ES2763237T3 - Conjugados de péptidos de RGD y fotosensibilizantes de (bacterio)clorofila y sus usos - Google Patents

Conjugados de péptidos de RGD y fotosensibilizantes de (bacterio)clorofila y sus usos Download PDF

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Abstract

Un conjugado de un péptido que contiene RGD o un compuesto no peptídico que imita péptidos que tienen el patrón RGD (en la presente memoria péptidomimético de RGD) y un fotosensibilizante seleccionado de una clorofila o bacterioclorofila de la fórmula I, II o III:**Fórmula** en donde M representa 2H o un átomo seleccionado de Mg, Pd, Pt, Co, Ni, Sn, Cu, Zn, Mn, In, Eu, Fe, Au, Al, Gd, Er, Yb, Lu, Ga, Y, Rh, Ru, Si, Ge, Cr, Mo, P, Re, Tc o Tl y sus isótopos, preferiblemente 2H, Cu, Mn o Pd; X es O o N-R7; R1, R'2 y R6 cada uno independientemente es Y-R8, -NR9R'9 o -N+R9R'9R''9A-; o R1 y R6 juntos forman un anillo que comprende un resto de péptido de RGD o peptidomimétido de RGD; Y es O o S; R2 es H, OH o COOR9; R3 es H, OH, alquilo C1-C12 o alcoxi C1-C12; R4 es -CH=CR9R'9, -CH=CR9Hal, -CH=CH-CH2-NR9R'9, -CH=CH-CH2-N+R9R'9R"A-, -CHO, - CH=NR9, -CH=N+R9R'9A-, -CH2-OR9, -CH2-SR9, -CH2-Hal, -CH2-R9, -CH2-NR9R'9, -CH2-N+R9R'9R"9A-, -CH2- CH2R9, -CH2-CH2Hal, -CH2-CH2OR9, -CH2-CH2SR9, -CH2-CH2-NR9R'9, -CH2-CH2-N+R9R'9R"9A-, -COCH3, C(CH3)=CR9R'9, -C(CH3)=CR9Hal, -C(CH3)=NR9, -CH(CH3)=N+R9R'9A-, -CH(CH3)-Hal, -CH(CH3)-OR9, - CH(CH3)-SR9, -CH(CH3)-NR9R'9, -CH(CH3)-N+R9R'9 R'9A-, o -C≡CR9; R'4 es metilo o formilo; R5 es =O, =S, =N-R9, =N+R9R'9A-, =CR9R'9, o =CR9-Hal; R7, R8, R9, R'9 y R"9 es cada uno independientemente: (a) H; (b) hidrocarbilo C1-C25; (c) hidrocarbilo C1-C25 sustituido con uno o más grupos funcionales seleccionados de halógeno, nitro, oxo, OR, SR, epoxi, epitio, -NRR', -CONRR', -CONR-NRR', -NHCONRR', -NHCONRNRR', -COR, COOR", - OSO3R, -SO3R", -SO2R, -NHSO2R, -SO2NRR', =N-OR, -(CH2)n-CO-NRR', -O-(CH2)n-OR, -O-(CH2)n-O- (CH2)n-R, -OPO3RR', -PO2HR, y -PO3R"R", en donde n es un número entero de 1 a 6, y R y R' es cada uno independientemente H, hidrocarbilo o heterociclilo, R' puede ser además un resto de un péptido de RGD o un peptidomimético de RGD, o R y R' junto con el átomo de N al que están unidos forman un anillo saturado de 5-7 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo adicional seleccionado de O, S y N, en donde el átomo de N adicional puede estar sustituido, y R" es H, un catión, hidrocarbilo o heterociclilo; (d) hidrocarbilo C1-C25 sustituido con uno o más grupos funcionales seleccionados de grupos con carga positiva, grupos con carga negativa, grupos básicos que se convierten en grupos con carga positiva en condiciones fisiológicas y grupos ácido que se convierten en grupos con carga negativa en condiciones fisiológicas; (e) hidrocarbilo C1-C25 que contiene uno o más heteroátomos y/o uno o más restos carbocíclicos o heterocíclicos; (f) hidrocarbilo C1-C25 que contiene uno o más heteroátomos y/o uno o más restos carbocíclicos o heterocíclicos y sustituido con uno o más grupos funcionales como se ha definido antes en (c) y (d); (g) hidrocarbilo C1-C25 sustituido con un resto de un aminoácido, un péptido, una proteína, un monosacárido, un oligosacárido, un polisacárido o un ligando polidentado y sus complejos de quelación con metales; o (h) un resto de un aminoácido, un péptido, una proteína, un monosacárido, un oligosacárido, un polisacárido; o un ligando polidentado y sus complejos de quelación con metales; R7 puede ser además -NRR', en donde R y R' es cada uno H o hidrocarbilo C1-C25, opcionalmente sustituido con un grupo con carga negativa, preferiblemente SO3 -; R8 puede ser además H+ o un catión R+10 cuando R1, R'2 y R6 es cada uno independientemente Y-R8; R+10 es un metal, un grupo amonio o un catión orgánico; A- es un anión fisiológicamente aceptable; m es 0 o 1; la línea de trazos en las posiciones 7-8 representa un doble enlace opcional; y sales farmacéuticamente aceptables e isómeros ópticos de los mismos; en donde dicho derivado de clorofila o bacterioclorofila de fórmula I, II o III contiene al menos un resto de péptido que contiene RGD o resto peptidomimético de RGD, en donde dicho péptido que contiene RGD es un péptido lineal o cíclico todo L, todo D o un L,D compuesto de 4-100, preferiblemente 5-50, 5-30, 5-20, más preferiblemente 4, 5, 6, 7, 9 o 25 restos aminoácido que pueden ser opcionalmente aminoácidos naturales o no naturales modificados, y dicho peptidomimético de RGD es un compuesto no peptídico que comprende una guanidina y un grupo carboxilo terminal espaciado por una cadena de 11 átomos, siendo átomos de carbono al menos 5 de dichos átomos, dicha cadena comprende uno o más átomos de O, S o N y puede estar opcionalmente sustituida con oxo, tioxo, halógeno, amino, alquilo C1-C6, hidroxilo o carboxilo o uno o más átomos de dicha cadena pueden formar un anillo carbocíclico o heterocíclico de 3-6 miembros.

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados de péptidos de RGD y fotosensibilizantes de (bacterio)clorofila y sus usos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a fotosensibilizantes y, en particular, a nuevos conjugados de clorofila y derivados de bacterioclorofila con péptidos que contienen el motivo RGD o con peptidomiméticos de RGD, a su preparación y su uso en métodos de terapia fotodinámica y diagnóstico de tumores y diferentes enfermedades vasculares tales como la degeneración macular asociada a la edad.
Definiciones y abreviaturas
DMAE: degeneración macular asociada a la edad; BChl a: bacterioclorofila a: 7,8,17,18-tetrahidroporfirina pentacíclica con un 5° anillo isocíclico, un átomo de Mg central, un grupo fitilo o geranilgeranilo en posición 173, un grupo COOCH3 en la posición 132, un átomo de H en la posición 132, grupos metilo en las posiciones 2, 7, 12, 18, un grupo acetilo en la posición 3 y un grupo etilo en la posición 8, en la presente memoria el compuesto i ; Bphe: bacteriofeofitina a (Bchl en la que el Mg central se reemplaza por dos átomos de H); Bpheid: bacteriofeoforbida a (el ácido carboxílico libre C-172 derivado de Bphe sin el átomo metálico central); Chl: clorofila; EC: células endoteliales; ECM: matriz extracelular; NIR: infrarrojo cercano; Pd-Bpheid: Pdbacteriofeoforbida a; PDT: terapia fotodinámica; RGD-4C: el nonapéptido cíclico CDCRGDCFC-NH2; Rodobacterioclorina: 7,8,17,18-tetrahidroporfirina tetracíclica que tiene un grupo -CH2CH2COOH en la posición 17, un -COOH en la posición 13, grupos metilo en las posiciones 2, 7, 12, 8 y grupos etilo en las posiciones 3 y 8; ROS: especies de oxígeno reactivas; VTI: generación de imagen dirigida vascular; VTP: PDT dirigida vascular.
Se usa la numeración IUPAC de los derivados de bacterioclorofila en toda la memoria descriptiva. Usando esta nomenclatura, las bacterioclorofilas naturales llevan dos ésteres de ácido carboxílico en las posiciones 132 y 172, sin embargo, están esterificados en las posiciones 133 y 173.
Antecedentes de la invención
La terapia fotodinámica (PDT) es un tratamiento no quirúrgico de tumores en el que se combinan fármacos no tóxicos y radiación fotosensibilizante no peligrosa para generar especies de oxígeno reactivas citotóxicas in situ. Esta técnica es más selectiva que la quimioterapia y la radioterapia tumoral usadas normalmente.
La PDT de tumores implica la combinación de fotosensibilizantes administrados y suministro de luz local, ambos agentes inocuos por sí mismos, pero en presencia de oxígeno molecular son capaces de producir especies de oxígeno reactivas citotóxicas (ROS) que pueden inactivar las células. Al ser una modalidad de tratamiento binario, la PDT permite una mayor especificidad y tiene el potencial de ser más selectiva, pero no menos destructiva, en comparación con la quimioterapia o radioterapia usadas normalmente (Dougherty et al., 1998; Bonnett et al., 1999; Kessel y Dougherty, 1999; Mazon, 1999; Hahn y Glatstein, 1999).
Las porfirinas se han empleado como los principales agentes fotosensibilizantes en las clínicas. La penetración óptima del tejido por la luz parece que ocurre entre 650-800 nm. El porfímero sódico (Photofrin®, una marca registrada de Axcan Pharma Inc.), el primer agente de terapia fotodinámica aprobado del mundo, que se obtiene a partir de la hematoporfirina-IX por tratamiento con ácidos y ha recibido la aprobación de la FDA para el tratamiento de cánceres esofágico y de pulmón no microcítico endobronquial, es una mezcla compleja e inseparable de monómeros, dímeros y oligómeros superiores.
Se han dedicado grandes cantidades de trabajo a la síntesis de compuestos puros individuales, los llamados sensibilizantes de "segunda generación", que absorben a longitudes de onda largas, tienen estructuras bien establecidas y presentan una mejor diferenciación entre su retención en células tumorales y su retención en la piel u otros tejidos normales. Con el fin de optimizar el rendimiento de los fármacos de porfirina en el tratamiento terapéutico y el diagnóstico, se han propuesto varios derivados de porfirina en los que, por ejemplo, hay un átomo metálico central (distinto del Mg) complejado con los cuatro anillos de pirrol y/o los sustituyentes periféricos de los anillos de pirrol están modificados y/o el macrociclo está dihidrogenado a derivados de clorofila (clorinas) o tetrahidrogenado a derivados de bacterioclorofila (bacterioclorinas).
Debido a su intensa absorción en regiones espectrales favorables (650-850 nm) y su fácil degradación después del tratamiento, los derivados de clorofila (Chl) y bacterioclorofila (BChl) se han identificado como excelentes sensibilizantes para la PDT de tumores y tienen propiedades superiores en comparación con las porfirinas. Las bacterioclorofilas son una ventaja potencial en comparación con las clorofilas porque muestran bandas intensas en el infrarrojo cercano, es decir, a longitudes de onda considerablemente más largas que los derivados de clorofila.
Direccionamiento vascular tumoral
Los reactivos fotodinámicos dirigidos para la destrucción de la vasculatura tumoral, a diferencia de las propias células tumorales, pueden ofrecer ventajas terapéuticas puesto que el crecimiento y desarrollo de las células tumorales depende de manera crítica del suministro continuo de oxígeno y nutrientes (Ruoslahti, 2002). Dicho daño vascular puede incluir la formación de trombos y restringir aún más la perfusión de sangre al tumor (Huang et al., 1997). Además, se espera que al dirigirse a la capa de células endoteliales (EC) vasculares tumorales se evite la poca penetración en el estroma tumoral de las macromoléculas terapéuticas (Huang et al., 1997; Burrows y Thorpe 1994). Aunque los vasos sanguíneos tumorales pueden ser afectados por el microambiente tumoral y adquirir una "firma" asociada al tumor, no son malignos y es menos probable que desarrollen resistencia a fármacos. Además, cuando un agente antivascular dirigido también es activo contra las células tumorales, se pueden esperar ganancias adicionales en eficacia. Por lo tanto, al combinar propiedades antivasculares con actividades citotóxicas antitumorales en un fármaco, se puede esperar que su eficacia aumente y, por consiguiente, disminuya la dosis citotóxica efectiva requerida. Además de las EC, en un caso también se ha mostrado que las células tumorales comprenden parte del mosaico de la superficie luminal de los vasos sanguíneos tumorales (Ruoslahti, 2002; Chang et al., 2000). Por consiguiente, se cree que estas células tumorales están expuestas directamente a la sangre e interaccionan libremente con macromoléculas terapéuticas que de otro modo no podrían cruzar la barrera endotelial.
El direccionamiento vascular selectivo se puede basar en la susceptibilidad diferencial y la consiguiente respuesta a los agentes terapéuticos de los vasos sanguíneos tumorales y normales. Alternativamente, la endocitosis diferencial puede promover la absorción selectiva de agentes citotóxicos u otros agentes terapéuticos. Estudios recientes han sugerido propiedades específicas de órganos/tejidos para las EC vasculares (Ruoslahti, 2002). Es probable que los vasos sanguíneos en diferentes tejidos expresen marcadores endoteliales específicos de tejido que son mayormente desconocidos. Los procesos patológicos tales como la inflamación, isquemia y tumor maligno también pueden imponer su firma en la respectiva vasculatura (Ruoslahti, 2002; Ruoslahti y Rajotte, 2000; Ruoslahti, 2000; Rajotte et al., 1998; Arap et al., 1998). Las características bioquímicas que caracterizan los vasos sanguíneos en los tumores pueden incluir moléculas relacionadas con la angiogénesis, tal como ciertas integrinas. Las integrinas avp3, avp5y a5p1 se han identificado en los patrones de expresión típicos de las EC vasculares angiogénicas asociadas con tumores, heridas, tejido inflamatorio y durante la remodelación vascular (Brooks et al, 1994a; Brooks et al, 1994b; Brooks et al, 1995; Elceiri y Cheresh, 1999). También se han descrito receptores del factor de crecimiento de células endoteliales, proteasas, peptidasas, proteoglicanos de superficie celular y componentes de la matriz extracelular (ECM) (Ruoslahti, 2000). Este rico repertorio de moléculas y procesos heterogéneos puede proporcionar nuevas oportunidades para la administración dirigida de tratamientos.
Se han seguido diferentes estrategias para lograr este objetivo. Los péptidos, peptidomiméticos o anticuerpos circulantes que se dirigen a sitios específicos en la vasculatura son atractivos como portadores para agentes terapéuticos y de diagnóstico que ofrecen ventajas teóricas frente a dichos conjugados que se dirigen directamente a las células tumorales, en su mayoría situadas más allá de las barreras fisiológicas tales como la pared de los vasos sanguíneos.
Chaleix et al., 2003, describen la síntesis de conjugados de RGD-porfirina como candidatos potenciales para la aplicación de PDT, en los que el macrociclo de porfirina no metalado está sustituido en cada una de las posiciones 10, 15, 20 con 4-metilfenilo o glucosiloxifenilo acetilado y en la posición 5 con un resto de un péptido lineal que contiene RGD unido al macrociclo por un brazo espaciador.
Captación selectiva de péptidos que contienen RGD por células endoteliales y tumorales a través de las integrinas avp3 y avp5
El motivo arginina-glicina-ácido aspártico Arg-Gly-Asp (RGD) de los componentes de la ECM, como la fibronectina (Pierschbacher y Ruoslahti, 1984) y la vitronectina, se une a las integrinas (Ruoslahti y Pierschbacher, 1987; D'Souza SE et al., 1991; Joshi et al., 1993; Koivunen et al., 1994). La adhesión mediada por integrina conduce a sucesos de señalización intracelular que regulan la supervivencia, proliferación y migración celular. Se conocen unas 25 integrinas, y al menos ocho de ellas se unen al motivo RGD como la secuencia de reconocimiento primaria en sus ligandos.
Los datos obtenidos por métodos de presentación en fagos (Pasqualini y Ruoslahti, 1996) para el cribado de péptidos que contienen RGD, han mostrado su unión selectiva al revestimiento endotelial de los vasos sanguíneos tumorales (Ruoslahti, 1996; Pasqualini et al., 1997). Debido a que se describe que la expresión de integrinas es alta en las EC activadas, pero más restringida en inactivas, se han propuesto péptidos sintéticos pequeños que contienen RGD como antagonistas que dificultan el crecimiento de las células tumorales y endoteliales vasculares. Los péptidos con RGD también retardan la transmisión de señales, afectan a la migración celular e inducen regresión o apoptosis de las células tumorales (Su et al., 2002). Los análogos de RGD se usan en la formación de imágenes tumorales (Haubner et al., 2001), planteamientos de antiangiogénesis (Kawaguchi et al., 2001; Pasqualini et al., 2000) y en el direccionamiento tumoral de radionucleótidos (van Hagen et al., 2000) y fármacos quimioterapéuticos (Arap et al., 1998; Zitzmann et al., 2002).
Las integrinas también se expresan en células de cáncer y, por lo tanto, tienen una función importante en la invasión, metástasis, proliferación y apoptosis de las células de cáncer. La invasión de metástasis de células tumorales en órganos preferidos puede representar fenómenos de retorno de células que dependen de la interacción adhesiva entre las células tumorales y marcadores endoteliales específicos de órganos (Ruoslahti y Rajotte, 2000). Al unirse a la integrina de las células endoteliales o tumorales, los péptidos de RGD son capaces de modular el tráfico celular in vivo por inhibición de las uniones de células tumorales-ECM y células tumorales-EC, que son obligatorias para los procesos metastásicos. Varios estudios han indicado que los compuestos que contienen RGD pueden interferir con los procesos metastásicos de células tumorales in vitro (Goligorsky et al., 1998; Romanov y Goligorsky 1999) e in vivo (Saiki et al., 1989; Hardan et al., 1993).
Los péptidos que son específicos para integrinas individuales son de considerable interés y de posible importancia médica. La integrina avp3 fue la primera integrina que se mostró asociada con la angiogénesis tumoral. Los péptidos de RGD que bloquean específicamente la integrina avp3 se muestran prometedores como inhibidores de la angiogénesis tumoral y retiniana, de la osteoporosis y en el direccionamiento de fármacos a la vasculatura tumoral (Assa-Munt et al., 2001). El acoplamiento del fármaco antineoplásico doxorrubicina o un péptido proapoptótico a un péptido de RGD que se une a la integrina avp3 produce compuestos que son más activos y menos tóxicos que los fármacos no modificados cuando se prueban contra tumores de xenoinjerto en ratones (Ruoslahti, 2000; Arap et al., 1998; Arap et al., 2002; Ellerby et al., 1999).
El documento US 6576239, la patente europea EP 0927045 B1 y la publicación internacional WO 98/010795 (todos los inventores del Instituto Burnham: E. Ruoslahti y R. Pasqualini) describen un conjugado que comprende un péptido de retorno tumoral que comprende la secuencia de aminoácidos RGD o NGR, dicho péptido de retorno tumoral unido a un resto terapéutico o de diagnóstico, con la condición de que dicho resto no sea una partícula de fago. El resto terapéutico puede ser un agente citotóxico o un agente quimioterapéutico contra el cáncer tal como doxorrubicina. El conjugado se dirige selectivamente a la vasculatura angiogénica tras la administración in vivo. El péptido de retorno tumoral puede ser un péptido de hasta 20 o 30 aminoácidos o de 50 a 100 aminoácidos de longitud, lineal o cíclico. Un péptido preferido es el nanopéptido cíclico, CDCRGDCFC o H-Cys*-Asp-Cys*-Arg-Gly-Asp-Cys*-Phe-Cys*-NH2.
Respuesta vascular selectiva inducida en tumores por terapia fotodinámica (PDT)
El grupo de los autores de la invención ha descrito en los últimos años aplicación de nuevos derivados de bacterioclorofila (Bchl) como sensibilizantes en PDT en la bibliografía científica (Zilberstein et al., 2001; Schreiber et al., 2002; Gross et al., 1997; Zilberstein et al., 1997; Rosenbach-Belkin et al., 1996; Gross et al., 2003a; Koudinova et al., 2003; Preise et al., 2003; Gross et al., 2003b) y en las publicaciones de patentes US 5 726 169 US 5650292, US 5955585, US 6147195, US 6740637, US 6333319, US 6569846, US 7045 117, DE 41 21 876, EP 1246 826, WO 2004/045492, WO 2005/120573. Los espectros, la fotofísica y la fotoquímica de los derivados de Bchl los han convertido en moléculas óptimas de captación de luz con claras ventajas frente a otros sensibilizantes usados actualmente en PDT. Estos derivados de Bchl son en su mayoría polares y permanecen en la circulación durante un tiempo muy corto sin prácticamente extravasaciones en otros tejidos (Brandis et al., 2003). Por lo tanto, estos compuestos son buenos candidatos para la PDT dirigida vascular que se basa en un encuentro intravascular temporal corto (5-10 min) con luz y una mayor susceptibilidad de los vasos tumorales a las ROS citotóxicas generadas por la PDT.
Estudios recientes llevados a cabo por el grupo de los autores de la invención mostraron que la fotosensibilización primaria es intravascular con un desarrollo rápido de oclusiones isquémicas y estasis dentro del período de iluminación. Este proceso también induce la peroxidación lipídica inducida fotoquímicamente (LPO) y la muerte temprana de EC que se limita principalmente a la vasculatura tumoral (Gross et al., 2003a; Koudinova et al., 2003). Debido a la ligera progresión independiente de las reacciones en cadena de radicales libres junto con el desarrollo de hipoxia, la LPO y la muerte celular se extendieron más allá del compartimento vascular para cubrir todo el intersticio del tumor hasta que se alcanza la necrosis completa del tumor alrededor de 24 horas después de la PDT. Por lo tanto, la acción primaria de la PDT bloquea el suministro de sangre e induce hipoxia que inicia, de manera secundaria, una serie de sucesos moleculares y fisiopatológicos que culminan con la erradicación del tumor.
Las mitocondrias, lisosomas, membrana plasmática y núcleos de las células se han evaluado como posibles objetivos de la PDT. Puesto que la mayoría de los sensibilizantes de PDT no se acumulan en núcleos celulares, la PDT en general tiene un potencial bajo de causar daño al ADN, mutaciones y carcinogénesis. Es probable que los sensibilizantes hidrófilos sean absorbidos por pinocitosis y/o endocitosis y, por lo tanto, se localicen en lisosomas o endosomas. Después, la exposición a la luz permeabilizará los lisosomas para que los sensibilizantes y las enzimas hidrolíticas se liberen en el citosol (Dougherty et al., 1998).
El daño de la PDT a la membrana plasmática se puede observar en minutos después de la exposición a la luz. Este tipo de daño se pone de manifiesto como hinchazón, desprendimiento de vesículas que contienen enzimas marcadoras de la membrana plasmática, enzimas citosólicas y enzimas lisosómicas, reducción del transporte activo, despolarización de la membrana plasmática, inhibición de las actividades de las enzimas de la membrana plasmática, cambios en el Ca2+ intracelular, regulación por aumento y por disminución de antígenos de superficie, LPO que puede conducir a la reticulación de proteínas y daños a transportadores de múltiples fármacos (Dougherty et al., 1998).
Los informes de que la PDT podría inducir rápidamente la apoptosis, tanto in vitro como in vivo, han proporcionado conocimiento sobre la naturaleza de los mecanismos de fotodestrucción. El conocimiento sobre el mecanismo de la apoptosis después de la PDT quizás lo han proporcionado informes que indican una asociación entre el fotodaño mitocondrial y las respuestas apoptóticas. Estudios recientes realizados por el grupo de los autores de la invención mostraron que los fotosensibilizantes basados en Bchl inducen la activación de la ruta apoptótica. Sin embargo, probablemente la apoptosis no es la causa de la muerte celular, ya que la inhibición de las rutas apoptóticas no rescataba las células (Mazor et al. 2003, no publicado).
Chaleix et al., 2003 (Eur. J. Org Chem., Vol. 8: 1486-1493) describen conjugados de RGD-porfirina como potenciales candidatos para la PDT, en los que el macrociclo de porfirina no metalado está sustituido en cada una de las posiciones 10,15, 20 con 4-metilfenilo o glucosiloxifenilo acetilado y en la posición 5 con un resto de un péptido lineal que contiene RGD unido al macrociclo por un brazo espaciador. Chaleix et al., 2004 (Tetrahedron Letters, vol. 45: 5295-5299), describen la síntesis en fase sólida de porfirinas glucosiladas que llevan un pseudopentapéptido cíclico que incorpora una secuencia de RGD obtenida por metatesis de cierre de anillo. Sternberg et al., 1998 (Tetrahedron, vol. 54, n° 17: 4151-4202) revisan la síntesis y las propiedades de una amplia variedad de fotosensibilizantes basados en porfirina, incluyendo porfirinas, clorinas y bacterioclorinas, que se han usado o sugerido como fotosensibilizantes en la PDT. Frochot et al., 2007 (Bioorganic Chemistry, vol. 35, no. 3: 205-220) describen un péptido lineal o cíclico que contiene RGD dirigido a la teterafenilclorina como sensibilizantes para la PDT selectiva.
Se hace referencia a las siguientes patentes y solicitudes de patentes de los autores de la invención de la presente solicitud: US 5726 169 US 5650292, US 5955 585, US 6 147 195, US 6740637, US 6333319, US 6569846, US 7045 117, DE 41 21 876, EP 1246826, WO 2004/045492, WO 2005/120573.
Compendio de la invención
La presente invención se refiere a un conjugado de un péptido que contiene RGD o un peptidomimético de RGD y un fotosensibilizante seleccionado de clorofila y bacterioclorofila.
En una realización, el fotosensibilizante es una clorofila o bacterioclorofila de las fórmulas I, II y III de la presente memoria.
La invención proporciona además una composición de diagnóstico, terapéutica o radioterapéutica para visualización, terapia PDT o radioterapia de tejidos u órganos, que comprende una cantidad eficaz de un conjugado de fotosensibilizante-péptido de RGD de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Los conjugados de la invención se pueden usar en métodos para el diagnóstico de tumores usando diferentes técnicas de diagnóstico y en métodos de terapia fotodinámica de tumores y enfermedades vasculares y en radioterapia tumoral.
Breve descripción de las figuras
Las figs. 1A-1C muestran espectros de caracterización del conjugado 11 Fig. 1A: Medición de espectrometría de masas. Fig. 1B: Análisis de espectrofotometría. Fig. 1C: Resultados de HPLC después de la síntesis (el conjugado 1_1 es el pico número 3).
Las figs. 2A-2B muestran espectros de caracterización del compuesto 9. Fig. 2A: Espectro electrónico en acetona. Fig. 2B: Espectro de masas: ESI-MS (+) 679 (M), 702 (M Na) m/z.
Las figs. 3A-3B muestran la purificación y caracterización de Eu-RGD-4C. Fig. 3A: Cromatografía de Eu-RGD-4C (un solo pico). Fig. 3B: Análisis de espectrometría de masas (MW de isotiocianatofenil-DTPA-Eu-RGD-4C = 1498, flecha).
La Fig. 4 muestra los resultados de un ensayo de unión al receptor. La actividad de unión específica de Eu-RGD-4C libre al receptor de integrina se midió usando células H5V en ausencia (unión total) o presencia de RGD-4C 1 |jM (unión no específica).
La Fig. 5 muestra el análisis Scatchard de Eu-RGD-4C unido (B) y libre (F) basado en los resultados del ensayo de unión al receptor descrito en la Fig. 4.
La Fig. 6 muestra los resultados de un ensayo de receptor en fase sólida que mide la unión de Eu-RGD-4C al receptor de integrina ayp 3 aislado. Se usó fluorometría resuelta en el tiempo para la determinación de fluorescencia.
Las figs. 7A-7B muestran el efecto de RGD-4C en el desprendimiento de células endoteliales H5V. Los cambios morfológicos de las células se documentaron usando microscopía óptica. 5% de células redondeadas (n = 200) después de la incubación en ausencia (Fig. 7A) y 99% en presencia de RGD-4C (Fig. 7B) Después de reemplazar el medio con uno nuevo e incubar durante 3 a 37°C, el % de células redondeadas (n = 200) en ausencia y en presencia de RGD-4C era del 6% y 8%, respectivamente (no mostrado).
La Fig. 8 muestra el efecto de RGD-4C en el desprendimiento de HUVEC. Los cambios morfológicos de las células se documentaron usando microscopía óptica. Los paneles superiores a-e representan la microscopía de contraste de fase del desprendimiento celular en presencia de concentraciones crecientes de RGD-4C (a: control; b: 25 |jM; c: 50 |jM; d: 100 |jM; e: 200 |jM). Los paneles inferiores representan la recuperación de las células 24 h después de la sustitución del medio por uno nuevo.
La Fig. 9 muestra la captación y localización celular del conjugado 24 en células endoteliales H5V como se representa en una fotografía trans (a), una imagen de fluorescencia (b) (filtro de excitación: 520 nm; filtro de emisión: 780 nm) y una fusión de la fotografía y la imagen (c).
La Fig. 10 es una serie de imágenes de fluorescencia que muestran la captación y localización celular del conjugado 24 y el compuesto 8 en células endoteliales H5V medido 20 min (paneles superiores) o 2.5 horas (paneles inferiores) después de incubación con los compuestos en un medio que contiene 10% o 75% de FCS (filtro de excitación: 520 nm; filtro de emisión: 780 nm). (a) 8,10% de FCS; (b) 24, 10% de FCS; (c) 8, 75% de FCS; (b) 24, 75% de FCS.
Las figs. 11A-11D son una serie de gráficas que muestran la biodistribución del conjugado 24, inyectado por vía i.v. en ratones CD1 macho atímicos con xenoinjertos tumorales de glioma C6 de rata (11A; cada tiempo de medición representa 6 ratones), carcinoma de colon CT26luc de ratón (11B; cada tiempo de medición representa 2 ratones) y el carcinoma de mama 4T1luc de ratón (11C; cada tiempo de medición representa 3 ratones), sacrificados en los tiempos indicados. Las concentraciones de Pd en diferentes órganos se determinaron por ICP-MS. Los cuadros presentan ventanas de tiempo más adecuadas para la PDT y mediciones de imágenes.
La Fig. 12 muestra la biodistribución del compuesto 8, inyectado por vía i.v. (vena de la cola) en ratones macho atímicos CD1 con xenoinjertos tumorales de glioma c 6 de rata, sacrificados en los tiempos indicados. Las concentraciones de Pd se determinaron por ICP-MS.
La Fig. 13 muestra la biodistribución del conjugado de Cu 15 en ratones que llevan tumor de mama MDA-MB-231. Los animales se sacrificaron en los tiempos de medición seleccionados. Las concentraciones de Cu se muestran en el tiempo de medición seleccionado, después de restar el tiempo 0, como un valor promedio de tres animales.
Las figs. 14A-14B son gráficas que muestran la biodistribución del conjugado 42 (que contiene el motivo RAD), inyectado por vía i.v. en ratones macho atímicos CD1 con injertos tumorales de carcinoma de colon CT26luc de ratón, sacrificados en los tiempos indicados. Las concentraciones de Pd en diferentes órganos se determinaron por ICP-MS. Fig. 14A resultados de ICP-MS para el conjugado 42. Cada tiempo de medición representa 2 ratones. La Fig. 14B muestra los mismos resultados centrándose en órganos específicos de interés (sangre, tumor, hígado, riñones y músculos) en comparación con los resultados obtenidos para el conjugado de RGD 24 (véanse las figs. 11A-11D).
La Fig. 15 muestra una comparación de imágenes de fluorescencia de NIR de cuerpo entero después de la administración del compuesto 8 (paneles superiores) o del conjugado 24. Las imágenes dadas ilustran la fluorescencia de un ratón que lleva xenoinjerto de glioma C6 de rata en la parte trasera de la extremidad posterior derecha (a) 4 horas, (b) 24 horas, (c) 48 horas y (d) 72 horas después de la inyección de dosis de 200 nmol de conjugado 24 o compuesto 8. Los tumores se indican con flechas y todas las imágenes están normalizadas respecto a la misma escala.
Las figs. 16A-16C son una fotografía (16A), una imagen de fluorescencia (16B) y una imagen de luminiscencia (luciferasa+luciferina; 16C) de un ratón que lleva, en la extremidad anterior derecha, un xenoinjerto subcutáneo de cáncer de colon CT26luc (transfectado con luciferasa) 24 horas después de inyección de dosis de 200 nmol del conjugado 24. Las imágenes de fluorescencia y luminiscencia se adquirieron usando el sistema IVIS.
Las figs. 17A-17C muestran fotografías (17A) e imágenes de fluorescencia (17B) y bioluminiscencia (17C) de dos ratones que llevan injertos subcutáneos de cáncer de glándula mamaria 4T1luc de ratón (transfectado con luciferasa) en la extremidad anterior derecha, 24 horas después de la inyección de 200 nmol de dosis de conjugado 24.
La Fig. 18 muestra la imagen de fluorescencia de un ratón que lleva xenoinjerto MLS de carcinoma de ovario, tomada 8 (panel izquierdo) y 14 (panel derecho) horas después de la inyección i.v. del conjugado 31. Las imágenes de fluorescencia y luminiscencia se adquirieron utilizando el sistema IVIS.
La Fig. 19 muestra imágenes de fluorescencia de dos ratones que llevan xenoinjerto de glioma C6 de rata 24 horas después de la administración de 140 nmol de conjugado 24 solo (ratón izquierdo), o una hora después de la inyección de 8.5 |jmol de péptido cicloRGDfK (ratón derecho). Cada ratón se ilustró desde arriba (panel superior, izquierda) y desde un lado (panel superior, derecha). También se muestra el acercamiento en las fotografías (panel inferior). Los círculos en las imágenes de fluorescencia indican la ubicación del tumor de glioma C6 de rata xenoinjertado.
La Fig. 20 muestra fotografías en blanco y negro (paneles superiores) e imágenes de fluorescencia (paneles inferiores) de ratones macho atímicos c D-1 con xenoinjertos CT26luc en la parte trasera de la extremidad posterior, 24 horas después de la administración del conjugado RGD 24 (paneles a, c) o conjugado RAD 42 (paneles b, d). Los tumores se indican con flechas y todas las imágenes están normalizadas respecto a la misma escala. Las imágenes de fluorescencia se adquirieron usando el sistema IVIS.
La Fig. 21 muestra fotografías en blanco y negro (paneles superiores) e imágenes de fluorescencia (paneles inferiores) de ratones que llevan xenoinjertos de (a) OVCAR 8, (b) CT26luc, (c) MLS y (d) 4T1luc en la parte trasera de la extremidad posterior, 24 horas después de la administración del conjugado 24. Los tumores se indican con flechas y todas las imágenes están normalizadas respecto a la misma escala.
La Fig. 22 muestra una fotografía (imagen superior, tomada usando una cámara digital) y una imagen de fluorescencia (imagen inferior) de la localización del conjugado 24 en metástasis pulmonar del tumor de cáncer de mama 4T1luc en ratón hembra BALB/c, 24 horas después de inyección i.v. del conjugado 24 (15 mg /kg). La señal de fluorescencia NIR se originó a partir de la localización del conjugado 24 tomada usando Imaging System Xenogen IVIS® 100.
Las figs. 23A-23I son una serie de fotografías (a), imágenes de bioluminiscencia (b) y fluorescencia (c) de metástasis pulmonares CT26luc en ratones macho atímicos CD-1 24 horas (A, B), 9 horas (C, D), 4 horas (E, F) después de inyección i.v. del conjugado 24 (15 mg/kg). Las imágenes G, H son de metástasis pulmonares de CT26luc en ratones macho atímicos CD-1 a los que no se inyectó el conjugado. La imagen I es de un ratón macho atímico CD-1 sin metástasis pulmonar 24 horas después de la inyección i.v. del conjugado 24. La imagen del medio es la señal de bioluminiscencia originada por la reacción de luciferina con las células tumorales transfectadas con luciferasa. La imagen de la derecha es la señal de fluorescencia NIR originada a partir de 24 tomada con Xenogen IVIS® Imaging System 100. Las flechas indican las metástasis pulmonares.
La Fig. 24 muestra fotografías en blanco y negro (a), imágenes de bioluminiscencia (b) y fluorescencia (c) de un ratón macho atímico CD-1 con tumor primario CT26luc en la parte trasera de su pierna izquierda y metástasis en el ganglio linfático cercano, 24 horas después de la inyección i.v. del conjugado 24 (15 mg/kg). La imagen central es la señal de bioluminiscencia originada por la reacción de luciferina con las células tumorales transfectadas con luciferasa. La imagen de la derecha es la señal de fluorescencia NIR originada a partir del conjugado 24 tomada con Xenogen IVIS® Imaging System 100. Las flechas indican las metástasis en los ganglios linfáticos.
Las figs. 25A-25C muestran la curva de supervivencia de dosis-respuesta de células H5V incubadas durante 90 minutos a 37°C con conjugado 23 0-25 jM o compuesto 10 en diferentes condiciones de medios: FCS al 10% en medio (Fig. 25A), medio de cultivo DMEM/F12 (Fig. 25B) o BSA 10 jM en medio (Fig. 25C) La supervivencia celular se determinó usando el ensayo de viabilidad de rojo neutro. Los puntos representan resultados promedio de tres repeticiones.
Las figs. 26A-26D muestran curvas de supervivencia de dosis-respuesta de células H5V incubadas durante 90 minutos a 37°C con compuesto 10 0-25 jM (figs. 16A, 16B) o conjugado 23 (figs. 26C, 26D) en ausencia o presencia de cicloRGDfK libre en exceso (100 veces hasta 1 mM), en diferentes condiciones de medios (10% de FCS en medio (figs. 26A, 27C) o BSA 10 jM en medio (figs. 26B, 26D)). La supervivencia celular se determinó usando el ensayo de viabilidad de rojo neutro. Los puntos representan resultados promedio de tres repeticiones.
Las figs. 27A-27B muestran curvas de supervivencia de dosis-respuesta de células H5V incubadas durante 15 minutos a 37°C (Fig. 27A) o 4°C (Fig. 27B) con conjugado 230-20 jM en FCS al 10% en medio en ausencia o presencia de exceso de cicloRGDfK libre (100 veces hasta 1 mM). La supervivencia celular se determinó usando el ensayo de viabilidad de rojo neutro. Los puntos representan resultados promedio de tres repeticiones.
La Fig. 28 muestra la curva de supervivencia de dosis-respuesta de células H5V incubadas durante 2 horas a 37°C con conjugado 240-25 jM en medio de cultivo DMEM/F12 con FCS al 10%. La supervivencia celular se determinó usando el ensayo de viabilidad de rojo neutro. Los puntos representan resultados promedio de tres repeticiones.
La Fig. 29 muestra la curva de supervivencia de dosis-respuesta de células H5V incubadas 90 min a 37°C con conjugado 110-20 jM o compuesto 8 (Pd-MLT) en BSA 10 jM en medio. La supervivencia celular se determinó usando el ensayo de viabilidad de rojo neutro. Los puntos representan resultados promedio de tres repeticiones.
Las figs. 30A-30B muestran curvas de supervivencia de dosis-respuesta de células H5V incubadas durante 90 minutos a 37°C con conjugado 1_10-10 jM (Fig. 30A) o compuesto 8 (Fig. 30B) en BSA 10 jM en medio en ausencia o presencia de exceso de RGD-4C (1 mM). La supervivencia celular se determinó usando el ensayo de viabilidad de rojo neutro. Los puntos representan resultados promedio de tres repeticiones.
Las figs. 31A-31E son imágenes de xenoinjertos de tumor de glioma C6 tratados con conjugado 24 o compuesto 8. Los ratones macho atímicos CD-1 que llevan xenoinjertos de glioma C6 se trataron como sigue: 31A. se inyectó el conjugado 24 por vía i.v. 15 mg/kg, 15 min de iluminación (90 J/cm2) 8 horas después de la inyección; paneles superiores: (a) pre PDT; (b) 2 días después de PDT; (c) 3 días después de PDT; (d) 4 días después de PDT; paneles inferiores: (a) 7 días después de PDT; (b) 9 días después de PDT; (c) 14 días después de PDT; (d) 18 días después de la PDT. 31B. se inyectó el conjugado 24 por vía i.v. 24 mg/kg, 10 min de iluminación (60 J/cm2) 8 horas después de la inyección; a, b, c y d en paneles superior e inferior como para 31A. 31C. Control oscuro: se inyectó el conjugado 24 por vía i.v. sin iluminación; a) antes de PDT, b) 5 días después de PDT. 31D. Control de luz: iluminación sin inyección de fotosensibilizante; a) antes de PDT, b) 5 días después de PDT. 31E. control de fotosensibilizante no conjugado - se inyectó el compuesto 8 por vía i.v.
9 mg/kg, 10 min de iluminación (60 J/cm2) 8 horas después de inyección, a) antes de PDT, b) 11 días después de PDT. Las imágenes se tomaron en el momento indicado después de la PDT.
Las figs. 32A-E muestran los resultados terapéuticos de aplicar 15 mg/kg, 10 min de iluminación (60 J/cm2), 8 horas después de inyección del conjugado 24 a ratones que llevan tumores CT26luc. 32A - se inyectó el conjugado 24 por vía i.v. 15 mg/kg, 10 min de iluminación (60 J/cm2) 8 horas después de inyección; a) antes de PDT, b) 1 día después de PDT; (c) 4 días después de PDT; (d) 8 días después de PDT; (e) 12 días después de PDT; (f) 19 días después de PDT. 32B: imágenes superpuestas tomadas después de inyección i.p. de luciferina en el ratón descrita en 32A, usando el sistema IVIS. La primera imagen es en blanco y negro, que da la fotografía del animal. La segunda imagen es una superposición de color de los datos de fotones emitidos. Todas las imágenes están normalizadas a la misma escala; (a) antes de PDT; (b) 1 día después de PDT; (c) 4 días después de PDT; (d) 8 días después de PDT. 32C - Cuantificación de la señal de bioluminiscencia (fotón/s/cm2) de los datos mostrados en 32B. 32D - control con compuesto 8 solo: se inyectó a los ratones por vía i.v. el compuesto 8 y se iluminaron después de 8 horas; (a) antes de PDT; (b) 2 días después de PDT. 32E - control con mezcla de compuesto 8 y cicloRGDfK: se inyectó a los ratones por vía i.v. mezcla de compuesto 8 con cicloRGDfK y se iluminaron después de 8 horas; (a) antes de PDT; (b) 2 días después de PDT. 32F -control con cicloRGDfK solo: se inyectó a los ratones por vía i.v. cicloRGDfK y se iluminaron después de 8 horas; (a) antes de PDT; (b) 2 días después de PDT. Las imágenes se tomaron en el momento indicado después de PDT.
La Fig. 33 muestra la curva de Kaplan-Mayer para los protocolos indicados en la Tabla 5 con asterisco.
Las figs. 34A-34B mostrar el cáncer de mama fluorescente MDA-MB-231 RFP clon 3 (resistente a la higromicina) después de 1 segundo y 3 segundos de exposición, respectivamente.
Las figs. 35A-35B muestran dos ejemplos representativos de la respuesta local del cáncer de mama humano MDA-MB-231-RFP a la PDT. A los ratones con xenoinjertos MDA-MB-231-RFP (~0.5 cm3) en sus lomos se les inyectó por vía i.v. 7.5 mg/kg de conjugado 13 y se iluminaron 8 h más tarde a través de la piel del ratón.
35A - Fotografías tomadas (a) el día 0 (antes del tratamiento) y después del tratamiento a los (b) 1, (c) 4, (d) 7, (e) 12 y (f) 90 días. El día 4 se observó necrosis parcial, el día 7 se observó aplanamiento del tumor, después de 90 días la herida caicatrizó y el animal se curó. A la derecha, fotografías del ratón el día 0 y después de 90 días. 35B - Imágenes de fluorescencia roja de cuerpo entero in vivo de ratones macho atímicos CD-1 que llevan tumor ortotópico MDA-MB-231-RFP. Las fotos se tomaron en los tiempos como en 35A. No se detectó señal 90 días después del tratamiento.
La Fig. 36 muestra acumulación de conjugado 13 en tumor primario ortotópico de mama humano MDA-MB-231-RFP (tamaño tumoral ~1 cm3). Se tomaron imágenes de 15 min a 24 horas después de la inyección del fármaco. Paneles superiores: imágenes de fluorescencia roja de cuerpo entero in vivo de ratones hembra atímicos CD-1 que llevan tumor ortotópico MDA-MB-231-RFP. Paneles inferiores: imágenes de fluorescencia NIR de cuerpo entero in vivo de la acumulación de conjugado 13. El fármaco no muestra acumulación específica en el tumor durante las primeras 24 horas. a a i -15 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4.5 h, 6 h, 7.5 h, 9 h, 24 h
La Fig. 37 muestra acumulación de conjugado 13 en tumor primario ortotópico de mama humano MDA-MB-231-RFP (tamaño tumoral ~1 cm3). Se tomaron imágenes del día 1 al 6 después de inyección del fármaco. Panel superior: imágenes de fluorescencia roja de cuerpo entero in vivo de ratones hembra atímicos CD-1 que llevan tumor ortotópico MDA-MB-231-RFP. Panel inferior: imágenes de fluorescencia NIR de cuerpo entero in vivo de la acumulación de conjugado 13. El fármaco muestra acumulación en el tumor, alcanzando una concentración máxima específicamente en el tumor desde el día 2 después de inyección a a i -1 h, 9 h, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días.
Descripción detallada de la invención
En un aspecto amplio, la presente invención se refiere a un conjugado de un fotosensibilizante seleccionado de clorofila (Chl) y bacterioclorofila (BChl) y un péptido que contiene RGD o un peptidomimético de RGD Un objeto de la presente invención es proporcionar conjugados de fotosensibilizantes que dirijan específicamente el sensibilizante a la vasculatura tumoral. Hay algunas ventajas en el direccionamiento del fotosensibilizante vascular frente al direccionamiento vascular con quimioterapia convencional. Primero, durante la acumulación de un fármaco convencional dirigido, a menudo está activo, a menos que sea un profármaco, mientras que el fotosensibilizante dirigido no está activo hasta que se ilumina localmente. En segundo lugar, un fármaco convencional dirigido se unirá y actuará también en objetivos indeseables que presentan la dirección de retorno, mientras que el fotosensibilizante dirigido se activará solo en el sitio iluminado relevante. Además, la PDT con fotosensibilizantes dirigidos a las firmas endoteliales neovasculares en el tumor puede ser notablemente selectiva para inducir la lesión fotodinámica de las EC.
Se ha descrito que la integrina avp3 tiene una función importante en la metástasis y angiogénesis tumorales, lo que implica el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasculaturas preexistentes durante el crecimiento tumoral. Esta integrina puede ser un marcador viable para el crecimiento y propagación tumoral. Por lo tanto, los métodos de formación de imágenes no invasivos para el seguimiento visual de la expresión de integrina avp 3 en tiempo real proporcionan oportunidades para valorar la intervención terapéutica, así como para la detección de metástasis.
Las integrinas conectan el citoesqueleto intracelular de las células con la matriz extracelular al reconocer el RGD. Los péptidos de RGD interaccionan con los sitios del receptor de integrina, que pueden iniciar procesos de señalización celular e influir en muchas enfermedades diferentes. Por lo tanto, el sitio de unión de integrina a RGD es un objetivo farmacéutico atractivo. La integrina avp 3 tiene un sitio de unión a RGD y los péptidos que contienen la secuencia RGD albergan y actúan como antagonistas de la integrina avp 3 . Por lo tanto, en una realización preferida de la invención, el péptido que contiene RGD es un antagonista de un receptor de integrina.
En los conjugados bifuncionales de la invención, el péptido que contiene RGD proporciona la propiedad de retorno mientras que el fotosensibilizante proporciona el efecto de la PDT. Estos conjugados deberían poder dirigir el sensibilizante a los neovasos de tumores sólidos primarios y posiblemente a metástasis respectivas para el diagnóstico y la destrucción fotodinámica. Además, pueden actuar como agentes antiangiogénicos e iniciar la destrucción apoptótica de células tumorales expuestas a la sangre y neoendoteliales.
Las expresiones "péptido que contiene RGD" o "péptido de RGD" se usan aquí de manera intercambiable y significan un péptido que contiene la secuencia RGD, también denominada motivo RGD. La expresión "peptidomimético de RGD" como se usa en la presente memoria se refiere a compuestos, particularmente, compuestos no peptídicos, que imitan péptidos que tienen el motivo RGD.
El péptido que contiene RGD puede ser un péptido lineal o cíclico todo L, todo D o L,D compuesto de 4-100, preferiblemente 5-50, 5-30, 5-20 o, más preferiblemente, 5-10, restos de aminoácidos. En realizaciones preferidas, el péptido de RGD está compuesto de 4, 5, 6, 7, 9 o 25, lo más preferiblemente 5 restos de aminoácidos que pueden ser opcionalmente aminoácidos naturales modificados o no naturales.
Como se usa en la presente memoria, el término "aminoácido" incluye los 20 aminoácidos naturales así como aminoácidos no naturales.
Los ejemplos de aminoácidos naturales adecuados para la invención incluyen, pero no se limitan a, Ala, Arg, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Tyr y Val.
Los ejemplos de aminoácidos no naturales incluyen, pero no se limitan a, ácido 4-aminobutírico (Abu), ácido 2-aminoadípico, ácido diaminopropiónico (Dap), hidroxilisina, homoserina, homovalina, homoleucina, norleucina (Nle), norvalina (Nva), ornitina (Orn), TIC, naftilalanina (Nal), derivados metilados en anillo de Phe, derivados halogenados de Phe u o-metil-Tyr.
El término "aminoácido" en la presente memoria incluye también aminoácidos modificados, tal como modificaciones que ocurren post-traduccionalmente in vivo, por ejemplo, hidroxiprolina, fosfoserina y fosfotreonina; D-modificación; N-alquilación, preferiblemente N-metilación, del enlace peptídico; acilación o alquilación del grupo amino terminal o del grupo amino libre de Lys; esterificación o amidación del grupo carboxi terminal o de un grupo carboxi libre de Asp o Glu; y esterificación o eterificación del grupo hidroxilo de Ser o Tyr.
El término "aminoácido" incluye los aminoácidos tanto D como L. Por lo tanto, los péptidos usados en los conjugados de la invención pueden ser todo D (excepto para la glicina), todo L o L,D-aminoácidos. Las modificaciones D así como la N-alquilación del enlace peptídico son las más beneficiosas para prevenir la escisión del péptido por enzimas en el organismo. En la presente invención, un D-aminoácido se indica con una letra minúscula como para el resto D-fenilalanina "f" en el péptido cicloRGDfK de la SEQ ID NO: 1 usado en la presente memoria.
La presente invención incluye también péptidos cíclicos. Los péptidos se pueden ciclar por una variedad de métodos, tal como la formación de disulfuros, sulfuros y, especialmente, la formación de lactama entre las funciones carboxilo y amino de los extremos N y C o las cadenas laterales de aminoácidos. La ciclación se puede obtener por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, por formación de enlaces amida, p. ej., incorporando Glu, Asp, Lys, Orn, ácido diaminobutírico (Dab), ácido diaminopropiónico (Dap) en varias posiciones en la cadena (enlaces -CO-NH o -NH-CO). La ciclación de una cadena principal a otra también se puede obtener por la incorporación de aminoácidos modificados de las fórmulas HN(CH2)n-COOH)-C(R)H-COOH o HN((CH2)n-NH2)-C(R)H-COOH, en donde n = 1-4, y además en donde R es cualquier cadena lateral natural o no natural de un aminoácido.
La ciclación también se puede obtener por formación de enlaces S-S mediante la incorporación de dos restos Cys. Se puede obtener una ciclación adicional de una cadena lateral a otra por formación de un enlace de interacción de la fórmula -(CH2VS-CH2-CO-, en donde n = 1 o 2, que es posible, por ejemplo, por la incorporación de Cys u homoCys y reacción de su grupo SH libre con, p. ej., Lys, Orn, Dab o Dap bromoacetilados.
En algunas realizaciones, los péptidos de RGD pueden ser los descritos en el documento US 6576239 y la patente europea EP 0927045.
En una realización preferida, el péptido usado según la invención es el pentapéptido cíclico RGDfK de SEQ ID NO: 1, en donde "f" indica un resto D-Phe.
En otra realización preferida, el péptido es el nonapéptido cíclico CDCRGDCGC de SEQ ID NO: 2, designado en la presente memoria "RGD-4C", que contiene cuatro restos cisteína que forman dos enlaces disulfuro en la molécula, y es uno de los péptidos prometedores con especificidad por integrinas. Se demostró que este péptido es un ligando selectivo y potente (constante de afinidad de ~100 nM) de las integrinas avp5 y avp3 (Ruoslahti, 2002; Elceiri y Cheresh, 1999).
El resto ácido aspártico del motivo RGD es muy propenso a la degradación química, lo que conduce a la pérdida de actividad biológica, y esta degradación se podría evitar por ciclación a través del enlace disulfuro (Bogdanowich-Knipp et al., 1999). Junto con la mejora de la estabilidad, los péptidos cíclicos dobles muestran una mayor potencia en comparación con el puente disulfuro simple y los péptidos lineales para inhibir la unión de vitronectina a las células. Es probable que la alta actividad del péptido de RGD cíclico doble se deba a una conformación adecuadamente restringida no solo del motivo RGD sino también de los aminoácidos que flanquean. El número y la naturaleza de los restos que flanquean la secuencia RGD en péptidos sintéticos tiene una influencia significativa en cómo es reconocida esa secuencia por los receptores de integrina individuales (Koivunen et al., 1995; Pierschbacher y Ruoslahti, 1987). Un resto aromático puede ser particularmente significativo para hacer contactos favorables en el sitio de unión de la integrina (Koivunen et al., 1995). Los péptidos de RGD cíclicos dirigidos para avp3 son internalizados por una ruta de endocitosis en fase fluida independiente de integrinas que no altera el número de receptores de integrina funcionales en la superficie celular. Además, los péptidos de RGD cíclicos permanecen o se degradan en el lisosoma, en un proceso que alcanza la saturación después de 15 minutos, y solo una pequeña porción puede salir del lisosoma y llegar al citoplasma celular. Esto explica por qué los péptidos de RGD cíclicos se encuentran en el citoplasma celular solo después de un cierto período de tiempo (48 a 72 horas) (Hart et al., 1994; Castel et al., 2001).
En otras realizaciones preferidas, el péptido de RGD se selecciona de los péptidos cíclicos: (i) tetrapéptido cicloRGDK (SEQ ID n O: 4), pentapéptido cicloRGDf-n(Me)K (SEQ ID NO: 7), en donde f indica D-Phe y el enlace peptídico entre f y K está metilado; y pentapéptido cicloRGDyK (SEQ ID NO: 8), en donde y indica D-Tyr.
En otra realización, el péptido que contiene RGD es lineal y se puede seleccionar del hexapéptido GRGDSP (SEQ ID NO: 3), el heptapéptido GRGDSPK (SEQ ID NO: 5) y el oligómero de 25 unidades (GRGDSP)4K (SEQ ID NO: 7)
En una realización de la invención, el péptido de RGD está unido directamente al fotosensibilizante macrociclo clorofila o bacterioclorofila por un grupo funcional en su periferia, por ejemplo, COOH, formando un grupo amida CO-NH2 con el grupo amino terminal o un grupo amino libre del péptido de RGD.
En otra realización, el péptido de RGD está unido al macrociclo fotosensibilizante por un brazo espaciador/grupo puente tal como, pero no limitado a un hidrocarbileno C1-C25, preferiblemente un alquileno C-i-C10o fenileno, sustituido por un grupo funcional terminal tal como OH, COOH, SO3H, COSH o NH2, formando así un grupo éter, éster, amida, tioamida o sulfonamida.
En algunas realizaciones, el fotosensibilizante se conjuga con un peptidomimético de RGd.
En una realización preferida, el peptidomimético de RGD es un compuesto no peptídico que comprende una guanidina y un grupo carboxilo terminal espaciados por una cadena de 11 átomos, siendo átomos de carbono al menos 5 de dichos átomos, y dicha cadena comprende uno o más átomos de O, S o N y opcionalmente puede estar sustituida con oxo, tioxo, halógeno, amino, alquilo C1-C6, hidroxilo o carboxilo o uno o más átomos de dicha cadena pueden formar un anillo carbocíclico o heterocíclico de 3-6 miembros. Los compuestos de este tipo se describen en la publicación internacional WO 93/09795 del mismo solicitante.
En realizaciones preferidas, el peptidomimético de RGD anterior comprende en la cadena átomos de N y está sustituido con un grupo oxo. En una realización más preferida, el peptidomimético de RGD tiene la fórmula mostrada en el conjugado 40 en la presente memoria:
H2N-C(=NH)NH-(CH2)5-CO-NH-CH(CH2)-(CH2)2-COOH
En otra realización, el peptidomimético de RGD tiene la fórmula mostrada en el conjugado 41 en la presente memoria.
En una realización, el fotosensibilizante es un derivado de clorofila o bacterioclorofila que puede ser un derivado natural o sintético no natural de clorofila o bacterioclorofila, incluyendo compuestos en los que se han hecho modificaciones en el macrociclo, y/o en la periferia y/o el átomo central de Mg puede estar ausente o se sustituye por otro átomo de metal adecuado para el fin de diagnóstico y/o para el fin de la PDT.
En realizaciones preferidas, la invención se refiere a un conjugado en donde el fotosensibilizante es una clorofila o bacterioclorofila de las fórmulas I, II o III:
Figure imgf000011_0001
M representa 2H o un átomo seleccionado del grupo que consiste en Mg, Pd, Pt, Co, Ni, Sn, Cu, Zn, Mn, In, Eu, Fe, Au, Al, Gd, Er, Yb, Lu, Ga, Y, Rh, Ru, Si, Ge, Cr, Mo, P, Re yT c y sus isótopos;
X es O o N-R7;
Ri, R’2 y R6 cada uno independientemente es Y-R8, -NRgR'g o -N+RgR'gR'g A-o Ri y R6 en la fórmula II junto con los átomos de carbono a los que están unidos forman un anillo que comprende un péptido de RGD o peptidomimétido de RGD;
Y es O o S;
R2 es H, OH o COOR9;
R3 es H, OH, alquilo C1-C12 o alcoxi C1-C12;
R4 es -CH=CR9R'9, -CH=CR9Hal, -CH=CH-CH2-NR9R'9, -CH=CH-CH2-N+R9R'9R"9 A-, -CHO, -CH=NR9, -CH=N+R9R'9 A-, -CH2-OR9, -CH2-SR9, -CH2-Hal, -CH2-R9, -CH2-NR9R'9, -CH2-N+R9R'9R"9 A', -CH2-CH2R9, -CH2-CH2Hal,-CH2-CH2OR9, -CH2-CH2SR9, -CH2-CH2-NR9R'9, -CH2-CH2-N+R9R'9R"9 A -COCH3, C(CH3)=CR9R'9, -C(CH3)=CR9Hal, -C(CH3)=NR9, -CH(CH3)=N+R9R'9A-, -CH(CH3)-Hal, -CH(CH3)-OR9, -CH(CH3)-SR9, -CH(CH3)-NR9R9, -CH(CH3)-N+R9R'9 R'gA-, o -CECR9;
R'4 es metilo o formilo;
R5 es =O, =S, =N-R9, =N+R9R'9A-, =CR9R'9, o =CR9-Hal;
R7, R8, R9, R'9 y R"9 es cada uno independientemente:
(a) H;
(b) hidrocarbilo C1-C25;
(c) hidrocarbilo C1-C25, preferiblemente alquilo, alquenilo o alquinilo C1-C25, más preferiblemente alquilo Ci-C10 o C1-C6, sustituido con uno o más grupos funcionales seleccionados del grupo que consiste en halógeno, nitro, oxo, OR, SR, epoxi, epitio, --NRR', -CONRR', -CONR-NRR', -NHCONRR', -NHCONRNRR', -COR, COOR", -OSO3R, -SO3R", -SO2R, -NHSO2R, -SO2NRR', =N-OR, -(CH2)n-CO-NRR' -O-(CH2)n-OR, -O-(CH2)n-O-(CH2)n-R, -OPO3RR', -PO2HR, y -PO3R"R", en donde R y R' es cada uno independientemente H, hidrocarbilo o heterociclilo y R" es hidrocarbilo o heterociclilo;
(d) hidrocarbilo C1-C25, preferiblemente alquilo C1-C25, más preferiblemente alquilo C1-C10 o C1-C6, sustituido con uno o más grupos funcionales seleccionados del grupo que consiste en grupos con carga positiva, grupos con carga negativa, grupos básicos que se convierten en grupos con carga positiva en condiciones fisiológicas y grupos ácido que se convierten en grupos con carga negativa en condiciones fisiológicas;
(e) hidrocarbilo C1-C25, preferiblemente alquilo C1-C25, más preferiblemente alquilo C1-C10 o C1-C6, que contiene uno o más heteroátomos y/o uno o más restos carbocíclico o heterocíclico;
(f) hidrocarbilo C1-C25, preferiblemente alquilo C1-C25, más preferiblemente alquilo C1-C10 o C1-C6, que contiene uno o más heteroátomos y/o uno o más restos carbocíclico o heterocíclico y sustituido con uno o más grupos funcionales como se ha definido antes en (c) y (d);
(g) hidrocarbilo C1-C25, preferiblemente alquilo C1-C25, más preferiblemente alquilo C1-C10 o C1-C6 sustituido con un resto de un aminoácido, un péptido, una proteína, un monosacárido, un oligosacárido, un polisacárido o un ligando polidentado y su complejo de quelación con metales; o
(h) un resto de un aminoácido, un péptido, una proteína, un monosacárido, un oligosacárido, un polisacárido o un ligando polidentado y su complejo de quelación con metales;
R7 puede ser además -NRR', en donde R y R' es cada uno H o hidrocarbilo C1-C25, preferiblemente alquilo C1-C25, más preferiblemente alquilo C1-C10 o C1-C6, opcionalmente sustituido con un grupo con carga negativa, preferiblemente SO3-;
R8 puede ser además H+ o un catión R+10 cuando R1, R'2 y R6 cada uno independientemente es Y-R8;
R+10 es un metal, un grupo amonio o un catión orgánico;
A- es un anión fisiológicamente aceptable;
m es 0 o 1;
la línea de trazos en las posiciones 7-8 representa un doble enlace opcional; y
sales farmacéuticamente aceptables e isómeros ópticos de los mismos;
y dicho derivado de clorofila o bacterioclorofila de fórmula I, II o III contiene al menos un resto peptídico que contiene RGD o un resto peptidomimético de RGD, en donde dicho péptido que contiene RGD es un péptido lineal o cíclico todo L, todo D o un L,D compuesto de 4-100, preferiblemente 5-50, 5-30, 5-20, más preferiblemente 4, 5, 6, 7, 9 o 25 restos aminoácido que pueden ser opcionalmente aminoácidos naturales o no naturales modificados, y dicho peptidomimético de RGD es un compuesto no peptídico que comprende una guanidina y un grupo carboxilo terminal espaciado por una cadena de 11 átomos, siendo átomos de carbono al menos 5 de dichos átomos, dicha cadena comprende uno o más átomos de O, S o N y puede estar opcionalmente sustituida con oxo, tioxo, halógeno, amino, alquilo C1-C6, hidroxilo o carboxilo o uno o más átomos de dicha cadena pueden formar un anillo carbocíclico o heterocíclico de 3-6 miembros.
En una realización, la línea de trazos en las posiciones 7-8 representa un doble enlace y el fotosensibilizante es una clorofila de la fórmula I, II o III. Los compuestos de fórmula I en donde M es Mg, R1 en la posición 173 es fitiloxi, R2 en la posición 132 es COOCH3, R3 en la posición 132 es un átomo de H, R5 es O, R4 en la posición 3 es vinilo, la línea de trazos en las posiciones 7-8 representa un doble enlace, y bien R'4 es metilo en la posición 7 y R4 es etilo en la posición 8 o R'4 es formilo en la posición 7 y R4es etilo en la posición 8, son la clorofila a y b, respectivamente, y sus derivados tendrán diferente átomo de metal y/o diferentes sustituyentes R1, R2, R3, R4, R'4 y/o R5.
En otra realización, las posiciones 7-8 están hidrogenadas y el fotosensibilizante es una bacterioclorofila de las fórmulas I, II o III. Los compuestos de fórmula I en donde M es Mg, R1 en la posición 173 es fitiloxi o geranilgeraniloxi, R2 en la posición 132 es COOCH3, R3 en la posición 132 es un átomo de H, R5 es O, R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo, y la línea de trazos en las posiciones 7-8 está ausente son la bacterioclorofila a, y sus derivados tendrán diferente átomo de metal y/o diferentes sustituyentes R1, R2, R3, R4 y/o R5.
Como se usa en la presente memoria, el término "hidrocarbilo" se refiere a cualquier radical hidrocarbilo lineal o ramificado, saturado o insaturado, acíclico o cíclico, incluyendo aromáticos, de 1-25 átomos de carbono, preferiblemente de 1 a 20, más preferiblemente de 1 a 6, lo más preferiblemente 2-3 átomos de carbono. El hidrocarbilo puede ser un radical alquilo, preferiblemente de 1 a 4 átomos de carbono, p. ej., metilo, etilo, propilo, butilo o alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo tal como fenilo o un grupo aralquilo tal como bencilo, o en la posición 17 es un radical derivado de los compuestos naturales Chl y Bchl, p. ej., geranilgeranilo (2,6-dimetil-2,6-octadienilo) o fitilo (2,6,10,14-tetrametil-hexadec-14-en-16-ilo).
Como se usa en la presente memoria, la expresión "resto carbocíclico" se refiere a un compuesto monocíclico o policíclico que contiene solo átomos de carbono en el(los) anillo(s). El resto carbocíclico puede ser saturado, es decir, cicloalquilo, o insaturado, es decir, cicloalquenilo, o aromático, es decir, arilo.
El término "alcoxi" como se usa en la presente memoria, se refiere a un grupo alquil(C1-C25)-O-, en el que el alquilo C1-C25 es como se ha definido antes. Ejemplos de alcoxi son metoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi, butoxi, isobutoxi, terc-butoxi, pentoxi, hexoxi, -OC15H31, -OC16H33, -OC17H35, -OC18H37, y similares. El término "ariloxi" como se usa en la presente memoria, se refiere a un grupo aril(C6-C1s)-O-, en el que el arilo C6-C18 es como se ha definido antes, por ejemplo, fenoxi y naftoxi.
Los términos "heteroarilo" o "resto heterocíclico" o "heteroaromático" o "heterociclilo", como se usan en la presente memoria, significan un radical derivado de un anillo heteroaromático mono o policíclico que contiene de uno a tres heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, S y N. Ejemplos particulares son pirrolilo, furilo, tienilo, pirazolilo, imidazolilo, oxazolilo, tiazolilo, piridilo, quinolinilo, pirimidinilo, 1,3,4-triazinilo, 1,2,3-triazinilo, 1,3,5-triazinilo, benzofurilo, isobenzofurilo, indolilo, imidazo[1,2-a]piridilo, bencimidazolilo, benzotiazolilo y benzoxazolilo.
Cualquier "carbocíclico", "arilo" o "heteroarilo" puede estar sustituido con uno o más radicales tales como halógeno, arilo C6-C14, alquilo C1-C25, nitro, OR, SR, -COR, -COOR, -SO3R, -SO2R, -NHSO2R, -NRR', -(CH2V NR-COR' y -(CH2)n-CO-NRR'. Debe entenderse que cuando un anillo heteroaromático policíclico está sustituido, las sustituciones pueden ser en cualquiera de los anillos carbocíclicos y/o heterocíclicos.
El término "halógeno", como se usa en la presente memoria, se refiere a flúor, cloro, bromo o yodo.
En una realización de la invención, el fotosensibilizante del conjugado es una clorofila o bacterioclorofila de la fórmula I, II o III que contiene al menos un grupo con carga negativa y/o al menos un grupo ácido que se convierte en un grupo con carga negativa al pH fisiológico
Como se define en la presente memoria, "un grupo con carga negativa" es un anión derivado de un ácido e incluye carboxilato (COO‘), tiocarboxilato (COS‘), sulfonato (SO3') y fosfonato (PO32'), y el "el grupo ácido que se convierte en un grupo con carga negativa en condiciones fisiológicas" incluye los grupos ácido carboxílico (-COOH), tiocarboxílico (-COSH), sulfónico (-SO3H) y fosfónico (-PO3H2). Los derivados de BChl con grupos con carga negativa o grupos convertidos en estos en condiciones fisiológicas se han descrito en la publicación internacional WO2004/045492 del mismo solicitante. En otra realización de la invención, el fotosensibilizante del conjugado es una clorofila o bacterioclorofila de la fórmula I, II o III que contiene al menos un grupo con carga positiva y/o al menos un grupo básico que se convierte en un grupo con carga positiva al pH fisiológico.
Como se define en la presente memoria, "un grupo con carga positiva" indica un catión derivado de un grupo que contiene N o de un grupo onio que no contiene N. Puesto que el endotelio tumoral se caracteriza por un mayor número de sitios aniónicos, los grupos con carga positiva o grupos básicos que se convierten en grupos con carga positiva en condiciones fisiológicas, puede mejorar la eficacia del direccionamiento de los conjugados de la presente invención.
Un "catión derivado de un grupo que contiene N" como se usa en la presente memoria indica, por ejemplo, pero no se limita a grupo un amonio -N+(RR'R"), hidrazinio -(R)NN+(R'R"), amonio-oxi O-^N+(RR')-, iminio >C=N+(RR'), amidinio -C(=RN)-N+R'R" o guanidinio -(R)NC(=NR)-N+R'R", en donde R, R' y R" son cada uno independientemente H, hidrocarbilo, preferiblemente alquilo C1-C6 como se define en la presente memoria, fenilo o bencilo, o heterociclilo, o en el grupo amonio uno de R, R' y R" puede ser OH, o dos de R, R' y R" en el grupo amonio o R y R' en los grupos hidrazinio, amonio-oxi, iminio, amidinio o guanidinio, junto con el átomo de N al que están unidos, forman un anillo saturado de 3-7 miembros, que opcionalmente contiene uno o más heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, S o N y opcionalmente sustituido además en el átomo de N adicional, o dicho catión deriva de un compuesto que contiene uno o más átomos de N en un anillo heteroaromático.
En una realización más preferida, el conjugado de la presente invención contiene un grupo amonio de la fórmula -N+(RR'R"), en donde cada uno de R, R' y R" es independientemente H o hidrocarbilo o heterociclilo opcionalmente sustituido, como se define en la presente memoria, o uno de ellos puede ser OH. El grupo amonio -N+(RR'R") puede ser un amonio secundario, en donde cualesquiera dos de los radicales R, R' o R" son H; un amonio terciario, en donde solo uno de R, R' o R" es H; o un amonio cuaternario, en donde cada uno de R, R' o R" es un grupo hidrocarbilo o heterociclilo opcionalmente sustituido como se define en la presente memoria. Cuando uno de R, R' o R" es OH, el grupo es un grupo hidroxilamonio. Preferiblemente, el grupo amonio es un grupo amonio cuaternario en donde R, R' y R" es cada uno alquilo C1-C6 tal como metilo, etilo, propilo, butilo, hexilo. Como se ha mencionado en lo que antecede, el grupo amonio puede ser un grupo final en la molécula o se puede encontrar dentro de una cadena de alquilo en la molécula.
En los grupos hidrazinio -(R)NN+(R'R"), amidinio -C(=NR)-N+R'R" y guanidinio -(R)NC(=NR)-N+R'R", R, R' y R" puede ser cada uno independientemente H o hidrocarbilo o heterociclilo, o R' y R" junto con el átomo de N al que están unidos forman un anillo saturado de 3-7 miembros, como se define en la presente memoria. Ejemplos de dichos grupos incluyen aquellos en donde R es H, y R' y R" es cada uno alquilo C1-C6 tal como metilo, etilo, propilo, butilo, hexilo.
En los grupos amonio-oxi O^N+(RR')- e iminio >C=N+(RR'), R y R' puede ser cada uno independientemente H o hidrocarbilo, preferiblemente alquilo C1-C6, o heterociclilo, o R y R' junto con el átomo de N al que están unidos forman un anillo saturado de 3-7 miembros, como se define en la presente memoria.
En otra realización preferida, el derivado de bacterioclorofila contiene un grupo de amonio cíclico de fórmula -N+(RR'R"), en donde dos de R, R' y R" junto con el átomo de N forman un anillo saturado de 3-7 miembros definido a continuación.
Como se define en la presente memoria, "un anillo saturado de 3-7 miembros" formado por dos de R, R' y R" junto con el átomo de N al que están unidos, puede ser un anillo que contiene solo N, como aziridina, pirrolidina, piperidina, piperazina o azepina, o puede contener un heteroátomo adicional seleccionado de O y S, tal como morfolina o tiomorfolina. El átomo de N adicional en el anillo de piperazina puede estar opcionalmente sustituido con alquilo, p. ej. alquilo C1-C6, que puede estar substituido con halógeno, OH o amino. Los grupos onio derivados de dichos anillos saturados incluyen aziridinio, pirrolidinio, piperidinio, piperazinio, morfolinio, tiomorfolinio y azepinio.
Como se define en la presente memoria, "un catión derivado de un radical heteroaromático que contiene N" indica un catión derivado de un compuesto N-heteroaromático que puede ser un compuesto mono o policíclico que opcionalmente contiene átomos de O, S o N adicionales. El anillo del cual deriva el catión debe contener al menos un átomo de N y ser aromático, pero el(los) otro(s) anillo(s), si los hay, pueden ser parcialmente saturados. Los ejemplos de cationes N-heteroaromáticos incluyen pirazolio, imidazolio, oxazolio, tiazolio, piridinio, pirimidinio, quinolinio, isoquinolinio, 1,2,4-triazinio, 1,3,5-triazinio y purinio.
El al menos un grupo con carga positiva también puede ser un grupo onio que no contiene nitrógeno, tal como pero no limitado a, grupo fosfonio [-P+(RR'R")], arsonio [-As+(RR'R")], oxonio [-O+(RR')], sulfonio [-S+(RR')], selenonio [-Se+(RR')], teluronio [-Te+(RR')], estibonio [-Sb+(RR'R")], o bismutonio [-BÍ+(r R'R")], en donde cada uno de R, R' y R", independientemente, es H, hidrocarbilo o heterociclilo, preferiblemente alquilo C1-C6tal como metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo o hexilo, o arilo, preferiblemente, fenilo.
Los ejemplos de grupos fosfonio de la fórmula -P+(RR'R") incluyen grupos en donde R, R' y R" son cada uno metilo, etilo, propilo, butilo o fenilo, o R es metilo, etilo, propilo, butilo o hexilo y R' y R" son ambos fenilo. Los ejemplos de grupos de arsonio de la fórmula -As+(RR'R") incluyen grupos en donde R, R' y R" son cada uno metilo, etilo, propilo, butilo o fenilo. Ejemplos de los grupos sulfonio de la fórmula -S+(RR') incluyen grupos en donde R y R' son cada uno metilo, etilo, propilo, butilo, fenilo, bencilo, fenetilo o un grupo hidrocarbilo sustituido.
Como se define en la presente memoria, "un grupo básico que se convierte en un grupo con carga positiva en condiciones fisiológicas" es, al menos teóricamente, cualquier grupo básico que generará en condiciones fisiológicas un grupo con carga positiva como se define en la presente memoria. Debe observarse que las condiciones fisiológicas, como se usa en la presente memoria, no se refieren únicamente al suero, sino a diferentes tejidos y compartimentos celulares en el cuerpo.
Los ejemplos de dichos grupos básicos que contienen N incluyen, sin estar limitado a cualquier grupo amino que generará un grupo amonio, cualquier grupo imina que generará un grupo iminio, cualquier grupo hidrazina que generará un grupo hidrazinio, cualquier grupo amino-oxi que generará un grupo amonio-oxi, cualquier grupo amidina que generará un grupo amidinio, cualquier grupo guanidina que generará un grupo guanidinio, todos como se definen en la presente memoria. Otros ejemplos incluyen grupos fosfino y mercapto.
Por lo tanto, los conjugados de la presente invención pueden contener al menos un grupo básico que se convierte en un grupo con carga positiva en condiciones fisiológicas, tales como -NRR', -C(=NR)-NR'R", -NR-NR'R", -(R)NC(=NR)-NR'R", O-^Nr -, o >C=NR, en donde cada uno de R, R' y R" es independientemente H, hidrocarbilo, preferiblemente alquilo C1-C25, más preferiblemente alquilo C1-C10 o C1-C6, o heterociclilo, o dos de R, R' y R" junto con el átomo de N forman un anillo saturado de 3-7 miembros, que contiene opcionalmente un átomo de O, S o N y opcionalmente sustituido además en el átomo de N adicional, o el grupo básico es un radical heteroaromático que contiene N.
El anillo saturado de 3-7 miembros puede ser aziridina, pirrolidina, piperidina, morfolina, tiomorfolina, azepina o piperazina opcionalmente sustituido en el átomo de N adicional con alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con halógeno, hidroxilo o amino, y el radical heteroaromático que contiene N puede ser pirazolilo, imidazolilo, oxazolilo, tiazolilo, piridilo, quinolinilo, isoquinolinilo, pirimidilo, 1,2,4-triazinilo, 1,3,5-triazinilo o purinilo.
Los derivados de BChl con grupos con carga positiva o grupos convertidos en los mismos en condiciones fisiológicas se han descrito en la publicación internacional WO2005/120573 del mismo solicitante.
En una realización, el fotosensibilizante es una clorofila o bacterioclorofila de fórmula II y R6 es un grupo básico -NRgR'g en donde R9 es H y R'g es alquilo C1-C6 sustituido con un grupo básico -NH-(CH2)2-6-NRR' en donde cada uno de R y R' es independientemente H, alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con NH2 o R y R' junto con el átomo de N forman un anillo saturado de 5-6 miembros, que contiene opcionalmente un átomo de O o N y opcionalmente sustituido además en el átomo de N adicional con -(CH2)2-6-NH2.
En otra realización, el fotosensibilizante es una bacterioclorofila de fórmula II y R6 es -NH-(CH2)3-NH-(CH2)3-NH2, -NH-(CH2)2-1-morfolino, o -NH-(CH2)3-piperazino-(CH2)3-NH2 o R1 y R6 juntos forman un anillo cíclico que comprende un péptido de RGD o un peptidomimético de RGD.
En otra realización, el fotosensibilizante es una clorofila o bacterioclorofila de fórmula III, X es -NR7, R7 es -NRR', R es H y R' es alquilo C2-6 sustituido con SO3- o una sal alcalina del mismo, preferiblemente el fotosensibilizante es una bacterioclorofila y X es -NR7 y R7 es -NH-(CH2)3-SO3K.
En otra realización, R7, R8, R9 o R'g son cada uno un alquilo C1-6 sustituido con uno o más grupos -OH. Por ejemplo, el fotosensibilizante es una clorofila o bacterioclorofila de fórmula II y R6 es -NRgR'g, Rg es H y R'g es HOCH2-CH(OH)-CH2-.
En otra realización, el fotosensibilizante es una clorofila o bacterioclorofila de fórmula II y R6 es -NRgR'g, Rg es H y R'g es alquilo C1-6 sustituido con un ligando polidentado o sus complejos de quelación con metales. Los ejemplos de ligandos polidentados incluyen, sin estar limitados a EDTA (ácido etilendiaminotetraacético), DTPA (ácido dietilentriaminopentaacético) o el ligando macrocíclico DOTA. En una realización preferida, el ligando polidentado es DTPA, R6 es -NH-(Ch 2)3-NH-DTPA, y el metal es Gd.
El catión R8+ puede ser un catión monovalente o divalente derivado de un metal alcalino o alcalinotérreo tal como K+, Na+, Li+, NH4+, Ca2+, más preferiblemente K+; o R8+ es un catión orgánico derivado de una amina o de un grupo que contiene N
Como se define en la presente memoria, el hidrocarbilo C1-C25 definido para R7, R8, Rg y R'g puede estar opcionalmente sustituido con uno o más grupos funcionales seleccionados de halógeno, nitro, oxo, OR, SR, epoxi, epitio, aziridina, -CONRR', -COR, Co Or , -OSO3R,-SO3R, -SO2R, -NHSO2R, -SO2NRR' -NRR', =N-OR, =N-NRR', -C(=NR)-NRR', -NR-NRR', -(R)N-C(=NR)-NRR', O ^NR-, >C=NR, -(CH2)n-NR-COR', -(CH2)n-CO-NRR', -O-(CH2)n-OR, -O-(CH2)n-O-(CH2)n-R, -PRR', -OPO3RR', -PO2HR,-PO3RR'; uno o más grupos con carga negativa tales como COO', c OS', -OSO3', -SO3', -OPO3R', -PO2H', -PO32' y -PO3R'; y/o uno o más grupos con carga positiva tales como -P+(RR'R"), -As+(RR'R"), -O+(RR'), -S+(RR'), -Se+(RR'), -Te+(RR'), -Sb+(RR'R"), -Bi+(RR'R"), O^N+(RR'), >C=N+(RR'), -N+(RR'R"), -(R)N-N+(RR'R"), -(R)N-C(=HN)-N+RR'R", -C(=NH)-N+(RR'R"), o un catión N-heteroaromático tal como pirazolio, imidazolio, oxazolio, tiazolio, piridinio, quinolinio, pirimidinio, 1,2,4-triazinio, 1,3,5-triazinio y purinio; en donde n es un número entero de 1 a 6, R, R' y R" es cada uno independientemente H, hidrocarbilo o heterociclilo, o dos de R, R' y R" junto con el átomo de N al que están unidos forman un anillo saturado de 3-7 miembros, que contiene opcionalmente uno o más heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, S o N y opcionalmente sustituido además en el átomo de N adicional. El hidrocarbilo C1-C25 definido para R7, R8, Rg y R'g también puede estar sustituido con el resto de un mono, oligo o polisacárido tal como glicosilo, o de un aminoácido, péptido o proteína. Además, R8, Rg y R'g puede ser cada uno independientemente un resto de un mono, oligo o polisacárido tal como glicosilo, o de un aminoácido, péptido o proteína, o un ligando polidentado tal como DTPA, DOTA, EDTA y similares y sus complejos de quelación con metales.
En los grupos OR y SR, cuando R es H, están representados los grupos hidroxi y mercapto, respectivamente, y cuando R es distinto de H, están representados los éteres y sulfuros. En el grupo -PRR', está representado el grupo fosfino cuando R y R' son H. En el grupo -COR, cuando R es H, está representado el grupo formilo -CHO de un aldehído, mientras que cuando R es distinto de H, este es el resto de una cetona tal como grupos alquilcarbonilo y arilcarbonilo. En el grupo COOR, cuando R no es H, este es un grupo éster de ácido carboxílico tal como los grupos alcoxicarbonilo y ariloxicarbonilo. De forma similar, están representados ésteres en los grupos -OSO3R, -SO3R, -SO2R, -OPO3RR', -PO2HR y -PO3RR' cuando R y R' son distintos de H.
En una realización preferida de la invención, el fotosensibilizante no está metalado, en concreto, M es 2H. En otras realizaciones preferidas, el fotosensibilizante está metalado como se define en lo que antecede, más preferiblemente M es Pd, Cu o Mn, lo más preferiblemente Pd.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, el fotosensibilizante es una bacterioclorofila de fórmula I, II o III, más preferiblemente de fórmula II, y M es 2H, Cu, Mn, más preferiblemente Pd. En otras realizaciones, el fotosensibilizante es una clorofila de la fórmula I, II o III, más preferiblemente de fórmula II, y M es 2H, Cu o Mn.
En algunas realizaciones preferidas, el conjugado comprende un fotosensibilizante bacterioclorofila de la fórmula II en donde M es Pd, Mn, Cu o 2H; m es 1; R1 es NH-P, donde P es el resto de un péptido que contiene RGD o peptidomimético de RGD unido directamente al NH- o por un espaciador; R'2 es metoxi; R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; y R6 es -NH-(CH2)2-SO3 ' Me+, en donde Me+ es Na+ o K+.
En otras realizaciones preferidas, el conjugado comprende un fotosensibilizante bacterioclorofila de la fórmula II en donde M es Pd o 2H; m es 1; R1 es NH-P, donde P es el resto de un péptido que contiene RGD o peptidomimético de RGD unido directamente al NH- o por un espaciador; R'2 es metoxi; R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; y R6 es -NH-CH2-CH(OH)-CH2-OH.
En otra realización, el conjugado comprende una bacterioclorofila de la fórmula III en donde M es Pd; R1 es NH-P, en donde P es el resto de un péptido que contiene RGD o peptidomimético de RGD unido directamente al NH- o por un espaciador; R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; X es N-R7 y R7 es -NH-(CH2)3-SO3'Me+, en donde Me+ es Na+ o K+.
En otra realización, el conjugado comprende una bacterioclorofila de la fórmula I en donde M es Mn; R1 es NH-P, donde P es el resto de un péptido que contiene RGD o peptidomimético de RGD unido directamente al NH-o por un espaciador; R2 es OH; R3 es COOCH3; R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; y R5 es O.
En otra realización, el conjugado comprende una clorofila de la fórmula II en donde M se selecciona de Mn, Cu o 2H; m es 1; R1 es NH-P, donde P es el resto de un péptido que contiene RGD o peptidomimético de RGD unido directamente al NH- o por un espaciador; R4 en la posición 3 es vinilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; y R6 es -NH-(CH 2 ) 2 -s O 3 - Me+, en donde Me+ es Na+ o K+.
En otra realización, el conjugado comprende una bacterioclorofila de la fórmula II en donde M es 2H; m es 1; R1 es NH-P, donde P es el resto de un péptido que contiene RGD o peptidomimético de RGD unido directamente al NH- o por un espaciador; R'2 es metoxi; R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; y Ra es -NH-(CH2)3-NH-(CH2)3-NH2.
En otra realización, el conjugado comprende una bacterioclorofila de la fórmula II en donde M es 2H; m es 1; R1 es NH-P, donde P es el resto de un péptido que contiene RGD o peptidomimético de RGD unido directamente al NH- o por un espaciador; R'2 es metoxi; R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; y R6 es -NH-(CH2)2-morfolino.
En otra realización, el conjugado comprende una bacterioclorofila de la fórmula II en donde M es 2H; m es 1; R1 es NH-P, donde P es el resto de un péptido que contiene RGD o peptidomimético de RGD unido directamente al NH- o por un espaciador; R'2 es metoxi; R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; y R6 es -NH-(CH2)3-piperazino-(CH2)3-NH2.
En otra realización, el conjugado comprende una bacterioclorofila de la fórmula II en donde M es Pd; m es 1; R1 es NH-P, en donde P es el resto del peptidomimético de RGD; R'2 es metoxi; R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; y R6 es -NH-(CH2)2-SO3K (conjugado 40).
En otra realización, el conjugado comprende una bacterioclorofila de la fórmula II en donde M es Pd; m es 1; R1 es NH-P, en donde P es el resto del peptidomimético de RGD; R'2 es metoxi; R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; y R6 es -NH-(CH2)2-SO3K (conjugado 41).
En otra realización, Ri y R6 juntos forman un anillo cíclico que comprende -NH-RGD-CO-NH-(CH2)2-NH- o -NH-RGD-CO-NH-(CH2)3-piperazino-(CH2)3-NH-. En una realización, el conjugado comprende una bacterioclorofila de la fórmula II en donde m es 1; R'2 es metoxi; R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; y bien R1 y R6 juntos forman un anillo cíclico que comprende -NH-RGD-CO-NH-(CH2)2-NH- y M es Pd (Conjugado 37) o M es 2H (Conjugado 38) o R1 y R6 juntos forman un anillo cíclico que comprende -NH-RGD-CO-NH-(CH2)3-piperazino-(CH2)3-NH- y M es Pd (Conjugado 39).
En otra realización, el conjugado comprende una clorofila de la fórmula II en donde M es 2H; m es 1; R'2 es metoxi; R1 es NH-P, en donde P es el resto del péptido que contiene RGD de SEQ ID NO: 1; R4 en la posición 3 es vinilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; y R6 es -NH-(CH2)2-SO3K (Conjugado 16).
En otra realización, el conjugado comprende una clorofila de la fórmula II en donde M es Mn; m es 1; R'2 es metoxi; R1 es NH-P, en donde P es el resto del péptido que contiene RGD de la SEQ ID NO: 1; R4 en la posición 3 es vinilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; y R6 es -NH-(CH2)2-SO3K (Conjugado 17).
En otra realización, el conjugado comprende una clorofila de la fórmula II en donde M es Cu; m es 1; R'2 es metoxi; R1 es NH-P, en donde P es el resto del péptido que contiene RGD de SEQ ID NO: 1; R4 en la posición 3 es vinilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; y R6 es -NH-(CH2)2-SO3K (Conjugado 18).
En otra realización, el conjugado comprende una bacterioclorofila de la fórmula I en donde M es Mn; R1 es NH-P, en donde P es el resto del péptido que contiene RGD de SEQ ID NO: 1; R2 es OH; R3 es COOCH3; R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; y R5 es O (Conjugado 12).
En otra realización, el conjugado comprende una bacterioclorofila de la fórmula I en donde M es 2H; R1 es NH-P, en donde P es el resto del péptido que contiene RGD de SEQ ID NO: 1; R2 es H; R3 es COOCH3; R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; y R5 es O (Conjugado 27).
En otra realización, el conjugado comprende una bacterioclorofila de la fórmula I en donde M es 2H; R1 es NH-(CH2)2-NH-CO-P, en donde P es el resto del péptido que contiene RGD de SEQ ID NO: 4; R2 es H; R3 es COOCH3; R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; y R5 es O (Conjugado 32).
En otra realización, el conjugado comprende una bacterioclorofila de la fórmula II en donde M es Pd; m es 1; R1 es NH-P, en donde P es el resto del péptido que contiene RGD de SEQ ID NO: 2; R'2 es metoxi; R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; y R6 es -NH-(CH2)2-SO3K (Conjugado 11).
En otra realización, el conjugado comprende una bacterioclorofila de la fórmula II en donde M es 2H; m es 1; R1 es NH-P, en donde P es el resto del péptido que contiene RGD de SEQ ID NO: 1; R'2 es metoxi; R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; y R6 es -NH-(CH2)2-SO3K (Conjugado 13).
En otra realización, el conjugado comprende una bacterioclorofila de la fórmula II en donde M es Mn; m es 1; R1 es NH-P, en donde P es el resto del péptido que contiene RGD de SEQ ID NO: 1; R'2 es metoxi; R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; y R6 es -NH-(CH2)2-SO3K (Conjugado 14).
En otra realización, el conjugado comprende una bacterioclorofila de la fórmula II en donde M es Cu; m es 1; R1 es NH-P, en donde P es el resto del péptido que contiene RGD de SEQ ID NO: 1; R'2 es metoxi; R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; y R6 es -NH-(CH2)2-SO3K (Conjugado 15).
En otra realización, el conjugado comprende una bacterioclorofila de la fórmula II en donde M es Pd; m es 1; R1 es NH-P, en donde P es el resto del péptido que contiene RGD de SEQ ID NO: 1; R'2 es metoxi; R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; y R6 es -NH-(CH2)2-SO3K (Conjugado 24).
En otra realización, el conjugado comprende una bacterioclorofila de la fórmula III en donde M es Pd; R1 es NH-P, en donde P es el resto de del péptido que contiene RGD de SEQ ID NO: 1; R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; X es NR7 y R7 es -NH-(CH2)3-SO3K (Conjugado 19).
En otra realización, el conjugado comprende una bacterioclorofila de la fórmula II en donde M es 2H; m es 1; R1 es NH-P, en donde P es el resto del péptido que contiene RGD de SEQ ID NO: 3; R'2 es metoxi; R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; y R6 es -NH-(CH2)2-SO3K (Conjugado 26).
En otra realización, el conjugado comprende una bacterioclorofila de la fórmula II en donde M es Pd; m es 1; R1 es NH-P, en donde P es el resto del péptido que contiene RGD de SEQ ID NO: 5; R'2 es metoxi; R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; y R6 es -NH-(CH2)2-SO3K (Conjugado 33).
En otra realización, el conjugado comprende una bacterioclorofila de la fórmula II en donde M es Pd; m es 1; R1 es NH-P, en donde P es el resto del péptido que contiene RGD de SEQ ID NO: 6; R'2 es metoxi; R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; y R6 es -NH-(CH2)2-SO3K (Conjugado 34).
En otra realización, el conjugado comprende una bacterioclorofila de la fórmula II en donde M es Pd; m es 1; R1 es NH-P, en donde P es el resto del péptido que contiene RGD de SEQ ID NO: 7; R'2 es metoxi; R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; y R6 es -NH-(CH2)2-SO3K (Conjugado 35).
En otra realización, el conjugado comprende una bacterioclorofila de la fórmula II en donde M es Pd; m es 1; R1 es NH-CH[(-(CH2)2-CO-NH-P]2, en donde P es el resto del péptido que contiene RGD de SEQ ID NO: 8; R'2 es metoxi; R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; y R6 es -NH-(CH2)2-SO3K (conjugado 36).
En otra realización, el conjugado comprende una bacterioclorofila de la fórmula II en donde M es Pd; m es 1; R1 es NH-P, en donde P es el resto de del péptido que contiene RGD de SEQ ID NO: 1; R'2 es metoxi; R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; y R6 es -NH-CH2-CH(OH)-CH2OH. (Conjugado 23).
En otra realización, el conjugado comprende una bacterioclorofila de la fórmula II en donde M es 2H; m es 1; R1 es NH-P, en donde P es el resto del péptido que contiene RGD de SEQ ID NO: 1; R'2 es metoxi; R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; y R6 es -NH-(CH2)3-NH-CO-DTPA (conjugado 43) o su complejo quelato con Gd (conjugado 44).
La invención proporciona además la nueva bacterioclorofila de la fórmula II, en donde M es Pd; R1 es COOH; R'2 es metoxi; R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; y R6 es -NH-CH2-CH(OH)-CH2-OH (compuesto 10).
En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un conjugado de un péptido que contiene RGD o un peptidomimético de RGD y un fotosensibilizante seleccionado de una clorofila o una bacterioclorofila como se define en la presente memoria y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En una realización, la composición farmacéutica comprende un conjugado que comprende un fotosensibilizante de clorofila o bacterioclorofila de fórmula I, II o III como se define en la presente memoria o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En una realización preferida, la composición farmacéutica comprende un conjugado en el que la clorofila tiene la fórmula II, más preferiblemente seleccionado de los conjugados 16, 17 y 18.
En otra realización preferida, la composición farmacéutica comprende un conjugado en el que la bacterioclorofila tiene la fórmula I, más preferiblemente seleccionado de los conjugados 12, 27 y 32.
En otra realización preferida, la composición farmacéutica comprende un conjugado en el que la bacterioclorofila tiene la fórmula III, más preferiblemente el conjugado 19.
En otra realización más preferida, la composición farmacéutica comprende un conjugado en el que la bacterioclorofila tiene la fórmula II conjugada con un péptido de RGD, más preferiblemente con el péptido de RGD de SEQ ID NO: 1, más preferiblemente seleccionado de los conjugados 13, 15, 23, 28, 29, 30, 31, 43 y 44, y más preferiblemente el conjugado 24.
En otra realización, la composición farmacéutica comprende un conjugado en el que la bacterioclorofila tiene la fórmula II conjugada con un péptido de RGD de cualquiera de las SEQ ID NO: 2-8 , más preferiblemente los conjugados 1_1, 26, 33, 34, 35 y 36.
En otra realización, la composición farmacéutica comprende un conjugado en el que la bacterioclorofila tiene la fórmula II conjugada con un peptidomimético de RGD, más preferiblemente los conjugados 40 y 41
En una realización, la composición farmacéutica es para usar en terapia fotodinámica (PDT), más particularmente para PDT dirigida vascular (VTP).
En una realización, la composición farmacéutica es para usaren oncología, en particular para VTP de tumores. La invención abarca cualquier tumor sólido adecuado, tanto tumores primarios como metástasis, de tumores seleccionados de, pero no limitados a melanoma, cáncer de colon, mama, pulmón, próstata, cerebro o cabeza y cuello.
En otra realización, la composición farmacéutica es para usar en enfermedades no oncológicas, para VTP de tejido u órgano no neoplásico. En una realización, la composición farmacéutica se usa para el tratamiento de enfermedades vasculares tales como la degeneración macular asociada a la edad (DMAE) o trastornos tales como la obesidad, limitando el suministro vascular al tejido adiposo y por lo tanto inhibiendo su crecimiento.
La composición farmacéutica de la invención también se usa con fines de diagnóstico, para la visualización de órganos y tejidos. Se puede usar en métodos de formación de imagen vascular dirigida (VTI).
En una realización, la composición farmacéutica se usa para el diagnóstico de tumores usando varias técnicas. Se pueden aplicar varias técnicas de diagnóstico según la invención, adaptando el átomo metálico central a la técnica particular.
Para el diagnóstico de tumores por imágenes de fluorescencia dinámica, M en el fotosensibilizante es 2H o un metal seleccionado de Cu, Pd Gd, Pt, Zn, Al, Eu, Er, Yb o isótopos de los mismos.
Para el diagnóstico de tumores por la técnica de radiodiagnóstico, M en el fotosensibilizante es un radioisótopo seleccionado de 64Cu, 67Cu, 99mTc, 67Ga, 201Tl, 195Pt, 60Co, 111In y 51Cr. En una realización, la técnica de radiodiagnóstico es la tomografía por emisión de positrones (PET) y M es 64Cu o 67Cu. En otra realización, la técnica de radiodiagnóstico es la tomografía por emisión de fotón único (SPET) y M es un radioisótopo seleccionado de 99mTc, 67Ga, 195Pt, 111In, 51Cr y 60Co.
Para el diagnóstico de tumores por imágenes de resonancia magnética molecular (MRI), M es un metal paramagnético seleccionado entre Mn3+, Cu2+, Fe3+, Eu3+, Gd3+ y Dy3+, o el fotosensibilizante se sustituye por un complejo de quelato metálico de un ligando polidentado y el metal es como se define en lo que antecede.
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica para usar en radioterapia de tumores, en donde M es un radioisótopo seleccionado de 103Pd, 195Pt, 105Rh, 106Rh, 188Re, 177Lu, 164Er, 117mSn, 153Sm, 90Y, 67Cu y 32P.
La presente invención proporciona además la nueva bacterioclorofila de la fórmula II, en donde M es Pd; R1 es COOH; R'2 es metoxi; R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; y R6 es -NH-CH(OH)-CH2-OH en la presente memoria identificado como compuesto 10.
Según una realización, la invención se refiere a la composición farmacéutica para usar en el diagnóstico de tumores mediante imágenes de fluorescencia dinámica, en donde M en el fotosensibilizante es 2H o un metal seleccionado de Cu, Pd Gd, Pt, Zn, Al, Eu, Er, Yb o isótopos de los mismos.
En otra realización, la invención proporciona la composición farmacéutica para usar en el diagnóstico de tumores por la técnica de radiodiagnóstico, en donde M en el fotosensibilizante es un radioisótopo seleccionado de 64Cu, 67Cu, 99mTc, 67Ga, 195Pt, 201Tl, 60Co, 111In o 51Cr. En una realización preferida, la técnica de radiodiagnóstico es la tomografía por emisión de positrones (PET) y M es 64Cu o 67Cu. En otra realización preferida, la técnica de radiodiagnóstico es la tomografía por emisión de fotón único (SPET) y M es un radioisótopo seleccionado del grupo que consiste en 99mTc, 67Ga, 195Pt, 111In, 51Cr y 60Co.
En una realización adicional, la invención proporciona la composición farmacéutica para usaren el diagnóstico de tumores mediante imágenes de resonancia magnética molecular (MRI), en donde M es un metal paramagnético seleccionado entre Mn3+, Cu2+, Fe3+, Eu3+ o Dy3+ y, preferiblemente, Gd+.
Los conjugados de péptido de RGD-fotosensibilizante de la invención son particularmente adecuados para la PDT vascular dirigida (VTP) y son útiles para el tratamiento de enfermedades asociadas con la angiogénesis/neovascularización y el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos, tales como cáncer, retinopatía diabética, degeneración macular y artritis. En una realización más preferida de la presente invención, el objetivo para el tratamiento con los sensibilizantes de la invención son vasos sanguíneos anormales, en particular vasos sanguíneos de tumores sólidos, degeneración macular asociada a la edad, reestenosis, inflamación aguda o aterosclerosis (Dougherty y Levy, 2003), debido a la diferencia inherente de la sensibilidad de los vasos sanguíneos normales y anormales a los protocolos de PDT sugeridos descritos en la presente memoria.
Así, en una realización, los conjugados de la invención son útiles en el campo oncológico para el tratamiento por PDT de estados precancerosos y varios tipos de cáncer tales como, pero no limitados a melanoma, cánceres y tumores de próstata, cerebro, colon, ovario, mama, cabeza y cuello, tumores de la pared torácica que provienen del cáncer de mama, piel, pulmón, esófago y vejiga. Los compuestos son útiles para el tratamiento de tumores primarios, así como metastásicos.
La invención se refiere además a la terapia tumoral sin PDT, en concreto, a la composición farmacéutica que comprende un conjugado de péptido de RGD-fotosensibilizante según la invención para usar en radioterapia tumoral en donde M es un radioisótopo seleccionado de 103Pd, 195Pt, 105Rh, 106Rh, 188Re, 177Lu, 164Er, 117mSn, 153Sm, 90Y, 67Cu o 32P.
En otra realización, los compuestos de la invención son útiles en áreas no oncológicas. Además de la destrucción eficaz de células no deseadas, como neoplasias y tumores, mediante la PDT, los compuestos de la invención también se pueden usar contra células y vasos sanguíneos en proliferación, que son la causa principal de la arteriosclerosis, artritis, psoriasis, obesidad y degeneración macular. Además, los compuestos se pueden usar en el tratamiento de tumores no malignos tales como la hipertrofia prostática benigna.
En una realización preferida, los conjugados de la invención se pueden usar en la PDT para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares principalmente para oclusión de vasos y trombosis en arteriopatías coronarias, hiperplasia de la íntima, reestenosis y placas ateroscleróticas. En una realización más preferida, los compuestos de la invención se usan para prevenir o reducir la reestenosis en prótesis endovascular en un individuo que padece una enfermedad cardiovascular que se sometió a angiografía coronaria. En otra realización preferida, los compuestos de la invención se pueden usar para el tratamiento de la aterosclerosis mediante la destrucción de la placa ateromatosa en un vaso sanguíneo enfermo.
En otra realización preferida, los compuestos de la invención se pueden usar en la PDT para el tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones dermatológicas tales como acné, cicatrización de acné, psoriasis, pie de atleta, verrugas, queratosis actínica y manchas de vino de Oporto (malformaciones de pequeños vasos sanguíneos que conectan las venas a las arterias (capilares) situados en los niveles superiores de la piel).
En otra realización preferida, los conjugados de la invención se pueden usar en la PDT para el tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones oftálmicas tales como la neovascularización corneal y coroidea y, más preferiblemente, la degeneración macular asociada a la edad (DMAE).
La cantidad del conjugado que se va a administrar para la terapia de PDT será establecida por un médico experto según la experiencia acumulada con derivados de porfirina, Chl y BChl usados en PDT, y variará dependiendo de la elección del derivado usado como principio activo, la afección que se va a tratar, el modo de administración, la edad y condición del paciente, y el criterio del médico.
La longitud de onda de la luz de irradiación se elige preferiblemente para que corresponda a la absorbancia máxima del fotosensibilizante. La longitud de onda adecuada para cualquiera de los compuestos se puede determinar fácilmente a partir de su espectro de absorción. En una realización preferida, se usa una fuente de luz fuerte, más preferiblemente láseres a 720-790 nm cuando el fotosensibilizante es un derivado de BChl.
Los conjugados de la invención se pueden usar además en terapia fotodinámica como un adyuvante para otra terapia actual usada para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección, para hacerla más eficaz. Por ejemplo, se pueden usar de modo intraoperatorio en combinación con cirugía, para ayudar a prevenir la recurrencia del cáncer en zonas de gran superficie tales como la pleura (revestimiento del pulmón) y el peritoneo (revestimiento del abdomen), sitios comunes de propagación para algunos tipos de cáncer, en el tratamiento intraoperatorio de carcinomas recurrentes de cabeza y cuello, o después de una angioplastia de la arteria femoral para prevenir la reestenosis. Los conjugados también se pueden usar en el diagnóstico de tumores por PDT intraoperatoria, por ejemplo, de tumores cerebrales.
Otra posibilidad según la invención es usar los conjugados de la invención en la PDT de tumores sólidos grandes mediante terapia intersticial, una técnica que implica alimentar fibras ópticas directamente a los tumores usando agujas guiadas por tomografía computarizada (TC). Esto puede ser especialmente útil en zonas que requieren cirugía extensa, tal como en tumores de cabeza y cuello.
La cantidad de conjugado que se va a administrar y la vía de administración se determinarán según el tipo de enfermedad, estadio de la enfermedad, edad y condiciones de salud del paciente, pero será mucho menor que la dosis usada actualmente de Photofrin II® (aproximadamente 5-40 mg HpD/kg de peso corporal) o Tookad® (aproximadamente 2-10 mg/kg de peso corporal).
Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar al paciente mediante procedimientos convencionales usados en PDT, por ejemplo, de forma sistémica, en particular por inyección, más preferiblemente por inyección intravenosa, de forma local por inyección directa en el tumor sólido o tópica para el tratamiento de enfermedades y afecciones de la piel.
La invención se ilustrará ahora mediante los siguientes ejemplos.
Ejemplos
I. Sección química
En los ejemplos de la presente memoria, los compuestos intermedios y compuestos 1 -10 y los conjugados de la invención (11 -24) se presentarán por sus respectivos números arábigos en negrita y subrayados según la siguiente Lista de compuestos y el Apéndice. Las fórmulas de todos los compuestos y conjugados se presentan en el Apéndice al final de la descripción, justo antes de las Referencias.
Lista de compuestos
1. Bacterioclorofila a (Bchl a)
2. 132-OH-Bacterioclorofila a (132-OH-Bchl a)
3. Bacteriofeoforbida a (Bpheid a)
4. 132-OH-Bacteriofeoforbida a (132-OH-Bpheid a)
4a. Bacteriopurpurina 18 (BPP 18)
5. Clorofila a (Chl a)
6. Feoforbida a (Pheid a)
7. Paladio-Bacteriofeoforbida a (Pd-Bpheid)
8. Sal de potasio de paladio-31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida 9. Manganeso(III)-132-OH-Bacteriofeoforbida a (Mn(III) 132-OH-Bpheid a)
10. Sal de potasio de paladio-31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2,3-dihidroxipropil)amida
11. Sal de potasio de paladio-31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)airiida-173-(RGD-4C)amida
12. Manganeso(IN)-132-OH-Bacteriofeoforbida-173-(cicloRGDfK)amida
13. Sal de potasio de 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)airiida-173-(cicloRGDfK)amida
14. Sal de potasio de manganeso(IN)-31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida-173-(cicloRGDfK)amida
15. Sal de potasio de cobre(II)-31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida-173-(cicloRGDfK)amida
16. Sal de potasio de 31,32-dideshidrorodoclorina 131-(2-sulfoetil)amida-173-(cicloRGDfK)amida
17. Sal de potasio de manganeso(IN)-31,32-dideshidrorodoclorina 131-(2-sulfoetil)amida-173-(cicloRGDfK)amida
18. Sal de potasio de cobre(II)-31,32-dideshidrorodoclorina 131-(2-sulfoetil)amida-173-(cicloRGDfK)amida 19. Sal de potasio de paladio-Bacteriopurpurina N-(3-sulfopropilamino)imida-173-(cicloRGDfK)amida 20. Meso-5-(4-cicloRGDfK-benzamido)-10,15,20-tris(4-carboxifenil)porfina
21. Cobre(II)-meso-5-(4-cicloRGDfK-benzamido)-10,15,20-tris(4-carboxifenil)porfina
22. Gadolinio(IN)-meso-5-(4-cicloRGDfK-benzamido)-10,15,20-tris(4-carboxi fenil)porfina
23. Paladio-31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2,3-dihidroxipropil)amida-173-(cicloRGDfK)amida
24. Sal de potasio de paladio-31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida-173-(cicloRGDfK)amida.
25. sal de potasio de la 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida.
26. Sal de potasio de 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida-173-(GRGDSP)amida
27. Bacteriofeoforbida-173-(cicloRGDfK)amida
28. 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(3-[(3-aminopropil)amino]propil)amida-173-(cicloRGDfK)amida
29. 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 31-(2,3-dihidroxipropil)amida-173-(cicloRGDfK)amida 30. 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-morfolino-N-etil)amida-173-(cicloRGDfK)amida 31. 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-{3-[4-(3-aminopropil)-piperazin-1-il]-propil}amida-173-(cicloRGDfK)amida
32. Bacteriofeoforbida-173-(2-cicloRGDK-amido-N-etil)amida
33. Sal de potasio de paladio-31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida-173-(GRGDSPK)amida
34. Sal de potasio de paladio-31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida-173 [(GRGDSP) 4 K]amida
35. Sal de potasio de paladio-31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacteriodorina 131-(2-sulfoetil)amida-173-(cicloRGDf-N(Me)K)amida
36. Sal de potasio de paladio-31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacteriodorina 131-(2-sulfoetil)-173-N-[4-ácido heptanodioico-bis-(cicloRGDyK-amido)]amida
37. Paladio-31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131,173-ciclo(2-RGD-amido-N-etil)diamida 38. 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131,173-ciclo(2-RGD-amido-N -etil)diamida
39. Paladio-31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131,173-ciclo{3-[4-(3-aminopropil-DGR-amido)-piperazin-1-il]-propil} diamida
40. Sal de potasio de paladio-31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida-173-[4-(metil-5-(6-guanidino-hexanoilamino)-ácido pentanoico)]amida
41. Sal de potasio de paladio-31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida-173-[7-amido-3-[[1-(4-guanidino-butiril)-piperidina-3-carbonil]-amino]-ácido heptanoico]
42. Sal de potasio de paladio-31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida-173-(cicloRADfK)amida
43. 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(3-DTPA-amido-N-propil)amida-173-(cicloRGDfK)amida
44. 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(3-Gd-DTPA-amido-N-propil)amida-173-(cicloRGDfK)amida
Materiales y métodos
(i) La bacterioclorofila a (Bchl a), i , se obtuvo como describen Scherz y Parson, 1984. El procedimiento empezaba con la extracción de pigmentos de células secas (liofilizadas) de la bacteria fotosintética Rhodovulum sulfidophilum. La purificación del extracto de pigmento bruto se llevó a cabo por cromatografía en columna de DEAE-Sepharose según Omata y Murata, 1983. Brevemente, la DEAE-Sepharose se lavó con agua destilada y después se convirtió en una forma de acetato por suspensión en un tampón de acetato de sodio 1 M (pH= 7). La suspensión se lavó 3 veces con acetona y finalmente se suspendió en metanol-acetona (1:3, v:v) para almacenamiento a 5°C. La pureza se comprobó por cromatografía en capa fina (TLC). La descripción detallada de las condiciones de TLC se puede encontrar en Fiedor et al., 1992.
(ii) La 132-OH-Bacterioclorofila a (132-OH-Bchl), 2, se produjo por alomerización de Bchl a, agitando una solución en metanol de Bchl a (1 g/ml) en la oscuridad, en contacto con el aire, como se describe en Struck et al., 1992.
(iii) La Bacteriofeoforbida (Bpheid), 3, y 132-OH-Bacteriofeoforbida (132-OH-Bpheid) 4, se sintetizaron siguiendo a Wasielewski y Svec, 1980, por desmetalación-desesterificación de la correspondiente Bchl a o 132-OH-Bchl a con ácido trifluoroacético acuoso al 80%. La purificación de Bpheid o 132-OH-Bpheid sintetizada se lleva a cabo en columna de sílice ("Kieselgel 60", Merck, Alemania) con gradiente de metanol en cloroformo (de 0 a 15/25% en vol.) como eluyente.
(iv) Clorofila a (Chl), 5, y (v) Feoforbida a (Pheid), 6. La Chl se obtuvo de las cianobacterias Spirulina platensis siguiendo la misma rutina de la obtención de Bchl (véase antes). Además, la Chl se convierte en Pheid siguiendo el mismo procedimiento descrito antes para Bpheid.
(vi) La Bacteriofoforbida de paladio a (Pd-Bpheid a), 7, se sintetizó como se describe en la publicación internacional WO2000/033833 (Ejemplo 2 en el mismo)
(vii) La sal de potasio de paladio-31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rhodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida, 8, se sintetizó como se describe en la publicación internacional WO2004/045492 (Ejemplo 1, síntesis del compuesto 4).
(viii) sal de dipotasio de 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rhodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida, 25, se sintetizó por reacción de Bpheid con taurina como se describe en la publicación internacional WO2004/045492 (Ejemplo 2, síntesis del compuesto 5).
(ix) La Bacteriopurpurina 18 (BPP18), 4a se sintetizó como describen Mironov et al., 1992.
(x) La resina, los derivados de aminoácidos, N-hidroxibenzotriazol (HOBt) y hexafluorofosfato de benzotriazol-1 -il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio (PyBOP) se adquirieron de Novabiochem; la N,N-diisopropiletilamina (DIEA), N,N'-diisopropilcarbodNmida (DIC) etilendiamina, 1,4-bis(3-aminopropil)-piperazina, ácido 1,3-dimetilbarbitúrico (DMBA), ácido dietilditiocarbámico, sal de sodio (DEDTC), 2,2,2-trifluoroetanol (TFE), triisopropilsilano (TIS), 1,2-etanoditiol (EDT), ácido trifluoroacético (TFA), meso-tetra(4-carboxifenil)porfina, L-ascorbato de sodio y ácido 4-oxoheptanodioico, se adquirieron en Aldrich (EE.UU.); la N-hidroxisuccinimida (NHS) se adquirió de Sigma (EE.UU.); la N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS), 1,3-diciclohexilcarbodiimida (DCC), N-(3-dimetilaminopropilo)-N'-etilcarbodiimida (EDC), ácido N-Fmoc-6-aminohexanoico, ácido Np-Fmoc-Nw-Boc-p-L-homolisina y ácido N-Fmoc-piperidina-3-carboxílico se adquirieron en Fluka (Suiza); el acetato de cadmio, acetato de cobre y cloruro de manganeso (II) eran de Merck (Alemania), y el tetrakis(trifenilfosfina)paladio se obtuvo de Acros.
En general se usaron productos químicos y disolventes de calidad analítica, excepto cuando se lleva a cabo la HPLC, donde se aplican disolventes de calidad de HPLC.
(x) Síntesis de péptidos - Los péptidos se sintetizaron por métodos de fase sólida mediante química de Fmoc usando aminoácidos protegidos y se ciclaron según procedimientos comunes en la técnica. La eliminación del grupo Fmoc y la finalización de los acoplamientos se siguieron por la prueba de la ninhidrina (Kaiser). Se usó TFA o una solución cóctel de TFA/tioanisol/H 2 O/triisopropilsilano (TIS) se para la separación del péptido de la resina simultáneamente con la desprotección (Arg-pentametilcroman-6-ilsulfonilo (Pmc) o 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo (Pbf); Asp-OtBu; Ser-ferc-butilo (tBu); Lys-terc-butiloxicarbonilo (Boc), aliloxicarbonilo (Alloc) o Dde).
(i) Los péptidos lineales GRGDSPK, (GRGDSP) 4 K o GRGDSP se obtuvieron usando resina de Fmoc-Lys(Boc)-Wang o resina de cloruro de 2-clorotritilo, respectivamente.
(ii) Los péptidos cíclicos (cicloRGDfK), (cicloRGDyK), (cicloRADfK) y (cicloRGDf-N(Me)K) se prepararon por síntesis de pentapéptidos en resina de cloruro de 2-clorotritilo y su posterior ciclación en solución como se describe en Haubner et al., 1999. Se preparó lisina protegida con Na-metilo a partir del ácido 2-aminoheptanodioico como se ha descrito previamente (Freidinger et al., 1983). Se describe otro método de síntesis de cicloRGDfK por ciclación en la resina en el ejemplo 13 en la presente memoria.
(iii) El péptido cíclico RGD-4C se preparó por síntesis de CDCRGDCFCG por protocolo de síntesis en fase sólida convencional y su ciclación por formación oxidativa espontánea de enlaces disulfuro (Koivunen et al.
1995).
(iv) El peptidil cíclico-amina cicloRGDK-NH 2 se sintetizó en clorotritilo-resina (protecciones: Arg-Pbf; Asp-OtBu; NE-Lys-Alloc). Después, el grupo Fmoc N-terminal y el grupo protector Alloc en el £-amino del resto lisina se escindieron, y se permitió la ciclación entre los dos aminos a través de un enlace urea usando N,N'-carbonildiimidazol (CDI) durante 12-16 h. El péptido cíclico se escindió del soporte y el carboxilato de la lisina se hizo reaccionar con 1,2-diaminoetano (activación con DCC) para obtener la peptidilamina requerida.
(v) Dímero ciclopeptídico (cicloRGDyK) 2 . El ácido 4-oxoheptanodioico se convirtió en ácido 4-aminoheptanodioico según Wanunu et al., 2005. Después, el grupo amino se protegió con Boc y los restos carboxílicos se activaron con NHS/DCC en DMF. El diéster se purificó en una columna de sílice con cloroformo-metanol, y después se hizo reaccionar con cicloRGDyK en DMF que contenía DIEA durante la noche. La protección Boc se escindió con TFA-agua-diclorometano (DCM) (90:5:5). El compuesto deseado se purificó por HPLC.
(vi) Los peptidomiméticos de RGD (RGD-PM1, RGD-PM2) se obtuvieron según la publicación internacional WO93/09795. En concreto, un grupo amino del ácido etil-5-amino-4-aminometil)pentanoico (Vaillancourt et al. 2001 y ref. en el mismo) se protegió con una cantidad equimolar de anhídrido de Boc y el grupo carboxílico se protegió con alcohol terc-butílico. El producto se purificó en una columna de sílice y se acopló con ácido N-Fmoc-6-aminohexanoico seguido de desprotección de Fmoc y conversión de la amina en guanidinio con nitrato de 3,5-dimetilpirazol-1-carboxamidina (pH 9.5; 50°C). Finalmente, el N-Boc y el O-tBu se eliminaron con TFA, y el producto RGD-PM1 se purificó por HPLC. La síntesis de RDG-PM1 se representa en el Esquema 3. Para la síntesis de RGD-PM2 (véase Esquema 3), se unión Np-Fmoc-Nw-Boc-p-L-homolisina a la resina Wang. A continuación, se llevaron a cabo acoplamientos con ácido N-Fmoc-piperidina-3-carboxílico y ácido N-Fmoc-4-aminobutírico usando métodos de fase sólida. Después de la formación de guanidinio (como se ha descrito antes), el material resultante se desprotegió y se eliminó de la resina con TFA, y el producto RGD-PM2 se purificó por HPLC.
(ix) TLC: placas de sílice (Kieselgel-60, Merck, Alemania); cloroformo-metanol (4:1, v/v).
(x) Los coeficientes de extinción de los metalocomplejos se determinaron correlacionando la concentración de metal central (usando fotometría de llama con sal metálica como referencia) con la densidad óptica de la solución examinada en la longitud de onda particular.
(xi) Espectros de masas. Los espectros de masas de ionización por electropulverización (ESI-MS) se registraron en un espectrómetro LCZ de plataforma (Micromass, Inglaterra). Las mediciones del espectro de masas de ionización/desorción por láser asistida por matriz (MALDI-TOF-MS) se realizaron en un instrumento Bruker REFLEX de tiempo de vuelo (Bruker Daltonics, EE.UU.).
(xii) Los espectros de absorción óptica (UV-VIS) de los diferentes complejos se registraron con espectrofotómetros Genesis-2 (Milton Roy, Inglaterra), V-570 (JASCO, Japón) o Shimadzu UV-1650PC (Japón).
(xiii) La HPLC se llevó a cabo usando un instrumento LC-900 (JASCO, Japón) equipado con un detector de matriz de diodos UV-915, o un sistema Waters Delta Prep 4000 equipado con un detector de absorbancia sintonizable UV-VIS Waters 486 y un colector de fracciones Waters, controlado por el programa Millennium v3.05. El caudal se ajustó a 75 ml/min, usando una columna preparativa (Vydac C18, 218TP101550, 50 x 250 mm, 10-15 |jm), el detector se ajustó a la longitud de onda de 380 nm y el colector de fracciones se ajustó en un modo de tiempo de 6 s/fracción. Los disolventes usados en la purificación por HPLC eran los siguientes: Disolvente A: solución 50 mM de acetato de amonio en H2O; disolvente B: acetonitrilo.
(ivx) LC-MS API 150EX (Applied Biosystems/MDS SCIEX), se llevó a cabo usando la columna YMS-Pack Pro C18. Fase móvil: disolvente A: 0.2% de AcOH/0.12% de NH4OH/H2O; disolvente B: 4.75% de A/0.2% de AcOH/acetonitrilo. Caudal: 200 jl/min. Gradiente: 20% de B (0-2min) a 95% de B (25-30 min).
Ejemplo 1. Síntesis del conjugado 11
El compuesto 8, obtenido como se describe en Materiales y Métodos, se conjugó directamente con el péptido cíclico RGD-4C como se describe en el Esquema 1, como sigue: el compuesto 8 (10 mg) se hizo reaccionar durante la noche con NHS (20 mg) en presencia de EDC (20 mg) en DMSO (3 ml). El éster de succinimida activado obtenido (Bauminger y Wilchek, 1980) se purificó en una columna de sílice usando CHCh:MeOH (6:1, vol.), se secó y se mantuvo en atmósfera de argón en la oscuridad hasta su uso posterior. Se disolvió RGD-4C (2 mg, 1.97 jmoles) en 800 j l de DMSO y se añadió al éster activado (4.8 mg, 5.13 jmoles en 800 j l de DMSO y 400 j l de tampón de NaHCO3 0.1 M, pH 8.5). La mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente durante 24 horas y se agitó en atmósfera de argón. El conjugado obtenido 11 se purificó usando HPLC y se identificó por espectroscopia de masas (1837 m/z) (Figs. 1A-1C) Rendimiento: 18%.
Ejemplo 2. Síntesis del conjugado 12
El conjugado 12 se preparó partiendo de la síntesis del compuesto 9.
(i) Síntesis del compuesto 9
El compuesto 4 (20 mg), obtenido como se describe en Materiales y Métodos, se disolvió en DMF (8 ml) que previamente se había pasado a través de columna de alúmina B (1x5 cm), y se burbujeó con argón durante 5­ 10 minutos. Se añadió acetato de cadmio (85 mg, 10 eq. a 4 ) y la mezcla de reacción se calentó a 110°C. El progreso de la reacción se controló espectralmente (en acetona). La metalación ocurrió en 5 minutos. Se añadió MnCh'2H2O (55 mg, 10 eq.) mientras se agitaba hasta que se completó la reacción (en 5-10 minutos adicionales). Para separar las sales inorgánicas, la solución de reacción se evaporó; el sólido se volvió a disolver en acetonitrilo, la solución se filtró a través de papel Whatman en embudo Buchner y se evaporó. Finalmente, se llevó a cabo la HPLC del producto bruto redisuelto en agua (instrumento LC-900, JASCO, Japón; columna S10P-jm ODS-A 250x20 mm, YMC, Japón) con acetonitrilo acuoso al 50% como una fase móvil con un caudal de 8 ml/min, y el producto puro 9 eluyó a los 10.5 -13.5 min, proporcionando una separación completa del producto de las mezclas de clorina y los subproductos. Rendimiento: 88%.
La estructura del compuesto 9 se confirmó espectralmente (véase el espectro electrónico representado en Fig. 2A) y por espectro de masas (Fig. 2B, ESI-MS, modo positivo y también modo negativo para comprobar la ausencia de MnCh; 679 m/z).
(ii) Síntesis del conjugado 12
El compuesto 9 (15 mg) se disolvió en DMSO con sulfo-NHS (30 mg) y DCC (24 mg), la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente en atmósfera de argón durante la noche, se evaporó, se redisolvió en tampón de fosfato 5 mM pH 8.0 (1.5 ml) y se filtró. Se añadió cicloRGDfK (30 mg) en DMSO (2.5 ml) al filtrado, la mezcla se agitó en atmósfera de argón durante 6 horas, se evaporó, se redisolvió en agua (2 ml) y se purificó en HPLC en columna preparativa C18 usando una elución con gradiente de acetonitrilo en agua, 10-40%, durante 15 min, flujo 7 ml/min. El conjugado purificado 12 se secó a presión reducida y se almacenó a -20°C en atmósfera de argón hasta la aplicación.
Ejemplo 3. Síntesis del conjugado 14
El compuesto del título se preparó a partir de la síntesis del conjugado 13 no metalado, como sigue.
(i) Síntesis del conjugado 13
Bpheid (compuesto 3) (40 mg), preparado como se ha descrito antes en Materiales y métodos, se activó con NHS (80 mg) y DCC (60 mg) en cloroformo (5 ml) con agitación, a temperatura ambiente durante la noche. El éster activado obtenido se purificó en una columna de sílice usando cloroformo como eluyente, y después se hizo reaccionar con cicloRGDfK (40 mg) en DMSO (5 ml) con agitación y atmósfera de argón durante la noche. Después, se añadió a la reacción taurina (50 mg) disuelta en hidrogenofosfato dipotásico 1 M (1.5 ml, pH ajustado a 8.2), y la mezcla se evaporó, conduciendo al compuesto putativo 13. El producto se purificó por HPLC en fase inversa usando elución con gradiente con tampón de fosfato 5 mM, pH 8.0 y metanol, como se ha descrito previamente (Brandis et al., 2005). Rendimiento: 52%.
(ii) Síntesis del conjugado 14
Se insertó manganeso en el compuesto 13 usando el procedimiento empleado en el Ejemplo 2. El producto, el conjugado 14, se purificó por HPLC usando elución con gradiente con acetonitrilo y agua como se ha descrito previamente (Brandis et al., 2005).
Ejemplo 4. Síntesis del conjugado 15
Se añadió una solución acuosa de acetato de cobre (2 mg) a una mezcla de conjugado 13 (3 mg) (preparado en el ejemplo 3 (i)) y ascorbato de sodio (2 mg) en agua. La reacción se controló inmediatamente por espectrofotometría. Después de la inserción del cobre en el macrociclo, el producto se purificó en un cartucho RP-18 (Lichrolut, Merck), primero usando agua para separar por lavado el acetato de cobre y ascorbatos que no habían reaccionado, y después metanol para la elución del compuesto principal, el conjugado 15, que se recogió y se evaporó. Rendimiento: 86%.
Para la preparación de conjugados radiactivos, se usa el mismo procedimiento con sales solubles en agua distintas del acetato de isótopo radiactivo recién preparado 64Cu o 67Cu (t-i /2 es 12.70 h y 2.58 d, respectivamente).
Ejemplo 5. Síntesis del conjugado 17
El compuesto del título se preparó partiendo de la preparación del conjugado 16 no metalado.
(i) Síntesis del conjugado 16
El conjugado 16 se preparó como en el ejemplo 3(i), pero usando Pheid (compuesto 6) como material de partida en lugar de Bpheid.
(ii) Síntesis del conjugado 17
El conjugado 17 se sintetizó según el procedimiento descrito en el ejemplo 3(ii), usando el conjugado 16 obtenido anteriormente como material de partida.
Ejemplo 6. Síntesis del conjugado 18
El compuesto del título se sintetizó siguiendo el procedimiento del ejemplo 5 anterior, usando el compuesto 16 como material de partida.
Ejemplo 7. Síntesis del conjugado 19
La preparación del conjugado 19 se describe esquemáticamente en el Esquema 2 a continuación.
Se mezclaron la bacteriopurpurina 18 (BPP 18), 4a (20 mg) obtenida como se describe en Materiales y métodos y acetato de paladio (10 mg) en cloroformo (8 ml) con ascorbato de palmitoilo (25 mg) en metanol (12 ml). Después de 20 min de agitación, la reacción se había completado (el control se levó a cabo por espectrofotometría) y la mezcla se agitó con cloroformo/agua. La capa orgánica se recogió, se secó sobre sulfato de sodio, se evaporó y se purificó en columna de sílice con elución de cloroformo-acetona, para obtener Pd-BPP 18. Espectro UV-ViS: 342, 414, 534 y 810 nm en cloroformo.
La Pd-BPP 18 (18 mg) se agitó con hidrato de hidrazina (12 pl) en piridina (8 ml) durante 35 min, la mezcla de reacción se vertió en cloroformo (30 ml) y en HCl 1 N (30 ml), y se agitó durante 2 h adicionales. Después, la capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se añadió propanosultona (50 mg) y la mezcla se agitó durante 10 min y se evaporó. El residuo se trató con amoniaco acuoso (28%, 3 ml) durante 30 min para eliminar la sultona sin reaccionar por conversión en sulfopropilamina, y la mezcla se evaporó de nuevo. Se añadió agua (3 ml) para disolver el residuo y el producto se purificó en un cartucho RP-18 (Lichrolut, Merck), primero usando agua para separar por lavado la sulfopropilamina, y después metanol para la elución del compuesto principal, obteniendo así Pd-Bacteriopurpurina-N-(3-sulfopropilamino)imida (espectro UV-VIS: 344, 417, 528 y 822 nm en agua).
La Pd-Bacteriopurpurina-N-(3-sulfopropilamino)imida (10 mg) se hizo reaccionar durante la noche con NHS (20 mg), en presencia de EDC (20 mg) en DMSO (3 ml). El éster activado obtenido se purificó en una columna de sílice usando CHCh:MeOH (5:1), se secó y se mantuvo en atmósfera de argón en la oscuridad hasta su uso posterior.
Se disolvió el CicloRGDfK (5 mg) en 1 ml de DMSO, se añadió al complejo activado (5 mg) en 1 ml de DMSO, y la mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente durante 24 horas, y se agitó en atmósfera de argón. El conjugado obtenido 19 se purificó usando HPLC, y se identificó por espectroscopía de masas (ESI-MS modo positivo, 1415 m/z).
Ejemplo 8. [Compuesto de referencia] Síntesis del conjugado 21
El compuesto del título se preparó partiendo de la síntesis del conjugado 20 como sigue.
(i) Síntesis del conjugado 20
Se mezcló meso-tetra(4-carboxifenil)porfina (20 mg, 25 |jmol) con sulfo-NHS (4 mg, 36 |jmol) y EDC (6 mg, 30 |jmol) en DMSO (6 ml), y se agitó a temperatura ambiente durante 24 h. Después, se añadió cicloRGDfK (20 mg, 33 jimol), la mezcla de reacción se agitó durante 24 horas más, y después se evaporó hasta sequedad, se redisolvió en agua y se purificó en HPLC en una columna preparativa C-is, usando una elución con gradiente de acetonitrilo en ácido acético al 0.2% 30-50% durante 15 min, flujo de 6 ml/min. El conjugado 20 purificado se secó a presión reducida y se almacenó a -20°C.
(ii) Síntesis del conjugado 21.
El conjugado 20 (4 mg) se disolvió en metanol acuoso al 50% y se añadieron soluciones acuosas de acetato de cobre (2 mg) y ascorbato de sodio (2 mg). La reacción se completó en 2 min (controlada por espectrofotometría). El producto se purificó en un cartucho RP-18 (Lichrolut, Merck), primero, usando agua para separar por lavado el acetato y ascorbato de cobre sin reaccionar, y después metanol para la elución del compuesto principal, el conjugado 21, que se recoge y se evapora (Espectro de UV- VIS: 418 y 538 nm en agua).
Ejemplo 9. [Compuesto de referencia] Síntesis del conjugado 22
El conjugado 20 (4 mg), obtenido en el ejemplo 8(i) anterior y acetilacetonato de gadolinio (10 mg) se calentaron en imidazol (0.3 g) a 210°C, como se ha descrito previamente (Horrocks et al., 1978). La reacción se completó en 50 min (controlada por espectrofotometría). Después de la sublimación del imidazol, el producto se redisolvió en agua y se purificó por HPLC, como se describe en el ejemplo 8(i).
Ejemplo 10. Síntesis del conjugado 23
El conjugado 23 se preparó partiendo de la síntesis del compuesto 10.
(i) Síntesis del compuesto 10
Se disolvió Pd-Bpheid a (compuesto 7) (100 mg) en N-metilpirrolidona (1 ml) y 3-amino-2-propanodiol (405 mg) y la solución se mezcló durante 3 horas a temperatura ambiente en atmósfera de argón. El producto 10 se purificó por HPLC usando una columna preparativa YMC-C18 con ácido acético al 0.2%/acetonitrilo. Rendimiento: 86%. El análisis se llevó a cabo en LC-MS usando una columna analítica YMC-C18 con acetato de amonio, pH4.5/acetonitrilo. ESI-MS modo positivo, 805 m/z.
(ii) Síntesis del conjugado 23
El compuesto 10 (50 mg), NHS (80 mg) y DCC (216 mg) se disolvieron en N,N-dimetilformamida seca (8 ml). La solución se agitó durante 90 minutos a temperatura ambiente bajo atmósfera de argón. El éster activo formado se purificó en HPLC usando una columna preparativa YMC-C18 con ácido acético al 0.2%/acetonitrilo, se analizó en LC-MS usando una columna analítica YMC-C18 con acetato de amonio, pH 4.5/acetonitrilo, y se identificó por espectroscopía de masas: ESI-MS modo positivo, 902 m/z.
El éster activo (10 mg) se disolvió en N-metilpirrolidona seca (1 ml). Se añadieron cicloRGDfK (8 mg) y trietilamina (10 jil) y la solución se agitó durante 75 min. El producto se purificó por HPLC usando una columna preparativa YMC-C18 con ácido acético al 0.2%/acetonitrilo. Rendimiento: 50%. El análisis se llevó a cabo por LC-MS usando una columna analítica YMC-C18 con acetato de amonio pH4.5/acetonitrilo: ESI-MS modo positivo, 1393 m/z.
Ejemplo 11. Síntesis del conjugado 24
El compuesto 8 (100 mg) se activó con NHS (70 mg) y N-ciclohexilcarbodiimida-N'-metil-poliestireno (120 mg) en DMF (5 ml). La solución se agitó a 50°C durante 15 horas y se filtró a través de un vidrio sinterizado. El cicloRGDfK (100 mg) se disolvió en DMF (5 ml) que contenía N-metilmorfolina (100 |jl) y se añadió al filtrado. La mezcla se agitó en atmósfera de argón a temperatura ambiente durante 24 horas, el disolvente se evaporó a vacío y el producto 24 se purificó en HPLC usando una columna preparativa YMC-C18 con acetato de amonio pH4.5/acetonitrilo. Rendimiento: 23%. El análisis se realizó en LC-MS con columna analítica YMC-C18 en las mismas condiciones. Espectro UV-VIS (HPLC): 332, 386, 516 y 750 nm. ESI-MS modo positivo, 1425 m/z.
Ejemplo 12. Síntesis del conjugado 26
A la GRGDSP-resina desprotegida de Fmoc (0.35 mmoles), se añadió una mezcla de compuesto 25 (530 mg, 0.7 mmoles), HOBt, PyBOP (ambos 0.7 mmoles) y DIEA (2.1 mmoles) en 6 ml de DMF, y el la reacción se agitó durante 2 h en atmósfera de argón. Después de lavar con DMF (10 x 5 ml) y DCM (5 x 5 ml), la resina se secó a vacío durante al menos 3 h. Después, el péptido-conjugado se escindió de la resina y se desprotegió (Arg, Pbf; Asp, OtBu) usando una solución de cóctel de TFA/tioanisol/H2O/triisopropilsilano (TIS) 85:5:5:5 (10 ml) durante 10 min a 0°C y luego 1 h a temperatura ambiente bajo atmósfera de Ar. La resina se filtró y se lavó con la solución de cóctel (4 ml) y los filtrados combinados se evaporaron mediante una corriente de N2 a aproximadamente la mitad de su volumen. Tras la adición de Et2O frío (30 ml), apareció un precipitado oscuro. La centrifugación y decantación del a capa Et2O y tratamiento adicional con Et2O frío (2 x 30 ml) proporcionó el sólido oscuro bruto, que se purificó más por RP-HPLC (264 mg; 58%). El análisis se llevó a cabo en LC-MS usando una columna analítica YMC-C18 con acetato de amonio pH4.5/acetonitrilo: ESI-MS modo positivo, 1306 m/z.
Ejemplo 13. Síntesis de conjugados 28-31
Los compuestos del título se prepararon partiendo de la síntesis del conjugado Bpheid-cicloRGDfK 27 no metalado, como sigue.
(i) Síntesis en fase sólida de cicloRGDfK
El ácido aspártico protegido con fmoc-C°'alilo se unió a la resina de cloruro de 2-clorotritilo. A continuación, se unieron glicina, NG'Pbf arginina, NE-Dde lisina y la fenilalanina a la resina mediante procedimientos químicos de Fmoc habituales, formando fKRGD peptidil-resina. Después, el grupo Fmoc N-terminal se eliminó con 2% de piperidina/DMF, y el grupo Ca-alilo en el resto ácido aspártico se eliminó con tetrakis(trifenilfosfina)paladio y ácido 1,3-dimetilbarbitúrico (DMBA) en DCM. El péptido se cicló en presencia de HOBt/PyBOP y DIEA. La £-amina del resto de lisina se escindió con hidrazina/DMF al 4%.
(ii) Síntesis del conjugado 27
Se unió Bpheid (3, 0.6 mmol) a £-NH2-Lys en la fKRGD peptidil-resina (0.3 mmol) en DMF usando PyBOP/HOBt (0.6 mmol) como agentes de acoplamiento y DIEA (1.8 mmol) como base, obteniendo así el conjugado 27.
(iii) Síntesis de conjugados 28 - 31.
El conjugado 27 (0.1 mmol) se trató en la resina con la amina adecuada de la Tabla 1 (5-6 mmol) en DMF a temperatura ambiente durante 2 h. Después, el exceso de amina se separó por lavado, el producto se desconectó de la resina, se desprotegió con el cóctel que contenía TFA y finalmente se purificó por RP-HPLC. El análisis se llevó a cabo en LC-MS usando la columna analítica YMC-C18 con acetato de amonio pH 4.5/acetonitrilo. Los resultados se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1. Rendimiento y ESI-MS de los conjugados 28-31
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Ejemplo 14. Síntesis del conjugado 32
El conjugado 32 se obtuvo por acoplamiento de peptidilamina cicloRGDK-NH2 (obtenida como se describe en Marteriales y métodos) y Bpheid a (3) en solución de DMF en presencia de DCC, seguido de desprotección de Pbf y O-tBu con TFA. El producto se purificó por RP-HPLC. Rendimiento: 53%. El análisis se llevó a cabo en LC-Ms usando una columna analítica YMC-C18 con acetato de amonio pH 4.5/acetonitrilo: ESI-MS modo positivo, 1135 m/z.
Ejemplo 15. Síntesis del conjugado 33
El conjugado 33 se obtuvo conjugando el compuesto 8 con el péptido lineal GRGDSPK (obtenido como se describe en Materiales y métodos) de manera similar al método descrito para el conjugado 24 en el ejemplo 11. Rendimiento: 55%. El análisis se llevó a cabo por LC-MS usando una columna analítica YMC-C18 con acetato de amonio pH 4.5/acetonitrilo: ESI-MS modo positivo, 1537 m/z.
Ejemplo 16. Síntesis del conjugado 34
El conjugado 34 se obtuvo conjugando el compuesto 8 con el péptido lineal (GRGDSP)4K (obtenido como se describe en Materiales y métodos) de manera similar al método descrito para el conjugado 24 en el ejemplo 11. Rendimiento: 41%. El análisis se llevó a cabo por LC-MS usando una columna analítica YMC-C18 con acetato de amonio pH 4.5/acetonitrilo. MALDI-MS modo positivo, 3291 (M 2Na) m/z.
Ejemplo 17. Síntesis del conjugado 35
El conjugado 35 se obtuvo conjugando el compuesto 8 con cicloRGDf-N(Me)K (obtenido como se describe en Materiales y métodos) de manera similar al método descrito para el conjugado 24 en el ejemplo 11. Rendimiento: 58%. El análisis se llevó a cabo por LC-MS usando una columna analítica YMC-C18 con acetato de amonio pH 4.5/acetonitrilo: ESI-MS modo positivo, 1439 m/z.
Ejemplo 18. Síntesis del conjugado 36
El conjugado 36 se obtuvo conjugando el compuesto 8 con el péptido dímero cíclico (cicloRGDyK)2 (obtenido como se describe en Materiales y métodos) de manera similar al método descrito para el conjugado 24 en el ejemplo 11. Rendimiento: 27%. El análisis se llevó a cabo por LC-MS usando una columna analítica YMC-C18 con acetato de amonio pH 4.5/acetonitrilo. MALDI-MS modo positivo, 2245 (M 2Na) m/z.
Ejemplo 19. Síntesis del conjugado 37
El conjugado 37 se sintetizó a partir de Pd-Bpheid (compuesto 7) y el péptido de RGD. El péptido se preparó por el procedimiento en fase sólida por acoplamiento de Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH a un resto de H-Asp-O-Alilo unido a resina.
(i) Preparación del dipéptido protegido Arg-Gly
Una solución de Fmoc-Gly-OH (4.162 g; 14 mmol) y DIEA (9.755 g; 56 mmol) en 100 ml de DCM seco se agitó con 10 g de resina de cloruro de 2-clorotritilo (1.4 mmol/g) durante 1 hora a temperatura ambiente (t.a.). El grupo Fmoc se eliminó por tratamiento con piperidina al 5% en DMF/DCM (1:1), seguido de piperidina al 20% en DMF. Después, Fmoc-Arg(Pbf)-OH (18.17 g; 28 mmol) en DMF (130 ml) se activó con HOBt (4.29 g; 28 mmol) y DIC (4.34 ml; 28 mmol) durante 15 minutos a t.a. y se añadió al recipiente de reacción. La mezcla se agitó durante 2 horas a t.a. La peptidil-resina se lavó y se secó a vacío durante 3 h. El dipéptido protegido se escindió de la resina por agitación con una solución de cóctel de AcOH/2,2,2-trifluoroetanol (TFE)/DCM (1:1:3) durante 1 hora a t.a. Tras el tratamiento con Et2O frío (1 litro), el residuo aceitoso solidificó. La filtración y lavados con Et2O frío proporcionó el precipitado blanco (8.64 g; 87.5%) con homogeneidad de aproximadamente 99% (h PlC).
(ii) Síntesis del tripéptido RGD
La unión del tercer aminoácido al dipéptido obtenido en la etapa (i) anterior comenzó agitando la resina de cloruro de 2-clorotritilo (0.5 g; 1.4 mmol/g) con una solución de Fmoc-Asp-O-Alilo (138.4 mg; 0.35 mmol) y DIEA (244 |jl; 1.4 mmol) en DCM durante 1 h a t.a. para dar una carga de aproximadamente 0.7 mmol/g. Después, la resina se lavó y se eliminó el Fmoc como se ha descrito antes. Fmoc-Arg (Pbf)-Gly-OH (371 mg; 0.525 mmol), HOBt (80.4 mg; 0.525 mmol) y DIC (81 jl; 0.525 mmol) se disolvieron en 2.5 ml de d Mf y se agitaron a t.a. durante 20 minutos. La solución resultante se añadió a la resina de H-Asp-O-Alilo lavada, y la mezcla se agitó durante 2 ha t.a. La peptidil-resina se lavó y se eliminó el Fmoc.
(iii) Síntesis del conjugado 37
Una mezcla de compuesto 7 (268 mg; 0.375 mmol), HOBT (57.4 mg; 0.375 mmol) y DIC (58 j l ; 0.375 mmol) en 3 ml de DMF se agitó durante 30 min a t.a. y se añadió a una parte alícuota de tripeptidil desprotegido de Fmoc-resina obtenida en (ii) antes (aproximadamente 0.125 mmol). La mezcla se agitó durante 2 h a t.a., y se obtuvo el conjugado de 7 con el tripéptido lineal RGD. Esta reacción y todas las siguientes operaciones con peptidil-resina modificada se llevaron en atmósfera de argón en la oscuridad. Después del lavado, la resina se trató con etilendiamina (251 jl; 375 mmol) en DMF durante 1 h a t.a., después se lavó. Con el fin de eliminar el grupo protector de alilo, la resina se hizo reaccionar con una solución de [(C6H5)3P]4Pd0 (87 mg; 0.075 mmol) y DMBA (137 mg; 0.875 mmol) en DCM durante 2 h a t.a.
La ciclación en la resina se logró uniendo el resto Asp desprotegido al resto etilendiamino usando una solución de PyBOP (195 mg; 0.375 mmol) y DIEA (131 |jl; 0.75 mmol) en DMF durante 2 horas a t.a. La resina se lavó y se secó a vacío durante 3 h. El conjugado de péptido se escindió de la resina usando una solución de cóctel de TFA/tioanisol/H2O/TIS/EDT (82.5:5:5:5:2.5) durante 10 min a 0°C y después 1 hora a t.a. Tras la adición de Et2O frío (25 ml), se obtuvo un sólido oscuro. El producto bruto (95 mg) se purificó por RP-HPLC para dar 2 mg de conjugado de RGD cíclico puro (98%) 37. ESI-MS 1087 (M H) m/z.
Ejemplo 20. Síntesis del conjugado 38
La síntesis se llevó a cabo en una escala de 0.175 mmol usando el mismo procedimiento que se describe en el ejemplo 19, pero partiendo del compuesto Bpheid 3 en lugar de Pd-Bpheid 7. El producto bruto (160 mg) se purificó por RP-HPLC para dar 17 mg de conjugado de RGD cíclico puro (98%) 38. ESI-MS 982 (M H) m/z.
Ejemplo 21. Síntesis del conjugado 39
El procedimiento es similar al del ejemplo 19, pero se usó 1,4-bis(3-aminopropil)-piperazina para la formación del "puente" entre el resto Bpheid y el resto Asp en lugar de etilendiamina. El producto bruto (158 mg) se purificó por Rp-HPLC para dar 12.5 mg de conjugado RGD cíclico puro (99%) 39. ESI-MS 1122 (M H) m/z.
Ejemplo 22. Síntesis del conjugado 40
El conjugado 40 se obtuvo por un método similar al descrito para el conjugado 24, pero usando el peptidomimético de RGD ácido 5-(6-guanidino-hexanoilamino)-pentanoico lineal (RGD-PM1). Rendimiento: 42%. El análisis se llevó a cabo por LC-MS usando una columna analítica YMC-C18 con acetato de amonio pH 4.5/acetonitrilo: ESI-MS modo positivo, 1123 m/z.
Ejemplo 23. Síntesis del conjugado 41.
El conjugado 41 se obtuvo por un método similar al descrito para el conjugado 24, pero usando el peptidomimético de RGD ácido 1-(4-guanidino-butiril)-piperidina-3-carbonil]-amino]-heptanoico lineal (RGD-PM2). Rendimiento: 66%. El análisis se llevó a cabo por LC-MS usando una columna analítica YMC-C18 con acetato de amonio pH 4.5/acetonitrilo: ESI-MS modo positivo, 1220 m/z.
Ejemplo 24. Síntesis del conjugado 42
El conjugado 42 se obtuvo por un método similar al descrito para el conjugado 24 en el ejemplo 11, pero usando el péptido cicloRADfK. Rendimiento: 30%. El análisis se llevó a cabo por LC-MS usando una columna analítica YMC-C18 con acetato de amonio pH 4.5/acetonitrilo: ESI-MS modo positivo, 1439 m/z.
Ejemplo 25. Síntesis del conjugado 43
El compuesto del título se preparó partiendo de la síntesis del conjugado de Bacteriofeoforbida-173-(cicloRGDfK)amida 27, como se describe en el ejemplo 13.
El conjugado 27 (0.1 mmol) se trató en la resina con una 1,3-propilendiamina (6 mmol) en DMF a temperatura ambiente durante 2 h. Después, el exceso de amina se separó por lavado, y se añadieron dianhídrido de DTPA (0.2 mmol) y trietilamina (100 ml) en DMF anhidra (30 ml). Después de 1 h de agitación en atmósfera de argón, se añadió agua destilada (50 ml), seguido de agitación adicional durante 30 min. El producto 43 se desconectó de la resina, se desprotegió con el cóctel que contenía TFA y finalmente se purificó por RP-HPLC (61 mg, 37%). El análisis se llevó a cabo en LC-MS usando una columna analítica YMC-C18 con agua/acetonitrilo. ESI-MS modo negativo, 1643 m/z.
Ejemplo 26. Síntesis del conjugado 44
Se añadió cloruro de gadolinio (0.1 mmol) en una solución acuosa tamponada con acetato de sodio (0.1 N, pH 5.5) a una solución de conjugado 43 (6 pmol) en 2 ml de DMF. La mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante la noche con agitación. La formación de los quelatos de metal se verificó por LC-MS (1799 m/z). La mezcla de reacción se evaporó y el producto se purificó en un cartucho RP-18 (Lichrolut, Merck), usando primero agua para separar por lavado la sal de gadolinio sin reaccionar, y después metanol para la elución del compuesto principal, el conjugado 44, que se recogió y se evaporó (8 mg, 73%).
II. Sección biológica
Materiales y métodos
(i) RGD-4C marcado con Eu. Se añadió RGD-4C (20 nmoles en 10 j l de DDW) a 100 j l de tampón de fosfato-K (0.1 M, pH 8.5) que contenía isotiocianatofenil-DTPA-Eu (150 nmoles, 50 jl). La mezcla se incubó durante la noche a temperatura ambiente con agitación constante. Para finalizar la reacción, se añadió 1 j l de Tris-Cl (1 M, pH 7.5), la mezcla se agitó durante 5 min, después se cargó en un cartucho Sep-Pak C-18 y se lavó con DDW para eluir el Eu libre. Después, la columna se lavó con etanol acuoso al 50%, se recogieron fracciones (250-500 |jl) y se midió su fluorescencia.
Estudios in vitro
(ii) Cultivo celular. Monocapas de células endoteliales de corazón embrionario de ratón (H5V) se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)/F12 que contenía HEPES 25 mM, pH 7.4, suero de ternero fetal al 10% (FCS), glutamina 2 mM, penicilina 0.06 mg/ml y estreptomicina 0.1 mg/ml a 37°C, en 8% de CO 2 . Las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) se mantuvieron en medio M199 (con glutamina y sales de EARLE) que contenían HEPES 10 mM, pH7.4, FCS inactivado por calor al 20% (56°C, 30 min), glutamina 2 mM, gentamicina 50 mg/ml, factor de crecimiento de células endoteliales (ECGF) de 25 jg/ml, heparina 5 Ul/ml a 37°C, en 5% de CO 2 . Las células H5V fueron amablemente proporcionadas por el Dr. Annunciata Vecci, Instituto Mario Negri, Milán, Italia. Las células HUVEC se obtuvieron del Centro Médico Rambam, Haifa, Israel.
(iii) Solubilización de sensibilizantes, péptidos y sus conjugados para experimentos de cultivo celular in vitro. El compuesto 8 soluble en agua y el conjugado 11 se disolvieron en medio de cultivo (DMEM/F12) o FCS al 10% en medio o BSA 10 p M en medio o PBS antes de su uso, como se describe para cada experimento. Los compuestos insolubles en agua (RGD-4C, cicloRGDfK, compuesto 10 y conjugado 23) se disolvieron en DMSO al 100% antes de usar y se diluyeron en medio de cultivo o PBS a una concentración final de DMSO de 2% v/v. El compuesto 24 se disolvió en DMSO al 100% antes de usar y se diluyó en solución salina hasta una concentración final de DMSO del 5% v/v.
(iv) Fuente de luz. La fuente de luz para los estudios in vitro era una lámpara halógena de 100 W de fabricación casera equipada con un filtro de paso alto (A> 650 nm, filtro Safelight 1A Eastman Kodak Co., Rochester, NY, EE.UU.) y un filtro de agua de 4 cm. La lámpara se usa para iluminar (20 mW/cm2/10 min (12 J/cm2)) las placas de cultivo desde la parte inferior a la temperatura ambiente en una habitación oscura.
(v) Ensayo de fototoxicidad de los conjugados de péptido de RGD-fotosensibilizante. Para determinar la eficacia fotodinámica del pigmento in vitro en condiciones estándar, las células se cultivaron en placas de 96 pocillos y se preincubaron durante 15 o 90 minutos a 37°C o 4°C, según el protocolo del experimento indicado, con fotosensibilizante conjugado o no conjugado 0-25 jM en diferentes condiciones de medios (medio de cultivo DMEM/F12; FCS al 10% en medio o BSA 10 jM en medio) en ausencia o presencia de péptido libre en exceso (100 veces hasta 1 mM). Las células se lavaron y se iluminaron (20 mW/cm2 durante 10 min). Las placas se volvieron a poner en la incubadora de cultivo durante 24 h. La supervivencia celular se determinó usando el ensayo de viabilidad de glóbulos rojos neutros. La supervivencia celular se calculó como el porcentaje del colorante acumulado en los controles no tratados. Se realizaron determinaciones por triplicado y se muestran experimentos representativos. Se usaron tres tipos de controles: (i) control de luz: células iluminadas en ausencia de pigmentos; (ii) control de oscuridad: células tratadas con pigmentos, pero mantenidas en la oscuridad; y (iii) células no tratadas que se mantuvieron en la oscuridad.
(vi) Ensayo de viabilidad de células con rojo neutro. Después de la fotosensibilización y un período de incubación de 24 h (37°C), se determinó la supervivencia celular por acumulación de rojo neutro (Fluka Chemie, Buchs, Suiza). Después de restar los blancos del ensayo, se calculó la densidad óptica neta (570 nm) como el valor promedio de las determinaciones por triplicado. La supervivencia celular se calculó como el porcentaje de colorante acumulado en los controles no tratados.
(vii) Ensayo de desprendimiento de células (redondeadas): las células H5V se cultivaron como monocapas en una placa de 3 cm durante 24-48 h, y se incubaron durante 1 h con RGD-4C 100 jM a 4°C o 37°C. Las células se lavaron una vez y se volvieron a incubar durante tres horas con medio de cultivo nuevo a 37°C. De la misma manera, se cultivaron HUVEC como monocapas en una placa de 6 pocillos recubierta previamente con gelatina durante 48 h, y se incubaron durante 1 h con RGD-4C100 jM a 37°C. Las células se lavaron una vez y se volvieron a incubar durante 24 h con medio de cultivo nuevo a 37°C. Los cambios morfológicos de las células se determinaron usando microscopía óptica.
Estudios in vivo
(viii) Animales; Ratones macho atímicos CD1 (de 8 semanas de edad, ~30 g) se alojaron y manipularon con acceso libre a alimentos y agua en las instalaciones para animales según las directrices (1996) del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Weizmann de Ciencias, Rehovot, Israel.
(ix) Modelos tumorales de xenoinjerto, injerto y metástasis. Las monocapas de células de glioma C6 de rata cultivadas se rasparon en solución salina con una varilla de policía de caucho. Las suspensiones de monocélulas de glioma C6 de rata (2-4*106 células/ratón, 50 j l ) se implantaron por vía subcutánea (s.c.) en los lomos de los ratones. La cepa de células gliales, C6, se clonó a partir de un tumor glial de rata inducido por N-nitrosometilurea después de una serie de cultivos alternativos y pases en animales. Los tumores alcanzaron el tamaño de tratamiento, es decir, un diámetro de 7-9 mm, en 2-3 semanas. Las células de glioma C6 de rata fueron amablemente proporcionadas por el profesor Michal Neeman, Instituto Weizmann de Ciencias, Rehovot, Israel.
Las monocapas de células de carcinoma de colon CT26luc BALB/c cultivadas transfectadas con luciferasa se rasparon en solución salina con una varilla policía de caucho. Suspensiones de monocélulas de CT26luc (2-4x106 células/ratón, 50 j l ) se implantaron por vía subcutánea (s.c.) en los lomos de los ratones. CT26 es una línea celular de carcinoma de colon no diferenciada inducida por N-nitroso-N-metiluretano-(NNMU). Se clonó para generar la línea celular denominada CT26WT, que se transdujo de forma estable con luciferasa para obtener el subclón letal CT26luc. Los tumores alcanzaron el tamaño de tratamiento, es decir, un diámetro de 7-9 mm, dentro de 1.5-2 semanas. Las células CT26luc fueron amablemente proporcionadas por Dina Preise, Instituto Weizmann, Rehovot, Israel.
Las monocapas de células tumorales de glándula mamaria BALB/cfC3H 4T1luc cultivadas transfectadas con luciferasa se rasparon bajo solución salina con una varilla de policía de caucho. Las suspensiones de monocélulas de 4T1luc (2-4*10® células/ratón, 50 pl) se implantaron por vía subcutánea (s.c.) en los lomos de los ratones. 4T1 es una línea celular resistente a 6-tioguanina seleccionada del tumor 410.4 sin tratamiento con mutágenos, que se transdujo de forma estable con luciferasa para obtener el subclón letal 4T1luc (amablemente proporcionado por Shimrit Ben-Zaken, Instituto Weizmann, Rehovot, Israel). Los tumores alcanzaron el tamaño de tratamiento, es decir, un diámetro de 7-9 mm, en 1 semana.
Las monocapas de células MDA-MB-231 de cáncer de mama humano metastásico cultivadas (ATCC, EE.UU.) se rasparon en solución salina con una varilla de policía de caucho. Se implantaron suspensiones unicelulares de cáncer de mama humano de rata (2-4x10® células/ratón, 50 pl) por vía s.c. en los lomos de los ratones. Los tumores alcanzaron el tamaño de tratamiento, es decir, un diámetro de 7-9 mm, en 1 semana.
Las monocapas de células de adenocarcinoma de ovario humano OVCAR-8 cultivadas (amablemente proporcionadas por el profesor Mordechai Liscovitz, Instituto Weizmann, Rehovot, Israel) se rasparon en solución salina con una varilla de policía de caucho. Se implantaron suspensiones unicelulares de adenocarcinoma de ovario humano OVCAR-8 (2-4x10® células/ratón, 50 j l ) por vía s.c. en los lomos de los ratones. OVCAR-8 se obtienen de un paciente tratado con quimioterapia con una enfermedad metastásica. Los tumores alcanzaron el tamaño de tratamiento, es decir, un diámetro de 7-9 mm, en 3-4 semanas.
Las monocapas de células de carcinoma humano MLS cultivadas (amablemente proporcionadas por el profesor Michal Neeman, Instituto Weizmann, Rehovot, Israel) se rasparon en solución salina con una varilla de policía de caucho. Se implantaron suspensiones unicelulares de células MLS humanas (2-4x10® células/ratón, 50 pl) por vía s.c. en los lomos de los ratones. Los tumores alcanzaron el tamaño de tratamiento, es decir, un diámetro de 7-9 mm, en una semana.
Metástasis inguinal. Células CT26luc cultivadas (1x10 ® células/ratón, 20 j l ) recogidas en solución salina se inyectaron por vía s.c. en la parte dorsal distal del pie de la pata trasera de ratones anestesiados. Cuando se inyectó la aguja debajo de la piel, se retiró el mango de la jeringa para verificar que no había penetrado en un vaso sanguíneo. De esta forma, se evitaba la diseminación sistémica de las células tumorales. Los tumores primarios crecieron a un tamaño de 6-8 mm en 3 semanas. Las metástasis inguinales se inspeccionaron usando el sistema de imagen Xenogen IVIS® como se describe en la presente memoria y por palpación.
Modelo de metástasis pulmonar. Células CT26luc o 4T1luc cultivadas (0.8-1x10® células/ratón, 300 j l) recogidas en solución salina se inyectaron por vía i.v. en la vena de la cola de ratones anestesiados. Las metástasis pulmonares en los pulmones se inspeccionaron usando el sistema de imágenes Xenogen IVIS® como se describe en la presente memoria, 2-3 semanas después de la inyección de células.
Los ratones fueron sacrificados (según las directrices del Instituto Weizmann de Ciencia) cuando los tumores alcanzaron el diámetro de >15 mm.
(x) Anestesia: los ratones se anestesiaron mediante una inyección intraperitoneal (i.p.) de una mezcla de 50 pl de ketamina (100 mg/ml; Rhone Merieux, Lyon, Francia) y xilacina (2%; Vitamed, Benyamina, Israel) (85:15, vol:vol).
(xi) Fuente de luz: la fuente de luz para estudios in vivo es un láser de diodo de 7®3 nm o 755 nm (1 W; Ceramoptec, Bonn, Alemania) según el fotosensibilizante que se use.
(xii) Solubilización de sensibilizantes y sus conjugados para experimentos en animales. El conjugado soluble en agua 11 se disolvió en PBS antes de usar. El conjugado insoluble en agua 24 se disolvió en DMSO al 100% antes de usar y se diluyó en solución salina o PBS a una concentración final de DMSO de 5% v/v.
(xiii) Biodistribución de compuestos que contienen Pd. Se inyectaron a los ratones anestesiados por vía i.v. (vena de la cola) los diferentes conjugados de fotosensibilizante (pigmento) (grupo de control: sin tratar). Los ratones se sacrificaron en los tiempos de medición indicados y las muestras de los órganos y tejidos indicados (sangre, tumor, intestino, hígado, bazo, riñones, testículos, corazón, pulmón, cerebro, piel, músculo y grasa) se pusieron en viales previamente pesados y se congelaron y almacenaron inmediatamente congelado a -20° en la oscuridad hasta su análisis. Se usaron dos métodos para la preparación de muestra: (1) Cada muestra se descongeló y se homogeneizó en DDW (1:10 p/v). Partes alícuotas del homogeneizado (500 pl) se liofilizaron en tubos de ensayo Eppendorf. Después, se añadieron 60 |jl de HNO3 (70%, TraceSelect, Fluka) a cada muestra seca, se incubaron durante 1 h a 90°C y se diluyeron con DDW a 3 ml. (2) Cada muestra se diluyó (1:2 p/v) en HNO3 (70%, TraceSelect, Fluka). Las muestras se trataron con ultrasonidos durante 30 min en agua hervida y se dejaron al menos 48 h a temperatura ambiente. Después, se añadieron 140 j l de cada muestra a 3.36 ml de DDW para dar un volumen total de 3.5 ml y se incubaron durante 1 h a 90°C. Las concentraciones de Pd se determinaron por ICP-MS.
(xiv) Se llevó a cabo espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) para la determinación de las concentraciones de Pd usando un instrumento ELAN-6000 (Perkin Elmer, CT).
(xv) Sistema de imágenes ópticas de fluorescencia in vivo: El sistema de imágenes ópticas de fluorescencia plana usado era Xenogen IVIS® Imaging System 100 Series equipado con una cámara CCD de 2.54 cm (1 pulgada) enfriada a -105°C. El campo de visión era de 15 cm. El sistema de imágenes Xenogen IVIS® es un sistema muy sensible, de bajo nivel de luz optimizado para imágenes in vivo (animales vivos, enteros). El sistema de imágenes IVIS es un sistema modular de software y hardware. Se tomaron dos imágenes; la primera imagen es en blanco y negro, que proporciona una fotografía del animal. La segunda imagen es una superposición coloreada de los datos de fotones emitidos, en el presente caso la fluorescencia NIR del compuesto (filtro de excitación de 680-720 nm y un filtro de emisión de 780-810 nm) o bioluminiscencia (560 nm) como se describe a continuación. El tiempo de integración de la CCD era de 10-20 s con el fin de mantener una alta relación señal/ruido. Las imágenes de fluorescencia dinámica se adquirieron inmediatamente después de la inyección de un conjugado de la invención y continuaron durante aproximadamente 2 horas. También se obtuvieron imágenes de fluorescencia bajo anestesia con isoflurano hasta 72 h después de la inyección inicial del conjugado. La dosis inyectada varió de 140 a 250 nmol por animal. El tiempo de integración de la CCD era de 20 s con el fin de mantener una alta relación señal/ruido. Una vez completada la adquisición de la imagen, el análisis y procesamiento de datos se llevaron a cabo mediante el software Living Image® que admite hardware para el sistema de imágenes IVIS 100 Series. El software Living Image® es un paquete de software personalizado desarrollado por Xenogen que ejecuta el sistema IVIS y proporciona herramientas para la visualización y el análisis de imágenes.
(xvi) Ensayo de luciferina. La localización y la viabilidad de las células tumorales CT26luc y 4T1luc trasplantadas en ratones se evaluaron con precisión por imágenes de bioluminiscencia (BLI) in vivo. Según la presente invención, la BLI se basa en las propiedades de emisión de luz de la enzima indicadora luciferasa de luciérnaga, que cataliza la transformación de su sustrato D-luciferina en oxilciferina, lo que conduce a la emisión de fotones. La luciferina es una sustancia química que se encuentra en las células de varios organismos bioluminiscentes. Cuando la luciferina se oxida bajo los efectos catalíticos de la luciferasa y el ATP, se produce una luz verde azulada. La luciferina de luciérnaga es un indicador particularmente bueno para las imágenes biofotónicas in vivo debido a las propiedades de sus espectros de emisión. El pico de emisión de luciferasa de luciérnaga (560 nm) está contenido dentro del espectro de la luz visible y se puede detectar y cuantificar con sistemas de imágenes de luz baja tales como el sistema IVIS. Antes de la formación de imágenes, se inyectó a los ratones por vía intraperitoneal D-luciferina (para imagen del cuerpo entero: 55 mg/kg de peso corporal; para imagen de metástasis de pulmones y ganglios linfáticos: 77 mg/kg de peso corporal). Las imágenes in vivo se adquirieron con el sistema de imágenes Xenogen IVIS® 100 Series y se analizaron con el software Living Image® 2.5. La luciferina se puede usar de varias maneras. Se puede usar para controlar la producción de luz in vivo y se puede controlar con un sistema de imágenes Xenogen IVIS®.
(xvii) Protocolo de PDT. Se anestesiaron ratones macho atímicos CD-1 que llevaban los diferentes xenoinjertos tumorales y se inyectaron por vía i.v. 24 (5-24 mg/kg de peso corporal) u 8 (9 mg/kg de peso corporal) por la vena de la cola. Los tumores se iluminaron de forma transcutánea después de 3.5, 6, 8, 12 y 24 horas durante 5-30 min con dosis de luz de 30-360 J/cm2. Intensidad de iluminación: 100-200 mW/cm2. Después del tratamiento, los ratones se devolvieron a la jaula. Los ratones se consideraron curados si no tenían tumor durante 90 días después del tratamiento. Los ratones se sacrificaron cuando el diámetro del tumor alcanzó 15 mm. Los controles usados eran: (1) control de oscuridad, se inyectó a los ratones por vía i.v. pigmento y no se iluminaron; (2) control de luz, los ratones se iluminaron sin inyección de pigmento; (3) control no tratado; (4) compuesto 8 solo: se inyectó a los ratones por vía i.v. 8 y se iluminaron después del tiempo de medición indicado. (5) Mezcla de 8 y cicloRGDfK: se inyectó a los ratones por vía i.v. una mezcla de 8 con cicloRGDfK y se iluminaron después del tiempo de medición indicado. (6) cicloRGDfK solo: se inyectó a los ratones por vía i.v. cicloRGDfK y se iluminaron después del tiempo de medición indicado. Las imágenes se tomaron en el momento indicado después de la PDT.
(xviii) Mediciones de MRI. Se adquieren imágenes convencionales de espín-eco antes de la administración del agente de contraste, con el fin de localizar el tumor. Se obtuvieron imágenes instantáneas de IR antes y 2, 5, 10, 20 y 30 minutos después de la inyección de 9. Los parámetros usados para las imágenes de IR eran: Tr /TE = 9.2/2.7 ms, campo de visión (FOV) = 5 cm, número de experimentos (NEX) = 1, matriz de imagen = 128x128, espesor de corte 2 mm y ángulo de giro 10°. Se usó una serie de siete imágenes, usando tiempos de inversión de 0.05 s, 0.25 s, 0.4 s, 1.8 s, 2.5 s, 3.6 s y 5 s para la evaluación de T1.
Ejemplo 26. Evaluación de parámetros de unión y actividades biológicas del péptido cíclico RGD-4C
Los parámetros de unión y actividades biológicas del nonapéptido cíclico RGD-4C se caracterizaron con el fin probar su idoneidad para el direccionamiento vascular del fotosensibilizante.
Caracterización de la actividad de unión a RGD-4C
(i) Preparación de RGD-4C marcado con Eu. Las características de los parámetros de unión para el receptor de integrina avp 3 expresado en células endoteliales (afinidad, especificidad y número de receptores/célula) se determinó usando espectroscopia de emisión resuelta en el tiempo con RGD-4C marcado con Eu. Para este fin, RGD-4C se marcó con Eu por conjugación directa de isotiocianatofenil-DTPA-Eu como se describe en Materiales y métodos. La separación de Eu-RGD-4C del isotiocianatofenil-DTPA-Eu libre se llevó a cabo usando Sep-Pak C-18. La columna se lavó con etanol acuoso al 50%, se recogieron fracciones y se midió su fluorescencia como se describe en Materiales y métodos. Un lavado adicional con etanol al 100% no puso de manifiesto la retención de ninguna cantidad significativa de material que contuviera Eu en la columna. El producto final, Eu-RGD-4C, eluyó cuantitativamente como un solo pico (Fig. 3A), como se confirmó por análisis de espectros de masas (1499 m/z) (Fig. 3B)
(ii) Ensayo de unión al receptor de integrina avp 3 . La actividad de unión de Eu-RGD-4C al receptor de integrina se determinó usando células endoteliales H5V de ratón en cultivo. Para el ensayo de unión, las células H5V se cultivaron en una placa de 48 pocillos (10 5 /pocillo) durante 48 h. Las placas se incubaron a 4°C (con el fin de inhibir la endocitosis del receptor), se lavaron una vez con tampón de unión helado (BSA al 0.1% en DMEM:F-12) y se incubaron durante 2 h con concentraciones crecientes de Eu-RGD-4C en la ausencia (unión total) o presencia de RGD-4C 1 |jM (unión no específica). La incubación se terminó por lavado triple con tampón de unión helado y se añadió solución de potenciación (300 jl/pocillo) con el fin de lisar las células y liberar el Eu quelado. Se tomaron muestras (200 j l ) de cada pocillo y se determinó la fluorescencia usando fluorometría resuelta en el tiempo. La unión específica neta se calculó restando los valores no específicos del total para cada concentración. Los porcentajes de unión no específica del ligando añadido total eran 4.9% ± 2.4% (media ± DE). La relación de unión total a unión no específica aumentó de ~1 en concentraciones bajas de ligando a ~4 en la concentración más alta. Los resultados de unión y el análisis de Scatchard se presentan en la Fig. 4 y Fig. 5, respectivamente, para un experimento representativo.
Los valores para los parámetros de unión del ligando se calcularon a partir del análisis de Scatchard: (1/Kd = Ka, la afinidad del compuesto ensayado) y Bmáx (el número máximo de sitios de unión) eran 37.2-41.3 nM, y 4.3-7.7 nM (1-1.8 millones de receptores por célula), respectivamente. Por lo tanto, Eu-RGD-4C se une específicamente a las células endoteliales H5V. 5 Estos resultados confirman los informes de otros de que RGD-4C es un ligando potente para el receptor de integrina avp 3 (constante de afinidad de ~100 nM). La unión específica al receptor de integrina avp 3 se demostró además usando el ensayo de unión de avp 3 aislado como sigue.
(iii) Ensayo de receptor en fase sólida. La unión de Eu-RGD-4C al receptor de integrina avp 3 aislado se determinó usando fluorometría de resolución en el tiempo. Cada pocillo de una placa de microvaloración (Nunc MaxiSorb) se revistió con 50 j l de receptor purificado (1 jg/m l en PBS) agitándolo a 4°C durante la noche. Después se eliminó la solución de receptor, y cada pocillo se bloqueó con 200 j l de leche (leche en polvo al 1% p/v en PBS, 1 h, temperatura ambiente). Después se lavó la placa con 200 j l de PBS una vez, y se incubó durante 1 hora a 37°C con concentraciones crecientes de RGD-4C en presencia de una cantidad constante de Eu-RGD-4C (10 millones de F.U./pocillo). La solución de ligando/competidor se retiró y cada pocillo se lavó tres veces con 200 j l de PBS. Se añadió solución de potenciación (200 jl/pocillo) para liberar el Eu quelado. Se tomaron muestras ( 100 j l) de cada pocillo y se determinó la fluorescencia usando fluorometría de resolución en el tiempo (Fig. 6 ). En estas condiciones experimentales, RGD-4C 100 jM reducía en 50% la unión de Eu-RGD-4C al receptor aislado. Este valor representa la atenuación más alta de la unión de Eu-RGD-4C, incluso a las concentraciones más altas de RGD-4C.
Caracterización de la actividad biológica de RGD-4C
El efecto biológico de la unión a RGD-4C se caracterizó en células H5V y células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) usando el ensayo de redondeo celular descrito en Materiales y métodos. Los cambios morfológicos de las células se documentaron usando microscopía óptica. Como se ve en la Fig. 7B, RGD-4C en una concentración 100 jM inducía un desprendimiento de células endoteliales H5V de 99% de la placa (n=200), mientras que se observó solo 5% de células redondeadas en ausencia de RGD-4C (véase la Fig. 7A). Este efecto era reversible ya que las células se recuperaron después de 3 h de reincubación con medio de cultivo de nueva aportación ( 8 % de células redondeadas en placas con presencia previa de RGD-4C frente a 6 % en ausencia de RGD-4C).
De manera similar a las células H5V, RGD-4C 100 jM inducía el desprendimiento de HUVEC de la placa de una forma reversible, puesto que las células se recuperaban después de 24 horas de reincubación con medio de cultivo de nueva aportación (Fig. 8 : los paneles superiores muestran el desprendimiento de células HUVEC en presencia de concentraciones crecientes de RGD-4C (0-200 j M) mientras que los paneles inferiores muestran la recuperación de las células 24 h después del reemplazo del medio con uno de nueva aportación).
Por lo tanto, el efecto de RGD-4C es reversible ya que la eliminación de RGD-4C por lavado exhaustivo y posterior mantenimiento de las células endoteliales ensayadas en cultivo durante 3 h (H5V) o 24 h (HUVEC), da como resultado la recuperación completa de sus capacidades adhesivas
Ejemplo 27. Unión, absorción celular y localización in vitro del conjugado 24
El patrón de unión de los conjugados de RGD-BChl es de gran importancia para comprender su modo de acción. El conjugado 24 presenta una fluorescencia NIR detectable y su unión celular y localización se determinaron in vitro usando microscopía de fluorescencia. Las células endoteliales h 5v cultivadas se incubaron con 24 25 j M en medio DMEM/F12 con FCS al 10% durante 2 horas a 37°C. Después se lavó el cultivo celular y se añadió PBS++. Usando un microscopio de fluorescencia hecho a medida, 24 se excitó a 520 nm y la fluorescencia emitida se detectó a 780 nm.
Como se muestra en Fig. 9, el conjugado 24 penetraba en las células endoteliales y se concentraba alrededor del núcleo en estructuras similares a gránulos.
Para fines de comparación, se midió la absorción celular del compuesto 8 no conjugado. Las células H5V cultivadas se incubaron con 24 u 8 25 j M en medio DMEM/F12 con FCS al 10% o FCS al 75% durante 20 minutos o 2 horas a 37°C. Después el cultivo celular se lavó y se añadió PBS++. La excitación se llevó a cabo a 520 nm y la detección de la fluorescencia emitida a 780 nm. La Fig. 10 demuestra que la absorción celular conjugada era más rápida que la del compuesto 8 .
En particular, altas concentraciones en el suero (75% frente a 10% de FCS) atenúan la absorción celular del conjugado 24- Los estudios cuantitativos de relación de función y estructura hechos en el grupo de los autores de la invención enfatizaban la función de la estructura del fotosensibilizante en las interacciones con proteínas séricas. Estos estudios sugieren que hay una implicación activa de la seroalbúmina en el tráfico del compuesto 8 tanto dentro como fuera de las células tratadas. Además, la absorción celular de 8 , la eliminación y fototoxicidad son mediadas por moléculas de BSA que experimentan absorción y secreción mediadas por receptor continuas. Con respecto al conjugado 24, la afinidad del resto bacterioclorofila por la seroalbúmina modifica la biodisponibilidad del conjugado al receptor de integrina ayp 3 . Esto puede explicar la disminución observada en la acumulación celular en presencia de altas concentraciones de proteínas séricas (Fig. 10). La mayor acumulación in vitro del conjugado 24 en comparación con el compuesto 8 en cada tiempo de medición que se ensayó podría explicarse por el hecho de que el conjugado de RGD puede entrar en la célula por endocitosis mediada por el receptor de integrina o/y por endocitosis no específica como 8 no conjugado.
Ejemplo 28. Biodistribución in vivo del conjugado 24 y el compuesto 8
Los conjugados de la invención son potenciales portadores de fármacos. Por lo tanto, su biodistribución in vivo es de gran importancia. Con el fin de cuantificar los niveles de conjugado en los tejidos objetivo, se usó espectroscopía de masas con plasma acoplado para iones (ICP-MS) para rastrear el átomo M central (p. ej., Pd, Cu) en el órgano objetivo. La unión estable del átomo de metal central permite controlar y determinar de forma precisa la concentración dependiente del tiempo del compuesto en los órganos objetivo. La biodistribución del conjugado 24 y del compuesto 8 se determinó en ratones macho atímicos CD1 con xenoinjertos tumorales de glioma C 6 de rata como se describe en Materiales y métodos, usando el método (2) para la preparación de muestras. La biodistribución de 24 también se determinó en ratones macho atímicos CD1 que llevan injertos tumorales de carcinoma de colon CT26luc de ratón y ratones macho atímicos CD1 que llevan injertos tumorales de ratón de cáncer de mama 4T1luc.
Los resultados, como se muestra en las figs. 11A-11D, indican la acumulación de conjugado 24 en los diferentes tejidos tumorales hasta 8 horas después de la inyección acompañado por una disminución continua de los niveles de conjugado en la sangre. Además, el patrón de biodistribución de 24 parece independiente del origen del tumor (glioma C 6 de rata (Fig. 11A), carcinoma de colon CT26luc de ratón (Fig. 11B) y carcinoma de mama 4T1 de ratón (Fig. 11C).
La biodistribución del compuesto 8 inyectado en ratones atímicos CD1 con xenoinjertos tumorales de glioma C 6 de rata presentó una imagen completamente diferente como se muestra en la Fig. 12: el compuesto 8 se eliminó rápidamente del sujeto y en ningún momento mostró acumulación o retención selectiva en el tejido tumoral. La acumulación de conjugado 24 en el tejido tumoral, con valores máximos a las 8 h después de la inyección, en oposición al compuesto 8 (Fig. 12), indica que el potencial portador de fármaco 24 se puede usar para fines de direccionamiento de fármacos y se puede aplicar para obtener imágenes de tumores y angiogénesis.
Además, debe observarse que las concentraciones de conjugado acumulado dentro del tejido tumoral alcanzaron el nivel j M, mientras otros describían que el cicloRGDfK marcado y cicloRGDfK conjugado con otros quelantes de metales alcanzaban concentraciones en el intervalo solo nM (Haubner et al., 2001; Janssen et al., 2002a; Janssen et al., 2002b; Temming, 2005). Estos resultados descritos demuestran una rápida absorción tumoral de los péptidos conjugados con una concentración del pico máxima a los 30 min, 1 hora o 2 horas después de inyección, dependiendo de la estructura del conjugado. Por lo tanto, la absorción tumoral notablemente mayor de los conjugados de la invención en comparación con el derivado de M-Bchl solo o el péptido que contiene GRD conjugado con otros quelantes, se puede atribuir a la conjugación del péptido que contiene RGD con el resto BChl.
Los niveles relativos de 24 en el tejido tumoral y la sangre se ilustran en la Fig. 11D, y se muestra que, aunque 8 horas después de inyección, el conjugado alcanzaba la concentración máxima en el tumor, a las 24 horas después de inyección, su concentración en el tumor en relación con la sangre y el tejido normal circundante, sigue siendo lo suficientemente alta como para permitir una formación de imagen dirigida vascular (VTI) y posiblemente PDT dirigida vascular (VTP).
Hay que indicar que la concentración del conjugado en el tejido tumoral en relación con otros órganos era significativamente menor en los tumores donde se sabe que las células no expresan la integrina avp 3 (p. ej., CT26luc). Por lo tanto, la acumulación observada en tumores negativos para avp 3 probablemente se deba a su absorción vascular.
Ejemplo 29. Biodistribución in vivo del conjugado 15
La biodistribución del conjugado de Cu 15 se determinó en ratones atímicos CD-1 hembra de 6 - 8 semanas de edad, que pesaban 20-23 g y que llevaban tumores de 6-9 mm 3 de células de adenocarcinoma humano obtenidas de tejido mamario (células MDA-MB-231). El conjugado (30 mg/ml en DMSO/PBS al 5%) se inyectó en la vena de la cola, y los animales se sacrificaron en tiempos de medición seleccionados. Las concentraciones de Cu se determinaron por ICP-MS como se describe en Material y métodos. Los resultados de ICP-MS después de la resta del tiempo 0 se muestran en la Fig. 13.
Los datos obtenidos mostraron una acumulación obvia de 15 en el tumor con un máximo a las 8-12 h después de inyección de una intensidad de aproximadamente 3 veces en comparación con el tejido normal circundante.
Ejemplo 30. Biodistribución in vivo del conjugado 42
Con el fin de evaluar el papel real del reconocimiento de RGD/integrina, se midió la biodistribución del conjugado 42, en el que la glicina en el péptido se reemplaza por alanina, y se comparó con la biodistribución del conjugado 24. Otros autores demostraron que la sustitución de un solo aminoácido interfiere con el reconocimiento de integrina (Pierschbacher y Ruoslahti, 1987). Se usaron principalmente los péptidos RAD o RGE para este propósito. El ensayo de biodistribución se llevó a cabo como se describe en el ejemplo 26 anterior usando ratones macho atímicos CD1 con injertos tumorales de células de cáncer de colon CT26luc de ratón, y las concentraciones de Pd se determinaron por ICP-MS. Los resultados de ICP-MS se muestran en la Fig. 14A.
La comparación entre la biodistribución del conjugado 24 y el conjugado 42 (Fig. 14B) demuestra que la absorción del conjugado RGD en el tejido tumoral era más rápida que la del conjugado de RAD y con una extensión mayor hasta 24 horas. El conjugado 24 se acumulaba en el tejido tumoral con una concentración de pico máxima a las 8 horas después de inyección, acompañado de una disminución continua de los niveles de conjugado en la sangre, mientras que las concentraciones de 42 en el tejido tumoral y la sangre 8 horas después de inyección son bastante iguales. Es importante destacar que ambos conjugados presentaron un nivel basal prolongado después de la administración debido a la unión no específica. Sin embargo, la acumulación del conjugado de RGD en el sitio del tumor era el doble en comparación con el conjugado de RAD.
Ejemplo 31. Imágenes de fluorescencia in vivo de ratones que llevan xenoinjertos de glioma C 6 de rata después de tratamiento con conjugado 24 o compuesto 8
Se obtuvieron imágenes de fluorescencia dinámica de ratones macho atímicos CD-1 que llevan xenoinjertos de glioma C 6 de rata. Las imágenes de fluorescencia se adquirieron usando el sistema IVIS como se describe en Materiales y métodos. El aclaramiento de los fotosensibilizantes inyectados (compuesto 8 o conjugado 24) se midió en ratones por imágenes de fluorescencia y se demuestra en la Fig. 15. A los ratones que llevaban xenoinjertos de glioma C 6 de rata en la parte trasera de la extremidad posterior derecha se les inyectó una dosis de 200 nmol de conjugado 8 (ratones en las imágenes superiores) o dosis de 200 nmol de 24 (ratones en las imágenes inferiores), y las imágenes se tomaron a las 4, 24, 48 y 72 horas después de inyección.
Excepto por una fluorescencia residual del hígado y el bazo, no se podía ver señal específica del animal tratado con el compuesto 8 a veces más de 4 horas después de la inyección, según los datos de ICP-MS (Figura 12). El conjugado 24 parece que se acumula en el tumor, bazo, hígado y una joroba de grasa debajo de la cabeza del animal. Estos resultados de imágenes, cuando se combinan con los resultados de ICP-MS, sugieren que la mejor ventana de tiempo para obtener imágenes y probablemente el tratamiento del tumor por VTP es a las 8-24 horas después de la administración del fármaco.
Ejemplo 32. Imagen de fluorescencia dinámica de ratones que llevan injertos de cáncer de colon CT26luc de ratón transfectados con luciferasa después del tratamiento con el conjugado 24
Las líneas celulares transfectadas con luciferasa generan luz visible en presencia de luciferina cuando están vivas. La luminiscencia de la luciferina permite controlar las células tumorales viables y, por lo tanto, proporciona los medios para validar el retorno del conjugado al sitio del tumor, su capacidad de formación de imágenes y la eficacia de VTP.
Para evitar la posibilidad teórica de la excitación del conjugado por la bioluminiscencia de la luciferina, se registraron las imágenes de fluorescencia y solo entonces se inyectó luciferina por vía i.p. a los animales y se detectó la bioluminiscencia de las células tumorales transfectadas.
Los resultados muestran que hay un solapamiento completo entre la región de la señal de fluorescencia NIR proveniente del conjugado 24 y la región de la señal de bioluminiscencia endógena que se origina en las propias células tumorales.
Se obtuvieron imágenes de fluorescencia dinámica de ratones macho atímicos CD-1 que llevaban injertos de cáncer de colon CT26luc de ratón transfectados con luciferasa, después de la inyección intravenosa de un conjugado que se dirige al receptor de integrina 24. Las figs. 16B-16C representan imágenes de fluorescencia y luminiscencia de un ratón que lleva un injerto en la parte trasera de la extremidad posterior derecha, 24 horas después de inyección de una dosis de 200 nmol del conjugado 24. Las imágenes de fluorescencia y luminiscencia se adquirieron utilizando el sistema de imágenes Xenogen IVIS® como se describe en Material y métodos.
Los resultados muestran que existe un solapamiento completo entre la región de la señal de fluorescencia NIR procedente del conjugado 24 y la región de la señal de bioluminiscencia endógena que se origina en las propias células tumorales.
Ejemplo 33. Imagen de fluorescencia dinámica de ratones que llevan injertos de cáncer de mama 4T1luc transfectados con luciferasa después del tratamiento con el conjugado 24
Se obtuvieron imágenes de fluorescencia dinámicas de ratones hembra BALB/c que llevaban injertos de cáncer de mama 4T1luc de ratón transfectado con luciferasa, después de la inyección intravenosa de un conjugado que se dirige al receptor de integrina 24. Las figs. 17A-17C muestran fotografías de imágenes de fluorescencia y luminiscencia de dos ratones hembra que llevaban un cáncer subcutáneo de glándula mamaria 4T1 de ratón transfectado con injertos de luciferasa en la parte trasera de la extremidad posterior derecha, 24 horas después de la inyección de una dosis de 200 nmol del conjugado 24. Las imágenes de fluorescencia y luminiscencia se adquirieron usando el sistema IVIS como se describe en Material y métodos.
Los resultados muestran que existe un solapamiento completo entre la región de la señal de fluorescencia NIR procedente del conjugado 24 y la región de la señal de bioluminiscencia endógena que se origina en las propias células tumorales.
Ejemplo 34. Fluorescencia dinámica de ratones que llevan carcinoma de ovario (MLS) después del tratamiento con el conjugado 26
El conjugado 26 (8 mg/kg) se inyectó por vía i.v. en animales que llevaban carcinoma de ovario MLS. Las imágenes de IVIS se tomaron después de 8 y 14 horas. Como se muestra en la Fig. 18, el conjugado no presentaba acumulación después de 8 horas, pero a las 14 horas se observó un alto nivel de fluorescencia en zonas del tumor e hígado.
Ejemplo 35. Demostración de imágenes de fluorescencia de la especificidad de unión in vivo del conjugado 24 al receptor de integrina ayp 3
La unión específica se define como una inhibida por el sensibilizante no conjugado. Por lo tanto, con el fin de demostrar la especificidad de la unión in vivo del conjugado 24, se llevaron a cabo intentos de bloquear su acumulación por competición con cicloRGDfK libre por la unión de los mismos sitios de unión. Las imágenes de fluorescencia se realizaron 24 horas después de la administración de 140 nmol de conjugado 24 solo (Fig. 19, ratón izquierdo en ambos paneles, con tumor en la parte trasera de la extremidad posterior derecha), o administración de 140 nmol de conjugado 24 1 hora después de inyección de péptido cicloRGDfK "libre" (8.5 |jmol) en exceso a ratones que llevan xenoinjertos de glioma C 6 (Fig. 19, ratón derecho en ambos paneles, con tumor en la parte trasera de la extremidad posterior izquierda). Las imágenes de fluorescencia de los xenoinjertos de receptores bloqueados con el mismo tiempo de exposición se ilustran en la Fig. 19 en la misma escala de color lineal para permitir una comparación cualitativa. La intensidad de fluorescencia originada del tumor era mayor cuando el conjugado 24 se administraba solo en comparación con cuando se administraba el péptido cicloRGDfK una hora antes de la administración del agente de formación de imágenes. En tejidos normales, no influía en la absorción la administración previa de cicloRGDfK.
Los resultados muestran que la absorción del conjugado 24 en las regiones tumorales era: (i) significativamente mayor que en las regiones de tejido normal contralateral; y (ii) bloqueada por inyección previa de cicloRGDfK en exceso. Considerado junto, se puede concluir que el cicloRGDfK "libre" inhibe la acumulación del conjugado 24, y la absorción reducida del conjugado 24 que resulta de la administración previa de cicloRGDfK en exceso valida la especificidad molecular in vivo del conjugado por los receptores avp 3 .
Ejemplo 36. Imagen de fluorescencia dinámica después de tratamiento con el conjugado 42
Con el fin de evaluar la función real del reconocimiento de RGD/integrina in vivo, se obtuvieron imágenes de fluorescencia dinámica de ratones macho atímicos CD-1 que llevaban injertos de CT26luc en la parte trasera de la extremidad posterior, 24 horas después de la administración del conjugado 24 (Fig. 20, ratón izquierdo en cada panel) o conjugado 42, en el que la glicina en el péptido se sustituye por alanina (cicloRADfK); ratón derecho en cada panel). Puesto que la señal de fluorescencia del conjugado de RGD en el tejido tumoral alcanza un máximo a las 3.5-4 horas después de inyección, las imágenes se presentan tomadas 4 horas después de la inyección. Es importante destacar que ambos conjugados presentan un nivel basal prolongado de fluorescencia después de la administración debido a la unión no específica. Sin embargo, la intensidad de fluorescencia del conjugado de RGD es claramente mayor que la del conjugado de RAD en el sitio del tumor. Estos resultados están respaldados cuantitativamente por mediciones de ICP-MS que muestran casi el doble de acumulación del conjugado de RGD en el tejido tumoral (véase el ejemplo 30 antes y la Fig. 14A).
Puesto que las células CT26luc carecen de avp 3 (aunque probablemente expresen algo de avp 5 ) (Yao et al., 2005; Borza et al., 2006), la mayor fluorescencia de 24 de los tumores probablemente se origina en su unión (por el tripéptido de RGD) a las integrinas neoendoteliales avp 3 .
La Fig. 21 representa las imágenes de fluorescencia de ratones atímicos CD1 que llevan tumores que se originan en adenocarcinoma de ovario humano OVCAR- 8 , cáncer de colon de ratón CT26luc, carcinoma de ovario epitelial humano MLS y líneas celulares de carcinoma mamario de ratón 4T1luc, 24 h después de la administración del conjugado 24. La integrina avp 3 se expresa en algunos tipos de células de tumores sólidos. Con respecto a las líneas celulares anteriores, MLS (Schiffenbauer et al., 2002) y 4Tlluc (Mi et al., 2006) sobreexpresan los receptores de integrina avp 3 en su superficie celular, mientras que CT26luc de ratón carece de receptores de integrina avp 3 , pero expresa algo de avp 5 (Yao et al., 2005; Borza et al., 2006), y OVCAR - 8 carecen de integrinas av (Ross et al., 2000). De hecho, la señal de fluorescencia era significativamente mayor para las células positivas para integrina avp 3 (MLS y 4T1luc) en comparación con las células negativas para integrina avp 3 (CT26luc y OVCAR- 8 ), probablemente debido a la acumulación adicional en las propias células tumorales. La diferencia observada entre la acumulación de compuestos en los dos tumores negativos para avp 3 (CT26luc y OVCAR- 8 ) probablemente refleja (i) una diferencia en su neovascularización ya que ambos carecen de las integrinas avp 3 , (ii) podría deberse a una acumulación adicional en las propias células tumorales CT26luc, puesto que expresan avp 5 que se puede unir específicamente al conjugado RGD-BChl.
Ejemplo 37. Imágenes de fluorescencia dinámica de metástasis pulmonares.
La detección de un modelo 4T1luc de metástasis de cáncer de mama en los pulmones era posible mediante el conjugado 24, 24 h después de inyección en ratón hembra BALB/c (15 mg/kg) (Fig. 22) Estos resultados muestran que la absorción de 24 en regiones metastásicas en los pulmones se puede controlar por fluorescencia con una precisión relativamente alta.
A continuación, se detectaron metástasis del modelo CT26luc en los pulmones en función del tiempo posterior a la inyección de 24 (4, 9 y 24 h, 15 mg/kg; figs. 23A-23I). Los ratones macho atímicos CD-1 que llevaban metástasis pulmonares CT26luc a los que no se inyectó el conjugado sirvieron como controles (figs. 23G.23H) y un ratón macho atímico CD-1 sin metástasis pulmonar al que se inyectó por vía i.v. el conjugado 24 (Fig. 23I). Los resultados de las imágenes de fluorescencia muestran que la absorción de 24 en las regiones metastásicas era significativamente mayor que en las regiones de tejido normales circundantes, con la mejor relación de tumor a fondo a las 24 horas después de la administración.
Ejemplo 38. Imagen de fluorescencia dinámica de metástasis de ganglios linfáticos
Se tomaron imágenes y se fotografió el ratón macho atímico CD-1 que llevaba tumor primario CT26luc en la parte trasera de su pierna izquierda y metástasis en el ganglio linfático cercano, 24 horas después de la inyección i.v. del conjugado 24 (15 mg/kg). La detección de las metástasis de CT26luc en el ganglio linfático era posible por la localización del conjugado 24 . La fotografía en blanco y negro, la señal de bioluminiscencia originada de la reacción de luciferna con las células tumorales transfectadas con luciferasa, y la imagen de fluorescencia del ratón se muestran en la Fig. 24.
Estos resultados indican que los tumores en regiones tanto primarias como metastásicas (pulmones, ganglios linfáticos) se pueden controlar por fluorescencia con una precisión relativamente alta.
Ejemplo 39. Imágenes de resonancia magnética (MRI) in vivo de ratones que llevan xenoinjertos de glioma C 6 de rata usando el compuesto 9 como agente de contraste
Las mediciones se realizaron en ratones macho atímicos CD1 (peso medio ~30 g) que llevaban los xenoinjertos de glioma C 6 (10-15 mm de diámetro; flanco izquierdo, subcutáneo). Se usaron siete ratones para IRM potenciada con Mn-132-OH-Bpheid (compuesto 9) (15 pmol/kg).
Las gráficas calculadas de la relación de intensidad de la señal y la relación de relajación pusieron de manifiesto que el compuesto 9 en una dosis de 15 pmol/kg aumentaba la relación de relajación tumor/normal de 0.8-1.0 a ~1.4, en aproximadamente 10 minutos después de inyección de la sustancia. El efecto de contraste obtenido con 9 era mayor que el conocido para los agentes de contraste que contienen Gd.
Considerando el mayor contraste obtenido por el compuesto 9 en comparación con los agentes de Gd y la permanencia prolongada esperada del correspondiente conjugado de cicloRGDfK que contiene Mn 12 en el tumor, que permite una integración larga de la señal de MR, se prevén imágenes superiores con este conjugado frente a otros agentes de contraste tales como Gd-DTPA.
Ejemplo 40. Fototoxicidad dirigida in vitro
Con el fin de evaluar la potencia fotodinámica del conjugado de péptido de RGD-fotosensibilizante frente a la del fotosensibilizante no conjugado, la fototoxicidad del conjugado 23 y el fotosensibilizante no conjugado 10 se determinaron controlando la supervivencia de las células endoteliales H5V cultivadas después de PDT.
Las células H5V se incubaron durante 90 minutos a 37°C con 0-25 pM de conjugado 23 o compuesto 10 en diferentes condiciones de medios, se iluminaron y se determinó su supervivencia usando el ensayo de viabilidad de rojo neutro como se describe en Materiales y métodos. Las curvas de supervivencia de dosisrespuesta de las células H5V tratadas con los fotosensibilizantes en diferentes condiciones se muestran en las figs. 25A-25C: 10% de FCS en medio (Fig. 25A), medio de cultivo DMEM/F12 (25B) y BSA 10 pM en medio (25C).
Se encontró que los efectos fototóxicos del conjugado 23 y el compuesto 10 en diferentes medios dependían de la luz y de la concentración del fármaco. Basándose en los valores de DL50 , se puede concluir que la potencia fotodinámica del conjugado 23 es mayor que la del fotosensibilizante no conjugado 10.
La fototoxicidad dirigida se define como una inhibida por el ligando libre. Por lo tanto, otros experimentos intentaron bloquear la fototoxicidad por administración del cicloRGDfK libre, que compite por la unión celular del conjugado 23. Las células H5V se incubaron durante 90 minutos a 37°C con 0-25 pM de compuesto 10 o conjugado 23 en diferentes medios (FCS al 10% en medio o BSA 10 pM en medio) en ausencia o en presencia de exceso de cicloRGDfK libre (100 veces hasta 1 mM). Las células se iluminaron y se determinó la supervivencia celular usando el ensayo de viabilidad de rojo neutro, como se ha descrito antes.
Como se muestra en las Figs. 26A-26D, que presentan las curvas de supervivencia de dosis-respuesta de las células tratadas, y como indican los valores de DL50 presentados en la Tabla 2, no influían en los efectos fototóxicos de 23 y 10 la presencia de exceso de cicloRGDfK.
Tabla 2. Valores de DL50 del conjugado 23 y compuesto 10 en ausencia y presencia del péptido libre en diferentes condiciones de reacción
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Estos resultados sugieren que el conjugado entra en la célula por endocitosis en fase fluida independiente de integrina, de modo que el cicloRGDfK libre no puede competir por la unión celular con el conjugado. La entrada en la célula independiente de integrina se puede atribuir bien a partes del conjugado, al resto de fotosensibilizante o al péptido cicloRGDfK. Hay un informe en la bibliografía que indica que el cicloRGDfK se internaliza por una endocitosis en fase fluida independiente de la integrina que no altera el número de receptores de integrina funcionales en la superficie celular (Hart et al., 1994; Castel et al., 2001).
Con el fin de ensayar la teoría de la endocitosis y puesto que el proceso de endocitosis depende del tiempo y la temperatura, las células H5V se incubaron a 37°C y 4°C durante 15 min con 0-20 pM del conjugado 23 en medio que contiene 10% de FCS, en presencia o ausencia de exceso de cicloRGDfK (100 veces hasta 1 mM). Las células se iluminaron y se determinó su supervivencia como se ha descrito antes. Las curvas de supervivencia de dosis-respuesta de las células H5V tratadas se muestran en las figs. 27A-27B.
Los valores de DL50 medidos para incubación de 15 min a 37°C o 4°C aumentaron con respecto a los valores obtenidos tras incubación de las células a 37°C durante 90 min (Tabla 2). Los valores de DL50 del conjugado 23 cambiaron a 3.5 pM y a 20 pM después de 15 min de incubación a 37°C y 4°C, respectivamente, en comparación con 1 pM obtenido para la incubación a 37°C durante 90 min. El aumento de valores de DL50 tras bajar la temperatura apoya la hipótesis de una posible función para la endocitosis en la absorción del conjugado.
Inesperadamente, no solo el efecto fotocitotóxico del conjugado 23 era desbloqueado por la presencia de exceso de cicloRGDfK, sino que, de hecho, la actividad fotodinámica de 23 por incubación de 15 minutos a 37°C o 4°C era mayor en presencia de cicloRGDfK libre. Existe la posibilidad de que el exceso de péptido libre provoque que las células sean más sensibles al efecto de la PDT del conjugado debido al desprendimiento potenciado de las células de la placa y/o la transducción de la señal apoptótica inducida.
La fototoxicidad del conjugado 24 se determinó controlando la supervivencia de las células endoteliales H5V cultivadas después de la PDT. Las células H5V se incubaron durante 2 horas a 37°C con 0-25 pM de conjugado 24 en medio de cultivo DMEM/F12 con 10% de FCS. Las células se iluminaron y su supervivencia se determinó como se ha descrito antes.
Como se muestra en la curva de supervivencia de dosis-respuesta (Fig. 28), se encontró que los efectos fototóxicos del conjugado 24 en las células H5V después de 2 h de incubación a 37°C dependían de la luz y de la concentración de fármaco.
La fototoxicidad de un tercer conjugado, 11, y del compuesto 8 también se determinó usando células endoteliales H5V. Las células se incubaron durante 90 min a 37°C en presencia de conjugado 11 o compuesto 8 0-20 pM en BSA 10 pM en medio, se iluminaron y se determinó su supervivencia como se ha descrito antes.
Como se muestra en la curva de supervivencia de dosis-respuesta (Fig. 29), se encontró que los efectos fototóxicos del conjugado 11 y el compuesto 8 dependían de la luz y de la concentración de fármaco. Los valores de DL50 se representan en la Tabla 3.
Tabla 3. Valores de DL50 del conjugado 11 y compuesto 8 en ausencia y presencia de exceso de péptido libre
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Como para el péptido cicloRGDfK, falló el bloqueo de la fototoxicidad del conjugado 11 por adición del RGD-4C cíclico libre al cultivo celular (Figs. 30A-30B, Tabla 3). Las células H5V se incubaron durante 90 minutos a 37°C con conjugado 11 o compuesto 8 0-10 pM en BSA 10 pM en medio en ausencia o presencia de RGD-4C en exceso (1 mM). Las células se iluminaron y su supervivencia se determinó como se ha descrito antes.
Una vez más, este resultado sugiere que el resto del fotosensibilizante (compuesto 8 ) determina la absorción celular del conjugado 11 por endocitosis libre.
Ejemplo 41. PDT in vivo en tumor de glioma C 6 de rata usando el conjugado 24
Basándose en los resultados anteriores, los autores de la invención desarrollaron un nuevo protocolo de tratamiento para la PDT de tumores sólidos usando el conjugado 24. Los parámetros del protocolo deben incluir: Tiempo de tratamiento (intervalo de fármaco-luz) - Iluminación de 3 a 24 horas después de la administración del fármaco; Dosis (mg/kg) - 5-24 mg/kg; Duración de la iluminación (min) - 5-30 min; Intensidad de la iluminación (mW/cm2) - 100-200 mW/cm2; Energía suministrada (J/cm2) - 30-360 J/cm 2
Los modelos de tumores iniciales usados comprendían xenoinjertos de tumor de glioma C 6 de rata, puesto que estas células tumorales expresan las integrinas avp 3 (Zhang et al., 2006) y avp 5 (Milner et al., 1999) además de la integrina avp3 expresada en la neovasculatura tumoral.
Se inyectaron por vía i.v. a ratones macho atímicos CD-1 que llevaban injertos de glioma C 6 , dosis de 15 o 24 mg/kg corporal de conjugado 24 o dosis 9 mg/kg corporal del compuesto 8 .
Para cada protocolo se usaron al menos 3 animales, pero debido a la alta tasa de mortalidad quedó un número limitado de animales. Los resultados se presentan en la Tabla 4.
Tabla 4. Resultados terapéuticos de diferentes protocolos de VTP que aplican el conjugado 24 a ratones que llevan glioma C 6 de rata.
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Los protocolos que parecían óptimos y proporcionaban los mejores resultados terapéuticos aparecen en negrita en la Tabla 4: 15 mg/kg, iluminación de 15 minutos (90 J/cm2) 8 horas después de inyección y 24 mg/kg, iluminación de 10 minutos (60 J/cm2) 8 horas después de inyección.
Las Figs. 31A y 31B muestran los resultados terapéuticos de esos protocolos, respectivamente. En el control de oscuridad (Fig. 31C), se inyectó a los ratones por vía i.v. el conjugado 24 y no se iluminaron; en el control de luz (Fig. 31D), los ratones se iluminaron sin inyección del conjugado 24; y en el control de fotosensibilizante no conjugado (Fig. 31E), se inyectó a los ratones por vía i.v. el compuesto 8 y se iluminaron después de 8 horas.
Los diferentes controles no mostraron efecto de PDT. Por el contrario, los animales tratados con el conjugado 24 y luz presentaron edema extenso pocas horas después del tratamiento con PDT que se convirtió en inflamación y necrosis debajo de la piel a los 3 días después de PDT. Se observó aplanamiento tumoral y un período largo de regresión tumoral, así como cicatrización de heridas.
Ejemplo 42. PDT in vivo en tumor de colon CT26 de ratón usando el conjugado 24
Usando el modelo de glioma C 6 de rata no se pudo obtener una evaluación inmediata del resultado de la VTP, una desventaja importante en el transcurso de un proceso de detección. Para superar este problema, se usó el modelo de carcinoma de colon CT26luc de ratón que consiste en células transfectadas con luciferasa, que permiten una evaluación rápida del efecto terapéutico.
Ratones macho atímicos CD-1 que llevaban tumores CT26luc se sometieron a diferentes protocolos de PDT con conjugado como se muestra en la Tabla 5.
Tabla 5. Resultados terapéuticos de diferentes protocolos de VTP que aplican el conjugado 24 a ratones que llevan cáncer de colon CT26luc de ratón.
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Las figs. 32A-E muestran los resultados terapéuticos de la aplicación de 15 mg/kg, iluminación de 10 min (60 J/cm2), 8 horas después de inyección del conjugado 24 en ratones que llevan tumores CT26luc (protocolo en negrita en la Tabla 5). 32A - el conjugado 24 se inyectó por vía i.v. 15 mg/kg, iluminación de 10 min (60 J/cm2) 8 horas después de inyección; 32B - imágenes superpuestas tomadas después de inyección i.p. de luciferina en el ratón descrito en 32A, usando el sistema IVIS. La primera imagen es en blanco y negro, que da la fotografía del animal. La segunda imagen es una superposición en color de los datos de fotones emitidos. Todas las imágenes están normalizadas respecto a la misma escala. 32C - Cuantificación de la señal de bioluminiscencia (fotón/s/cm2) de los datos mostrados en B. 32D - control con el compuesto 8 solo: se inyectó a los ratones por vía i.v. el compuesto 8 y se iluminaron después de 8 horas. 32E - control con mezcla de compuesto 8 y cicloRGDfK: se inyectó a los ratones por vía i.v. una mezcla de compuesto 8 con cicloRGDfK y se iluminaron después de 8 horas. 32F - control con cicloRGDfK solo: se inyectó a los ratones por vía i.v. cicloRGDfK y se iluminaron después de 8 horas. Las imágenes se tomaron en el tiempo indicado después de la PDT.
La Fig. 32B son imágenes superpuestas tomadas con el sistema IVIS después de inyección i.p. de luciferina en el ratón representado en la Fig. 32A. La Fig. 32C proporciona una descripción cuantitativa de la bioluminiscencia mostrada en la Fig. 32 B. Los controles usados eran (1) compuesto 8 solo (Fig. 32D); (2) mezcla de compuesto no conjugado 8 y cicloRGDfK (Fig. 32E); y (3) cicloRGDfK solo (Fig. 32F) Los diferentes controles no mostraron efecto de PDT. En cambio, los animales tratados con el conjugado dirigido desarrollaron necrosis en los 4 días posteriores a la PDT (Fig. 32A). Aparece señal de bioluminiscencia significativa de las células tumorales residuales 8 días después de la PDT (Fig. 32B), aunque no se palpó ningún tumor ni se detectó visualmente. La curación de heridas y el aplanamiento tumoral se observaron en todos los animales que respondieron.
La Fig. 33 muestra la curva de Kaplan-Mayer para los protocolos indicados en la Tabla 5 con asterisco.
Ejemplo 43. Diagnóstico de tumor y tratamiento de PDT de tumores de mama con el conjugado 13
Células MDA-MB-231 de cáncer de mama humano (ATCC) se transfectaron con proteína fluorescente roja (RFP) como sigue.
Plásmidos - el plásmido que se usó para la transfección de las células era pDsRed-Monomer-Hyg-C1 (Clontech, Palo Alto, CA) que lleva el gen RFP y el gen de resistencia a la higromicina en el que el gen DsRed-Monomer se reemplazó por pDsRed2 (del plásmido pDsRed2-N1).
Proceso de transfección - para el proceso de transfección, se usó Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen) según el protocolo del fabricante: se incubaron 4 |jg de ADN durante 5 minutos con 250 j l de medio Opti-MEM (suministrado por el fabricante Invitrogen). En un tubo de ensayo separado, se incubaron 10 j l de lipofectamina durante 5 minutos con 250 j l de medio Opti-MEM. Después de incubación, las soluciones de ADN y lipofectamina se mezclaron e incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente y el contenido se dispersó uniformemente en uno de una placa de 6 pocillos que tenía 50-60% de confluencia con las células MDA-MB-231.
Selección del clon estable - 24 horas después de la transfección de las células MDA-MB-231, la placa se comprobó con un microscopio de fluorescencia (Nikon). En esta etapa era detectable una transfección transitoria. El medio se reemplazó con medio nuevo que contenía antibióticos (higromicina) en una concentración de 250 jg/ml. Cuando las placas alcanzaron la confluencia, las células se desprendieron de la placa de cultivo después de un tratamiento de 30-60 s con tripsina, y se cultivaron en una placa de 96 pocillos en una concentración de 0.5 células/pocillo. Los pocillos que contenían un solo clon y el clon era fluorescente, se recogieron y se cultivaron en placas en una placa de 6 pocillos. Después de alcanzar la confluencia, se cultivaron además en una placa de 10 cm. Las Figs. 34A-34B muestra el clon 3 RFP MDA-MB-231 fluorescente (resistente a la higromicina) después de 1 s y 3 s de exposición, respectivamente.
Para los experimentos de PDT, las células RFP MDA-MB-231 (4x106) se implantaron por vía subcutánea en los lomos de los ratones y los tumores se desarrollaron al tamaño de tratamiento (6-8 mm) en 2-3 semanas.
Protocolo de PDT: a los ratones anestesiados se les inyectó por vía i.v. el conjugado 13 (7.5 mg de fármaco/kg de peso corporal). Los tumores se iluminaron durante 10 min. El intervalo de fármaco-luz usado era 8 h después de la inyección del fármaco. Se usó iluminación transdérmica a través de la piel de ratón con láser de diodo a 755 nm a 100 mW/cm2 (Ceramoptec, Alemania). Después del tratamiento, los ratones se devolvieron a la jaula. En el grupo de control de oscuridad, se inyectó a los ratones por vía i.v. el conjugado sensibilizante 13 y se pusieron en una jaula oscura durante 24 horas. En el grupo de control de luz, los ratones se iluminaron durante 10 min con 100 mW/cm2. Durante los primeros 2 días después de la PDT, según fuera necesario, los ratones recibieron analgesia (2.5 mg/kg de flunixina diariamente) y 3 días de oxicodona en el agua de beber. El punto final de supervivencia del animal es cuando el tamaño del tumor alcanza el 10% del peso del animal. Los ratones se sacrifican en este momento (hasta 90 días) por dislocación cervical.
Las Figs. 35A-35B muestran dos ejemplos representativos de la respuesta local de MDA-MB-231-RFP humanas a la PDT. Se inyectaron a ratones con xenoinjertos MDA-MB-231-RFP (~0.5 cm3) en sus lomos por vía i.v. 7.5 mg/kg de conjugado 13 y se iluminaron 8 h más tarde a través de la piel del ratón con láser de diodo de 755 nm a 100 mW/cm2. 35A - Fotografías tomadas desde el día 0 (antes del tratamiento) y después del tratamiento a los 1, 4, 7, 12 y 90 días. El día 4 se observó necrosis parcial, el día 7 se observó aplanamiento del tumor, después de 90 días la herida se cicatrizó y el animal se curó. 35B - Imagen de fluorescencia roja de cuerpo entero in vivo de ratones macho atímicos c D-1 que llevaban tumor ortotópico MDA-MB-231-RFP. No se detectó señal 90 días después del tratamiento.
Con el fin de estudiar la acumulación del fotosensibilizante en tumores mamarios primarios, se implantaron células MDA-MB-231-RFP (4x106) de forma ortotópica en la almohadilla mamaria de los ratones. Los tumores se desarrollaron hasta el tamaño deseado, mayor de 1 cm3, en 3-4 semanas.
Para la evaluación de la acumulación, los ratones se anestesiaron por inyección i.p. de 30 pl de mezcla de ketamina:xilazina 85:15, y recibieron una inyección i.v. en la vena de la cola de 15 mg de fármaco/kg de peso corporal de conjugado 13. La fluorescencia tanto de las células tumorales como del conjugado 13 se controla por el sistema de imagen IVIS®100 (Xenogen). El conjunto principal de filtros de imágenes tumorales estaba compuesto por: filtro de excitación 500-550 nm, filtro de emisión 575-650 nm; Conjunto de filtros de fondo para restar la autofluorescencia del tejido: filtro de excitación 460-490 nm, filtro de emisión 575-650 nm. Conjunto principal de filtros de imágenes de fotosensibilizante: filtro de excitación 665-695 nm, filtro de emisión 810-875 nm.
Se tomaron imágenes en estos tiempos de medición después de la inyección del fármaco: 15 min, 1, 2, 3, 4.5, 6 , 7.5, 9, 24 h, 2, 3, 4, 5, 6 , 7 días. Los resultados se muestran en las Figs. 36 y 37.
La Fig. 36 muestra acumulación de conjugado 13 en tumor primario MDA-MB-231-RFP de mama humano ortotópico (tamaño tumoral ~1cm3). Se tomaron imágenes desde 15 min a 24 h después de la inyección de fármaco. Panel superior - imágenes de fluorescencia roja de cuerpo entero in vivo de ratones hembra atímicos CD-1 que llevan tumor ortotópico MDA-MB-231-RFP. Panel inferior - imágenes de fluorescencia NIR de cuerpo entero in vivo de la acumulación de conjugado 13. El fármaco no muestra acumulación específica en el tumor durante las primeras 24 h.
La Fig. 37 muestra acumulación de conjugado 13 en tumor primario MDA-MB-231-RFP de mama humano ortotópico (tamaño tumoral ~1cm3). Se tomaron imágenes desde el día 1 al 6 después de la inyección del fármaco. Panel superior - imágenes de fluorescencia roja de cuerpo entero in vivo de ratones hembra atímicos CD-1 con tumor MDA-MB-231-RFP ortotópico. Panel inferior - imágenes de fluorescencia NIR de cuerpo entero in vivo de la acumulación del conjugado 13. El fármaco muestra acumulación en el tumor, alcanzando la concentración máxima específicamente en el tumor desde el día 2 después de inyección.
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Esquema 1
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Ċ
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Łpéndice
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Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un conjugado de un péptido que contiene RGD o un compuesto no peptídico que imita péptidos que tienen el patrón RGD (en la presente memoria péptidomimético de RGD) y un fotosensibilizante seleccionado de una clorofila o bacterioclorofila de la fórmula I, II o III:
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M representa 2H o un átomo seleccionado de Mg, Pd, Pt, Co, Ni, Sn, Cu, Zn, Mn, In, Eu, Fe, Au, Al, Gd, Er, Yb, Lu, Ga, Y, Rh, Ru, Si, Ge, Cr, Mo, P, Re, Tc o Tl y sus isótopos, preferiblemente 2H, Cu, Mn o Pd;
X es O o N-R7 ;
R1 , R'2 y R6 cada uno independientemente es Y-R8, -NRgR'g o -N+RgR'gR'gA-; o R1 y R6 juntos forman un anillo que comprende un resto de péptido de RGD o peptidomimétido de RGD;
Y es O o S;
R2 es H, OH o COORg;
R3 es H, OH, alquilo C1-C12 o alcoxi C1-C12;
R4 es -CH=CRgR'g, -CH=CRgHal, -CH=CH-CH2-NRgR'g, -CH=CH-CH2-N+RgR'gR"A‘, -CHO, -CH=NRg, -CH=N+RgR'gA-, -CH2-ORg, -CH2-SRg, -CH2-Hal, -CH2-Rg, -CH2-NRgR'g, -CH2-N+RgR'gR"gA‘, -CH2-CH2 Rg, -CH2-CH2 Hal, -CH2-CH2ORg, -CH2-CH2SRg, -CH2-CH2-NRgR'g, -CH2-CH2-N+RgR'gR"gA‘, -COCH3 , C(CH3 )=CRgR'g, -C(CH3)=CRgHal, -C(CH3)=NRg, -CH(CH3 )=N+RgR'gA‘, -CH(CH3)-Hal, -CH(CH3)-ORg, -CH(CH3 )-SRg, -CH(CH3)-NRgR'g, -CH(CH3)-N+RgR'g R'gA', o -CECRg;
6Q
R'4 es metilo o formilo;
R5 es =O, =S, =N-Rg, =N+RgR'9A", =CRgR'g, o =CRg-Hal;
R7 , R8, R9 , R'9 y R"g es cada uno independientemente:
(a) H;
(b) hidrocarbilo C1-C25 ;
(c) hidrocarbilo C1-C25 sustituido con uno o más grupos funcionales seleccionados de halógeno, nitro, oxo, OR, SR, epoxi, epitio, -NRR', -CONRR', -CONR-NRR', -NHCONRR', -NHCONRNRR', -COR, COOR", -OSO3 R, -SO3 R", -SO2 R, -NHSO2 R, -SO2 NRR', =N-OR, -(CH2)n-CO-NRR', -O-(CH2)n-OR, -O-(CH2)n-O-(CH2 )n-R, -OPO3 RR', -PO2 HR, y -PO3 R"R", en donde n es un número entero de 1 a 6, y R y R' es cada uno independientemente H, hidrocarbilo o heterociclilo, R' puede ser además un resto de un péptido de RGD o un peptidomimético de RGD, o R y R' junto con el átomo de N al que están unidos forman un anillo saturado de 5-7 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo adicional seleccionado de O, S y N, en donde el átomo de N adicional puede estar sustituido, y R" es H, un catión, hidrocarbilo o heterociclilo;
(d) hidrocarbilo C1-C25 sustituido con uno o más grupos funcionales seleccionados de grupos con carga positiva, grupos con carga negativa, grupos básicos que se convierten en grupos con carga positiva en condiciones fisiológicas y grupos ácido que se convierten en grupos con carga negativa en condiciones fisiológicas;
(e) hidrocarbilo C1-C25 que contiene uno o más heteroátomos y/o uno o más restos carbocíclicos o heterocíclicos;
(f) hidrocarbilo C1-C25 que contiene uno o más heteroátomos y/o uno o más restos carbocíclicos o heterocíclicos y sustituido con uno o más grupos funcionales como se ha definido antes en (c) y (d);
(g) hidrocarbilo C1-C25 sustituido con un resto de un aminoácido, un péptido, una proteína, un monosacárido, un oligosacárido, un polisacárido o un ligando polidentado y sus complejos de quelación con metales; o (h) un resto de un aminoácido, un péptido, una proteína, un monosacárido, un oligosacárido, un polisacárido; o un ligando polidentado y sus complejos de quelación con metales;
R7 puede ser además -NRR', en donde R y R' es cada uno H o hidrocarbilo C1-C25 , opcionalmente sustituido con un grupo con carga negativa, preferiblemente SO3 -;
R8 puede ser además H+ o un catión R+10 cuando R1, R'2 y R6 es cada uno independientemente Y-R8;
R+10 es un metal, un grupo amonio o un catión orgánico;
A' es un anión fisiológicamente aceptable;
m es 0 o 1;
la línea de trazos en las posiciones 7-8 representa un doble enlace opcional; y
sales farmacéuticamente aceptables e isómeros ópticos de los mismos;
en donde dicho derivado de clorofila o bacterioclorofila de fórmula I, II o III contiene al menos un resto de péptido que contiene RGD o resto peptidomimético de RGD, en donde dicho péptido que contiene RGD es un péptido lineal o cíclico todo L, todo D o un L,D compuesto de 4-100, preferiblemente 5-50, 5-30, 5-20, más preferiblemente 4, 5, 6, 7, 9 o 25 restos aminoácido que pueden ser opcionalmente aminoácidos naturales o no naturales modificados, y dicho peptidomimético de RGD es un compuesto no peptídico que comprende una guanidina y un grupo carboxilo terminal espaciado por una cadena de 11 átomos, siendo átomos de carbono al menos 5 de dichos átomos, dicha cadena comprende uno o más átomos de O, S o N y puede estar opcionalmente sustituida con oxo, tioxo, halógeno, amino, alquilo C1-C6 , hidroxilo o carboxilo o uno o más átomos de dicha cadena pueden formar un anillo carbocíclico o heterocíclico de 3-6 miembros.2
2. El conjugado según la reivindicación 1, en donde dicho péptido que contiene RGD es un péptido cíclico seleccionado de:
(i) el pentapéptido cicloRGDfK (SEQ ID NO: 1), en donde f indica D-Phe,
(ii) el nonapéptido designado en la presente memoria RGD-4C (SEQ ID NO: 2),
(iii) el tetrapéptido cicloRGDK (SEQ ID NO: 4),
(iv) el pentapéptido cicloRGDf-n(Me)K (SEQ ID NO: 7), en donde f indica D- Phe; o
(v) el pentapéptido cicloRGDyK (SEQ ID NO: 8), en donde y indica D-Tyr;
o un péptido lineal seleccionado de:
(i) el hexapéptido GRGDSP (SEQ ID NO: 3),
(ii) el heptapéptido GRGDSPK (SEQ ID NO: 5), o
(iii) el péptido de secuencia (GRGDSP)4 K (SEQ ID NO: 7);
y dicho peptidomimético de RGD tiene la fórmula:
(i) H2N-C(=NH)NH-(CH2)5-CO-NH-CH(CH2)-(CH2)2-COOH.
3. El conjugado según la reivindicación 1, en donde la línea de trazos en las posiciones 7-8 representa bien un doble enlace y el fotosensibilizante es una clorofila de la fórmula I, II o III, o la línea de trazos en las posiciones 7-8 está ausente y el fotosensibilizante es una bacterioclorofila de la fórmula I, II o III; en donde cada R4 , independientemente, es radical acetilo, vinilo, etilo o 1 -hidroxietilo o un éter o éster de dicho radical 1 -hidroxietilo, y cualquiera de los hidrocarbilos C1-C25 es un alquilo C1-C25 , preferiblemente alquilo C1-C10 , más preferiblemente alquilo C2-C3.
4. El conjugado según la reivindicación 1, en donde el fotosensibilizante es una bacterioclorofila de fórmula I o II, en donde R4 en la posición 3 es acetilo, R4 en la posición 8 es etilo, R'4 es metilo y las posiciones 7-8 están hidrogenadas, o una clorofila de fórmula I o II, en donde R4 en la posición 3 es vinilo, R4 en la posición 8 es etilo, R'4 es metilo y hay un doble enlace en las posiciones 7-8.
5. El conjugado según la reivindicación 1, en donde el fotosensibilizante es una bacterioclorofila de la fórmula I, II o III, y M es Pd, o el fotosensibilizante es una clorofila de la fórmula II y M es 2H, Cu o Mn.
6. El conjugado según la reivindicación 1, en donde dicha clorofila o bacterioclorofila de la fórmula I, II o III contiene al menos un grupo con carga negativa seleccionado de COO‘, COS- SO3 ' o PO32' o al menos un grupo ácido que se convierte en un grupo con carga negativa al pH fisiológico seleccionado de COOH, COSH, SO3 H o PO3 H2 , o una sal del mismo.
7. El conjugado según la reivindicación 1, en donde dicha clorofila o bacterioclorofila de la fórmula I, II o III contiene al menos un grupo con carga positiva seleccionado de:
(i) un catión derivado de un grupo que contiene N seleccionado de -N+(RR'R"), -(R)NN+(R'R"), O-^N+(RR')-, >C=N+(RR'), -C(=RN)-N+R'R" y -(R)NC(=NR)-N+R'R", en donde R, R' y R" es cada uno independientemente H, hidrocarbilo o heterociclilo, o dos de R, R' y R" junto con el átomo de N al que están unidos, forman un anillo saturado de 3-7 miembros, que opcionalmente contiene uno o más heteroátomos seleccionados de O, S o N y opcionalmente sustituido además en el átomo de N adicional;
(ii) un catión derivado de un compuesto heteroaromático que contiene uno o más átomos de N y opcionalmente átomos de O o S seleccionados de pirazolio, imidazolio, oxazolio, tiazolio, piridinio, quinolinio, isoquinolinio, pirimidinio, 1,2,4-triazinio, 1,3,5-triazinio y purinio; o
(iii) un grupo onio seleccionado de -O+(RR'), -S+(RR'), -Se+(RR'), -Te+(RR'), -P+(RR'R"), -As+(RR'R"), -Sb+(RR'R") y -Bi+(RR'R"), en donde R, R' y R" es cada uno independientemente H, hidrocarbilo o heterociclilo.
8. El conjugado según la reivindicación 1, que contiene al menos un grupo básico que se convierte en un grupo con carga positiva en condiciones fisiológicas, en donde dicho al menos un grupo básico es -NRR', -C(=NR)-NR'R", -NR-NR'R", -(R)NC(=NR)-NR'R", O ^NR-, o >C=NR, en donde cada uno de R, R' y R" es independientemente H, opcionalmente hidrocarbilo o heterociclilo sustituido, o dos de R, R' y R" junto con el átomo de N forman un anillo saturado de 3-7 miembros, que contiene opcionalmente un átomo de O, S o N y opcionalmente sustituido además en el átomo de N adicional, dicho anillo se selecciona de aziridina, pirrolidina, piperidina, morfolina, tiomorfolina, azepina o piperazina opcionalmente sustituido en el átomo de N adicional con alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con halógeno, hidroxilo o amino, o el grupo básico es un radical heteroaromático que contiene N seleccionado de pirazolilo, imidazolilo, oxazolilo, tiazolilo, piridilo, quinolinilo, isoquinolinilo, pirimidilo, 1,2,4-triazinilo, 1,3,5-triazinilo o purinilo, en donde dicho grupo básico es un grupo final o un grupo situado dentro de una cadena de alquilo.
9. El conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 8, en donde el fotosensibilizante se selecciona de:
(i) una clorofila o bacterioclorofila de fórmula II y R6 es un grupo básico -NRgR'g en donde Rg es H y R'g es alquilo C1-C6 sustituido con un grupo básico -NH-(CH2 )2-6-NRR' en donde cada uno de R y R' es independientemente H, alquilo C 1 -C 6 opcionalmente sustituido con NH 2 o R y R' junto con el átomo de N forman un anillo saturado de 5-6 miembros, que contiene opcionalmente un átomo de O o N y opcionalmente sustituido además en el átomo de N adicional con -(CH 2 ) 2 - 6 -NH 2 , en donde R6 es preferiblemente -NH-(CH 2 ) 3 -NH-(CH 2 ) 3 -NH 2 , -NH-(CH2)2-1-morfolino, o -NH-(CH 2 ) 3 -piperazino-(CH 2 ) 3 -NH 2 ;
(ii) una clorofila o bacterioclorofila de fórmula II y R 1 y R6 juntos forman un anillo cíclico que comprende un péptido de RGD o un peptidomimético de RGD;
(iii) una clorofila o bacterioclorofila de fórmula III, en donde X es -N-R 7 , R 7 es -NRR', R es H y R' es alquilo C 2 -C 6 sustituido con SO 3 - o una sal alcalina del mismo, en donde R 7 preferiblemente es -NH-(CH 2 ) 3 -SO 3 K;
(iv) una clorofila o bacterioclorofila de fórmula II y R6 es -NRgR'g, Rg es H y R'g es HOCH 2 -CH(OH)-CH 2 -;
(v) una clorofila o bacterioclorofila de fórmula II y R6 es -NRgR'g, Rg es H y R'g es alquilo C 1 -C 6 sustituido con un ligando polidentado o sus complejos de quelación con metales, preferiblemente una bacterioclorofila de fórmula II y dicho ligando polidentado es Ed Ta , DTPA o DOTA; R6 es -NRgR'g, preferiblemente -NH-(CH 2 ) 3 -NH-DTPA, Rg es H y R'g es alquilo C 1 -C 6 sustituido con un ligando polidentado o sus complejos de quelación con metales tales como Gd; o
(vi) una clorofila o bacterioclorofila de fórmula II y R 6 es -NRgR'g en donde Rg es H y R'g es alquilo C 1 -C 10 sustituido con SO 3 H o una sal alcalina del mismo, preferiblemente R 6 es -NH-(CH 2 ) 2 -SO 3 K.
10. El conjugado según la reivindicación 1, seleccionado de:
(i) un conjugado en donde el fotosensibilizante es una bacterioclorofila de la fórmula II en donde M es Pd; m es 1; R 1 es NH-P, en donde P es el resto del peptidomimético de RGD; R '2 es metoxi; R 4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R '4 es metilo; y R6 es -NH-(CH 2 ) 2 -SO 3 K (conjugado 40) o -NH-(CH 2 ) 2 -SO 3 K (conjugado 41);
(ii) un conjugado en donde el fotosensibilizante es una bacterioclorofila de la fórmula II en donde m es 1; R '2 es metoxi; R 4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R '4 es metilo; y bien R 1 y R6 juntos forman un anillo cíclico que comprende -NH-Rg D-CO-NH-(CH 2 ) 2 -NH- y M es Pd (Conjugado 37) o M es 2H (Conjugado 38) o R 1 y R6 juntos forman un anillo cíclico que comprende -NH-RGD-CO-NH-(CH 2 ) 3 -piperazino-(CH 2 )' 3 -NH- y M es Pd (Conjugado 39);
(iii) un conjugado en donde el fotosensibilizante es una clorofila de la fórmula II en donde m es 1; R '2 es metoxi; R 1 es NH-P, en donde P es el resto del péptido que contiene RGD de SEQ ID NO: 1; R 4 en la posición 3 es vinilo y en la posición 8 es etilo; R '4 es metilo; y R6 es -NH-(CH 2 ) 2 -SO 3 K (Conjugado 16), M es Mn (Conjugado 17), o M es Cu (Conjugado 18);
(iv) un conjugado en donde el fotosensibilizante es una bacterioclorofila de la fórmula I en donde R 1 es NH-P, en donde P es el resto del péptido que contiene RGD de SEQ ID NO: 1; R 2 es OH; R 3 es COOCH 3 ; R 4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R '4 es metilo; y R 5 es O (Conjugado 12); o R 2 es H, u M es 2H (Conjugado 27);
(v) un conjugado en donde el fotosensibilizante es una bacterioclorofila de la fórmula I en donde M es 2H; R 1 es NH-(c H 2 ) 2 -NH-CO-P, en donde P es el resto del péptido que contiene RGD de SEQ ID NO: 4; R 2 es H; R 3 es COOCH 3 ; R 4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R '4 es metilo; y R 5 es O (Conjugado 32);
(vi) un conjugado en donde el fotosensibilizante es una bacterioclorofila de la fórmula II en donde M es Pd; m es 1; R 1 es NH-P, en donde P es el resto del péptido que contiene RGD de SEQ ID NO: 2; R '2 es metoxi; R 4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R '4 es metilo; y R6 es -NH-(CH 2 ) 2 -SO 3 K (Conjugado 11);
(vii) un conjugado en donde el fotosensibilizante es una bacterioclorofila de la fórmula II en donde m es 1; R 1 es NH-P, en donde P es el resto del péptido que contiene RGD de SEQ ID NO: 1; R '2 es metoxi; R 4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R '4 es metilo; y R6 es -NH-(CH 2 ) 2 -SO 3 K; y M es 2H (Conjugado 13), M es Mn (Conjugado 14); M es Cu (Conjugado 15) o M es Pd (Conjugado 24);
(viii) un conjugado en donde el fotosensibilizante es una bacterioclorofila de la fórmula III en donde M es Pd; R 1 es NH-P, en donde P es el resto del péptido que contiene RGD de SEQ ID NO: 1; R 4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R '4 es metilo; X es N-R 7 y R 7 es -NH-(CH 2 ) 3 -SO 3 K (Conjugado 19);
(ix) un conjugado en donde el fotosensibilizante es una bacterioclorofila de la fórmula II en donde M es 2H; m es 1; R 1 es NH-P, en donde P es el resto del péptido que contiene RGD de SEQ ID NO: 3; R '2 es metoxi; R 4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R '4 es metilo; y R6 es -NH-(CH 2 ) 2 -SO 3 K (Conjugado 26);
(x) un conjugado en donde el fotosensibilizante es una bacterioclorofila de la fórmula II en donde M es Pd; m es 1 ; R '2 es metoxi; R 4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R '4 es metilo; y R6 es -NH-(CH 2 ) 2 SO 3 K y R 1 es NH-P, en donde P es el resto del péptido que contiene RGD de SEQ ID NO: 5 (Conjugado 33) SEQ iD NO: 6 (Conjugado 34) o SEQ ID NO: 7 (Conjugado 35);
(xi) un conjugado en donde el fotosensibilizante es una bacterioclorofila de la fórmula II en donde M es Pd; m es 1; R 1 es NH-CH(-(CH 2 ) 2 -CO-NH-P) 2 , en donde P es el resto del péptido que contiene RGD de SEQ ID NO: 8; R' 2 es metoxi; R 4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R' 4 es metilo; y R 6 es -NH-(CH 2 ) 2 -SO 3 K (conjugado 36);
(xii) un conjugado en donde el fotosensibilizante es una bacterioclorofila de la fórmula II en donde M es Pd; m es 1; R 1 es NH-P, en donde P es el resto del péptido que contiene RGD de SEQ ID NO: 1; R' 2 es metoxi; R 4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R' 4 es metilo; y R 6 es -NH-CH 2 -CH(OH)-CH 2 OH. (Conjugado 23); o
(xiii) un conjugado en donde el fotosensibilizante es una bacterioclorofila de la fórmula II en donde M es 2H; m es 1; R 1 es NH-P, en donde P es el resto del péptido que contiene RGD de SEQ ID NO: 1; R' 2 es metoxi; R 4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R' 4 es metilo; y R 6 es -NH-(CH 2 ) 3 -NH-CO-DTPA (conjugado 43) o su complejo quelado con Gd (conjugado 44).
11. La bacterioclorofila de la fórmula II en la reivindicación 1, en donde M es Pd; R 1 es COOH; m es 1; R' 2 es metoxi; R 4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R' 4 es metilo; y R 6 es -NH-CH 2 -CH(OH)-CH 2 -OH (compuesto 10).
12. Una composición farmacéutica que comprende un conjugado de un péptido que contiene RGD o un peptidomimético de RGD y un fotosensibilizante seleccionado de una clorofila o una bacterioclorofila como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
13. La composición farmacéutica según la reivindicación 12, en donde el conjugado se selecciona de:
(i) Sal de potasio de paladio-3 1 -oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 13 1 -(2-sulfoetil)amida-17 3 -(RGD-4C)amida (conjugado 11 );
(ii) Manganeso(III)-13 2 -OH-Bacteriofeoforbida-17 3 -(cicloRGDfK)amida (conjugado 12);
(iii) Sal de potasio de 3 1 -oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 13 1 -(2-sulfoetil)amida-17 3 -(cicloRGDfK)amida (conjugado 13);
(iv) Sal de potasio de cobre(II)-3 1 -oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 13 1 -(2-sulfoetil)amida-17 3 -(cicloRGDfK)amida (conjugado 15);
(v) Sal de potasio de 3 1 ,3 2 -dideshidrorodoclorina 13 1 -(2-sulfoetil)amida-17 3 -(cicloRGDfK) amida (conjugado 16);
(vi) Sal de potasio de manganeso(III)-3 1 ,3 2 -dideshidrorodoclorina 13 1 -(2-sulfoetil)amida-17 3 -(cicloRGDfK)amida (conjugado 17);
(vii) Sal de potasio de cobre(II)-3 1 ,3 2 -dideshidrorodoclorina 13 1 -(2-sulfoetil)amida-17 3 -(cicloRGDfK)amida (conjugado 18);
(viii) Sal de potasio de paladio-bacteriopurpurina N-(3-sulfopropilamino)imida-17 3 -(cicloRGDfK)amida (conjugado 19);
(ix) Paladio-3 1 -oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina-13 1 -(2,3-dihidroxipropil)amida-17 3 -(cicloRGDfK)amida (conjugado 23);
(x) Sal de potasio de paladio-3 1 -oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 13 1 -(2-sulfoetil)amida-17 3 -(cicloRGDfK)amida (conjugado 24);
(xi) Sal de potasio de 3 1 -oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 13 1 -(2-sulfoetil)amida-17 3 -(GRGDSP)amida (conjugado 26);
(xii) Bacteriofeoforbida-17 3 -(cicloRGDfK)amida (conjugado 27);
(xiii) 3 1 -oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 13 1 -(3-[(3-aminopropil)amino]propil)amida-17 3 -(cicloRGDfK)amida (conjugado 28);
(xiv) 3 1 -oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 13 1 -(2,3-dihidroxipropil)amida-17 3 -(cicloRGDfK)amida (conjugado 29);
(xv) 3 1 -oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 13 1 -(2-morfolino-N-etil)amida-17 3 -(cicloRGDfK)amida (conjugado 30);
(xvi) 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacteriodorina 131-{3-[4-(3-aminopropil)-piperazin-1-il]-propil}amida-173-(cidoRGDfK)amida (conjugado 31);
(xvii) Bacteriofeoforbida-173-(2-cicloRGDK-amido-N-etil)amida (conjugado 32);
(xviii) Sal de potasio de paladio-31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amidal73-(GRGDSPK)amida (conjugado 33);
(xix) Sal de potasio de paladio-31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida-173-[(GRGDSP)4 K]amida (conjugado 34);
(xx) Sal de potasio de paladio-31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida-173-(cicloRGDf-N(Me)K)amida (conjugado 35);
(xxi) Sal de potasio de paladio-31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)-173-N-[ácido 4-heptanodioico bis-(cidoRGDyK-amido)]amida (conjugado 36);
(xxii) Sal de potasio de paladio-31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida-173-[4-(metil-5-(6-guanidino-hexanoilamino)-ácido pentanoico)]amida sal de potasio (conjugado 40);
(xxiii) Sal de potasio de paladio-31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacteriodorina 131-(2-sulfoetil)amida-173-[7-amido-3-[[1-(4-guanidino-butiril)-piperidina-3-carbonil]-amino]-ácido heptanoico] (conjugado 41); (xxiv) 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(3-DTPA-amido-N-propil)amida-173-(cicloRGDfK)amida (conjugado 43); y
(xxv) 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(3-Gd-DTPA-amido-N-propil)amida-173-(cicloRGDfK)amida (conjugado 44),
preferiblemente sal de potasio de paladio-31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil)amida-173-(cicloRGDfK)amida (conjugado 24).
14. La composición farmacéutica según la reivindicación 12 o 13, para usar en terapia fotodinámica (PDT) o PDT vascular dirigida (VTP).
15. La composición farmacéutica según la reivindicación 14, para usar en el tratamiento de: (i) tumores que incluyen tumores primarios o tumores metastásicos tales como melanoma, cáncer de colon, mama, pulmón, próstata, cerebro o cabeza y cuello; (ii) tejido no neoplásico; (iii) degeneración macular asociada a la edad; y (iv) obesidad.
16. La composición farmacéutica según la reivindicación 12 o 13, para usar en propósitos de diagnóstico, que incluyen: visualización de órganos y tejidos y diagnóstico de tumores, que incluye:
(i) diagnóstico de tumores por imágenes de fluorescencia dinámica, en donde M en el fotosensibilizante es 2H o un metal seleccionado de Cu, Pd Gd, Pt, Zn, Al, Eu, Er, Yb o isótopos de los mismos;
(ii) diagnóstico de tumores por técnica de radiodiagnóstico, en donde M en el fotosensibilizante es un radioisótopo seleccionado de 64Cu, 67Cu, 99mTc, 67Ga, 201Tl, 195Pt, 60Co, 111In y 51Cr, preferiblemente en donde dicha técnica de radiodiagnóstico es tomografía por emisión de positrones (PET) y M es 64Cu o 67Cu, o en donde dicha técnica de radiodiagnóstico es tomografía de emisión de fotón único (SPET) y M es un radioisótopo seleccionado de 99mTc, 67Ga, 195Pt, 111In, 51Cr y 60Co; y
(iii) diagnóstico de tumores por imágenes de resonancia magnética molecular (MRI), en donde M es un metal paramagnético seleccionado de Mn3+, Cu2+, Fe3+, Eu3+, Gd3+ y Dy3+, o el fotosensibilizante está sustituido con un complejo de metal-quelato de un ligando polidentado y el metal es como se define en lo que antecede.
17. La composición farmacéutica según la reivindicación 12 para usar en radioterapia tumoral, en donde M es un radioisótopo seleccionado de 103Pd, 195Pt, 105Rh, 106Rh, 188Re, 177Lu, 164Er, 117mSn, 153Sm, 90Y, 67Cu y 32P.
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