CN103555784A - 一种从黄芩中同时分离汉黄芩素与黄芩素单体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从黄芩中同时分离汉黄芩素与黄芩素单体的方法，通过将黄芩药材粉碎，加入适量水以及食用酶进行酶解，将酶解后的药材进行超临界萃取，使用夹带剂分段收集，进行重结晶后可分别得到黄芩素与汉黄芩素；所述方法从黄芩药材中同时提取出黄芩苷元类化合物单体，且收率比直接分离法高出3倍以上，制备的汉黄芩素和黄芩素单体纯度均在98%以上，且流程简便、绿色环保，具有非常重要的生产实践意义，适合规模化工业生产的需要。

Description

一种从黄芩中同时分离汉黄芩素与黄芩素单体的方法

技术领域

本发明涉及天然活性物质分离领域，尤其是一种从黄芩中同时分离汉黄芩素与黄芩素单体的方法。

背景技术

黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎之功效。黄芩的主要成分是黄芩苷(Baicalin)、汉黄芩苷(Wogonside)、千层纸素A(Oroxylin)和少量的白杨素(Chrysin)等黄酮类成分。药物代谢研究发现，黄芩提取物吸收入血的主要成分为黄芩苷元和汉黄芩苷元及少量的千层纸素，黄芩苷以及汉黄芩苷很难被肠道吸收，生物利用度极低。近年来已证实汉黄芩素具有明确的抗肿瘤效果，如汉黄芩素能恢复肿瘤坏死因子受体细胞凋亡诱导配体

（Tumornecrosisfactorreceptorapoptosis-inducingligand,TRAIL）在失活的癌细胞中TRAIL的敏感性；在人结肠癌HCT116细胞，汉黄芩素可通过p53依赖的PUMA（凋亡诱导因子）诱导作用诱导细胞凋亡。因此，汉黄芩素有望开发成为新一代抗肿瘤药物。

目前黄芩素以及汉黄芩素制备的方法主要有传统硅胶柱分离法、酸水解法联合硅胶柱分离法、利用内源酶及柱分离等方法。由于黄芩素以及汉黄芩素在植物中含量低（一般为0.05-0.5%），因此直接分离较困难；酸水解方法，可以将部分黄芩苷转化为其苷元，但由于黄酮苷类为7-0-葡萄糖醛酸结合苷，糖苷键较为牢固不易断裂，因此酸水解转移率受到一定限制；利用内源酶法降解条件比较温和，但用时较长，降解后仍需采用硅胶柱以及大量有机溶剂才能分离得到黄芩素以及汉黄芩素，因此，现有制备方法在转移率、可操作性、安全性、成本等方面均存在一定局限性。加之，黄芩素、汉黄芩素结构上具有邻三酚羟基，性质不稳定，极易被氧化为醌类结构而变性，加大了这类化合物分离制备的难度。为了使黄芩素与汉黄芩素更为广泛的应用于临床，对于黄芩素与汉黄芩素的大规模生产制备方法有待创新与突破。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种从黄芩中同时分离汉黄芩素与黄芩素单体的方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种从黄芩中同时分离汉黄芩素与黄芩素单体的方法，具体步骤为：向黄芩中加入适量水以及食用酶进行酶解，将酶解后的药材进行超临界萃取，使用夹带剂分段收集，进行重结晶后可分别得到黄芩素与汉黄芩素，其中，所述食用酶为β-葡萄糖苷酶、β-D-葡萄糖醛酸酶、纤维素酶、苦杏仁酶、蜗牛酶的一种或任意组合而成的复合酶，所述夹带剂为乙醇、甲醇、丙酮或乙酸乙酯。

优选的，上述从黄芩中同时分离汉黄芩素与黄芩素单体的方法，包括如下步骤：

（1）将黄芩药材粉碎，加入药材重量3-15倍量的蒸馏水和0.01-10%食用酶，控制温度在35-60℃，酶解1-10小时；

（2）将蒸馏水过滤，黄芩药材装入超临界萃取釜中，预热后，设定萃取压力为10-35Mpa，温度为40-60℃，萃取时间为1-5小时，夹带剂用量为5-100ml/100g黄芩药材；

（3）分段收集，将夹带剂溶液浓缩后用乙酸乙酯、石油醚或丙酮进行重结晶后可分别得到黄芩素与汉黄芩素。

优选的，上述从黄芩中同时分离汉黄芩素与黄芩素单体的方法，包括如下步骤：

（1）将黄芩药材粉碎，加入药材重量3-15倍量的蒸馏水和0.1-3%食用酶，该食用酶为β-D-葡萄糖醛酸酶、β-葡萄糖苷酶或苦杏仁酶，控制温度在40-50℃，酶解2-8小时；

（2）将蒸馏水过滤，黄芩药材装入超临界萃取釜，预热后，设定萃取压力为15-28Mpa，温度为45-55℃，萃取时间为2-4小时，夹带剂为乙醇、甲醇或乙酸乙酯，用量为10-50ml/100g黄芩药材；

（3）分段收集，将夹带剂溶液浓缩后用乙酸乙酯或丙酮进行重结晶后可分别得到黄芩素与汉黄芩素。

优选的，上述从黄芩中同时分离汉黄芩素与黄芩素单体的方法，包括如下步骤：

（1）将黄芩药材粉碎，加入药材重量7倍量的蒸馏水和1.0%β-D-葡萄糖醛酸酶，控制温度50℃，酶解3小时；

（2）将蒸馏水过滤，黄芩药材装入超临界萃取釜，预热后，设定萃取压力最优选为20Mpa，温度为50℃，萃取时间为3.5小时，夹带剂为乙醇，用量为40ml/100g黄芩药材；

（3）分段收集，将乙醇溶液浓缩后用乙酸乙酯进行重结晶后可分别得到黄芩素与汉黄芩素。

本发明的有益效果是：

所述从黄芩中同时分离汉黄芩素与黄芩素单体的方法，从黄芩药材中同时提取出黄芩苷元类化合物单体，与以往的黄芩药材中提取的黄芩苷类提取物有本质上的区别，该方法通过酶进行生物降解，获得能吸收入血的有效成分黄芩素和汉黄芩素，在抗菌、抗病毒、抑制炎症反应、保肝、利胆、利尿等方面,具有较好的临床应用价值，尤其是汉黄芩素具有非常重要的药理活性，该方法收率比直接分离法高出3倍以上，制备的汉黄芩素和黄芩素单体纯度均在98%以上，且流程简便、绿色环保，具有非常重要的生产实践意义，适合规模化工业生产的需要。

附图说明

图1为汉黄芩素LC-100液相色谱图；

图2为汉黄芩素对照品LC-100液相色谱图；

图3为黄芩素LC-100液相色谱图；

图4为黄芩素对照品LC-100液相色谱图。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图及具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。

实施例1

一种从黄芩中同时分离汉黄芩素与黄芩素单体的方法，包括如下步骤：

（1）将500g黄芩药材粉碎，加入药材重量6倍量的蒸馏水和5gβ-D-葡萄糖醛酸酶（食用酶），控制温度50℃，酶解3小时；

（2）将蒸馏水过滤，黄芩药材装入超临界萃取釜，预热后，设定萃取压力为20Mpa，温度为50℃，萃取时间为3.5小时，夹带剂为乙醇，用量为200ml；

（3）分段收集，将乙醇溶液浓缩后用乙酸乙酯进行重结晶后分别得到25.18g黄芩素与13.64g汉黄芩素,经HPLC检测，黄芩素纯度为98.23%，汉黄芩素纯度为98.35%。

对上述所得汉黄芩素和黄芩素进行鉴别和含量测定：

1、检测方法

仪器设备:伍丰LC-100

色谱柱:菲罗门C-18250*4.6mm5μ

柱温:25℃

流动相:甲醇-水-甲酸65-35-0.2

流速:1.0ml/min

检测波长:276nm

2、汉黄芩素含量测定：

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-甲酸（65：35-0.2）为流动相；检测波长为276nm。理论板数按斑蝥素峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备取汉黄芩素对照品（中检所批号为111514-200403）12.5389，精密称定，加甲醇至100ml容量瓶中定容，即得。

汉黄芩素供试品溶液的制备取本品粗粉约5.0944g，精密称定，加甲醇至100ml容量瓶中定容，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，结果见图1、图2，得汉黄芩素，5,7-二羟基-8-甲氧基-2-苯基-4H-1-苯并呋喃-4-酮，结构式如下：

测得汉黄芩素纯度为98.35%。

3、黄芩素含量测定：

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-甲酸（65：35-0.2）为流动相；检测波长为276nm。理论板数按斑蝥素峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备取黄芩素对照品（中检所批号为111514-200403）10.2531，精密称定，加甲醇至100ml容量瓶中定容，即得。

黄芩素供试品溶液的制备取本品粗粉约9.9045g，精密称定，加甲醇至100ml容量瓶中定容，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，结果见图3、图4，得黄芩素（C₁₅H₁₀O₅），结构式如下：

测得黄芩素纯度为98.23%。

实施例2

一种从黄芩中同时分离汉黄芩素与黄芩素单体的方法，包括如下步骤：

（1）将500g黄芩药材粉碎，加入药材重量3倍量的蒸馏水和0.05g蜗牛酶(食用酶)，控制温度在60℃，酶解10小时；

（2）将蒸馏水过滤，黄芩药材装入超临界萃取釜中，预热后，设定萃取压力为35Mpa，温度为40℃，萃取时间为5小时，夹带剂为丙酮，用量为25ml;

（3）分段收集，将丙酮溶液浓缩后用石油醚进行重结晶后分别得到10g黄芩素与1.5g汉黄芩素,经HPLC检测，黄芩素纯度为98.27%，汉黄芩素纯度为98.65%。

实施例3

一种从黄芩中同时分离汉黄芩素与黄芩素单体的方法，包括如下步骤：

（1）将500g黄芩药材粉碎，加入药材重量15倍量的蒸馏水和50g纤维素酶(食用酶)，控制温度在35℃，酶解1小时；

（2）将蒸馏水过滤，黄芩药材装入超临界萃取釜中，预热后，设定萃取压力为10Mpa，温度为60℃，萃取时间为1小时，夹带剂为乙酸乙酯，用量为500ml;

（3）分段收集，将乙酸乙酯浓缩后用丙酮进行重结晶后分别得到10.5g黄芩素与1.3g汉黄芩素,经HPLC检测，黄芩素纯度为98.45%，汉黄芩素纯度为98.29%。

实施例4

一种从黄芩中同时分离汉黄芩素与黄芩素单体的方法，包括如下步骤：

（1）将500g黄芩药材粉碎，加入药材重量10倍量的蒸馏水和0.5g苦杏仁酶(食用酶)，控制温度在40℃，酶解8小时；

（2）将蒸馏水过滤，黄芩药材装入超临界萃取釜，预热后，设定萃取压力为28Mpa，温度为45℃，萃取时间为4小时，夹带剂为甲醇，用量为50ml;

（3）分段收集，将甲醇溶液浓缩后用乙酸乙酯进行重结晶后分别得到10.6g黄芩素与1.6g汉黄芩素,经HPLC检测，黄芩素纯度为98.36%，汉黄芩素纯度为98.98%。

实施例5

一种从黄芩中同时分离汉黄芩素与黄芩素单体的方法，包括如下步骤：

（1）将500g黄芩药材粉碎，加入药材重量7倍量的蒸馏水和15gβ-D-葡萄糖醛酸酶(食用酶)，控制温度在50℃，酶解2小时；

（2）将蒸馏水过滤，黄芩药材装入超临界萃取釜，预热后，设定萃取压力为15Mpa，温度为55℃，萃取时间为2小时，夹带剂为乙醇，用量为10-50ml/100g黄芩药材；

（3）分段收集，将乙醇溶液浓缩后用丙酮进行重结晶后分别得到10.7g黄芩素与1.2g汉黄芩素,经HPLC检测，黄芩素纯度为98.65%，汉黄芩素纯度为98.31%。

实施例6

一种从黄芩中同时分离汉黄芩素与黄芩素单体的方法，包括如下步骤：

（1）将500g黄芩药材粉碎，加入药材重量7倍量的蒸馏水和5gβ-葡萄糖苷酶（食用酶），控制温度50℃，酶解3小时；

（2）将蒸馏水过滤，黄芩药材装入超临界萃取釜，预热后，设定萃取压力为25Mpa，温度为50℃，萃取时间为3小时，夹带剂为乙醇，用量为150ml；

（3）分段收集，将乙醇溶液浓缩后用乙酸乙酯进行重结晶后分别得到10.1g黄芩素与1.3g汉黄芩素,经HPLC检测，黄芩素纯度为98.63%，汉黄芩素纯度为98.23%。

上述实施例1-6中所述各试剂及食用酶、夹带剂均为市售产品。各组分用量按照相同比例增加或减少，同样可以达到本发明的技术目的，属于本发明的保护范围。

上述参照具体实施方式对该一种从黄芩中同时分离汉黄芩素与黄芩素单体的方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种从黄芩中同时分离汉黄芩素与黄芩素单体的方法，其特征在于：具体步骤为：向黄芩中加入适量水以及食用酶进行酶解，将酶解后的药材进行超临界萃取，使用夹带剂分段收集，进行重结晶后可分别得到黄芩素与汉黄芩素，其中，所述食用酶为β-葡萄糖苷酶、β-D-葡萄糖醛酸酶、纤维素酶、苦杏仁酶、蜗牛酶的一种或任意组合而成的复合酶，所述夹带剂为乙醇、甲醇、丙酮或乙酸乙酯。

2.根据权利要求1所述的从黄芩中同时分离汉黄芩素与黄芩素单体的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）将黄芩药材粉碎，加入药材重量3-15倍量的蒸馏水和0.01-10%食用酶，控制温度在35-60℃，酶解1-10小时；

（2）将蒸馏水过滤，黄芩药材装入超临界萃取釜中，预热后，设定萃取压力为10-35Mpa，温度为40-60℃，萃取时间为1-5小时，夹带剂用量为5-100ml/100g黄芩药材；

（3）分段收集，将夹带剂溶液浓缩后用乙酸乙酯、石油醚或丙酮进行重结晶后可分别得到黄芩素与汉黄芩素。

3.根据权利要求1所述的从黄芩中同时分离汉黄芩素与黄芩素单体的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）将黄芩药材粉碎，加入药材重量3-15倍量的蒸馏水和0.1-3%食用酶，该食用酶为β-D-葡萄糖醛酸酶、β-葡萄糖苷酶或苦杏仁酶，控制温度在40-50℃，酶解2-8小时；

（2）将蒸馏水过滤，黄芩药材装入超临界萃取釜，预热后，设定萃取压力为15-28Mpa，温度为45-55℃，萃取时间为2-4小时，夹带剂为乙醇、甲醇或乙酸乙酯，用量为10-50ml/100g黄芩药材；

（3）分段收集，将夹带剂溶液浓缩后用乙酸乙酯或丙酮进行重结晶后可分别得到黄芩素与汉黄芩素。

4.根据权利要求1-3之一所述的从黄芩中同时分离汉黄芩素与黄芩素单体的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）将黄芩药材粉碎，加入药材重量7倍量的蒸馏水和1.0%β-D-葡萄糖醛酸酶，控制温度50℃，酶解3小时；

（2）将蒸馏水过滤，黄芩药材装入超临界萃取釜，预热后，设定萃取压力最优选为20Mpa，温度为50℃，萃取时间为3.5小时，夹带剂为乙醇，用量为40ml/100g黄芩药材；

（3）分段收集，将乙醇溶液浓缩后用乙酸乙酯进行重结晶后可分别得到黄芩素与汉黄芩素。

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