纯化，收集的馏分冻干，得102mg(82％)标题化合物，为蓝色固体。
Figure BSA00000860797200321
(c＝0.14，MeOH).FT-MS(m/z)1303.6919[M+H]+，2606.3838，[2M+H]+，3909.0757[3M+H]+，5211.7676[4M+H]+.g＝2.00779.IR(KBr)3344，3080，2930，1666，1535，1392，1250，1181，1030，835，800，719，638。
实施例60制备1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-[Nω-(Arg-Pro-Ala-Lys)-Lys-Arg-Gly-Asp-Val]苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉(Ih)
冰浴下将182mg(0.1mmol)1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉与6mL三氟乙酸和1.5mL三氟甲磺酸混合，搅拌1小时后TCL(CHCl3∶MeOH，1∶1)显示原料点消失。反应化合物减压浓缩，残留物用无水乙醚反复洗涤，减压浓缩，残留物用水溶解，用25％氨水调pH8，用Sephadex G10除盐，用C18柱纯化，收集的馏分冻干，得99mg(84％)标题化合物，为蓝色固体。
Figure BSA00000860797200322
(c＝0.18，MeOH).FT-MS(m/z)ESI-MS(m/z)1315.7282[M+H]+，2630.4564[2M+H]+，3945.1846[3M+H]+，5259.9128[4M+H]+.g＝2.00779.IR(KBr)3329，2953，1665，1533，1391，1198，1134，834，801，720，599cm-1。
实施例61制备1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-[Nω-(Arg-Pro-Ala-Lys)-Lys-Arg-Gly-Asp-Phe]苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉(Ii)
冰浴下将187mg(0.1mmol)1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉与6mL三氟乙酸和1.5mL三氟甲磺酸混合，搅拌1小时后TCL(CHCl3∶MeOH，1∶1)显示原料点消失。反应化合物减压浓缩，残留物用无水乙醚反复洗涤，减压浓缩，残留物用水溶解，用25％氨水调pH8，用Sephadex G10除盐，用C18柱纯化，收集的馏分冻干，得96mg(81％)标题化合物，为蓝色固体。(c＝0.14，MeOH).FT-MS(m/z)1363.7282[M+H]+，2726.4564[2M+H]+，4089.1846[3M+H]+，5451.9128[4M+H]+.g＝2.00789.IR(KBr)3322，3060，2928，1661，1530，1391，1303，1247，641cm-1。
制备具溶血栓活性肽：适当保护的PAK
实施例62制备Boc-Pro-Ala-Lys(Z)
将638mg(1mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl溶于3mL甲醇中，冰浴下加入NaOH水溶液(2N)，室温下搅拌30min。保持pH12，冰浴下搅拌10min。TLC显示原料点消失，用2N HCl调pH7。将反应液减压浓缩，残留物用2mL饱和食盐水溶液稀释，用2N HCl调pH2，用乙酸乙酯萃取3次(5ml×3)，合并的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液室温下减压浓缩，得509mg(91.6％)标题化合物，为无色固体.EI-MS(m/z)547[M-H]-。
制备PAK/咪唑啉/RGD三元缀合物(通式I-1-4化合物)：Ij，Ik，Il
实施例63制备1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-OMe}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉
冰浴下将548mg(1mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)，135mg(1mmol)HOBt，250mg(1mmol)DCC和10mL无水THF的溶液搅拌20分钟。向该溶液加由480mg(1mmol)1，3-二氧基-2-[(4’-氧乙酰基-Lys-OMe)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉和100mg(1mmol)N-甲基吗啉与5mL无水THF配制的溶液，室温反应24小时。TLC(CHCl3∶MeOH，40∶1)显示原料点消失。反应化合物按常规处理，得876mg(87％)标题化合物，为蓝色固体。
Figure BSA00000860797200331
(c＝0.16，MeOH).ESI-MS(m/z)1003[M+Na]+。IR(KBr)：3315，3069，2937，1671，1531，1449，1394，1364，1302，1167，1132，1054，836，743，698，596，541，458cm-1.
实施例64制备1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉
冰浴下将980mg(1mmol)1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-OMe}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉溶于3mL甲醇中，加入NaOH水溶液(2N)，室温下搅拌30min。保持pH12，冰浴下搅拌10min，TLC显示原料点消失。用2NHCl调pH7，将反应液减压浓缩，残留物用2mL饱和食盐水稀释，用2N HCl调pH2，用乙酸乙酯萃取3次(5mL×3)。合并的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液室温下减压浓缩，得867mg(80％)标题化合物，为蓝色固体。EI-MS(m/z)965[M-H]-。
实施例65制备1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉
冰浴下将483mg(0.5mmol)1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉，69mg(0.5mmol)HOBt，126mg(0.6mmol)DCC和20mL无水THF的溶液搅拌20分钟。向该溶液加由442mg(0.5mmol)HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl，50mg(0.5mmol)N-甲基吗啉及5mL无水THF配制的溶液，室温反应24小时。TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。反应混合物按常规处理，得421mg(42％)标题化合物，为蓝色固体。
Figure BSA00000860797200341
(c＝0.14，MeOH).ESI-MS(m/z)1697[M+H]+.IR(KBr)3298，3070，2935，2869，1642，1534，1450，1369，1253，741，697，596cm-1。
实施例66制备1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉
冰浴下将483mg(0.5mmol)1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉，69mg(0.5mmol)HOBt，126mg(0.6mmol)DCC和20mL无水THF的溶液搅拌20分钟。向该溶液加由432mg(0.5mmol)HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl，50mg(0.5mmol)N-甲基吗啉及5mL无水THF配制的溶液，室温反应24小时。TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。反应混合物按常规处理，得357mg(37％)标题化合物，为蓝色固体。
Figure BSA00000860797200342
(c＝0.17，MeOH).ESI-MS(m/z)1620[M+H]+。IR(KBr)3303，3072，2935，1644，1533，1451，1394，1364，1255，1167，745，697，597cm-1。
实施例67制备1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉
冰浴下将483mg(0.5mmol)1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉，69mg(0.5mmol)HOBt，126mg(0.6mmol)DCC和20mL无水THF的溶液搅拌20分钟。向该溶液加由439mg(0.5mmol)HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl，50mg(0.5mmol)N-甲基吗啉及5mL无水THF配制的溶液，室温反应24小时。TLC(CHCl3∶MeOH，20∶1)显示原料点消失。反应混合物按常规处理，得472mg(48％)标题化合物，为蓝色固体。
Figure BSA00000860797200351
(c＝0.13，MeOH).ESI-MS(m/z)1667[M+H]+。IR(KBr)3296，3071，2935，1641，1534，1394，1253，1170，834，745，697，594cm-1。
实施例68制备1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-[Nω-(Pro-Ala-Lys)-Lys-Arg-Gly-Asp-Ser]苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉(Ij)
冰浴下将169mg(0.1mmol)1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉与6mL三氟乙酸和1.5mL三氟甲磺酸混合，搅拌1小时后TCL(CHCl3∶MeOH，1∶1)显示原料点消失。反应化合物减压浓缩，残留物用无水乙醚反复洗涤，减压浓缩，残留物用水溶解，用25％氨水调pH8，用Sephadex G10除盐，用C18柱纯化，收集的馏分冻干，得98mg(80％)标题化合物，为蓝色固体。
Figure BSA00000860797200352
(c＝0.13，MeOH).FT-MS(m/z)1147.5907[M+H]+，2294.1814[2M+H]+，3440.7721[3M+H]+，4587.3628[4M+H]+.g＝2.00779.IR(KBr)3204，1672，1543，1436，1199，1133，837，801，722，598cm-1。
实施例69制备1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-[Nω-(Pro-Ala-Lys)-Lys-Arg-Gly-Asp-Val]苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉(Ik)
冰浴下将162mg(0.1mmol)1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉与6mL三氟乙酸和1.5mL三氟甲磺酸混合，搅拌1小时后TCL(CHCl3∶MeOH，1∶1)显示原料点消失。反应化合物减压浓缩，残留物用无水乙醚反复洗涤，减压浓缩，残留物用水溶解，用25％氨水调pH8，用Sephadex G10除盐，用C18柱纯化，收集的馏分冻干，得96mg(81％)标题化合物，为蓝色固体。
Figure BSA00000860797200353
(c＝0.13，MeOH).FT-MS(m/z)1159.6271[M+H]+，2318.2542[2M+H]+，3476.8813[3M+H]+，4635.5084[4M+H]+.g＝2.00779.IR(KBr)3388，2959，1666，1540，1494，1198，1134，835，801，720，598cm-1。
实施例70制备1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-[Nω-(Pro-Ala-Lys)-Lys-Arg-Gly-Asp-Phe]苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉(Il)
冰浴下将169mg(0.1mmol)1，3-二氧基-2-{4’-氧乙酰基-{Nω-[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl}苯基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉与6mL三氟乙酸和1.5mL三氟甲磺酸混合，搅拌1小时后TCL(CHCl3∶MeOH，1∶1)显示原料点消失。反应化合物减压浓缩，残留物用无水乙醚反复洗涤，减压浓缩，残留物用水溶解，用25％氨水调pH8，用Sephadex G10除盐，用C18柱纯化，收集的馏分冻干，得96mg(81％)标题化合物，为蓝色固体。
Figure BSA00000860797200361
(c＝0.16，MeOH).FT-MS(m/z)1207.6271[M+H]+，2414.2542[2M+H]+，3620.8813[3M+H]+，4827.5084[4M+H]+.g＝2.00789.IR(KBr)3385，2938，1659，1541，1450，1391，1251，1126，963，841，599，456cm-1。
试验例1本发明化合物Ia至Il的NO自由基清除试验
体重250-300g雄性Wistar大鼠，术前禁食12小时，自由饮水，颈椎脱位致死，迅速开胸摘取胸主动脉，剥离附着的结缔组织，将血管剪成3-5mm长的动脉环置于灌流浴槽内。浴槽盛有15mlKrebs-Henseleit液，37℃恒温，通95％O2-5％CO2气体，固定动脉环的挂钩连接张力换能器，在二道记录仪上描记血管舒缩曲线，纸速为1mm/min。调整静止张力为1.0g，平衡30min后给予终浓度为10-8M去甲肾上腺素使动脉收缩以起预激作用。洗去去甲肾上腺素，平衡30min，浴槽加终浓度为10-8M去甲肾上腺素，待收缩张力持续稳定于平台水平后，浴槽加20μl生理盐水(空白)或加20μl化合物Ia-l之一的生理盐水溶液(终浓度为5×10-6M)，或加20μl NO自由基清除剂(1，3-二氧基-2-(4’-氧乙酸-苯基)-4，4，5，5-四甲基咪唑啉，TMMZ)的生理盐水溶液(终浓度为5×10-6M)，待平稳后，加入20μl乙酰胆碱的生理盐水溶液(终浓度为10-6M)。药物清除NO的能力以抑制乙酰胆碱舒张血管条的百分比来表示。试验结果见表1。
试验结果表明，通过清除NO，Ia-l可抑制乙酰胆碱的血管条舒张作用。可见，通过Lys将溶栓肽ARPAK，GRPAK，RPAK或PAK和靶向肽RGDS，RGDV或RGDF连接到自由基清除剂(1，3-二氧基-2-(4’-氧乙酸-苯基)-4，4，5，5-四甲基咪唑啉，TMMZ)上，有9个化合物抑制乙酰胆碱舒张血管条的活性明显比TMMZ强，有2个化合物抑制乙酰胆碱舒张血管条的活性与TMMZ没有差异，有1个化合物抑制乙酰胆碱舒张血管条的活性明显比TMMZ弱。在评价的12种化合物中，抑制率超过30％有4个化合物。这4个化合物抑制乙酰胆碱舒张血管条的活性顺序是Ie＞Ih＞Ib＞If。这就意味着通过Lys将溶栓肽ARPAK，GRPAK，RPAK或PAK和靶向肽RGDS，RGDV或RGDF连接到自由基清除剂TMMZ上，整体上改善了TMMZ基清除NO自由基的活性。
表1Ia-l对乙酰胆碱舒张血管条的百分抑制率
Figure BSA00000860797200371
n＝6；a)与TMMZ比p＜0.01；b)与TMMZ比p＞0.05；c)与TMMZ比p＜0.05.
试验例2本发明化合物Ia至Il的溶解优球蛋白试验
取猪血与3.8％枸橼酸钠溶液按9∶1的体积比混合，立即以3000r/min速度离心10min，分离出贫血小板血浆。向50mL的离心管加2mL贫血小板的猪血浆和36mL超纯水。每管加0.4mL乙酸(1％)，充分混合，放入4℃冰箱冷冻10min，以3000r/min速度离心10min。倒置离心管，待液体流干后用滤纸吸干管内壁。将离心所得的优球蛋白沉淀冷冻干燥约40min，刮出。取约35mg优球蛋白溶于7mL硼砂缓冲液(pH9.28)。1小时后优球蛋白基本溶解，加入0.7mL CaCl2溶液(25mM)，立刻将其平铺于10×10cm的玻璃板上，厚约1mm。凝固后，用移液枪将10μL生理盐水或10μL化合物Ia-l之一的生理盐水溶液(1mM)或10μL尿激酶的生理盐水溶液(0.8mg/mL)滴加到凝固平板上，每两点之间的间隔大于1.5cm，每个样品点3次。4小时后量取溶圈的直径，读数列入表2。
试验结果表明，通过Lys将溶栓肽ARPAK，GRPAK，RPAK或PAK和靶向肽RGDS，RGDV或RGDF连接到自由基清除剂TMMZ上，所有化合物显示明确的优球蛋白溶解活性。
表2Ia-l作用4h的优球蛋白溶解直径
Figure BSA00000860797200381
n＝3；a)与Ia-l比p＜0.01.
试验例3本发明化合物Ia至Il的体外溶栓试验
SD大鼠(雄性，350-400g)按1200mg/kg剂量腹腔注射乌拉坦溶液进行麻醉。麻醉大鼠仰卧位固定，分离右颈总动脉，于近心端夹动脉夹，近心端和远心端分别穿入手术线，将远心端的手术线于皮毛用止血钳夹紧，在远心端插管，松开动脉夹，放出全部动脉血，装在50ml事先硅油化的容器中。往垂直固定的玻璃管(长20mm，内径4mm，外径5mm，管底用胶塞密封)中注入0.8ml大鼠动脉血液，往管内迅速插入一支不锈钢质料的血栓固定螺栓。该血栓固定螺旋用直径为0.2mm的不锈钢丝绕成，螺旋部分长18mm，含15个螺圈，螺圈的直径为1.8mm，托柄与螺旋相连，长7.0mm，呈问号型。血液凝固40min后，打开玻璃管底部的胶塞，用镊子固定血栓固定螺旋的托柄，从玻璃管中小心地取出被血栓包裹的血栓固定螺旋。将其悬浮浸泡于三蒸水中，以除去表面的浮血。1h后取出，精确称重。将血栓悬浮浸泡在8mL生理盐水中或化合物Ia-l之一的生理盐水溶液(浓度为100nM)中或ARPAK，或GRPAK，或RPAK，或P AK的生理盐水溶液(浓度为100nM)中或尿激酶的生理盐水溶液(100IU/mL)中，于37℃恒温摇床中振摇(63r/min)，2h后取出，精确称量栓重。求出血栓在给药前后的质量差，结果列入表3。
试验结果表明，通过Lys将溶栓肽ARPAK，GRPAK，RPAK或PAK和靶向肽RGDS，RGDV或RGDF连接到自由基清除剂TMMZ上，所有化合物显示明确的体外溶栓活性。由于Ia-c的活性与ARPAK的活性相当，Id-f的活性与GRPAK的活性相当，Ig-i的活性与RPAK的活性相当，Ij-l的活性与PAK的活性相当，所以一方面Ia-l的体外溶栓活性应当归咎于溶栓肽的活性，另一方面通过Lys将溶栓肽ARPAK，GRPAK，RPAK或PAK和靶向肽RGDS，RGDV或RGDF连接到自由基清除剂TMMZ上不会降低对应的溶栓肽的活性。
表3Ia-l作用2h的体外溶栓活性
n＝6；a)与Ia-l比p＜0.01.
试验例4本发明化合物Ia至Il的体内溶栓试验
SD大鼠(雄性，220-230g)按1200mg/kg剂量腹腔注射乌拉坦溶液进行麻醉。麻醉大鼠仰卧位固定，分离右颈总动脉，于近心端夹动脉夹，近心端和远心端分别穿入手术线，将远心端的手术线于皮毛用止血钳夹紧，在远心端插管，松开动脉夹，放出约1ml动脉血，装在1ml子弹头中。往垂直固定的玻璃管(长15mm，内径2.5mm，外径5.0mm，管底用胶塞密封)中注入0.1ml大鼠动脉血液，往管内迅速插入一支不锈钢质料的血栓固定螺栓。该血栓固定螺旋用直径为0.2mm的不锈钢丝绕成，螺旋部分长12mm，含15个螺圈，螺圈的直径为1.0mm，托柄与螺旋相连，长7.0mm，呈问号型。血液凝固15min后，打开玻璃管底部的胶塞，用镊子固定血栓固定螺旋的托柄，从玻璃管中小心地取出被血栓包裹的血栓固定螺旋，精确称重。
旁路插管由3段构成。中段为聚乙烯胶管，长60.0mm，内径3.5mm。两端为相同的聚乙烯管，管长100.0mm，内径1.0mm，外径2.0mm该管的一端拉成尖管以便插入大鼠颈动脉或静脉，外径为1.0mm，另一端的外部套一段长7.0mm，外径为3.5mm的聚乙烯管(加粗，用于插入中段的聚乙烯胶管内)3段管的内壁均硅烷化(1％的硅油乙醚溶液)。将血栓包裹的血栓固定螺旋放入中段聚乙烯胶管内，胶管的两端分别与两根聚乙烯的加粗端相套。用注射器通过尖管端将管中注满肝素生理盐水溶液(50IU/kg)，备用。继续分离麻醉大鼠的气管，并做气管插管。分离大鼠的左颈外静脉，近心端和远心端分别穿入手术线，在暴露的左颈外静脉上小心地剪一斜口，将上面制备好的旁路管道的尖管由斜口插入左颈外静脉开口的近心端，同时远离旁路管中段(含精确称重的血栓固定螺旋)内血栓固定螺旋的托柄。用注射器通过另一端的尖管推入准确量的肝素生理盐水(50IU/kg)，此时注射器不要撤离聚乙烯管，用止血钳夹住注射器与聚乙烯管之间的软管。在右颈总动脉的近心端用动脉夹止血，在离动脉夹不远处将右颈总动脉小心地剪一斜口。从聚乙烯管的尖部拔出注射器，将聚乙烯管的尖部插入动脉斜口的近心端。旁路管道的两端都用4号手术缝线与动静脉固定。
用头皮针将生理盐水(3mL/kg)，或尿激酶的生理盐水溶液(剂量为20000IU/kg)或化合物Ia-l之一的生理盐水溶液(剂量为0.1μmol/kg)或ARPAK，或GRPAK，或RPAK，或P AK的生理盐水溶液(剂量为1μmol/kg)通过旁路管的中段(含精确称重的血栓固定螺旋)，刺入远离血栓固定螺旋的近静脉处，打开动脉夹，使血流通过旁路管道从动脉流向静脉，此即大鼠动静脉旁路溶栓模型，缓慢将注射器中的液体注入到血液中，使生理盐水(空白对照)，尿激酶(阳性对照)或或ARPAK，或GRPAK，或RPAK，或P AK(组分对照)或Ia-l通过血液循环，按静脉—心脏—动脉的顺序作用到血栓上。从开始注射时计时，1h后从旁路管道中取出血栓固定螺旋，精确称重。求每只大鼠旁路管道中血栓固定螺旋给药前后的质量差，试验结果见表4。
试验结果表明，通过Lys将溶栓肽ARPAK，GRPAK，RPAK或PAK和靶向肽RGDS，RGDV或RGDF连接到自由基清除剂TMMZ上得到的化合物Ia-c在0.1μmol/kg剂量下不仅都有确切的溶栓活性，而且活性强度与对应的溶栓肽ARPAK，GRPAK，RPAK或PAK在1μmol/kg剂量下的溶栓活性强度相当。可见，通过Lys将溶栓肽ARPAK，GRPAK，RPAK或PAK和靶向肽RGDS，RGDV或RGDF连接到自由基清除剂TMMZ上可使有效剂量降低10倍。
表4Ia-l的体内溶栓活性
n＝10；a)与Ia-l比p＜0.01.
试验例5本发明化合物Ia至Il的体内抗栓试验
将SD大鼠(雄性，220-230g)随机分组，每组11只，静息饲养一天，停止喂养过夜。大鼠经灌胃给予生理盐水(剂量为3mL/kg)，或化合物Ia-l之一的生理盐水溶液(剂量为0.1μmol/kg)，或靶向肽RGDS，RGDV或RGDF的生理盐水溶液(剂量为10μmol/kg)，或阿司匹林(剂量为33mg/kg)。30分钟后，大鼠用20％乌来糖溶液麻醉后分离右颈动脉和左颈静脉。将插管充满肝素钠的生理盐水溶液后，一端插入左侧静脉，另一端用注射器加入定量肝素钠抗凝后，然后插入右侧动脉。血流从右侧动脉流经聚乙烯管流入左侧静脉，15分钟后取出附有血栓的丝线并记录重量，总重量减去丝线重量即为血栓湿重。试验结果见表5。
试验结果表明，通过Lys将溶栓肽ARPAK，GRPAK，RPAK或PAK和靶向肽RGDS，RGDV或RGDF连接到自由基清除剂TMMZ上得到的化合物Ia-c在0.1μmol/kg口服剂量下不仅都有确切的抗栓活性，而且活性强度与对应的靶向肽RGDS，RGDV或RGDF在10μmol/kg剂量下的抗栓活性强度相当。可见，通过Lys将溶栓肽ARPAK，GRPAK，RPAK或PAK和靶向肽RGDS，RGDV或RGDF连接到自由基清除剂TMMZ上可使有效剂量降低100倍。
表5Ia-l的体内抗栓活性
Figure BSA00000860797200421
n＝11；a)与Ia-l比p＜0.01.
建立评价本发明化合物对中风患者的确切疗效的动物模型
(1)这里描述的大鼠实验方案符合日内瓦动物试验指南并经学校伦理委员会认可。体重为280-305g的清洁级健康雄性SD大鼠，购自维通利华实验动物中心。这些大鼠随机用于制备血栓或制造中风模型；
(2)SD大鼠腹腔注射10％水合氯醛溶液，剂量为400mg/kg体重，使麻醉。分离颈动脉，取新鲜动脉血15mL，按每10μL为一份置于1.5mL的EP管里，形成的血栓先室温放置2小时，再-20℃冰箱中放置22小时。使用时加0.5mL生理盐水，用玻璃棒捣碎，制成大小均匀的血栓块的生理盐水悬浮液，每个血栓块的体积大约为0.1mm3。
(3)SD大鼠腹腔注射10％水合氯醛溶液，剂量为400mg/kg体重，使麻醉。分离颈动脉，取新鲜动脉血15mL，按每10μL为一份置于1.5mL的EP管里，形成的血栓先室温放置24小时。使用时加0.5mL生理盐水，用玻璃棒捣碎，制成大小均匀的血栓块的生理盐水悬浮液，每个血栓块的体积大约为0.1mm3。
(4)雄性SD大鼠腹腔注射10％水合氯醛溶液，剂量为400mg/kg体重，使麻醉。于颈部正中纵行切口，分离出右侧颈总动脉主干(约3cm长)。于舌骨水平分离结扎颈外动脉各分支，于颈膨大处分离出颈内动脉。用无创动脉夹分别夹闭颈内动脉开口处和颈总动脉近心端，并结扎颈外动脉远端。于颈外动脉主干处插入装有0.5mL血栓块生理盐水悬浮液的导管，在松开颈内动脉夹的同时，将导管内的0.5mL血栓块生理盐水悬浮液缓慢从颈外动脉向近心端经过颈内动脉注入大脑中动脉。之后，结扎颈外动脉近心端，打开颈内动脉和颈总动脉处的动脉夹，恢复血流，分离大颈外静脉，把生理盐水(空白对照)或者本发明化合物的生理盐水溶液从颈外静脉输入。缝合伤口，并肌肉注射2万IU的青霉素，预防感染。这是中风立即治疗模型。
(5)雄性SD大鼠腹腔注射10％水合氯醛溶液，剂量为400mg/kg体重，使麻醉。于颈部正中纵行切口，分离出右侧颈总动脉主干(约3cm长)。于舌骨水平分离结扎颈外动脉各分支，于颈膨大处分离出颈内动脉。用无创动脉夹分别夹闭颈内动脉开口处和颈总动脉近心端，并结扎颈外动脉远端。于颈外动脉主干处插入装有0.5mL血栓块生理盐水悬浮液的导管，在松开颈内动脉夹的同时，将导管内的0.5mL血栓块生理盐水悬浮液缓慢从颈外动脉向近心端经过颈内动脉注入大脑中动脉。之后，结扎颈外动脉近心端，打开颈内动脉和颈总动脉处的动脉夹，恢复血流，缝合伤口。并肌肉注射2万IU的青霉素，预防感染。4小时、6小时或者24小时之后把生理盐水(空白对照)或者本发明化合物的生理盐水溶液从尾静脉输入。这是中风4小时、6小时和24小时大鼠的治疗模型。
建立评价本发明化合物对中风4小时、6小时和24小时的确切疗效的动物模型
(1)大鼠中风立即接受本发明化合物治疗、大鼠中风4小时之后接受本发明化合物治疗、大鼠中风6小时之后接受本发明化合物治疗的疗效是指，大鼠大鼠苏醒24小时后观察行为。行为包括行走方式、右眼眼皮下垂程度、尾巴僵直程度、肌肉张力、脑袋偏斜程度、四肢支撑力和死亡状况。
(2)大鼠中风24小时之后接受本发明化合物治疗的疗效是指，治疗24小时后观察大鼠行为。行为包括行走方式、右眼眼皮下垂程度、尾巴僵直程度、肌肉张力、脑袋偏斜程度、四肢支撑力和死亡状况。
(3)一次性接受本发明化合物治疗的中风大鼠的疗效与一次性接受生理盐水治疗的中风大鼠进行比较。
(4)连续接受治疗的中风大鼠每隔24小时从尾静脉输入本发明化合物的生理盐水一次，于翌日录像，自身进行比较。
本发明化合物Ia至Il在上述动物模型的试验结果如下：
试验例6大鼠中风后立即接受本发明化合物Ia至Il治疗的试验
本发明化合物的体内抗中风活性用神经功能评分表示，评分越低活性越强。SD雄性大鼠(250-300g)用10％水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉，从颈部正中略偏右部竖直开约2cm长切口，沿胸锁乳突肌内侧缘分离出右颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。用无创动脉夹分别夹闭颈内动脉开口处和颈总动脉近心端，在颈外动脉剪一小口，结扎颈外动脉远心端，松开颈总动脉近心端的动脉夹，取10μl血，取血之后再用无创动脉夹夹闭颈总动脉近心端。将取得的10μl血装入1mL EP管中，先在常温下放置30分钟使血液凝固，然后转移至-20℃冰箱中放置1小时，使血凝块结实。1小时后取出血液凝块，加入1mL生理盐水用钢铲把血液凝块捣成比较均一的细小血栓，然后把细小血栓混悬液转移至1mL注射器内备用。松开大鼠颈内动脉夹的同时，将1mL注射器内的血栓混悬液缓慢从大鼠颈外动脉向近心端经过颈内动脉注入大鼠的大脑，然后结扎颈外动脉近心端，打开颈内动脉和颈总动脉处得动脉夹，恢复血流。分离大鼠颈总静脉，或立即结扎静脉，伤口处滴加3滴青霉素，缝合伤口，等待动物苏醒，为假手术组，或注入尿激酶的生理盐水溶液(阳性对照组，剂量为20000IU/kg)，或注入生理盐水(空白对照组，剂量为3ml/kg)，或注入TMMZ的生理盐水溶液(组分对照组，剂量为1μmol/kg)，或注入溶栓肽ARPAK，GRPAK，RPAK或PAK的生理盐水溶液(组分对照，剂量为1μmol/kg)，或注入化合物Ia-l之一的生理盐水溶液(剂量为0.1μmol/kg)。大鼠苏醒24小时后按Zealonga方法评定神经功能缺损程度。0分表示无任何神经功能缺失体征，1分表示未损伤侧前肢不能伸展，2分表示向未损伤侧行走，3分表示向未损伤侧转圈成追尾状行走，4分表示意识障碍无自主行走，5分表示死亡。试验结果见表6。
试验结果表明，通过Lys将溶栓肽ARPAK，GRPAK，RPAK或PAK和靶向肽RGDS，RGDV或RGDF连接到自由基清除剂TMMZ上得到的化合物Ia-c在0.1μmol/kg剂量下都有确切的抗中风活性。而在20000IU/kg剂量下尿激酶没有显示确切的抗中风活性。同样，在1μmol/kg剂量下溶栓肽ARPAK，GRPAK，RPAK或PAK也没有显示确切的抗中风活性。可见，通过Lys将溶栓肽ARPAK，GRPAK，RPAK或PAK和靶向肽RGDS，RGDV或RGDF连接到自由基清除剂TMMZ上可使化合物具有抗中风作用。其中在1μmol/kg剂量下有4种化合物的抗中风活性与20000IU/kg剂量下的尿激酶的抗中风活性相当，有8种化合物的抗中风活性明显强于20000IU/kg剂量下的尿激酶的抗中风活性。
表6Ia-c的体内抗中风活性
Figure BSA00000860797200451
Figure BSA00000860797200461
n＝10；a)与生理盐水比p＞0.05；b)与尿激酶比p＞0.05，与生理盐水比p＜0.01；c)与生理盐水及尿激酶比p＜0.01.
试验例7大鼠中风后立即接受本发明化合物Ia至Il治疗的脑梗死体积试验
试验例6的大鼠苏醒24小时评定神经功能缺损程度后，用乌拉坦麻醉后迅速断头取脑，将脑组织置于-20℃冰箱2小时后，从前额极开始行约2mm冠状连续切片，共6片，然后置于2％TTC溶液中37℃避光孵育30min，并观察脑切片的颜色变化，正常脑组织被TTC染成红色，而缺血脑组织即梗死脑组织呈白色。然后用数码相机照相，经SPSS统计软件处理，计算冠状切片中梗死脑组织体积和正常脑组织体积。试验结果见表7。
试验结果表明，通过Lys将溶栓肽ARPAK，GRPAK，RPAK或PAK和靶向肽RGDS，RGDV或RGDF连接到自由基清除剂TMMZ上得到的化合物Ia-c在0.1μmol/kg剂量下不仅都可有效地减小中风大鼠的脑梗死体积，而且这种作用明显强于在20000IU/kg剂量下尿激酶的作用。
表7Ia-c治疗的中风大鼠的脑梗死体积
Figure BSA00000860797200471
n＝10；a)与生理盐水相比p＞0.05；b)与生理盐水及Ia-l比p＜0.01.
试验例8大鼠中风后立即接受不同剂量本发明化合物Ie治疗的试验
为了说明化合物Ia至Il在上述试验中体现的治疗作用具有剂量依赖关系，本发明在分析、比较和综合所有试验结果的基础上选择化合物Ie作代表，进行量效关系试验。应当强调的是，因为在试验例1-7中Ia至Il的其它化合物与Ie达到类似的NO自由基清除、溶解优球蛋白、溶血栓、抗血栓以及治疗中风大鼠等效果，所以Ia至Il的其它化合物应与Ie一样可以获得剂量依赖的治疗作用。
SD雄性大鼠(250-300g)用10％水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉，从颈部正中略偏右部竖直开约2cm长切口，沿胸锁乳突肌内侧缘分离出右颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。用无创动脉夹分别夹闭颈内动脉开口处和颈总动脉近心端，在颈外动脉剪一小口，结扎颈外动脉远心端，松开颈总动脉近心端的动脉夹，取10μl血，取血之后再用无创动脉夹夹闭颈总动脉近心端。将取得的10μl血装入1mL EP管中，先在常温下放置30分钟使血液凝固，然后转移至-20℃冰箱中放置1小时，使血凝块结实。1小时后取出血液凝块，加入1mL生理盐水用钢铲把血液凝块捣成比较均一的细小血栓，然后把细小血栓混悬液转移至1mL注射器内备用。松开大鼠颈内动脉夹的同时，将1mL注射器内的血栓混悬液缓慢从大鼠颈外动脉向近心端经过颈内动脉注入大鼠的大脑，然后结扎颈外动脉近心端，打开颈内动脉和颈总动脉处得动脉夹，恢复血流，注入尿激酶的生理盐水溶液(阳性对照组，剂量为20000IU/kg)，或注入tPA的生理盐水溶液(阳性对照组，剂量为3mg/kg)，或注入生理盐水(空白对照组，剂量为3mL/kg)，或注入化合物Ie的生理盐水溶液(剂量为1μmol/kg，0.1μmol/kg，0.1μmol/kg)。大鼠苏醒24小时后按Zealonga方法评定神经功能缺损程度。0分表示无任何神经功能缺失体征，1分表示未损伤侧前肢不能伸展，2分表示向未损伤侧行走，3分表示向未损伤侧转圈成追尾状行走，4分表示意识障碍无自主行走，5分表示死亡。试验结果见表8。结果表明，大鼠中风之后立即接受1μnmol/kg，0.1μnmol/kg和0.01μnmol/kg化合物Ie治疗，神经功能评分为0的大鼠的百分数分别为60％，30％和0％；神经功能评分为1的大鼠的百分数分别为20％，30％和10％。可见，化合物Ie的抗中风活性显示剂量依赖性。此外，与20000IU/kg尿激酶和3mg/kg tPA治疗的中风大鼠的神经功能评分为0的大鼠的百分数分别为10％和40％以及神经功能评分为1的大鼠的百分数分别为50％和10％相比，1μnmol/kg和0.1μnmol/kg化合物Ie的疗效明显优秀。
表8不同剂量下本发明化合物Ie的体内抗中风活性
Figure BSA00000860797200481
n＝10；a)与生理盐水比p＜0.01.
试验例9大鼠中风4小时后接受1μmol/kg本发明化合物Ie连续治疗6次的试验
疗效用神经功能评分表示，评分越低疗效越好。雄性SD大鼠腹腔注射10％水合氯醛溶液，剂量为400mg/kg体重，使麻醉。于颈部正中纵行切口，分离出右侧颈总动脉主干(约3cm长)。于舌骨水平分离结扎颈外动脉各分支，于颈膨大处分离出颈内动脉。用无创动脉夹分别夹闭颈内动脉开口处和颈总动脉近心端，并结扎颈外动脉远端。于颈外动脉主干处插入装有0.5mL血栓块生理盐水悬浮液的导管，在松开颈内动脉夹的同时，将导管内的0.5mL血栓块生理盐水悬浮液缓慢从颈外动脉向近心端经过颈内动脉注入大脑中动脉。之后，结扎颈外动脉近心端，打开颈内动脉和颈总动脉处的动脉夹，恢复血流，缝合伤口。并肌肉注射2万IU的青霉素，预防感染。4小时之后把化合物Ie(剂量为1μmol/kg，n＝11)的生理盐水溶液，或尿激酶(剂量为20000IU/kg，n＝6)的生理盐水溶液，或tPA(剂量为3mg/kg，n＝6)的生理盐水溶液从尾静脉输入。每天从大鼠尾静脉输1次化合物Ie的生理盐水溶液，连续输6天，观察7天，每天自身对照，按Zealonga方法评定神经功能缺损程度。或每天从大鼠尾静脉输1次尿激酶的生理盐水溶液，连续输2天，每天自身对照，按Zealonga方法评定神经功能缺损程度。或每天从大鼠尾静脉输1次tPA的生理盐水溶液，连续输2天，每天自身对照，按Zealonga方法评定神经功能缺损程度。0分表示无任何神经功能缺失体征，1分表示未损伤侧前肢不能伸展，2分表示向未损伤侧行走，3分表示向未损伤侧转圈成追尾状行走，4分表示意识障碍无自主行走，5分表示死亡。试验结果见表9-1，9-2和9-3。
表9-1的数据说明，大鼠中风4小时之后每天接受1次剂量为1μmol/kg的化合物Ie治疗，连续治疗6次，除1只于第二天意外死亡，其余10只大鼠有8只好转为无任何神经功能缺失体征，有两只残留轻微的神经功能缺失体征。可见，在1μmol/kg剂量下，化合物Ie对超出黄金期的中风有确切的治疗作用。
表9-1大鼠中风4小时后接受1μmol/kg本发明化合物Ie治疗的疗效
Figure BSA00000860797200491
表9-2的数据说明，大鼠中风4小时之后每天接受1次剂量为20000IU/kg的尿激酶治疗，6只大鼠有2只于48小时内死亡。对死亡大鼠进行了尸体解剖，发现它们的脏器都有出血现象，尤其是肺出血严重。于是，在给药2次之后终止给药。2次给药没有大鼠好转为无任何神经功能缺失体征或残留轻微的神经功能缺失体征。
表9-2大鼠中风4小时后接受20000IU/kg尿激酶治疗的疗效
评分时间 每天神经功能评分(Mean±SD)及得分的大鼠数目
0分 1分 2分 3分 4分 5分
第一天 2只 3只 1只
第二天 3只 1只 1只
表9-3的数据说明，大鼠中风4小时之后每天接受1次剂量为3mg/kg的tPA治疗，6只大鼠有1只于24小时内死亡。对死亡大鼠进行了尸体解剖，发现它们的脏器都有出血现象，尤其是肺出血严重。于是，在给药2次之后终止给药。2次给药没有大鼠好转为无任何神经功能缺失体征，有2只好转为残留轻微的神经功能缺失体征。
表9-3大鼠中风4小时后接受3mg/kg tPA治疗的疗效
Figure BSA00000860797200501
综合表9-1，9-2和9-3的数据可以看出，对于中风4小时的大鼠即使连续治疗两天，剂量为1μmol/kg的化合物Ie也明显比剂量为20000IU/kg的尿激酶和剂量为3mg/kg的tPA优秀。
试验例10大鼠中风6小时后接受1μmol/kg本发明化合物Ie连续治疗6次的试验
疗效用神经功能评分表示，评分越低疗效越好。雄性SD大鼠腹腔注射10％水合氯醛溶液，剂量为400mg/kg体重，使麻醉。于颈部正中纵行切口，分离出右侧颈总动脉主干(约3cm长)。于舌骨水平分离结扎颈外动脉各分支，于颈膨大处分离出颈内动脉。用无创动脉夹分别夹闭颈内动脉开口处和颈总动脉近心端，并结扎颈外动脉远端。于颈外动脉主干处插入装有0.5mL血栓块生理盐水悬浮液的导管，在松开颈内动脉夹的同时，将导管内的0.5mL血栓块生理盐水悬浮液缓慢从颈外动脉向近心端经过颈内动脉注入大脑中动脉。之后，结扎颈外动脉近心端，打开颈内动脉和颈总动脉处的动脉夹，恢复血流，缝合伤口。并肌肉注射2万IU的青霉素，预防感染。6小时之后把化合物Ie(剂量为1μmol/kg，n＝11)的生理盐水溶液，或尿激酶(剂量为20000IU/kg，n＝6)的生理盐水溶液，或tPA(剂量为3mg/kg，n＝6)的生理盐水溶液从尾静脉输入。每天从大鼠尾静脉输1次化合物Ie的生理盐水溶液，连续输6天，观察7天，每天自身对照，按Zealonga方法评定神经功能缺损程度。或每天从大鼠尾静脉输1次尿激酶的生理盐水溶液，连续输2天，每天自身对照，按Zealonga方法评定神经功能缺损程度。或每天从大鼠尾静脉输1次tPA的生理盐水溶液，连续输2天，每天自身对照，按Zealonga方法评定神经功能缺损程度。0分表示无任何神经功能缺失体征，1分表示未损伤侧前肢不能伸展，2分表示向未损伤侧行走，3分表示向未损伤侧转圈成追尾状行走，4分表示意识障碍无自主行走，5分表示死亡。试验结果见表10-1，10-2和10-3。
表10-1的数据说明，大鼠中风6小时之后每天接受1次剂量为1μmol/kg的化合物Ie治疗，连续治疗6次，除2只于第二天意外死亡，其余9只大鼠有2只好转为无任何神经功能缺失体征，有1只残留轻微的神经功能缺失体征，有6只残留未损伤侧转圈成追尾状行走体征。可见，在1μmol/kg剂量下，化合物Ie对超出黄金期的中风确实有治疗作用。
表10-1大鼠中风6小时后接受1μmol/kg本发明化合物Ie治疗的疗效
Figure BSA00000860797200511
表10-2的数据说明，大鼠中风6小时之后每天接受1次剂量为20000IU/kg的尿激酶治疗，6只大鼠有4只于24小时内死亡。对死亡大鼠进行了尸体解剖，发现它们的脏器都有出血现象，尤其是肺出血严重。于是，在给药2次之后终止给药。2次给药有1只大鼠好转为无任何神经功能缺失体征，有1只大鼠残留意识障碍无自主行走体征。
表10-2大鼠中风6小时后接受20000IU/kg尿激酶治疗的疗效
Figure BSA00000860797200512
表10-3的数据说明，大鼠中风6小时之后每天接受1次剂量为3mg/kg的tPA治疗，6只大鼠有2只于24小时内死亡。对死亡大鼠进行了尸体解剖，发现它们的脏器都有出血现象，尤其是肺出血严重。于是，在给药2次之后终止给药。2次给药没有大鼠好转为无任何神经功能缺失体征，有2只残留轻微的神经功能缺失体征，有1只残留未损伤侧转圈成追尾状行走体征，有1只残留意识障碍无自主行走体征。
表10-3大鼠中风6小时后接受3mg/kg tPA治疗的疗效
Figure BSA00000860797200522
综合表10-1，10-2和10-3的数据可以看出，对于中风6小时的大鼠即使连续治疗两天，剂量为1μmol/kg的化合物Ie也明显比剂量为20000IU/kg的尿激酶和剂量为3mg/kg的tPA优秀。
试验例11大鼠中风6小时后首次5μmol/kg之后5次2μmol/kg本发明化合物Ie治疗的试验
疗效用神经功能评分表示，评分越低疗效越好。雄性SD大鼠腹腔注射10％水合氯醛溶液，剂量为400mg/kg体重，使麻醉。于颈部正中纵行切口，分离出右侧颈总动脉主干(约3cm长)。于舌骨水平分离结扎颈外动脉各分支，于颈膨大处分离出颈内动脉。用无创动脉夹分别夹闭颈内动脉开口处和颈总动脉近心端，并结扎颈外动脉远端。于颈外动脉主干处插入装有0.5mL血栓块生理盐水悬浮液的导管，在松开颈内动脉夹的同时，将导管内的0.5mL血栓块生理盐水悬浮液缓慢从颈外动脉向近心端经过颈内动脉注入大脑中动脉。之后，结扎颈外动脉近心端，打开颈内动脉和颈总动脉处的动脉夹，恢复血流，缝合伤口。并肌肉注射2万IU的青霉素，预防感染。6小时之后把化合物Ie(首次剂量为5μmol/kg，n＝12)的生理盐水溶液从尾静脉输入。之后，每天从大鼠尾静脉输1次化合物Ie的生理盐水溶液(剂量为2μmol/kg，n＝12)，连续输6天，观察7天，每天自身对照，按Zealonga方法评定神经功能缺损程度。0分表示无任何神经功能缺失体征，1分表示未损伤侧前肢不能伸展，2分表示向未损伤侧行走，3分表示向未损伤侧转圈成追尾状行走，4分表示意识障碍无自主行走，5分表示死亡。试验结果见表11。
表11的数据说明，大鼠中风6小时之后第一天接受1次剂量为5μmol/kg的化合物Ie治疗，之后5天每天接受1次剂量为2μmol/kg的化合物Ie治疗可以获得确切疗效。除2只死亡外，接受治疗的12只大鼠中余下的10只大鼠有6只好转为好转为无任何神经功能缺失体征，有2只残留轻微的神经功能缺失体征，有1只残留向未损伤侧行走体征，有1只残留未损伤侧转圈成追尾状行走体征。可见，化合物Ie连续治疗对于对超出黄金期的中风确实有效。
表11大鼠中风6小时后接受本发明化合物Ie治疗的疗效
Figure BSA00000860797200531
试验例12大鼠中风24小时后首次5μmol/kg之后5次2μmol/kg本发明化合物Ie治疗的试验
疗效用神经功能评分表示，评分越低疗效越好。雄性SD大鼠腹腔注射10％水合氯醛溶液，剂量为400mg/kg体重，使麻醉。于颈部正中纵行切口，分离出右侧颈总动脉主干(约3cm长)。于舌骨水平分离结扎颈外动脉各分支，于颈膨大处分离出颈内动脉。用无创动脉夹分别夹闭颈内动脉开口处和颈总动脉近心端，并结扎颈外动脉远端。于颈外动脉主干处插入装有0.5mL血栓块生理盐水悬浮液的导管，在松开颈内动脉夹的同时，将导管内的0.5mL血栓块生理盐水悬浮液缓慢从颈外动脉向近心端经过颈内动脉注入大脑中动脉。之后，结扎颈外动脉近心端，打开颈内动脉和颈总动脉处的动脉夹，恢复血流，缝合伤口。并肌肉注射2万IU的青霉素，预防感染。24小时之后把化合物Ie(首次剂量为5μmol/kg，n＝12)的生理盐水溶液从尾静脉输入。之后，每天从大鼠尾静脉输1次化合物Ie的生理盐水溶液(剂量为2μmol/kg)，连续输6天，观察7天，每天自身对照，按Zealonga方法评定神经功能缺损程度。0分表示无任何神经功能缺失体征，1分表示未损伤侧前肢不能伸展，2分表示向未损伤侧行走，3分表示向未损伤侧转圈成追尾状行走，4分表示意识障碍无自主行走，5分表示死亡。试验结果见表12。
表12的数据说明，大鼠中风24小时之后第一天接受1次剂量为5μmol/kg的化合物Ie治疗，之后5天每天接受1次剂量为2μmol/kg的化合物Ie治疗可以获得确切疗效。除3只死亡外，接受治疗的12只大鼠中余下的9只大鼠有8只好转为好转为无任何神经功能缺失体征，有1只残留轻微的神经功能缺失体征。可见，化合物Ie连续治疗对于对超出黄金期的中风确实有效。
表12大鼠中风24小时后接受本发明化合物Ie治疗的疗效
试验例13大鼠中风6小时后6次2μmol/kg本发明化合物Ie治疗的试验
疗效用神经功能评分表示，评分越低疗效越好。雄性SD大鼠腹腔注射10％水合氯醛溶液，剂量为400mg/kg体重，使麻醉。于颈部正中纵行切口，分离出右侧颈总动脉主干(约3cm长)。于舌骨水平分离结扎颈外动脉各分支，于颈膨大处分离出颈内动脉。用无创动脉夹分别夹闭颈内动脉开口处和颈总动脉近心端，并结扎颈外动脉远端。于颈外动脉主干处插入装有0.5mL血栓块生理盐水悬浮液的导管，在松开颈内动脉夹的同时，将导管内的0.5mL血栓块生理盐水悬浮液缓慢从颈外动脉向近心端经过颈内动脉注入大脑中动脉。与前面的试验例不同，本试验例使用的血栓块不是用-24℃保存的血栓制备的血栓块的生理盐水悬浮液，而是用室温放置24小时的更加陈旧的血栓制备的明显硬的血栓块的生理盐水悬浮液。之后，结扎颈外动脉近心端，打开颈内动脉和颈总动脉处的动脉夹，恢复血流，缝合伤口。并肌肉注射2万IU的青霉素，预防感染。24小时之后把化合物Ie(首次剂量为5μmol/kg，n＝12)的生理盐水溶液从尾静脉输入。之后，每天从大鼠尾静脉输1次化合物Ie的生理盐水溶液(剂量为2μmol/kg)，连续输6天，观察7天，每天自身对照，按Zealonga方法评定神经功能缺损程度。0分表示无任何神经功能缺失体征，1分表示未损伤侧前肢不能伸展，2分表示向未损伤侧行走，3分表示向未损伤侧转圈成追尾状行走，4分表示意识障碍无自主行走，5分表示死亡。试验结果见表13。
表13的数据说明，在陈旧血栓诱导的大鼠中风6小时之后的模型上，每天给于1次剂量为2μmol/kg的化合物Ie治疗，连续6次可以获得确切疗效。除6只死亡外，接受治疗的12只大鼠中余下的6只大鼠有1只好转为好转为无任何神经功能缺失体征，有5只残留轻微的神经功能缺失体征。可见，化合物Ie连续治疗对于陈旧性中风确实有效。
表13大鼠中风6小时后接受2μmol/kg本发明化合物Ie治疗的疗效
Figure BSA00000860797200551
Figure BSA00000860797200561
应当强调的是，因为在试验例1-7中Ia至Il的其它化合物与Ie达到类似的NO自由基清除、溶解优球蛋白、溶血栓、抗血栓以及治疗中风大鼠等效果，所以Ia至Il的其它化合物应与Ie一样可以获得对于陈旧性中风的治疗作用。
试验例14本发明化合物Ia至Il在1×10-6M、1×10-9M和1×10-12M浓度下的纳米结构试验
将本发明化合物Ia至Il用三蒸水分别配成1×10-6M，1×10-9M和1×10-12M的溶液，吸取10μL滴于铜网表面，铜网下面衬滤纸，自然晾干，在透射电子显微镜透射电镜(JEOL，JEM-1230)下观察并用照片记录形态及粒径。
1.供试化合物：本发明化合物Ia至Il。
2.试验方法：将供试化合物(Ia-Il)用三蒸水分别配成1×10-6M，1×10-9M和1×10-12M的溶液，吸取微量(约10μl)滴于铜网表面，铜网下面衬滤纸，自然晾干，在透射电子显微镜透射电镜(JEOL，JEM-1230)下观察形态及粒径，并用照片记录。
3.试验结果试验结果见图25-36。图25为本发明化合物Ia在1×10-6M，1×10-9M和1×10-12M水溶液中的纳米结构，水溶液中Ia的纳米结构是直径为3.1nm至86.1nm的纳米球；图26为本发明化合物Ib在1×10-6M，1×10-9M和1×10-12M水溶液中的纳米结构，水溶液中Ib的纳米结构是直径为4.3nm至297.9nm的纳米球；图27为本发明化合物Ic在1×10-6M，1×10-9M和1×10-12M水溶液中的纳米结构，水溶液中Ic的纳米结构分别是直径为2.2nm至165.7nm的纳米球；图28为本发明化合物Id在1×10-6M，1×10-9M和1×10-12M水溶液中的纳米结构，水溶液中Id的纳米结构是直径为16.2nm至201.2nm的纳米球；图29为本发明化合物Ie在1×10-6M，1×10-9M和1×10-12M水溶液中的纳米结构，水溶液中Ie的纳米结构是直径为3.3nm至138.9nm的纳米球；图30为本发明化合物If在1×10-6M，1×10-9M和1×10-12M水溶液中的纳米结构，水溶液中If的纳米结构是直径为3.6nm至82.4nm的纳米球；图31为本发明化合物Ig在1×10-6M，1×10-9M和1×10-12M水溶液中的纳米结构，水溶液中Ig的纳米结构是直径为6.3nm至264.5nm的纳米球；图32为本发明化合物Ih在1×10-6M，1×10-9M和1×10-12M水溶液中的纳米结构，水溶液中Ih的纳米结构是直径为5.1nm至149.8nm的纳米球；图33为本发明化合物Ii在1×10-6M，1×10-9M和1×10-12M水溶液中的纳米结构，水溶液中Ii的纳米结构是直径为4.7nm至107.7nm的纳米球；图34为本发明化合物Ij在1×10-6M，1×10-9M和1×10-12M水溶液中的纳米结构，水溶液中Ij的纳米结构是直径为9.1nm至73.7nm的纳米球；图35为本发明化合物Ik在1×10-6M，1×10-9M和1×10-12M水溶液中的纳米结构，水溶液中Ik的纳米结构是直径为10.1nm至66.7nm的纳米球；图36为本发明化合物Il在1×10-6M，1×10-9M和1×10-12M水溶液中的纳米结构，水溶液中Il的纳米结构是直径为6.1nm至153.3nm的纳米球。
试验例15本发明化合物Ia至Il在1×10-6M，1×10-9M和1×10-12M浓度下的高分辨FT-MS试验
将化合物Ia-l用三蒸水分别配成12.5μM的溶液，吸取10μL进样，在solariX FT-ICR质谱(Bruk er Daltonik)上观察分子间缔合状态，并记录数据。结果列入表14-16。
表14本发明化合物Ia-l在三种浓度下形成的二聚体的高分辨FT-MS数据
Figure BSA00000860797200571
Figure BSA00000860797200581
表15本发明化合物Ia-l在三种浓度下形成的三聚体的高分辨FT-MS数据
Figure BSA00000860797200582
表16本发明化合物Ia-l在三种浓度下形成的四聚体的高分辨FT-MS数据
Figure BSA00000860797200583
Figure BSA00000860797200591
表14-16是使用FT高分辨质谱仪测定的精确质数。这些质量数说明，本发明化合物Ia-l在1×10-6M、1×10-9和1×10-12M三种浓度下同时测定到二聚体、三聚体和四聚体。可见，本发明化合物在水溶液中可以同时形成二聚体、三聚体和四聚体。
试验例16本发明化合物Ie在10.0μM，1.0μM，0.1μM，0.01μM浓度下的高分辨FT-MS试验
为了将质谱可视化将化合物Ie用三蒸水分别配成10.0μM，1.0μM，0.1μM，0.01μM的溶液，吸取10μL进样，在solariX FT-ICR质谱(Bruk er Daltonik)上观察分子间缔合状态，并记录图谱。结果如图37-40所示。图37为本发明化合物Ie在0.01μM浓度下的高分辨FT-MS质谱图：915.84146为二聚体的三电荷离子，1030.32114三聚电荷离子1099.00914为四聚体的五电荷离子；图38为本发明化合物Ie在0.1μM浓度下的高分辨FT-MS质谱图：915.84146为二聚体的三电荷离子，1030.32114三聚电荷离子1099.00914为四聚体的五电荷离子；图39为本发明化合物Ie在1μM浓度下的高分辨FT-MS质谱图：915.84146为二聚体的三电荷离子，1030.32114三聚电荷离子1099.00914为四聚体的五电荷离子；图40为本发明化合物Ie在10μM浓度下的高分辨FT-MS质谱图：915.84146为二聚体的三电荷离子，1030.32114三聚电荷离子1099.00914为四聚体的五电荷离子。
本发明化合物在水溶液中形成的二聚体、三聚体和四聚体进一步组装便形成直径为2nm至300nm的纳米球。在这些尺寸的纳米球中，直径小于100nm的纳米球数量超过99％。纳米药学的一个公知的事实是，直径小于100nm的纳米球在血液在输送不易被巨噬细胞吞噬，容易跨过毛细血管壁。这些性能使得本发明的化合物可跨过血脑屏障。正是本发明的化合物可跨过血脑屏障的性能，使得在接受治疗的中风大鼠的脑组织中可检测到本发明的化合物的代谢产物。
试验例17高分辨FT-MS监测本发明化合物Ie治疗的大鼠脑组织中的代谢产物试验
取大鼠整个大脑，放置于50mL离心管中，加入10mL0.9％NaCl溶液，匀浆得到均一的混悬物，然后于3000rpm的条件下离心10min；取上请液5mL，再加入10mL甲醇，振荡混匀后，于3000rpm的条件下离心10min，取上请液并减压浓缩蒸干。再加入1mL甲醇，再次于12000rpm的条件下离心10min所得上清液用于监测化合物在Ie治疗的大鼠脑组织中的代谢产物含量。
高分辨FT-MS的测试结果显示脑中有两个代谢产物M1和M2。其中M1的[M+1]+为291.06971，分子式为C15H19O5N2；M2的[M+1]+为307.04350，分子式为C15H19O4N2(质谱条件：进样量为10μL；电离模式为ES+；锥孔电压为30V；流动相流速为0.2mL/min)。根据这些数据，我们推断代谢产物M1和M2应为以下化合物：
M1 M2
理论分子量： 291.1345 307.1249
测得分子量： 291.0697 307.0435
这说明了本发明化合物Ie确实通过了血脑屏障，可以达成在脑内清除NO自由基、溶血栓和抗血栓的疗效。

Claims (61)

1.一种式I化合物：
Figure FSA00000860797100011
其中，NN代表具清除NO自由基活性的咪唑啉类；AA1代表具有至少三个连接用基团的连接臂；AA2代表具溶血栓活性肽；AA3代表血栓靶向肽。
2.如权利要求1所述的化合物，其中所述具清除NO自由基活性的咪唑啉类为1，3-二氧基-2-[(4-氧乙酸)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉。
3.如权利要求1所述的化合物，其中所述连接用基团选自羧基和氨基所构成的群组。
4.如权利要求3所述的化合物，其中所述连接臂为天然氨基酸。
5.如权利要求4所述的化合物，其中所述天然氨基酸选自L-Lys、L-Asp和L-Glu所构成的群组。
6.如权利要求1所述的化合物，其中所述具溶血栓活性肽为含PAK(Pro-Ala-Lys)序列、AKP(Ala-Lys-Pro)序列或KAP(Lys-Ala-Pro)序列的寡肽或包含以PAK序列、AKP序列或KAP序列为结构单元的重复序列肽。
7.如权利要求6所述的化合物，其中所述含PAK序列、AKP序列或KAP序列的寡肽选自PAK、RPAK(Arg-Pro-Ala-Lys)、ARPAK(Ala-Arg-Pro-Ala-Lys)、GRPAK(Gly-Arg-Pro-Ala-Lys)、QRPAK(Gln-Arg-Pro-Ala-Lys)、AKP、KAP、KPAK(Lys-Pro-Ala-Lys)、PAKP(Pro-Ala-Lys-Pro)、AKPAK(Ala-Lys-Pro-Ala-Lys)和PAKPA(Pro-Ala-Lys-Pro-Ala)所构成的群组。
8.如权利要求6所述的化合物，其中所述以PAK序列、AKP序列或KAP序列为结构单元的重复序列肽选自(PAK)n、(AKP)n和(KPA)n所构成的群组，其中n为2至6。
9.如权利要求1所述的化合物，其中所述血栓靶向肽为含RGD(Arg-Gly-Asp)序列的寡肽。
10.如权利要求9所述的化合物，其中所述含RGD序列的寡肽选自RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser)、RGDV(Arg-Gly-Asp-Val)和RGDF(Arg-Gly-Asp-Phe)所构成的群组。
11.如权利要求1所述的化合物，其中所述血栓靶向肽为RGD(Arg-Gly-Asp)肽与YIGS(Tyr-Ile-Gly-Ser)肽进行缀合式修饰而得的多肽。
12.如权利要求11所述的化合物，其中所述修饰而得的多肽选自YIGSRRGDS、YIGSRRGDV、YIGSRRGDF、YIGSRYIGSK、YIGSRYIGSR、YIGSKRGDS、YIGSKRGDF、YIGSKRGDV、YIGSKYIGSK、YIGSKYIGSR、RGDSRGDS、RGDVRGDV、RGDFRGDF、RGDSYIGSR、RGDSYIGSK、RGDVYIGSR、RGDVYIGSK、RGDFYIGSR、和RGDFYIGSK所构成的群组。
13.如权利要求1所述的化合物，其中所述具清除NO自由基活性的咪唑啉类为1,3-二氧基-2-[(4-氧乙酸)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉；所述连接臂为L-Lys；所述具溶血栓活性肽为含PAK序列(Pro-Ala-Lys)的寡肽；且所述血栓靶向肽为含RGD序列(Arg-Gly-Asp)的寡肽。
14.如权利要求13所述的化合物，具有以下通式I-1或I-2：
其中aa1和aa2可为同时存在、aa1存在但aa2不存在、或同时不存在；当其同时存在时，aa1为R(Arg)，且aa2为G(Gly)、A(Ala)或Q(Gln)；当aa1存在但aa2不存在时，aa1为R(Arg)；aa3可为S(Ser)、V(Val)或F(Phe)。
15.如权利要求14所述的化合物，具有以下通式I-1-1：
Figure FSA00000860797100022
其中aa3的定义如权利要求14中所述。
16.如权利要求14所述的化合物，具有以下通式I-1-2：
Figure FSA00000860797100023
其中aa3的定义如权利要求14中所述。
17.如权利要求16所述的化合物，其中aa3为V(Val)。
18.如权利要求14所述的化合物，具有以下通式I-1-3：
Figure FSA00000860797100031
其中aa3的定义如权利要求14中所述。
19.如权利要求14所述的化合物，具有以下通式I-1-4：
Figure FSA00000860797100032
其中aa3的定义如权利要求14中所述。
20.如权利要求1所述的化合物，其中所述具清除NO自由基活性的咪唑啉类为1，3-二氧基-2-[(4-氧乙酸)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉；所述连接臂为L-Asp；所述具溶血栓活性肽为含PAK序列(Pro-Ala-Lys)的寡肽；且所述血栓靶向肽为含RGD序列(Arg-Gly-Asp)的寡肽。
21.如权利要求20所述的化合物，具有以下通式I-3或I-4：
Figure FSA00000860797100033
其中aa1和aa2可为同时存在、aa1存在但aa2不存在、或同时不存在；当其同时存在时，aa1为R(Arg)，且aa2为G(Gly)、A(Ala)或Q(Gln)；当aa1存在但aa2不存在时，aa1为R(Arg)；aa3可为S(Ser)、V(Val)、或F(Phe)。
22.如权利要求21所述的化合物，其中aa1为R(Arg)；aa2为G(Gly)；且aa3为V(Val)。
23.如权利要求1所述的化合物，其中所述具清除NO自由基活性的咪唑啉类为1，3-二氧基-2-[(4-氧乙酸)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉；所述连接臂为L-Glu；所述具溶血栓活性肽为含PAK序列(Pro-Ala-Lys)的寡肽；且所述血栓靶向肽为含RGD序列(Arg-Gly-Asp)的寡肽。
24.如权利要求23所述的化合物，具有以下通式I-5或I-6：
其中aa1和aa2可为同时存在、aa1存在但aa2不存在、或同时不存在；当其同时存在时，aa1为R(Arg)，且aa2为G(Gly)、A(Ala)或Q(Gln)；当aa1存在但aa2不存在时，aa1为R(Arg)；aa3可为S(Ser)、V(Val)、或F(Phe)。
25.如权利要求24所述的化合物，其中aa1为R(Arg)；aa2为G(Gly)；且aa3为V(Val)。
26.一种药物组合物，包含如权利要求1至25任一项所述的化合物，及药学上可接受的载剂。
27.如权利要求26所述的药物组合物，其中所述化合物选自具有通式I-1、I-2、I-3、I-4、I-5、和I-6的化合物所构成的群组：
Figure FSA00000860797100051
其中aa1和aa2可为同时存在、aa1存在但aa2不存在、或同时不存在；当其同时存在时，aa1为R(Arg)，且aa2为G(Gly)、A(Ala)或Q(Gln)；当aa1存在但aa2不存在时，aa1为R(Arg)；aa3可为S(Ser)、V(Val)、或F(Phe)。
28.如权利要求27所述的药物组合物，其中所述化合物选自具有通式I-1-1、I-1-2、I-1-3和I-1-4的化合物所构成的群组：
Figure FSA00000860797100052
其中aa3的定义如权利要求27中所述。
29.如权利要求28所述的药物组合物，其中所述化合物可形成二聚体、三聚体、或四聚体结构。
30.如权利要求29所述的药物组合物，其中所述化合物可形成纳米球结构。
31.如权利要求30所述的药物组合物，其中所述纳米球结构的直径为2nm至300nm。
32.如权利要求31所述的药物组合物，其中所述纳米球结构的直径为2nm至100nm。
33.如权利要求26所述的药物组合物，作为溶血栓药物。
34.如权利要求33所述的药物组合物，用于治疗心肌梗塞(Mmyocardialinfarction)、中风(Ischemic stroke)、静脉栓塞(Deep vein thrombosis)、肺栓塞(Pulmonaryembolism)、周边动脉阻塞性疾病(Peripheral arterial occlusive disease)、静脉导管阻塞(occluded central vascular access devices)、动静脉廔管及分流管阻塞(Clottedarteriovenous fistula and shunts)、或颈动脉狭窄(Carotid Stenosis)。
35.如权利要求26所述的药物组合物，作为清除NO自由基药物。
36.如权利要求35所述的药物组合物，用于治疗神经退化疾病(Neurodegenerativediseases)、心血管疾病(Cardiovascular disease)、精神疾病、高地综合症(Altitudesickness)、糖尿病、类风湿性关节炎、创伤性脑损伤(Traumatic brain injury)、癌症、X染色体易裂症(Fragile X syndrome)、镰刀型红血球疾病(Sickle Cell Disease)、扁平苔藓(Lichen planus)、白斑病(Vitiligo)、或慢性疲劳症候群。
37.如权利要求26所述的药物组合物，作为抗血栓药物。
38.如权利要求37所述的药物组合物，用于治疗血小板增多症(Thrombocytosis)、骨髓增生性疾病(myeloproliferative disease)、真性红细胞增多症(Polycythemia vera)、或布卡综合征。
39.如权利要求26所述的药物组合物作为治疗中风或脑梗药物。
40.如权利要求39所述的药物组合物，用于连续给药方式来治疗中风或脑梗。
41.如权利要求39所述的药物组合物，用于治疗发病超过3小时的中风或脑梗。
42.如权利要求39所述的药物组合物，用于治疗发病超过4小时的中风或脑梗。
43.如权利要求39所述的药物组合物，用于治疗发病超过6小时的中风或脑梗。
44.如权利要求39所述的药物组合物，用于治疗发病超过24小时的中风或脑梗。
45.一种权利要求1所述式I化合物的制备方法，
其中，NN代表具清除NO自由基活性的咪唑啉类；AA1代表具有至少三个连接用基团的连接臂；AA2代表具溶血栓活性肽；AA3代表血栓靶向肽；
包括以下步骤：
(1)提供所述具清除NO自由基活性的咪唑啉类(NN)、具有至少三个连接用基团的连接臂(AA1)、具溶血栓活性肽(AA2)及血栓靶向肽(AA3)，其中所述连接臂具有第一连接用基团、第二连接用基团及第三连接用基团；
(2)在适当反应条件下，连接所述具清除NO自由基活性的咪唑啉类(NN)与所述连接臂(AA1)的第一连接用基团，形成通式IM-1化合物：
NN-AA1(IM-1)：
(3)在适当反应条件下，连接所述具溶血栓活性肽(AA2)与通式IM-1化合物，其中所述具溶血栓活性肽的一端与所述连接臂的第二连接用基团相连接，形成通式IM-2化合物：
NN-AA1-AA2(IM-2)；及
(4)在适当反应条件下，连接所述血栓靶向肽(AA3)与通式IM-2化合物，其中所述血栓靶向肽的一端与所述连接臂的第三连接用基团相连接而形成式I化合物；其中步骤(3)与步骤(4)的顺序可以交换。
46.如权利要求45所述的制备方法，步骤(1)更包含将所述连接臂(AA1)的第二和第三连接用基团以保护基保护，且将具溶血栓活性肽(AA2)和血栓靶向肽(AA3)上除连接用一端外的活性基团以保护基保护；步骤(3)更包含先将受保护的第二连接用基团去保护，再将所述具溶血栓活性肽与所述去保护的第二连接用基团相连接；步骤(4)更包含先将受保护的第三连接用基团去保护，再将所述血栓靶向肽与所述去保护的第三连接用基团相连接；且步骤(4)后更包含将具溶血栓活性肽(AA2)和血栓靶向肽(AA3)上受保护的活性基团去保护。
47.如权利要求45所述的制备方法，其中所述第一连接用基团为氨基，且所述第二和第三连接用基团选自羧基和氨基所构成的群组。
48.如权利要求47所述的制备方法，其中所述连接臂选自L-Lys、L-Asp和L-Glu所构成的群组。
49.如权利要求45所述的制备方法，其中所述具溶血栓活性肽为含PAK(Pro-Ala-Lys)序列、AKP(Ala-Lys-Pro)序列或KAP(Lys-Ala-Pro)序列的寡肽或包含以PAK序列、AKP序列或KAP序列为结构单元的重复序列肽。
50.如权利要求49所述的制备方法，其中所述含PAK序列、AKP序列或KAP序列的寡肽选自PAK(Pro-Ala-Lys)、RPAK(Arg-Pro-Ala-Lys)、ARPAK(Ala-Arg-Pro-Ala-Lys)、GRPAK(Gly-Arg-Pro-Ala-Lys)、QRPAK(Gln-Arg-Pro-Ala-Lys)、AKP、KAP、KPAK(Lys-Pro-Ala-Lys)、PAKP(Pro-Ala-Lys-Pro)、AKPAK(Ala-Lys-Pro-Ala-Lys)和PAKPA(Pro-Ala-Lys-Pro-Ala)所构成的群组。
51.如权利要求49所述的制备方法，其中所述以PAK序列、AKP序列或KAP序列为结构单元的重复序列肽选自(PAK)n、(AKP)n和(KPA)n所构成的群组，其中n为2至6。
52.如权利要求45所述的制备方法，其中所述血栓靶向肽为含RGD(Arg-Gly-Asp)序列的寡肽。
53.如权利要求52所述的制备方法，其中所述含RGD序列的寡肽选自RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser)、RGDV(Arg-Gly-Asp-Val)和RGDF(Arg-Gly-Asp-Phe)所构成的群组。
54.如权利要求45所述的制备方法，其中所述血栓靶向肽为RGD(Arg-Gly-Asp)肽与YIGS(Tyr-Ile-Gly-Ser)肽进行缀合式修饰而得的多肽。
55.如权利要求54所述的制备方法，其中所述修饰而得的多肽选自YIGSRRGDS、YIGSRRGDV、YIGSRRGDF、YIGSRYIGSK、YIGSRYIGSR、YIGSKRGDS、YIGSKRGDF、YIGSKRGDV、YIGSKYIGSK、YIGSKYIGSR、RGDSRGDS、RGDVRGDV、RGDFRGDF、RGDSYIGSR、RGDSYIGSK、RGDVYIGSR、RGDVYIGSK、RGDFYIGSR、和RGDFYIGSK所构成的群组。
56.如权利要求45所述的制备方法，其中所述具清除NO自由基活性的咪唑啉类为1，3-二氧基-2-[(4-氧乙酸)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉；所述连接臂为L-Lys；所述具溶血栓活性肽为含PAK序列(Pro-Ala-Lys)的寡肽；且所述血栓靶向肽为含RGD序列(Arg-Gly-Asp)的寡肽。
57.如权利要求56所述的制备方法，其中1，3-二氧基-2-[(4-氧乙酸)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉与L-Lys连接臂的一氨基相连接；所述含PAK序列的寡肽上的羧基与L-Lys连接臂的另一氨基相连接；且所述含RGD序列的寡肽上的氨基与L-Lys连接臂的羧基相连接。
58.如权利要求56所述的制备方法，其中1，3-二氧基-2-[(4-氧乙酸)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉与L-Lys连接臂的一氨基相连接；所述含PAK序列的寡肽上的氨基与L-Lys连接臂的羧基相连接；且所述含RGD序列的寡肽上的羧基与L-Lys连接臂的另一氨基相连接。
59.如权利要求45所述的制备方法，其中所述具清除NO自由基活性的咪唑啉类为1，3-二氧基-2-[(4-氧乙酸)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉；所述连接臂为L-Asp；所述具溶血栓活性肽为含PAK序列(Pro-Ala-Lys)的寡肽；所述血栓靶向肽为含RGD序列(Arg-Gly-Asp)的寡肽；且其中1，3-二氧基-2-[(4-氧乙酸)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉与L-Asp连接臂的氨基相连接；所述含PAK序列的寡肽上的氨基与L-Asp连接臂的一羧基相连接；且所述含RGD序列的寡肽上的氨基与L-Asp连接臂的另一羧基相连接。
60.如权利要求45所述的制备方法，其中所述具清除NO自由基活性的咪唑啉类为1，3-二氧基-2-[(4-氧乙酸)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉；所述连接臂为L-Glu；所述具溶血栓活性肽为含PAK序列(Pro-Ala-Lys)的寡肽；且所述血栓靶向肽为含RGD序列(Arg-Gly-Asp)的寡肽；且其中1，3-二氧基-2-[(4-氧乙酸)苯基]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉与L-Glu连接臂的氨基相连接；所述含PAK序列的寡肽上的氨基与L-Glu连接臂的一羧基相连接；且所述含RGD序列的寡肽上的氨基与L-Glu连接臂的另一羧基相连接。
61.如权利要求56至60任一项所述的制备方法，其中所述含PAK序列的寡肽选自ARPAK(Ala-Arg-Pro-Ala-Lys)、GRPAK(Gly-Arg-Pro-Ala-Lys)、QRPAK(Gln-Arg-Pro-Ala-Lys)、RPAK(Arg-Pro-Ala-Lys)和PAK所构成的群组；且所述含RGD序列的寡肽选自RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser)、RGDV(Arg-Gly-Asp-Val)和RGDF(Arg-Gly-Asp-Phe)所构成的群组。
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