WO2014036821A1 - 同时具溶血栓、清除自由基和血栓靶向功能的新颖化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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彭师奇
赵明
蒋雪云
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    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif

Definitions

  • the present invention relates to a novel compound having both functions of thrombolytic, NO free radical and thrombus targeting/antithrombotic, and a preparation method and use thereof.
  • the present invention further relates to a thrombo-oligopeptide containing a PAK (Pro-Ala-Lys) sequence, 1-(4-oxyacetyl-phenyl)-3,3,4,4- as a linker containing a carboxyl group and an amino group.
  • PAK Pro-Ala-Lys
  • Novel ternary "PAK-containing peptide/imidazoline/RGD-containing sequence peptide” formed by the combination of tetramethyl-imidazoline and thrombotargeting peptide/anti-thromb oligopeptide containing RGD (Arg-Gly-Asp) sequence Conjugate.
  • the invention further relates to a pharmaceutical composition comprising the compound for scavenging NO radicals, thrombolytics, thrombus targeting/antithrombotic and treating stroke/cerebral infarction.
  • the invention also relates to a process for the preparation of said compounds. Background technique
  • thrombotic diseases Globally, the incidence and mortality of thrombotic diseases are the highest. Coronary thrombosis, leading to myocardial infarction. Cerebral vascular embolism leads to cerebral infarction, which is a clinical ischemic stroke. Patients with myocardial infarction can be either intravenous thrombolytic drugs or bypass surgery. It must be noted that the positive result of intravenous thrombolytic drugs in patients with myocardial infarction is ischemia-reperfusion. Because of the large amount of NO free radicals produced during ischemia-reperfusion, the thrombolytic process is associated with myocardial damage and patient death. This is a serious problem of thrombolytic therapy for myocardial infarction.
  • tPA tissue-type plasminogen activator
  • no other drugs can show efficacy in stroke patients
  • tPA treatment only The patient showed a curative effect within 3 hours of stroke, that is, tPA only had 3 hours to treat the golden period
  • CN102807604 and the application CN102807605 discloses ⁇ ⁇ - (1,3- dioxo-4,4,5,5-tetramethyl-4'-oxo-2-phenyl imidazoline Acetyl)- ⁇ ⁇ -fatty acyl-Lys-Arg-Gly-Asp-Val and ⁇ ⁇ -(1,3-dioxo-4,4,5,5-tetramethylimidazolin-2-phenyl- 4'-O-acetyl) - ⁇ ⁇ - fatty acyl -Lys-Arg-Gly-Asp- Phe two compounds.
  • These two compounds combine an imidazoline having an activity of scavenging NO radicals with an anti-thrombotic oligopeptide containing an RGD sequence (Arg-Gly-Asp) in lysine. Unlike the compounds of the present invention, no thrombolytic peptides are linked to these two compounds. These two compounds have no thrombolytic effect and are not suitable for the preparation of thrombolytic drugs and are not suitable for the treatment of patients with ischemic stroke.
  • the invention provides a ternary conjugate which integrates the activity of trans-blood-brain barrier, thrombolytic, anti-thrombosis and NO-free radical elimination, wherein the ternary is an imidazoline having the activity of scavenging NO radicals, With thrombolytic active peptides and thrombotargeting peptides, through suitable linkages The arms are connected together.
  • ternary conjugates of the invention may be represented by the compounds of formula I:
  • NN represents an imidazoline having an activity of scavenging NO radicals
  • AAi represents a tether having at least three linking groups
  • AA 2 represents a thrombolytic active peptide
  • AA 3 represents a thrombus targeting peptide.
  • the imidazolines useful in the present invention include Nitronyl Nitroxides ( ) imidazole-based nitroxide radicals, which are capable of scavenging NO and also have the function of scavenging oxygen radicals, and have strong protective effects against oxygen-damaged cells.
  • the imidazoline having the activity of scavenging NO radicals of the present invention is preferably ⁇ 3-dioxy -2- [(4-oxyacetate)phenyl]-4,4,5,5-tetramethylimidazoline.
  • the tethers useful in the present invention have at least three linking groups, such as a carboxyl group and an amino group, for linking together the imidazoline, the thrombolytic active peptide, and the thrombus targeting peptide.
  • the tethers of the invention may be natural amino acids such as: L-Lys, L-Asp and L-Glu.
  • more than three linking groups are present, more than one NN, AA 2 , or AA 3 may be attached ; two or more of NN, AA 2 , or AA 3 may be used.
  • ⁇ ! has four linking groups, one NN, two AA 2 , and one AA 3 can be connected ; at this time, two AA 2 can be the same or different thrombolytic active peptides. .
  • the thrombolytic active peptide useful in the present invention may be an oligopeptide comprising a PAK (Pro-Ala-Lys) sequence, an AKP (Ala-Lys-Pro) sequence or a KAP (Lys-Ala-Pro) sequence or comprise a PAK sequence.
  • the AKP sequence or the KAP sequence is a repeat peptide of a structural unit.
  • An oligopeptide refers to a small molecule peptide having a molecular weight of less than 1000 Daltons (D), generally consisting of 3 to 8 amino acids.
  • the thrombolytic active oligopeptide of the present invention may be a tripeptide to octapeptide containing a PAK sequence, an AKP sequence or a KAP sequence, preferably a tripeptide to pentapeptide containing a PAK sequence, an AKP sequence or a KAP sequence.
  • an oligopeptide which can be used in the present invention containing a PAK sequence, an AKP sequence or a KAP sequence can be PAK, RPAK (Arg-Pro-Ala-Lys), ARPAK (Ala-Arg-Pro-Ala-Lys), GRPAK (Gly-Arg-Pro-Ala-Lys), QRPAK (Gln-Arg-Pro-Ala-Lys), AKP, KAP, KPAK (Lys-Pra-Ala-Lys), PAKP (Pro-Ala-Lys-Pro) AKPAK (Ala-Lys-Pro-Ala-Lys) or PAKPA (Pro-Ala-Lys-Pro-Ala).
  • a repeat peptide which can be used in the present invention as a structural unit of a PAK sequence, an AKP sequence or a KAP sequence can be a series of thrombolytically active peptides disclosed in the application of Chinese Patent Application Publication No.
  • CN101190941 including Repetitive sequence peptides (PAK) 2 , (PAK) 3 , (PAK) 4 , (PAK ) 5 and (PAK) 6 synthesized with PAK as a structural unit; repeat peptide (AKP) 2 synthesized with AKP as a structural unit; (AKP) 3 (AKP) 4 (AKP) 5 P(AKP) 6 ; and repeat peptides synthesized by KPA as structural units (KPA) 2 , (KPA) 3 , (KPA) 4 , (KPA) 5 and KPA) 6 .
  • the thrombotargeting/antithrombotic peptide useful in the present invention may be an oligopeptide containing an RGD sequence (Arg-Gly-Asp).
  • the oligopeptide containing the RGD sequence may be an RGD tetrapeptide such as RGDS (Arg-Gly-Asp-Ser), RGDV (Arg-Gly-Asp-Val) and RGDF (Arg-Gly-Asp-Phe).
  • RGDS Ar-Gly-Asp-Ser
  • RGDV Arg-Gly-Asp-Val
  • RGDF Arg-Gly-Asp-Phe
  • the RGD sequence is the active site of ligand Fg and activated GPIIb/IIIa receptor binding, with activated platelet targeting. Structures containing RGD sequences competitively inhibit and block the binding of Fg and GPIIb/IIIa receptors, thereby blocking platelet aggregation and thrombus formation, making RGD-containing oligopeptides effective thrombus-targeting molecules and antithrombotic Agent.
  • the thrombotargeting peptide which can be used in the present invention can be a series of polypeptides having targeted antithrombotic activity disclosed in the application of Chinese Patent Application Publication No.
  • CN101190940 comprising a pair of RGD peptides and YIGS (Tyr-Ile-Gly- The Ser) peptide is subjected to a conjugative modification of the polypeptide.
  • modified polypeptides may be YIGSRRGDS, YIGSRRGDV, YIGSRRGDF, YIGSRYIGSK, YIGSRYIGSR, YIGSKRGDS, YIGSKRGDF, YIGSKRGDV, YIGSKYIGSK, YIGSKYIGSR, RGDSRGDS, RGDVRGDV, RGDFRGDF, RGDSYIGSR, RGDSYIGSK, RGDVYIGSR, RGDVYIGSR, RGDSYIGSR, RGDSYIGSK, RGDVYIGSR, RGDVYIGSK, RGDVYIGSK, RGDFYIGSR, or RGDFYIGSK.
  • the imidazoline having the activity of scavenging NO radicals in the compound of the present invention is 1,3-dioxy-2-[(4-oxyacetate)phenyl]-4,4,5, 5-tetramethylimidazoline;
  • the thrombolytic active peptide is an oligopeptide containing a PAK sequence (Pro-Ala-Lys); and the thrombotargeting peptide is an oligopeptide containing an RGD sequence (Arg-Gly-Asp).
  • the present invention provides a "PAK-containing peptide/imidazoline/RGD-containing peptide" ternary conjugate that integrates blood-brain barrier, thrombolytic, antithrombotic, and NO-free radical activity.
  • the imidazoline having the activity of scavenging NO radicals in the compound of the present invention is 1,3-dioxy-2-[(4-oxyacetate)phenyl]-4,4,5,5- Tetramethylimidazoline;
  • the tether is L-Lys;
  • the thrombolytic active peptide is an oligopeptide containing a PAK sequence (Pro-Ala-Lys); and the thrombotargeting peptide is an RGD-containing sequence (Arg-Gly-Asp) Oligopeptides.
  • the oligopeptide containing the PAK sequence may be an ARPAK pentapeptide, a GRPAK pentapeptide, a RPAK tetrapeptide or a PAK tripeptide; and the oligopeptide containing the RGD sequence may be an RGD tetrapeptide such as RGDS, RGDV or RGDF.
  • the compound of the present invention may be of the following formula 1-1 or 1-2:
  • ⁇ and ⁇ ! ⁇ may exist simultaneously, a ai exists but aa 2 does not exist, or does not exist at the same time; when it exists simultaneously, & ⁇ is 11 (eight), and aa 2 is G (Gly), A (Ala) or Q (Gin); when a ai is present but aa 2 is absent, aaj is R (Arg) ; aa 3 can be S (Ser), V (Val), or F (Phe).
  • the compound of the present invention may be an ARPAK/imidazoline/RGD ternary conjugate represented by the following formula 1-1-1;
  • the compound of the present invention may be a GRPAK/imidazoline/RGD ternary conjugate represented by the following formula 1-1-2; in still another preferred embodiment, the compound of the present invention may be as follows The RPAK/imidazoline/RGD ternary conjugate represented by the formula 1-1-3; and in still another preferred embodiment, the compound of the present invention may be a PAK/imidazoline represented by the following formula 1-1-4 /RGD Ternary Conjugate:
  • Aa 3 may be S (Ser), V (Val), or F (Phe), and is preferably V (Val).
  • Aa 3 may be S (Ser), V (Val), or F (Phe), and preferably V (Val)
  • the imidazoline having the activity of scavenging NO radicals in the compound of the present invention is 1,3-dioxy-2-[(4-oxyacetate)phenyl]-4,4,5,5- Tetramethylimidazoline;
  • the tether is L-Asp;
  • the thrombolytic active peptide is an oligopeptide containing a PAK sequence (Pro-Ala-Lys); and the thrombotargeting peptide is an RGD-containing sequence (Arg-Gly-Asp) Oligopeptide.
  • L-Asp is used as a tether, the compounds of the invention may be the following formulas 1-3 - 4:
  • ai exists but aa 2 does not exist, or does not exist at the same time; when it exists simultaneously, & ⁇ is 11 (eight), and aa 2 is G (Gly), A ( Ala) or Q (Gin); when a is present but aa 2 is absent, aaj is R (Arg) ; aa 3 can be S (Ser), V (Val), or F (Phe).
  • a is preferably R (Arg);
  • aa 2 is preferably G (Gly); and aa 3 is preferably V (Val).
  • the compound of the present invention may preferably be the following formula 1-3-1, 1-3-2, 1-3-3 or 1-3-4:
  • Aa 3 may be S(Ser), V(Val), or F(Phe), and is preferably V(Val).
  • the present invention combines -4-1, 1-4-2, 1-4-3 or 1-4-4:
  • Aa 3 may be S(Ser), V(Val), or F(Phe), and is preferably V(Val).
  • the imidazoline having the activity of scavenging NO radicals in the compound of the present invention is 1,3-dioxy-2-[(4-oxyacetate)phenyl]-4,4,5,5- Tetramethylimidazoline;
  • the tether is L-Glu;
  • the thrombolytic active peptide is an oligopeptide containing a PAK sequence (Pro-Ala-Lys); and the thrombotargeting peptide is an RGD-containing sequence (Arg-Gly-Asp) Oligopeptides.
  • L-Glu is used as a tether
  • the compound of the present invention may be of the following formula 1-5 or 1-6:
  • ⁇ and ⁇ ! ⁇ may exist simultaneously, a ai exists but aa 2 does not exist, or does not exist at the same time; when it exists simultaneously, & ⁇ is 11 (eight), And aa 2 is G (Gly), A (Ala) or Q (Gin); when a exists but aa 2 does not exist, aaj is R (Arg) ; aa 3 can be S (Ser), V (Val), Or F (Phe;). a is preferably R (Arg); aa 2 is preferably G (Gly); and aa 3 is preferably V (Val).
  • the -5 compound is exemplified, and the compound of the present invention may preferably be of the following formula 1-5-1, 1-5-2, 1-5-3 or 1-5-4:
  • Aa 3 may be S (Ser), V (Val), or F (Phe), and is preferably V (Val).
  • the compound of the present invention may be 1-6-1, 1-6-2, 1-6-3 or 1-6-4:
  • Aa 3 may be S (Ser), V (Val), or F (Phe), and is preferably V (Val).
  • the present invention is also directed to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the aforementioned compound of the present invention, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is preferably a compound comprising the above formula 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, or 1-6.
  • the pharmaceutical composition of the present invention more preferably comprises a compound of the formula 1-1-1, 1-1-2, 1-1-3 or 1-1-4.
  • these compounds can form a dimer in the pharmaceutical composition, A polymer or tetramer structure and can form nanospheres with a diameter of 2 nm to 300 nm.
  • the nanosphere structure is more preferably a diameter of from 2 nm to 100 nm.
  • a well-known fact of nanopharmaceutics is that nanospheres with a diameter of less than 100 nm are not easily phagocytized by macrophages in the blood and easily cross the capillary wall. These properties allow the compounds of the invention to cross the blood brain barrier.
  • the pharmaceutical composition of the invention can be used as a thrombus Drug for the treatment of myocardial infarction, Ischemic stroke, Deep vein thrombosis, pulmonary embolism, peripheral arterial occlusive disease, occluded central Vascular access devices: diseases such as Clotted arteriovenous fistula and shunts, and Carotid Stenosis.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can also be used as a drug for removing NO radicals for treating neurodegenerative diseases, such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, and motor nerves.
  • Motor neuron diseases amyotrophic lateral sclerosis, noise-induced hearing loss, Lou Gehrig's disease, or Huntington's disease;
  • cardiovascular disease such as Atherosclerosis, Coronary heart disease or Myocardial infarction
  • mental disorders such as Bipolar disorder, Schizophrenia, or Autism
  • Altitude sickness diabetes, rheumatoid arthritis, Traumatic brain injury; cancer, X Fragile X syndrome, sickle cell disease, Sickle Cell Disease, Diseases such as Lichen planus, white spot disease (Vitiligo ⁇ or Chronic fatigue syndrome).
  • the pharmaceutical composition of the present invention can also be used as a thrombus-targeting/antithrombotic drug for treating thrombocytosis (Thrombocytosis; , myeloproliferative disease ⁇ Polycythemia vera (Polycythemia vera), or Budd-Chiari syndrome, etc.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can also be used as a treatment for stroke or cerebral infarction, preferably It is used to treat strokes or cerebral infarctions with onset of more than 3 hours, 4 hours, 6 hours and 24 hours, and is treated by continuous administration.
  • the pharmaceutical composition/compound of the invention has both elimination of NO radicals, thrombolytics, and anti-drugs.
  • the thrombus/thromb-targeted function therefore, remains effective after 3 hours of stroke in the patient, ie, is not limited by the 3-hour treatment golden phase with tPA; does not cause a tPA-like systemic hemorrhagic response; and is able to clear ischemia
  • the large amount of NO radicals generated during the perfusion process protects the brain from nerve damage during treatment.
  • the nanostructure of the compound maximizes the effect of crossing the blood-brain barrier, thrombolysis, thrombus targeting/anti-thrombosis, and eliminating NO radicals generated during ischemia-reperfusion.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be any clinically acceptable suitable preparation, for example, it may be an injection preparation (powder needle, lyophilized powder, water needle, infusion, etc.), a tablet, an oral solution, a granule, a capsule. , soft capsules or dropping pills, etc., wherein the pharmaceutically acceptable carrier can be xylitol, mannitol, lactose, fructose, dextran, glucose, polyvinylpyrrolidone, low molecular weight dextran, sodium chloride, One or more of calcium gluconate or calcium phosphate. Further, the pharmaceutical composition of the present invention may further comprise an auxiliary material, which may be an antioxidant complexing agent, a filler, a skeleton material or the like.
  • an auxiliary material which may be an antioxidant complexing agent, a filler, a skeleton material or the like.
  • the present invention also relates to a process for the preparation of a compound of the above formula I, comprising the steps of:
  • step (3) and step (4) can be exchanged.
  • the linker arm (the second and third linking groups of the group are protected by a protecting group, and the thrombolytic active peptide (AA 2 ) and the thrombus targeting peptide are contained.
  • step (3) in addition to the active group connected to one end of the outer protective group; in step (3) further comprises a second connection with the first protected group is deprotected with thrombolytic active peptide and then deprotected The second linkage is linked by a group; the step (4) further comprises first deprotecting the protected third attachment group, and then linking the thrombotargeting peptide to the deprotected third attachment group; and the step (4) further comprises deprotecting the protected active group on the thrombolytic active peptide (AA 2 ) and the thrombotargeting peptide (AA 3 ).
  • the NN can be controlled by the technique of adding a protecting group and removing the protecting group.
  • reaction conditions refer to the conventional conditions in the synthesis of the polypeptide.
  • NO radical-active imidazoline (N) having at least three linking groups
  • the tether (AAi;), the thrombolytic active peptide (AA 2 ), and the thrombotargeting peptide (AA 3 ) are the same as defined above for use in the compounds of formula I of the present invention.
  • the first linking group of the tether of the preparation method of the present invention is an amino group
  • the second and third linking groups are selected from the group consisting of a carboxyl group and an amino group.
  • the imidazoline having the activity of scavenging NO radicals is 1,3-dioxy-2-[(4-oxyacetate)phenyl]-4,4,5,5 - tetramethylimidazoline;
  • the tether is L-Lys;
  • the thrombolytic active peptide is an oligopeptide containing a PAK sequence (Pro-Ala-Lys); and the thrombotargeting peptide is an RGD-containing sequence (Arg-Gly-Asp) Oligopeptides.
  • 1,3-dioxy-2-[(4-oxoacetate)phenyl]-4,4,5,5-tetramethylimidazoline is linked to an amino group of the L-Lys linker;
  • the carboxyl group on the oligopeptide of the PAK sequence is linked to another amino group of the L-Lys linker; and the amino group on the oligopeptide containing the RGD sequence is linked to the carboxyl group of the L-Lys linker arm (such as the compound of the above formula 1-1) As shown; or
  • Fig. 1 is a synthetic route diagram for preparing a compound of the formula 1-1-1
  • Fig. 2 is a synthetic route diagram for preparing a compound of the formula 1-1-2
  • Fig. 3 is a synthetic route diagram for preparing a compound of the formula 1-1-3
  • Figure 4 is a synthetic route diagram for the preparation of the compound of the formula 1-1-4.
  • aa 3 may be S (Ser), V (Val), or F (Phe;) as described above.
  • the preparation method of the present invention is as follows:
  • the oligopeptide containing the PAK sequence and the oligopeptide containing the RGD sequence can be protected by a protecting group on the reactive group at a suitable position according to the design of the combination, to select one end of the sequence (including the active group which can be joined to the tether) To bind to the reactive groups of the tether.
  • the step of combining the oligopeptide containing the PAK sequence with the oligopeptide containing the RGD sequence may be exchanged in order, for example, by combining with an oligopeptide containing an RGD sequence, and then with an oligopeptide containing a PAK sequence.
  • the reactive group contains a group such as an amino group or a carboxyl group which can undergo a condensation reaction.
  • the protecting group for the amino group may be benzyloxycarbonyl (CBz), tert-butoxycarbonyl (Boc), 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc), benzyl (Bn) or p-methoxyphenyl (PMP).
  • the protecting group for the carboxyl group may be a methyl ester (OMe), a benzyl ester (OBn), a benzyl methyl ester (OBzl), a tert-butyl ester (OBUT), or a silyl ester (OSi(CH 3 ) 3 ).
  • aa 3 may be S (Ser), V (Val), or F (Phe) as described above.
  • 1,3-dioxy-2-[(4'-oxyacetyl) can be prepared first.
  • phenyl-Lys-OMe)phenyl]-4,4,5,5-tetramethylimidazoline then the C-terminus of the oligopeptide containing the RGD sequence is first combined with the amino group of the Lys tether; the PAK sequence is finally included The N-terminus of the oligopeptide is combined with the carboxyl group of the deprotected tether.
  • the imidazoline having the activity of scavenging NO radicals in the preparation method of the present invention is 1,3-dioxy-2-[(4-oxyacetate)phenyl]-4,4,5, 5-tetramethylimidazoline;
  • the linking arm is L-Asp;
  • the thrombolytic active peptide is an oligopeptide containing a PAK sequence (Pro-Ala-Lys);
  • the thrombotargeting peptide is an RGD-containing sequence (Arg-Gly-Asp) Oligopeptide; and wherein 1,3-dioxy-2-[(4-oxyacetate)phenyl]-4,4,5,5-tetramethylimidazoline is linked to the amino group of the L-Asp linker
  • the amino group on the oligopeptide containing the PAK sequence is linked to the monocarboxy group of the L-Asp linker; and the amino group on the oligopeptide containing the RGD sequence is linked to the other carboxyl
  • Figure 9 is a synthetic route diagram for preparing a compound of the formula 1-3-1
  • Figure 10 is a synthetic route diagram for preparing a compound of the formula 1-3-2
  • Figure 11 is a synthetic route diagram for preparing a compound of the formula 1-3-3
  • Figure 12 is a synthetic route diagram for the preparation of compounds of formula 1-3-4.
  • aa 3 may be S (Ser), V (Val), or F (Phe) as described above.
  • 1,3-dioxy-2-[(4'-oxyacetyl) can be prepared first.
  • phenyl-Asp-OMe)phenyl] -4,4,5,5-tetramethylimidazoline then the N-terminus of the PAK sequence-containing oligopeptide is first combined with the monocarboxyl group of the Asp junction arm; the final will contain the RGD sequence The N-terminus of the oligopeptide is combined with another carboxyl group of the deprotected Asp junction arm.
  • Fig. 13- The synthetic route shown in 16.
  • Figure 13 is a synthetic route diagram for the preparation of the compound of the formula 1-4-1;
  • Figure 14 is a synthetic route diagram for the preparation of the compound of the formula 1-4-2;
  • Figure 15 is a synthetic route diagram for the preparation of the compound of the formula 1-4-3
  • Figure 16 is a synthetic scheme for the preparation of compounds of formula 1-4-4.
  • aa 3 may be S (Ser), V (Val), or F (Phe) as described above.
  • 1,3-dioxy-2-[(4'-oxyacetyl) can be prepared first.
  • phenyl-Asp-OMe)phenyl]-4,4,5,5-tetramethylimidazoline then the N-terminus of the oligopeptide containing the RGD sequence is first combined with the monocarboxyl group of the Asp tether; the PAK sequence will be finally included The N-terminus of the oligopeptide is combined with another carboxyl group of the deprotected Asp ligation arm.
  • the imidazoline having the activity of scavenging NO radicals in the preparation method of the present invention is 1,3-dioxy-2-[(4-oxyacetate)phenyl]-4,4,5, 5-tetramethylimidazoline;
  • the tether is L-Glu;
  • the thrombolytic active peptide is an oligopeptide containing a PAK sequence (Pro-Ala-Lys); and the thrombotargeting peptide is an RGD-containing sequence (Arg-Gly-Asp) An oligopeptide; and wherein 1,3-dioxy-2-[(4-oxyacetate)phenyl]-4,4,5,5-tetramethylimidazoline is attached to the amino group of L-Glu;
  • the amino group on the oligopeptide containing the PAK sequence is linked to the monocarboxy group of the L-Glu tether; and the amino group on the oligopeptide containing the RGD sequence is linked to the other carboxyl group of the L-
  • Fig. 17- The synthetic route shown in 20.
  • Figure 17 is a synthetic route diagram for the preparation of the compound of the formula 1-5-1;
  • Figure 18 is a synthetic route diagram for the preparation of the compound of the formula 1-5-2;
  • Figure 19 is a synthetic route diagram for the preparation of the compound of the formula 1-5-3
  • Figure 20 is a synthetic route diagram for the preparation of compounds of the formula 1-5-4.
  • aa 3 may be S (Ser), V (Val), or F (Phe) as described above.
  • 1,3-dioxy-2-[(4'-oxyacetyl) can be prepared first.
  • phenyl-Glu-OMe)phenyl] -4,4,5,5-tetramethylimidazoline then the N-terminus of the oligopeptide containing the RGD sequence is first combined with a carboxy group of the Glu tether; the PAK sequence will be finally The N-terminus of the oligopeptide is combined with another carboxyl group of the deprotected Glu tether.
  • FIG. 21 is a synthetic route diagram for the preparation of the compound of the formula 1-6-1
  • Figure 22 is a synthetic route diagram for the preparation of the compound of the formula 1-6-2
  • Figure 23 is a synthetic route diagram for the preparation of the compound of the formula 1-6-3
  • Figure 24 is a synthetic scheme for the preparation of compounds of the formula 1-6-4.
  • aa 3 may be S (Ser), V (Val), or F (Phe) as described above.
  • 1,3-dioxy-2-[(4'-oxyacetyl) can be prepared first.
  • phenyl-Glu-OMe)phenyl] -4,4,5,5-tetramethylimidazoline then the N-terminus of the PAK sequence-containing oligopeptide is first combined with a carboxy group of the Glu tether; the final RGD-containing sequence The N-terminus of the oligopeptide is combined with another carboxyl group of the deprotected Glu tether.
  • the oligopeptide containing the PAK sequence in the aforementioned preparation method may be ARPAK (Ala-Arg-Pro-Ala-Lys), GRPAK (Gly-Arg-Pro-Ala-Lys), QRPAK (Gln-Arg-Pro-Ala-Lys).
  • RPAK ArAK
  • PAK Pro-Ala-Lys
  • the oligopeptide containing the RGD sequence may be RGDS (Arg-Gly-Asp-Ser), RGDV (Arg-Gly-Asp-Val) Or RGDF (Arg-Gly-Asp-Phe).
  • the compound or pharmaceutical composition of the present invention has a high activity of scavenging NO radicals in a test for NO scavenging activity in rats In vivo and in vitro thrombolytic and antithrombotic activity tests, it has excellent thrombolytic and antithrombotic activity; it has been proved in the anti-stroke activity test in rats that it can effectively protect the nerve function of stroke rats, and has excellent Anti-stroke activity; In the infarct volume test of stroke rats, it can be effectively reduced the infarct volume of stroke rats.
  • Figure 1 is a synthetic route diagram of an embodiment of the compound of the present invention (compound of the formula 1-1-1);
  • Figure 2 is a synthetic route diagram of an embodiment of the compound of the present invention (compound of the formula 1-1-2);
  • Figure 3 is a synthetic route diagram of an embodiment of the compound of the present invention (compound of the formula 1-1-3);
  • Figure 4 is a synthetic route diagram of an embodiment of the compound of the present invention (the compound of the formula 1-1-4);
  • FIG. 5 is a synthetic route diagram of an embodiment of the compound of the present invention (compound of the formula 1-2-1);
  • Figure 6 is a synthetic route diagram of an embodiment of the compound of the present invention (the compound of the formula 1-2-2);
  • Figure 7 is a synthetic route diagram of an embodiment of the compound of the present invention (compound of the formula 1-2-3);
  • Figure 8 is a synthetic route diagram of an embodiment of the compound of the present invention (compound of the formula 1-2-4);
  • Figure 9 is a synthetic route diagram of an embodiment of the compound of the present invention (compound of the formula 1-3-1);
  • Figure 10 is a synthetic route diagram of an embodiment of the compound of the present invention (the compound of the formula 1-3-2);
  • Figure 11 is a synthetic route diagram of an embodiment of the compound of the present invention (the compound of the formula 1-3-3);
  • Figure 12 is a synthetic route diagram of an embodiment of the compound of the present invention (compound of the formula 1-3-4);
  • Figure 13 is a synthetic route diagram of an embodiment of the compound of the present invention (compound of the formula 1-4-1);
  • Figure 14 is a synthetic route diagram of an embodiment of the compound of the present invention (the compound of the formula 1-4-2);
  • Figure 15 is a synthetic route diagram of an embodiment of the compound of the present invention (the compound of the formula 1-4-3);
  • Figure 16 is a synthetic route diagram of an embodiment of the compound of the present invention (the compound of the formula 1-4-4);
  • Figure 17 is a synthetic route diagram of an embodiment of the compound of the present invention (compound of the formula 1-5-1);
  • Figure 18 is a synthetic route diagram of an embodiment of the compound of the present invention (the compound of the formula 1-5-2);
  • Figure 19 is a synthetic route diagram of an embodiment of the compound of the present invention (the compound of the formula 1-5-3);
  • Figure 20 is a synthetic route diagram of an embodiment of the compound of the present invention (compound of the formula 1-5-4);
  • Figure 21 is a synthetic route diagram of an embodiment of the compound of the present invention (compound of the formula 1-6-1);
  • Figure 22 is a synthetic route diagram of an embodiment of the compound of the present invention (the compound of the formula 1-6-2);
  • Figure 23 is a synthetic route diagram of an embodiment of the compound of the present invention (the compound of the formula 1-6-3);
  • Figure 24 is a synthetic route diagram of an embodiment of the compound of the present invention (the compound of the formula 1-6-4);
  • FIG 26 present in the compound lb 1 ⁇ 10- 6 ⁇ invention, 1 ⁇ 10 "9; 1 ⁇ 10- 9 ⁇ and 1 ⁇ 10- 12 ⁇ nanostructures in an aqueous solution of a compound of the present invention.
  • FIG. 25 in la 1 ⁇ 10- 6 ⁇ , ⁇ and 1 ⁇ 10-12 ⁇ aqueous nanostructures;
  • FIG 29 nanostructures in an aqueous solution in the present invention is a compound Ie 1 ⁇ 10- 6 ⁇ , 1 ⁇ 10 " 9 ⁇ and 1 ⁇ 10- 12 ⁇ ;
  • FIG 30 If the compounds of the present invention 1 ⁇ 10- 6 ⁇ , 1 10- 9 M And nanostructures in an aqueous solution of 10-12 M;
  • FIG 31 is a nanostructure of the compound ig of the present invention in an aqueous solution of ixicr 6 M, 1 icr 9 M and 1 icr 12 M;
  • FIG 32 compound Ih of the invention in 1 ⁇ 10- 6 ⁇ , 1 10 "9 ⁇ and 1 10- 12 ⁇ nanostructures in an aqueous solution;
  • FIG 34 the compounds of the present invention Ij 1 ⁇ 10- 6 ⁇ , 1 10- 9 ⁇ and 1 10- 12 ⁇ nanostructures in an aqueous solution;
  • Figure 37 is a high resolution FT-MS mass spectrum of the compound Ie of the present invention at a concentration of 0.01 ⁇ M;
  • Figure 38 is a high resolution FT-MS mass spectrum of the compound Ie of the present invention at a concentration of 0.1 ⁇ ?;
  • Figure 39 is a high resolution FT-MS mass spectrum of the compound Ie of the present invention at a concentration of 1 ⁇ ;
  • Figure 40 is a high resolution FT-MS mass spectrum of the compound Ie of the present invention at a concentration of 10 ⁇ .
  • Lys-OMe ⁇ phenyl ⁇ -4,4,5,5-tetramethylimidazoline was dissolved in 3 mL of methanol, added with aqueous NaOH (2N) and stirred at room temperature for 30 min. While maintaining pH 12 and stirring for 10 min in an ice bath, TLC showed the disappearance of the starting material. The pH was adjusted to pH 7 with 2N EtOAc. EtOAc (EtOAc m. The combined ethyl acetate layer was dried with EtOAc EtOAc. EI-MS (m/z) 1223 [M - H] ⁇ .
  • ARPAK, GRPAK, RPAK or PAK and the targeting peptide RGDS, RGDV or RGDF are linked to a free radical scavenging U(1,3-dioxy-2-(4'-oxyacetic acid-phenyl)-4,4,5 , 5-tetramethylimidazoline, TMMZ), 9 compounds inhibited the activity of acetylcholine diastolic vascular strips significantly stronger than TMMZ, there are 2 compounds inhibiting the activity of acetylcholine diastolic vascular strips and TMMZ no difference, there is a compound inhibition The activity of acetylcholine diastolic vascular strips is significantly weaker than TMMZ.
  • n 6; a) p ⁇ 0.01 vs. TMMZ; b) p > 0.05 vs. TMMZ; c) p ⁇ 0.05 vs. TMMZ.
  • Test Example 2 Dissolved euglobulin test of the compounds la to II of the present invention
  • Pig blood was mixed with 3.8% sodium citrate solution in a volume ratio of 9:1, and immediately centrifuged at 3000 r/min for 10 min to separate platelet-poor plasma.
  • euglobulin Approximately 35 mg of euglobulin was dissolved in 7 mL of borax buffer (pH 9.28). After 1 hour, the euglobulin was substantially dissolved, and 0.7 mL of CaCl 2 solution (25 mM) was added, and it was immediately placed on a 10 10 cm glass plate to a thickness of about 1 mm. After coagulation, pipette 10 ⁇ L of normal saline or 10 ⁇ L of one of the compounds Ia-Il A physiological saline solution (1 mM) or a physiological saline solution (0.8 mg/mL) of 10 urokinase was added dropwise to the coagulation plate, and the interval between every two points was more than 1.5 cm, and each sample was taken 3 times. The diameter of the solution circle was measured after 4 hours, and the readings are shown in Table 2.
  • SD rats male, 350 - 400 g were anesthetized by intraperitoneal injection of urethane solution at a dose of 1200 mg/kg.
  • the anesthetized rats were fixed in the supine position, the right common carotid artery was separated, the arterial clip was clamped at the proximal end, and the proximal and distal ends were respectively inserted into the surgical line.
  • the distal end of the surgical line was clamped to the fur with a hemostatic forceps.
  • the cannula was intubated, the arterial clip was released, and all arterial blood was released and placed in a 50 ml pre-siliconized container.
  • a 0.8 ml rat arterial blood into a vertically fixed glass tube (length 20 mm, inner diameter 4 mm, outer diameter 5 mm, sealed with a rubber stopper), and quickly insert a stainless steel thrombus fixing bolt into the tube.
  • the thrombus-fixed helix is wound with a 0.2 mm diameter stainless steel wire.
  • the helical portion is 18 mm long and contains 15 coils. The diameter of the coil is 1.8 mm.
  • the handle is connected to the spiral and has a length of 7.0 mm.
  • the suspension was immersed in three distilled water to remove the floating blood on the surface. After l h, take out and accurately weigh.
  • the thrombus suspension was immersed in 8 mL of physiological saline or a physiological saline solution (concentration of 100 nM) of one of the compounds Ia-Il or a physiological saline solution (concentration of 100 nM) of ARPAK, or GRPAK, or RPAK, or PAK.
  • test results indicate that the thrombolytic peptide ARPAK, GRPAK, RPAK or PAK and the targeting peptides RGDS, RGDV or
  • RGDF was attached to the free radical scavenger TMMZ and all compounds showed clear in vitro thrombolytic activity. Since the activity of Ia-Ic is comparable to the activity of ARPAK, the activity of Id-If is comparable to the activity of GRPAK, the activity of Ig-Ii is comparable to that of RPAK, and the activity of Ij-Il is comparable to that of PAK, so on the one hand Ia- The in vitro thrombolytic activity of Il should be attributed to the activity of the thrombolytic peptide.
  • the thrombolytic peptide ARPAK , GRPAK, RPAK or PAK and the targeting peptide RGDS, RGDV or RGDF are linked to the free radical scavenger TMMZ by Lys. Will reduce the activity of the corresponding thrombolytic peptide.
  • Ia-Il In vitro thrombolytic activity of Ia-Il for 2h
  • SD rats male, 220-230 g were anesthetized by intraperitoneal injection of urethane solution at a dose of 1200 mg/kg.
  • the anesthetized rats were fixed in the supine position, the right common carotid artery was separated, the arterial clip was clamped at the proximal end, and the proximal and distal ends were respectively inserted into the surgical line. The distal end of the surgical line was clamped to the fur with a hemostatic forceps. Intubate the heart, loosen the arterial clip, release about 1 ml of arterial blood, and place it in the lml bullet.
  • a 0.1 ml rat arterial blood into a vertically fixed glass tube (length 15 mm, inner diameter 2.5 mm, outer diameter 5.0 mm, sealed with a rubber stopper), and quickly insert a stainless steel thrombus fixing bolt into the tube.
  • the thrombus-fixed helix is wound with a 0.2 mm diameter stainless steel wire, the helix portion is 12 mm long, contains 15 coils, the diameter of the coil is 1.0 mm, the handle is connected to the helix, and the length is 7. 0 mm, which is a question mark type. .
  • the rubber stopper at the bottom of the glass tube was opened, the handle of the thrombus-fixed screw was fixed with forceps, and the thrombus-fixed thrombus was carefully removed from the glass tube and accurately weighed.
  • the bypass cannula consists of 3 segments.
  • the middle section is a polyethylene hose with a length of 60.0 mm and an inner diameter of 3.5 mm.
  • the same polyethylene tube at both ends, the tube length is 100.0 mm, the inner diameter is 1.0 mm, the outer diameter is 2.0 mm.
  • One end of the tube is drawn into a pointed tube for insertion into the rat carotid artery or vein, the outer diameter is 1.0 mm, and the outer end is the outer sleeve.
  • a length of 7.0 mm, 3.5 mm outer diameter polyethylene tube (bold, inserted into the middle section of the polyethylene hose)
  • the inner wall of the 3-segment tube is siliconized (1% silicone oil ether solution).
  • the thrombus-wrapped thrombus-fixed helix is placed in the middle-stage polyethylene hose, and the two ends of the hose are respectively sleeved with the thickened ends of the two polyethylenes.
  • the tube was filled with heparin saline solution (50 IU/kg) through a tip end with a syringe and set aside.
  • the trachea of the anesthetized rats was continued to be separated and tracheal intubation was performed.
  • the left external jugular vein of the rat was isolated, and the proximal and distal ends were respectively inserted into the surgical line, and a oblique opening was carefully cut on the exposed left external jugular vein, and the tip tube of the bypass tube prepared above was obliquely inclined.
  • the mouth is inserted into the proximal end of the left external jugular vein opening, while away from the middle of the bypass tube (including the accurately weighed thrombus-fixed helix).
  • Use a syringe to push the exact amount of heparin saline (50 IU/kg) through the tip of the other end.
  • physiological saline solution (3 mL/kg), or a physiological saline solution of urokinase (dosage of 20,000 IU/kg) or a physiological saline solution of one of the compounds Ia-I (dosage of 0.1 ⁇ /kg) or ARPAK, Or a physiological saline solution of GRPAK, or RPAK, or PAK (at a dose of 1 ⁇ /kg) through the middle of the bypass tube (containing a precisely weighed thrombus-fixed helix), pierce the proximal vein away from the thrombus-fixed helix, and open the artery Clip, so that blood flow from the artery to the vein through the bypass duct, this is the rat arteriovenous bypass thrombolysis model, slowly inject the liquid in the syringe into the blood, so that saline (blank control), urokinase (positive control) Or ARPAK, or GRPAK, or
  • the compound Ia-Ic obtained by linking the thrombolytic peptide ARPAK, GRPAK, RPAK or PAK and the targeting peptide RGDS, RGDV or RGDF to the radical scavenger TMMZ by Lys has not only the 0.1 ⁇ /kg dose.
  • the exact thrombolytic activity, and the intensity of the activity is comparable to the thrombolytic activity of the corresponding thrombolytic peptides ARPAK, GRPAK, RPAK or PAK at a dose of 1 ⁇ /kg.
  • SD rats male, 220-230 g were randomized into groups of 11 animals each with a resting word for one day and stopped feeding overnight. Rats were given normal saline (dose at 3 mL/kg), or a physiological saline solution of one of the compounds Ia-I (at a dose of 0.1 ⁇ /kg), or a physiological saline solution targeting the peptides RGDS, RGDV or RGDF. (dose of 10 mol/kg), or aspirin (dose of 33 mg/kg). After 30 minutes, the rats were anesthetized with 20% umose solution and the right carotid artery and left jugular vein were isolated.
  • the compound Ia-Ic obtained by linking the thrombolytic peptide ARPAK, GRPAK, RPAK or PAK and the targeting peptide RGDS, RGDV or RGDF to the free radical scavenger TMMZ by Lys was not only at an oral dose of 0.1 ⁇ /kg. It has an exact antithrombotic activity, and the intensity of the activity is comparable to that of the corresponding targeting peptide RGDS, RGDV or RGDF at a dose of 10 ⁇ /kg.
  • the rat experimental protocol described here is in accordance with the Geneva Animal Testing Guidelines and is approved by the School Ethics Committee.
  • a clean grade healthy male SD rat weighing 280-305 g was purchased from the Vitallihua Experimental Animal Center. These rats were randomly used to prepare thrombus or to create a stroke model.
  • a catheter containing 0.5 mL of thrombus physiological saline suspension was inserted into the trunk of the external carotid artery. While releasing the internal carotid artery clamp, the 0.5 mL thrombus physiological saline suspension in the catheter was slowly moved from the external carotid artery to the proximal heart. The end is injected into the middle cerebral artery through the internal carotid artery.
  • the proximal end of the external carotid artery is ligated, the arterial clip at the internal carotid artery and the common carotid artery is opened, the blood flow is restored, the large external jugular vein is separated, and physiological saline (blank control) or physiological saline solution of the compound of the present invention is taken from the neck.
  • External vein input.
  • the wound was sutured and intramuscularly injected with 20,000 IU of penicillin to prevent infection. This is the immediate treatment model for stroke.
  • a catheter containing 0.5 mL of thrombus physiological saline suspension was inserted into the trunk of the external carotid artery. While releasing the internal carotid artery clamp, the 0.5 mL thrombus physiological saline suspension in the catheter was slowly moved from the external carotid artery to the proximal heart. The end is injected into the middle cerebral artery through the internal carotid artery. Thereafter, the proximal end of the external carotid artery is ligated, and the arterial clip at the internal carotid artery and the common carotid artery is opened to restore blood flow and suture the wound. And intramuscular injection of 20,000 IU of penicillin to prevent infection.
  • Physiological saline or a physiological saline solution of the compound of the present invention is introduced from the tail vein after 4 hours, 6 hours or 24 hours. This is a treatment model for stroke rats at 4 hours, 6 hours and 24 hours. Establish an animal model for evaluating the exact efficacy of the compounds of the invention for strokes of 4 hours, 6 hours and 24 hours
  • the therapeutic effect of the treatment with the compound of the present invention after 24 hours of stroke in rats means that the behavior of the rats was observed after 24 hours of treatment.
  • Behaviors include walking patterns, degree of eyelid drooping in the right eye, degree of stiffness in the tail, muscle tone, degree of slanting of the head, support of the limbs, and death.
  • the in vivo anti-stroke activity of the compounds of the invention is indicated by a neurological function score, the lower the score, the stronger the activity.
  • SD male rats 250-300 g were anesthetized by intraperitoneal injection of 10% chloral hydrate (400 mg/kg), and a 2 cm long incision was made from the center of the neck slightly to the right, along the inside of the sternocleidomastoid muscle.
  • the right common carotid artery, external carotid artery and internal carotid artery were separated.
  • the non-invasive arterial clip was used to clamp the opening of the internal carotid artery and the proximal end of the common carotid artery. A small opening was made in the external carotid artery.
  • the distal end of the external carotid artery was ligated, and the artery clamp of the proximal common carotid artery was loosened.
  • the obtained 10 ⁇ M of blood was placed in a 1 mL EP tube, and the blood was coagulated by placing it at room temperature for 30 minutes, and then transferred to a -20 ° C refrigerator for 1 hour to make the blood clot firm.
  • the blood clot was removed, and 1 mL of physiological saline was added to smash the blood clot into a relatively uniform small thrombus, and then the small thrombus suspension was transferred to a 1 mL syringe for use.
  • the thrombus suspension in the lmL syringe was slowly injected from the rat external carotid artery to the proximal end through the internal carotid artery into the rat's brain, and then the proximal carotid artery was ligated. Open the internal carotid artery and the common carotid artery to obtain an arterial clip to restore blood flow.
  • the rat common carotid vein was isolated, or the vein was immediately ligated, 3 drops of penicillin were added to the wound, the wound was sutured, and the animal was awakened.
  • the sham operation group or the physiological saline solution of urokinase was injected (positive control group, the dose was 20000 IU/ (kg), or infused with normal saline (blank control, dose 3 ml/kg), or injected with TMMZ physiological saline solution (component control, dose 1 mol/kg), or injected with thrombolytic peptide
  • a physiological saline solution of ARPAK, GRPAK, RPAK or PAK component control, dose of 1 ⁇ 1 /] 3 ⁇ 4
  • a physiological saline solution dose of 0.1 ⁇ /kg injecting one of the compounds Ia-Il.
  • the degree of neurological deficit was assessed by the Zeakmga method 24 hours after the rat was awakened. 0 points means no signs of neurological deficit, 1 point means that the forelimbs of the uninjured side can not stretch, 2 points means walking to the uninjured side, 3 points means turning to the uninjured side to form a trailing trail, and 4 points means that the consciousness is not autonomous. 5 points means death.
  • the test results are shown in Table 6.
  • the compound Ia-Ic obtained by linking the thrombolytic peptide ARPAK, GRPAK, RPAK or PAK and the targeting peptide RGDS, RGDV or RGDF to the radical scavenger TMMZ by Lys has the exact dose at 0.1 ⁇ /kg.
  • Urokinase did not show exact anti-stroke activity at the 20000 IU/kg dose.
  • the thrombolytic peptides ARPAK, GRPAK, RPAK or PAK did not show exact anti-stroke activity at a dose of 1 ⁇ /kg.
  • n 10 ; a) ratio of physiological saline to p >0.05; b) ratio of urokinase to p > 0.05, and ratio of physiological saline to p ⁇ 0.01;
  • Test Example 7 Test of cerebral infarction volume treated with the compound of the present invention la to II immediately after stroke in rats
  • Test Example 6 After the rats in Test Example 6 were awakened for 24 hours to assess the degree of neurological deficit, the rats were anesthetized with urethane and the brain was quickly decapitated. The brain tissue was placed in a refrigerator at -20 ° C for 2 hours, and a crown of about 2 mm was started from the forehead. Serial sections, 6 pieces, were then placed in 2% TTC solution for 30 min at 37 ° C in the dark, and the color changes of brain slices were observed. Normal brain tissue was stained red by TTC, and ischemic brain tissue was infarcted brain tissue. It is white. Then, a digital camera was taken and processed by SPSS statistical software to calculate the infarct brain volume and normal brain tissue volume in the coronal section. The test results are shown in Table 7.
  • the test results show that the compound Ia-Ic obtained by linking the thrombolytic peptide ARPAK, GRPAK, RPAK or PAK and the targeting peptide RGDS, RGDV or RGDF to the radical scavenger TMMZ by Lys can be used at a dose of 0.1 ⁇ /kg.
  • the cerebral infarct volume of stroke rats was effectively reduced, and this effect was significantly stronger than that of urokinase at a dose of 20000 IU/kg.
  • Table 7 Cerebral infarction volume of stroke rats treated with Ia-Ic
  • n 10; a) > 0.05 compared with saline; b) ⁇ .01 compared with saline and Ia-Il.
  • Test Example 8 Test of different doses of the compound of the present invention Ie immediately after stroke in rats
  • the present invention selects the compound Ie as a representative based on the analysis, comparison and synthesis of all the test results, and performs a dose-effect relationship test. It should be emphasized that since other compounds of la to II in Test Examples 1-7 and Ie achieve similar effects such as NO radical scavenging, lytic globulin, thrombolytic, antithrombotic, and stroke patients, la to Other compounds of II should be dose-dependent therapeutically comparable to Ie.
  • SD male rats 250-300 g were anesthetized by intraperitoneal injection of 10% chloral hydrate (400 mg/kg), and a 2 cm long incision was made from the right side of the neck slightly to the right, along the inside of the sternocleidomastoid muscle.
  • the right common carotid artery, external carotid artery and internal carotid artery were separated.
  • the non-invasive arterial clip was used to clamp the opening of the internal carotid artery and the proximal end of the common carotid artery. A small opening was made in the external carotid artery.
  • the distal end of the external carotid artery was ligated, and the artery clamp of the proximal common carotid artery was loosened.
  • the obtained ⁇ blood was placed in a l mL EP tube, and the blood was coagulated by being left at room temperature for 30 minutes, and then transferred to a -20 ° C refrigerator for 1 hour to make the blood clot firm.
  • the blood clot was removed, and 1 mL of physiological saline was added to smash the blood clot into a relatively uniform small thrombus, and then the fine thrombus suspension was transferred to a 1 mL syringe for use. While loosening the internal carotid artery clamp, the thrombus suspension in the 1 mL syringe was slowly injected from the rat external carotid artery to the proximal end through the internal carotid artery into the rat's brain, and then the proximal carotid artery was ligated.
  • 0 points means no signs of neurological deficit
  • 1 point means that the forelimbs of the uninjured side can not stretch
  • 2 points means walking to the uninjured side
  • 3 points means turning to the uninjured side to form a trailing trail
  • 4 points means that the consciousness is not autonomous.
  • 5 points means death.
  • the test results are shown in Table 8. The results showed that rats were treated with 1 nmol/kg, 0.1 ⁇ /kg, and 0.01 ⁇ /kg of compound Ie immediately after stroke, and the percentage of rats with neurological score of 0 was 60%, 30%, and 0%, respectively; The percentage of rats with a score of 1 was 20%, 30%, and 10%, respectively. It can be seen that the anti-stroke activity of Compound Ie shows a dose dependency.
  • the percentage of rats with a neurological function score of 0 in the stroke rats treated with 20000 IU/kg urokinase and 3 mg/kg tPA was 10% and 40%, respectively, and the percentage of rats with a neurological score of 1 were respectively.
  • the efficacy of Compound Ie was significantly better than that of 50% and 10%, 1 ⁇ /kg and 0.1 ⁇ /kg.
  • the efficacy is indicated by a neurological function score, and the lower the score, the better the efficacy.
  • Male Sprague-Dawley rats were intraperitoneally injected with 10% chloral hydrate solution at a dose of 400 mg/kg body weight for anesthesia.
  • a longitudinal incision was made in the middle of the neck to separate the trunk of the right common carotid artery (about 3 cm long).
  • the branches of the external carotid artery were ligated at the level of the hyoid bone, and the internal carotid artery was separated at the neck.
  • the non-invasive arterial clip was used to clamp the proximal end of the internal carotid artery and the proximal common carotid artery, and the distal end of the external carotid artery was ligated.
  • a catheter containing 0.5 mL of thrombus physiological saline suspension was inserted into the trunk of the external carotid artery. While releasing the internal carotid artery clamp, the 0.5 mL thrombus physiological saline suspension in the catheter was slowly moved from the external carotid artery to the proximal heart. The end is injected into the middle cerebral artery through the internal carotid artery.
  • the proximal end of the external carotid artery is ligated, and the arterial clip at the internal carotid artery and the common carotid artery is opened to restore blood flow and suture the wound.
  • intramuscular injection of 20,000 IU of penicillin to prevent infection.
  • the physiological saline solution of Compound Ie was once administered from the tail vein of the rats once a day for 6 days, and observed for 1 day.
  • the degree of neurological deficit was evaluated according to the Zealonga method.
  • a normal saline solution of urokinase was administered once a day from the tail vein of the rat for 2 consecutive days.
  • the degree of neurological deficit was assessed by Zealonga method on a daily basis.
  • the physiological saline solution of tPA was once transferred from the tail vein of the rats every day for 2 days, and the degree of neurological deficit was evaluated according to the Zealonga method.
  • 0 points means no signs of neurological deficit
  • 1 point means that the forelimbs of the uninjured side can not stretch
  • 2 points means walking to the uninjured side
  • 3 points means turning to the uninjured side to form a trailing trail
  • 4 points means that the consciousness is not autonomous.
  • 5 points means death.
  • Table 9-1 9-2 and 9-3 Table 9-1 shows that the rats were treated with Compound Ie at a dose of ⁇ /kg once every 4 hours after stroke, and treated continuously for 6 times, except for 1 On the second day, the patient died unexpectedly. Eight of the remaining 10 rats were converted to no signs of neurological deficit, and two residual signs of neurological deficit were found. It can be seen that at doses of ⁇ ⁇ /kg, Compound Ie has a definite therapeutic effect on strokes beyond the golden age.
  • Test Example 10 Rat Stroke After 6 hours, 1 ⁇ /kg of the compound of the present invention Ie was continuously treated 6 times.
  • the efficacy is indicated by a neurological function score, and the lower the score, the better the efficacy.
  • Male Sprague-Dawley rats were intraperitoneally injected with 10% chloral hydrate solution at a dose of 400 mg/kg body weight for anesthesia.
  • a longitudinal incision was made in the middle of the neck to separate the trunk of the right common carotid artery (about 3 cm long).
  • the branches of the external carotid artery were ligated at the level of the hyoid bone, and the internal carotid artery was separated at the neck.
  • the non-invasive arterial clip was used to clamp the proximal end of the internal carotid artery and the proximal common carotid artery, and the distal end of the external carotid artery was ligated.
  • a catheter containing 0.5 mL of thrombus physiological saline suspension was inserted into the trunk of the external carotid artery. While releasing the internal carotid artery clamp, the 0.5 mL thrombus physiological saline suspension in the catheter was slowly moved from the external carotid artery to the proximal heart. The end is injected into the middle cerebral artery through the internal carotid artery.
  • the proximal end of the external carotid artery is ligated, and the arterial clip at the internal carotid artery and the common carotid artery is opened to restore blood flow and suture the wound.
  • intramuscular injection of 20,000 IU of penicillin to prevent infection.
  • the physiological saline solution of Compound Ie was once administered from the tail vein of the rats once a day for 6 days, and observed for 1 day.
  • the degree of neurological deficit was evaluated according to the Zealonga method.
  • a normal saline solution of urokinase was administered once a day from the tail vein of the rat for 2 consecutive days.
  • the degree of neurological deficit was assessed by Zealonga method on a daily basis.
  • the physiological saline solution of tPA was once transferred from the tail vein of the rats every day for 2 days, and the degree of neurological deficit was evaluated according to the Zealonga method.
  • 0 points means no signs of neurological deficit
  • 1 point means that the forelimbs of the uninjured side can not stretch
  • 2 points means walking to the uninjured side
  • 3 points means turning to the uninjured side to form a trailing trail
  • 4 points means that the consciousness is not autonomous.
  • 5 points means death.
  • Tables 10-1, 10-2 and 10-3 The test results are shown in Tables 10-1, 10-2 and 10-3.
  • Table 10-1 indicates that rats were treated with Compound Ie at a dose of 1 ⁇ /kg once a day for 6 hours after stroke, and treated continuously for 6 times, except for 2 accidental deaths on the next day, and the remaining 9 rats were 2 good to no signs of neurological deficit, 1 residual With a slight sign of neurological deficit, there were 6 residual uninjured lateral turns into a trailing walking sign. It can be seen that at a dose of 1 ⁇ /kg, Compound Ie does have a therapeutic effect on strokes beyond the golden phase.
  • Table 10-2 shows that rats were treated with urokinase at a dose of 20000 IU/kg once a day after 6 hours of stroke, and 4 of 6 rats died within 24 hours.
  • the dead rats were autopsied and found to have bleeding in their organs, especially in the lungs.
  • the administration was terminated after administration twice.
  • One rat was transferred to the absence of any signs of neurological deficit in one dose, and one rat had no signs of autonomic walking with residual disturbance of consciousness.
  • Table 10-3 shows that rats received a daily dose of 3 mg/kg of tPA after 6 hours of stroke, and 2 of 6 rats died within 24 hours.
  • the dead rats were autopsied and found to have bleeding in their organs, especially pulmonary hemorrhage.
  • the administration was terminated after administration twice.
  • Two doses of no rats improved to no signs of neurological deficits, two had residual signs of neurological deficits, one had residual uninjured lateral turns into a trailing walking sign, and one residual conscious disorder did not walk autonomously. Signs.
  • the branches of the external carotid artery were ligated at the level of the hyoid bone, and the internal carotid artery was separated at the neck enlargement.
  • the non-invasive arterial clip was used to clamp the opening of the internal carotid artery and the proximal end of the common carotid artery, and the distal end of the external carotid artery was ligated.
  • a catheter containing 0.5 mL of thrombus physiological saline suspension was inserted into the trunk of the external carotid artery.
  • the daily self-control was used to evaluate the neurological deficit according to the Zeakmga method. degree. 0 points means no signs of neurological deficit, 1 point means that the forelimbs of the uninjured side can not stretch, 2 points means walking to the uninjured side, 3 points means turning to the uninjured side to form a trailing trail, and 4 points means that the consciousness is not autonomous. 5 points means death.
  • the test results are shown in Table 11.
  • the data in Table 11 indicates that the first day after 6 hours of stroke in rats, one dose of Compound Ie at a dose of 5 ⁇ /kg was administered, and the daily dose of Compound Ie at a dose of 2 ⁇ /kg for 5 days was obtained. . Except for 2 deaths, 6 of the remaining 10 rats in the 12 treatments improved to no signs of neurological deficit, 2 had slight signs of neurological deficit, and 1 remained There was one uninjured side walking sign, and one residual undamaged side turned into a trailing and trailing walking sign. It can be seen that continuous treatment of compound Ie is indeed effective for strokes beyond the golden period.
  • Test Example 12 After a stroke of 24 hours in rats, the first time after 5 ⁇ /kg 5 times 2 ⁇ /kg The therapeutic effect of the compound Ie of the present invention was evaluated by a neurological function score, and the lower the score, the better the therapeutic effect.
  • Male Sprague-Dawley rats were intraperitoneally injected with 10% chloral hydrate solution at a dose of 400 mg/kg body weight for anesthesia.
  • a longitudinal incision was made in the middle of the neck to separate the trunk of the right common carotid artery (about 3 cm long).
  • the branches of the external carotid artery were ligated at the level of the hyoid bone, and the internal carotid artery was separated at the neck enlargement.
  • the non-invasive arterial clip was used to clamp the opening of the internal carotid artery and the proximal end of the common carotid artery, and the distal end of the external carotid artery was ligated.
  • a catheter containing 0.5 mL of thrombus physiological saline suspension was inserted into the trunk of the external carotid artery. While releasing the internal carotid artery clamp, the 0.5 mL thrombus physiological saline suspension in the catheter was slowly moved from the external carotid artery to the proximal heart. The end is injected into the middle cerebral artery through the internal carotid artery.
  • a physiological saline solution of Compound Ie (dose of 2 mol/kg) was administered from the tail vein of the rats once a day for 6 days, and observed for 7 days.
  • the degree of neurological deficit was evaluated according to the Zeakmga method.
  • 0 points means no signs of neurological deficit
  • 1 point means that the forelimbs of the uninjured side can not stretch
  • 2 points means walking to the uninjured side
  • 3 points means turning to the uninjured side to form a trailing trail
  • 4 points means that the consciousness is not autonomous.
  • 5 points means death.
  • Table 12 shows that the first day after 24 hours of stroke in rats, one dose of Compound Ie at a dose of 5 ⁇ /kg was administered, and the compound Ie administered at a dose of 2 ⁇ /kg per day for 5 days was obtained. . Except for 3 deaths, 8 of the remaining 12 rats in the 12 treatments were better to be improved without any signs of neurological deficit, and 1 had a slight residual neurological deficit. It can be seen that continuous treatment of Compound Ie is indeed effective for strokes beyond the golden period. Table 12 Efficacy of treatment with compound Ie of the present invention after 24 hours of stroke in rats
  • Test Example 13 Test of Compound Ie of the present invention 6 times after 6 hours of stroke in rats 2 ⁇ /kg
  • the efficacy is indicated by a neurological function score, and the lower the score, the better the efficacy.
  • Male Sprague-Dawley rats were intraperitoneally injected with 10% chloral hydrate solution at a dose of 400 mg/kg body weight for anesthesia.
  • a longitudinal incision was made in the middle of the neck to separate the trunk of the right common carotid artery (about 3 cm long).
  • the branches of the external carotid artery were ligated at the level of the hyoid bone, and the internal carotid artery was isolated at the neck enlargement.
  • the non-invasive arterial clip was used to clamp the opening of the internal carotid artery and the proximal end of the common carotid artery, and the distal end of the external carotid artery was ligated.
  • a catheter containing 0.5 mL of thrombus physiological saline suspension was inserted into the trunk of the external carotid artery. While releasing the internal carotid artery clamp, the 0.5 mL thrombus physiological saline suspension in the catheter was slowly moved from the external carotid artery to the proximal heart. The end is injected into the middle cerebral artery through the internal carotid artery.
  • the thrombus block used in this test case is not a physiological saline suspension of a thrombus block prepared by thrombus stored at -24 ° C, but is obviously hard prepared by placing a more old thrombus at room temperature for 24 hours.
  • a physiological saline suspension of thrombus mass After that, the proximal end of the external carotid artery was ligated, and the arterial clip at the internal carotid artery and the common carotid artery was opened to restore blood flow and suture the wound. And intramuscular injection of 20,000 IU of penicillin to prevent infection.
  • the degree of neurological deficit was evaluated by Zeakmga method on a daily basis. 0 points means no signs of neurological deficit, 1 point means that the forelimbs of the uninjured side can not stretch, 2 points means walking to the uninjured side, 3 points means turning to the uninjured side to form a trailing trail, and 4 points means that the consciousness is not autonomous. 5 points means death.
  • the test results are shown in Table 13.
  • Test Example Compound 14 of the present invention to II in la lxlO_ 6 M, nanostructures test at lxlO_ 9 M and lxlO_ 12 M concentration of the compound of the present invention to II la 1 ⁇ 10 ⁇ 6 were formulated with distilled water three ⁇ , 1> ⁇ 10 ⁇ 9 ⁇ and 1> ⁇ 10 ⁇ 12 ⁇ solution, draw 10 ⁇ L of water on the surface of the copper mesh, lining the filter paper under the copper mesh, dry naturally, observe and use photos under transmission electron microscope transmission electron microscope (JEOL, JEM-1230) Record the morphology and particle size.
  • JEOL, JEM-1230 transmission electron microscope transmission electron microscope
  • Test compound Compounds la to II of the present invention.
  • test method The test compound (Ia-Il) was separately prepared into a solution of 1 ⁇ 10 ⁇ 6 ⁇ , 1> ⁇ 10 ⁇ 9 ⁇ and 1> ⁇ 10 ⁇ 12 ⁇ with three distilled waters, and a small amount (about 10 ⁇ ) was taken. Dropped on the surface of the copper mesh, the copper mesh was lined with filter paper, and dried naturally. The morphology and particle size were observed under a transmission electron microscope transmission electron microscope (JEOL, JEM-1230) and recorded by photographs.
  • JEOL, JEM-1230 transmission electron microscope transmission electron microscope
  • Figure 25 is a nanostructure of the compound la of the present invention in an aqueous solution of ⁇ - 6 ⁇ , ⁇ " 9 M and ⁇ - 12 M, and the nanostructure of la in an aqueous solution is a nanosphere having a diameter of 3.1 nm to 86.1 nm; compound lb invention 1 ⁇ 10- 6 ⁇ , 1 ⁇ 10- 9 ⁇ and 1 ⁇ 10- 12 ⁇ nanostructures in an aqueous solution, an aqueous solution lb nanostructures having a diameter of 4.3 nm to 297.9 nm nanospheres; FIG.
  • FIG 30 If the compounds of the present invention 1 ⁇ 10- 6 ⁇ , 1 ⁇ 10- 9 ⁇ and 1 ⁇ 10- 12 ⁇ Nanostructure in aqueous solution, nanostructure of If in aqueous solution is nanosphere with diameter of 3.6 nm to 82.4 nm;
  • Figure 31 is a nanostructure of aqueous solution Ig of compound Ig in 1 ⁇ 10_ 6 ⁇ , 1 ⁇ 10_ 9 ⁇ and lxlO 12 M aqueous solution, aqueous solution The nanostructure of Ig is a nanosphere with a diameter of 6.3 nm to 264.5 nm;
  • Figure 32 is the nanostructure of the compound Ih in the aqueous solution of lxlO- 6
  • FIG. 33 in the present invention is a compound Ii 1 ⁇ 10_ 6 ⁇ , 1 ⁇ 10 "9 ⁇ and 1 ⁇ 10_ 12 ⁇ nanostructures in an aqueous solution, an aqueous solution of Ii nanostructures having a diameter of 4.7 nm to 107.7 nm nanospheres;
  • FIG. 34 in the present invention the compound Ij 1 ⁇ 10- 6 ⁇ , 1 ⁇ 10- 9 ⁇ and 1 ⁇ 10- 12 ⁇ nanostructures in an aqueous solution, an aqueous solution of Ij nanostructures are of a diameter of 9.1 nm to 73.7 nm nanospheres;
  • FIG. 34 in the present invention the compound Ij 1 ⁇ 10- 6 ⁇ , 1 ⁇ 10- 9 ⁇ and 1 ⁇ 10- 12 ⁇ nanostructures in an aqueous solution, an aqueous solution of Ij nanostructures are of a diameter of 9.1 nm to 73.7 nm nanospheres;
  • FIG. 34 in the present invention the compound Ij
  • Test Example 15 Compound II to the invention la lxl0_ 6 M, high resolution FT- MS under test and lxlO_ 9 M lxlO_ 12 M concentration of 12.5 ⁇ solutions were formulated with the compound Ia-Il triple-distilled water, suction inlet 10 Like, in solariX FT-ICR mass spectrometry (Bruker) Daltonik) observed the state of intermolecular association and recorded data. The results are shown in Tables 14 - 16.
  • Table 14 - Table 16 are the exact masses determined using an FT high resolution mass spectrometer. These mass stated, the compounds of the present invention, Ia-Il in 1 10_ 6 M, measured at the same time (12 ⁇ Three concentrations ⁇ > ⁇ lxllT 9 1 ⁇ 1 and dimers, trimers and tetramers be seen, the present invention The compound can simultaneously form dimers, trimers, and tetramers in an aqueous solution.
  • Test Example 16 High-resolution FT-MS test of the compound Ie of the present invention at a concentration of 10.0 ⁇ , 1.0 ⁇ , 0.1 ⁇ , 0.01 ⁇
  • the compound Ie was separately formulated into three-distilled water to be 10.0 ⁇ , 1.0 ⁇ , 0.1 ⁇ . , 0.01 ⁇ of the solution, aspirate ⁇ ⁇ injection, observe the intermolecular association state on solariX FT-ICR mass spectrometer (Bruker Daltonik), and record the map. The results are shown in Figures 37-40.
  • Figure 37 is a high resolution FT-MS mass spectrum of the compound Ie of the present invention at a concentration of 0.01 ⁇ : 915.84146 is a dimer-charged three-charged ion, and the tetra-charged ion of the 1030.321 14 trimer is 1099.00914 is a tetramer-charged penta-charged ion;
  • Figure 38 is a high resolution FT-MS mass spectrum of the compound Ie of the present invention at a concentration of 0.1 ⁇ : 915.84124 is a dimer-charged three-charged ion, and the 1030.32208 trimer tetra-charged ion 1099.00829 is a tetramer-charged ion; 39 is a high resolution FT-MS mass spectrum of the compound Ie of the present invention at a concentration of 1 ⁇ : 915.84095 is a dimer of a three-charged ion, a 1030.32067 trim
  • the dimers, trimers, and tetramers formed in the aqueous solution of the compound of the present invention are further assembled to form nanospheres having a diameter of 2 nm to 300 nm.
  • the number of nanospheres less than 100 nm in diameter exceeds 99%.
  • a well-known fact of nanopharmaceutics is that nanospheres with a diameter of less than 100 nm are not easily phagocytized by macrophages in the blood and easily cross the capillary wall. These properties allow the compounds of the invention to cross the blood brain barrier. It is the ability of the compounds of the invention to cross the blood-brain barrier such that metabolites of the compounds of the invention are detectable in the brain tissue of treated stroke rats.
  • Test Example 17 High-resolution FT-MS monitoring of metabolites in rat brain tissue treated with compound Ie of the present invention
  • the whole brain of the rat was taken, placed in a 50 mL centrifuge tube, 10 mL of 0.9% NaCl solution was added, homogenized to obtain a uniform suspension, and then centrifuged at 3000 rpm for 10 min; take 5 mL of the solution, and then Add 10 mL of methanol, mix by shaking, centrifuge at 3000 rpm for 10 min, take the solution and concentrate to dryness under reduced pressure. Further, 1 mL of methanol was added, and the supernatant was again centrifuged at 12,000 rpm for 10 min to monitor the metabolite content of the compound in the brain tissue of the Ie-treated rat.
  • the compound Ie of the present invention does pass through the blood-brain barrier and can achieve the effects of removing NO radicals, thrombolytics and anti-thrombus in the brain.

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Abstract

本发明公开了一种同时具有溶血栓、清除自由基和血栓靶向功能的新颖化合物及其制备方法和用途。所述化合物是以连接臂将溶血栓肽、自由基清除剂和血栓靶向/抗血栓肽组合在一起形成的三元缀合物。本发明还公开了含有所述化合物的药物组合物，其中所述化合物形成纳米球结构。

Description

同时具溶血栓、 清除自由基和血栓靶向功能的新颖化合物及其制备方法和用途 技术领域
本发明涉及一种同时具有溶血栓、 清除 NO 自由基和血栓靶向 /抗血栓三种功能的新颖化合物及其 制备方法和用途。 本发明进一步涉及以含有羧基和氨基的连接臂将含 PAK (Pro-Ala-Lys)序列的溶血栓 寡肽、 1-(4-氧乙酰基-苯基) -3，3，4，4-四甲基 -咪唑啉及含 RGD (Arg-Gly-Asp)序列的血栓靶向肽 /抗血栓寡 肽连接在一起形成的 "含 PAK序列肽 /咪唑啉 /含 RGD序列肽"的新颖三元缀合物。 本发明还涉及包含所 述化合物的用于清除 NO自由基、 溶血栓、 血栓靶向 /抗血栓和治疗中风 /脑梗塞的药物组合物。 本发明 同时还涉及所述化合物的制备方法。 背景技术
在全球范围内， 血栓性疾病的发病率和死亡率都居首位。 冠状动脉血栓， 导致心梗。 脑血管栓塞， 导致脑梗， 也就是临床上的缺血性中风。 心梗患者既可以静脉注射溶栓药物， 也可以施以搭桥手术。 必 须指出， 给心梗患者静脉注射溶栓药物的正面结果是缺血再灌注。 由于缺血再灌注过程中产生大量 NO 自由基， 所以溶栓过程与心肌损伤及患者死亡相联系。 这是目前溶栓治疗心梗的严重问题。 目前， 脑梗 治疗面临的问题更复杂。例如现有溶栓药物都不能有效地跨过血脑屏障， 以至于静脉注射溶栓药物对脑 梗患者的疗效极其有限。又例如目前还没有适宜的手术可以救治脑梗患者。 同样， 给脑梗患者静脉注射 溶栓药物即使有正面结果， 缺血再灌注过程中也会产生大量 NO自由基， 使溶栓过程与脑组织损伤及患 者死亡相联系。这是目前溶栓治疗脑梗的严重问题。再者，中风患者的临床治疗面临四个难题： 1) 除 tPA (tissue-type plasminogen activator, 组织型纤溶酶原激活剂)外， 没有其它药物可对中风患者显示疗效； 2) tPA治疗只在患者中风 3小时之内显示疗效，即 tPA只有 3小时治疗黄金期；3) tPA治疗通常引起全身出血； 4) tPA治疗无法避免缺血再灌注过程中产生的大量 NO自由基对患者造成的脑组织损伤及患者死亡。 只 有解决了这四个难题， 中风患者的临床治疗才可能获得实质性突破。
在中国专利申请公布号 CN102807604和 CN102807605的申请案中， 公开了 Να-(1，3-二氧 -4，4，5，5-四甲 基咪唑啉—2-苯基 -4'-氧乙酰基) -ηω -脂肪酰基 -Lys-Arg-Gly-Asp-Val和 Να-(1，3-二氧 -4，4，5，5-四甲基咪唑啉 -2-苯基 -4'-氧乙酰基) -ηω -脂肪酰基 -Lys-Arg-Gly-Asp-Phe两种化合物。 这两种化合物是将具清除 NO自由 基活性的咪唑啉与含 RGD序列 (Arg-Gly-Asp)的抗血栓寡肽以赖氨酸组合。 与本发明的化合物不同， 此 两种化合物中没有连接溶栓肽。此两种化合物没有溶血栓作用， 不适用于制备溶血栓药物， 且不适用于 治疗缺血性中风的患者。
为解决上述问题，需要一种同时具有溶血栓、清除 NO自由基和血栓靶向 /抗血栓作用的新颖化合物。 并且， 这样的新颖化合物要能够有在患者中风 3小时之后显示疗效， 即不受使用 tPA的 3小时治疗黄金期 的限制； 没有 tPA样的全身出血反应； 且能够清除缺血再灌注过程中产生的大量 NO自由基。 发明内容
本发明提供一种集跨血脑屏障、 溶血栓、 抗血栓和清除 NO自由基活性作用于一体的三元缀合物， 其中所述三元是指具清除 NO自由基活性的咪唑啉类、具溶血栓活性肽及血栓靶向肽，其通过适合的连 接臂连接在一起。
具体而言， 本发明的三元缀合物可以式 I化合物表示：
Figure imgf000003_0001
其中， NN代表具清除 NO自由基活性的咪唑啉类； AAi代表具有至少三个连接用基团的连接臂； AA2代表具溶血栓活性肽； AA3代表血栓靶向肽。
可用于本发明的咪唑啉类包含 Nitronyl Nitroxides( )类咪唑类氮氧自由基， 其能够清除 NO， 还具 有清除氧自由基的功能，对氧自由基损伤的细胞有很强的保护作用。本发明的具清除 NO自由基活性的 咪唑啉类， 较佳是 ^3-二氧基 -2-[(4-氧乙酸)苯基 ]-4，4，5，5-四甲基咪唑啉， 其具有突出的化学稳定性和物 理， 即不仅可用于与溶血栓活性肽及血栓靶向肽缀合的任何化学反应， 而且在储存过程中不容易分解， 因而可满足制剂需求。
可用于本发明的连接臂具有至少三个连接用基团， 例如： 羧基和氨基， 用以将咪唑啉类、 具溶血栓 活性肽、血栓靶向肽这三者连接在一起。本发明的连接臂可为天然氨基酸，例如： L-Lys、 L-Asp和 L-Glu。 当用于本发明的连接臂 (ΑΑ^具有三个以上的连接用基团时， 可接一个以上的 NN、 AA2、 或 AA3 ; 其中 两个以上的 NN、 AA2、 或 AA3可为相同或不同。 例如， 当 ^！有四个连接用基团时， 可接一个 NN、 两个 AA2、 和一个 AA3 ; 此时两个 AA2可为相同或不同的溶血栓活性肽。
可用于本发明的具溶血栓活性肽可为含 PAK (Pro-Ala-Lys)序列、 AKP (Ala-Lys-Pro)序列或 KAP (Lys-Ala-Pro)序列的寡肽或包含以 PAK序列、 AKP序列或 KAP序列为结构单元的重复序列肽。寡肽是 指分子量在 1000道尔顿 (D)以下的小分子肽， 一般由 3至 8个氨基酸组成。本发明的具溶血栓活性寡肽 可为含 PAK序列、 AKP序列或 KAP序列的三肽至八肽， 较佳为含 PAK序列、 AKP序列或 KAP序列 的三肽至五肽。 举例来说， 可用于本发明的含 PAK序列、 AKP序列或 KAP序列的寡肽可为 PAK、 RPAK(Arg-Pro-Ala-Lys)、 ARPAK (Ala-Arg- Pro-Ala-Lys)、 GRPAK (Gly-Arg-Pro-Ala-Lys)、 QRPAK (Gln-Arg-Pro-Ala-Lys)、 AKP、 KAP、 KPAK (Lys-Pra-Ala-Lys)、 PAKP (Pro-Ala-Lys-Pro) AKPAK (Ala-Lys-Pro-Ala-Lys)或 PAKPA (Pro-Ala-Lys-Pro-Ala)。 举例来说， 可用于本发明的以 PAK序列、 AKP 序列或 KAP序列为结构单元的重复序列肽可为在中国专利申请公布号 CN101190941的申请案中公布的 一系列具有溶血栓活性的肽，包含以 PAK为结构单元合成的重复序列肽 (PAK)2、(PAK)3、(PAK)4、(PAK)5 和 (PAK)6 ; 以 AKP 为结构单元合成的重复序列肽 (AKP)2、 (AKP)3 (AKP)4 (AKP)5 P(AKP)6 ; 及以 KPA为结构单元合成的重复序列肽 (KPA)2、 （KPA)3、 （KPA)4、 （KPA)5和 (KPA)6。
可用于本发明的血栓靶向 /抗血栓肽可为含 RGD序列 (Arg-Gly-Asp)的寡肽。 含 RGD序列的寡肽可 为 RGDS (Arg-Gly-Asp-Ser), RGDV (Arg-Gly-Asp-Val)和 RGDF (Arg-Gly-Asp-Phe)等 RGD四肽。 纤维 蛋白原 (Fibrinogen, Fg)和活化血小板膜糖蛋白 (Glycoprotein, GP)IIb/IIIa受体的特异性结合是各种生理性 诱导剂引起血小板聚集的最终共同通道， 在血栓形成中起着重要作用。 而 RGD序列则是配体 Fg和活 化 GPIIb/IIIa受体结合的活性位点， 具有活化血小板靶向性。 含 RGD序列的结构物可竞争性地抑制和 阻断 Fg和 GPIIb/IIIa受体的结合， 从而阻断血小板聚集和血栓的形成， 使含 RGD的寡肽成为有效的血 栓靶向分子与抗血栓剂。 另外， 可用于本发明的血栓靶向肽可为在中国专利申请公布号 CN101190940的申请案中公开的一 系列有靶向抗血栓活性的多肽，包含对 RGD肽与 YIGS (Tyr-Ile-Gly-Ser)肽进行缀合式修饰而得的多肽。 这些修饰而得的多肽可为 YIGSRRGDS、 YIGSRRGDV、 YIGSRRGDF, YIGSRYIGSK、 YIGSRYIGSR、 YIGSKRGDS、 YIGSKRGDF、 YIGSKRGDV、 YIGSKYIGSK、 YIGSKYIGSR、 RGDSRGDS、 RGDVRGDV、 RGDFRGDF、 RGDSYIGSR、 RGDSYIGSK、 RGDVYIGSR、 RGDVYIGSK、 RGDFYIGSR、或 RGDFYIGSK。
在一较佳实施例中，本发明化合物中具清除 NO自由基活性的咪唑啉类为 1，3-二氧基 -2-[(4-氧乙酸) 苯基] -4，4，5，5-四甲基咪唑啉； 具溶血栓活性肽为含 PAK序列 (Pro-Ala-Lys)的寡肽； 且血栓靶向肽为含 RGD序列 (Arg-Gly-Asp)的寡肽。 据此， 本发明提供了一种集跨血脑屏障、 溶血栓、 抗血栓和清除 NO 自由基活性作用于一体的"含 PAK序列肽 /咪唑啉 /含 RGD序列肽"三元缀合物。
在一实施例中， 本发明化合物中具清除 NO 自由基活性的咪唑啉类为 1，3-二氧基 -2-[(4-氧乙酸)苯 基] -4，4，5，5-四甲基咪唑啉； 连接臂为 L-Lys; 具溶血栓活性肽为含 PAK序列 (Pro-Ala-Lys)的寡肽； 且血 栓靶向肽为含 RGD序列 (Arg-Gly-Asp)的寡肽。 其中， 含 PAK序列的寡肽可为 ARPAK五肽、 GRPAK 五肽、 RPAK四肽或 PAK三肽； 且含 RGD序列的寡肽可为 RGD四肽， 例如 RGDS、 RGDV或 RGDF。 当以 -Lys为连接臂时， 本发明化合物可为以下通式 1-1或 1-2:
Figure imgf000004_0001
其中 ^^和^!^可为同时存在、 aai存在但 aa2不存在、 或同时不存在； 当其同时存在时， &^为11 (八 )， 且 aa2为 G (Gly)、 A (Ala)或 Q (Gin);当 aai存在但 aa2不存在时， aaj为 R (Arg); aa3可为 S (Ser), V (Val), 或 F (Phe)。
以通式 1-1化合物为例， 在一较佳实施例中， 本发明化合物可为如以下通式 1-1-1表示的 ARPAK/ 咪唑啉 /RGD三元缀合物； 在另一较佳实施例中， 本发明化合物可为如以下通式 1-1-2表示的 GRPAK/ 咪唑啉 /RGD三元缀合物； 在又一较佳实施例中， 本发明化合物可为如以下通式 1-1-3表示的 RPAK/咪 唑啉 /RGD三元缀合物； 且在再一较佳实施例中， 本发明化合物可为如以下通式 1-1-4表示的 PAK/咪唑 啉 /RGD三元缀合物：
Figure imgf000004_0002
Figure imgf000005_0001
aa3可为 S (Ser)、 V (Val)、 或 F (Phe), 且较佳为 V (Val)。
可 佳为以下通式 1-2-1、 1-2-2、 1-2-3或 1-2-4:
Figure imgf000005_0002
aa3可为 S (Ser)、 V (Val)、 或 F (Phe), 且较佳为 V (Val)„
另一实施例中， 本发明化合物中具清除 NO 自由基活性的咪唑啉类为 1，3-二氧基 -2-[(4-氧乙酸)苯 基] -4，4，5，5-四甲基咪唑啉； 连接臂为 L-Asp; 具溶血栓活性肽为含 PAK序列 (Pro-Ala-Lys)的寡肽； 且所 述血栓靶向肽为含 RGD序列 (Arg-Gly-Asp)的寡肽。 当以 L- Asp为连接臂时， 本发明化合物可为以下通 式 1-3 -4:
Figure imgf000005_0003
其中 &^和&&2可为同时存在、 aai存在但 aa2不存在、 或同时不存在； 当其同时存在时， &^为11 (八 )， 且 aa2为 G (Gly)、 A (Ala)或 Q (Gin);当 a 存在但 aa2不存在时， aaj为 R (Arg); aa3可为 S (Ser)、 V (Val)、 或 F (Phe)。 a 较佳为 R (Arg); aa2较佳为 G (Gly); 且 aa3较佳为 V (Val)。
以通式 1-3化合物为例， 本发明化合物可较佳为以下通式 1-3-1、 1-3-2、 1—3-3或 1-3-4:
Figure imgf000006_0001
aa3可为 S(Ser)、 V(Val)、 或 F (Phe)， 且较佳为 V(Val)。
-4化合物为例， 本发明化合 -4-1、 1-4-2、 1-4-3或 1-4-4:
Figure imgf000006_0002
aa3可为 S(Ser)、 V(Val)、 或 F (Phe)， 且较佳为 V(Val)。
又一实施例中， 本发明化合物中具清除 NO 自由基活性的咪唑啉类为 1，3-二氧基 -2-[(4-氧乙酸)苯 基] -4，4，5，5-四甲基咪唑啉； 连接臂为 L-Glu; 具溶血栓活性肽为含 PAK序列 (Pro-Ala-Lys)的寡肽； 且血 栓靶向肽为含 RGD序列 (Arg-Gly-Asp)的寡肽。当以 L- Glu为连接臂时，本发明化合物可为以下通式 1-5 或 1-6:
Figure imgf000006_0003
其中 ^^和^!^可为同时存在、 aai存在但 aa2不存在、 或同时不存在； 当其同时存在时， &^为11(八 )， 且 aa2为 G (Gly)、 A (Ala)或 Q (Gin);当 a 存在但 aa2不存在时， aaj为 R (Arg); aa3可为 S (Ser)、 V (Val)、 或 F (Phe；)。 a 较佳为 R (Arg); aa2较佳为 G (Gly); 且 aa3较佳为 V (Val)。
-5化合物为例， 本发明化合物可较佳为以下通式 1-5-1、 1-5-2、 1-5-3或 1-5-4:
Figure imgf000007_0001
aa3可为 S (Ser)、 V (Val)、 或 F (Phe)， 且较佳为 V (Val)。
1-6化合物为例， 本发明化合物可 1-6-1、 1-6-2、 1-6-3或 1-6-4:
Figure imgf000007_0002
Figure imgf000007_0003
aa3可为 S (Ser)、 V (Val)、 或 F (Phe)， 且较佳为 V (Val)。
又一方面， 本发明还涉及一种药物组合物， 包含前述的本发明化合物， 及药学上可接受的载剂。 本 发明药物组合物较佳是包含前述通式 1-1、 1-2、 1-3、 1-4、 1-5、 或 1-6的化合物。 本发明药物组合物更佳 是包含通式 1-1-1、 1-1-2、 1-1-3或 1-1-4的化合物。 当本发明药物组合物包含通式 1-1-1、 1-1-2、 1-1-3或 1-1-4 的化合物时， 这些化合物在药物组合物中可形成二聚体、 三聚体或四聚体结构， 并且可形成直径 为 2 nm至 300 nm的纳米球。 在本发明药物组合物中， 所述纳米球结构更佳是具有 2 nm至 100 nm的 直径。 纳米药学的一个公知的事实是， 直径小于 100 nm的纳米球在血液在输送不易被巨噬细胞吞噬， 容易跨过毛细血管壁。这些性能使得本发明的化合物可跨过血脑屏障。本发明药物组合物可作为溶血栓 药物， 用于治疗心肌梗塞（Mmyocardial infarction)、 中风（Ischemic stroke)、 静脉栓塞（Deep vein thrombosis) 肺栓塞 (Pulmonary embolism)、周边动脉阻塞性疾病 (Peripheral arterial occlusive disease)、静 脉导管阻塞 (occluded central vascular access devices) 动静脉瘻管及分流管阻塞 (Clotted arteriovenous fistula and shunts), 和颈动脉狭窄 (Carotid Stenosis)等疾病。 本发明药物组合物亦可作为清除 NO自由基 药物， 用于治疗神经退化疾病 (Neurodegenerative diseases；)， 例如阿尔茨海默氏病 (Alzheimer's disease；)、 帕金森氏症 (Parkinson's disease)、 运动神经元病 (motor neuron diseases)、 肌萎缩性脊髓侧索硬化症 (Amyotrophic lateral sclerosis) 噪声 (Noise-induced hearing loss)、 卢贾里格症 (Lou Gehrig's disease、 或 亨廷顿病性痴呆 (Huntington's disease )；用于治疗心血管疾病 (Cardiovascular disease),例如动脉粥样硬化 (Atherosclerosis)、 冠心病 (Coronary heart disease) 或心肌梗死 (Myocardial infarction); 用于治疗精神疾 病， 例如躁郁症 (Bipolar disorder)、 精神分裂症 (Schizophrenia)、 或自闭症 (Autism); 及用于治疗高地综 合症 (Altitude sickness；)、 糖尿病、 类风湿性关节炎、 创伤性脑损伤 (Traumatic brain injury；)、 癌症、 X染 色体易裂症 (Fragile X syndrome)、 镰刀型红血球疾病 (Sickle Cell Disease)、 扁平苔藓 (Lichen planus)、 白 斑病 (Vitiligo^或慢性疲劳症候群 (Chronic fatigue syndrome)等疾病。本发明药物组合物还可作为血栓靶 向 /抗血栓药物， 用于治疗血小板增多症 (Thrombocytosis；)、 骨髓增生性疾病 (myeloproliferative disease) ^ 真性红细胞增多症 (Polycythemia vera)、或布卡综合征 (Budd-Chiari syndrome)等疾病。本发明药物组合物 也可作为治疗中风或脑梗药物，更佳用于治疗发病超过 3小时、 4小时、 6小时和 24小时的中风或脑梗， 且以连续给药方式来治疗。 本发明药物组合物 /化合物同时具有清除 NO自由基、 溶血栓、 和抗血栓 /血 栓靶向的功能， 因此能够在患者中风 3小时之后仍然保持疗效， 即不受使用 tPA的 3小时治疗黄金期 的限制； 不会造成 tPA样的全身出血反应； 和能够清除缺血再灌注过程中产生的大量 NO自由基， 使患 者在治疗时脑神经组织免受损伤。 本发明药物组合物中， 所述化合物的纳米结构可达成跨过血脑屏障、 溶血栓、 血栓靶向 /抗血栓和清除缺血再灌注过程中产生的 NO自由基的作用最大化。
本发明药物组合物可为任何一种临床可接受的适宜制剂，例如，可以是注射制剂（粉针、冻干粉针、 水针、 输液等） 、 片剂、 口服液、 颗粒剂、 胶囊剂、 软胶囊或滴丸等； 其中， 药学上可接受的载剂可为 木糖醇、 甘露醇、 乳糖、 果糖、 葡聚糖、 葡萄糖、 聚乙烯吡咯垸酮、 低分子右旋糖酐、 氯化钠、 葡萄糖 酸钙或磷酸钙中的一种或几种。另外，本发明药物组合物还可包含辅料，所述的辅料可以是抗氧络合剂、 填充剂、 骨架材料等。
再一方面， 本发明还涉及前述式 I化合物的制备方法， 包括以下步骤：
(1) 提供具清除 NO 自由基活性的咪唑啉类 ( N)、 具有至少三个连接用基团的连接臂 (AA 具溶血栓 活性肽 (AA2)及血栓靶向肽 (AA3)， 其中连接臂具有第一连接用基团、 第二连接用基团及第三连接用 基团；
(2) 在适当反应条件下，连接具清除 NO自由基活性的咪唑啉类 ( N)与连接臂 (ΑΑ^的第一连接用基团， 形成通式 IM-1化合物：
Figure imgf000008_0001
(3) 在适当反应条件下， 连接具溶血栓活性肽 (AA2)与通式 IM-1化合物， 其中具溶血栓活性肽的一端与 连接臂的第二连接用基团相连接， 形成通式 IM-2化合物：
N -AA AA2 (IM-2); 及 (4) 在适当反应条件下， 连接血栓靶向肽 (AA3)与通式 IM-2化合物， 其中血栓靶向肽的一端与连接臂的 第三连接用基团相连接而形成通式 I化合物；
其中步骤 (3)与步骤 (4)的顺序可以交换。
本发明的制备方法， 在步骤 (1)更包含将连接臂 (ΑΑ^的第二和第三连接用基团以保护基保护， 且将 具溶血栓活性肽 (AA2)和血栓靶向肽 (AA3)上除连接用一端外的活性基团以保护基保护； 步骤 (3)更包含 先将受保护的第二连接用基团去保护，再将具溶血栓活性肽与去保护的第二连接用基团相连接；步骤 (4) 更包含先将受保护的第三连接用基团去保护，再将血栓靶向肽与去保护的第三连接用基团相连接；且步 骤 (4)后更包含将具溶血栓活性肽 (AA2)和血栓靶向肽 (AA3)上受保护的活性基团去保护。 利用加上保护 基和去除保护基的技术， 可以控制 NN、 AA2和 AA3与连接臂连接的次序和位置； 待组合完成后再将其 它活性基团上的保护基去保护。 适当反应条件是指多肽合成中的常规条件。 可用于本发明制备方法的 NO自由基活性的咪唑啉类 ( N)、 具有至少三个连接用基团的连接臂 (AAi；)、 具溶血栓活性肽 (AA2)及血 栓靶向肽 (AA3)与前述用于本发明式 I化合物中的定义相同。
本发明制备方法可由以下更详细的说明来进一步了解。
在一实施例中，本发明制备方法的连接臂的第一连接用基团为氨基，且所述第二和第三连接用基团 选自羧基和氨基。
本发明制备方法的较佳实施例中， 具清除 NO 自由基活性的咪唑啉类为 1，3-二氧基 -2-[(4-氧乙酸) 苯基] -4，4，5，5-四甲基咪唑啉； 连接臂为 L-Lys ; 具溶血栓活性肽为含 PAK序列 (Pro-Ala-Lys)的寡肽； 且 血栓靶向肽为含 RGD序列 (Arg-Gly-Asp)的寡肽。 当以 L-Lys为连接臂时， 可有以下两种接合方式：
(1) 1，3-二氧基 -2-[(4-氧乙酸)苯基] -4，4，5，5-四甲基咪唑啉与 L-Lys连接臂的一氨基相连接； 含 PAK 序列的寡肽上的羧基与 L-Lys连接臂的另一氨基相连接； 且含 RGD序列的寡肽上的氨基与 L-Lys连接 臂的羧基相连接 (如前述通式 1- 1化合物所示； 或
(2) 1，3-二氧基 -2-[(4-氧乙酸)苯基] -4，4，5，5-四甲基咪唑啉与 L-Lys连接臂的一氨基相连接； 含 PAK 序列的寡肽上的氨基与 L-Lys连接臂的羧基相连接； 且含 RGD序列的寡肽上的羧基与 L-Lys连接臂的 另一氨基相连接 (如前述通式 1-2化合物所示)。
以通式 1- 1化合物为例， 当制备通式 1- 1-1、 1- 1-2、 1-1-3或 1- 1-4化合物时， 本发明制备方法可为图
1-图 4所示的合成路线。 图 1为制备通式 1-1- 1化合物的合成路线图； 图 2为制备通式 1-1-2化合物的合 成路线图； 图 3为制备通式 1-1-3化合物的合成路线图； 图 4为制备通式 1-1-4化合物的合成路线图。 图 1至图 4中， aa3如前所述， 可为 S (Ser)、 V (Val), 或 F (Phe；)。 以通式 1-1-2化合物为例， 本发明的制备 方法说明如下：
(1) 制备 1，3-二氧基 -2-(4-氧乙酸基-苯基) -4，4，5，5-四甲基咪唑啉；
(2) 制备 1，3-二氧基 -2-[(4'-氧乙酰基 -Lys-OMe)苯基] -4，4，5，5-四甲基咪唑啉 (在 Lys连接臂的羧基以保护 基保护；)；
(3) 制备 HCl-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl 、 HCl-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Val-Obzl 或 HCl-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-Obzl;
(4) 制备 Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z);
(5) 将 Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)连接到 1，3-二氧基 -2-[(4'-氧乙酰基 -Lys-OMe)苯基] -4，4，5，5-四甲 基咪唑啉的赖氨酸上得到 1，3-二氧基 -2-{4'-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys} 苯基 }—4，4，5，5-四甲基咪唑啉；
(6) 将 HCl'Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl、 HCl-Arg(N02)-Gly-Asp (OBzl)-Val-Obzl或 HCl'Arg (N02)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-Obzl分别与 1，3-二氧基 -2-{4'-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala- Lys(Z)]-Lys}苯基 }-4，4，5，5-四甲基咪唑啉相缀合分别得到 1，3-二氧基 -2-{4'-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-
Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl}苯基 }-4，4，5，5-四甲基咪 唑啉、 1，3-二氧基 -2-{4'-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]- Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp- (OBzl)-Val-OBzl}苯基 } -4,4,5,5-四甲基-咪唑啉或 1，3-二氧基 -2- {4'-氧乙酰基- {Nra-[Boc-Gly-Arg (1^02)-?1¾- 1 -1^8(2)]-1^8- (1^02)-01 -八8 (0821)-?1½-0821}苯基}- 4，4，5，5-四甲基咪唑啉； (7) 将步骤 (6)所制备的化合物脱去保护基，得到 1，3-二氧基 -2-{4'-氧乙酰基 -{Nra-[Gly-Arg-Pr0-Ala-LyS]- Lys-Arg-Gly-Asp-Ser}苯基 }-4，4，5，5-四甲基咪唑啉、 1，3-二氧基 -2-{4'-氧乙酰基 -{Nra-[Gly-Arg-Pro- Ala-Lys]-Lys-Arg-Gly-Asp-Val}苯基 }-4，4，5，5-四甲基咪唑啉或 1，3-二氧基 -2-{4'-氧乙酰基 -{Nra-[Gly- Arg-Pro-Ala-Lys]-Lys-Arg-Gly-Asp-Phe}苯基 }- 4，4，5，5-四甲基咪唑啉。
在制备通式 1-1-1、 1-1-3、和 1-1-4化合物时， 则是将步骤 (4)中的" Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)" 置换为 "Boc-Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)，，、 "Boc-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)'\ 和" Boc-Pro-Ala-Lys(Z)"来 执行上述的制程步骤。
含 PAK序列的寡肽与含 RGD序列的寡肽可依组合设计的需要， 在适当位置的活性基团上以保护 基保护， 以选择序列的一端 (含可与连接臂接合的活性基团)来和连接臂的活性基团结合。 组合含 PAK 序列的寡肽与含 RGD序列的寡肽的步骤可以交换顺序， 例如， 先与含 RGD序列的寡肽组合， 再与含 PAK序列的寡肽组合。
活性基团包含氨基或羧基等可进行缩合反应的基团。 氨基的保护基可为苄氧羰基（CBz) 、 叔丁氧 羰基（Boc) 、 9-芴甲氧羰基 （Fmoc ) 、 苄基 （Bn)或对甲氧苯基（PMP ) 。 羧基的保护基可为甲基酯 (OMe)、 苄基酯 (OBn)、 苄甲基酯 ( OBzl) 、 叔丁基酯 ( OBUT) 、 或硅基酯 ( OSi(CH3)3 ) 。
以通式 1-2化合物为例， 当制备通式 1-2-1、 1-2-2、 1-2-3或 1-2-4化合物时， 本发明制备方法可为图 5-图 8所示的合成路线。 图 5为制备通式 1-2-1化合物的合成路线图； 图 6为制备通式 1-2-2化合物的合 成路线图； 图 7为制备通式 1-2-3化合物的合成路线图； 图 8为制备通式 1-2-4化合物的合成路线图。 图 5至图 8中， aa3如前所述， 可为 S (Ser)、 V (Val)、 或 F (Phe)。 在合成通式 1-2-1、 1-2-2、 1-2-3或 1-2-4 化合物时， 可先制备 1，3-二氧基 -2-[(4'-氧乙酰基 -Lys-OMe)苯基] -4，4，5，5-四甲基咪唑啉， 然后将含 RGD 序列的寡肽的 C端与 Lys连接臂的氨基先组合；最后将含 PAK序列的寡肽的 N端与去保护后的连接臂 的羧基组合。
在另一实施例中，本发明制备方法的具清除 NO自由基活性的咪唑啉类为 1，3-二氧基 -2-[(4-氧乙酸) 苯基] -4，4，5，5-四甲基咪唑啉； 连接臂为 L-Asp; 具溶血栓活性肽为含 PAK序列 (Pro-Ala-Lys)的寡肽； 血 栓靶向肽为含 RGD序列 (Arg-Gly-Asp)的寡肽； 且其中 1，3-二氧基 -2-[(4-氧乙酸)苯基] -4，4，5，5-四甲基咪 唑啉与 L-Asp连接臂的氨基相连接； 含 PAK序列的寡肽上的氨基与 L-Asp连接臂的一羧基相连接； 且 含 RGD序列的寡肽上的氨基与 L-Asp连接臂的另一羧基相连接 (如前述通式 1-3或 1-4化合物所示)。
以通式 1-3化合物为例， 当制备通式 1-3-1、 1-3-2、 1-3-3或 1-3-4化合物时， 本发明制备方法可为图 9-图 12所示的合成路线。 图 9为制备通式 1-3-1化合物的合成路线图； 图 10为制备通式 1-3-2化合物的 合成路线图；图 11为制备通式 1-3-3化合物的合成路线图；图 12为制备通式 1-3-4化合物的合成路线图。 图 9至图 12中， aa3如前所述， 可为 S (Ser)、 V (Val)、或 F (Phe)。在合成通式 1-3-1、 1-3-2、 1-3-3 M 1-3-4 化合物时， 可先制备 1，3-二氧基 -2-[(4'-氧乙酰基 -Asp-OMe)苯基] -4，4，5，5-四甲基咪唑啉， 然后将含 PAK 序列的寡肽的 N端与 Asp连接臂的一羧基先组合;最后将含 RGD序列的寡肽的 N端与去保护后的 Asp 连接臂的另一羧基组合。
以通式 1-4化合物为例， 当制备通式 1-4-1、 1-4-2、 1-4-3或 1-4-4化合物时， 本发明制备方法可为图 13-图 16所示的合成路线。 图 13为制备通式 1-4-1化合物的合成路线图； 图 14为制备通式 1-4-2化合物 的合成路线图； 图 15为制备通式 1-4-3化合物的合成路线图； 图 16为制备通式 1-4-4化合物的合成路线 图。 图 13至图 16中， aa3如前所述， 可为 S (Ser)、 V (Val)、 或 F (Phe)。 在合成通式 1-4-1、 1-4-2、 1-4-3 或 1-4-4化合物时， 可先制备 1，3-二氧基 -2-[(4'-氧乙酰基 -Asp-OMe)苯基] -4，4，5，5-四甲基咪唑啉， 然后将 含 RGD序列的寡肽的 N端与 Asp连接臂的一羧基先组合； 最后将含 PAK序列的寡肽的 N端与去保护 后的 Asp连接臂的另一羧基组合。
在又一实施例中，本发明制备方法的具清除 NO自由基活性的咪唑啉类为 1，3-二氧基 -2-[(4-氧乙酸) 苯基 ]—4，4，5，5-四甲基咪唑啉； 连接臂为 L-Glu; 具溶血栓活性肽为含 PAK序列 (Pro-Ala-Lys)的寡肽； 且 血栓靶向肽为含 RGD序列 (Arg-Gly-Asp)的寡肽； 且其中 1，3-二氧基 -2-[(4-氧乙酸)苯基] -4，4，5，5-四甲基 咪唑啉与 L-Glu的氨基相连接;含 PAK序列的寡肽上的氨基与 L-Glu连接臂的一羧基相连接;且含 RGD 序列的寡肽上的氨基与 L-Glu连接臂的另一羧基相连接 (如前述通式 1-5或 1-6化合物所示)。
以通式 1-5化合物为例， 当制备通式 1-5-1、 1-5-2、 1-5-3或 1-5-4化合物时， 本发明制备方法可为图 17-图 20所示的合成路线。 图 17为制备通式 1-5-1化合物的合成路线图； 图 18为制备通式 1-5-2化合物 的合成路线图； 图 19为制备通式 1-5-3化合物的合成路线图； 图 20为制备通式 1-5-4化合物的合成路线 图。 图 17至图 20中， aa3如前所述， 可为 S (Ser)、 V (Val)、 或 F (Phe)。 在合成通式 1-5-1、 1-5-2、 1-5-3 或 1-5-4化合物时， 可先制备 1，3-二氧基 -2-[(4'-氧乙酰基 -Glu-OMe)苯基] -4，4，5，5-四甲基咪唑啉， 然后将 含 RGD序列的寡肽的 N端与 Glu连接臂的一羧基先组合； 最后将含 PAK序列的寡肽的 N端与去保护 后的 Glu连接臂的另一羧基组合。
以通式 1-6化合物为例， 当制备通式 1-6-1、 1-6-2、 1-6-3或 1-6-4化合物时， 本发明制备方法可为图 21-图 24所示的合成路线。 图 21为制备通式 1-6-1化合物的合成路线图； 图 22为制备通式 1-6-2化合物 的合成路线图； 图 23为制备通式 1-6-3化合物的合成路线图； 图 24为制备通式 1-6-4化合物的合成路线 图。 图 21至图 24中， aa3如前所述， 可为 S (Ser)、 V (Val)、 或 F (Phe)。 在合成通式 1-6-1、 1-6-2、 1-6-3 或 1-6-4化合物时， 可先制备 1，3-二氧基 -2-[(4'-氧乙酰基 -Glu-OMe)苯基] -4，4，5，5-四甲基咪唑啉， 然后将 含 PAK序列的寡肽的 N端与 Glu连接臂的一羧基先组合； 最后将含 RGD序列的寡肽的 N端与去保护 后的 Glu连接臂的另一羧基组合。
前述制备方法中含 PAK序列的寡肽可为 ARPAK(Ala-Arg-Pro-Ala-Lys)、 GRPAK(Gly-Arg-Pro-Ala- Lys)、 QRPAK(Gln-Arg-Pro-Ala-Lys) RPAK(Arg-Pro-Ala-Lys)或 PAK(Pro-Ala-Lys)； 且含 RGD序列的 寡肽可为 RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser)、 RGDV(Arg-Gly-Asp-Val)或 RGDF(Arg-Gly-Asp-Phe)。
本发明的化合物或药物组合物在大鼠体内 NO清除活性试验中表明，具有较高的清除 NO自由基活 性； 在体内外溶血栓和抗血栓活性试验中表明， 具有优异的溶血栓和抗血栓活性； 在大鼠体内抗中风活 性试验中证明， 可以有效地保护中风大鼠的神经功能， 具有优异的抗中风活性； 在中风大鼠大脑梗死体 积试验中表明， 可以有效地可以降低中风大鼠大脑梗死体积。 附图说明
图 1为本发明化合物一实施例 (通式 1-1-1化合物)的合成路线图；
图 2为本发明化合物一实施例 (通式 1-1-2化合物)的合成路线图；
图 3为本发明化合物一实施例 (通式 1-1-3化合物)的合成路线图；
图 4为本发明化合物一实施例 (通式 1-1-4化合物)的合成路线图；
图 5为本发明化合物一实施例 (通式 1-2-1化合物)的合成路线图；
图 6为本发明化合物一实施例 (通式 1-2-2化合物)的合成路线图；
图 7为本发明化合物一实施例 (通式 1-2-3化合物)的合成路线图；
图 8为本发明化合物一实施例 (通式 1-2-4化合物)的合成路线图；
图 9为本发明化合物一实施例 (通式 1-3-1化合物)的合成路线图；
图 10为本发明化合物一实施例 (通式 1-3-2化合物)的合成路线图；
图 11为本发明化合物一实施例 (通式 1-3-3化合物)的合成路线图；
图 12为本发明化合物一实施例 (通式 1-3-4化合物)的合成路线图；
图 13为本发明化合物一实施例 (通式 1-4-1化合物)的合成路线图；
图 14为本发明化合物一实施例 (通式 1-4-2化合物)的合成路线图；
图 15为本发明化合物一实施例 (通式 1-4-3化合物)的合成路线图；
图 16为本发明化合物一实施例 (通式 1-4-4化合物)的合成路线图；
图 17为本发明化合物一实施例 (通式 1-5-1化合物)的合成路线图；
图 18为本发明化合物一实施例 (通式 1-5-2化合物)的合成路线图；
图 19为本发明化合物一实施例 (通式 1-5-3化合物)的合成路线图；
图 20为本发明化合物一实施例 (通式 1-5-4化合物)的合成路线图；
图 21为本发明化合物一实施例 (通式 1-6-1化合物)的合成路线图；
图 22为本发明化合物一实施例 (通式 1-6-2化合物)的合成路线图；
图 23为本发明化合物一实施例 (通式 1-6-3化合物)的合成路线图；
图 24为本发明化合物一实施例 (通式 1-6-4化合物)的合成路线图；
图 25为本发明化合物 la在 1χ10—6Μ、 1 χ 10—9Μ和 1 χ 10—12Μ水溶液中的纳米结构； 图 26为本发明化合物 lb在 1χ10—6Μ、 1 χ 10"9Μ和 1 χ 10—12Μ水溶液中的纳米结构;
图 27为本发明化合物 Ic在 1χ10—6Μ、 1 10"9M和 1 χ 10—12Μ水溶液中的纳米结构； 图 28为本发明化合物 Id在 1χ10—6Μ、 1 χ 10"9Μ和 1 χ 10—12Μ水溶液中的纳米结构;
图 29为本发明化合物 Ie在 1χ10—6Μ、 1 χ 10"9Μ和 1 χ 10—12Μ水溶液中的纳米结构； 图 30为本发明化合物 If在 1χ10—6Μ、 1 10—9M和 1 10—12M水溶液中的纳米结构； 图 31为本发明化合物 ig在 ixicr6M、 1 icr9M和 1 icr12M水溶液中的纳米结构； 图 32为本发明化合物 Ih在 1 χ 10—6 Μ、 1 10"9 Μ和 1 10—12 Μ水溶液中的纳米结构； 图 33为本发明化合物 Ii在 1 χ 10—6 Μ、 1 10—9 Μ和 1 10—12 Μ水溶液中的纳米结构；
图 34为本发明化合物 Ij在 1 χ 10—6 Μ、 1 10—9 Μ和 1 10—12 Μ水溶液中的纳米结构；
图 35为本发明化合物 Ik在 1 χ 10—6 Μ、 1 10—9 Μ和 1 10—12 Μ水溶液中的纳米结构；
图 36为本发明化合物 II在 1 χ 10—6 Μ、 1 10—9 Μ和 1 10—12 Μ水溶液中的纳米结构；
图 37为本发明化合物 Ie在 0.01 μΜ浓度下的高分辨 FT- MS质谱图；
图 38为本发明化合物 Ie在 0.1 μΜ浓度下的高分辨 FT- MS质谱图；
图 39为本发明化合物 Ie在 1 μΜ浓度下的高分辨 FT- MS质谱图；
图 40为本发明化合物 Ie在 10 μΜ浓度下的高分辨 FT-MS质谱图。 具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些 实施例仅是范例性的， 并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是， 在不偏离本 发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本 发明的保护范围内。
制备具清除 NO自由基活性的咪唑啉类： 1,3-二氧基 -2-ί(4-氧乙酸)苯基 1-4,4,5,5-四甲基咪唑啉
实施例 1 制备 2,3-二甲基 -2,3-二硝基丁垸
69 g (0.78 mol) 2-硝基丙垸加入 130 ml NaOH (6N)水溶液中， 在冰盐浴搅拌下滴加 20 ml (0.38 mol) Br2、 l h 内滴加完， 然后加入 240 mL乙醇， 9CTC回流 3 h， 将反应液乘热倒入 800 ml冰水中， 滤得 55 g (81%)标题化合物， 为无色片状结晶， Mp l lO-112°C。
实施例 2制备 2,3-二甲基 -2,3-二羟胺基丁垸
将 7 g (40 mmol) 2，3-二甲基 -2，3-二硝基丁垸和 4 g N C1混悬于 80 mL乙醇水溶液 (50%) 中， 冰浴下 搅拌， 在 3 h内加入 16 g锌粉。 锌粉加完后， 撤去冰浴， 继续室温搅拌反应 3 h， 然后将反应液抽滤。 滤 饼用乙醇水溶液 (50%)反复洗涤， 合并滤液及洗涤液， 用浓盐酸调节 pH=2， 减压蒸至泥浆状。 加入适量 碳酸钾， 拌匀后， 使用索氏提取器， 氯仿为提取剂， 抽提 6 h， 提取液减压浓缩至少量， 加入石油醚后 析出 2.60 g (44%)标题化合物， 为无色晶体。 Mp l57-159°C。
实施例 3 制备 1,3-二羟基 -2-(4'-羟基苯基) -4,4,5,5-四甲基咪唑垸
1.22 g (10 mmol)对羟基苯甲醛与 1.48g (10 mmol) 2，3-二甲基 -2，3-二羟胺基丁垸溶于 10 mL甲醇中， 室温搅拌 8 h后， TLC显示原料点消失。抽滤得到 1.29 g (51%)标题化合物， 为无色晶体。 EI-MS (m/z) 252 [M]+. ^-NMR (DMSO-ί ί) 5(ppm) = 1.03 (s， 6H)， 1.05 (s， 6H)， 4.39 (s， 1H), 6.70 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 7.23 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 7.63 (s, 1H)， 7.85(s, 2H)。
实施例 4制备 1,3-二羟基 -2-(4'-羟基苯基) -4,4,5,5-四甲基咪唑啉
将 504 mg (2 mmol) 1，3-二羟基 -2-(4'-羟基苯基) -4，4，5，5-四甲基咪唑垸溶解于 30 mL甲醇中， 加入 3 g Pb02， 室温搅拌 40 min， TLC显示原料点消失。 抽滤除去固体， 滤液室温下减压蒸干， 残留物柱层析纯 化 (氯仿洗脱)， 得 260 mg (52%)标题化合物， 为蓝色固体。 Mp 134-135 °C ,EI-MS (m/z) 249 [M]+. IR (KBr) 3250,1610,1500,1490, 840。
实施例 5制备 1,3-二氧基 -2-(4，-氧基乙酸乙酯 -苯基 )-4,4,5,5-四甲基咪唑啉
将 250 mg(l mmol)l，3-二羟基 -2-(4'-羟基苯基) -4，4，5，5-四甲基咪唑啉、 0.32 mL溴代乙酸乙酯及 32 mg 氢化钠溶于 5 mL无水 THF中， 混合物 60°C搅拌 5小时， TLC显示原料点消失。 室温下减压过滤， 滤液减 压浓缩至干， 残留物柱层析 (乙酸乙酯:石油醚 =1 :5)纯化， 得到 300 mg (90%)目标化合物。 Mp 107-109°C。
实施例 6制备 1,3-二氧基 -2-(4，-氧乙酸 -苯基 )-4,4,5,5-四甲基咪唑啉 (TMMZ)
向 33 mg (0.1 mmol) 1，3-二氧基 -2-(4'-氧基乙酸乙酯 -苯基 )-4，4，5，5-四甲基咪唑啉与 3 mL甲醇的溶液 中加 7滴 NaOH(2N)水溶液， 室温搅拌 30 min， TLC显示原料点消失。 将反应液减压浓缩， 残留物先加 2 mL饱和食盐水稀释， 再用 2N HC1调 pH 6， 然后用乙酸乙酯萃取 3次 (3 ml χ 3)， 合并的乙酸乙酯层 用无水硫酸钠干燥， 过滤， 滤液室温下减压浓缩至干， 得 30 mg (99%)标题化合物， 为蓝色晶体。 Mp 155-157°C . EI-MS (m/z) 307岡+。 组合具清除 NO自由基活性的咪唑啉类与连接臂： 1,3-二氧基 -2-ί(4，-氧乙酰基 -Lvs-OMe)苯基 1-4,4,5,5-四 甲基咪唑啉
实施例 7制备 1,3-二氧基 -2-[(4，-氧乙酰 -Nra-Boc-Lys-OMe)苯基] -4,4,5,5-四甲基咪唑啉
将 307 mg(l mmol) 1，3-二氧基 -2-(4'-氧乙酸 -苯基 )-4，4，5，5-四甲基咪唑啉与 30 1111无水71^的溶液在 冰浴下搅拌。 向溶液加 250 mg (1.2 mmol) DCC及 135 mg (1 mmol) HOBt, 冰浴下搅拌 10 min。 向该溶 液加由 300 mg (1 mmol) HCl'Lys(Boc)-Ome、 122 mg (1 mmol)N-甲基吗啉及 6 mL无水 THF配制的溶液。 得到的反应混合物室温反应 24小时。 TLC (乙酸乙酯:石油醚 = 2: l)显示HCl·LyS(BOC)-OMe消失。 反应 混合物减压浓缩至干， 残留物用乙酸乙酯溶解， 滤除不溶物。滤液依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯 化钠水溶液洗。 分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、 过滤、 滤液 37°C减压浓缩 (这些操作在下文中统 称常规处理)， 残留物柱层析纯化 (乙酸乙酯:石油醚 = 2: 1)， 得 433 mg(65%)标题化合物， 为蓝色固体。 ESI-MS(m/z) 550 [M + H]+。
实施例 8制备 1,3-二氧基 -2-[(4，-氧乙酰 -Lys-OMe)苯基] -4,4,5,5-四甲基咪唑啉
将 625 mg (1 mmol) 1，3-二氧基 -2-[(4'-氧乙酰 -Nra-Boc-Lys-OMe)苯基] -4，4，5，5-四甲基咪唑啉溶于 15mL无水氯化氢 -乙酸乙酯液 (4N)， 室温搅拌 3小时， TLC(CHCl3:MeOH， 20: 1)显示原料点消失。 反应 混合物按常规方法处理， 残留物用无水乙醚析晶， 得标题化合物。 制备具溶血栓活性肽： 适当保护的 ARPAK
实施例 9制备 Boc-Ala-Lys(Z)-OBzl
将 473 mg (2.5 mmol)Boc-Ala溶于 10 ml无水 THF。 冰浴下往里加由 338 mg (2.5 mmol) HOBt、 619 mg (3 mmol) DCC及 10 mL无水 THF配制的溶液。 反应混合物冰浴下搅拌 20分钟。 向该溶液中加由 936 mg (2.3 mmol)HCl Lys(Z)-ObzK 232 mg (2.3 mmol)N-甲基吗啉先及 6 mL无水 THF配制的溶液。 得 到的反应混合物室温反应 24小时， TLC (CHCl3:MeOH = 30: 1) 显示 HCl'Lys(Z)-OBzl消失。反应混合 物按常规处理得 1.204 g (97%)标题化合物， 为无色固体。 Mp 88-90°C . [«]^° =-29.2 (c = 0.1, MeOH). ESI-MS(m/z) 565 [M + Na]+。 实施例 10制备 HCl'Ala-Lys(Z)-OBzl
将 1.354 g (2.5 mmol)Boc-Ala-Lys(Z)-OBzl溶于约 10 ml无水氯化氢-乙酸乙酯溶液 (4N)，室温搅拌 3 小时， TLC(CHCl3 :MeOH，30: l)显示原料点消失。 反应混合液在室温下减压浓缩， 残留物再用乙酸乙酯 溶解并室温下浓缩， 如此反复数次， 直至除净游离的氯化氢 (这些操作在下文中统称常规处理)。 残留物 用无水乙醚析晶， 得标题化合物， 直接用于下步反应。
实施例 11 制备 Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将 538 mg (2.5 mmol) Boc-Pro溶于适量无水 THF, 冰浴下加入 338 mg (2.5 mmol)HOBt、 619 mg (3 mmol) DCC的无水 THF溶液， 反应 20分钟。 向该溶液加由 1.099 g (2.3 mmol) HCl Ala-Lys(Z)-ObzK 232 mg(2.3 mmol)N-甲基吗啉及 10 mL无水 THF配制的溶液，室温反应 24小时。 TLC(CHCl3:MeOH， 20: 1) 显示原料点消失。 反应化合物按常规处理， 得 2.847 g (98%)标题化合物。 Mp 82-83°C . [a]2° =-46.4 (c = 0.11, MeOH). ESI-MS(m/z) 661 [M + Na] +。
实施例 12制备 HCl'Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将 1.596 g (2.5 mmol) Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl溶于 15 mL无水氯化氢 -乙酸乙酯液 (4N)， 室温搅拌 3小时， TLCXCHCl3 :MeOH， 20: 1)显示原料点消失。 反应混合物按常规方法处理， 残留物用无水乙醚析 晶， 得标题化合物， 直接用于下步反应。
实施例 13制备 Boc-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
冰浴下将 798 mg(2.5 mmol) Boc-Arg(N02)、338 mg (2.5 mmol) HOBt、619 mg (3 mmol) DCC和 10 mL 无水 THF的溶液搅拌 20分钟。向该溶液中加由 1.322 g (2.3 mmol) HCl Pro-Ala-Lys(Z)-ObzK 232 mg(2.3 mmol)N-甲基吗啉与 5 mL无水 THF配制的溶液， 室温反应 24小时。 TLC(CHCl3:MeOH， 20: 1) 显示原 料点消失。 按常规处理， 得 1.642 g (85%)标题化合物。 Mp 84-85 °C . [«]^° =-65.0 (c = 0.13, MeOH). ESI-MS (m/z) 864 [M + Na] +。
实施例 14制备 HCl' Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将 2.099 g (2.5 mmol) Boc-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl溶于 20 mL无水氯化氢 -乙酸乙酯液 (4N)， 室温搅拌 3小时， TLC(CHCl3:MeOH， 20: 1) 显示原料点消失。 反应混合物按常规方法处理， 残留物用 无水乙醚析晶， 得标题化合物， 直接用于下步反应。
实施例 15制备 Boc-Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
冰浴下将 473 mg(2.5 mmol) Boc-Ala、 338 mg(2.5 mmol)HOBt、 619 mg (3 mmol) DCC和 10 mL无 水 THF的溶液搅拌 20分钟。向该溶液中加由 1.785 g(2.3 mmol)HCl Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzK 232 mg(2.3 mmol)N-甲基吗啉与 5 mL无水 THF配制的溶液， 反应 24小时得 1.802 g (86%)标题化合物。 Mp 87 - 89°C . [a]2° =-63.9 (c = 0.12, MeOH). ESI-MS (m/e) 934 [M + Na] 实施例 16制备 Boc-Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)
将 921 mg(l mmol) Boc-Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl溶于 3 mL甲醇中，冰浴下加入 NaOH水 溶液 (2N)， 室温下搅拌 30 min， 保持 pH 12， 冰浴下搅拌 10 min， TLC显示原料点消失。 用 2N HC1调 pH 7， 将反应液减压浓缩， 残留物加 2 mL饱和食盐水稀释， 用 2N HC1调 pH 2， 用乙酸乙酯萃取 3次 (5 mLx 3), 合并的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥， 室温下减压浓缩得 767 mg (80%)标题化合物， 为无 色固体。 EI-MS (m/z) 830 [M - H]―。 制备血栓靶向 /抗血栓肽： 适当保护的 RGDS、 RGDV、 RGDF
实施例 17制备 Boc-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl
冰浴下将 808 mg(2.5 mmol)Boc-Asp(OBzl)、 338 mg(2.5 mmol)HOBt、 619 mg(3 mmol)DCC和 10 mL 无水 THF的溶液搅拌反应 20分钟。向该溶液加由 740 mg (2.3 mmol)HCl · Ser(Bzl)-Obzl , 232 mg (2.3 mmol) N-甲基吗啉与 5 mL无水 THF配制的溶液， 室温反应 24小时。 TLC(CHCl3:MeOH， 20: 1)显示原料点消 失。 反应化合物按常规处理， 得 1.29 g (95%)标题化合物， 为无色油状物。 ESI-MS(m/z;» 591 [M + H] +。
实施例 18制备 HCl'Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl
将 1.477 g (2.5 mmol) Boc-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl溶于 15 mL无水氯化氢 -乙酸乙酯液 (4N)并室温 搅拌 3小时， TLC(CHCl3 :MeOH，20: l)显示原料点消失。 反应混合物按常规方法处理， 残留物用无水乙 醚析晶， 得标题化合物， 直接用于下步反应。
实施例 19制备 Boc-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl
冰浴下将 438 mg (2.5 mmol)Boc-Gly、 338 mg (2.5 mmol) HOBt、 619 mg (3 mmol) DCC和 10 mL无 水 THF的溶液搅拌 20分钟。向该溶液中加由 1.212 g (2.3 mmol)HCl-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-ObzK 232 mg(2.3 mmol) N-甲基吗啉与 5 mL无水 THF配制的溶液， 室温反应 24小时。 TLC (CHCl3:MeOH， 20: 1) 显示原 料点消失。 反应混合物按常规处理， 得 1.461 g (98%)标题化合物， 为无色固体。 Mp 53 - 55 °C .
Figure imgf000016_0001
= —23.7 (c = 0.13, MeOH). ESI-MS (m/z) 649 [M + H]+。
实施例 20制备 HCl' Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl
将 1.619 g (2.5 mmol) Boc-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl溶于 15 mL无水氯化氢 -乙酸乙酯液 (4N)， 室温搅拌 3小时， TLC (CHCl3 :MeOH， 20: 1) 显示原料点消失。 反应混合物按常规方法处理， 残留物用 无水乙醚析晶， 得标题化合物， 直接用于下步反应。
实施例 21制备 Boc-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl
冰浴下将 798 mg(2.5 mmol) Boc-Arg(N02)、338 mg(2.5 mmol) HOBt、619 mg (3 mmol) DCC及 10 mL 无水 THF的溶液搅拌 20分钟。 向该溶液加由 1.343 g(2.3 mmol) HCl-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-ObzK 232 mg (2.3 mmol) N-甲基吗啉与 5 mL无水 THF配制的溶液， 室温反应 24小时。 TLC(CHCl3:MeOH， 20: 1) 显示原料点消失。 按常规处理， 得标题化合物 1.66 g (85%)， 为无色固体。 Mp 74 - 75 °C .
Figure imgf000016_0002
= -26.2 (c = 0.12, MeOH). ESI-MS(m/z) 872 [M + Na]+。
实施例 22制备 HCl Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl
将 2.122 g (2.5 mmol) Boc-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl与 20 mL氯化氢 -乙酸乙酯液 (4N) 的混合物室温搅拌 3小时， TLC(CHCl3 : MeOH，20: l)显示原料点消失。 反应混合物按常规方法处理， 残 留物用无水乙醚析晶， 得标题化合物。
实施例 23制备 Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl
冰浴下将 808 mg (2.5 mmol) Boc-Asp(OBzl)、 338 mg (2.5 mmol) HOBt、 619 mg (3 mmol) DCC及 10 ml无水 THF的溶液搅拌 20分钟。向该溶液加由 558 mg (2.3 mmol) HCl- Val-OBzK232 mg (2.3 mmol) N- 甲基吗啉与 5 ml无水 THF配制的溶液， 室温反应 24小时。 TLC(CHCl3:MeOH， 20: 1)显示原料点消失。 反应化合物按常规处理， 得 1.129 g (96%)标题化合物， 为无色油状液体。 ESI-MS(m/z) 512 [M + H]+。
实施例 24制备 HCl'Asp(OBzl)-Val-OBzl
将 1.278 g (2.5 mmol) Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl溶于 15 ml无水氯化氢 -乙酸乙酯液 (4N)， 室温搅拌 3 小时， TLC (CHCl3:MeOH， 20: 1) 显示原料点消失。 反应混合物按常规方法处理， 残留物用无水乙醚析 晶， 得标题化合物， 直接用于下步反应。
实施例 25制备 Boc-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl
冰浴下将 438 mg (2.5 mmol)Boc-Gly、 338 mg (2.5 mmol) HOBt、 619 mg (3 mmol) DCC和 10 mL无 水 THF的溶液搅拌 20分钟。向该溶液加由 1.03 g (2.3 mmol) HCl-Asp(OBzl)-Val-ObzK232 mg (2.3 mmol) N-甲基吗啉与 5 mL无水 THF配制的溶液， 室温反应 24小时。 TLC(CHCl3:MeOH， 20: 1)显示原料点消 失。反应化合物按常规处理，得 1.242 g (95%)标题化合物，为无色固体。 Mp 66 - 68 °C. [«]^° =-43.8 (c= 0.11, MeOH). ESI-MS(m/z) 592 [M + Na]+。
实施例 26制备 HCl' Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl
将 1.421 g (2.5 mmol) Boc-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl溶于 15 mL无水氯化氢 -乙酸乙酯液 (4N)， 室温 搅拌 3小时， TLC(CHCl3 :MeOH，20: l)显示原料点消失。 反应混合物按常规方法处理， 残留物用无水乙 醚析晶， 得标题化合物， 直接用于下步反应。
实施例 27制备 Boc-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl
冰浴下将 798 mg (2.5 mmol) Boc-Arg(N02)、 338 mg (2.5 mmol) HOBt、 619 mg (3 mmol) DCC和 10 mL无水 THF的溶液搅拌 20分钟。向该溶液加由 U62 g (2.3 mmol)HCl-Gly-Asp(OBzl)-Val-ObzK232 mg (2.3 mmol)N-甲基吗啉与 5 mL无水 THF配制的溶液， 室温反应 24小时。 TLC (CHCl3:MeOH， 20: 1)显示 原料点消失。反应化合物按常规处理，得 1.523 g (86%)标题化合物，为无色固体。 Mp 107 - 109°C . [«]^° =-38.0 (c= 0.12, MeOH). ESI-MS(m/z) 793 [M + Na]+。
实施例 28制备 HCl'Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl
将 1.925 g (2.5 mmol) Boc-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl溶于 20 mL无水氯化氢 -乙酸乙酯液
(4N), 室温搅拌 3小时， TLC(CHCl3 :MeOH， 20: 1)显示原料点消失。 反应混合物按常规方法处理， 残留 物用无水乙醚析晶， 得标题化合物。
实施例 29制备 Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl
冰浴下将 808 mg (2.5 mmol) Boc-Asp(OBzl)、 338 mg (2.5 mmol) HOBt、 619 mg (3 mmol) DCC和 10 mL无水 THF的溶液搅拌 20分钟。 向该溶液加由 668 mg (2.3 mmol)HCl-Phe-ObzK 232 mg(2.3 mmol)N- 甲基吗啉与 5 mL无水 THF配制的溶液， 室温反应 24小时。 TLC(CHCl3:MeOH， 20: 1)显示原料点消失。 按常规处理， 得标题化合物 1.222 g (95%)， 为无色固体。 Mp 79 - 80'e.
Figure imgf000017_0001
(c = 0.13, MeOH), ESI-MS(m/z) 561 [M + H]+。 实施例 30制备 HCl'Asp(OBzl)-Phe-OBzl
将 1.398 g (2.5 mmol) Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl溶于 15 mL无水氯化氢-乙酸乙酯溶液 (4N)， 室温搅 拌 3小时， TLC (CHCl3 :MeOH 20: l)显示原料点消失。 反应混合物按常规方法处理， 残留物用无水乙醚 析晶， 得标题化合物， 直接用于下步反应。
实施例 31制备 Boc-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl
冰浴下将 438 mg (2.5 mmol)Boc-Gly 338 mg (2.5 ol)HOBt 619 mg (3 mmol) DCC的无水 THF 溶液搅拌 20分钟。 向该溶液加由 1.141 g (2.3 mmol) HCl'Asp(OBzl)-Phe-Obzl 232 mg (2.3 mmol)N-甲 基吗啉与 5 mL无水 THF配制的溶液， 室温反应 24小时。 TLC(CHCl3:MeOH 20: 1)显示原料点消失。 反应混合物按常规处理，得 1.29 g (91%)标题化合物，为无色固体。 Mp 70 - 71 °C .
Figure imgf000018_0001
(c = 0.14, MeOH). ESI-MS(m/z) 640 [M + Na] +
实施例 32制备 HCl' Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl
将 1.541 g (2.5 mmol) Boc-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl溶于 15 mL无水氯化氢 -乙酸乙酯液 (4N)， 室温 搅拌 3小时， TLC (CHCl3:MeOH 20: l)显示原料点消失。 反应混合物按常规方法处理， 残留物用无水乙 醚析晶， 得标题化合物， 直接用于下步反应。
实施例 33制备 Boc-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl
冰浴下将 798 mg (2.5 mmol) Boc-Arg(N02 338 mg (2.5 mmol)HOBt 619 mg (3 mmol) DCC和 10 mL 无水 THF的溶液搅拌 20分钟。 向该溶液加由 1.272 g (2.3 mmol) HCl- Gly-Asp(OBzl)-Phe-Obzl , 232 mg (2.3 mmol)N-甲基吗啉与 5 mL无水 THF配制的溶液， 室温反应 24小时。 TLC(CHCl3:MeOH 20: 1)显示 原料点消失。反应混合物按常规处理，得 1.637g (87%)标题化合物，为无色固体。 Mp 77 - 79 °C . [«]^° = -22.6 (c = 0.09, MeOH). ESI-MS(m/z) 841 [M + Na]+
实施例 34制备 HCl'Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl
将 2.045 g (2.5 mmol) Boc-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl溶于 15 mL无水氯化氢 -乙酸乙酯液 (4N), 室温搅拌 3小时， TLC(CHCl3:MeOH 20: l) 显示原料点消失。 反应混合物按常规方法处理， 残留 物用无水乙醚析晶， 得标题化合物。 制备 ARPAK7咪唑啉 /RGD三元缀合物 (通式 1-1-1化合物)： Ia Ib Ic
实施例 35制备 1,3-二氧基 -2-{4，-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-OMe}苯 基 4,4,5,5-四甲基咪唑啉
冰浴下将 821 mg(l mmol) Boc-Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)^ 135 mg(l mmol)HOBt 250 mg(l mmol) DCC和 10 mL无水 THF的溶液搅拌 20分钟。 向该溶液加由 480 mg(l mmol) 1 3-二氧基 -2-[(4'-氧乙酰 基 -Lys-OMe)苯基] -4 4 5 5-四甲基咪唑啉和 100 mg (1 mmol) N-甲基吗啉与 5 mL无水 THF配制的溶液， 室温反应 24小时。 TLC(CHCl3:MeOH 40: l)显示原料点消失。反应化合物按常规处理， 得 925 mg (83%) 标题化合物， 为蓝色固体。 Mp 179 - 182°C. [af° =-34.3 (c = 0.14, MeOH), ESI-MS(m/z) 1275 [M + Na]+o IR (KBr) 3319, 2935, 1658 1531, 1448 1363, 1254, 1168 1053 835 749 540 cm-1 实施例 36 制备 1,3-二氧基 -2-{4，-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}苯基 4,4,5,5-四甲基咪唑啉
冰浴下将 1260 mg (1 mmol) 1，3-二氧基 -2-{4'-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]- Lys-OMe}苯基 }-4，4，5，5-四甲基咪唑啉溶于 3 mL甲醇中， 加入 NaOH水溶液 (2N)， 室温下搅拌 30 min。 保持 pH 12， 冰浴下搅拌 10 min， TLC显示原料点消失。 用 2N HC1调 pH 7， 将反应液减压浓缩， 残留 物用 2 mL饱和食盐水稀释， 用 2N HC1调 pH 2， 用乙酸乙酯萃取 3次 (5 mLx 3)。 合并的乙酸乙酯层用 无水硫酸钠干燥， 过滤， 滤液室温下减压浓缩， 得 945 mg (82%)标题化合物， 为蓝色固体。 EI-MS ( /z) 1238 [M - H]―。
实施例 37 制备 1,3-二氧基 -2-{4，-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg- (N02)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl}苯基 4,4,5,5-四甲基咪唑啉
冰浴下将 618 mg(0.5 mmol) 1，3-二氧基 -2-{4'-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]- Lys}苯基 }-4，4，5，5-四甲基咪唑啉、 69 mg (0.5 mmol) HOBt、 126 mg (0.6 mmol) DCC和 20 mL无水 THF 的溶液搅拌 20分钟。向该溶液加由 442 mg (0.5 mmol) HCl Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-ObzK 50 mg (0.5 mmol)N-甲基吗啉及 5 mL无水 THF配制的溶液， 室温反应 24小时。 TLC(CHCl3:MeOH， 20: 1)显示 原料点消失。反应混合物按常规处理，得 300 mg (31%)标题化合物，为蓝色固体。 Mp 138 - 140°C . [a]2° =-39.4 (c = 0.13, MeOH). ESI-MS(m/z) 1991 [M + H]+. IR(KBr) 3309, 2936, 1656， 1531, 1449, 1363, 1256, 836, 743, 697, 601 cm-1。
实施例 38 制备 1,3-二氧基 -2-{4，-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg- (N02)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl}苯基 }-4,4,5,5-四甲基咪唑啉
冰浴下将 618 mg(0.5 mmol) 1，3-二氧基 -2-{4'-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-
Lys}苯基 }-4，4，5，5-四甲基咪唑啉、 69 mg (0.5 mmol) HOBt、 126 mg (0.6 mmol) DCC和 20 mL无水 THF 的溶液搅拌 20分钟。向该溶液加由 421 mg (0.5 mmol) HCl Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-ObzK 50 mg (0.5 mmol)N-甲基吗啉及 5 mL无水 THF配制的溶液， 室温反应 24小时。 TLC(CHCl3:MeOH， 20: 1)显示原料 点消失。 反应混合物按常规处理， 得 389 mg (36%)标题化合物， 为蓝色固体。 Mp l l7 - 120°C. [«]^° = —14.8 (c = 0.01, MeOH). ESI-MS(m/z) 1913 [M + H]+。 IR(KBr) 3312, 2937, 1655， 1530, 1448， 1362, 1257, 835, 744， 697, 592 cm"1
实施例 39 制备 1,3-二氧基 -2-{4，-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg- (N02)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl}苯基 }-4,4,5,5-四甲基咪唑啉
冰浴下将 618 mg(0.5 mmol) 1，3-二氧基 -2-{4'-氧乙酰基 -{Nra-[Boc- Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]- Lys}苯基 }-4，4，5，5-四甲基咪唑啉、 69 mg (0.5 mmol) HOBt、 126 mg (0.6 mmol) DCC和 20 ml无水 THF 的溶液搅拌 20分钟。向该溶液加由 445 mg (0.5 mmol) HCl Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzK50 mg (0.5 mmol)N-甲基吗啉及 5 mL无水 THF配制的溶液， 室温反应 24小时。 TLC(CHCl3:MeOH， 20: 1)显示原料 点消失。 反应混合物按常规处理， 得 320 mg (36%)标题化合物， 为蓝色固体。 Mp l l5 - 118°C . [«]^° = -21.5 (c = 0.16, MeOH). ESI-MS(m/z) 1961 [M + H]+。 IR(KBr) 3316, 2936, 1654， 1529, 1448， 1362, 1256, 1169, 742， 698, 593 cm-1。
实施例 40 制备 1,3-二氧基 -2-{4，-氧乙酰基 -[Nra-(Ala-Arg-Pro-Ala-Lys)-Lys-Arg-Gly-Asp-Ser]苯 基 4,4,5,5-四甲基咪唑啉 （la)
冰浴下将 199 mg (0.1 mmol) 1，3-二氧基 -2-{4'-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]- Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl}苯基 }- 4，4，5，5-四甲基咪唑啉与 6 mL三氟乙酸和 1.5 mL三 氟甲磺酸混合， 搅拌 1小时后 TCL(CHCl3 :MeOH， 1 : 1)显示原料点消失。 反应化合物减压浓缩， 残留物 用无水乙醚反复洗涤， 减压浓缩， 残留物用水溶解， 用 25%氨水调 pH 8， 用 Sephadex G10 除盐， 用 C18柱纯化，收集的馏分冻干，得 109 mg (85%)标题化合物，为蓝色固体。 Mp 134 - 135°C . [af° =-39.7
(c = 0.12, MeOH). FT-MS(m/z) 1374.7290 [M + H]+， 2748.4580 [2M + H]+， 4122.1870 [3M + H]+， 5495.9160 [4M + H]+. g = 2.00779. IR(KBr) 3346, 3180, 2920, 1665， 1537, 1449, 1252, 1179, 1030, 837, 801, 720, 639, 518 cm-1。
实施例 41 制备 1,3-二氧基 -2-{4，-氧乙酰基 -[Nra-(Ala-Arg-Pro-Ala-Lys)-Lys-Arg-Gly-Asp-Val]苯 基 4,4,5,5-四甲基咪唑啉 （lb)
冰浴下将 190 mg(0.1 mmol) 1，3-二氧基 -2-{4'-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Ala- Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]- Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl}苯基 }-4，4，5，5-四甲基咪唑啉与 6 mL三氟乙酸和 1.5 mL三氟甲 磺酸混合， 搅拌 1小时后 TCL(CHCl3 :MeOH， 1 : 1)显示原料点消失。 反应化合物减压浓缩， 残留物用无 水乙醚反复洗涤， 减压浓缩， 残留物用水溶解， 用 25%氨水调 pH 8， 用 Sephadex G10 除盐， 用 C18 柱纯化， 收集的馏分冻干， 得 96 mg (82%)标题化合物， 为蓝色固体。 Mp l43 - 144°C. [«]^° =-31.8 (c = 0.01, MeOH). FT-MS(m/z) 1386.7654 [M + H]+， 2772.5308, [2M + H]+， 4158.2962 [3M + H]+， 5544.0616 [4M + H]+. g = 2.00779. IR(KBr) 3349, 2942, 1659, 1539, 1394, 1250, 1030, 639 cm"1。
实施例 42 制备 1,3-二氧基 -2-{4，-氧乙酰基 -[Nra-(Ala-Arg-Pro-Ala-Lys)-Lys-Arg-Gly-Asp-Phe]苯 基 4,4,5,5-四甲基咪唑啉 （Ic)
冰浴下将 194 mg(0.1 mmol) 1，3-二氧基 -2-{4'-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Ala-Arg(N02)-Pro-Ala- Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl}苯基 }- 4，4，5，5-四甲基咪唑啉与 6 mL三氟乙酸和 1.5 mL 三氟甲磺酸混合， 搅拌 1小时后 TCL(CHCl3 :MeOH， 1 : 1)显示原料点消失。 反应化合物减压浓缩， 残留 物用无水乙醚反复洗涤， 减压浓缩， 残留物用水溶解， 用 25%氨水调 pH 8， 用 Sephadex G10 除盐， 用 C18柱纯化， 收集的馏分冻干， 得 106 mg (81%)标题化合物， 为蓝色固体。 Mp 96 - 97°C . [a]2° =-44.4
(c = 0.15, MeOH). FT-MS (m/z) ESI-MS (m/z) 1444.7654 [M + H]+， ESI-MS(m/z) 2888.5308 [2M + H]+， 4332.2962 [3M + H]+， 5776.0616 [4M + H]+. g = 2.00789. IR(KBr) 3363, 1665， 1538, 1448， 1256, 1173, 1031, 640, 577, 518 cm"1 制备具溶血栓活性肽： 适当保护的 GRPAK
实施例 43制备 Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
冰浴下将 438 mg(2.5 mmol) Boc-Gly, 338 mg(2.5 mmol)HOBt、 619 mg (3 mmol) DCC和 10 mL无水 THF的溶液搅拌 20分钟。 向该溶液中加由 1.785 g(2.3 mmol)HCl- Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl, 232 mg(2.3 mmol)N-甲基吗啉与 5 mL无水 THF配制的溶液， 反应 24小时， 得 1.857 g (90%)标题化合物。 Mp 85 - 87 °C . [α]β =-38.5 (c = 0.11, MeOH). ESI-MS (m/e) 920 [M + Na] +。 实施例 44制备 Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)
将 907 mg(l mmol) Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl溶于 3 mL甲醇中，冰浴下加入 NaOH水 溶液 (2N)， 室温下搅拌 30 min， 保持 pH 12， 冰浴下搅拌 10 min， TLC显示原料点消失。 用 2N HC1调 pH 7， 将反应液减压浓缩， 残留物加 2 mL饱和食盐水稀释， 用 2N HC1调 pH 2， 用乙酸乙酯萃取 3次 (5 mL 3), 合并的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥， 室温下减压浓缩得 785 mg (82%)标题化合物， 为无 色固体。 EI-MS (m/z) 816 [M— H]―。 制备 GRPAK7咪唑啉 /RGD三元缀合物 (通式 1-1-2化合物)： Id、 Ie、 If
实施例 45制备 1,3-二氧基 -2-{4，-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-OMe}苯 基 4,4,5,5-四甲基咪唑啉
冰浴下将 817 mg (1 mmol) Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)、 135 mg (1 mmol)HOBt、 250 mg (1 mmol) DCC和 10 mL无水 THF的溶液搅拌 20分钟。 向该溶液加由 480 mg(l mmol) 1，3-二氧基 -2-[(4'- 氧乙酰基 -Lys-OMe)苯基] -4，4，5，5-四甲基咪唑啉和 100 mg (1 mmol) N-甲基吗啉与 5 mL无水 THF配制的 溶液， 室温反应 24小时。 TLC(CHCl3:MeOH， 40: 1)显示原料点消失。反应化合物按常规处理，得 680 mg
(52%)标题化合物， 为蓝色固体。 Mp 79 - 82°C . [af° =-12.3 (c = 0.14, MeOH), ESI-MS(m/z) 1261 [M + Na]+o IR (KBr) 3319, 2935, 1658， 1531, 1448， 1363, 1254, 1168， 1053， 835， 749， 540 cm-1。
实施例 46 制备 1,3-二氧基 -2-{4，-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}苯 基 4,4,5,5-四甲基咪唑啉
冰浴下将 1260 mg (1 mmol) 1，3-二氧基 -2-{4'-氧乙酰基 - {Nra-[Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-
Lys-OMe}苯基 }-4，4，5，5-四甲基咪唑啉溶于 3 mL甲醇中， 加入 NaOH水溶液 (2N)， 室温下搅拌 30 min。 保持 pH 12， 冰浴下搅拌 10 min， TLC显示原料点消失。用 2N HC1调 pH 7， 将反应液减压浓缩， 残留物 用 2 mL饱和食盐水稀释， 用 2N HC1调 pH 2， 用乙酸乙酯萃取 3次 (5 mL x 3)。 合并的乙酸乙酯层用无 水硫酸钠干燥，过滤，滤液室温下减压浓缩，得 945 mg (82%)标题化合物，为蓝色固体。 EI-MS (m/z) 1223 [M - H]―。
实施例 47 制备 1,3-二氧基 -2-{4，-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg- (N02)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl}苯基 4,4,5,5-四甲基咪唑啉
冰浴下将 611 mg(0.5 mmol) 1，3-二氧基 -2- {4'-氧乙酰基 - {Nra-[Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]- Lys}苯基 }-4，4，5，5-四甲基咪唑啉、 69 mg (0.5 mmol) HOBt、 126 mg (0.6 mmol) DCC和 20 mL无水 THF 的溶液搅拌 20分钟。向该溶液加由 442 mg (0.5 mmol) HCl Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-ObzK 50 mg (0.5 mmol)N-甲基吗啉及 5 mL无水 THF配制的溶液， 室温反应 24小时。 TLC(CHCl3:MeOH， 20: 1)显示 原料点消失。反应混合物按常规处理，得 500 mg (48%)标题化合物，为蓝色固体。 Mp 127 - 129°C . [a]2° =—49.4 (c = 0.13, MeOH). ESI-MS(m/z) 1956 [M + H]+. IR(KBr) 3306, 2936, 1652, 1531, 1449, 1362, 1255, 1166, 742， 697, 592 cm-1。 实施例 48 制备 1,3-二氧基 -2-{4，-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg- (N02)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl}苯基 }-4,4,5,5-四甲基咪唑啉
冰浴下将 611 mg(0.5 mmol) 1，3-二氧基 -2-{4'-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]- Lys}苯基 }-4，4，5，5-四甲基咪唑啉、 69 mg (0.5 mmol) HOBt、 126 mg (0.6 mmol) DCC和 20 mL无水 THF 的溶液搅拌 20分钟。向该溶液加由 421 mg (0.5 mmol) HCl Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-ObzK 50 mg (0.5 mmol)N-甲基吗啉及 5 mL无水 THF配制的溶液， 室温反应 24小时。 TLC(CHCl3:MeOH， 20: 1)显示原料 点消失。 反应混合物按常规处理， 得 392 mg (35%)标题化合物， 为蓝色固体。 Mp l47 - 150°C. [«]^° = -34.6 (c = 0.16, MeOH). ESI-MS(m/z) 1899 [M + Na]+。 IR(KBr) 3311, 3068, 2937, 1661， 1531, 1451， 1395, 1254, 1163, 839, 743, 697, 596 cm-1。
实施例 49 制备 1,3-二氧基 -2-{4，-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-
(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl}苯基 }-4,4,5,5-四甲基咪唑啉
冰浴下将 611 mg(0.5 mmol) 1，3-二氧基 -2-{4'-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]- Lys}苯基 }-4，4，5，5-四甲基咪唑啉、 69 mg (0.5 mmol) HOBt、 126 mg (0.6 mmol) DCC和 20 mL无水 THF 的溶液搅拌 20分钟。向该溶液加由 445 mg (0.5 mmol) HCl Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-ObzK 50 mg (0.5 mmol)N-甲基吗啉及 5 mL无水 THF配制的溶液， 室温反应 24小时。 TLC (CHCl3:MeOH， 20: 1)显示原 料点消失。 反应混合物按常规处理， 得 336 mg (31%)标题化合物， 为蓝色固体。 Mp l25 - 128°C . [«]^° = -31.3 (c = 0.18, MeOH). ESI-MS(m/z) 1925 [M + H]+。 IR(KBr) 3315， 2935， 1657， 1529, 1448， 1361, 1257, 1173, 834, 742， 698, 541 cm-1。
实施例 50 制备 1,3-二氧基 -2-{4，-氧乙酰基 -[Nra-(Gly-Arg-Pro-Ala-Lys)- Lys-Arg-Gly-Asp-Ser]苯 基 4,4,5,5-四甲基咪唑啉 （Id)
冰浴下将 195 mg (0.1 mmol) 1，3-二氧基 -2-{4'-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]- Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl}苯基 }-4，4，5，5-四甲基咪唑啉与 6 mL三氟乙酸和 1.5 mL三氟 甲磺酸混合， 搅拌 1小时后 TCL(CHCl3:MeOH， 1 : 1)显示原料点消失。 反应化合物减压浓缩， 残留物用无 水乙醚反复洗涤， 减压浓缩， 残留物用水溶解， 用 25%氨水调 pH 8， 用 Sephadex G10除盐， 用 C18柱纯 化，收集的馏分冻干，得 102 mg (82%)标题化合物，为蓝色固体。 Mp 142 - 145 °C . [ f° =-29.7 (c = 0.14,
MeOH). FT-MS(m/z) 1360.7133 [M + H]+， 2720.4266 [2M + H]+， 4080.1399 [3M + H]+， 5439.8532 [4M + H]+. g = 2.00779. IR(KBr) 3348, 3180, 2940, 1670, 1539, 1447， 1199, 1134, 1034, 836, 801， 721， 638 cm-1。
实施例 51 制备 1,3-二氧基 -2-{4，-氧乙酰基 -[Nra-(Gly-Arg-Pro-Ala-Lys)-Lys-Arg-Gly-Asp-Val]苯 基 4,4,5,5-四甲基咪唑啉 （Ie)
冰浴下将 190 mg(0.1 mmol) 1，3-二氧基 -2-{4'-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-
Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl}苯基 }-4，4，5，5-四甲基咪唑啉与 6 mL三氟乙酸和 1.5 mL三氟甲 磺酸混合， 搅拌 1小时后 TCL(CHCl3 :MeOH， 1 : 1)显示原料点消失。 反应化合物减压浓缩， 残留物用无 水乙醚反复洗涤， 减压浓缩， 残留物用水溶解， 用 25%氨水调 pH 8， 用 Sephadex G10除盐， 用 C 18柱 纯化， 收集的馏分冻干， 得 99 mg (84%)标题化合物， 为蓝色固体。 Mp 147 - 149 °C . [af° =-31.1 (c = 0.17, MeOH). FT-MS(m/z) 1372.7497 [M + H]+， 2744.4994 [2M + H]+， 41 16.2491 [3M + H]+， 5487.9988 [4M + H]+. g = 2.00779. IR(KBr) 3338, 2960, 1662, 1539, 1451， 1392, 1251, 1 170, 1030, 639, 519 cm"1
实施例 52 制备 1,3-二氧基 -2-{4，-氧乙酰基 -[Nra-(Gly-Arg-Pro-Ala-Lys)-Lys-Arg-Gly-Asp-Phe]苯 基 4,4,5,5-四甲基咪唑啉 （If)
冰浴下将 192 mg(0.1 mmol) 1，3-二氧基 -2- {4'-氧乙酰基 - {Nra-[Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-
Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl}苯基 }-4，4，5，5-四甲基咪唑啉与 6 mL三氟乙酸和 1.5 mL三氟甲 磺酸混合， 搅拌 1小时后 TCL(CHCl3 :MeOH， 1 : 1)显示原料点消失。 反应化合物减压浓缩， 残留物用无 水乙醚反复洗涤， 减压浓缩， 残留物用水溶解， 用 25%氨水调 pH 8， 用 Sephadex GlO除盐， 用 C 18柱 纯化，收集的馏分冻干，得 106 mg (81%)标题化合物，为蓝色固体。 Mp 84 - 85 °C . [a]2° =-54.1 (c = 0.15, MeOH). FT-MS (m/z) 1420.7497 [M + H]+， 2840.4994 [2M + H]+， ESI-MS FT-MS(m/z) 1420.7497 [M + H]+， 2840.4994 [2M + H]+， 4260.2491 [3M + H]+， 5679.9976 [4M + H]+. g = 2.00789. IR(KBr) 3344, 3080, 2930, 1666， 1535, 1392, 1250, 1181， 1030, 835, 800, 719, 638 cm-1。 制备具溶血栓活性肽： 适当保护的 RPAK
实施例 53制备 Boc-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)
将 850 mg(l mmol) Boc-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl溶于 3 mL甲醇中， 冰浴下加入 NaOH水溶 液 (2N)， 室温搅拌 30 min， 保持 pH 12， 冰浴搅拌 10 min， TLC显示原料点消失。 用 2N HC1调 pH 7， 将反应液减压浓缩， 残留物加 2 mL饱和食盐水稀释， 用 2N HC1调 pH 2， 用乙酸乙酯萃取 3次 (5 mL x 3), 合并的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥， 过滤， 滤液室温下减压浓缩得 742 mg (92%)标题化合物， 为 无色固体。 EI-MS (m/z) 849 [M - H]一。 制备 RPAK7咪唑啉 /RGD三元缀合物 (通式 1-1-3化合物)： Ig、 Ih、 Ii
实施例 54 制备 1,3-二氧基 -2-{4，-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-OMe}苯 基 4,4,5,5-四甲基咪唑啉
冰浴下将 760 mg (1 mmol) Boc-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)、 135 mg (1 mmol)HOBt、 250 mg (1 mmol) DCC和 10 mL无水 THF的溶液搅拌 20分钟。 向该溶液加由 480 mg(l mmol) 1，3-二氧基 -2-[(4'-氧乙酰 基 -Lys-OMe)苯基] -4，4，5，5-四甲基咪唑啉和 100 mg (1 mmol) N-甲基吗啉与 5 mL无水 THF配制的溶液， 室温反应 24小时。 TLC(CHCl3:MeOH，40: l)显示原料点消失。反应化合物按常规处理， 得 920 mg (83%) 标题化合物， 为蓝色固体。 Mp 72 - 76°C . [af° =-32.7 (c = 0.13, MeOH), ESI-MS(m/z) 1204 [M + Na IR (KBr) 33 17, 2937, 1658， 153 1, 1447， 1362, 1254, 1168， 1055, 835, 746， 697, 541, 460 cm"1
实施例 55制备 1,3-二氧基 -2-{4，-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}苯基 }-4,4,5,5- 四甲基咪唑啉
冰 浴 下 将 1200 mg (1 mmol) 1,3- 二 氧 基 -2-{4'- 氧 乙 酰 基 - {Nra-[Boc-Arg(N02)- Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-OMe}苯基 }-4，4，5，5-四甲基咪唑啉溶于 3 mL甲醇中， 加入 NaOH水溶液 (2N)， 室温 下搅拌 30 min。 保持 pH 12， 冰浴下搅拌 10 min， TLC显示原料点消失。 用 2N HC1调 pH 7， 将反应液 减压浓缩， 残留物用 2 mL饱和食盐水稀释， 用 2N HC1调 pH 2， 用乙酸乙酯萃取 3次 (5 mL x 3)。 合并 的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥， 过滤， 滤液室温下减压浓缩， 得 899 mg (80%)标题化合物， 为蓝色固 体。 EI-MS (m/z) 1116 [M - H]―。
实施例 56 制备 1,3-二氧基 -2-{4，-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)- Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl}苯基 4,4,5,5-四甲基咪唑啉
冰浴下将 583 mg(0.5 mmol) 1，3-二氧基 -2- {4'-氧乙酰基 - {Nra-[Boc-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}苯 基}—4，4，5，5-四甲基咪唑啉、 69 mg (0.5 mmol) HOBt、 126 mg (0.6 mmol) DCC和 20 mL无水 THF的溶液 搅拌 20分钟。 向该溶液加由 442 mg (0.5 mmol) HCl Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-ObzK 50 mg (0.5 mmol)N-甲基吗啉及 5 mL无水 THF配制的溶液， 室温反应 24小时。 TLC(CHCl3:MeOH， 20: 1)显示原料 点消失。反应混合物按常规处理，得 421 mg (40%)标题化合物，为蓝色固体。 Mp 77 - 79 °C . [a]D 2° = -45.4 (c = 0.15, MeOH). ESI-MS(m/z) 1897 [M + H]+. IR(KBr) 3319, 2934, 1658， 1530, 1449, 1361, 1256, 834, 74 L 698, 542 cm-1。
实施例 57 制备 1,3-二氧基 -2-{4，-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)- Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl}苯基 4,4,5,5-四甲基咪唑啉
冰浴下将 583 mg (0.5 mmol) 1，3-二氧基 -2-{4'-氧乙酰基 -{Nra-[Boc- Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}苯 基}—4，4，5，5-四甲基咪唑啉、 69 mg (0.5 mmol) HOBt、 126 mg (0.6 mmol) DCC和 20 mL无水 THF的溶液 搅拌 20分钟。 向该溶液加由 421 mg (0.5 mmol) HCl Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Val-ObzK 50 mg (0.5 mmol)N-甲基吗啉及 5 mL无水 THF配制的溶液， 室温反应 24小时。 TLC(CHC13: MeOH, 20: 1)显示原 料点消失。 反应混合物按常规处理， 得 472 mg (42%)标题化合物， 为蓝色固体。 Mp l07 - 109°C . [a]2° =-28.8 (c = 0.11, MeOH). ESI-MS(m/z) 1820 [M + H]+。 IR(KBr) 3314， 2938， 1658， 1531, 1448， 1362, 1258， 742， 698， 594 cm-1。
实施例 58 制备 1,3-二氧基 -2-{4，-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)- Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl}苯基 4,4,5,5-四甲基咪唑啉
冰浴下将 583 mg(0.5 mmol) 1，3-二氧基 -2- {4'-氧乙酰基 -{Nra-[Boc- Arg(N02)- Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}苯 基}—4，4，5，5-四甲基咪唑啉、 69 mg (0.5 mmol) HOBt、 126 mg (0.6 mmol) DCC和 20 mL无水 THF的溶液 搅拌 20分钟。 向该溶液加由 445 mg (0.5 mmol) HCl'Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-Obzl、 50 mg (0.5 mmol)N-甲基吗啉及 5 mL无水 THF配制的溶液， 室温反应 24小时。 TLC(CHCl3:MeOH， 20: 1)显示原料 点消失。 反应混合物按常规处理， 得 420 mg (47%)标题化合物， 为蓝色固体。 Mp 141 - 144°C . [a]2° = -35.7 (c = 0.12, MeOH). ESI-MS(m/z) 1867 [M + H]+。 IR(KBr) 3319, 2936, 1656， 1529, 1448， 1362, 1257, 1169, 834, 743, 698, 541 cm-1。
实施例 59 制备 1,3-二氧基 -2-{4，-氧乙酰基 -[Nra-(Arg-Pro-Ala-Lys)-Lys-Arg-Gly-Asp-Ser]苯 基 4,4,5,5-四甲基咪唑啉 （Ig)
冰浴下将 170 mg (0.1 mmol) 1，3-二氧基 -2-{4'-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys- Arg-(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl}苯基 }-4，4，5，5-四甲基咪唑啉与 6 mL三氟乙酸和 l mL三氟甲 磺酸混合， 搅拌 1小时后 TCL(CHCl3 :MeOH， 1 : 1)显示原料点消失。 反应化合物减压浓缩， 残留物用无 水乙醚反复洗涤， 减压浓缩， 残留物用水溶解， 用 25%氨水调 pH 8， 用 Sephadex GlO除盐， 用 C 18柱 纯化， 收集的馏分冻干， 得 102 mg (82%)标题化合物， 为蓝色固体。 Mp 148 - 15CTC . [af° =-22.4 (c = 0.14, MeOH). FT-MS(m/z) 1303.6919 [M + H]+， 2606.3838, [2M + H]+， 3909.0757 [3M + H]+， 521 1.7676 [4M + H]+. g = 2.00779. IR(KBr) 3344, 3080, 2930, 1666， 1535, 1392, 1250, 1181， 1030, 835, 800, 719, 638。
实施例 60 制备 1,3-二氧基 -2-{4，-氧乙酰基 -[Nra-(Arg-Pro-Ala-Lys)-Lys-Arg-Gly-Asp-Val]苯 基 4,4,5,5-四甲基咪唑啉 （Ih)
冰浴下将 182 mg(0.1 mmol) 1，3-二氧基 -2-{4'-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys- Arg-(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl}苯基 }-4，4，5，5-四甲基咪唑啉与 6 mL三氟乙酸和 1.5 mL三氟甲磺酸混 合， 搅拌 1小时后 TCL(CHCl3 :MeOH， 1 : 1)显示原料点消失。 反应化合物减压浓缩， 残留物用无水乙醚反 复洗涤， 减压浓缩， 残留物用水溶解， 用 25%氨水调 pH 8， 用 Sephadex G10除盐， 用 C 18柱纯化， 收集 的馏分冻干， 得 99 mg (84%)标题化合物， 为蓝色固体。 Mp 137 - 139°C . [a]2° =-34.3 (c = 0.18, MeOH). FT-MS(m/z) ESI-MS(m/z) 1315.7282 [M + H]+， 2630.4564 [2M + H]+， 3945.1846 [3M + H]+， 5259.9128 [4M + H]+. g = 2.00779. IR(KBr) 3329, 2953, 1665， 1533, 1391, 1198, 1134, 834, 801, 720, 599 cm"1
实施例 61 制备 1,3-二氧基 -2-{4，-氧乙酰基 -[Nra-(Arg-Pro-Ala-Lys)-Lys-Arg-Gly-Asp-Phe]苯 基 4,4,5,5-四甲基咪唑啉 （Ii)
冰浴下将 187 mg(0.1 mmol) 1，3-二氧基 -2-{4'-氧乙酰基 - {Nra-[Boc-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys- Arg-(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl}苯基 }-4，4，5，5-四甲基咪唑啉与 6 mL三氟乙酸和 1.5 mL三氟甲磺酸 混合， 搅拌 1小时后 TCL(CHCl3:MeOH， 1 : 1)显示原料点消失。 反应化合物减压浓缩， 残留物用无水乙 醚反复洗涤， 减压浓缩， 残留物用水溶解， 用 25%氨水调 pH 8， 用 Sephadex GlO除盐， 用 C 18柱纯化， 收集的馏分冻干， 得 96 mg (81%)标题化合物， 为蓝色固体。 Mp 99 - 100°C . [ f° =-24.7 (c = 0.14, MeOH). FT-MS (m/z) 1363.7282 [M + H]+， 2726.4564 [2M + H]+， 4089.1846 [3M + H]+， 5451.9128 [4M + H]+. g = 2.00789. IR(KBr) 3322, 3060, 2928, 1661， 1530, 1391, 1303, 1247, 641 cm-1。 制备具溶血栓活性肽： 适当保护的 PAK
实施例 62制备 Boc-Pro-Ala-Lys(Z)
将 638 mg (1 mmol) Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl溶于 3 mL甲醇中，冰浴下加入 NaOH水溶液 (2N)，室 温下搅拌 30 min。 保持 pH 12、 冰浴下搅拌 10 min。 TLC显示原料点消失， 用 2N HC1调 pH 7。 将反应 液减压浓缩，残留物用 2 mL饱和食盐水溶液稀释，用 2N HC1调 pH 2，用乙酸乙酯萃取 3次 （5 ml x 3), 合并的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥， 过滤， 滤液室温下减压浓缩， 得 509 mg (91.6%)标题化合物， 为 无色固体。 EI-MS (m/z) 547 [M - H]一。 制备 PAK7咪唑啉 /RGD三元缀合物 (通式 1-1-4化合物)： I Ik、 II
实施例 63 制备 1,3-二氧基 -2-{4，-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-OMe}苯基 }-4,4,5,5-四甲 基咪唑啉
冰浴下将 548 mg (1 mmol) Boc-Pro-Ala-Lys(Z)、 135 mg (1 mmol)HOBt、 250 mg (1 mmol) DCC和 10 mL无水 THF 的溶液搅拌 20 分钟。 向该溶液加由 480 mg(l mmol) 1，3-二氧基 -2-[(4'-氧乙酰基 -Lys-OMe)苯基] -4，4，5，5-四甲基咪唑啉和 100 mg (1 mmol) N-甲基吗啉与 5 mL无水 THF配制的溶液，室 温反应 24小时。 TLC(CHCl3:MeOH， 40: 1)显示原料点消失。 反应化合物按常规处理， 得 876 mg (87%) 标题化合物， 为蓝色固体。 Mp 77 - 80 °C . [a]2° =- 12.6(c = 0.16, MeOH). ESI-MS(m/z) 1003 [M + Na]+。 IR (KBr): 33 15, 3069, 2937, 1671， 153 1, 1449, 1394, 1364, 1302, 1 167， 1132, 1054, 836, 743, 698, 596, 541， 458 cm-1。
实施例 64制备 1,3-二氧基 -2-{4，-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}苯基 4,4,5,5-四甲基咪 唑啉
冰浴下将 980 mg (1 mmol) 1，3-二氧基 -2-{4'-氧乙酰基 - {Nra-[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-OMe}苯 基}-4，4，5，5-四甲基咪唑啉溶于 3 mL甲醇中， 加入 NaOH水溶液 (2N)， 室温下搅拌 30 min。 保持 pH 12、 冰浴下搅拌 10 min， TLC显示原料点消失。 用 2N HC1调 pH 7， 将反应液减压浓缩， 残留物用 2 mL饱 和食盐水稀释， 用 2N HC1调 pH 2， 用乙酸乙酯萃取 3次 (5 mL 3)。 合并的乙酸乙酯层用无水硫酸钠 干燥，过滤，滤液室温下减压浓缩，得 867 mg (80%)标题化合物，为蓝色固体。 EI-MS (m/z) 965 [M - H]_。
实施例 65 制备 1,3-二氧基 -2-{4，-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)- Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl}苯基 4,4,5,5-四甲基咪唑啉
冰浴下将 483 mg(0.5 mmol) 1，3-二氧基 -2- {4'-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Pro- Ala-Lys(Z)]-Lys}苯基 }-4，4，5，5- 四甲基咪唑啉、 69 mg (0.5 mmol) HOBt、 126 mg (0.6 mmol) DCC和 20 mL无水 THF的溶液搅拌 20分 钟。 向该溶液加由 442 mg (0.5 mmol) HCl Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-ObzK 50 mg (0.5 mmol)N- 甲基吗啉及 5 mL无水 THF配制的溶液， 室温反应 24小时。 TLC(CHCl3:MeOH， 20: 1)显示原料点消失。 反应混合物按常规处理， 得 421 mg (42%)标题化合物， 为蓝色固体。 Mp 97 - 100°C . [af° =-42.5 (c = 0.14, MeOH). ESI-MS(m/z) 1697 [M + H]+. IR(KBr) 3298, 3070, 2935, 2869, 1642, 1534, 1450, 1369, 1253, 741， 697, 596 cm-1。
实施例 66 制备 1,3-二氧基 -2-{4，-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)- Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl}苯基 4,4,5,5-四甲基咪唑啉
冰浴下将 483 mg(0.5 mmol) 1,3-二氧基 -2- {4'-氧乙酰基 - {Nra-[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}苯 基}—4，4，5，5-四甲基咪唑啉、 69 mg (0.5 mmol) HOBt、 126 mg (0.6 mmol) DCC和 20 mL无水 THF的溶液 搅拌 20分钟。 向该溶液加由 432 mg (0.5 mmol) HCl Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Val-ObzK 50 mg (0.5 mmol)N-甲基吗啉及 5 mL无水 THF配制的溶液， 室温反应 24小时。 TLC(CHCl3:MeOH， 20: 1)显示原料 点消失。 反应混合物按常规处理， 得 357 mg (37%)标题化合物， 为蓝色固体。 Mp l l7 - 120°C . [a]2° = -22.3 (c = 0.17, MeOH). ESI-MS(m/z) 1620 [M + H]+。 IR(KBr) 3303, 3072, 2935, 1644， 1533, 1451， 1394, 1364, 1255, 1 167， 745， 697, 597 cm"1。
实施例 67 制备 1,3-二氧基 -2-{4，-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)- Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl}苯基 4,4,5,5-四甲基咪唑啉
冰浴下将 483 mg(0.5 mmol) 1,3-二氧基 -2- {4'-氧乙酰基 - {Nra-[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}苯 基}—4，4，5，5-四甲基咪唑啉、 69 mg (0.5 mmol) HOBt、 126 mg (0.6 mmol) DCC和 20 mL无水 THF的溶液 搅拌 20分钟。 向该溶液加由 439 mg (0.5 mmol) HCl'Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-Obzl、 50 mg (0.5 mmol)N-甲基吗啉及 5 mL无水 THF配制的溶液， 室温反应 24小时。 TLC(CHCl3:MeOH， 20: 1)显示原料 点消失。 反应混合物按常规处理， 得 472 mg (48%)标题化合物， 为蓝色固体。 Mp 111 - 114°C.
Figure imgf000027_0001
= -15.3 (c = 0.13, MeOH). ESI-MS(m/z) 1667 [M + H]+。 IR(KBr) 3296, 3071, 2935, 1641， 1534, 1394, 1253, 1170， 834， 745， 697， 594 cm-1。
实施例 68制备 1,3-二氧基 -2-{4，-氧乙酰基 -[Nra-(Pro-Ala-Lys)-Lys-Arg-Gly-Asp-Ser]苯基 }-4,4,5,5- 四甲基咪唑啉 （Ij)
冰浴下将 169 mg (0.1 mmol) 1，3-二氧基 -2-{4'-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)- Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl}苯基 }-4，4，5，5-四甲基咪唑啉与 6 mL三氟乙酸和 1.5 mL三氟甲磺酸混合，搅 拌 1小时后 TCL(CHCl3 :MeOH， 1 : 1)显示原料点消失。反应化合物减压浓缩，残留物用无水乙醚反复洗涤， 减压浓缩， 残留物用水溶解， 用 25%氨水调 pH 8， 用 Sephadex G10除盐， 用 C18柱纯化， 收集的馏分冻 干， 得 98 mg (80%)标题化合物， 为蓝色固体。 Mp 127 - 128 °C . [af° =-22 A (c = 0.13, MeOH). FT-MS(m/z) 1147.5907 [M + H]+， 2294.1814 [2M + H]+， 3440.7721 [3M + H]+， 4587.3628 [4M + H]+. g = 2.00779. IR(KBr) 3204, 1672, 1543, 1436,1199, 1133, 837, 801, 722, 598 cm-1。
实施例 69制备 1,3-二氧基 -2-{4，-氧乙酰基 -[Nra-(Pro-Ala-Lys)-Lys-Arg-Gly-Asp-Val]苯基 4,4,5,5- 四甲基咪唑啉 （Ik)
冰浴下将 162 mg(0.1 mmol) 1，3-二氧基 -2-{4'-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)- Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl}苯基 }-4，4，5，5-四甲基咪唑啉与 6 mL三氟乙酸和 1.5 mL三氟甲磺酸混合， 搅拌 1 小时后 TCL(CHCl3 :MeOH， 1 : 1)显示原料点消失。 反应化合物减压浓缩， 残留物用无水乙醚反复洗涤， 减压浓缩， 残留物用水溶解， 用 25%氨水调 pH 8， 用 Sephadex G10除盐， 用 C18柱纯化， 收集的馏分冻 干， 得 96 mg (81%)标题化合物， 为蓝色固体。 Mp 123 - 124 °C . [af° =-24.6 (c = 0.13, MeOH). FT-MS(m/z) 1159.6271 [M + H]+， 2318.2542 [2M + H]+， 3476.8813 [3M + H]+， 4635.5084 [4M + H]+. g = 2.00779. IR(KBr) 3388, 2959, 1666， 1540, 1494, 1198, 1134, 835, 801, 720, 598 cm 。
实施例 70制备 1,3-二氧基 -2-{4，-氧乙酰基 -[Nra-(Pro-Ala-Lys)-Lys-Arg-Gly-Asp-Phe]苯基 4,4,5,5- 四甲基咪唑啉 （II)
冰浴下将 169 mg(0.1 mmol) 1，3-二氧基 -2-{4'-氧乙酰基 -{Nra-[Boc-Pro-Ala- Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)- Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl}苯基 }-4，4，5，5-四甲基咪唑啉与 6 mL三氟乙酸和 1.5 mL三氟甲磺酸混合，搅拌 1小时后 TCL(CHCl3 :MeOH， 1 : 1)显示原料点消失。 反应化合物减压浓缩， 残留物用无水乙醚反复洗涤， 减压浓缩， 残留物用水溶解， 用 25%氨水调 pH 8， 用 Sephadex G10除盐， 用 C18柱纯化， 收集的馏分 冻干，得 96 mg (81%)标题化合物，为蓝色固体。 Mp 153 - 154°C . [a]2° =-12.6 (c = 0.16, MeOH). FT-MS (m/z) 1207.6271 [M + H]+， 2414.2542 [2M + H]+， 3620.8813 [3M + H]+， 4827.5084 [4M + H]+. g = 2.00789. IR(KBr) 3385, 2938, 1659, 1541， 1450, 1391, 1251, 1126, 963, 841， 599, 456 cm-1。 试验例 1 本发明化合物 la至 II的 NO自由基清除试验
体重 250-300g雄性 Wistar大鼠， 术前禁食 12小时， 自由饮水， 颈椎脱位致死， 迅速开胸摘取胸主 动脉， 剥离附着的结缔组织， 将血管剪成 3-5 mm 长的动脉环置于灌流浴槽内。 浴槽盛有 15 mlKrebs-Henseleit液， 37°C恒温， 通 95%02-5%C02气体， 固定动脉环的挂钩连接张力换能器， 在二道 记录仪上描记血管舒缩曲线，纸速为 1 mm/min。调整静止张力为 1.0g，平衡 30 min后给予终浓度为 10_8 M去甲肾上腺素使动脉收缩以起预激作用。洗去去甲肾上腺素，平衡 30 min，浴槽加终浓度为 10_8 M去 甲肾上腺素， 待收缩张力持续稳定于平台水平后， 浴槽加 20 μΐ生理盐水 (空白)或加 20 μΐ化合物 Ia-Il 之一的生理盐水溶液 (终浓度为 5x l0_6 M)， 或加 20 μΐ NO 自由基清除剂 (1，3-二氧基 -2-(4'-氧乙酸-苯 基) -4，4，5，5-四甲基咪唑啉， TMMZ)的生理盐水溶液 (终浓度为 5x lO_6 M)， 待平稳后， 加入 20 μΐ 乙酰胆 碱的生理盐水溶液 （终浓度为 10_6 Μ 药物清除 NO的能力以抑制乙酰胆碱舒张血管条的百分比来表 示。 试验结果见表 1。
试验结果表明， 通过清除 NO， Ia-Il可抑制乙酰胆碱的血管条舒张作用。 可见， 通过 Lys将溶栓肽
ARPAK、 GRPAK、 RPAK或 PAK和靶向肽 RGDS、 RGDV或 RGDF连接到自由基清除齐 U( 1，3-二氧基 -2-(4'- 氧乙酸 -苯基 )-4，4，5，5-四甲基咪唑啉， TMMZ)上， 有 9个化合物抑制乙酰胆碱舒张血管条的活性明显比 TMMZ强， 有 2个化合物抑制乙酰胆碱舒张血管条的活性与 TMMZ没有差异， 有 1个化合物抑制乙酰 胆碱舒张血管条的活性明显比 TMMZ弱。 在评价的 12种化合物中， 抑制率超过 30%有 4个化合物。 这 4个化合物抑制乙酰胆碱舒张血管条的活性顺序是 Ie > Ih > lb > If。 这就意味着通过 Lys将溶栓肽 ARPAK、 GRPAK、 RPAK或 PAK和靶向肽 RGDS、 RGDV或 RGDF连接到自由基清除剂 TMMZ上， 整体上改善了 TMMZ基清除 NO自由基的活性。
表 1 Ia-Il对乙酰胆碱舒张血管条的百分抑制率
Figure imgf000028_0001
n=6; a) 与 TMMZ比 p<0.01 ; b) 与 TMMZ比 p > 0.05 ; c) 与 TMMZ比 p<0.05。 试验例 2本发明化合物 la至 II的溶解优球蛋白试验
取猪血与 3.8%枸櫞酸钠溶液按 9: 1的体积比混合， 立即以 3000 r/min速度离心 10 min, 分离出贫 血小板血浆。 向 50 mL的离心管加 2 mL贫血小板的猪血浆和 36 mL超纯水。每管加 0.4 mL乙酸 (1%)， 充分混合， 放入 4°C冰箱冷冻 10 min， 以 3000 r/min速度离心 10 min。 倒置离心管， 待液体流干后用滤 纸吸干管内壁。 将离心所得的优球蛋白沉淀冷冻干燥约 40 min， 刮出。 取约 35 mg优球蛋白溶于 7 mL 硼砂缓冲液 (pH 9.28)。 1小时后优球蛋白基本溶解， 加入 0.7 mL CaCl2溶液 (25 mM)， 立刻将其平铺于 10 10 cm的玻璃板上， 厚约 1 mm。 凝固后， 用移液枪将 10 μL生理盐水或 10 μL化合物 Ia-Il之一的 生理盐水溶液（1 mM)或 10 尿激酶的生理盐水溶液（0.8 mg/mL) 滴加到凝固平板上， 每两点之间 的间隔大于 1.5 cm, 每个样品点 3次。 4小时后量取溶圈的直径， 读数列入表 2。
试验结果表明，通过 Lys将溶栓肽 ARPAK、GRPAK、RPAK或 PAK和靶向肽 RGDS、RGDV或 RGDF 连接到自由基清除剂 TMMZ上， 所有化合物显示明确的优球蛋白溶解活性。
表 2 Ia-Il作用 4 h的优球蛋白溶解直径
Figure imgf000029_0001
n=3 ; a) 与 Ia-1 tt p < 0.01。 试验例 3 本发明化合物 la至 II的体外溶栓试验
SD大鼠 (雄性， 350 - 400 g) 按 1200 mg/kg剂量腹腔注射乌拉坦溶液进行麻醉。 麻醉大鼠仰卧位固 定， 分离右颈总动脉， 于近心端夹动脉夹， 近心端和远心端分别穿入手术线， 将远心端的手术线于皮毛 用止血钳夹紧， 在远心端插管， 松开动脉夹， 放出全部动脉血， 装在 50 ml事先硅油化的容器中。 往垂 直固定的玻璃管 (长 20 mm， 内径 4 mm， 外径 5 mm， 管底用胶塞密封） 中注入 0.8 ml大鼠动脉血液， 往管内迅速插入一支不锈钢质料的血栓固定螺栓。 该血栓固定螺旋用直径为 0.2 mm的不锈钢丝绕成， 螺旋部分长 18 mm， 含 15个螺圈， 螺圈的直径为 1.8 mm， 托柄与螺旋相连， 长 7.0 mm， 呈问号型。 血液凝固 40 min后， 打开玻璃管底部的胶塞， 用镊子固定血栓固定螺旋的托柄， 从玻璃管中小心地取 出被血栓包裹的血栓固定螺旋。 将其悬浮浸泡于三蒸水中， 以除去表面的浮血。 l h后取出， 精确称重。 将血栓悬浮浸泡在 8 mL生理盐水中或化合物 Ia-Il之一的生理盐水溶液 （浓度为 100 nM) 中或 ARPAK、 或 GRPAK、或 RPAK、或 PAK的生理盐水溶液 (浓度为 100 nM) 中或尿激酶的生理盐水溶液 (100 IU/mL) 中， 于 37°C恒温摇床中振摇 （63 r/min)， 2 h后取出， 精确称量栓重。 求出血栓在给药前后的质量差，结 果列入表 3。
试验结果表明， 通过 Lys将溶栓肽 ARPAK、 GRPAK, RPAK或 PAK和靶向肽 RGDS、 RGDV或
RGDF 连接到自由基清除剂 TMMZ上， 所有化合物显示明确的体外溶栓活性。 由于 Ia-Ic 的活性与 ARPAK的活性相当， Id-If的活性与 GRPAK的活性相当， Ig-Ii的活性与 RPAK的活性相当， Ij-Il的活 性与 PAK的活性相当， 所以一方面 Ia-Il的体外溶栓活性应当归咎于溶栓肽的活性， 另一方面通过 Lys 将溶栓肽 ARPAK：、 GRPAK, RPAK或 PAK和靶向肽 RGDS、 RGDV或 RGDF连接到自由基清除剂 TMMZ 上不会降低对应的溶栓肽的活性。 Ia-Il作用 2h的体外溶栓活性
Figure imgf000030_0001
n=6; a) 与 Ia-Il tt p < 0.01。 试验例 4本发明化合物 la至 II的体内溶栓试验
SD大鼠 (雄性， 220-230 g) 按 1200 mg/kg剂量腹腔注射乌拉坦溶液进行麻醉。麻醉大鼠仰卧位固定， 分离右颈总动脉， 于近心端夹动脉夹， 近心端和远心端分别穿入手术线， 将远心端的手术线于皮毛用止 血钳夹紧， 在远心端插管， 松开动脉夹，放出约 lml动脉血， 装在 lml子弹头中。往垂直固定的玻璃管 (长 15 mm, 内径 2.5 mm， 外径 5.0 mm， 管底用胶塞密封） 中注入 0. 1 ml大鼠动脉血液， 往管内迅速插入一 支不锈钢质料的血栓固定螺栓。 该血栓固定螺旋用直径为 0.2 mm的不锈钢丝绕成， 螺旋部分长 12 mm, 含 15 个螺圈， 螺圈的直径为 1.0 mm， 托柄与螺旋相连， 长 7. 0 mm， 呈问号型。 血液凝固 15 min后， 打开玻璃管底部的胶塞，用镊子固定血栓固定螺旋的托柄，从玻璃管中小心地取出被血栓包裹的血栓固 定螺旋， 精确称重。
旁路插管由 3 段构成。 中段为聚乙烯胶管， 长 60. 0 mm, 内径 3. 5 mm。 两端为相同的聚乙烯管， 管长 100.0 mm， 内径 1.0 mm, 外径 2.0 mm该管的一端拉成尖管以便插入大鼠颈动脉或静脉， 外径为 1.0 mm, 另一端的外部套一段长 7.0 mm, 外径为 3.5 mm 的聚乙烯管 (加粗， 用于插入中段的聚乙烯胶管内) 3段管的内壁均硅垸化 (1%的硅油乙醚溶液)。 将血栓包裹的血栓固定螺旋放入中段聚乙烯胶管内， 胶管 的两端分别与两根聚乙烯的加粗端相套。用注射器通过尖管端将管中注满肝素生理盐水溶液 (50 IU/kg)， 备用。 继续分离麻醉大鼠的气管， 并做气管插管。 分离大鼠的左颈外静脉， 近心端和远心端分别穿入手 术线，在暴露的左颈外静脉上小心地剪一斜口，将上面制备好的旁路管道的尖管由斜口插入左颈外静脉 开口的近心端， 同时远离旁路管中段 (含精确称重的血栓固定螺旋)内血栓固定螺旋的托柄。 用注射器通 过另一端的尖管推入准确量的肝素生理盐水 (50 IU/kg), 此时注射器不要撤离聚乙烯管， 用止血钳夹住 注射器与聚乙烯管之间的软管。在右颈总动脉的近心端用动脉夹止血，在离动脉夹不远处将右颈总动脉 小心地剪一斜口。从聚乙烯管的尖部拔出注射器， 将聚乙烯管的尖部插入动脉斜口的近心端。旁路管道 的两端都用 4号手术缝线与动静脉固定。 用头皮针将生理盐水 (3 mL/kg), 或尿激酶的生理盐水溶液 (剂量为 20000 IU/kg)或化合物 Ia-Il之一 的生理盐水溶液 (剂量为 0.1 μπιοΐ/kg)或 ARPAK、 或 GRPAK、 或 RPAK，或 PAK的生理盐水溶液 (剂量为 1 μπιοΐ/kg)通过旁路管的中段 (含精确称重的血栓固定螺旋)， 刺入远离血栓固定螺旋的近静脉处， 打开动 脉夹， 使血流通过旁路管道从动脉流向静脉， 此即大鼠动静脉旁路溶栓模型， 缓慢将注射器中的液体注 入到血液中，使生理盐水 (空白对照)， 尿激酶 (阳性对照)或或 ARPAK、或 GRPAK、或 RPAK、或 PAK (组 分对照）或 Ia-Il通过血液循环， 按静脉-心脏-动脉的顺序作用到血栓上。 从开始注射时计时， 1 h后从 旁路管道中取出血栓固定螺旋， 精确称重。求每只大鼠旁路管道中血栓固定螺旋给药前后的质量差， 试 验结果见表 4。
试验结果表明，通过 Lys将溶栓肽 ARPAK、GRPAK、RPAK或 PAK和靶向肽 RGDS、RGDV或 RGDF 连接到自由基清除剂 TMMZ上得到的化合物 Ia-Ic在 0.1 μπιοΐ/kg剂量下不仅都有确切的溶栓活性， 而 且活性强度与对应的溶栓肽 ARPAK、 GRPAK、 RPAK或 PAK在 1 μπιοΐ/kg剂量下的溶栓活性强度相当。 可见， 通过 Lys将溶栓肽 ARPAK、 GRPAK、 RPAK或 PAK和靶向肽 RGDS、 RGDV或 RGDF连接到 自由基清除剂 TMMZ上可使有效剂量降低 10倍。
表 4 Ia-Il的体内溶栓活性
Figure imgf000031_0001
n= 10; a) 与 Ia-Il tt p < 0.01。 试验例 5本发明化合物 la至 II的体内抗栓试验
将 SD大鼠 (雄性， 220-230 g) 随机分组， 每组 11只， 静息词养一天， 停止喂养过夜。 大鼠经灌胃 给予生理盐水 (剂量为 3 mL/kg), 或化合物 Ia-Il之一的生理盐水溶液 (剂量为 0.1 μπιοΐ/kg), 或靶向肽 RGDS、 RGDV或 RGDF的生理盐水溶液 (剂量为 10 mol/kg), 或阿司匹林 (剂量为 33 mg/kg)。 30分钟 后， 大鼠用 20%乌来糖溶液麻醉后分离右颈动脉和左颈静脉。 将插管充满肝素钠的生理盐水溶液后， 一端插入左侧静脉， 另一端用注射器加入定量肝素钠抗凝后， 然后插入右侧动脉。血流从右侧动脉流经 聚乙烯管流入左侧静脉， 15 分钟后取出附有血栓的丝线并记录重量， 总重量减去丝线重量即为血栓湿 重。 试验结果见表 5。 试验结果表明， 通过 Lys将溶栓肽 ARPAK、 GRPAK, RPAK或 PAK和靶向肽 RGDS、 RGDV或 RGDF连接到自由基清除剂 TMMZ上得到的化合物 Ia-Ic在 0.1 μπιοΐ/kg口服剂量下不仅都有确切的抗 栓活性， 而且活性强度与对应的靶向肽 RGDS、 RGDV或 RGDF在 10 μπιοΐ/kg剂量下的抗栓活性强度 相当。 可见， 通过 Lys将溶栓肽 ARPAK、 GRPAK, RPAK或 PAK和靶向肽 RGDS、 RGDV或 RGDF 连接到自由基清除剂 TMMZ上可使有效剂量降低 100倍。
表 5 Ia-Il的体内抗栓活性
Figure imgf000032_0001
n=l l ; a)与 Ia-Il tt p < 0.01。 建立评价本发明化合物对中风患者的确切疗效的动物模型
(1) 这里描述的大鼠实验方案符合日内瓦动物试验指南并经学校伦理委员会认可。 体重为 280-305 g的 清洁级健康雄性 SD 大鼠， 购自维通利华实验动物中心。 这些大鼠随机用于制备血栓或制造中风 模型。
(2) SD大鼠腹腔注射 10%水合氯醛溶液， 剂量为 400 mg/kg体重， 使麻醉。 分离颈动脉， 取新鲜动脉 血 15 mL, 按每 10 μL为一份置于 1.5 mL的 EP管里， 形成的血栓先室温放置 2小时， 再 -2CTC冰 箱中放置 22小时。 使用时加 0.5 mL生理盐水， 用玻璃棒捣碎， 制成大小均匀的血栓块的生理盐 水悬浮液， 每个血栓块的体积大约为 0.1 mm3。
(3) SD大鼠腹腔注射 10%水合氯醛溶液， 剂量为 400 mg/kg体重， 使麻醉。 分离颈动脉， 取新鲜动脉 血 15 mL, 按每 10 μL为一份置于 1.5 mL的 EP管里， 形成的血栓先室温放置 24小时。 使用时加 0.5 mL生理盐水， 用玻璃棒捣碎， 制成大小均匀的血栓块的生理盐水悬浮液， 每个血栓块的体积 大约为 0.1 mm3。
(4) 雄性 SD大鼠腹腔注射 10%水合氯醛溶液，剂量为 400 mg/kg体重，使麻醉。于颈部正中纵行切口， 分离出右侧颈总动脉主干 (约 3 cm长)。 于舌骨水平分离结扎颈外动脉各分支， 于颈膨大处分离出 颈内动脉。 用无创动脉夹分别夹闭颈内动脉开口处和颈总动脉近心端， 并结扎颈外动脉远端。 于 颈外动脉主干处插入装有 0.5 mL血栓块生理盐水悬浮液的导管， 在松开颈内动脉夹的同时， 将导 管内的 0.5 mL血栓块生理盐水悬浮液缓慢从颈外动脉向近心端经过颈内动脉注入大脑中动脉。之 后， 结扎颈外动脉近心端， 打开颈内动脉和颈总动脉处的动脉夹， 恢复血流， 分离大颈外静脉， 把生理盐水 (空白对照)或者本发明化合物的生理盐水溶液从颈外静脉输入。缝合伤口， 并肌肉注射 2万 IU的青霉素， 预防感染。 这是中风立即治疗模型。
(5) 雄性 SD大鼠腹腔注射 10%水合氯醛溶液，剂量为 400 mg/kg体重，使麻醉。于颈部正中纵行切口， 分离出右侧颈总动脉主干 (约 3 cm长)。 于舌骨水平分离结扎颈外动脉各分支， 于颈膨大处分离出 颈内动脉。 用无创动脉夹分别夹闭颈内动脉开口处和颈总动脉近心端， 并结扎颈外动脉远端。 于 颈外动脉主干处插入装有 0.5 mL血栓块生理盐水悬浮液的导管， 在松开颈内动脉夹的同时， 将导 管内的 0.5 mL血栓块生理盐水悬浮液缓慢从颈外动脉向近心端经过颈内动脉注入大脑中动脉。之 后， 结扎颈外动脉近心端， 打开颈内动脉和颈总动脉处的动脉夹， 恢复血流， 缝合伤口。 并肌肉 注射 2万 IU的青霉素， 预防感染。 4小时、 6小时或者 24小时之后把生理盐水 (空白对照)或者本 发明化合物的生理盐水溶液从尾静脉输入。 这是中风 4小时、 6小时和 24小时大鼠的治疗模型。 建立评价本发明化合物对中风 4小时、 6小时和 24小时的确切疗效的动物模型
(1) 大鼠中风立即接受本发明化合物治疗、 大鼠中风 4 小时之后接受本发明化合物治疗、 大鼠中风 6 小时之后接受本发明化合物治疗的疗效是指， 大鼠大鼠苏醒 24小时后观察行为。 行为包括行走方 式、 右眼眼皮下垂程度、 尾巴僵直程度、 肌肉张力、 脑袋偏斜程度、 四肢支撑力和死亡状况。
(2) 大鼠中风 24小时之后接受本发明化合物治疗的疗效是指，治疗 24小时后观察大鼠行为。行为包括 行走方式、 右眼眼皮下垂程度、 尾巴僵直程度、 肌肉张力、 脑袋偏斜程度、 四肢支撑力和死亡状 况。
(3) 一次性接受本发明化合物治疗的中风大鼠的疗效与一次性接受生理盐水治疗的中风大鼠进行比较。 (4) 连续接受治疗的中风大鼠每隔 24小时从尾静脉输入本发明化合物的生理盐水一次， 于翌日录像， 自身进行比较。 本发明化合物 la至 II在上述动物模型的试验结果如下：
试验例 6大鼠中风后立即接受本发明化合物 la至 II治疗的试验
本发明化合物的体内抗中风活性用神经功能评分表示，评分越低活性越强。 SD雄性大鼠 (250-300 g) 用 10%水合氯醛 (400 mg/kg)腹腔注射麻醉， 从颈部正中略偏右部竖直开约 2 cm长切口， 沿胸锁乳突肌 内侧缘分离出右颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。用无创动脉夹分别夹闭颈内动脉开口处和颈总动脉近 心端， 在颈外动脉剪一小口， 结扎颈外动脉远心端， 松开颈总动脉近心端的动脉夹， 取 ΙΟ μΙ血， 取血 之后再用无创动脉夹夹闭颈总动脉近心端。 将取得的 10 μΐ血装入 1 mL EP管中， 先在常温下放置 30 分钟使血液凝固， 然后转移至 -20°C冰箱中放置 1小时， 使血凝块结实。 1小时后取出血液凝块， 加入 1 mL生理盐水用钢铲把血液凝块捣成比较均一的细小血栓， 然后把细小血栓混悬液转移至 1 mL注射器 内备用。 松开大鼠颈内动脉夹的同时， 将 l mL注射器内的血栓混悬液缓慢从大鼠颈外动脉向近心端经 过颈内动脉注入大鼠的大脑， 然后结扎颈外动脉近心端， 打开颈内动脉和颈总动脉处得动脉夹， 恢复血 流。 分离大鼠颈总静脉， 或立即结扎静脉， 伤口处滴加 3滴青霉素， 缝合伤口， 等待动物苏醒， 为假手 术组， 或注入尿激酶的生理盐水溶液（阳性对照组， 剂量为 20000 IU/kg)， 或注入生理盐水 （空白对照 组， 剂量为 3 ml/kg)， 或注入 TMMZ的生理盐水溶液 （组分对照组， 剂量为 1 mol/kg), 或注入溶栓肽 ARPAK, GRPAK, RPAK或 PAK 的生理盐水溶液 （组分对照，剂量为 1 μπιο1 /]¾)，或注入化合物 Ia-Il 之一的生理盐水溶液 (剂量为 0.1 μπιοΐ/kg)。大鼠苏醒 24小时后按 Zeakmga方法评定神经功能缺损程度。 0分表示无任何神经功能缺失体征， 1分表示未损伤侧前肢不能伸展， 2分表示向未损伤侧行走， 3分表 示向未损伤侧转圈成追尾状行走， 4分表示意识障碍无自主行走， 5分表示死亡。 试验结果见表 6。
试验结果表明， 通过 Lys将溶栓肽 ARPAK、 GRPAK, RPAK或 PAK和靶向肽 RGDS、 RGDV或 RGDF连接到自由基清除剂 TMMZ上得到的化合物 Ia-Ic在 0.1 μπιοΐ/kg剂量下都有确切的抗中风活性。 而在 20000 IU/kg剂量下尿激酶没有显示确切的抗中风活性。同样，在 1 μπιοΐ/kg剂量下溶栓肽 ARPAK、 GRPAK, RPAK或 PAK也没有显示确切的抗中风活性。 可见， 通过 Lys将溶栓肽 ARPAK：、 GRPAK、 RPAK或 PAK和靶向肽 RGDS、 RGDV或 RGDF连接到自由基清除剂 TMMZ上可使化合物具有抗中 风作用。 其中在 1 μπιοΐ/kg剂量下有 4种化合物的抗中风活性与 20000 IU/kg剂量下的尿激酶的抗中风 活性相当， 有 8种化合物的抗中风活性明显强于 20000 IU/kg剂量下的尿激酶的抗中风活性。
表 6 Ia-Ic的体内抗中风活性
Figure imgf000034_0001
n= 10; a) 与生理盐水比 p > 0.05 ; b) 与尿激酶比 p > 0.05， 与生理盐水比 p< 0.01 ;
c) 与生理盐水及尿激酶比 < 0.01。
试验例 7大鼠中风后立即接受本发明化合物 la至 II治疗的脑梗死体积试验
试验例 6的大鼠苏醒 24小时评定神经功能缺损程度后， 用乌拉坦麻醉后迅速断头取脑， 将脑组织 置于 -20°C冰箱 2小时后， 从前额极开始行约 2 mm冠状连续切片， 共 6片， 然后置于 2%TTC溶液中 37°C避光孵育 30 min， 并观察脑切片的颜色变化， 正常脑组织被 TTC染成红色， 而缺血脑组织即梗死 脑组织呈白色。 然后用数码相机照相， 经 SPSS统计软件处理， 计算冠状切片中梗死脑组织体积和正常 脑组织体积。 试验结果见表 7。
试验结果表明， 通过 Lys将溶栓肽 ARPAK、 GRPAK, RPAK或 PAK和靶向肽 RGDS、 RGDV或 RGDF连接到自由基清除剂 TMMZ上得到的化合物 Ia-Ic在 0.1 μπιοΐ/kg剂量下不仅都可有效地减小中 风大鼠的脑梗死体积， 而且这种作用明显强于在 20000 IU/kg剂量下尿激酶的作用。 表 7 Ia-Ic治疗的中风大鼠的脑梗死体积
Figure imgf000035_0001
n = 10； a) 与生理盐水相比 > 0.05 ; b) 与生理盐水及 Ia-Il比 ρθ.01。 试验例 8 大鼠中风后立即接受不同剂量本发明化合物 Ie治疗的试验
为了说明化合物 la至 II在上述试验中体现的治疗作用具有剂量依赖关系， 本发明在分析、 比较和 综合所有试验结果的基础上选择化合物 Ie作代表， 进行量效关系试验。 应当强调的是， 因为在试验例 1-7中 la至 II的其它化合物与 Ie达到类似的 NO自由基清除、 溶解优球蛋白、 溶血栓、 抗血栓以及治 疗中风大鼠等效果， 所以 la至 II的其它化合物应与 Ie—样可以获得剂量依赖的治疗作用。
SD雄性大鼠 (250-300 g)用 10%水合氯醛 (400 mg/kg)腹腔注射麻醉， 从颈部正中略偏右部竖直开约 2 cm长切口， 沿胸锁乳突肌内侧缘分离出右颈总动脉、 颈外动脉和颈内动脉。 用无创动脉夹分别夹闭 颈内动脉开口处和颈总动脉近心端， 在颈外动脉剪一小口， 结扎颈外动脉远心端， 松开颈总动脉近心端 的动脉夹， 取 ΙΟ μΙ血， 取血之后再用无创动脉夹夹闭颈总动脉近心端。将取得的 ΙΟ μΙ血装入 l mL EP 管中， 先在常温下放置 30分钟使血液凝固， 然后转移至 -20°C冰箱中放置 1小时， 使血凝块结实。 1小 时后取出血液凝块， 加入 l mL生理盐水用钢铲把血液凝块捣成比较均一的细小血栓， 然后把细小血栓 混悬液转移至 1 mL注射器内备用。 松开大鼠颈内动脉夹的同时， 将 1 mL注射器内的血栓混悬液缓慢 从大鼠颈外动脉向近心端经过颈内动脉注入大鼠的大脑，然后结扎颈外动脉近心端，打开颈内动脉和颈 总动脉处得动脉夹， 恢复血流， 注入尿激酶的生理盐水溶液（阳性对照组， 剂量为 20000 IU/kg), 或注 入 tPA的生理盐水溶液 （阳性对照组，剂量为 3 mg/kg),或注入生理盐水 （空白对照组，剂量为 3 mL/kg), 或注入化合物 Ie的生理盐水溶液 (剂量为 1 μπιο1/]¾、 0.1 μπιοΐ/kg, 0.1 μπιοΐ/kg；)。 大鼠苏醒 24小时后按 Zealonga方法评定神经功能缺损程度。 0分表示无任何神经功能缺失体征， 1分表示未损伤侧前肢不能 伸展， 2分表示向未损伤侧行走， 3分表示向未损伤侧转圈成追尾状行走， 4分表示意识障碍无自主行 走， 5分表示死亡。 试验结果见表 8。 结果表明， 大鼠中风之后立即接受 1 nmol/kg、 0.1 μηπιοΐ/kg和 0.01 μηπιοΐ/kg化合物 Ie治疗， 神经功能评分为 0的大鼠的百分数分别为 60%、 30%和 0%; 神经功能 评分为 1的大鼠的百分数分别为 20%、 30%和 10%。 可见， 化合物 Ie的抗中风活性显示剂量依赖性。 此外， 与 20000 IU/kg尿激酶和 3 mg/kg tPA治疗的中风大鼠的神经功能评分为 0的大鼠的百分数分别 为 10%和 40%以及神经功能评分为 1的大鼠的百分数分别为 50%和 10%相比， 1 μηπιοΐ/kg和 0.1 μηπιοΐ/kg 化合物 Ie的疗效明显优秀。
表 8 不同剂量下本发明化合物 Ie的体内抗中风活性
Figure imgf000036_0001
n = 10 a) 与生理盐水比 p< 0.01 试验例 9 大鼠中风 4小时后接受 1 μιηοΐ/kg本发明化合物 Ie连续治疗 6次的试验
疗效用神经功能评分表示， 评分越低疗效越好。 雄性 SD大鼠腹腔注射 10%水合氯醛溶液， 剂量为 400 mg/kg体重， 使麻醉。 于颈部正中纵行切口， 分离出右侧颈总动脉主干 (约 3 cm长)。 于舌骨水平分离 结扎颈外动脉各分支， 于颈膨大处分离出颈内动脉。 用无创动脉夹分别夹闭颈内动脉开口处和颈总动脉 近心端， 并结扎颈外动脉远端。 于颈外动脉主干处插入装有 0.5 mL血栓块生理盐水悬浮液的导管， 在松 开颈内动脉夹的同时， 将导管内的 0.5 mL血栓块生理盐水悬浮液缓慢从颈外动脉向近心端经过颈内动脉 注入大脑中动脉。 之后， 结扎颈外动脉近心端， 打开颈内动脉和颈总动脉处的动脉夹， 恢复血流， 缝合 伤口。 并肌肉注射 2万 IU的青霉素， 预防感染。 4小时之后把化合物 Ie (剂量为 l mol/kg, n = l l)的生 理盐水溶液、 或尿激酶 (剂量为 20000 IU/kg n = 6)的生理盐水溶液、 或 tPA (剂量为 3 mg/kg n = 6)的生 理盐水溶液从尾静脉输入。每天从大鼠尾静脉输 1次化合物 Ie的生理盐水溶液， 连续输 6天， 观察 1天， 每天自身对照， 按 Zealonga方法评定神经功能缺损程度。 或每天从大鼠尾静脉输 1次尿激酶的生理盐水 溶液， 连续输 2天， 每天自身对照， 按 Zealonga方法评定神经功能缺损程度。 或每天从大鼠尾静脉输 1 次 tPA的生理盐水溶液， 连续输 2天， 每天自身对照， 按 Zealonga方法评定神经功能缺损程度。 0分表 示无任何神经功能缺失体征， 1分表示未损伤侧前肢不能伸展， 2分表示向未损伤侧行走， 3分表示向未 损伤侧转圈成追尾状行走， 4分表示意识障碍无自主行走， 5分表示死亡。试验结果见表 9-1 9-2和 9-3 表 9-1的数据说明， 大鼠中风 4小时之后每天接受 1次剂量为 Ιμπιοΐ/kg的化合物 Ie治疗，连续治疗 6 次， 除 1只于第二天意外死亡， 其余 10只大鼠有 8只好转为无任何神经功能缺失体征， 有两只残留轻 微的神经功能缺失体征。 可见， 在 Ι μπιοΐ/kg剂量下， 化合物 Ie对超出黄金期的中风有确切的治疗作用。
表 9-1 大鼠中风 4小时后接受 1 μπιοΐ/kg本发明化合物 Ie治疗的疗效 每天利 3经功能评分 （Mean ± SD)及得分的大鼠数目
评分时间
0分 1 分 2分 3分 4分 5分 第一天 1只 4只 4只 1只 1只 0只 第二天 3只 5只 1只 1只 0只 1只 第三天 5只 5只 0只 0只 0只 0只 第四天 7只 3只 0只 0只 0只 0只 第五天 8只 z口 0只 0只 0只 0只 第六天 8只 z口 0只 0只 0只 0只 第七天 8只 z口 0只 0只 0只 0只 表 9-2的数据说明， 大鼠中风 4小时之后每天接受 1次剂量为 20000 IU/kg的尿激酶治疗， 6只大 鼠有 2只于 48小时内死亡。 对死亡大鼠进行了尸体解剖， 发现它们的脏器都有出血现象， 尤其是肺出 血严重。 于是， 在给药 2次之后终止给药。 2次给药没有大鼠好转为无任何神经功能缺失体征或残留轻 微的神经功能缺失体征。
表 9-2 大鼠中风 4小时后接受 20000 IU/kg尿激酶治疗的疗效
Figure imgf000037_0001
表 9-3的数据说明， 大鼠中风 4小时之后每天接受 1次剂量为 3mg/kg的 tPA治疗， 6只大鼠有 1 只于 24小时内死亡。对死亡大鼠进行了尸体解剖， 发现它们的脏器都有出血现象， 尤其是肺出血严重。 于是， 在给药 2次之后终止给药。 2次给药没有大鼠好转为无任何神经功能缺失体征， 有 2只好转为残 留轻微的神经功能缺失体征。
表 9-3 大鼠中风 4小时后接受 3 mg/kg tPA治疗的疗效
Figure imgf000037_0002
综合表 9-1、9-2和 9-3的数据可以看出，对于中风 4小时的大鼠即使连续治疗两天，剂量为 1 μπιοΐ/kg 的化合物 Ie也明显比剂量为 20000 IU/kg的尿激酶和剂量为 3mg/kg的 tPA优秀。
试验例 10大鼠中风 6小时后接受 1 μιηοΐ/kg本发明化合物 Ie连续治疗 6次的试验
疗效用神经功能评分表示， 评分越低疗效越好。 雄性 SD大鼠腹腔注射 10%水合氯醛溶液， 剂量为 400 mg/kg体重， 使麻醉。 于颈部正中纵行切口， 分离出右侧颈总动脉主干 (约 3 cm长)。 于舌骨水平分离 结扎颈外动脉各分支， 于颈膨大处分离出颈内动脉。 用无创动脉夹分别夹闭颈内动脉开口处和颈总动脉 近心端， 并结扎颈外动脉远端。 于颈外动脉主干处插入装有 0.5 mL血栓块生理盐水悬浮液的导管， 在松 开颈内动脉夹的同时， 将导管内的 0.5 mL血栓块生理盐水悬浮液缓慢从颈外动脉向近心端经过颈内动脉 注入大脑中动脉。 之后， 结扎颈外动脉近心端， 打开颈内动脉和颈总动脉处的动脉夹， 恢复血流， 缝合 伤口。 并肌肉注射 2万 IU的青霉素， 预防感染。 6小时之后把化合物 Ie (剂量为 1 mol/kg, n=l l)的生理 盐水溶液、 或尿激酶 (剂量为 20000 IU/kg， n = 6)的生理盐水溶液， 或 tPA (剂量为 3 mg/kg， n = 6)的生理 盐水溶液从尾静脉输入。 每天从大鼠尾静脉输 1次化合物 Ie的生理盐水溶液， 连续输 6天， 观察 1天， 每天自身对照， 按 Zealonga方法评定神经功能缺损程度。 或每天从大鼠尾静脉输 1次尿激酶的生理盐水 溶液， 连续输 2天， 每天自身对照， 按 Zealonga方法评定神经功能缺损程度。 或每天从大鼠尾静脉输 1 次 tPA的生理盐水溶液， 连续输 2天， 每天自身对照， 按 Zealonga方法评定神经功能缺损程度。 0分表 示无任何神经功能缺失体征， 1分表示未损伤侧前肢不能伸展， 2分表示向未损伤侧行走， 3分表示向未 损伤侧转圈成追尾状行走， 4分表示意识障碍无自主行走， 5分表示死亡。试验结果见表 10-1、 10-2和 10-3。
表 10-1的数据说明，大鼠中风 6小时之后每天接受 1次剂量为 1 μπιοΐ/kg的化合物 Ie治疗，连续治 疗 6 次， 除 2只于第二天意外死亡， 其余 9只大鼠有 2只好转为无任何神经功能缺失体征， 有 1只残 留轻微的神经功能缺失体征，有 6只残留未损伤侧转圈成追尾状行走体征。可见，在 1 μπιοΐ/kg剂量下， 化合物 Ie对超出黄金期的中风确实有治疗作用。
表 10-1 大鼠中风 6小时后接受 1 μπιοΐ/kg本发明化合物 Ie治疗的疗效
Figure imgf000038_0001
表 10-2的数据说明， 大鼠中风 6小时之后每天接受 1次剂量为 20000 IU/kg的尿激酶治疗， 6只大 鼠有 4只于 24小时内死亡。 对死亡大鼠进行了尸体解剖， 发现它们的脏器都有出血现象， 尤其是肺出 血严重。 于是， 在给药 2次之后终止给药。 2次给药有 1只大鼠好转为无任何神经功能缺失体征， 有 1 只大鼠残留意识障碍无自主行走体征。
表 10-2 大鼠中风 6小时后接受 20000 IU/kg尿激酶治疗的疗效
Figure imgf000038_0002
表 10-3的数据说明， 大鼠中风 6小时之后每天接受 1次剂量为 3mg/kg的 tPA治疗， 6只大鼠有 2 只于 24小时内死亡。 对死亡大鼠进行了尸体解剖， 发现它们的脏器都有出血现象， 尤其是肺出血严重。 于是， 在给药 2次之后终止给药。 2次给药没有大鼠好转为无任何神经功能缺失体征， 有 2只残留轻微的 神经功能缺失体征，有 1只残留未损伤侧转圈成追尾状行走体征，有 1只残留意识障碍无自主行走体征。
表 10-3 大鼠中风 6小时后接受 3 mg/kg tPA治疗的疗效
Figure imgf000038_0003
综合表 10-1 10-2和 10-3 的数据可以看出， 对于中风 6小时的大鼠即使连续治疗两天， 剂量为 Ιμπιοΐ/kg的化合物 Ie也明显比剂量为 20000 IU/kg的尿激酶和剂量为 3mg/kg的 tPA优秀。 试验例 11 大鼠中风 6小时后首次 5 μιηοΐ/kg之后 5次 2 μιηοΐ/kg本发明化合物 Ie治疗的试验 疗效用神经功能评分表示， 评分越低疗效越好。雄性 SD大鼠腹腔注射 10%水合氯醛溶液， 剂量为 400 mg/kg体重， 使麻醉。 于颈部正中纵行切口， 分离出右侧颈总动脉主干 (约 3 cm长)。 于舌骨水平分 离结扎颈外动脉各分支，于颈膨大处分离出颈内动脉。用无创动脉夹分别夹闭颈内动脉开口处和颈总动 脉近心端， 并结扎颈外动脉远端。 于颈外动脉主干处插入装有 0.5 mL血栓块生理盐水悬浮液的导管， 在松开颈内动脉夹的同时， 将导管内的 0.5 mL血栓块生理盐水悬浮液缓慢从颈外动脉向近心端经过颈 内动脉注入大脑中动脉。之后，结扎颈外动脉近心端，打开颈内动脉和颈总动脉处的动脉夹，恢复血流， 缝合伤口。 并肌肉注射 2万 IU的青霉素， 预防感染。 6小时之后把化合物 Ie (首次剂量为 5 mol/kg, n=12)的生理盐水溶液从尾静脉输入。 之后， 每天从大鼠尾静脉输 1次化合物 Ie的生理盐水溶液 (剂量 为 2 mol/kg， n=12), 连续输 6天， 观察 7天，每天自身对照， 按 Zeakmga方法评定神经功能缺损程度。 0分表示无任何神经功能缺失体征， 1分表示未损伤侧前肢不能伸展， 2分表示向未损伤侧行走， 3分表 示向未损伤侧转圈成追尾状行走， 4分表示意识障碍无自主行走， 5分表示死亡。 试验结果见表 11。
表 11的数据说明， 大鼠中风 6小时之后第一天接受 1次剂量为 5 μπιοΐ/kg的化合物 Ie治疗， 之后 5天每天接受 1次剂量为 2 μπιοΐ/kg的化合物 Ie治疗可以获得确切疗效。除 2只死亡外，接受治疗的 12 只大鼠中余下的 10只大鼠有 6只好转为好转为无任何神经功能缺失体征， 有 2只残留轻微的神经功能 缺失体征， 有 1只残留向未损伤侧行走体征， 有 1只残留未损伤侧转圈成追尾状行走体征。 可见， 化合 物 Ie连续治疗对于对超出黄金期的中风确实有效。
表 11 大鼠中风 6小时后接受本发明化合物 Ie治疗的疗效
Figure imgf000039_0001
试验例 12大鼠中风 24小时后首次 5 μιηοΐ/kg之后 5次 2 μιηοΐ/kg本发明化合物 Ie治疗的试验 疗效用神经功能评分表示， 评分越低疗效越好。雄性 SD大鼠腹腔注射 10%水合氯醛溶液， 剂量为 400 mg/kg体重， 使麻醉。 于颈部正中纵行切口， 分离出右侧颈总动脉主干 (约 3 cm长)。 于舌骨水平分 离结扎颈外动脉各分支，于颈膨大处分离出颈内动脉。用无创动脉夹分别夹闭颈内动脉开口处和颈总动 脉近心端， 并结扎颈外动脉远端。 于颈外动脉主干处插入装有 0.5 mL血栓块生理盐水悬浮液的导管， 在松开颈内动脉夹的同时， 将导管内的 0.5 mL血栓块生理盐水悬浮液缓慢从颈外动脉向近心端经过颈 内动脉注入大脑中动脉。之后，结扎颈外动脉近心端，打开颈内动脉和颈总动脉处的动脉夹，恢复血流， 缝合伤口。 并肌肉注射 2万 IU的青霉素， 预防感染。 24小时之后把化合物 Ie (首次剂量为 5 mol/kg， n=12)的生理盐水溶液从尾静脉输入。 之后， 每天从大鼠尾静脉输 1次化合物 Ie的生理盐水溶液 (剂量 为 2 mol/kg)， 连续输 6天， 观察 7天， 每天自身对照， 按 Zeakmga方法评定神经功能缺损程度。 0分 表示无任何神经功能缺失体征， 1分表示未损伤侧前肢不能伸展， 2分表示向未损伤侧行走， 3分表示 向未损伤侧转圈成追尾状行走， 4分表示意识障碍无自主行走， 5分表示死亡。 试验结果见表 12。
表 12的数据说明， 大鼠中风 24小时之后第一天接受 1次剂量为 5 μπιοΐ/kg的化合物 Ie治疗， 之 后 5天每天接受 1次剂量为 2 μπιοΐ/kg的化合物 Ie治疗可以获得确切疗效。除 3只死亡外，接受治疗的 12只大鼠中余下的 9只大鼠有 8只好转为好转为无任何神经功能缺失体征， 有 1只残留轻微的神经功 能缺失体征。 可见， 化合物 Ie连续治疗对于对超出黄金期的中风确实有效。 表 12 大鼠中风 24小时后接受本发明化合物 Ie治疗的疗效
Figure imgf000040_0001
试验例 13 大鼠中风 6小时后 6次 2 μιηοΐ/kg本发明化合物 Ie治疗的试验
疗效用神经功能评分表示， 评分越低疗效越好。雄性 SD大鼠腹腔注射 10%水合氯醛溶液， 剂量为 400 mg/kg体重， 使麻醉。 于颈部正中纵行切口， 分离出右侧颈总动脉主干 (约 3 cm长)。 于舌骨水平分 离结扎颈外动脉各分支，于颈膨大处分离出颈内动脉。用无创动脉夹分别夹闭颈内动脉开口处和颈总动 脉近心端， 并结扎颈外动脉远端。 于颈外动脉主干处插入装有 0.5 mL血栓块生理盐水悬浮液的导管， 在松开颈内动脉夹的同时， 将导管内的 0.5 mL血栓块生理盐水悬浮液缓慢从颈外动脉向近心端经过颈 内动脉注入大脑中动脉。与前面的试验例不同， 本试验例使用的血栓块不是用 -24 °C保存的血栓制备的 血栓块的生理盐水悬浮液， 而是用室温放置 24小时的更加陈旧的血栓制备的明显硬的血栓块的生理盐 水悬浮液。 之后， 结扎颈外动脉近心端， 打开颈内动脉和颈总动脉处的动脉夹， 恢复血流， 缝合伤口。 并肌肉注射 2万 IU的青霉素， 预防感染。 6小时之后把化合物 Ie (首次剂量为 5 μπιοΐ/kg, n=12)的生理 盐水溶液从尾静脉输入。之后， 每天从大鼠尾静脉输 1次化合物 Ie的生理盐水溶液 (剂量为 2 μπιοΐ/kg), 连续输 6天， 观察 7天， 每天自身对照， 按 Zeakmga方法评定神经功能缺损程度。 0分表示无任何神经 功能缺失体征， 1分表示未损伤侧前肢不能伸展， 2分表示向未损伤侧行走， 3分表示向未损伤侧转圈 成追尾状行走， 4分表示意识障碍无自主行走， 5分表示死亡。 试验结果见表 13。
表 13 大鼠中风 6小时后接受 2 mol/kg本发明化合物 Ie治疗的疗效
Figure imgf000040_0002
表 13的数据说明，在陈旧血栓诱导的大鼠中风 6小时之后的模型上，每天给于 1次剂量为 2 μπιοΐ/kg 的化合物 Ie治疗， 连续 6次可以获得确切疗效。 除 6只死亡外， 接受治疗的 12只大鼠中余下的 6只大 鼠有 1只好转为好转为无任何神经功能缺失体征， 有 5只残留轻微的神经功能缺失体征。可见， 化合物 Ie连续治疗对于陈旧性中风确实有效。
应当强调的是， 因为在试验例 1-7中 la至 II的其它化合物与 Ie达到类似的 NO自由基清除、 溶解 优球蛋白、 溶血栓、抗血栓以及治疗中风大鼠等效果， 所以 la至 II的其它化合物应与 Ie—样可以获得 对于陈旧性中风的治疗作用。
试验例 14本发明化合物 la至 II在 lxlO_6M、 lxlO_9M和 lxlO_12M浓度下的纳米结构试验 将本发明化合物 la至 II用三蒸水分别配成 1χ10·6Μ、 1><10·9Μ和 1><10·12Μ的溶液， 吸取 10 μL滴 于铜网表面， 铜网下面衬滤纸， 自然晾干， 在透射电子显微镜透射电镜 (JEOL， JEM- 1230)下观察并用 照片记录形态及粒径。
1. 供试化合物： 本发明化合物 la至 II。
2. 试验方法： 将供试化合物 （Ia-Il) 用三蒸水分别配成 1χ10·6Μ、 1><10·9 Μ和 1><10·12 Μ的溶液， 吸 取微量 (约 10 μΐ)滴于铜网表面， 铜网下面衬滤纸， 自然晾干， 在透射电子显微镜透射电镜 (JEOL, JEM- 1230)下观察形态及粒径， 并用照片记录。
3. 试验结果试验结果见图 25-图 36。 图 25为本发明化合物 la在 ΙχΙΟ—6 Μ、 ΙχΙΟ"9 M和 ΙχΙΟ—12 M水 溶液中的纳米结构， 水溶液中 la的纳米结构是直径为 3.1 nm至 86.1 nm的纳米球； 图 26为本发 明化合物 lb在 1χ10—6Μ、 1χ10—9Μ和 1χ10—12Μ水溶液中的纳米结构， 水溶液中 lb的纳米结构是 直径为 4.3 nm至 297.9 nm的纳米球； 图 27为本发明化合物 Ic在 1χ1(Γ6Μ、 1χ10_9Μ和 1χ10"12Μ 水溶液中的纳米结构，水溶液中 Ic的纳米结构分别是直径为 2.2 nm至 165.7 nm的纳米球； 图 28 为本发明化合物 Id在 1χ10—6Μ、 1χ10—9Μ和 ΙχΙΟ—12 Μ水溶液中的纳米结构， 水溶液中 Id的纳米 结构是直径为 16.2 nm至 201.2 nm的纳米球； 图 29为本发明化合物 Ie在 1χ10_6 Μ、 ΙχΙΟ"9 Μ和 1χ10_12Μ水溶液中的纳米结构， 水溶液中 Ie的纳米结构是直径为 3.3 nm至 138.9 nm的纳米球； 图 30为本发明化合物 If在 1χ10—6Μ、 1χ10—9Μ和 1χ10—12Μ水溶液中的纳米结构， 水溶液中 If的 纳米结构是直径为 3.6 nm至 82.4 nm的纳米球； 图 31为本发明化合物 Ig在 1χ10_6Μ、 1χ10_9Μ和 lxlO_12M水溶液中的纳米结构， 水溶液中 Ig的纳米结构是直径为 6.3 nm至 264.5 nm的纳米球； 图 32为本发明化合物 Ih在 lxlO—6 Μ、 ΙχΙΟ"9 M和 ΙχΙΟ—12 Μ水溶液中的纳米结构， 水溶液中 Ih 的纳米结构是直径为 5.1 nm至 149.8 nm的纳米球； 图 33为本发明化合物 Ii在 1χ10_6Μ、 1χ10"9Μ 和 1χ10_12Μ水溶液中的纳米结构，水溶液中 Ii的纳米结构是直径为 4.7 nm至 107.7 nm的纳米球； 图 34为本发明化合物 Ij在 1χ10—6Μ、 1χ10—9Μ和 1χ10—12Μ水溶液中的纳米结构， 水溶液中 Ij的 纳米结构是直径为 9.1 nm至 73.7 nm的纳米球； 图 35为本发明化合物 Ik在 1χ10_6 Μ、 1χ10"9Μ 和 1χ10_12Μ水溶液中的纳米结构，水溶液中 Ik的纳米结构是直径为 10.1 nm至 66.7 nm的纳米球； 图 36为本发明化合物 II在 1χ10—6Μ、 1χ10—9Μ和 1χ10—12Μ水溶液中的纳米结构， 水溶液中 II的 纳米结构是直径为 6.1 nm至 153.3 nm的纳米球。
试验例 15本发明化合物 la至 II在 lxl0_6M、 lxlO_9M和 lxlO_12M浓度下的高分辨 FT- MS试验 将化合物 Ia-Il用三蒸水分别配成 12.5 μΜ的溶液，吸取 10 进样，在 solariX FT-ICR质谱（Bruker Daltonik)上观察分子间缔合状态， 并记录数据。 结果列入表 14-表 16。
表 14 本发明化合物 Ia-Il在三种浓度下形成的二聚体的高分辨 FT-MS数据
Figure imgf000042_0001
表 14-表 16是使用 FT高分辨质谱仪测定的精确质数。这些质量数说明，本发明化合物 Ia-Il在 1><10_6 M、 lxllT9和 1χ1(Γ12 Μ三种浓度下同时测定到二聚体、 三聚体和四聚体。 可见， 本发明化合物在水溶 液中可以同时形成二聚体、 三聚体和四聚体。 试验例 16本发明化合物 Ie在 10.0 μΜ、 1.0 μΜ、 0.1 μΜ、 0.01 μΜ浓度下的高分辨 FT-MS试验 为了将质谱可视化将化合物 Ie用三蒸水分别配成 10.0 μΜ、 1.0 μΜ、 0.1 μΜ、 0.01 μΜ的溶液， 吸 取 ΙΟ μί进样， 在 solariX FT-ICR质谱 （Bruker Daltonik)上观察分子间缔合状态， 并记录图谱。 结果如 图 37-图 40所示。 图 37为本发明化合物 Ie在 0.01 μΜ浓度下的高分辨 FT- MS质谱图： 915.84146为二 聚体的三电荷离子， 1030.321 14三聚体的四电荷离子 1099.00914为四聚体的五电荷离子； 图 38为本发 明化合物 Ie在 0.1 μΜ浓度下的高分辨 FT-MS质谱图： 915.84124为二聚体的三电荷离子， 1030.32208 三聚体的四电荷离子 1099.00829为四聚体的五电荷离子； 图 39为本发明化合物 Ie在 1 μΜ浓度下的高 分辨 FT- MS质谱图： 915.84095为二聚体的三电荷离子， 1030.32067三聚体的四电荷离子， 1099.00914 为四聚体的五电荷离子； 图 40为本发明化合物 Ie在 10 μΜ浓度下的高分辨 FT- MS质谱图： 915.84163 为二聚体的三电荷离子， 1030.32067为三聚体的四电荷离子， 1099.00914为四聚体的五电荷离子。
本发明化合物在水溶液中形成的二聚体、三聚体和四聚体进一步组装便形成直径为 2 nm至 300 nm 的纳米球。 在这些尺寸的纳米球中， 直径小于 100 nm的纳米球数量超过 99%。 纳米药学的一个公知的 事实是， 直径小于 100 nm的纳米球在血液在输送不易被巨噬细胞吞噬， 容易跨过毛细血管壁。 这些性 能使得本发明的化合物可跨过血脑屏障。正是本发明的化合物可跨过血脑屏障的性能，使得在接受治疗 的中风大鼠的脑组织中可检测到本发明的化合物的代谢产物。
试验例 17高分辨 FT- MS监测本发明化合物 Ie治疗的大鼠脑组织中的代谢产物试验
取大鼠整个大脑， 放置于 50 mL离心管中， 加入 10 mL 0.9% NaCl溶液， 匀浆得到均一的混悬物， 然后于 3000 rpm的条件下离心 lO min; 取上请液 5 mL， 再加入 10 mL 甲醇， 振荡混匀后， 于 3000 rpm 的条件下离心 10 min， 取上请液并减压浓缩蒸干。 再加入 l mL甲醇， 再次于 12000 rpm的条件下离心 10 min所得上清液用于监测化合物在 Ie治疗的大鼠脑组织中的代谢产物含量。
高分辨 FT- MS的测试结果显示脑中有两个代谢产物 Ml和 M2。 其中 Ml的 [M+l]+为 291.06971， 分子式为 C15H1905N2 ; M2的 [M+l]+为 307.04350， 分子式为 C15H1904N2 (质谱条件： 进样量为 10 L; 电离模式为 ES+; 锥孔电压为 30 V； 流动相流速为 0.2 niL/min)。 根据这些数据， 推断代谢产物 Ml和 M2应为以下化合物：
Figure imgf000043_0001
Figure imgf000043_0002
这说明了本发明化合物 Ie确实通过了血脑屏障， 可以达成在脑内清除 NO 自由基、 溶血栓和抗血 栓的疗效。

Claims

权利要求书
1、 一种式 I化合物：
Figure imgf000044_0001
丽一 AA!
AA3
(I)
其中， NN代表具清除 NO自由基活性的咪唑啉类； 代表具有至少三个连接用基团的连接臂； AA2代表具溶血栓活性肽； AA3代表血栓靶向肽。
2、 如权利要求 1所述的化合物， 其中所述具清除 NO 自由基活性的咪唑啉类为 1，3-二氧基 -2-[(4- 氧乙酸)苯基] -4，4，5，5-四甲基咪唑啉。
3、 如权利要求 1所述的化合物， 其中所述连接用基团选自羧基和氨基所构成的群组。
4、 如权利要求 3所述的化合物， 其中所述连接臂为天然氨基酸， 特别是 L-Lys、 L-Asp或 L-Glu。
5、 如权利要求 1 所述的化合物， 其中所述具溶血栓活性肽为含 PAK (Pro-Ala-Lys)序列、 AKP
(Ala-Lys-Pro)序列或 KAP (Lys -Ala -Pro)序列的寡肽或包含以 PAK序列、 AKP序列或 KAP序列为结构 单元的重复序列肽。
6、 如权利要求 1所述的化合物， 其中所述血栓靶向肽为含 RGD (Arg-Gly-Asp)序列的寡肽。
7、 如权利要求 1 所述的化合物， 其中所述血栓靶向肽为 RGD (Arg-Gly-Asp)肽与 YIGS (Tyr-Ile-Gly-Ser)肽进行缀合式修饰而得的多肽。
8、 如权利要求 1所述的化合物， 其中所述具清除 NO 自由基活性的咪唑啉类为 1，3-二氧基 -2-[(4- 氧乙酸)苯基] -4，4，5，5-四甲基咪唑啉； 所述连接臂为 L-Lys 、 L-Asp或 L-Glu; 所述具溶血栓活性肽为含 PAK序列 (Pro-Ala-Lys)的寡肽； 且所述血栓靶向肽为含 RGD序列 (Arg-Gly-Asp)的寡肽。
9、 一种药物组合物， 其包含如权利要求 1至 8任一项所述的化合物， 及药学上可接受的载剂。
10、 如权利要求 9所述的药物组合物， 其中所述化合物可形成纳米球结构。
11、 如权利要求 9所述的药物组合物， 作为溶血栓药物、 清除 NO自由基药物或抗血栓药物。
12、 如权利要求 9所述的药物组合物作为治疗中风或脑梗药物。
13、 如权利要求 12所述的药物组合物， 用于治疗发病超过 3小时的中风或脑梗。
14、 一种权利要求 1所述式 I化合物的制备方法，
Figure imgf000044_0002
其中， NN代表具清除 NO自由基活性的咪唑啉类； AAi代表具有至少三个连接用基团的连接臂； AA2代表具溶血栓活性肽； AA3代表血栓靶向肽；
所述制备方法包括以下步骤：
(1)提供所述具清除 NO 自由基活性的咪唑啉类 ( N)、 具有至少三个连接用基团的连接臂 (AA ,具溶血栓活性肽 (AA2)及血栓靶向肽 (AA3)，其中所述连接臂具有第一连接用基团、 第二连接用基团及第三连接用基团； (2)在适当反应条件下， 连接所述具清除 NO自由基活性的咪唑啉类 ( N)与所述连接臂 (AA^ 的第一连接用基团， 形成通式 IM-1化合物：
NN-AAj (IM-1)：
(3)在适当反应条件下， 连接所述具溶血栓活性肽 (AA2)与通式 IM-1 化合物， 其中所述具溶 血栓活性肽的一端与所述连接臂的第二连接用基团相连接， 形成通式 IM-2化合物：
N -AA AA2 (IM-2); 及
(4)在适当反应条件下， 连接所述血栓靶向肽 (AA3)与通式 IM-2 化合物， 其中所述血栓靶向 肽的一端与所述连接臂的第三连接用基团相连接而形成式 I化合物；
其中步骤 (3)与步骤 (4)的顺序可以交换。
15、 如权利要求 14所述的制备方法， 步骤 (1)更包含将所述连接臂 (ΑΑ^的第二和第三连接用基团 以保护基保护，且将具溶血栓活性肽 (AA2)和血栓靶向肽 (AA3)上除连接用一端外的活性基团以保护基保 护； 步骤 (3)更包含先将受保护的第二连接用基团去保护， 再将所述具溶血栓活性肽与所述去保护的第 二连接用基团相连接； 步骤 (4)更包含先将受保护的第三连接用基团去保护， 再将所述血栓靶向肽与所 述去保护的第三连接用基团相连接； 且步骤 (4)后更包含将具溶血栓活性肽 (AA2)和血栓靶向肽 (AA3)上 受保护的活性基团去保护。
16、如权利要求 14或 15所述的制备方法， 其中所述第一连接用基团为氨基， 且所述第二和第三连 接用基团选自羧基和氨基所构成的群组。
17、如权利要求 16所述的制备方法，其中所述连接臂为天然氨基酸，特别是 L-Lys、 L-Asp或 L-Glu。
18、 如权利要求 16所述的制备方法， 其中所述具溶血栓活性肽为含 PAK (Pro-Ala-LyS)序列、 AKP (Ala-Lys -Pro)序列或 KAP (Lys -Ala- Pro)序列的寡肽或包含以 PAK序歹 I」、 AKP序列或 KAP序列为结构 单元的重复序列肽。
19、 如权利要求 16所述的制备方法， 其中所述血栓靶向肽为含 RGD (Arg-Gly-Asp)序列的寡肽。
20、 如权利要求 14或 15所述的制备方法， 其中所述具清除 NO自由基活性的咪唑啉类为 1，3-二氧 基 -2-[(4-氧乙酸)苯基] -4，4，5，5-四甲基咪唑啉； 所述连接臂为 L-Lys、 L-Asp或 L-Glu; 所述具溶血栓活性 肽为含 PAK序歹 lJ(Pro-Ala-LyS)的寡肽； 且所述血栓靶向肽为含 RGD序列 (Arg-Gly-Asp)的寡肽。
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Free format text: APRESENTE A TRADUCAO SIMPLES DA FOLHA DE ROSTO DA CERTIDAO DE DEPOSITO DAS PRIORIDADES REIVINDICADAS; OU DECLARACAO DE QUE OS DADOS DO PEDIDO INTERNACIONAL ESTAO FIELMENTE CONTIDOS NAS PRIORIDADES REIVINDICADAS, CONTENDO TODOS OS DADOS IDENTIFICADORES (NUMERO DA PRIORIDADE, DATA, DEPOSITANTE E INVENTORES), CONFORME O PARAGRAFO UNICO DO ART. 25 DA RESOLUCAO 77/2013. CABE SALIENTAR NAO FOI POSSIVEL INDIVIDUALIZAR OS TITULARES DA CITADA PRIORIDADE, INFORMACAO NECESSARIA PARA O EXAME DA CESSAO DO DOCUMENTO DE PRIORIDADE, SE FOR O CASO.

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