CN104151375B - 一种昆仑雪菊酚苷化合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种昆仑雪菊酚苷化合物及其制备方法和用途,其为式(I)结构所示的化合物或其药学上可接受的盐。本发明从昆仑雪菊中分离出的4,6-二羟基-2-[6-羟基-1,5-二甲基-4-己烯基]-5-苯甲基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷为首次从天然资源中得到的化合物,该化合物具有较强的DPPH和ABTS自由基清除能力,可作为原料、辅料和配料应用于食品、药品或化妆品的生产等领域。
Description
技术领域
本发明属于天然化合物提取分离领域,具体涉及一种新的昆仑雪菊酚苷化合物,以及其制备方法和用途。
背景技术
昆仑雪菊又称血菊,学名蛇目菊(CoreopsistinctoriaNutt),是一种具有独特功效的稀有高寒菊科植物,主要分布在昆仑山脉北麓海拔3000米雪线以上部分地区。研究证实昆仑雪菊具有降血压、血脂、血糖,抗菌、消炎的作用;体外活性研究表明,昆仑雪菊提取物具有显著的抗氧化活性和抗肿瘤活性。
酚苷类物质是一类广泛存在于植物体内复杂的多酚类次生代谢的产物,研究发现植物多酚具有抗氧化、抑菌、抗病毒、抗肿瘤、抗心脑血管疾病、护肝益肾等作用。酚类化合物在植物体内主要以结合型的酚苷形式存在,通过酯键、醚键、缩醛键与细胞壁构成材料-膳食纤维结合、能耐受肠道消化酶不被降解并最终通过胃肠道到达结肠,结肠含有的大量细菌菌群可以发酵降解这些物质,降解产物能够中和氧化剂、维持肠道菌落的生长,从而为维持肠胃健康起到重要作用。
采用多种分离纯化技术联用方法研究天然活性物质,从天然动植物中提取、分离具有生物活性的有效组份并阐明其化学结构是进一步开发稀有植物资源的重要手段。另外,功能性食品的研究与开发是近年来食品领域的发展前沿,代表着21世纪食品的一种发展潮流,然而目前某些人工合成的食品添加剂会产生毒性物质,具有致癌性,因此从植物中寻找高效无副作用的天然活性物质用于功能性食品或药品的生产具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是利用现代分离技术和现代波谱学技术对昆仑雪菊进行化学成分研究,从中得到一个新的酚苷类化合物,鉴定了结构,测定了该化合物的抗氧化活性,扩展了昆仑雪菊的药用和食用价值。
本发明的目的是提供一种上述化合物的制备方法。
本发明的另一个目的是提供一种上述化合物的用途。
本发明的目的可以通过以下措施达到:
式(I)结构所示的化合物或其药学上可接受的盐,该化合物的化学名为:4,6-二羟基-2-[6-羟基-1,5-二甲基-4-己烯基]-5-苯甲基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷,将其命名为Coretinphenol。
目前尚未见对这个化合物的化学结构及抗氧化活性的报道。
本发明的式(I)化合物可以通过下述方法制备得到,其具体步骤如下:将干燥的昆仑雪菊头状花序捣碎后,加入甲醇溶液浸提多次,过滤去除萃取液,滤渣用NaOH溶液降解,降解后用盐酸中和至中性,再加入正丁醇溶液萃取多次,取正丁醇萃取液抽滤,真空浓缩得到正丁醇提取物;正丁醇提取物经反复硅胶柱层析以及SephadexLH-20柱层析,分离纯化得到式(I)化合物。
在制备方法中,昆仑雪菊头状花序与甲醇溶液的重量体积比为1:1~3kg/L,优选为1:2kg/L,用甲醇溶液浸提昆仑雪菊头状花序3次。
在制备方法的降解步骤中,NaOH溶液的浓度为1~3mol·L-1,优选为2mol·L-1,降解温度为45~55℃,优选为50℃,降解时间为1~3h,优选为2h。
在制备方法中,正丁醇溶液与原料昆仑雪菊头状花序的体积重量比为1~3:1L/kg,优选为2:1L/kg;用正丁醇溶液萃取3次。
在制备方法的柱层析分离中,正丁醇提取物先用硅胶常压柱进行两次层析分离后,再用SephadexLH-20柱层析纯化,最后用常压硅胶柱层析分离,得到式(I)化合物。在一种优选方案中,正丁醇提取物先用硅胶常压柱进行两次层析分离时,首次用石油醚-丙酮-甲醇进行梯度洗脱,后一次用氯仿-甲醇进行梯度洗脱;SephadexLH-20柱层析的洗脱液为氯仿-甲醇;最后一次常压硅胶柱的洗脱液为氯仿-甲醇。
本发明采用DPPH、ABTS法测试了式(I)所示酚苷新化合物的抗氧化活性,实验证实,式(I)所示酚苷新化合物有较强的抗氧化活性,特别是具有较强的DPPH和ABTS自由基清除能力,故式(I)化合物或其药学上可接受的盐可以应用于作为自由基清除剂方面,还可以作为昆仑雪菊中的标志性酚苷化合物成分。
本发明式(I)所示酚苷新化合物也可作为食品、药品或化妆品原料用于生产食品(如保健食品)、药品和化妆品。
本发明还包括一种组合物,其以式(I)结构的化合物或其药学上可接受的盐为活性成分或主要活性成分,辅以辅料制成。具体可辅以食品辅料制成食品(如保健食品等)、辅以药学上可接受的载体制成药品、辅以化妆品辅料制成化妆品等。
本发明的有益效果:本发明从昆仑雪菊中分离出的4,6-二羟基-2-[6-羟基-1,5-二甲基-4-己烯基]-5-苯甲基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷为首次从天然资源中得到的化合物,该化合物具有较强的DPPH和ABTS自由基清除能力,可应用于食品、药品或化妆品等方面。
附图说明
图1是式(Ⅰ)所示化合物的UV图谱;
图2是式(Ⅰ)所示化合物的MS图谱;
图3是式(Ⅰ)所示化合物的1HNMR图谱;
图4是式(Ⅰ)所示化合物的13CNMR图谱;
图5是式(Ⅰ)所示化合物的1H-HCOSYNMR图谱;
图6是式(Ⅰ)所示化合物的HSQCNMR图谱;
图7是式(Ⅰ)所示化合物的HMBCNMR图谱;
图8是式(Ⅰ)所示化合物的DPPH自由基清除率曲线图;
图9是式(Ⅰ)所示化合物的ABTS自由基清除率曲线图。
具体实施方式
实施例1、化合物的制备
称取干燥的昆仑雪菊头状花序5kg,用匀浆搅拌机捣碎,置于20L的容量瓶中,加10L甲醇进行萃取,放置24h,萃取三次。用布氏漏斗抽滤,滤渣置于20L的容量瓶中,用2mol·L-1的NaOH溶液于50℃水浴中降解2h,盐酸中和至中性后用10L正丁醇进行萃取,放置24h,萃取三次。抽取正丁醇层,用旋转蒸发仪在55℃真空浓缩得正丁醇提取物。
正丁醇提取物(152g)用100g硅胶干法拌样后上装有300g硅胶(300-400目)的常压柱,用石油醚-丙酮-甲醇梯度洗脱分离。洗脱的组分真空浓缩后进行TLC检测,TLC条件为(1)显色剂为5%的硫酸溶液,溶剂为乙醇;(2)展开剂:氯仿:甲醇=2:0.4;将Rf值相同,遇硫酸显色剂显色相同的进行合并,得到5个组分Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5,其中Fr.3显紫色。
组分Fr.3(3.2g),进一步上常压硅胶柱,体积比为80:1的氯仿-甲醇洗脱,TLC检测,条件同上,将Rf值相同,遇硫酸显色剂显色相同的进行合并,得到组分Fr.3-1、Fr.3-2、Fr.3-3,其中,组分Fr.3-2遇硫酸显紫色;组分Fr.3-2用SephadexLH-20纯化,氯仿-甲醇(体积比1:1)洗脱,TLC检测,条件同上,得到遇硫酸显紫色的组分Fr.3-2-1,组分Fr.3-2-1继续用常压硅胶柱(300-400目)分离,氯仿-甲醇(体积比50:1)洗脱,得纯化合物,TLC检测,条件同上,得到Rf=0.5,遇硫酸显紫色的斑点,即为式(Ⅰ)化合物(20.2mg)。
化合物1:黄色固体,HRESI-MS在m/z451.1952(calcd,451.1944)处给出[M+Na]+峰,提示该化合物的分子量为428,分子式为C21H32O9,不饱和度为6。紫外光谱显示三个主要吸收峰νmax207,230,280,红外光谱在3416,1699,1508,1802,1047处的吸收峰提示分子中含有羟基、双键、苯环和糖苷键,提示该化合物可能为酚苷类化合物。1H-NMR和13C-NMR谱显示该化合物中含有1个苯环,一个糖单元和一个双键。综合分析二维谱包括1H-1HCOSY、HSQC和HMBC使分子中的所有耦合信号得到全面归属(表1)。1H-1HCOSY谱提示分子中含有C1'-C4'和C1″-C5″两个分子片段,HMBC谱显示一组关键远程耦合关系包括H-3与C-1,C-4,C-5和C-1'耦合,5-CH3与C-4、C-5和C-6耦合,1'-CH3与C-2、C-1'和C-2'耦合,5'-CH3与C-4'、C-5'和C-6'耦合。HMBC谱中,异头氢δ4.89(d,J=7.08Hz,1H,H-1″)与δ137.0(C-1)之间存在关键耦合信号,说明吡喃糖是通过氧苷键直接与苯环连接的,由异头氢的耦合常数(J=7.08Hz)可知该吡喃糖为β构型。该化合物的绝对构型通过通过盐酸水解并衍生化反应后进行GC-MS分析,比较与标准D-和L-型葡萄糖酸的保留时间确定为D-型。因此,该化合物鉴定为4,6-二羟基-2-[6-羟基-1,5-二甲基-4-己烯基]-5-苯甲基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。通过ACS数据库SCIFinder软件对化合物1的结构进行检索,可知该化合物为新化合物,将其命名为Coretinphenol。
衍生化分析方法:化合物1mg溶于2MHCl/H2O(2mL),在85℃下搅拌15h。反应混合物冷却后,然后用乙酸乙酯(10mL)和水H2O(10mL)萃取,水相部分用水反复浓缩蒸干后得到单糖剩余物。剩余物溶于1mL吡啶,再加入L-半胱氨酸甲酯盐酸盐2.0mg。混合物在60℃保温2h,之后加入0.2mL三甲基硅唑在60℃再保温2h。混合物在正己烷和水(各2mL)之间萃取,然后正己烷相用GC-MS分析(ThermoQuestTrace2000GC;PhenomenexDB-5柱(30mx0.25mmx0.25μm);载气:N2;进样温度:250℃;检测温度:280℃;柱温:最初160℃(3min),然后以20℃/min加热到300℃(30min)。
表1化合物的核磁数据
实施例2、抗氧化活性的测试
1.实验样品及实验方法
1.1DPPH法。
DPPH溶液的配制:准确称取0.0197gDPPH,无水乙醇定容到250ml,得到浓度为2×10-4mol·L-1的DPPH溶液。
测定方法:2ml样品加2mlDPPH溶液,摇匀后避光静置30min,于517nm处测得吸光值AI;空白用2ml无水乙醇代替样品,2ml样品加2ml无水乙醇,摇匀后避光静置30min,于517nm处测得吸光值AJ;2ml无水乙醇加2mlDPPH溶液,摇匀后避光静置30min,于517nm处测得吸光值AC;清除率为[1-(AI-AJ)/AC]×100%。VE溶液(20-100μmol·L-1)做阳性对照,每个样品平行三次。
1.2ABTS法。
ABTS工作液的配制:称取0.1918gABTS,去离子水定容到50ml容量瓶;取0.0662g过硫酸钾,去离子水定容到100ml容量瓶;将上述两种溶液按体积比1:1混匀后避光放置12-16h;取混合液,加一定量的无水乙醇在734nm处测量吸光度,用无水乙醇调吸光值至0.7±0.02即可使用(混合液现配现用)。
测定方法:取0.2ml无水乙醇配制的样品加入0.6mlABTS工作液,室温静置5min后,于734nm测量吸光值,空白用无水乙醇代替样品。清除率为(1-AI/A0)×100%,其中A0为空白样的吸光值、AI各浓度下样品的吸光值。VE溶液(20-100μmol·L-1)做阳性对照,每个样品平行三次。
2.实验结果
2.1DPPH法对纯品单体化合物进行活性评价结果
如图8显示,在测试浓度范围内,样品的DPPH自由基清除率随浓度增加呈现明显的计量效应关系,当浓度在20~40μmol·L-1之间时样品的DPPH自由基清除率与VE对照基本相当,当浓度在40~100μmol·L-1之间时样品的DPPH自由基清除率略低于VE对照。其中样品对DPPH的半数抑制率IC50值为92.51±1.17μmol·L-1,略高于阳性对照VE的DPPH的半数抑制率IC50值(78.08±1.63μmol·L-1)。综上所述,样品具有较强的DPPH自由基清除活性。
2.2ABTS法对纯品单体化合物进行活性评价结果
如图9显示,在测试浓度范围内,样品的ABTS自由基清除率随浓度增加呈现明显的计量效应关系,且样品的ABTS自由基清除率趋势线更加平缓,当浓度在20~40μmol·L-1之间时样品的ABTS自由基清除率要高于VE对照,当浓度在40~100μmol·L-1之间时样品的ABTS自由基清除率逐渐低于VE对照,可见在低浓度条件下样品的ABTS自由基清除率要好于VE阳性对照。其中样品对ABTS的半数抑制率IC50值为40.18±0.97μmol·L-1,略高于阳性对照VE的ABTS的半数抑制率IC50值(38.54±0.42μmol·L-1)。综上所述,样品具有较强的ABTS自由基清除活性。
Claims (7)
1.式(I)结构所示的化合物或其药学上可接受的盐,
2.一种权利要求1所述的化合物的制备方法,其特征在于将干燥的昆仑雪菊头状花序捣碎后,加入甲醇溶液浸提多次,过滤去除萃取液,滤渣用NaOH溶液降解,降解后用盐酸中和至中性,再加入正丁醇溶液萃取多次,取正丁醇萃取液抽滤,真空浓缩得到正丁醇提取物;正丁醇提取物先用硅胶常压柱进行两次层析分离后,再用SephadexLH-20柱层析纯化,最后用常压硅胶柱层析分离,得到式(I)化合物;在正丁醇提取物用硅胶常压柱进行两次层析分离时,首次用石油醚-丙酮-甲醇进行梯度洗脱,后一次用氯仿-甲醇进行梯度洗脱;SephadexLH-20柱层析的洗脱液为氯仿-甲醇;最后一次常压硅胶柱的洗脱液为氯仿-甲醇体积比50:1。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于所述昆仑雪菊头状花序与甲醇溶液的重量体积比为1:1~3kg/L,用甲醇溶液浸提昆仑雪菊头状花序3次。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于所述NaOH溶液的浓度为1~3mol·L-1,降解温度为45~55℃,降解时间为1~3h。
5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于正丁醇溶液与原料昆仑雪菊头状花序的体积重量比为1~3:1L/kg,用正丁醇溶液萃取3次。
6.权利要求1所述的式(I)结构所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备自由基清除剂药物方面的应用。
7.权利要求1所述的式(I)结构所示的化合物或其药学上可接受的盐作为原料、辅料和配料用于食品、药品或化妆品的生产。
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