JP2010502574A - Ｒｇｄペプチドとポルフィリン又は（バクテリオ）クロロフィル光合成剤とのコンジュゲート及びその使用 - Google Patents

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Abstract

腫瘍及び加齢黄斑変性症などの非新生物性血管疾患の光線力学的治療（ＰＤＴ）、特に血管標的のＰＤＴ（ＶＴＰ）、並びに様々な技術による腫瘍の診断に有用な、ポルフィリン、クロロフィル及びバクテリオクロロフィル感光剤とＲＧＤ含有ペプチド又はＲＧＤペプチド模倣体とのコンジュゲートを提供する。

Description

本発明は感光剤に関し、より詳細には、ポルフィリン、クロロフィル及びバクテリオクロロフィル誘導体とＲＧＤモチーフを含むペプチド又はＲＧＤペプチド模倣体との新規コンジュゲート、その調製、並びに腫瘍及び加齢黄斑変性症などの様々な血管疾患のｉｎ ｖｉｖｏ光線力学的治療及び診断の方法におけるその使用に関する。
定義及び略記
ＡＭＤ：加齢黄斑変性症；Ｂｃｈｌ ａ：バクテリオクロロフィルａ：第５の同素環、中心Ｍｇ原子、１７３位にフィチル又はゲラニルゲラニル基、１３２位にＣＯＯＣＨ３基、１３２位にＨ原子、２、７、１２、１８位にメチル基、３位にアセチル基、及び８位にエチル基を有する、五環性７，８，１７，１８−テトラヒドロポルフィリンであり、本明細書中で化合物１と呼ぶ；Ｂｐｈｅ：バクテリオフェオフィチンａ（中心Ｍｇが２つのＨ原子によって置き換えられているＢｃｈｌ）；Ｂｐｈｅｉｄ：バクテリオフェオホルビドａ（中心金属原子を有さないＢｐｈｅに由来するＣ−１７２−遊離カルボン酸）；Ｃｈｌ：クロロフィル；ＥＣ：内皮細胞；ＥＣＭ：細胞外基質；ＮＩＲ：近赤外線；Ｐｄ−Ｂｐｈｅｉｄ：Ｐｄ−バクテリオフェオホルビドａ；ＰＤＴ：光線力学的治療；ＲＧＤ−４Ｃ：環状ノナペプチドＣＤＣＲＧＤＣＦＣ−ＮＨ２；ロドバクテリオクロリン（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｉｎ）：１７位に−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ基、１３位に−ＣＯＯＨ、２、７、１２、８位にメチル基、並びに３及び８位にエチル基を有する、四環性７，８，１７，１８−テトラヒドロポルフィリン；ＲＯＳ：反応性酸素種；ＶＴＩ：血管標的のイメージング；ＶＴＰ：血管標的のＰＤＴ。
バクテリオクロロフィル誘導体のＩＵＰＡＣの番号付けを本明細書全体にわたって使用する。この学名を使用して、天然のバクテリオクロロフィルは１３２及び１７２位で２つのカルボン酸エステルを保有するが、これらは１３３及び１７３位でエステル化されている。
光線力学的治療（ＰＤＴ）とは、無毒性薬物及び無害の光感作性照射を組み合わせて細胞毒性を有する反応性酸素種をｉｎ ｓｉｔｕで発生させる、腫瘍の非外科的処置である。この技術は、一般的に使用されている腫瘍の化学療法及び放射線療法よりも選択的である。
腫瘍のＰＤＴは、感光剤の投与及び局所光送達の組合せを含み、これらは、それ自体ではどちらも無害の薬剤であるが、酸素分子の存在下では、細胞を失活させることができる、細胞毒性を有する反応性酸素種（ＲＯＳ）を生じる能力を有する。２成分の処置法であるＰＤＴは、より高い特異性を可能にし、より選択的である潜在性を有する一方で、一般的に使用されている化学療法又は放射線療法と比較して破壊性は低くない（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ他、１９９８；Ｂｏｎｎｅｔｔ他、１９９９；Ｋｅｓｓｅｌ及びＤｏｕｇｈｅｒｔｙ、１９９９；Ｍａｚｏｎ、１９９９；Ｈａｈｎ及びＧｌａｔｓｔｅｉｎ、１９９９）。
ポルフィリンは、診療所において一次感光剤として用いられている。光による最適な組織浸透は、６５０〜８００ｎｍで起こると考えられる。世界で最初に認可された光線力学的治療剤であり、ヘマトポルフィリン−ＩＸから酸で処理することによって得られ、食道及び気管支内の非小細胞肺癌の処置についてＦＤＡの認可を受けたポルフィマーナトリウム（Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）、Ａｘｃａｎ Ｐｈａｒｍａ Ｉｎｃ．の商標）は、単量体、二量体、及び高次オリゴマーの複雑且つ分離できない混合物である。
大量の作業が、長い波長で吸収し、十分に確立された構造を有し、腫瘍細胞中におけるその保持と皮膚又は他の正常組織中でのその保持の差別化がより良好である、単一の純粋な化合物、いわゆる「第二世代」増感剤の合成に充てられてきた。治療学及び診断学におけるポルフィリン薬物の性能を最適化するために、例えば、４つのピロール環と錯体形成した中心金属原子（Ｍｇ以外）が存在する、及び／又はピロール環の周辺置換基が修飾されている、及び／又は大環状分子が二水素化されてクロロフィル誘導体（クロリン）となっている若しくは四水素化されてバクテリオクロロフィル誘導体（バクテリオクロリン）となっている、いくつかのポルフィリン誘導体が提案されている。
有利なスペクトル領域（６５０〜８５０ｎｍ）におけるその吸収が強いこと、及び処置後のその分解性が容易なことにより、クロロフィル（Ｃｈｌ）及びバクテリオクロロフィル（ＢＣｈｌ）誘導体は、腫瘍のＰＤＴの優れた増感剤として同定され、またポルフィリンと比較して優れた特性を有している。バクテリオクロロフィルは、近赤外線、即ち、クロロフィル誘導体よりも相当に長い波長で強いバンドを示すので、クロロフィルと比較して潜在的に有利である。
腫瘍血管の標的化
腫瘍細胞の成長及び発生は、連続的な酸素及び栄養素の供給に非常に依存するので、腫瘍細胞自体ではなく腫瘍血管構造を破壊するために光線力学的試薬を標的化することは、治療上の利点を提供し得る（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、２００２）。そのような血管損傷には血栓の形成が含まれ、腫瘍血液灌流をさらに制限し得る（Ｈｕａｎｇ他、１９９７）。さらに、腫瘍血管内皮細胞（ＥＣ）層の標的化により、治療用巨大分子による腫瘍間質の乏しい浸透が回避されると予測される（Ｈｕａｎｇ他、１９９７；Ｂｕｒｒｏｗｓ及びＴｈｏｒｐｅ、１９９４）。腫瘍血管は腫瘍の微小環境に影響を受け、腫瘍関連の「シグネチャ」を獲得する可能性があるが、これらは悪性ではなく、薬物耐性を発生する可能性は低い。さらに、標的化した抗血管剤も腫瘍細胞に対して活性を有する場合は、有効性のさらなる増加を期待することができる。したがって、抗血管特性を抗腫瘍の細胞毒性活性と１つの薬物中で組み合わせることにより、その有効性は増加することが期待でき、したがって、必要な有効細胞毒性用量を低下させることができる。ＥＣに加えて、一例では、腫瘍血管の管腔側モザイクの一部も腫瘍細胞を含むことが示されている（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、２００２；Ｃｈａｎｇ他、２０００）。したがって、これらの腫瘍細胞は血液に直接曝されており、そうでなければ内皮障壁を越えることができない治療用巨大分子と自由に相互作用すると考えられている。
選択的な血管の標的化は、示差的な感受性並びにその結果としての腫瘍及び正常血管の治療剤に対する応答に依存することができる。或いは、示差的なエンドサイトーシスにより、細胞毒性がある又は他の治療剤の選択的な取り込みを促進し得る。最近の研究により、血管ＥＣの器官／組織に特異的な特性が示唆されている（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、２００２）。様々な組織中の血管は、ほとんどが知られていない組織特異的内皮マーカーを発現する可能性が高い。炎症、虚血及び悪性疾患などの病理学的プロセスも、そのシグネチャをそれぞれの血管構造に課すことができる（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、２００２；Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ及びＲａｊｏｔｔｅ、２０００；Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、２０００；Ｒａｊｏｔｔｅ他、１９９８；Ａｒａｐ他、１９９８）。腫瘍中の血管を特徴づける生化学的特徴には、特定のインテグリンなどの血管形成関連分子が含まれ得る。インテグリンαｖβ３、αｖβ５及びα５β１は、腫瘍、創傷、炎症性組織、及び血管再構築中に関連している血管形成の血管ＥＣに典型的な発現パターンにおいて同定されている（Ｂｒｏｏｋｓ他、１９９４ａ；Ｂｒｏｏｋｓ他、１９９４ｂ；Ｂｒｏｏｋｓ他、１９９５；Ｅｌｃｅｉｒｉ及びＣｈｅｒｅｓｈ、１９９９）。内皮細胞成長因子受容体、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、細胞表面プロテオグリカン及び細胞外基質（ＥＣＭ）の構成成分も記載されている（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、２０００）。この異種遺伝子型の分子及びプロセスの豊かなレパートリーは、治療の標的化した送達の新しい機会を提供し得る。
この目的を達成するために、様々な戦略が探求されている。血管構造中の特異的部位を標的とする循環ペプチド、ペプチド模倣体又は抗体は、そのほとんどが血管壁などの生理的障壁の先に位置する、腫瘍細胞を直接標的とするそのようなコンジュゲートを超える理論的な利点を提供する治療剤及び診断剤の担体として魅力的である。
Ｃｈａｌｅｉｘ他、２００３は、ＲＧＤ−ポルフィリンのコンジュゲートの合成をＰＤＴでの応用の潜在的な候補として開示しており、メタレート化されていないポルフィリン大環状分子は、１０、１５、２０位のそれぞれで４−メチルフェニル又はアセチル化グルコシルオキシフェニルによって、且つ５位でスペーサーアームを介して、大環状分子と連結している直鎖状ＲＧＤ含有ペプチドの残基によって置換されている。
αｖβ３及びαｖβ５インテグリンを介した内皮及び腫瘍細胞によるＲＧＤ含有ペプチドの選択的取り込み
ＥＣＭ構成成分のアルギニン−グリシン−アスパラギン酸Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）モチーフは、フィブロネクチン（Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ及びＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９８４）並びにビトロネクチンと同様、インテグリンと結合する（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ及びＰｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ、１９８７；Ｄ’Ｓｏｕｚａ ＳＥ他、１９９１；Ｊｏｓｈｉ他、１９９３；Ｋｏｉｖｕｎｅｎ他、１９９４）。インテグリンに媒介される接着は、細胞の生存、増殖、及び遊走を調節する細胞内シグナル伝達事象をもたらす。２５種程度のインテグリンが知られており、そのうち少なくとも８種が、ＲＧＤモチーフを一次認識配列としてそのリガンド中で結合する。
ＲＧＤ含有ペプチドをスクリーニングするファージディスプレイ方法によって得られたデータ（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ及びＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６）により、腫瘍血管の内皮裏層に対するその選択的結合が示されている（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ他、１９９７）。インテグリンの発現は、活性状態のＥＣ上では高いが、休止状態のＥＣ上ではより制限されていることが報告されているので、小さな合成ＲＧＤ含有ペプチドは、血管内皮及び腫瘍細胞の成長を損なわせる拮抗剤として提案されている。また、ＲＧＤペプチドは、シグナル伝達を遅延させ、細胞遊走に影響を与え、腫瘍細胞の回帰又はアポトーシスも誘発する（Ｓｕ他、２００２）。ＲＧＤ類似体は、腫瘍イメージング（Ｈａｕｂｎｅｒ他、２００１）、抗血管形成手法（Ｋａｗａｇｕｃｈｉ他、２００１；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ他、２０００）、並びに放射性ヌクレオチドの腫瘍標的化（ｖａｎ Ｈａｇｅｎ他、２０００）及び化学療法薬（Ａｒａｐ他、１９９８；Ｚｉｔｚｍａｎｎ他、２００２）において使用されている。
インテグリンは癌細胞上でも発現され、したがって、癌細胞の侵襲、転移、増殖及びアポトーシスにおいて重要な役割を果たす。好ましい器官内への腫瘍細胞の転移侵襲は、腫瘍細胞と器官に特異的な内皮マーカーとの間の接着性相互作用に依存する細胞ホーミング現象を表し得る（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ及びＲａｊｏｔｔｅ、２０００）。内皮又は腫瘍細胞のどちらかのインテグリンと結合することによって、ＲＧＤペプチドは、腫瘍細胞−ＥＣＭ及び腫瘍細胞−ＥＣの付着を阻害することによってｉｎ ｖｉｖｏ細胞輸送を変調することができ、これは転移プロセスに必須である。いくつかの研究は、ＲＧＤ含有化合物が、腫瘍細胞の転移プロセスをｉｎ ｖｉｔｒｏで（Ｇｏｌｉｇｏｒｓｋｙ他、１９９８；Ｒｏｍａｎｏｖ及びＧｏｌｉｇｏｒｓｋｙ、１９９９）並びにｉｎ ｖｉｖｏで（Ｓａｉｋｉ他、１９８９；Ｈａｒｄａｎ他、１９９３）妨害できることを示している。
個々のインテグリンに特異的なペプチドは相当の興味が持たれており、且つ医薬的有意性の可能性が高い。αｖβ３インテグリンは、腫瘍血管形成と関連していることが示された最初のインテグリンであった。αｖβ３インテグリンを特異的に遮断するＲＧＤペプチドは、腫瘍及び網膜血管形成、骨粗鬆症の阻害剤として、また、腫瘍血管構造を薬物の標的とすることにおいて、有望性を示している（Ａｓｓａ−Ｍｕｎｔ他、２００１）。抗癌薬ドキソルビシン又はプロアポトーシスペプチドをαｖβ３インテグリン結合ＲＧＤペプチドとカップリングさせることにより、マウスにおける異種移植腫瘍に対して試験した場合に、未修飾の薬物よりも活性が高く毒性が低い化合物が得られる（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、２０００；Ａｒａｐ他、１９９８；Ａｒａｐ他、２００２；Ｅｌｌｅｒｂｙ他、１９９９）。
米国特許ＵＳ６，５７６，２３９、欧州特許ＥＰ０９２７０４５Ｂ１及び国際公開公報ＷＯ９８／０１０７９５（すべてＴｈｅ Ｂｕｒｎｈａｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ所有、発明者：Ｅ．Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ及びＲ．Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ）は、アミノ酸配列ＲＧＤ又はＮＧＲを含む腫瘍ホーミングペプチドを含むコンジュゲートを開示しており、前記腫瘍ホーミングペプチドは治療部分又は診断部分と連結しているが、但し、前記部分はファージ粒子ではない。治療部分は、細胞毒性剤又はドキソルビシンなどの癌化学療法剤であり得る。コンジュゲートは、ｉｎ ｖｉｖｏ投与した際に血管形成の血管構造へと選択的にホーミングする。腫瘍ホーミングペプチドは、２０若しくは３０個までのアミノ酸又は５０〜１００個のアミノ酸の長さの、直鎖状又は環状のペプチドであり得る。１つの好ましいペプチドは、環状ノナペプチド、ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ又はＨ−Ｃｙｓ＊−Ａｓｐ−Ｃｙｓ＊−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ＊−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ＊−ＮＨ２。
光線力学的治療（ＰＤＴ）によって腫瘍中で誘発される選択的血管応答
ＰＤＴにおける新規バクテリオクロロフィル（Ｂｃｈｌ）誘導体の増感剤としての応用が、近年、本発明者らのグループによって、科学文献（Ｚｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎ他、２００１；Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ他、２００２；Ｇｒｏｓｓ他、１９９７；Ｚｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎ他、１９９７；Ｒｏｓｅｎｂａｃｈ−Ｂｅｌｋｉｎ他、１９９６；Ｇｒｏｓｓ他、２００３ａ；Ｋｏｕｄｉｎｏｖａ他、２００３；Ｐｒｅｉｓｅ他、２００３；Ｇｒｏｓｓ他、２００３ｂ）及び特許公開の米国特許ＵＳ５，７２６，１６９、ＵＳ５，６５０，２９２、ＵＳ５，９５５，５８５、ＵＳ６，１４７，１９５、ＵＳ６，７４０，６３７、ＵＳ６，３３３，３１９、ＵＳ６，５６９，８４６、ＵＳ７，０４５，１１７、ドイツ特許ＤＥ４１ ２１ ８７６、欧州特許ＥＰ１ ２４６ ８２６、国際公開公報ＷＯ２００４／０４５４９２、ＷＯ２００５／１２０５７３中に報告されている。Ｂｃｈｌ誘導体のスペクトル、光物理学、及び光化学により、これらは、ＰＤＴで現在使用されている他の増感剤を超える明白な利点を有する、最適な光収集分子となっている。これらのＢｃｈｌ誘導体は大部分が極性であり、非常に短い間循環中に留まり、他の組織への血管外遊走は実質的にない（Ｂｒａｎｄｉｓ他、２００３）。したがって、これらの化合物は、光との短い（５〜１０分間）側頭血管内遭遇及びＰＤＴで生じた細胞毒性を有するＲＯＳに対する腫瘍血管のより高い感受性に依存する血管標的のＰＤＴの良好な候補である。
本発明者らのグループが行った最近の研究により、一次光感作は血管内であり、虚血性閉塞の急速な発生及び照射期間内での静止を伴うことが示された。また、このプロセスは、光化学的に誘発される脂質過酸化（ＬＰＯ）及び主に腫瘍血管構造に限局されている早期ＥＣ死も誘発させる（Ｇｒｏｓｓ他、２００３ａ；Ｋｏｕｄｉｎｏｖａ他、２００３）。光非依存性のフリーラジカル連鎖反応の進行及び発生する低酸素症により、ＬＰＯ及び細胞死は血管区画を越えて拡大して、ＰＤＴの約２４時間後で腫瘍の完全壊死が達成されるまで腫瘍間質全体に及ぶ。したがって、ＰＤＴの一次作用は、血液供給を遮断し、低酸素症を誘発し、これは、二次的な様式で、腫瘍の根絶に終わる一連の分子学的及び病態生理学的事象を開始する。
細胞のミトコンドリア、リソソーム、形質膜、及び核が、潜在的なＰＤＴ標的として評価されている。ほとんどのＰＤＴ増感剤は細胞核中に蓄積されないので、ＰＤＴは、ＤＮＡ損傷、突然変異、及び発癌を引き起こす潜在性が一般に低い。親水性増感剤はピノサイトーシス及び／又はエンドサイトーシスによって取り込まれる可能性が高く、したがって、リソソーム又はエンドソーム内に局在する。その後、露光によりリソソームを透過処理し、増感剤及び加水分解酵素がサイトゾル中に放出される（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ他、１９９８）。
形質膜へのＰＤＴ損傷は、露光の数分間以内に観察することができる。この種類の損傷は、腫脹、形質膜マーカー酵素、サイトゾル酵素及びリソソーム酵素を含む小胞の脱粒、能動輸送の低下、形質膜の脱分極、形質膜酵素の活性の阻害、細胞内Ｃａ２＋の変化、表面抗原のアップ及びダウンレギュレーション、タンパク質の架橋結合をもたらし得るＬＰＯ、並びに多剤トランスポーターへの損傷として現れる（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ他、１９９８）。
ＰＤＴがｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのどちらにおいてもアポトーシスを急速に誘発できるという報告により、光死滅機構の性質への洞察が提供されている。ＰＤＴ後のアポトーシス機構への洞察は、ミトコンドリア光損傷とアポトーシス応答との関連性を示す報告によって提供されていた可能性もある。本発明者らのグループが最近行った研究により、Ｂｃｈｌ系の感光剤がアポトーシス経路の活性化を誘発することが示された。しかし、アポトーシス経路の阻害によっては細胞を救出できなかったので、アポトーシスは恐らく細胞死の原因ではない（Ｍａｚｏｒ他、２００３、未発表）。
本出願の出願人の以下の特許及び特許出願を引用し、これらの特許及び特許出願すべての内容は、本明細書中に完全に開示した場合と同じように、その全体が参照により本明細書中に組み込まれている：米国特許ＵＳ５，７２６，１６９、ＵＳ５，６５０，２９２、ＵＳ５，９５５，５８５、ＵＳ６，１４７，１９５、ＵＳ６，７４０，６３７、ＵＳ６，３３３，３１９、ＵＳ６，５６９，８４６、ＵＳ７，０４５，１１７、ドイツ特許ＤＥ４１ ２１ ８７６、欧州特許ＥＰ１ ２４６ ８２６、国際公開公報ＷＯ２００４／０４５４９２、ＷＯ２００５／１２０５７３。
本発明は、ＲＧＤ含有ペプチド又はＲＧＤペプチド模倣体とポルフィリン、クロロフィル及びバクテリオクロロフィルからなる群から選択される感光剤とのコンジュゲートであって、感光剤が、１０、１５、２０位のそれぞれで４−メチルフェニル又はアセチル化グルコシルオキシフェニルによって、５位でスペーサーアームを介してポルフィリン大環状分子と連結した直鎖状ＲＧＤ含有ペプチドの残基によって置換されている、メタレート化されていないポルフィリンであるコンジュゲートを除外したコンジュゲートに関する。
一実施形態では、感光剤は、ポルフィリン、好ましくはテトラアリールポルフィリンである。別の実施形態では、感光剤は、クロロフィル又はバクテリオクロロフィル、好ましくは本明細書中の式Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩのものである。
本発明は、有効量の本発明の感光剤−ＲＧＤペプチドのコンジュゲート及び製薬上許容される担体を含む、組織又は器官の可視化、ＰＤＴ治療又は放射線療法を行うための診断、治療又は放射線治療用の組成物をさらに提供する。
本発明のコンジュゲートは、様々な診断技術を用いて腫瘍を診断する方法において、並びに腫瘍及び血管疾患の光線力学的治療の方法並びに腫瘍の放射線療法において、使用することができる。
コンジュゲート１１の特徴づけスペクトルを示す図である。図１Ａ：質量分析測定。 コンジュゲート１１の特徴づけスペクトルを示す図である。図１Ｂ：分光光度法分析。 コンジュゲート１１の特徴づけスペクトルを示す図である。図１Ｃ：合成後のＨＰＬＣ結果（コンジュゲート１１はピーク番号３）。 コンジュゲート９の特徴づけスペクトルを示す図である。図２Ａ：アセトン中の電子スペクトル。 コンジュゲート９の特徴づけスペクトルを示す図である。図２Ｂ：質量スペクトル：ＥＳＩ−ＭＳ（＋）６７９（Ｍ）、７０２（Ｍ＋Ｎａ）ｍ／ｚ。 Ｅｕ−ＲＧＤ−４Ｃの精製及び特徴づけを示す図である。図３Ａ：Ｅｕ−ＲＧＤ−４Ｃのクロマトグラフィー（単一の選択）。 Ｅｕ−ＲＧＤ−４Ｃの精製及び特徴づけを示す図である。図３Ｂ：質量分析（イソチオシアナトフェニル−ＤＴＰＡ−Ｅｕ−ＲＧＤ−４Ｃの分子量＝１４９８、矢印）。 受容体結合アッセイの結果を示す図である。インテグリン受容体に対する遊離Ｅｕ−ＲＧＤ−４Ｃの特異的結合活性を、Ｈ５Ｖ細胞を用いて、１μＭのＲＧＤ−４Ｃを存在させずに（全結合）又は存在させて（非特異的結合）測定した。 図４に記載の受容体結合アッセイの結果に基づいた、結合（Ｂ）及び遊離（Ｆ）Ｅｕ−ＲＧＤ−４Ｃのスキャッチャード分析を示す図である。 単離したαｖβ３インテグリン受容体と結合するＥｕ−ＲＧＤ−４Ｃを測定する固相受容体アッセイの結果を示す図である。蛍光の決定には時間分解蛍光光度法を使用した。 Ｈ５Ｖ内皮細胞の剥離に対するＲＧＤ−４Ｃの効果を示す図である。光学顕微鏡観察を用いて細胞の形態学的変化を記録した。ＲＧＤ−４Ｃを存在させないインキュベーション後に円形化細胞の５％（ｎ＝２００）。培地を新鮮なものに交換し、３時間３７℃でインキュベーションした後、ＲＧＤ−４Ｃを存在させない場合の円形化細胞の％（ｎ＝２００）は６％であった（示さず）。 Ｈ５Ｖ内皮細胞の剥離に対するＲＧＤ−４Ｃの効果を示す図である。光学顕微鏡観察を用いて細胞の形態学的変化を記録した。ＲＧＤ−４Ｃを存在させたインキュベーション後に円形化細胞の９９％（ｎ＝２００）。培地を新鮮なものに交換し、３時間３７℃でインキュベーションした後、ＲＧＤ−４Ｃを存在させた場合の円形化細胞の％（ｎ＝２００）は８％であった（示さず）。 ＨＵＶＥＣの剥離に対するＲＧＤ−４Ｃの効果を示す図である。光学顕微鏡観察を用いて細胞の形態学的変化を記録した。上パネルａ〜ｅは、漸増する濃度のＲＧＤ−４Ｃが存在する場合の細胞剥離の位相差顕微鏡観察を表す（ａ：対照；ｂ：２５μＭ；ｃ：５０μＭ；ｄ：１００μＭ；ｅ：２００μＭ）。下パネルは、培地を新鮮なものに交換した２４時間後の細胞の回復を表す。 トランス写真（ａ）、蛍光イメージ（ｂ）（励起フィルター：５２０ｎｍ；発光フィルター：７８０ｎｍ）並びに写真及び画像のマージ（ｃ）に示す、Ｈ５Ｖ内皮細胞におけるコンジュゲート２４の細胞の取り込み及び局在化を示す図である。 化合物と共に、１０％又は７５％のＦＣＳを含む培地中でインキュベーションした２０分後（上パネル）又は２．５時間後（下パネル）測定した、Ｈ５Ｖ内皮細胞におけるコンジュゲート２４及び化合物８の細胞の取り込み及び局在化を示す、一連の蛍光イメージである（励起フィルター：５２０ｎｍ；発光フィルター：７８０ｎｍ）。（ａ）８、１０％のＦＣＳ；（ｂ）２４、１０％のＦＣＳ；（ｃ）８、７５％のＦＣＳ；（ｂ）２４、７５％のＦＣＳ。 示した時点で屠殺した、ラットＣ６神経膠腫（それぞれの時点は６匹のマウスを表す）の腫瘍異種移植を有するＣＤ１ヌード雄マウス内に静脈内注射した、コンジュゲート２４の体内分布を示すグラフである。様々な器官中のＰｄ濃度は、ＩＣＰ−ＭＳによって決定した。ボックスは、ＰＤＴ及びイメージングの測定に最も適した時間窓を表す。 示した時点で屠殺した、マウスＣＴ２６ｌｕｃ結腸癌（それぞれの時点は２匹のマウスを表す）の腫瘍異種移植を有するＣＤ１ヌード雄マウス内に静脈内注射した、コンジュゲート２４の体内分布を示すグラフである。様々な器官中のＰｄ濃度は、ＩＣＰ−ＭＳによって決定した。ボックスは、ＰＤＴ及びイメージングの測定に最も適した時間窓を表す。 示した時点で屠殺した、マウス４Ｔ１ｌｕｃ乳癌（それぞれの時点は３匹のマウスを表す）の腫瘍異種移植を有するＣＤ１ヌード雄マウス内に静脈内注射した、コンジュゲート２４の体内分布を示すグラフである。様々な器官中のＰｄ濃度は、ＩＣＰ−ＭＳによって決定した。ボックスは、ＰＤＴ及びイメージングの測定に最も適した時間窓を表す。 示した時点で屠殺した、ラットＣ６神経膠腫の腫瘍異種移植を有するＣＤ１−ヌード雄マウス内に静脈内注射した（尾部静脈）、化合物８の体内分布を示す図である。Ｐｄ濃度は、ＩＣＰ−ＭＳによって決定した。 ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳房腫瘍を保有するマウスにおける、Ｃｕ−コンジュゲート１５の体内分布を示す図である。動物を選択した時点で屠殺した。時間０を減算した後、Ｃｕ濃度を選択した時点で、３匹の動物の平均値として示した。 示した時点で屠殺した、マウスＣＴ２６ｌｕｃ結腸癌の腫瘍移植片を有するＣＤ１ヌード雄マウス内に静脈内注射した、コンジュゲート４２（ＲＡＤモチーフを含む）の体内分布を示すグラフである。様々な器官中のＰｄ濃度は、ＩＣＰ−ＭＳによって決定した。コンジュゲート４２のＩＣＰ−ＭＳの結果。それぞれの時点は２匹のマウスを表す。 示した時点で屠殺した、マウスＣＴ２６ｌｕｃ結腸癌の腫瘍移植片を有するＣＤ１ヌード雄マウス内に静脈内注射した、コンジュゲート４２（ＲＡＤモチーフを含む）の体内分布を示すグラフである。様々な器官中のＰｄ濃度は、ＩＣＰ−ＭＳによって決定した。ＲＧＤコンジュゲート２４で得られた結果（図１１Ａ〜１１Ｄ参照）と比較した、目的の特定の器官（血液、腫瘍、肝臓、腎臓及び筋肉）に注目した、図１４Ａと同じ結果を示す。 化合物８（上パネル）又はコンジュゲート２４を投与した後の全身ＮＩＲ蛍光イメージングの比較を示す図である。示した画像は、右後肢の後側にラットＣ６神経膠腫異種移植を保有するマウスの、２００ｎｍｏｌ用量のコンジュゲート２４又は化合物８を注射した（ａ）４時間後、（ｂ）２４時間後、（ｃ）４８時間後及び（ｄ）７２時間後の、蛍光を例示する。腫瘍を矢印によって示し、すべての画像は同スケールに正規化している。 右前肢にＣＴ２６ｌｕｃ結腸癌の皮下異種移植（ルシフェラーゼで形質移入した）を保有するマウスの、２００ｎｍｏｌ用量のコンジュゲート２４を注射した２４時間後の写真を示す図である。蛍光及び発光イメージは、ＩＶＩＳシステムを用いて得た。 右前肢にＣＴ２６ｌｕｃ結腸癌の皮下異種移植（ルシフェラーゼで形質移入した）を保有するマウスの、２００ｎｍｏｌ用量のコンジュゲート２４を注射した２４時間後の蛍光イメージを示す図である。蛍光及び発光イメージは、ＩＶＩＳシステムを用いて得た。 右前肢にＣＴ２６ｌｕｃ結腸癌の皮下異種移植（ルシフェラーゼで形質移入した）を保有するマウスの、２００ｎｍｏｌ用量のコンジュゲート２４を注射した２４時間後の発光イメージ（ルシフェラーゼ＋ルシフェリン）を示す図である。蛍光及び発光イメージは、ＩＶＩＳシステムを用いて得た。 右前肢にマウス４Ｔ１ｌｕｃ乳腺癌（ルシフェラーゼで形質移入した）の皮下移植片を保有する２匹のマウスの、２００ｎｍｏｌ用量のコンジュゲート２４を注射した２４時間後の写真を示す図である。 右前肢にマウス４Ｔ１ｌｕｃ乳腺癌（ルシフェラーゼで形質移入した）の皮下移植片を保有する２匹のマウスの、２００ｎｍｏｌ用量のコンジュゲート２４を注射した２４時間後の蛍光イメージを示す図である。 右前肢にマウス４Ｔ１ｌｕｃ乳腺癌（ルシフェラーゼで形質移入した）の皮下移植片を保有する２匹のマウスの、２００ｎｍｏｌ用量のコンジュゲート２４を注射した２４時間後の生物発光イメージを示す図である。 コンジュゲート３１を静脈内注射した８（左パネル）及び１４（右パネル）時間後に撮影した、子宮癌ＭＬＳ異種移植を保有するマウスの蛍光イメージングを示す図である。蛍光及び発光イメージは、ＩＶＩＳシステムを用いて得た。 ラットＣ６神経膠腫異種移植を保有する２匹のマウスの、１４０ｎｍｏｌのコンジュゲート２４を単独で投与した２４時間後（左側のマウス）、又は８．５μｍｏｌの環状ＲＧＤｆＫペプチドを注射した１時間後（右側のマウス）の蛍光イメージを示す図である。それぞれのマウスは、上部から（上パネル、左）及び側面から（上パネル、右）記録した。写真の拡大も示す（下パネル）。蛍光イメージ中の丸は、異種移植したラットＣ６神経膠腫腫瘍の位置を示す。 後肢の後側にＣＴ２６ｌｕｃ異種移植を保有するＣＤ−１ヌード雄マウスの、ＲＧＤコンジュゲート２４（パネルａ、ｃ）又はＲＡＤコンジュゲート４２（パネルｂ、ｄ）を投与した２４時間後の白黒写真（上パネル）及び蛍光イメージ（下パネル）を示す図である。腫瘍を矢印によって示し、すべての画像は同スケールに正規化している。蛍光イメージは、ＩＶＩＳシステムを用いて得た。 後肢の後側に（ａ）ＯＶＣＡＲ８、（ｂ）ＣＴ２６ｌｕｃ、（ｃ）ＭＬＳ、及び（ｄ）４Ｔ１ｌｕｃ異種移植を保有するマウスの、ｃコンジュゲート２４を投与した２４時間の白黒写真（上パネル）及び蛍光イメージ（下パネル）を示す図である。腫瘍を矢印によって示し、すべての画像は同スケールに正規化している。 ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスにおける４Ｔ１ｌｕｃ乳癌腫瘍の肺転移中のコンジュゲート２４の局在化からの、コンジュゲート２４（１５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射した２４時間後の写真（上側の画像、デジタルカメラを用いて撮影）及び蛍光イメージ（下側の画像）を示す図である。ＮＩＲ蛍光シグナルは、イメージングシステムＸｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ（登録商標）１００を用いて撮影したコンジュゲート２４の局在化に由来する。 ＣＤ−１ヌード雄マウスにおけるＣＴ２６ｌｕｃ肺転移の、コンジュゲート２４（１５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射した２４時間後の一連の写真（ａ）、生物発光（ｂ）及び蛍光（ｃ）の画像を示す図である。中央の画像は、ルシフェルンとルシフェラーゼで形質移入した腫瘍細胞との反応に由来する生物発光シグナルである。右側の画像は、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステム１００を用いて撮影した、２４に由来するＮＩＲ蛍光シグナルである。矢印は肺転移を示す。 ＣＤ−１ヌード雄マウスにおけるＣＴ２６ｌｕｃ肺転移の、コンジュゲート２４（１５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射した２４時間後の一連の写真（ａ）、生物発光（ｂ）及び蛍光（ｃ）の画像を示す図である。中央の画像は、ルシフェルンとルシフェラーゼで形質移入した腫瘍細胞との反応に由来する生物発光シグナルである。右側の画像は、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステム１００を用いて撮影した、２４に由来するＮＩＲ蛍光シグナルである。矢印は肺転移を示す。 ＣＤ−１ヌード雄マウスにおけるＣＴ２６ｌｕｃ肺転移の、コンジュゲート２４（１５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射した９時間後の一連の写真（ａ）、生物発光（ｂ）及び蛍光（ｃ）の画像を示す図である。中央の画像は、ルシフェルンとルシフェラーゼで形質移入した腫瘍細胞との反応に由来する生物発光シグナルである。右側の画像は、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステム１００を用いて撮影した、２４に由来するＮＩＲ蛍光シグナルである。矢印は肺転移を示す。 ＣＤ−１ヌード雄マウスにおけるＣＴ２６ｌｕｃ肺転移の、コンジュゲート２４（１５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射した９時間後の一連の写真（ａ）、生物発光（ｂ）及び蛍光（ｃ）の画像を示す図である。中央の画像は、ルシフェルンとルシフェラーゼで形質移入した腫瘍細胞との反応に由来する生物発光シグナルである。右側の画像は、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステム１００を用いて撮影した、２４に由来するＮＩＲ蛍光シグナルである。矢印は肺転移を示す。 ＣＤ−１ヌード雄マウスにおけるＣＴ２６ｌｕｃ肺転移の、コンジュゲート２４（１５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射した４時間後の一連の写真（ａ）、生物発光（ｂ）及び蛍光（ｃ）の画像を示す図である。中央の画像は、ルシフェルンとルシフェラーゼで形質移入した腫瘍細胞との反応に由来する生物発光シグナルである。右側の画像は、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステム１００を用いて撮影した、２４に由来するＮＩＲ蛍光シグナルである。矢印は肺転移を示す。 ＣＤ−１ヌード雄マウスにおけるＣＴ２６ｌｕｃ肺転移の、コンジュゲート２４（１５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射した４時間後の一連の写真（ａ）、生物発光（ｂ）及び蛍光（ｃ）の画像を示す図である。中央の画像は、ルシフェルンとルシフェラーゼで形質移入した腫瘍細胞との反応に由来する生物発光シグナルである。右側の画像は、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステム１００を用いて撮影した、２４に由来するＮＩＲ蛍光シグナルである。矢印は肺転移を示す。 コンジュゲートを注射しなかったＣＤ−１ヌード雄マウスにおけるＣＴ２６ｌｕｃ肺転移を示す画像である。中央の画像は、ルシフェルンとルシフェラーゼで形質移入した腫瘍細胞との反応に由来する生物発光シグナルである。右側の画像は、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステム１００を用いて撮影した、２４に由来するＮＩＲ蛍光シグナルである。矢印は肺転移を示す。 コンジュゲートを注射しなかったＣＤ−１ヌード雄マウスにおけるＣＴ２６ｌｕｃ肺転移を示す画像である。中央の画像は、ルシフェルンとルシフェラーゼで形質移入した腫瘍細胞との反応に由来する生物発光シグナルである。右側の画像は、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステム１００を用いて撮影した、２４に由来するＮＩＲ蛍光シグナルである。矢印は肺転移を示す。 肺転移を有さないＣＤ−１ヌード雄マウスの、コンジュゲート２４を静脈内注射した２４時間後の画像である。中央の画像は、ルシフェルンとルシフェラーゼで形質移入した腫瘍細胞との反応に由来する生物発光シグナルである。右側の画像は、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステム１００を用いて撮影した、２４に由来するＮＩＲ蛍光シグナルである。矢印は肺転移を示す。 その左脚の後側にＣＴ２６ｌｕｃ原発腫瘍を保有し、近傍のリンパ節に転移を有するＣＤ−１ヌード雄マウスの、コンジュゲート２４（１５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射した２４時間後の白黒写真（ａ）、生物発光（ｂ）及び蛍光（ｃ）の画像を示す図である。中央の画像は、ルシフェリンとルシフェラーゼで形質移入した腫瘍細胞との反応に由来する生物発光シグナルである。右側の画像は、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステム１００を用いて撮影した、コンジュゲート２４に由来するＮＩＲ蛍光シグナルである。矢印はリンパ節転移を示す。 ９０分間３７℃で、培地中に１０％のＦＣＳの培地条件中、０〜２５μＭのコンジュゲート２３又は化合物１０と共にインキュベーションした、Ｈ５Ｖ細胞の用量応答性の生存曲線を示す図である。細胞の生存は、ニュートラルレッド生存度アッセイを用いて決定した。点は３つ組の平均結果を表す。 ９０分間３７℃で、培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２の培地条件中、０〜２５μＭのコンジュゲート２３又は化合物１０と共にインキュベーションした、Ｈ５Ｖ細胞の用量応答性の生存曲線を示す図である。細胞の生存は、ニュートラルレッド生存度アッセイを用いて決定した。点は３つ組の平均結果を表す。 ９０分間３７℃で、培地中に１０μＭのＢＳＡの培地条件中、０〜２５μＭのコンジュゲート２３又は化合物１０と共にインキュベーションした、Ｈ５Ｖ細胞の用量応答性の生存曲線を示す図である。細胞の生存は、ニュートラルレッド生存度アッセイを用いて決定した。点は３つ組の平均結果を表す。 ９０分間３７℃で、培地中に１０％のＦＣＳの培地条件中、０〜２５μＭの化合物１０と共に、過剰の遊離環状ＲＧＤｆＫ（１００倍から１ｍＭまで）を存在させて又は存在させずにインキュベーションした、Ｈ５Ｖ細胞の用量応答性の生存曲線を示す図である。細胞の生存は、ニュートラルレッド生存度アッセイを用いて決定した。点は３つ組の平均結果を表す。 ９０分間３７℃で、培地中に１０μＭのＢＳＡの培地条件中、０〜２５μＭの化合物１０と共に、過剰の遊離環状ＲＧＤｆＫ（１００倍から１ｍＭまで）を存在させて又は存在させずにインキュベーションした、Ｈ５Ｖ細胞の用量応答性の生存曲線を示す図である。細胞の生存は、ニュートラルレッド生存度アッセイを用いて決定した。点は３つ組の平均結果を表す。 ９０分間３７℃で、培地中に１０％のＦＣＳの培地条件中、コンジュゲート２３と共に、過剰の遊離環状ＲＧＤｆＫ（１００倍から１ｍＭまで）を存在させて又は存在させずにインキュベーションした、Ｈ５Ｖ細胞の用量応答性の生存曲線を示す図である。細胞の生存は、ニュートラルレッド生存度アッセイを用いて決定した。点は３つ組の平均結果を表す。 ９０分間３７℃で、培地中に１０μＭのＢＳＡの培地条件中、コンジュゲート２３と共に、過剰の遊離環状ＲＧＤｆＫ（１００倍から１ｍＭまで）を存在させて又は存在させずにインキュベーションした、Ｈ５Ｖ細胞の用量応答性の生存曲線を示す図である。細胞の生存は、ニュートラルレッド生存度アッセイを用いて決定した。点は３つ組の平均結果を表す。 １５分間３７℃で、０〜２０μＭのコンジュゲート２３と共に、培地中に１０％のＦＣＳで、過剰の遊離環状ＲＧＤｆＫ（１００倍から１ｍＭまで）を存在させて又は存在させずにインキュベーションした、Ｈ５Ｖ細胞の用量応答性の生存曲線を示す図である。細胞の生存は、ニュートラルレッド生存度アッセイを用いて決定した。点は３つ組の平均結果を表す。 １５分間４℃で、０〜２０μＭのコンジュゲート２３と共に、培地中に１０％のＦＣＳで、過剰の遊離環状ＲＧＤｆＫ（１００倍から１ｍＭまで）を存在させて又は存在させずにインキュベーションした、Ｈ５Ｖ細胞の用量応答性の生存曲線を示す図である。細胞の生存は、ニュートラルレッド生存度アッセイを用いて決定した。点は３つ組の平均結果を表す。 ２時間３７℃で、０〜２５μＭのコンジュゲート２４と共に、１０％のＦＣＳを含む培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２中でインキュベーションした、Ｈ５Ｖ細胞の用量応答性の生存曲線を示す図である。細胞の生存は、ニュートラルレッド生存度アッセイを用いて決定した。点は３つ組の平均結果を表す。 ９０分間３７℃で、０〜２０μＭのコンジュゲート１１又は化合物８（Ｐｄ−ＭＬＴ）と共に、培地中に１０μＭのＢＳＡでインキュベーションした、Ｈ５Ｖ細胞の用量応答性の生存曲線を示す図である。細胞の生存は、ニュートラルレッド生存度アッセイを用いて決定した。点は３つ組の平均結果を表す。 ９０分間３７℃で、０〜１０μＭのコンジュゲート１１と共に、培地中に１０μＭのＢＳＡで、過剰のＲＧＤ−４Ｃ（１ｍＭ）を存在させて又は存在させずにインキュベーションした、Ｈ５Ｖ細胞の用量応答性の生存曲線を示す図である。細胞の生存は、ニュートラルレッド生存度アッセイを用いて決定した。点は３つ組の平均結果を表す。 ９０分間３７℃で、０〜１０μＭの化合物８と共に、培地中に１０μＭのＢＳＡで、過剰のＲＧＤ−４Ｃ（１ｍＭ）を存在させて又は存在させずにインキュベーションした、Ｈ５Ｖ細胞の用量応答性の生存曲線を示す図である。細胞の生存は、ニュートラルレッド生存度アッセイを用いて決定した。点は３つ組の平均結果を表す。 コンジュゲート２４又は化合物８で処置したＣ６神経膠腫腫瘍異種移植の画像である。Ｃ６神経膠腫異種移植を保有するＣＤ−１ヌード雄マウスを以下のように処置した：コンジュゲート２４を１５ｍｇ／ｋｇで静脈内注射し、注射の８時間後に１５分間の照射（９０Ｊ／ｃｍ２）；上パネル：（ａ）ＰＤＴ前；（ｂ）ＰＤＴの２日後；（ｃ）ＰＤＴの３日後；（ｄ）ＰＤＴの４日後；下パネル：（ａ）ＰＤＴの７日後；（ｂ）ＰＤＴの９日後；（ｃ）ＰＤＴの１４日後；（ｄ）ＰＤＴの１８日後。画像はＰＤＴ後の示した時点で撮影した。 コンジュゲート２４又は化合物８で処置したＣ６神経膠腫腫瘍異種移植の画像である。Ｃ６神経膠腫異種移植を保有するＣＤ−１ヌード雄マウスを以下のように処置した：コンジュゲート２４を２４ｍｇ／ｋｇで静脈内注射し、注射の８時間後に１０分間の照射（６０Ｊ／ｃｍ２）；上及び下パネルのａ、ｂ、ｃ及びｄは３１Ａと同様。画像はＰＤＴ後の示した時点で撮影した。 コンジュゲート２４又は化合物８で処置したＣ６神経膠腫腫瘍異種移植の画像である。Ｃ６神経膠腫異種移植を保有するＣＤ−１ヌード雄マウスを以下のように処置した：暗対照−照射せずにコンジュゲート２４を静脈内注射した；ａ）ＰＤＴ前、ｂ）ＰＤＴの５日後。画像はＰＤＴ後の示した時点で撮影した。 コンジュゲート２４又は化合物８で処置したＣ６神経膠腫腫瘍異種移植の画像である。Ｃ６神経膠腫異種移植を保有するＣＤ−１ヌード雄マウスを以下のように処置した：明対照−感光剤を注射せずに照射した；ａ）ＰＤＴ前、ｂ）ＰＤＴの５日後。画像はＰＤＴ後の示した時点で撮影した。 コンジュゲート２４又は化合物８で処置したＣ６神経膠腫腫瘍異種移植の画像である。Ｃ６神経膠腫異種移植を保有するＣＤ−１ヌード雄マウスを以下のように処置した：コンジュゲートしていない感光剤の対照−化合物８を９ｍｇ／ｋｇで静脈内注射し、注射の８時間後に１０分間の照射（６０Ｊ／ｃｍ２）、ａ）ＰＤＴ前、ｂ）ＰＤＴの１１日後。画像はＰＤＴ後の示した時点で撮影した。 ＣＴ２６ｌｕｃ腫瘍を保有するマウスに１５ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート２４、注射の８時間後に１０分間の照射（６０Ｊ／ｃｍ２）を施用した治療の結果を示す図である。コンジュゲート２４を１５ｍｇ／ｋｇで静脈内注射し、注射の８時間後に１０分間の照射（６０Ｊ／ｃｍ２）；ａ）ＰＤＴ前、ｂ）ＰＤＴの１日後；（ｃ）ＰＤＴの４日後；（ｄ）ＰＤＴの８日後；（ｅ）ＰＤＴの１２日後；（ｆ）ＰＤＴの１９日後。画像はＰＤＴ後の示した時点で撮影した。 ＣＴ２６ｌｕｃ腫瘍を保有するマウスに１５ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート２４、注射の８時間後に１０分間の照射（６０Ｊ／ｃｍ２）を施用した治療の結果を示す図である。ＩＶＩＳシステムを用いて、３２Ａで記載したマウスにルシフェリンを腹腔内注射した後に撮影したオーバーレイ画像。最初の画像は白黒であり、動物の写真である。２番目の画像は、放出された光子データのカラーのオーバーレイである。すべての画像は同スケールに正規化している；（ａ）ＰＤＴ前；（ｂ）ＰＤＴの１日後；（ｃ）ＰＤＴの４日後；（ｄ）ＰＤＴの８日後。画像はＰＤＴ後の示した時点で撮影した。 ＣＴ２６ｌｕｃ腫瘍を保有するマウスに１５ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート２４、注射の８時間後に１０分間の照射（６０Ｊ／ｃｍ２）を施用した治療の結果を示す図である。３２Ｂに示したデータの生物発光シグナルの定量（光子／秒／ｃｍ２）である。画像はＰＤＴ後の示した時点で撮影した。 ＣＴ２６ｌｕｃ腫瘍を保有するマウスに１５ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート２４、注射の８時間後に１０分間の照射（６０Ｊ／ｃｍ２）を施用した治療の結果を示す図である。化合物８を単独で用いた対照：マウスに化合物８を静脈内注射し、８時間後に照射した；（ａ）ＰＤＴ前；（ｂ）ＰＤＴの２日後。画像はＰＤＴ後の示した時点で撮影した。 ＣＴ２６ｌｕｃ腫瘍を保有するマウスに１５ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート２４、注射の８時間後に１０分間の照射（６０Ｊ／ｃｍ２）を施用した治療の結果を示す図である。化合物８及び環状ＲＧＤｆＫの混合物を用いた対照：マウスに化合物８及び環状ＲＧＤｆＫの混合物を静脈内注射し、８時間後に照射した；（ａ）ＰＤＴ前；（ｂ）ＰＤＴの２日後。画像はＰＤＴ後の示した時点で撮影した。 ＣＴ２６ｌｕｃ腫瘍を保有するマウスに１５ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート２４、注射の８時間後に１０分間の照射（６０Ｊ／ｃｍ２）を施用した治療の結果を示す図である。環状ＲＧＤｆＫを単独で用いた対照：マウスに環状ＲＧＤｆＫを静脈内注射し、８時間後に照射した；（ａ）ＰＤＴ前；（ｂ）ＰＤＴの２日後。画像はＰＤＴ後の示した時点で撮影した。 表５にアスタリスクで示したプロトコルのカプラン−メイヤー曲線を示す図である。 １秒間の曝露後の、蛍光乳腺癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ＲＦＰクローン３（ハイグロマイシンに耐性）を示す図である。 ３秒間の曝露後の、蛍光乳腺癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ＲＦＰクローン３（ハイグロマイシンに耐性）を示す図である。 ＰＤＴに対するヒト乳腺癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰの局所応答の２つの代表的な例を示す図である。その背中にＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ異種移植（約０．５ｃｍ３）を有するマウスに、７．５ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１３を静脈内注射し、マウス皮膚を通して８時間後に照射した。（ａ）０日目（処置前）並びに処置後の（ｂ）１、（ｃ）４、（ｄ）７、（ｅ）１２及び（ｆ）９０日目に撮影した写真。４日目には部分的壊死が見られ、７日目には腫瘍の平坦化が観察され、９０日後には創傷が治癒し、動物は治癒した。右側は０日目及び９０日後におけるマウスの写真。 ＰＤＴに対するヒト乳腺癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰの局所応答の２つの代表的な例を示す図である。その背中にＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ異種移植（約０．５ｃｍ３）を有するマウスに、７．５ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１３を静脈内注射し、マウス皮膚を通して８時間後に照射した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ同所性腫瘍を保有するＣＤ−１ヌード雄マウスのｉｎ ｖｉｖｏの全身赤色蛍光イメージング。写真は３５Ａと同様の時点で撮影した。処置の９０日後にはシグナルが検出されなかった。 同所性ヒト乳房ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ原発腫瘍におけるコンジュゲート１３の蓄積を示す図である（腫瘍の大きさ約１ｃｍ３）。画像は、薬物注射の１５分間から２４時間後に撮影した。上パネル−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ同所性腫瘍を保有するＣＤ−１ヌード雌マウスのｉｎ ｖｉｖｏの全身赤色蛍光イメージング。下パネル−コンジュゲート１３の蓄積のｉｎ ｖｉｖｏの全身ＮＩＲ蛍光イメージング。薬物は最初の２４時間の間、腫瘍中に特異的な蓄積を示さなかった。ａ〜ｉ−１５分間、１時間、２時間、３時間、４．５時間、６時間、７．５時間、９時間、２４時間。 同所性ヒト乳房ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ原発腫瘍におけるコンジュゲート１３の蓄積を示す図である（腫瘍の大きさ約１ｃｍ３）。画像は、薬物注射の１日から６日後に撮影した。上パネル−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ同所性腫瘍を保有するＣＤ−１ヌード雌マウスのｉｎ ｖｉｖｏの全身赤色蛍光イメージング。下パネル−コンジュゲート１３の蓄積のｉｎ ｖｉｖｏの全身ＮＩＲ蛍光イメージング。薬物は腫瘍中の蓄積を示し、注射の２日後に腫瘍中に特異的なピーク濃度に達した。ａ〜ｉ−１時間、９時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間。
幅広い態様では、本発明は、ポルフィリン、クロロフィル（Ｃｈｌ）及びバクテリオクロロフィル（ＢＣｈｌ）から選択される感光剤とＲＧＤ含有ペプチド又はＲＧＤペプチド模倣体とのコンジュゲートに関する。
本発明の一目的は、増感剤を腫瘍血管構造へと特異的に標的化する感光剤のコンジュゲートを提供することである。慣用の化学療法では血管の標的化を超える血管感光剤の標的化の利点が一部存在する。第１に、標的化した慣用の薬物は、蓄積中、これがプロドラッグでない限りはしばしば活性化されているが、一方で、標的化した感光剤は、局所的に照射するまでは活性でない。第２に、標的化した慣用の薬物はホーミングアドレスを提示している望ましくない標的でも結合して作用するが、標的化した感光剤は関連する照射した部位でのみ活性化される。さらに、腫瘍中の新生血管内皮シグネチャに標的化した感光剤を用いたＰＤＴは、光線力学的ＥＣ傷害の誘発において顕著に選択的であり得る。
インテグリンαｖβ３は、腫瘍の増殖中に既存の血管構造からの新血管の成長を含む、腫瘍転移及び血管形成において重要な役割を果たすことが報告されている。このインテグリンは、腫瘍の増殖及び拡大の実現性のあるマーカーであり得る。したがって、インテグリンαｖβ３の発現をリアルタイムで視覚的監視するための非侵襲性のイメージング方法により、治療行為を評価する機会及び転移を検出する機会が提供される。
インテグリンは、ＲＧＤを認識することによって細胞の細胞内細胞骨格を細胞外基質と連結する。ＲＧＤペプチドはインテグリン受容体部位と相互作用し、これは、細胞シグナル伝達プロセスを開始し、多くの異なる疾患に影響を与えることができる。したがって、インテグリンのＲＧＤ結合部位は魅力的な製薬上の標的である。インテグリンαｖβ３はＲＧＤ結合部位を有しており、配列ＲＧＤを含むペプチドは、αｖβ３インテグリンにホーミングし、その拮抗剤として作用する。したがって、本発明の好ましい一実施形態では、ＲＧＤ含有ペプチドはインテグリン受容体の拮抗剤である。
本発明の二官能性コンジュゲートでは、ホーミング特性はＲＧＤ含有ペプチドによって提供される一方で、ＰＤＴ効果は感光剤によって提供される。これらのコンジュゲートは、診断及び光線力学的破壊の目的で、増感剤を原発固形腫瘍の新生血管及び場合によっては対応する転移へと標的化できるはずである。これらはさらに、抗血管形成剤として作用して新生の内皮及び血液に曝された腫瘍細胞のアポトーシス破壊を開始させることができる。
用語「ＲＧＤ含有ペプチド」又は「ＲＧＤペプチド」とは、本明細書中で互換性があるように使用し、ＲＧＤモチーフとも呼ばれるＲＧＤ配列を含むペプチドを意味する。本明細書中で使用する用語「ＲＧＤペプチド模倣体」とは、ＲＧＤモチーフを有するペプチドを模倣する化合物、特に非ペプチド化合物をいう。
ＲＧＤ含有ペプチドは、４〜１００、好ましくは５〜５０、５〜３０、５〜２０、又はより好ましくは５〜１０個のアミノ酸残基からなる直鎖状又は環状ペプチドであり得る。好ましい実施形態では、ＲＧＤペプチドは、４、５、６、７、９又は２５、最も好ましくは５個のアミノ酸残基からなる。
本明細書中で使用する用語「アミノ酸」には、２０種の天然アミノ酸及び非天然アミノ酸が含まれる。
本発明に適した天然アミノ酸の例には、それだけには限定されないが、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、及びＶａｌが含まれる。
非天然アミノ酸の例には、それだけには限定されないが、４−アミノ酪酸（Ａｂｕ）、２−アミノアジピン酸、ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、ヒドロキシリシン、ホモセリン、ホモバリン、ホモロイシン、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、ＴＩＣ、ナフチルアラニン（Ｎａｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体又はｏ−メチル−Ｔｙｒが含まれる。
また、本明細書中の用語「アミノ酸」には、翻訳後にｉｎ ｖｉｖｏで起こる修飾、例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリン及びホスホスレオニン；Ｄ−修飾；ペプチド結合のＮ−アルキル化、好ましくはＮ−メチル化；Ｌｙｓのアミノ末端基又は遊離アミノ基のアシル化又はアルキル化；Ａｓｐ又はＧｌｕのカルボキシ末端基又は遊離カルボキシ基のエステル化又はアミド化；及びＳｅｒ又はＴｙｒのヒドロキシル基のエステル化又はエーテル化などの、修飾アミノ酸も含まれる。
用語「アミノ酸」には、Ｄ−及びＬ−アミノ酸がどちらも含まれる。したがって、本発明のコンジュゲート中で使用するペプチドはすべてＤ（グリシンを除く）、すべてＬ又はＬ，Ｄ−アミノ酸であることができる。生物中の酵素によるペプチド切断を防止するためには、ペプチド結合のＤ−修飾及びＮ−アルキル化が最も有益である。本発明では、本明細書中で使用する配列番号１のペプチド、環状ＲＧＤｆＫ中のＤ−フェニルアラニンの「ｆ」残基のように、Ｄ−アミノ酸は小文字で示す。
本発明には、環状ペプチドも含まれる。ペプチドは、ジスルフィド、スルフィドの形成、特にＮ−及びＣ−末端又はアミノ酸側鎖のカルボキシルとアミノ官能基との間のラクタム形成などの、様々な方法によって環化することができる。環化は、当分野で知られている任意の方法によって、例えば、アミド結合の形成によって、例えば、鎖中の様々な位置（−ＣＯ−ＮＨ又は−ＮＨ−ＣＯ結合）でＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）を取り込むことによって、得ることができる。また、主鎖間の環化は、式Ｈ−Ｎ（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ）−Ｃ（Ｒ）Ｈ−ＣＯＯＨ又はＨ−Ｎ（（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２）−Ｃ（Ｒ）Ｈ−ＣＯＯＨ［式中、ｎ＝１〜４であり、さらにＲは任意のアミノ酸の天然又は非天然の側鎖である］の修飾アミノ酸を取り込むことによっても得ることができる。
また、環化は、２つのＣｙｓ残基を取り込むことによるＳ−Ｓ結合の形成を介しても得ることができる。さらなる側鎖間の環化は、式−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯ−［式中、ｎ＝１又は２である］の相互作用結合の形成を介して得ることができ、これは、例えば、Ｃｙｓ又はホモＣｙｓを取り込み、及びその遊離ＳＨ基と例えばブロモアセチル化Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ又はＤａｐとの反応によって可能である。
一部の実施形態では、ＲＧＤペプチドは、本明細書中に完全に開示されているかのようにその全体が本明細書中に参照により組み込まれている米国特許ＵＳ６，５７６，２３９及び欧州特許ＥＰ０９２７０４５に記載のものであり得る。
好ましい一実施形態では、本発明に従って使用するペプチドは、配列番号１の環状ペンタペプチドのＲＧＤｆＫであり、「ｆ」はＤ−Ｐｈｅ残基を示す。
別の好ましい実施形態では、ペプチドは、本明細書中で「ＲＧＤ−４Ｃ」と命名する、分子内で２つのジスルフィド結合を形成する４つのシステイン残基を含む、配列番号２の環状ノナペプチドＣＤＣＲＧＤＣＧＣであり、これはインテグリン特異性を有する有望なペプチドの１つである。このペプチドは、αｖβ５及びαｖβ３インテグリンの選択的且つ強力なリガンド（約１００ｎＭの親和定数）であることが示されている（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、２００２；Ｅｌｃｅｉｒｉ及びＣｈｅｒｅｓｈ、１９９９）。
ＲＧＤモチーフのアスパラギン酸残基は、生物活性の損失をもたらす化学分解を非常に受けやすく、この分解は、ジスルフィド結合を介した環化によって防止することができる（Ｂｏｇｄａｎｏｗｉｃｈ−Ｋｎｉｐｐ他、１９９９）。二環状ペプチドは、安定性を改善すると共に、ビトロネクチンと細胞との付着の阻害において単一のジスルフィド橋及び直鎖状ペプチドよりも高い力価を示す。二環状ＲＧＤペプチドの高い活性は、ＲＧＤモチーフだけでなく側方アミノ酸の適切に制限されたコンホメーションが原因である可能性が高い。合成ペプチド中のＲＧＤ配列の側方の残基の数及び性質は、その配列がどのように個々のインテグリン受容体によって認識されるかに、顕著な影響を与える（Ｋｏｉｖｕｎｅｎ他、１９９５；Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ及びＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９８７）。芳香族残基は、インテグリンの結合部位中で好ましい接触を行うために特に重要であり得る（Ｋｏｉｖｕｎｅｎ他、１９９５）。αｖβ３に対して標的化した環状ＲＧＤペプチドは、細胞表面上の機能的インテグリン受容体の数を変更させないインテグリン非依存性液相エンドサイトーシス経路によって内部移行する。さらに、環状ＲＧＤペプチドは、１５分後に飽和に達するプロセスにおいてリソソーム内に残る又はそこで分解され、ごく一部のみがリソソームを出て細胞質に達することができる。このことが、環状ＲＧＤペプチドが一定時間後（４８〜７２時間）にのみ細胞質中で見つかる理由を説明している（Ｈａｒｔ他、１９９４；Ｃａｓｔｅｌ他、２００１）。
他の好ましい実施形態では、ＲＧＤペプチドは、環状ペプチド：（ｉ）テトラペプチドの環状ＲＧＤＫ（配列番号４）、ペンタペプチドの環状ＲＧＤｆ−ｎ（Ｍｅ）Ｋ（配列番号７）［式中、ｆはＤ−Ｐｈｅを示し、ｆとＫの間のペプチド結合はメチル化されている］；及びペンタペプチドの環状ＲＧＤｙＫ（配列番号８）［式中、ｙはＤ−Ｔｙｒを示す］から選択される。
別の実施形態では、ＲＧＤ含有ペプチドは直鎖状であり、ヘキサペプチドのＧＲＧＤＳＰ（配列番号３）、ヘプタペプチドのＧＲＧＤＳＰＫ（配列番号５）、及び２５量体の（ＧＲＧＤＳＰ）４Ｋ（配列番号７）から選択され得る。
本発明の一実施形態では、ＲＧＤペプチドは、その周辺の官能基、例えばＣＯＯＨを介して、感光剤ポルフィリン、クロロフィル又はバクテリオクロロフィル大環状分子と直接連結しており、ＲＧＤペプチドのアミノ末端基又は遊離アミノ基とアミドＣＯ−ＮＨ２基を形成している。
別の実施形態では、ＲＧＤペプチドは、それだけには限定されないが、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＳＯ３Ｈ、ＣＯＳＨ又はＮＨ２などの末端官能基によって置換された、Ｃ１〜Ｃ２５ヒドロカルビレン、好ましくはＣ１〜Ｃ１０アルキレン又はフェニレン等のスペーサーアーム／架橋基を介して感光剤大環状分子と連結しており、これにより、エーテル、エステル、アミド、チオアミド又はスルホンアミド基を形成している。
一部の実施形態では、感光剤はＲＧｄペプチド模倣体とコンジュゲートしている。
好ましい一実施形態では、ＲＧＤペプチド模倣体は、１１個の原子の鎖によって間隔が空いたグアニジン及びカルボキシル末端基を含む非ペプチド化合物であり、前記原子のうちの少なくとも５個が炭素原子であり、前記鎖は１つ又は複数のＯ、Ｓ又はＮ原子を含み、オキソ、チオキソ、ハロゲン、アミノ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ヒドロキシル、若しくはカルボキシによって任意選択で置換され得るか、又は、前記鎖の１つ若しくは複数の原子は３〜６員の炭素環若しくはヘテロ環を形成し得る。この種の化合物は、本明細書中に完全に開示されているかのようにその全体が本明細書中に参照により組み込まれている、同出願人の国際公開公報ＷＯ９３／０９７９５に記載されている。
好ましい実施形態では、上記ＲＧＤペプチド模倣体は、鎖中にＮ原子を含み、オキソ基によって置換されている。より好ましい実施形態では、ＲＧＤペプチド模倣体は、本明細書中コンジュゲート４０で示す式を有する：
Ｈ２Ｎ−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ−（ＣＨ２）５−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２）−（ＣＨ２）２−ＣＯＯＨ
別の実施形態では、ＲＧＤペプチド模倣体は、本明細書中コンジュゲート４１で示す式を有する。
一実施形態では、感光剤は、メタレート化されていてもメタレート化されていなくてもよく、アルキル、アリール、ヘテロアリール及び又は官能基などの様々な置換基によって周辺が任意選択で置換されたポルフィリンである。好ましい実施形態では、ポルフィリン大環状分子は、５、１０、１５、２０位で４つのアリール基によって置換されている。
好ましい一実施形態では、感光剤は、以下の式のテトラアリールポルフィリンである：
Figure 2010502574
［式中、
Ａｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３、及びＡｒ４は、同一又は異なり、それぞれ、炭素環アリール、ヘテロアリール及び混合カルボアリール−ヘテロアリール基から選択されるアリール基であり、アリール基のそれぞれは、未置換であるか、又は、ハロゲン原子、アリールがフェニルの場合はＣ２〜Ｃ８アルキル、アリールがヘテロアリール若しくは混合カルボアリール−ヘテロアリールの場合はＣ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ、カルボキシ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルアミノ、アミノ−（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノ、トリ−（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアンモニウム、ヒドロキシ、及びＣＯＮＨ２から選択される１つ若しくは複数の置換基によって置換されており、Ａｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３、及びＡｒ４のうちの少なくとも１つは、その置換基のうちの１つ又は架橋基を介して前記少なくとも１つのアリール基と連結したＲＧＤ含有ペプチド又はＲＧＤペプチド模倣体によって置換されており；
ｎは、置換基が中性の場合は０であるか、又は、ｎは１〜４の整数であり；
Ｘは、アリール基が正荷電の場合は製薬上許容される陰イオンであるか、又は、アリール基が負荷電の場合は製薬上許容される陽イオンであり；
Ｍは、２Ｈであるか、又は、Ｍｇ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｓｎ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｉｎ、Ｅｕ、Ｆｅ、Ａｕ、Ａｌ、Ｇｄ、Ｅｒ、Ｙｂ、Ｌｕ、Ｇａ、Ｙ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｃｒ、Ｍｏ、Ｐ、Ｒｅ、Ｔｌ及びＴｃ並びにその同位体からなる群から選択される原子である］。
炭素環アリール基は、それ自体で又は混合カルボアリール−ヘテロアリール基の一部として、置換された又は未置換の単環又は二環状芳香族基であってよく、前記ヘテロアリール基は、それ自体で又は混合カルボアリール−ヘテロアリール基の一部として、Ｏ、Ｓ及び／又はＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含む、置換された又は未置換の５〜６員の芳香環であってよい。
炭素環アリール基の例には、フェニル、ビフェニル及びナフチルが含まれ、ヘテロアリールの例には、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、チアゾリル、ピリジル、ピリミジル、及びトリアジニルが含まれる。炭素環アリール及び／又はヘテロアリール基は、未置換であるか、又は、１つ若しくは複数のハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ、カルボキシ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルアミノ、アミノ−（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノ、及びトリ−（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアンモニウム基、カルボキシ、ＣＯＮＨ２によって置換されていてもよく、但し、炭素環アリールがメチル又はテトラアセチルグルコシルオキシによって置換されたフェニルであり、ＲＧＤペプチドが直鎖状の場合は、Ｍは２Ｈではない。
上記テトラアリールポルフィリンでは、Ｍは、好ましくは２Ｈ、Ｐｄ、Ｃｕ、Ｍｎ又はＧｄである。
好ましい一実施形態では、ポルフィリン感光剤を含むコンジュゲート中のＲＧＤペプチドは、好ましくは−ＣＯ−ＮＨ−基を介してポルフィリン部分の少なくとも１つのアリール基と連結した、配列番号１のペプチドである。
好ましい実施形態では、ＲＧＤペプチド−ポルフィリンのコンジュゲートは、配列番号１のペプチドとコンジュゲートした、メタレート化されていない又はメタレート化されたテトラアリールポルフィリンを含む：メソ−５−（４−環状ＲＧＤｆＫ−ベンズアミド）−１０，１５，２０−トリス（４−カルボキシフェニル）ポルフィン（２０）；銅（ＩＩ）メソ−５−（４−環状ＲＧＤｆＫ−ベンズアミド）−１０，１５，２０−トリス（４−カルボキシフェニル）ポルフィン（２１）；及びガドリニウム（ＩＩＩ）メソ−５−（４−環状ＲＧＤｆＫ−ベンズアミド）−１０，１５，２０−トリス（４−カルボキシフェニル）ポルフィン（２２）。
別の実施形態では、感光剤は、クロロフィル又はバクテリオクロロフィルの天然又は合成の非天然の誘導体であり得る、クロロフィル又はバクテリオクロロフィル誘導体であり、これには、大環状分子及び／又は周辺に修飾を行った、並びに／或いは中心Ｍｇ原子が存在しないか、又は診断目的及び／若しくはＰＤＴ目的に適した他の金属原子によって置換されていてもよい化合物が含まれる。
好ましい実施形態では、本発明は、感光剤が、式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩのクロロフィル又はバクテリオクロロフィル、並びにその製薬上許容される塩及び光学異性体：
Figure 2010502574
［式中、
Ｍは、２Ｈ、又はＭｇ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｓｎ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｉｎ、Ｅｕ、Ｆｅ、Ａｕ、Ａｌ、Ｇｄ、Ｅｒ、Ｙｂ、Ｌｕ、Ｇａ、Ｙ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｃｒ、Ｍｏ、Ｐ、Ｒｅ及びＴｃ並びにその同位体からなる群から選択される原子を表し；
Ｘは、Ｏ又はＮ−Ｒ７であり；
Ｒ１、Ｒ’２及びＲ６は、それぞれ独立して、Ｙ−Ｒ８、−ＮＲ９Ｒ’９若しくは−Ｎ＋Ｒ９Ｒ’９Ｒ”９Ａ−であるか、
又は、式ＩＩ中のＲ１及びＲ６は、それらが付着している炭素原子と一緒になって、ＲＧＤペプチド若しくはＲＧＤペプチド模倣体を含む環を形成し；
Ｙは、Ｏ又はＳであり；
Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ又はＣＯＯＲ９であり；
Ｒ３は、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル又はＣ１〜Ｃ１２アルコキシであり；
Ｒ４は、−ＣＨ＝ＣＲ９Ｒ’９、−ＣＨ＝ＣＲ９Ｈａｌ、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＮＲ９Ｒ’９、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−Ｎ＋Ｒ９Ｒ’９Ｒ”９Ａ−、−ＣＨＯ、−ＣＨ＝ＮＲ９、−ＣＨ＝Ｎ＋Ｒ９Ｒ’９Ａ−、−ＣＨ２−ＯＲ９、−ＣＨ２−ＳＲ９、−ＣＨ２−Ｈａｌ、−ＣＨ２−Ｒ９、−ＣＨ２−ＮＲ９Ｒ’９、−ＣＨ２−Ｎ＋Ｒ９Ｒ’９Ｒ”９Ａ−、−ＣＨ２−ＣＨ２Ｒ９、−ＣＨ２−ＣＨ２Ｈａｌ、−ＣＨ２−ＣＨ２ＯＲ９、−ＣＨ２−ＣＨ２ＳＲ９、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ９Ｒ’９、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ＋Ｒ９Ｒ’９Ｒ”９Ａ−、−ＣＯＣＨ３、Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＲ９Ｒ’９、−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＲ９Ｈａｌ、−Ｃ（ＣＨ３）＝ＮＲ９、−ＣＨ（ＣＨ３）＝Ｎ＋Ｒ９Ｒ’９Ａ−、−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｈａｌ、−ＣＨ（ＣＨ３）−ＯＲ９、−ＣＨ（ＣＨ３）−ＳＲ９、−ＣＨ（ＣＨ３）−ＮＲ９Ｒ’９、−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｎ＋Ｒ９Ｒ’９ Ｒ’９Ａ−、又は−Ｃ≡ＣＲ９であり；
Ｒ’４は、メチル又はホルミルであり；
Ｒ５は、＝Ｏ、＝Ｓ、＝Ｎ−Ｒ９、＝Ｎ＋Ｒ９Ｒ’９Ａ−、＝ＣＲ９Ｒ’９、又は＝ＣＲ９−Ｈａｌであり；
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ’９及びＲ”９は、それぞれ独立して：
（ａ）Ｈ；
（ｂ）Ｃ１〜Ｃ２５ヒドロカルビル；
（ｃ）ハロゲン、ニトロ、オキソ、ＯＲ、ＳＲ、エポキシ、エピチオ、−−ＮＲＲ’、−ＣＯＮＲＲ’、−ＣＯＮＲ−ＮＲＲ’、−ＮＨＣＯＮＲＲ’、−ＮＨＣＯＮＲＮＲＲ’、−ＣＯＲ、ＣＯＯＲ”、−ＯＳＯ３Ｒ、−ＳＯ３Ｒ”、−ＳＯ２Ｒ、−ＮＨＳＯ２Ｒ、−ＳＯ２ＮＲＲ’、＝Ｎ−ＯＲ、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−ＮＲＲ’、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＲ、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ、−ＯＰＯ３ＲＲ’、−ＰＯ２ＨＲ、及び−ＰＯ３Ｒ”Ｒ”からなる群から選択される１つ又は複数の官能基によって置換された、Ｃ１〜Ｃ２５ヒドロカルビル、好ましくはＣ１〜Ｃ２５アルキル、アルケニル又はアルキニル、より好ましくはＣ１〜Ｃ１０又はＣ１〜Ｃ６アルキル（式中、Ｒ及びＲ’は、それぞれ独立して、Ｈ、ヒドロカルビル又はヘテロシクリルであり、Ｒ”はヒドロカルビル又はヘテロシクリルである）；
（ｄ）正荷電基、負荷電基、生理的条件下で正荷電基に変換される塩基性基、及び生理的条件下で負荷電基に変換される酸性基からなる群から選択される１つ又は複数の官能基によって置換された、Ｃ１〜Ｃ２５ヒドロカルビル、好ましくはＣ１〜Ｃ２５アルキル、より好ましくはＣ１〜Ｃ１０又はＣ１〜Ｃ６アルキル；
（ｅ）１つ若しくは複数のヘテロ原子及び／又は１つ若しくは複数の炭素環若しくはヘテロ環部分を含む、Ｃ１〜Ｃ２５ヒドロカルビル、好ましくはＣ１〜Ｃ２５アルキル、より好ましくはＣ１〜Ｃ１０又はＣ１〜Ｃ６アルキル；
（ｆ）１つ若しくは複数のヘテロ原子及び／又は１つ若しくは複数の炭素環若しくはヘテロ環部分を含み、上記（ｃ）及び（ｄ）で定義した１つ又は複数の官能基によって置換された、Ｃ１〜Ｃ２５ヒドロカルビル、好ましくはＣ１〜Ｃ２５アルキル、より好ましくはＣ１〜Ｃ１０又はＣ１〜Ｃ６アルキル；
（ｇ）アミノ酸残基、ペプチド、タンパク質、単糖、オリゴ糖、多糖、又は多座配位子及び金属とのそのキレート錯体によって置換された、Ｃ１〜Ｃ２５ヒドロカルビル、好ましくはＣ１〜Ｃ２５アルキル、より好ましくはＣ１〜Ｃ１０、又はＣ１〜Ｃ６アルキル；或いは
（ｈ）アミノ酸残基、ペプチド、タンパク質、単糖、オリゴ糖、多糖、又は多座配位子及び金属とのそのキレート錯体であり；
Ｒ７はさらに、−ＮＲＲ’であってよく、Ｒ及びＲ’は、それぞれ、Ｈ、又は負荷電基、好ましくはＳＯ３ −によって任意選択で置換された、Ｃ１〜Ｃ２５ヒドロカルビル、好ましくはＣ１〜Ｃ２５アルキル、より好ましくはＣ１〜Ｃ１０若しくはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ８はさらに、Ｈ＋、又はＲ１、Ｒ’２及びＲ６は、それぞれ独立してＹ−Ｒ８である場合は陽イオンＲ＋ １０であってよく；
Ｒ＋ １０は、金属、アンモニウム基又は有機陽イオンであり；
Ａ−は、生理的に許容される陰イオンであり；
ｍは０又は１であり；
７〜８位の点線は、任意選択の二重結合を表す］であるコンジュゲートに関し、前記式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩのクロロフィル又はバクテリオクロロフィルの誘導体は、少なくとも１つのＲＧＤ含有ペプチド残基を含む。
一実施形態では、７〜８位の点線は二重結合を表し、感光剤は式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩのクロロフィルである。ＭがＭｇであり、１７３位のＲ１がフィチルオキシであり、１３２位のＲ２がＣＯＯＣＨ３であり、１３２位のＲ３がＨ原子であり、Ｒ５がＯであり、３位のＲ４がビニルであり、７〜８位の点線は二重結合を表し、Ｒ’４が７位でメチルであり、且つＲ４が８位でエチルであるか、又はＲ’４が７位でホルミルであり、且つＲ４が８位でエチルである、式Ｉの化合物は、それぞれクロロフィルａ及びｂであり、その誘導体は、異なる金属原子並びに／又は異なる置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ’４及び／若しくはＲ５を有する。
別の実施形態では、７〜８位は水素化されており、感光剤は式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩのバクテリオクロロフィルである。ＭがＭｇであり、１７３位のＲ１がフィチルオキシ又はゲラニルゲラニルオキシであり、１３２位のＲ２がＣＯＯＣＨ３であり、１３２位のＲ３がＨ原子であり、Ｒ５がＯであり、Ｒ４が、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり、７〜８位の点線が存在しない、式Ｉの化合物は、バクテリオクロロフィルａであり、その誘導体は、異なる金属原子並びに／又は異なる置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及び／若しくはＲ５を有する。
本明細書中で使用する用語「ヒドロカルビル」とは、任意の直鎖状又は分枝鎖状の、飽和又は不飽和の、非環状又は環状の、芳香族を含めた、１〜２５個の炭素原子、好ましくは１〜２０、より好ましくは１〜６、最も好ましくは２〜３個の炭素原子のヒドロカルビル基を意味する。ヒドロカルビルは、好ましくは１〜４個の炭素原子のアルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、若しくはアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、フェニルなどのアリール若しくはベンジルなどのアラルキル基であってよく、又は、１７位で天然のＣｈｌ及びＢｃｈｌ化合物に由来する基、例えばゲラニルゲラニル（２，６−ジメチル−２，６−オクタジエニル）若しくはフィチル（２，６，１０，１４−テトラメチル−ヘキサデカ−１４−エン−１６−イル）であってもよい。
本明細書中で使用する用語「炭素環部分」とは、環中に炭素原子のみを含む単環又は多環化合物をいう。炭素環部分は、飽和、即ちシクロアルキル、又は不飽和、即ちシクロアルケニル、又は芳香族、即ちアリールであり得る。
本明細書中で使用する用語「アルコキシ」とは、（Ｃ１〜Ｃ２５）アルキル−Ｏ−基をいい、Ｃ１〜Ｃ２５アルキルは上記定義したとおりである。アルコキシの例は、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシ、−ＯＣ１５Ｈ３１、−ＯＣ１６Ｈ３３、−ＯＣ１７Ｈ３５、−ＯＣ１８Ｈ３７、などである。本明細書中で使用する用語「アリールオキシ」とは、（Ｃ６〜Ｃ１８）アリール−Ｏ−基をいい、Ｃ６〜Ｃ１８アリールは上記定義したとおりであり、例えば、フェノキシ及びナフトキシである。
本明細書中で使用する用語「ヘテロアリール」又は「ヘテロ環部分」又は「芳香族ヘテロ環」又は「ヘテロシクリル」とは、Ｏ、Ｓ及びＮからなる群から選択される１〜３個のヘテロ原子を含む単環又は多環芳香族ヘテロ環に由来する基を意味する。具体的な例は、ピロリル、フリル、チエニル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、ピリジル、キノリニル、ピリミジニル、１，３，４−トリアジニル、１，２，３−トリアジニル、１，３，５−トリアジニル、ベンゾフリル、イソベンゾフリル、インドリル、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル及びベンゾオキサゾリルである。
任意の「炭素環」、「アリール」又は「ヘテロアリール」は、ハロゲン、Ｃ６〜Ｃ１４アリール、Ｃ１〜Ｃ２５アルキル、ニトロ、ＯＲ、ＳＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、−ＳＯ３Ｒ、−ＳＯ２Ｒ、−ＮＨＳＯ２Ｒ、−ＮＲＲ’、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＲ−ＣＯＲ’、及び−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−ＮＲＲ’などの１つ又は複数の基によって置換されていてもよい。多環芳香族ヘテロ環が置換されている場合、置換は炭素環及び／又はヘテロ環のうちいずれかに行い得ることを理解されたい。
本明細書中で使用する用語「ハロゲン」とは、フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨードをいう。
本発明の一実施形態では、コンジュゲートの感光剤は、生理的ｐＨで負荷電基に変換される少なくとも１つの負荷電基及び／又は少なくとも１つの酸性基を含む、式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩのクロロフィル又はバクテリオクロロフィルである。
本明細書中で定義する「負荷電基」とは、酸に由来する陰イオンであり、カルボン酸（ＣＯＯ−）、チオカルボン酸（ＣＯＳ−）、スルホン酸（ＳＯ３ −）、及びホスホン酸（ＰＯ３ ２−）イオンが含まれ、「生理的条件下で負荷電基に変換される酸性基」には、カルボキシル（−ＣＯＯＨ）、チオ−カルボキシル（−ＣＯＳＨ）、スルホン酸（−ＳＯ３Ｈ）及びホスホン酸（−ＰＯ３Ｈ２）基が含まれる。負荷電基又は生理的条件下でそれに変換される基を有するＢＣｈｌ誘導体は、本明細書中に完全に開示されているかのようにその全体が参照により本明細書中に組み込まれている、同出願人の国際公開公報ＷＯ２００４／０４５４９２に記載されている。
本発明の別の実施形態では、コンジュゲートの感光剤は、生理的ｐＨで正荷電基に変換される少なくとも１つの正荷電基及び／又は少なくとも１つの塩基性基を含む、式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩのクロロフィル又はバクテリオクロロフィルである。
本明細書中で定義する「正荷電基」は、Ｎ含有基又はＮを含まないオニウム基に由来する陽イオンを表す。腫瘍内皮は陰イオン部位の数の増加を特徴とするので、正荷電基又は生理的条件下で正荷電基に変換される塩基性基は、本発明のコンジュゲートの標的化効率を増強し得る。
本明細書中で使用する「Ｎ含有基に由来する陽イオン」とは、例えば、それだけには限定されないが、アンモニウム−Ｎ＋（ＲＲ’Ｒ”）、ヒドラジニウム−（Ｒ）Ｎ−Ｎ＋（Ｒ’Ｒ”）、アンモニウムオキシＯ←Ｎ＋（ＲＲ’）−、イミニウム＞Ｃ＝Ｎ＋（ＲＲ’）、アミジニウム−Ｃ（＝ＲＮ）−Ｎ＋Ｒ’Ｒ”又はグアニジニウム−（Ｒ）Ｎ−Ｃ（＝ＮＲ）−Ｎ＋Ｒ’Ｒ”基を表し、Ｒ、Ｒ’及びＲ”は、それぞれ独立して、Ｈ、ヒドロカルビル、好ましくは本明細書中で定義したＣ１〜Ｃ６アルキル、フェニル若しくはベンジル、又はヘテロシクリルであるか、或いは、アンモニウム基中のＲ、Ｒ’及びＲ”のうちの１つがＯＨであるか、又は、アンモニウム基中のＲ、Ｒ’及びＲ”のうちの２つか、ヒドラジニウム、アンモニウムオキシ、イミニウム、アミジニウム若しくはグアニジニウム基中のＲ及びＲ’が、それらが付着しているＮ原子と一緒になって、Ｏ、Ｓ若しくはＮからなる群から選択される１つ若しくは複数のヘテロ原子を任意選択で含み、且つ追加のＮ原子でさらに任意選択で置換されている３〜７員の飽和環を形成してもよい。或いは、前記陽イオンは、芳香族ヘテロ環中に１つ又は複数のＮ原子を含む化合物に由来する。
より好ましい一実施形態では、本発明のコンジュゲートは、式−Ｎ＋（ＲＲ’Ｒ”）のアンモニウム基を含み、Ｒ、Ｒ’及びＲ”のそれぞれは、独立して、Ｈ又は本明細書中で定義した任意選択で置換されたヒドロカルビル若しくはヘテロシクリルであるか、又は、それらのうちの１つがＯＨであり得る。−Ｎ＋（ＲＲ’Ｒ”）アンモニウム基は、Ｒ、Ｒ’若しくはＲ”基のうちの任意の２つがＨである二次アンモニウム；Ｒ、Ｒ’若しくはＲ”のうちの１つだけがＨである三次アンモニウム；又はＲ、Ｒ’又はＲ”のそれぞれが、本明細書中で定義した任意選択で置換されたヒドロカルビル若しくはヘテロシクリル基である第四級アンモニウムであり得る。Ｒ、Ｒ’又はＲ”のうちの１つがＯＨである場合、基はヒドロキシルアンモニウム基である。好ましくは、アンモニウム基は、Ｒ、Ｒ’及びＲ”が、それぞれ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシルなどのＣ１〜Ｃ６アルキルである、第四級アンモニウム基である。本明細書中で上述したように、アンモニウム基は分子中の末端基であるか、又は分子中のアルキル鎖内に見つかり得る。
ヒドラジニウム−（Ｒ）Ｎ−Ｎ＋（Ｒ’Ｒ”）、アミジニウム−Ｃ（＝ＮＲ）−Ｎ＋Ｒ’Ｒ”及びグアニジニウム−（Ｒ）Ｎ−Ｃ（＝ＮＲ）−Ｎ＋Ｒ’Ｒ”基では、Ｒ、Ｒ’及びＲ”は、それぞれ独立して、Ｈ又はヒドロカルビル若しくはヘテロシクリルであるか、或いは、Ｒ’及びＲ”は、それらが付着しているＮ原子と一緒になって、本明細書中で定義した３〜７員の飽和環を形成し得る。そのような基の例には、ＲがＨであり、Ｒ’及びＲ”が、それぞれ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシルなどのＣ１〜Ｃ６アルキルであるものが含まれる。
アンモニウムオキシＯ←Ｎ＋（ＲＲ’）−及びイミニウム＞Ｃ＝Ｎ＋（ＲＲ’）基では、Ｒ及びＲ’は、それぞれ独立して、Ｈ又はヒドロカルビル、好ましくはＣ１〜Ｃ６アルキル、若しくはヘテロシクリルであるか、或いは、Ｒ及びＲ’は、それらが付着しているＮ原子と一緒になって、本明細書中で定義した３〜７員の飽和環を形成し得る。
別の好ましい実施形態では、バクテリオクロロフィル誘導体は、式−Ｎ＋（ＲＲ’Ｒ”）の環状アンモニウム基を含み、Ｒ、Ｒ’及びＲ”のうちの２つは、Ｎ原子と一緒になって、本明細書中以下に定義する３〜７員の飽和環を形成する。
本明細書中で定義するＲ、Ｒ’及びＲ”のうちの２つによって形成される「３〜７員の飽和環」とは、それらが付着しているＮ原子と一緒になって、アジリジン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン若しくはアゼピンなどのＮのみを含む環であるか、モルホリン若しくはチオモルホリンなど、Ｏ及びＳから選択されるさらなるヘテロ原子を含み得る。ピペラジン環中のさらなるＮ原子は、ハロ、ＯＨ又はアミノによって置換されていてもよいアルキル、例えばＣ１〜Ｃ６アルキルによって、任意選択で置換されていてよい。前記飽和環に由来するオニウム基には、アジリジニウム、ピロリジニウム、ピペリジニウム、ピペラジニウム、モルホリニウム、チオモルホリニウム及びアゼピニウムが含まれる。
本明細書中で定義した「Ｎ含有芳香族ヘテロ環基に由来する陽イオン」とは、Ｏ、Ｓ又は追加のＮ原子を任意選択で含む単環又は多環化合物であり得る、Ｎ−芳香族ヘテロ環化合物に由来する陽イオンを表す。陽イオンが由来する環は、少なくとも１つのＮ原子を含み、且つ芳香族であるべきであるが、他の環は、存在する場合は、部分的に飽和であることができる。Ｎ−芳香族ヘテロ環の陽イオンの例には、ピラゾリウム、イミダゾリウム、オキサゾリウム、チアゾリウム、ピリジニウム、ピリミジニウム、キノリニウム、イソキノリニウム、１，２，４−トリアジニウム、１，３，５−トリアジニウム及びプリニウムが含まれる。
また、少なくとも１つの正荷電基は、それだけには限定されないが、ホスホニウム［−Ｐ＋（ＲＲ’Ｒ”）］、アルソニウム［−Ａｓ＋（ＲＲ’Ｒ”）］、オキソニウム［−Ｏ＋（ＲＲ’）］、スルホニウム［−Ｓ＋（ＲＲ’）］、セレノニウム［−Ｓｅ＋（ＲＲ’）］、テルロニウム［−Ｔｅ＋（ＲＲ’）］、スチボニウム［−Ｓｂ＋（ＲＲ’Ｒ”）］、又はビスマスオニウム［−Ｂｉ＋（ＲＲ’Ｒ”）］基などの窒素を含まないオニウム基であってもよく、Ｒ、Ｒ’及びＲ”のそれぞれは、独立して、Ｈ、ヒドロカルビル又はヘテロシクリル、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル若しくはヘキシルなどのＣ１〜Ｃ６アルキル、又はアリール、好ましくはフェニルである。
式−Ｐ＋（ＲＲ’Ｒ”）のホスホニウム基の例には、Ｒ、Ｒ’及びＲ”が、それぞれ、メチル、エチル、プロピル、ブチル若しくはフェニルであるか、又は、Ｒがメチル、エチル、プロピル、ブチル若しくはヘキシルであり、Ｒ’及びＲ”がどちらもフェニルである基が含まれる。式−Ａｓ＋（ＲＲ’Ｒ”）のアルソニウム基の例には、Ｒ、Ｒ’及びＲ”が、それぞれ、メチル、エチル、プロピル、ブチル又はフェニルである基が含まれる。式−Ｓ＋（ＲＲ’）のスルホニウム基の例には、Ｒ及びＲ’が、それぞれ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、フェニル、ベンジル、フェネチル、又は置換ヒドロカルビル基である基が含まれる。
本明細書中で定義する「生理的条件下で正荷電基に変換される塩基性基」とは、少なくとも理論上、生理的条件下で本明細書中に定義した正荷電基を生じる任意の塩基性基をいう。本明細書中で使用する生理的条件とは、血清のみをいうのではなく、体内の様々な組織及び細胞区画もいうことに注意されたい。
そのようなＮ含有塩基性基の例には、それだけには限定されないが、すべて本明細書中で定義した、アンモニウム基を生じる任意のアミノ基、イミニウム基を生じる任意のイミン基、ヒドラジニウム基を生じる任意のヒドラジン基、アンモニウムオキシ基を生じる任意のアミノオキシ基、アミジニウム基を生じる任意のアミジン基、グアニジニウム基を生じる任意のグアニジン基が含まれる。他の例にはホスフィノ及びメルカプト基が含まれる。
したがって、本発明のコンジュゲートは、−ＮＲＲ’、−Ｃ（＝ＮＲ）−ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ−ＮＲ’Ｒ”、−（Ｒ）Ｎ−Ｃ（＝ＮＲ）−ＮＲ’Ｒ”、Ｏ←ＮＲ−、又は＞Ｃ＝ＮＲなどの、生理的条件下で正荷電基に変換される少なくとも１つの塩基性基を含んでいてよく、Ｒ、Ｒ’及びＲ”のそれぞれは、独立して、Ｈ、ヒドロカルビル、好ましくはＣ１〜Ｃ２５アルキル、より好ましくはＣ１〜Ｃ１０又はＣ１〜Ｃ６アルキル、若しくはヘテロシクリルであるか、又は、Ｒ、Ｒ’及びＲ”のうちの２つは、Ｎ原子と一緒になって、Ｏ、Ｓ若しくはＮ原子を任意選択で含み、且つ追加のＮ原子でさらに任意選択で置換されている３〜７員の飽和環を形成する。或いは、塩基性基はＮ含有芳香族ヘテロ環基である。
３〜７員の飽和環は、追加のＮ原子でハロ、ヒドロキシル若しくはアミノによって任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルによって任意選択で置換された、アジリジン、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、チオモルホリン、アゼピン又はピペラジンであってよく、Ｎ含有芳香族ヘテロ環基は、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、ピリジル、キノリニル、イソキノリニル、ピリミジル、１，２，４−トリアジニル、１，３，５−トリアジニル又はプリニルであってよい。
正荷電基又は生理的条件下でそれに変換される基を有するＢＣｈｌ誘導体は、本明細書中に完全に開示されているかのようにその全体が参照により本明細書中に組み込まれている、同出願人の国際公開公報ＷＯ２００５／１２０５７３に記載されている。
一実施形態では、感光剤は式ＩＩのクロロフィル又はバクテリオクロロフィルであり、Ｒ６は塩基性基−ＮＲ９Ｒ’９であり、Ｒ９はＨであり、Ｒ’９は塩基性基−ＮＨ−（ＣＨ２）２〜６−ＮＲＲ’によって置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｒ及びＲ’のそれぞれは、独立して、Ｈ、ＮＨ２によって任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルであるか、又は、Ｒ及びＲ’は、Ｎ原子と一緒になってＯ若しくはＮ原子を任意選択で含み、且つ追加のＮ原子でさらに−（ＣＨ２）２〜６−ＮＨ２によって任意選択で置換されている、５〜６員の飽和環を形成する。
別の実施形態では、感光剤は式ＩＩのバクテリオクロロフィルであり、Ｒ６は−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−１−モルホリノ、若しくは−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ピペラジノ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２であるか、又は、Ｒ１及びＲ６は、一緒になって、ＲＧＤペプチド若しくはＲＧＤペプチド模倣体を含む環を形成する。
別の実施形態では、感光剤は式ＩＩＩのクロロフィル又はバクテリオクロロフィルであり、Ｘは−ＮＲ７であり、Ｒ７は−ＮＲＲ’であり、ＲはＨであり、Ｒ’は、ＳＯ３−によって置換されたＣ２〜６−アルキル又はそのアルカリ塩であり、好ましくは、感光剤はバクテリオクロロフィルであり、Ｘは−ＮＲ７であり、Ｒ７は−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＳＯ３Ｋである。
別の実施形態では、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９又はＲ’９は、それぞれ、１つ又は複数の−ＯＨ基によって置換されたＣ１〜６−アルキルである。例えば、感光剤は式ＩＩのクロロフィル又はバクテリオクロロフィルであり、Ｒ６は−ＮＲ９Ｒ’９であり、Ｒ９はＨであり、Ｒ’９はＨＯＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−である。
別の実施形態では、感光剤は式ＩＩのクロロフィル又はバクテリオクロロフィルであり、Ｒ６は−ＮＲ９Ｒ’９であり、Ｒ９はＨであり、Ｒ’９は、多座配位子又は金属とのそのキレート錯体によって置換されたＣ１〜６−アルキルである。多座配位子の例には、それだけには限定されないが、ＥＤＴＡ（エトリレンジアミン四酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）又は大環状リガンドＤＯＴＡが含まれる。好ましい一実施形態では、多座配位子はＤＴＰＡであり、Ｒ６は−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−ＤＴＰＡであり、金属はＧｄである。
陽イオンＲ８ ＋は、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｌｉ＋、ＮＨ４ ＋、Ｃａ２＋などのアルカリ若しくはアルカリ土類金属、より好ましくはＫ＋に由来する一価若しくは二価の陽イオンであるか、又は、Ｒ８ ＋は、アミン若しくはＮ含有基に由来する有機陽イオンであり得る。
本明細書中で定義した、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ’９について定義したＣ１〜Ｃ２５ヒドロカルビルは、ハロゲン、ニトロ、オキソ、ＯＲ、ＳＲ、エポキシ、エピチオ、アジリジン、−ＣＯＮＲＲ’、−ＣＯＲ、ＣＯＯＲ、−ＯＳＯ３Ｒ、−ＳＯ３Ｒ、−ＳＯ２Ｒ、−ＮＨＳＯ２Ｒ、−ＳＯ２ＮＲＲ’−ＮＲＲ’、＝Ｎ−ＯＲ、＝Ｎ−ＮＲＲ’、−Ｃ（＝ＮＲ）−ＮＲＲ’，−ＮＲ−ＮＲＲ’、−（Ｒ）Ｎ−Ｃ（＝ＮＲ）−ＮＲＲ’、Ｏ←ＮＲ−、＞Ｃ＝ＮＲ、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＲ−ＣＯＲ’、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−ＮＲＲ’、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＲ、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ、−ＰＲＲ’、−ＯＰＯ３ＲＲ’、−ＰＯ２ＨＲ、−ＰＯ３ＲＲ’；ＣＯＯ−、ＣＯＳ−、−ＯＳＯ３ −、−ＳＯ３ −、−ＯＰＯ３Ｒ−、−ＰＯ２Ｈ−、−ＰＯ３ ２−及び−ＰＯ３Ｒ−などの１つ若しくは複数の負荷電基；並びに／又は−Ｐ＋（ＲＲ’Ｒ”）、−Ａｓ＋（ＲＲ’Ｒ”）、−Ｏ＋（ＲＲ’）、−Ｓ＋（ＲＲ’）、−Ｓｅ＋（ＲＲ’）、−Ｔｅ＋（ＲＲ’）、−Ｓｂ＋（ＲＲ’Ｒ”）、−Ｂｉ＋（ＲＲ’Ｒ”）、Ｏ←Ｎ＋（ＲＲ’）−、＞Ｃ＝Ｎ＋（ＲＲ’）、−Ｎ＋（ＲＲ’Ｒ”）、−（Ｒ）Ｎ−Ｎ＋（ＲＲ’Ｒ”）、−（Ｒ）Ｎ−Ｃ（＝ＨＮ）−Ｎ＋ＲＲ’Ｒ”、−Ｃ（＝ＮＨ）−Ｎ＋（ＲＲ’Ｒ”）などの１つ若しくは複数の正荷電基、又はピラゾリウム、イミダゾリウム、オキサゾリウム、チアゾリウム、ピリジニウム、キノリニウム、ピリミジニウム、１，２，４−トリアジニウム、１，３，５−トリアジニウム及びプリニウムなどのＮ−芳香族ヘテロ環の陽イオンから選択される１つ又は複数の官能基によって任意選択で置換されていてもよく；ｎは１〜６の整数であり、Ｒ、Ｒ’及びＲ”は、それぞれ独立して、Ｈ、ヒドロカルビル若しくはヘテロシクリルであるか、又は、Ｒ、Ｒ’及びＲ”のうちの２つは、それらが付着しているＮ原子と一緒になって、Ｏ、Ｓ若しくはＮからなる群から選択される１つ若しくは複数のヘテロ原子を任意選択で含み、且つ追加のＮ原子でさらに任意選択で置換されている３〜７員の飽和環を形成する。また、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ’９について定義したＣ１〜Ｃ２５ヒドロカルビルは、グリコシルなどのモノ−、オリゴ−若しくは多糖、又はアミノ酸、ペプチド若しくはタンパク質の残基によって置換されていてもよい。さらに、Ｒ８、Ｒ９及びＲ’９は、それぞれ独立して、グリコシルなどのモノ−、オリゴ−若しくは多糖、又はアミノ酸、ペプチド若しくはタンパク質の残基、或いはＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＥＤＴＡなどの多座配位子及び金属とのそのキレート錯体であり得る。
ＯＲ及びＳＲ基では、ＲがＨである場合は、ヒドロキシ及びメルカプト基がそれぞれ表され、ＲがＨ以外の場合は、エーテル及びスルフィドがそれぞれ表される。−ＰＲＲ’基では、Ｒ及びＲ’がＨである場合にホスフィノ基が表される。−ＣＯＲ基では、ＲがＨである場合は、アルデヒドのホルミル基−ＣＨＯが表される一方で、ＲがＨ以外の場合は、これはアルキルカルボニル及びアリールカルボニル基などのケトン残基である。ＣＯＯＲ基では、ＲがＨでない場合、これはアルコキシカルボニル及びアリールオキシカルボニル基などのカルボン酸エステル基である。同様に、−ＯＳＯ３Ｒ、−ＳＯ３Ｒ、−ＳＯ２Ｒ、−ＯＰＯ３ＲＲ’、−ＰＯ２ＨＲ及び−ＰＯ３ＲＲ’基では、Ｒ及びＲ’がＨ以外の場合にエステルが表される。
本発明の好ましい一実施形態では、感光剤はメタレート化されていない、即ち、Ｍは２Ｈである。他の好ましい実施形態では、感光剤は、本明細書中で上記定義したようにメタレート化されている、より好ましくは、ＭはＰｄ、Ｃｕ又はＭｎ、最も好ましくはＰｄである。
本発明の一部の好ましい実施形態では、感光剤は、式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩ、より好ましくは式ＩＩのバクテリオクロロフィルであり、Ｍは２Ｈ、Ｃｕ、Ｍｎ、より好ましくはＰｄである。他の実施形態では、感光剤は式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩ、より好ましくは式ＩＩのクロロフィルであり、Ｍは２Ｈ、Ｃｕ又はＭｎである。
一部の好ましい実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩの感光剤バクテリオクロロフィルを含み、ＭはＰｄ、Ｍｎ、Ｃｕ又は２Ｈであり；ｍは０であり；Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、Ｐは、ＮＨ−に直接又はスペーサーを介して連結しているＲＧＤ含有ペプチド又はＲＧＤペプチド模倣体の残基であり；Ｒ’２はメトキシであり；Ｒ４は、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４はメチルであり；Ｒ６は−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３ −Ｍｅ＋であり、Ｍｅ＋はＮａ＋又はＫ＋である。
他の好ましい実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩの感光剤バクテリオクロロフィルを含み、ＭはＰｄ又は２Ｈであり；ｍは０であり；Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、Ｐは、ＮＨ−に直接又はスペーサーを介して連結しているＲＧＤ含有ペプチド又はＲＧＤペプチド模倣体の残基であり；Ｒ’２はメトキシであり；Ｒ４は、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４はメチルであり；Ｒ６は−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＯＨである。
別の実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩＩのバクテリオクロロフィルを含み、ＭはＰｄであり；Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、Ｐは、ＮＨ−に直接又はスペーサーを介して連結しているＲＧＤ含有ペプチド又はＲＧＤペプチド模倣体の残基であり；Ｒ４は、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４はメチルであり；ＸがＮ−Ｒ７であり、Ｒ７は−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＳＯ３ −Ｍｅ＋であり、Ｍｅ＋はＮａ＋又はＫ＋である。
別の実施形態では、コンジュゲートは式Ｉのバクテリオクロロフィルを含み、ＭはＭｎであり；Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、Ｐは、ＮＨ−に直接又はスペーサーを介して連結しているＲＧＤ含有ペプチド又はＲＧＤペプチド模倣体の残基であり；Ｒ２はＯＨであり；Ｒ３はＣＯＯＣＨ３であり；Ｒ４は、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４はメチルであり；Ｒ５はＯである。
別の実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩのクロロフィルを含み、ＭはＭｎ、Ｃｕ又は２Ｈから選択され；Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、Ｐは、ＮＨ−に直接又はスペーサーを介して連結しているＲＧＤ含有ペプチド又はＲＧＤペプチド模倣体の残基であり；Ｒ４は、３位ではビニルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４はメチルであり；Ｒ６は−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３ −Ｍｅ＋であり、Ｍｅ＋はＮａ＋又はＫ＋である。
別の実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩのバクテリオクロロフィルを含み、Ｍは２Ｈであり；ｍは０であり；Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、Ｐは、ＮＨ−に直接又はスペーサーを介して連結しているＲＧＤ含有ペプチド又はＲＧＤペプチド模倣体の残基であり；Ｒ’２はメトキシであり；Ｒ４は、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４はメチルであり；Ｒ６は−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２である。
別の実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩのバクテリオクロロフィルを含み、Ｍは２Ｈであり；ｍは０であり；Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、Ｐは、ＮＨ−に直接又はスペーサーを介して連結しているＲＧＤ含有ペプチド又はＲＧＤペプチド模倣体の残基であり；Ｒ’２はメトキシであり；Ｒ４は、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４はメチルであり；Ｒ６は−ＮＨ−（ＣＨ２）２−モルホリノである。
別の実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩのバクテリオクロロフィルを含み、Ｍは２Ｈであり；ｍは０であり；Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、Ｐは、ＮＨ−に直接又はスペーサーを介して連結しているＲＧＤ含有ペプチド又はＲＧＤペプチド模倣体の残基であり；Ｒ’２はメトキシであり；Ｒ４は、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４はメチルであり；Ｒ６は−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ピペラジノ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２である。
別の実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩのバクテリオクロロフィルを含み、ＭはＰｄであり；ｍは０であり；Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、ＰはＲＧＤペプチド模倣体の残基であり；Ｒ’２はメトキシであり；Ｒ４は、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４はメチルであり；Ｒ６は−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋである（コンジュゲート４０）。
別の実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩのバクテリオクロロフィルを含み、ＭはＰｄであり；ｍは０であり；Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、ＰはＲＧＤペプチド模倣体の残基であり；Ｒ’２はメトキシであり；Ｒ４は、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４はメチルであり；Ｒ６は−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋである（コンジュゲート４１）。
別の実施形態では、Ｒ１及びＲ６は、一緒になって、−ＮＨ−ＲＧＤ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−又は−ＮＨ−ＲＧＤ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ピペラジノ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−を含む環を形成する。一実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩのバクテリオクロロフィルを含み、ｍは０であり；Ｒ’２はメトキシであり；Ｒ４は、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４はメチルであり；Ｒ１及びＲ６は、一緒になって、−ＮＨ−ＲＧＤ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−を含む環を形成し、ＭはＰｄであるか（コンジュゲート３７）、若しくはＭは２Ｈであるか（コンジュゲート３８）、又は、Ｒ１及びＲ６は、一緒になって、−ＮＨ−ＲＧＤ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ピペラジノ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−を含む環を形成し、ＭはＰｄである（コンジュゲート３９）。
別の実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩのクロロフィルを含み、Ｍは２Ｈであり；Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、Ｐは配列番号１のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ４は、３位ではビニルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４はメチルであり；Ｒ６は−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋである（コンジュゲート１６）。
別の実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩのクロロフィルを含み、ＭはＭｎであり；Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、Ｐは配列番号１のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ４は、３位ではビニルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４はメチルであり；Ｒ６は−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋである（コンジュゲート１７）。
別の実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩのクロロフィルを含み、ＭはＣｕであり；Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、Ｐは配列番号１のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ４は、３位ではビニルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４はメチルであり；Ｒ６は−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋである（コンジュゲート１８）。
別の実施形態では、コンジュゲートは式Ｉのバクテリオクロロフィルを含み、ＭはＭｎであり；Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、Ｐは配列番号１のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ２はＯＨであり；Ｒ３はＣＯＯＣＨ３であり；Ｒ４は、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４はメチルであり；Ｒ５はＯである（コンジュゲート１２）。
別の実施形態では、コンジュゲートは式Ｉのバクテリオクロロフィルを含み、Ｍは２Ｈであり；Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、Ｐは配列番号１のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ２はＯＨであり；Ｒ３はＣＯＯＣＨ３であり；Ｒ４は、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４はメチルであり；Ｒ５はＯである（コンジュゲート２７）。
別の実施形態では、コンジュゲートは式Ｉのバクテリオクロロフィルを含み、Ｍは２Ｈであり；Ｒ１はＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−Ｐであり、Ｐは配列番号４のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ２はＯＨであり；Ｒ３はＣＯＯＣＨ３であり；Ｒ４は、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４はメチルであり；Ｒ５はＯである（コンジュゲート３２）。
別の実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩのバクテリオクロロフィルを含み、ＭはＰｄであり；ｍは０であり；Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、Ｐは配列番号２のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ’２はメトキシであり；Ｒ４は、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４はメチルであり；Ｒ６は−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋである（コンジュゲート１１）。
別の実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩのバクテリオクロロフィルを含み、Ｍは２Ｈであり；ｍは０であり；Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、Ｐは配列番号１のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ’２はメトキシであり；Ｒ４は、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４はメチルであり；Ｒ６は−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋである（コンジュゲート１３）。
別の実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩのバクテリオクロロフィルを含み、ＭはＭｎであり；ｍは０であり；Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、Ｐは配列番号１のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ’２はメトキシであり；Ｒ４は、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４はメチルであり；Ｒ６は−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋである（コンジュゲート１４）。
別の実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩのバクテリオクロロフィルを含み、ＭはＣｕであり；ｍは０であり；Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、Ｐは配列番号１のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ’２はメトキシであり；Ｒ４は、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４はメチルであり；Ｒ６は−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋである（コンジュゲート１５）。
別の実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩのバクテリオクロロフィルを含み、ＭはＰｄであり；ｍは０であり；Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、Ｐは配列番号１のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ’２はメトキシであり；Ｒ４は、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４はメチルであり；Ｒ６は−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋである（コンジュゲート２４）。
別の実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩのバクテリオクロロフィルを含み、ＭはＰｄであり；ｍは０であり；Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、Ｐは配列番号１のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ’２はメトキシであり；Ｒ４は、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４はメチルであり；Ｒ６は−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＳＯ３Ｋである（コンジュゲート１９）。
別の実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩのバクテリオクロロフィルを含み、Ｍは２Ｈであり；ｍは０であり；Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、Ｐは配列番号３のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ’２はメトキシであり；Ｒ４は、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４はメチルであり；Ｒ６は−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋである（コンジュゲート２６）。
別の実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩのバクテリオクロロフィルを含み、ＭはＰｄであり；ｍは０であり；Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、Ｐは配列番号５のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ’２はメトキシであり；Ｒ４は、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４はメチルであり；Ｒ６は−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋである（コンジュゲート３３）。
別の実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩのバクテリオクロロフィルを含み、ＭはＰｄであり；ｍは０であり；Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、Ｐは配列番号６のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ’２はメトキシであり；Ｒ４は、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４はメチルであり；Ｒ６は−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋである（コンジュゲート３４）。
別の実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩのバクテリオクロロフィルを含み、ＭはＰｄであり；ｍは０であり；Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、Ｐは配列番号７のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ’２はメトキシであり；Ｒ４は、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４はメチルであり；Ｒ６は−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋである（コンジュゲート３５）。
別の実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩのバクテリオクロロフィルを含み、ＭはＰｄであり；ｍは０であり；Ｒ１はＮＨ−ＣＨ［（−（ＣＨ２）２−ＣＯ−ＮＨ−Ｐ］２であり、Ｐは配列番号８のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ’２はメトキシであり；Ｒ４は、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４はメチルであり；Ｒ６は−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋである（コンジュゲート３６）。
別の実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩのバクテリオクロロフィルを含み、ＭはＰｄであり；ｍは０であり；Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、Ｐは配列番号１のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ’２はメトキシであり；Ｒ４は、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４はメチルであり；Ｒ６は−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２ＯＨである。（コンジュゲート２３）。
別の実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩのバクテリオクロロフィルを含み、Ｍは２Ｈであり；ｍは０であり；Ｒ１はＮＨ−Ｐであり、Ｐは配列番号１のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ’２はメトキシであり；Ｒ４は、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４はメチルであり；Ｒ６は、−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−ＣＯ−ＤＴＰＡ（コンジュゲート４３）又はＧｄとのそのキレート錯体（コンジュゲート４４）である。
本発明は、式ＩＩの新規バクテリオクロロフィルをさらに提供し、ＭはＰｄであり；Ｒ１はＣＯＯＨであり；Ｒ’２はメトキシであり；Ｒ４は、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４はメチルであり；Ｒ６は−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＯＨである（化合物１０）。
別の態様では、本発明は、ＲＧＤ含有ペプチド又はＲＧＤペプチド模倣体と、本明細書中で定義したポルフィリン、クロロフィル又はバクテリオクロロフィルから選択される感光剤と、製薬上許容される担体とのコンジュゲートを含む薬剤組成物を提供する。
一実施形態では、薬剤組成物は、本明細書中で定義したポルフィリン感光剤又は製薬上許容されるその塩を含むコンジュゲートを含む。別の実施形態では、薬剤組成物は、本明細書中で定義した式Ｉ、ＩＩ若しくはＩＩＩのクロロフィル若しくはバクテリオクロロフィル感光剤又は製薬上許容されるその塩を含むコンジュゲートを含む。
好ましい一実施形態では、薬剤組成物は、クロロフィルが式ＩＩを有するコンジュゲート、より好ましくはコンジュゲート１６、１７及び１８から選択されるコンジュゲートを含む。
別の好ましい実施形態では、薬剤組成物は、バクテリオクロロフィルが式Ｉを有するコンジュゲート、より好ましくはコンジュゲート１２、２７及び３２から選択されるコンジュゲートを含む。
別の好ましい実施形態では、薬剤組成物は、バクテリオクロロフィルが式ＩＩＩを有するコンジュゲート、より好ましくはコンジュゲート１９を含む。
別のより好ましい実施形態では、薬剤組成物は、ＲＧＤペプチド、より好ましくは配列番号１のＲＧＤペプチドとコンジュゲートした、バクテリオクロロフィルが式ＩＩを有するコンジュゲート、より好ましくはコンジュゲート１３、１５、２３、２８、２９、３０、３１、４３、及び４４から選択されるコンジュゲート、より好ましくはコンジュゲート２４を含む。
別の実施形態では、薬剤組成物は、配列番号２〜８のうちの任意のＲＧＤペプチドとコンジュゲートした、バクテリオクロロフィルが式ＩＩを有するコンジュゲート、より好ましくはコンジュゲート１１、２６、３３、３４、３５、及び３６を含む。
別の実施形態では、薬剤組成物は、ＲＧＤペプチド模倣体とコンジュゲートした、バクテリオクロロフィルが式ＩＩを有するコンジュゲート、より好ましくはコンジュゲート４０及び４１を含む。
一実施形態では、薬剤組成物は、光線力学的治療（ＰＤＴ）、より詳細には血管標的のＰＤＴ（ＶＴＰ）で使用するためのものである。
一実施形態では、薬剤組成物は、腫瘍学、特に腫瘍のＶＴＰで使用するためのものである。任意の適切な固形腫瘍は、それだけには限定されないが、黒色腫、結腸、乳房、肺、前立腺、脳又は頭頸部の癌から選択される腫瘍の原発腫瘍及び転移がどちらも、本発明によって包含される。
別の実施形態では、薬剤組成物は、非腫瘍学的疾患において、非新生物性の組織又は器官のＶＴＰで使用するためのものである。一実施形態では、薬剤組成物は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）などの血管疾患、又は脂肪組織への血管供給を制限することでその成長を阻害することによる肥満症などの障害の治療に使用する。
また、本発明の薬剤組成物は、診断目的で、器官及び組織の可視化にも使用する。これは、血管標的のイメージング（ＶＴＩ）の方法で使用することができる。
一実施形態では、薬剤組成物は、いくつかの技術を用いた腫瘍の診断に使用する。中心金属原子を特定の技術に適応させることによって、いくつかの診断技術を本発明に従って応用することができる。
動的蛍光イメージングによる腫瘍診断では、感光剤中のＭは、２Ｈ又はＣｕ、Ｐｄ Ｇｄ、Ｐｔ、Ｚｎ、Ａｌ、Ｅｕ、Ｅｒ、Ｙｂ若しくはその同位体から選択される金属である。
放射線診断技術による腫瘍診断では、感光剤中のＭは、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９９ｍＴｃ、６７Ｇａ、２０１Ｔｌ、１９５Ｐｔ、６０Ｃｏ、１１１Ｉｎ及び５１Ｃｒから選択される放射性同位体である。一実施形態では、放射線診断技術は陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）であり、Ｍは６４Ｃｕ又は６７Ｃｕである。別の実施形態では、放射線診断技術は単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＴ）であり、Ｍは９９ｍＴｃ、６７Ｇａ、１９５Ｐｔ、１１１Ｉｎ、５１Ｃｒ及び６０Ｃｏから選択される放射性同位体である。
分子磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）による腫瘍診断では、Ｍは、Ｍｎ３＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ３＋、Ｅｕ３＋、Ｇｄ３＋及びＤｙ３＋から選択される常磁性金属であるか、又は、感光剤は多座配位子の金属キレート錯体によって置換され、金属は本明細書中で既に定義したとおりである。
また、本発明は、腫瘍の放射線療法のための薬剤組成物も提供し、Ｍは、１０３Ｐｄ、１９５Ｐｔ、１０５Ｒｈ、１０６Ｒｈ、１８８Ｒｅ、１７７Ｌｕ、１６４Ｅｒ、１１７ｍＳｎ、１５３Ｓｍ、９０Ｙ、６７Ｃｕ及び３２Ｐから選択される放射性同位体である。
本発明は、式ＩＩの新規バクテリオクロロフィルをさらに提供し、ＭはＰｄであり；Ｒ１はＣＯＯＨであり；Ｒ’２はメトキシであり；Ｒ４は、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４はメチルであり；Ｒ６は−ＮＨ−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＯＨであり、本明細書中で化合物１０として同定する。
一実施形態によれば、本発明は、（ａ）腫瘍を有することが疑われる対象に、Ｍが２Ｈであるか、又は、Ｃｕ、Ｐｄ Ｇｄ、Ｐｔ、Ｚｎ、Ａｌ、Ｅｕ、Ｅｒ、Ｙｂ若しくはその同位体から選択される金属である、本発明のＲＧＤペプチド−感光剤のコンジュゲートを投与するステップと；（ｂ）標準の手順によって対象を照射し、疑われる領域の蛍光を測定するステップであって、より高い蛍光が腫瘍部位を示すステップとを含む、動的蛍光イメージングによって腫瘍を診断する方法に関する。
別の実施形態では、本発明は、（ａ）腫瘍を有することが疑われる対象に、Ｍが６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９９ｍＴｃ、６７Ｇａ、１９５Ｐｔ、２０１Ｔｌ、６０Ｃｏ、１１１Ｉｎ又は５１Ｃｒから選択される放射性同位体である、本発明のＲＧＤペプチド−感光剤のコンジュゲートを投与するステップと；（ｂ）対象をイメージングスキャナー内で走査し、疑われる領域の放射線レベルを測定するステップであって、増強した放射線が腫瘍部位を示すステップとを含む、放射線診断技術によって腫瘍を診断する方法を提供する。好ましい実施形態では、放射線診断技術は陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）であり、Ｍは６４Ｃｕ又は６７Ｃｕである。別の好ましい実施形態では、放射線診断技術は単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＴ）であり、Ｍは９９ｍＴｃ、６７Ｇａ、１９５Ｐｔ、１１１Ｉｎ、５１Ｃｒ及び６０Ｃｏからなる群から選択される放射性同位体である。
さらなる実施形態では、本発明は、（ａ）腫瘍を有することが疑われる対象に、Ｍが常磁性金属である本発明のＲＧＤペプチド−感光剤のコンジュゲートを投与するステップと；（ｂ）前記投与の前に患者の体内の目的の標的領域の少なくとも１つのＭＲ画像、その後に１つ又は複数のＭＲ画像を作成することによって、患者を磁気共鳴画像法に供するステップとを含む、腫瘍診断のための分子磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）方法を提供する。常磁性金属は、それだけには限定されないが、Ｍｎ３＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ３＋、Ｅｕ３＋、又はＤｙ３＋、好ましくはＧｄ３＋を含めた、任意のＭＲＩに適切な金属であり得る。
好ましい一実施形態では、ＭＲＩ方法には、（ａ）対象に、Ｍが常磁性金属である本発明のＲＧＤペプチド−感光剤のコンジュゲート、好ましくは、Ｍｎ３＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ３＋、Ｅｕ３＋、又はＤｙ３＋、より好ましくはＧｄ３＋を投与するステップと；（ｂ）０時点及びその後の２番目以降の時点でＭＲ画像を作成するステップと；（ｃ）データを処理及び分析して腫瘍の存在の有無を診断するステップとが含まれる。
さらに別の実施形態では、本発明は、改良点が本発明のＲＧＤペプチド−感光剤のコンジュゲートを使用することである、感光剤を用いて蛍光イメージングによって腫瘍を診断する方法を提供する。
本発明は、改良点が本発明のＲＧＤペプチド−感光剤のコンジュゲートを使用することである、感光剤を用いてＰＥＴ又はＳＰＥＴ走査によって腫瘍を診断する方法をさらに提供する。
改良点が本発明のＲＧＤペプチド−感光剤のコンジュゲートを使用することである、感光剤を用いてＭＲＩによって腫瘍を診断する方法をさらに提供する。
本発明のＲＧＤペプチド−感光剤のコンジュゲートは血管標的のＰＤＴ（ＶＴＰ）に特に適しており、血管形成／血管新生並びに癌、糖尿病性網膜症、黄斑変性症及び関節炎などの新血管成長に関連する疾患の処置に有用である。本発明の最も好ましい一実施形態では、本発明の増感剤を用いた処置の標的は、正常及び異常血管の、本明細書中に記載の提案したＰＤＴプロトコルに対する感度の固有の差により、異常血管、特に固形腫瘍、加齢黄斑変性症、再狭窄、急性炎症又はアテローム性動脈硬化症の血管である（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ及びＬｅｖｙ、２００３）。
したがって、一実施形態では、本発明のコンジュゲートは、腫瘍学の分野において、前癌状態並びにそれだけには限定されないが、乳癌、皮膚、肺、食道及び膀胱の癌及び腫瘍から生じる黒色腫、前立腺、脳、結腸、卵巣、乳房、頭頸部、胸部壁の腫瘍などのいくつかの癌の種類を、ＰＤＴによって処置するために有用である。化合物は、原発腫瘍及び転移性腫瘍の処置に有用である。
本態様では、本発明は、（ａ）必要としている個体に、本発明によるＲＧＤペプチド−感光剤のコンジュゲートを投与するステップと；（ｂ）腫瘍の局所を照射するステップとを含む、腫瘍の光線力学的治療の方法に関する。
本発明は、必要としている個体に、Ｍが１０３Ｐｄ、１９５Ｐｔ、１０５Ｒｈ、１０６Ｒｈ、１８８Ｒｅ、１７７Ｌｕ、１６４Ｅｒ、１１７ｍＳｎ、１５３Ｓｍ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、又は３２Ｐである本発明によるＲＧＤペプチド−感光剤のコンジュゲートを投与するステップを含む、ＰＤＴを用いない腫瘍治療、即ち、腫瘍の放射線療法の方法にさらに関する。
別の実施形態では、本発明の化合物は、非腫瘍学的な領域に有用である。新生物及び腫瘍などの所望しない細胞の、ＰＤＴによる効率的な破壊以外に、本発明の化合物は、動脈硬化症、関節炎、乾癬、肥満症及び黄斑変性症の主な原因である、増殖細胞及び血管に対しても使用することができる。さらに、化合物は、良性前立腺肥大などの非悪性腫瘍の処置に使用することができる。
好ましい一実施形態では、本発明のコンジュゲートは、心血管病、主に冠動脈疾患、内膜過形成、再狭窄、及びアテローム硬化斑における血管閉塞及び血栓症を処置するために、ＰＤＴで使用することができる。より好ましい実施形態では、本発明の化合物は、冠血管の血管造影法を受けた、心血管病に罹患している個体において、ステント内再狭窄を予防又は軽減させるために使用する。別の好ましい実施形態では、本発明の化合物は、患部血管内のアテローム性溶菌斑の破壊によってアテローム性動脈硬化症を処置する方法で使用することができる。
別の好ましい実施形態では、本発明の化合物は、ざ瘡、ざ瘡瘢痕、乾癬、足白癬、疣贅、光線性角化症、及びぶどう酒様血管腫（皮膚の上層に位置する静脈を動脈と連結する小さな血管（毛細血管）の形成異常）などの皮膚科学的な疾患、障害及び状態を処置するために、ＰＤＴで使用することができる。
別の好ましい実施形態では、本発明のコムジュゲートは、角膜及び脈絡の血管新生、より好ましくは加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）などの眼の疾患、障害及び状態を処置するために、ＰＤＴで使用することができる。
ＰＤＴ処置のために投与するコンジュゲートの量は、ＰＤＴで使用されているポルフィリン、Ｃｈｌ及びＢＣｈｌ誘導体で蓄積された経験に従って、熟練した医師によって確立され、活性成分として用いる誘導体の選択、処置する状態、投与様式、患者の年齢及び状態、並びに医師の判断に応じて変動する。
照射する光の波長は、好ましくは、感光剤の最大吸光度と一致するように選択する。任意の化合物に適切な波長は、その吸収スペクトルから容易に決定することができる。好ましい実施形態では、強力な光源、より好ましくは感光剤がＢＣｈｌ誘導体である場合は７２０〜７９０ｎｍのレーザーを用いる。
本発明のコンジュゲートは、光線力学的治療において、疾患、障害又は状態を処置するために使用されている別の最新治療のアジュバントとして、それをより有効にするためにさらに使用し得る。例えば、これらは、手術と組み合わせて術中に、一部の癌種が拡大する一般的な部位である、胸膜（肺の裏層）及び腹膜（腹部の裏層）などの広い表面積上での癌の再発の予防を補助するために、再発性頭頸部癌の術中処置において、又は大腿動脈血管形成術後に再狭窄を予防するために、使用し得る。また、コンジュゲートは、術中のＰＤＴの腫瘍診断において、例えば脳腫瘍でも使用し得る。
本発明による別の可能性は、本発明のコンジュゲートを大きな固形腫瘍のＰＤＴにおいて、コンピューター断層撮影（ＣＴ）によって導かれる針を用いて光ファイバーを直接腫瘍内に送り込むことを含む技術である、組織内治療によって使用することである。これは、頭頸部腫瘍など大規模な手術を要する領域で特に有用であり得る。
投与するコンジュゲートの量及び投与経路は、疾患の種類、疾患の段階、患者の年齢及び健康状態に従って決定するが、現在使用されているＰｈｏｔｏｆｒｉｎ ＩＩ（登録商標）（約５〜４０ｍｇのＨｐＤ／体重１ｋｇ）又はＴｏｏｋａｄ（登録商標）（約２〜１０ｍｇ／体重１ｋｇ）の用量よりもはるかに低いものとなる。
本発明の薬剤組成物は、ＰＤＴで用いられている標準の手順、例えば、全身投与、特に注射による投与、より好ましくは静脈内注射によって、固形腫瘍内への直接注射によって局所的に、又は皮膚の疾患及び状態の処置には局所的に、患者に投与する。
以降、本発明を以下の非限定的な実施例によって例示する。
Ｉ 化学セクション
本明細書の実施例では、本発明の中間体及び化合物１〜１０並びにコンジュゲート（１１〜２４）を、以下の化合物リスト及び付属書に従って、その対応する太字且つ下線を引いたアラビア番号によって提示する。すべての化合物及びコンジュゲートの式は、明細書の最後、参考文献の直前の付属書中に提示する。
化合物リスト
１．バクテリオクロロフィルａ（Ｂｃｈｌ ａ）
２．１３２−ＯＨ−バクテリオクロロフィルａ（１３２−ＯＨ−Ｂｃｈｌ ａ）
３．バクテリオフェオホルビドａ（Ｂｐｈｅｉｄ ａ）
４．１３２−ＯＨ−バクテリオフェオホルビドａ（１３２−ＯＨ−Ｂｐｈｅｉｄ ａ）
４ａ．バクテリオプルプリン１８（ＢＰＰ１８）
５．クロロフィルａ（Ｃｈｌ ａ）
６．フェオホルビドａ（Ｐｈｅｉｄ ａ）
７．パラジウムバクテリオフェオホルビドａ（Ｐｄ−Ｂｐｈｅｉｄ）
８．パラジウム３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン１３１−（２−スルホエチル）アミドカリウム塩
９．マンガン（ＩＩＩ）１３２−ＯＨ−バクテリオフェオホルビドａ（Ｍｎ（ＩＩＩ）１３２−ＯＨ−Ｂｐｈｅｉｄ ａ）
１０．パラジウム３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン−１３１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）アミドカリウム塩
１１．パラジウム３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン１３１−（２−スルホエチル）アミド−１７３−（ＲＧＤ−４Ｃ）アミドカリウム塩
１２．マンガン（ＩＩＩ）１３２−ＯＨ−バクテリオフェオホルビド−１７３−（環状ＲＧＤｆＫ）アミド
１３．３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン１３１−（２−スルホエチル）アミド−１７３−（環状ＲＧＤｆＫ）アミドカリウム塩
１４．マンガン（ＩＩＩ）３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン１３１−（２−スルホエチル）アミド−１７３−（環状ＲＧＤｆＫ）アミドカリウム塩
１５．銅（ＩＩ）３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン１３１−（２−スルホエチル）アミド−１７３−（環状ＲＧＤｆＫ）アミドカリウム塩
１６．３１，３２−ジデヒドロロドクロリン１３１−（２−スルホエチル）アミド−１７３−（環状ＲＧＤｆＫ）アミドカリウム塩
１７．マンガン（ＩＩＩ）３１，３２−ジデヒドロロドクロリン１３１−（２−スルホエチル）アミド−１７３−（環状ＲＧＤｆＫ）アミドカリウム塩
１８．銅（ＩＩ）３１，３２−ジデヒドロロドクロリン１３１−（２−スルホエチル）アミド−１７３−（環状ＲＧＤｆＫ）アミドカリウム塩
１９．パラジウムバクテリオプルプリンＮ−（３−スルホプロピルアミノ）イミド−１７３−（環状ＲＧＤｆＫ）アミドカリウム塩
２０．メソ−５−（４−環状ＲＧＤｆＫ−ベンズアミド）−１０，１５，２０−トリス（４−カルボキシフェニル）ポルフィン
２１．銅（ＩＩ）メソ−５−（４−環状ＲＧＤｆＫ−ベンズアミド）−１０，１５，２０−トリス（４−カルボキシフェニル）ポルフィン
２２．ガドリニウム（ＩＩＩ）メソ−５−（４−環状ＲＧＤｆＫ−ベンズアミド）−１０，１５，２０−トリス（４−カルボキシフェニル）ポルフィン
２３．パラジウム３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン−１３１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）アミド−１７３−（環状ＲＧＤｆＫ）アミド
２４．パラジウム３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン１３１−（２−スルホエチル）アミド−１７３−（環状ＲＧＤｆＫ）アミドカリウム塩。
２５．３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン１３１−（２−スルホエチル）アミドカリウム塩。
２６．３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン１３１−（２−スルホエチル）アミド−１７３−（ＧＲＧＤＳＰ）アミドカリウム塩
２７．バクテリオフェオホルビド−１７３−（環状ＲＧＤｆＫ）アミド
２８．３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン１３１−（３−［（３−アミノプロピル）アミノ］プロピル）アミド−１７３−（環状ＲＧＤｆＫ）アミド
２９．３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン１３１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）アミド−１７３−（環状ＲＧＤｆＫ）アミド
３０．３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン１３１−（２−モルホリノ−Ｎ−エチル）アミド−１７３−（環状ＲＧＤｆＫ）アミド
３１．３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン１３１−｛３−［４−（３−アミノプロピル）−ピペラジン−１−イル］−プロピル｝アミド−１７３−（環状ＲＧＤｆＫ）アミド
３２．バクテリオフェオホルビド−１７３−（２−環状ＲＧＤＫ−アミド−Ｎ−エチル）アミド
３３．パラジウム３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン１３１−（２−スルホエチル）アミド−１７３−（ＧＲＧＤＳＰＫ）アミドカリウム塩
３４．パラジウム３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン１３１−（２−スルホエチル）アミド−１７３−［（ＧＲＧＤＳＰ）４Ｋ］アミドカリウム塩
３５．パラジウム３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン１３１−（２−スルホエチル）アミド−１７３−（環状ＲＧＤｆ−Ｎ（Ｍｅ）Ｋ）アミドカリウム塩
３６．パラジウム３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン１３１−（２−スルホエチル）−１７３−Ｎ−［４−ヘプタン二酸ビス−（環状ＲＧＤｙＫ−アミド）］アミドカリウム塩
３７．パラジウム３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン１３１，１７３−環状（２−ＲＧＤ−アミド−Ｎ−エチル）ジアミド
３８．３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン１３１，１７３−環状（２−ＲＧＤ−アミド−Ｎ−エチル）ジアミド
３９．パラジウム３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン１３１，１７３−シクロ｛３−［４−（３−アミノプロピル−ＤＧＲ−アミド）−ピペラジン−１−イル］−プロピル｝ジアミド
４０．パラジウム３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン１３１−（２−スルホエチル）アミド−１７３−［４−（メチル−５−（６−グアニジノ−ヘキサノイルアミノ）−ペンタン酸）］アミドカリウム塩
４１．パラジウム３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン１３１−（２−スルホエチル）アミド−１７３−［７−アミド−３−［［１−（４−グアニジノ−ブチリル）−ピペリジン−３−カルボニル］−アミノ］−ヘプタン酸］カリウム塩
４２．パラジウム３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン１３１−（２−スルホエチル）アミド−１７３−（環状ＲＡＤｆＫ）アミドカリウム塩
４３．３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン１３１−（３−ＤＴＰＡ−アミド−Ｎ−プロピル）アミド−１７３−（環状ＲＧＤｆＫ）アミド
４４．３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン１３１−（３−Ｇｄ−ＤＴＰＡ−アミド−Ｎ−プロピル）アミド−１７３−（環状ＲＧＤｆＫ）アミド
材料及び方法
（ｉ）バクテリオクロロフィルａ（Ｂｃｈｌ ａ）、１を、Ｓｃｈｅｒｚ及びＰａｒｓｏｎ、１９８４に記載のように得た。手順は、光合成細菌ロドブラム・サルフィドフィルム（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）の乾燥（凍結乾燥）細胞から生体色素を抽出することから開始した。粗生体色素抽出物の精製は、ＤＥＡＥ−セファロースカラムクロマトグラフィーによって、Ｏｍａｔａ及びＭｕｒａｔａ、１９８３に従って実施した。手短に述べると、ＤＥＡＥ−セファロースを蒸留水で洗浄し、その後、１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７）中に懸濁させることによって、酢酸形態に変換した。スラリーをアセトンで３回洗浄し、最後にメタノール−アセトン（１：３、ｖ：ｖ）に懸濁させて５℃で保管した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって純度を確認した。ＴＬＣ条件の詳細な説明は、Ｆｉｅｄｏｒ他、１９９２に見つけることができる。
（ｉｉ）１３２−ＯＨ−バクテリオクロロフィルａ（１３２−ＯＨ−Ｂｃｈｌ）、２は、Ｓｔｒｕｃｋ他、１９９２に記載のように、Ｂｃｈｌ ａ（１ｇ／ｍｌ）のメタノール溶液を暗所で空気と接触させて攪拌することによる、Ｂｃｈｌ ａの異質同形化によって生成した。
（ｉｉｉ）バクテリオフェオホルビド（Ｂｐｈｅｉｄ）、３及び１３２−ＯＨ−バクテリオフェオホルビド（１３２−ＯＨ−Ｂｐｈｅｉｄ）４は、Ｗａｓｉｅｌｅｗｓｋｉ及びＳｖｅｃ、１９８０に従って、対応するＢｃｈｌ ａ又は１３２−ＯＨ−Ｂｃｈｌ ａを、８０％のトリフルオロ酢酸水溶液を用いて脱メタレート化−脱エステル化することによって、合成した。合成したＢｐｈｅｉｄ又は１３２−ＯＨ−Ｂｐｈｅｉｄの精製は、シリカ（「Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０」、Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）カラムで、クロロホルム中のメタノールの勾配（０から１５／２５体積％）を溶出液として用いて実施した。
（ｉｖ）クロロフィルａ（Ｃｈｌ）、５及び（ｖ）フェオホルビドａ（Ｐｈｅｉｄ）、６。Ｃｈｌを、ラン藻スピルリナ・プラテンシス（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）から、Ｂｃｈｌを得るルーチンと同じルーチンに従って得た（上記参照）。さらに、Ｂｐｈｅｉｄについて上述した手順と同じ手順に従って、ＣｈｌをＰｈｅｉｄへと変換した。
（ｖｉ）パラジウムバクテリオフェオホルビドａ（Ｐｄ−Ｂｐｈｅｉｄ ａ）、７は、国際公開公報ＷＯ２０００／０３３８３３に記載のように合成した（この明細書の実施例２）。
（ｖｉｉ）パラジウム３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン１３１−（２−スルホエチル）アミドカリウム塩、８は、国際公開公報ＷＯ２００４／０４５４９２に記載のように合成した（実施例１、化合物４の合成）。
（ｖｉｉｉ）３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン１３１−（２−スルホエチル）アミドジカリウム塩、２５は、国際公開公報ＷＯ２００４／０４５４９２に記載のように、Ｂｐｈｅｉｄとタウリンとの反応によって合成した（実施例２、化合物５の合成）。
（ｉｘ）バクテリオプルプリン１８（ＢＰＰ１８）、４ａは、Ｍｉｒｏｎｏｖ他、１９９２に記載のように合成した。
（ｘ）樹脂、アミノ酸誘導体、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）及びベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）はＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから購入し；Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）エチレンジアミン、１，４−ビス（３−アミノプロピル）−ピペラジン、１，３−ジメチルバルビツール酸（ＤＭＢＡ）、ジエチルジチオカルバミン酸、ナトリウム塩（ＤＥＤＴＣ）、２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）、トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）、１，２−エタンジチオール（ＥＤＴ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、メソ−テトラ（４−カルボキシ−フェニル）ポルフィン、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム及び４−オキソヘプタン二酸は、Ａｌｄｒｉｃｈ（米国）から購入し；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）はＳｉｇｍａ（米国）から購入し；Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−Ｆｍｏｃ−６−アミノヘキサン酸、Ｎβ−Ｆｍｏｃ−Ｎω−Ｂｏｃ−β−Ｌ−ホモリシン、及びＮ−Ｆｍｏｃ−ピペリジン−３−カルボン酸はＦｌｕｋａ（スイス）から購入し；酢酸カドミウム、酢酸銅及び塩化マンガン（ＩＩ）はＭｅｒｃｋ（ドイツ）から購入し；テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウムはＡｃｒｏｓから入手した。
分析用グレードの化学薬品及び溶媒を一般に使用したが、ＨＰＬＣを行ったときだけは、ＨＰＬＣグレードの溶媒を適用した。
（ｘ）ペプチド合成−ペプチドを、保護したアミノ酸を用いたＦｍｏｃ化学を介した固相方法によって合成し、当分野で一般的な手順に従って環化した。Ｆｍｏｃ基の除去及びカップリングの完了は、ニンヒドリン（カイザー）試験によって監視した。ＴＦＡ又はＴＦＡ／チオアニソール／Ｈ２Ｏ／トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）のカクテル溶液を用いて、樹脂からペプチドを取り出し、同時に脱保護を行った（Ａｒｇ−ペンタメチルクロマン−６−イルスルホニル（Ｐｍｃ）又は２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）；Ａｓｐ−ＯｔＢｕ；Ｓｅｒ−ｔｅｒｔ−ブチル（ｔＢｕ）；Ｌｙｓ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）又はＤｄｅ）。
（ｉ）直鎖状ペプチドＧＲＧＤＳＰＫ、（ＧＲＧＤＳＰ）４Ｋ又はＧＲＧＤＳＰは、それぞれＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ワン（Ｗａｎｇ）樹脂又は塩化２−クロロトリチル樹脂を用いて得た。
（ｉｉ）環状ペプチド（環状ＲＧＤｆＫ）、（環状ＲＧＤｙＫ）、（環状ＲＡＤｆＫ）及び（環状ＲＧＤｆ−Ｎ（Ｍｅ）Ｋ）は、Ｈａｕｂｎｅｒ他、１９９９に記載のように、ペンタペプチドを塩化２−クロロトリチル樹脂上で合成し、続いてそれらを溶液中で環化することによって調製した。既に記載のように（Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ他、１９８３）、Ｎα−メチル保護したリシンを２−アミノヘプタン二酸から調製した。樹脂上の環化によって環状ＲＧＤｆＫを合成する別の方法は、本明細書の実施例１３に記載されている。
（ｉｉｉ）環状ペプチドＲＧＤ−４Ｃは、標準の固相合成プロトコルによるＣＤＣＲＧＤＣＦＣＧの合成、及びジスルフィド結合の自発性酸化的形成によるその環化によって調製した（Ｋｏｉｖｕｎｅｎ他、１９９５）。
（ｉｖ）環状ペプチジル−アミン環状ＲＧＤＫ−ＮＨ２をクロロトリチル樹脂上で合成した（保護：Ａｒｇ−Ｐｂｆ；Ａｓｐ−ＯｔＢｕ；Ｎε−Ｌｙｓ−Ａｌｌｏｃ）。その後、リシン残基のＮ末端のＦｍｏｃ基及びε−アミノ上のＡｌｌｏｃ保護基を切断し、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を用いて、尿素結合による２つのアミノ間の環化を１２〜１６時間行わせた。環状ペプチドを担体から切断し、カルボン酸リシンを１，２−ジアミノエタン（ＤＣＣ活性化）と反応させて、所要のペプチジルアミンが得られた。
（ｖ）シクロペプチド二量体（環状ＲＧＤｙＫ）２。Ｗａｎｕｎｕ他、２００５に従って、４−オキソヘプタン二酸を４−アミノヘプタン二酸へと変換した。その後、アミノ基をＢｏｃ保護し、カルボキシル部分をＤＭＦ中のＮＨＳ／ＤＣＣで活性化させた。ジエステルをクロロホルム−メタノールを用いたシリカカラムで精製し、その後、ＤＩＥＡを含むＤＭＦ中の環状ＲＧＤｙＫと終夜反応させた。Ｂｏｃ保護をＴＦＡ−水−ジクロロメタン（ＤＣＭ）（９０：５：５）で切断した。所望の化合物をＨＰＬＣによって精製した。
（ｖｉ）ＲＧＤペプチド模倣体（ＲＧＤ−ＰＭ１、ＲＧＤ−ＰＭ２）を国際公開公報ＷＯ９３／０９７９５に従って得た。即ち、エチル５−アミノ−４−アミノメチル）ペンタン酸（Ｖａｉｌｌａｎｃｏｕｒｔ他、２００１及びそれ中の参考文献）の１つのアミノ基を等モル量のＢｏｃ酸無水物で保護し、カルボキシル基をｔｅｒｔ−ブチルアルコールで保護した。生成物をシリカカラムで精製し、Ｎ−Ｆｍｏｃ−６−アミノヘキサン酸とカップリングさせ、次いでＦｍｏｃ脱保護を行い、３，５−ジメチルピラゾール１−カルボキサミジンナイトレート（ｐＨ９．５；５０℃）を用いてアミンをグアニジニウムへと変換した。最後に、Ｎ−Ｂｏｃ及びＯ−ｔＢｕをＴＦＡで除去し、生成物ＲＧＤ−ＰＭ１をＨＰＬＣによって精製した。ＲＤＧ−ＰＭ１の合成をスキーム３に示す。ＲＧＤ−ＰＭ２の合成には（スキーム３参照）、Ｎβ−Ｆｍｏｃ−Ｎω−Ｂｏｃ−β−Ｌ−ホモリシンをワン樹脂に付着させた。次に、Ｎ−Ｆｍｏｃ−ピペリジン−３−カルボン酸及びＮ−Ｆｍｏｃ−４−アミノ酪酸とのカップリングを、固相方法を用いて行った。グアニジニウムの形成後（上述）、生じた物質を脱保護し、ＴＦＡを用いて樹脂から取り外し、生成物ＲＧＤ−ＰＭ２をＨＰＬＣによって精製した。
（ｉｘ）ＴＬＣ：シリカプレート（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ−６０、Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）；クロロホルム−メタノール（４：１、ｖ／ｖ）。
（ｘ）金属錯体の消光係数は、中心金属濃度（金属塩を標準物質とした炎光光度法を用いる）を、特定の波長における検査した溶液の光学密度と相関させることによって決定した。
（ｘｉ）質量スペクトル。エレクトロスプレーイオン化質量スペクトル（ＥＳＩ−ＭＳ）は、プラットフォームＬＣＺ分光計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ、英国）で記録した。マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量スペクトル（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）の測定は、Ｂｒｕｋｅｒ ＲＥＦＬＥＸ飛行時間装置（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、米国）で行った。
（ｘｉｉ）様々な錯体の光学吸収（ＵＶ−ＶＩＳ）スペクトルは、Ｇｅｎｅｓｉｓ−２（Ｍｉｌｔｏｎ Ｒｏｙ、英国）、Ｖ−５７０（ＪＡＳＣＯ、日本）又はＳｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ−１６５０ＰＣ（日本）のいずれかの分光光度計で記録した。
（ｘｉｉｉ）ＨＰＬＣは、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ ｖ３．０５プログラムによって制御した、ＵＶ−９１５ダイオード−アレイ検出器を備えたＬＣ−９００装置（ＪＡＳＣＯ、日本）、又はＷａｔｅｒｓ４８６ＵＶ−ＶＩＳ調節可能吸光度検出器及びＷａｔｅｒｓ画分回収器を備えたＷａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ Ｐｒｅｐ４０００システムを用いて行った。流速は７５ｍｌ／分に設定し、調製用カラム（Ｖｙｄａｃ Ｃ１８、２１８ＴＰ１０１５５０、５０×２５０ｍｍ、１０〜１５μｍ）を用い、検出器は波長３８０ｎｍに設定し、画分回収器は６秒／画分の時間モードに設定した。ＨＰＬＣ精製に用いた溶媒は、溶媒Ａ：５０ｍＭのＨ２Ｏ中の酢酸アンモニウムの溶液；溶媒Ｂ：アセトニトリルであった。
（ｉｖｘ）ＹＭＳ−Ｐａｃｋ Ｐｒｏ Ｃ１８カラムを用いてＬＣ−ＭＳ ＡＰＩ １５０ＥＸ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ ＳＣＩＥＸ）を行った。移動相：溶媒Ａ：０．２％のＡｃＯＨ／０．１２％のＮＨ４ＯＨ／Ｈ２Ｏ；溶媒Ｂ：４．７５％のＡ／０．２％のＡｃＯＨ／アセトニトリル。流速：２００μｌ／分。勾配：２０％のＢ（０〜２分間）から９５％のＢ（２５〜３０分間）。
（実施例１）
コンジュゲート１１の合成
材料及び方法に記載のように得た化合物８を、以下のようにして、スキーム１に記載のように、環状ペプチドＲＧＤ−４Ｃと直接コンジュゲートさせた：化合物８（１０ｍｇ）を、ＮＨＳ（２０ｍｇ）と、ＤＭＳＯ（３ｍｌ）中のＥＤＣ（２０ｍｇ）の存在下で、終夜反応させた。得られた活性スクシンイミドエステル（Ｂａｕｍｉｎｇｅｒ及びＷｉｌｃｈｅｋ、１９８０）をＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ（６：１、体積）を用いたシリカカラムで精製し、乾燥させ、さらに使用するまでアルゴン下で暗所に保った。ＲＧＤ−４Ｃ（２ｍｇ、１．９７μｍｏｌ）を８００μｌのＤＭＳＯに溶かし、活性エステル（８００μｌのＤＭＳＯ及び４００μｌのＮａＨＣＯ３緩衝液、０．１Ｍ、ｐＨ８．５中に、４．８ｍｇ、５．１３μｍｏｌ）に加えた。反応混合物を室温で２４時間インキュベーションし、アルゴン下で攪拌した。得られたコンジュゲート１１を、ＨＰＬＣを用いて精製し、質量分析によって同定した（１８３７ｍ／ｚ）（図１Ａ〜１Ｃ）。収率：１８％。
（実施例２）
コンジュゲート１２の合成
化合物９の合成から開始してコンジュゲート１２を調製した。
（ｉ）化合物９の合成
材料及び方法に記載のように得た化合物４（２０ｍｇ）を、事前にアルミナＢカラム（１×５ｃｍ）に通し、アルゴン気泡を５〜１０分間通したＤＭＦ（８ｍｌ）に溶かした。酢酸カドミウム（８５ｍｇ、４に対して１０当量）を加え、反応混合物を１１０℃まで加熱した。反応の進行をスペクトルで監視した（アセトン中）。メタル化が５分以内に起こった。ＭｎＣｌ２・２Ｈ２０（５５ｍｇ、１０当量）を、反応が完了するまで攪拌しながら加えた（さらに５〜１０分以内）。無機塩を除去するために、反応溶液を蒸発させた；固形物をアセトニトリルに再度溶かし、溶液を、ブフナー漏斗上のワットマン紙を通して濾過し、蒸発させた。最後に、水に再度溶かした粗生成物のＨＰＬＣを（ＬＣ−９００装置、ＪＡＳＣＯ、日本；カラムＳ１０Ｐ−μｍ ＯＤＳ−Ａ ２５０×２０ｍｍ、ＹＭＣ、日本）、５０％のアセトニトリル水溶液を移動相として用い、８ｍｌ／分の流速で行い、純粋な生成物９が１０．５〜１３．５分で溶出され、生成物のクロリン混合物及び副産物からの完全分離がもたらされた。収率：８８％。
化合物９の構造をスペクトル（図２Ａに示した電子スペクトル参照）及び質量スペクトル（図２Ｂ、ＥＳＩ−ＭＳ、陽性モード、及びＭｎＣｌ２が存在しないことを確認するために陰性モードでも；６７９ｍ／ｚ）によって確認した。
（ｉｉ）コンジュゲート１２の合成
化合物９（１５ｍｇ）を、スルホ−ＮＨＳ（３０ｍｇ）及びＤＣＣ（２４ｍｇ）と共にＤＭＳＯに溶かし、反応混合物を室温、アルゴン雰囲気下で終夜攪拌し、蒸発させ、５ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ８．０（１．５ｍｌ）に再度溶かし、濾過した。ＤＭＳＯ（２．５ｍｌ）中の環状ＲＧＤｆＫ（３０ｍｇ）を濾液に加え、混合物をアルゴン雰囲気下で６時間攪拌し、蒸発させ、水（２ｍｌ）に再度溶かし、調製用Ｃ１８カラムのＨＰＬＣで、水中のアセトニトリルの勾配溶出、１０〜４０％、１５分間の間、流速７ｍｌ／分を用いて精製した。精製したコンジュゲート１２を減圧下で乾燥させ、施用まで−２０℃、アルゴン雰囲気下で保管した。
（実施例３）
コンジュゲート１４の合成
以下のようにして、メタレート化されていないコンジュゲート１３の合成から開始して表題化合物を調製した。
（ｉ）コンジュゲート１３の合成
上記材料及び方法に記載のように調製したＢｐｈｅｉｄ（化合物３）（４０ｍｇ）を、クロロホルム（５ｍｌ）中のＮＨＳ（８０ｍｇ）及びＤＣＣ（６０ｍｇ）を用いて、攪拌下、室温で終夜、活性化させた。得られた活性エステルを、クロロホルムを溶出液として用いたシリカカラムで精製し、その後、ＤＭＳＯ（５ｍｌ）中の環状ＲＧＤｆＫ（４０ｍｇ）と、攪拌下、アルゴン雰囲気下で終夜反応させた。その後、１Ｍのリン酸水素二カリウム（１．５ｍｌ、ｐＨを８．２に調節）に溶かしたタウリン（５０ｍｇ）を反応に加え、混合物を蒸発させ、推定上の化合物１３がもたらされた。生成物を、以前に記載されているように（Ｂｒａｎｄｉｓ他、２００５）５ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ８．０、及びメタノールの勾配溶出を用いた逆相のＨＰＬＣによって精製した。収率：５２％。
（ｉｉ）コンジュゲート１４の合成
実施例２で用いた手順を使用して、マンガンを化合物１３内に挿入した。生成物のコンジュゲート１４を、以前に記載されているように（Ｂｒａｎｄｉｓ他、２００５）、アセトニトリル及び水の勾配溶出を用いたＨＰＬＣによって精製した。
（実施例４）
コンジュゲート１５の合成
酢酸銅（２ｍｇ）の水溶液を、水中のコンジュゲート１３（３ｍｇ）（実施例３（ｉ）で調製）及びアスコルビン酸ナトリウム（２ｍｇ）の混合物に加えた。反応を分光光度法によってすぐに監視した。銅を大環状分子内に挿入した後、生成物を、ＲＰ−１８カートリッジ（Ｌｉｃｈｒｏｌｕｔ、Ｍｅｒｃｋ）で、最初に未反応の酢酸銅及びアスコルビン酸塩を洗い流すために水を用いて、その後、主化合物のコンジュゲート１５を溶出させるためにメタノールを用いて精製し、これを回収し、蒸発させた。収率：８６％。
放射性コンジュゲートの調製には、同じ手順を使用し、新しく調製した放射性同位体６４Ｃｕ又は６７Ｃｕ（ｔ１／２はそれぞれ１２．７０時間及び２．５８日間）の、酢酸塩以外の水溶液の塩を用いる。
（実施例５）
コンジュゲート１７の合成
メタレート化されていないコンジュゲート１６の調製から開始して表題化合物を調製した。
（ｉ）コンジュゲート１６の合成
Ｂｐｈｅｉｄの代わりにＰｈｅｉｄ（化合物６）を出発物質として用いて、コムジュゲート１６を実施例３（ｉ）のように調製した。
（ｉｉ）コンジュゲート１７の合成
実施例３（ｉｉ）に記載の手順に従って、上記で得られたコンジュゲート１６を出発物質として用いて、コンジュゲート１７を合成した。
（実施例６）
コンジュゲート１８の合成
上記実施例５の手順に従って、化合物１６を出発物質として用いて、表題化合物を合成した。
（実施例７）
コンジュゲート１９の合成
コンジュゲート１９の調製を、本明細書中以降、スキーム２に模式図で説明する。
クロロホルム（８ｍｌ）中のバクテリオプルプリン１８（ＢＰＰ１８）、材料及び方法に記載のように得た４ａ（２０ｍｇ）、及び酢酸パラジウム（１０ｍｇ）を、メタノール（１２ｍｌ）中のアスコルビン酸パルミトイル（２５ｍｇ）と混合した。２０分間攪拌した後、反応が完了し（監視は分光光度法によって実施した）、混合物をクロロホルム／水と共に振盪した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させ、クロロホルム−アセトン溶出を用いたシリカカラムで精製して、Ｐｄ−ＢＰＰ１８が得られた。ＵＶ−ＶＩＳスペクトル：クロロホルム中で３４２、４１４、５３４及び８１０ｎｍ。
Ｐｄ−ＢＰＰ１８（１８ｍｇ）を、ピリジン（８ｍｌ）中のヒドラジン水和物（１２μｌ）と共に３５分間攪拌し、反応混合物をクロロホルム（３０ｍｌ）及び１ＮのＨＣｌ（３０ｍｌ）中に注ぎ、さらに２時間攪拌した。その後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、プロパンスルトン（５０ｍｇ）を加え、混合物を１０分間攪拌し、蒸発させた。未反応のスルトンをスルホプロピルアミンへと変換することによって排除するために残渣をアンモニア水溶液（２８％、３ｍｌ）で３０分間処理し、混合物を再度蒸発させた。残渣を溶かすために水（３ｍｌ）を加え、生成物を、ＲＰ−１８カートリッジ（Ｌｉｃｈｒｏｌｕｔ、Ｍｅｒｃｋ）で、最初にスルホプロピルアミンを洗い流すために水を用いて、その後、主化合物を溶出させるためにメタノールを用いて精製し、したがってＰｄ−バクテリオプルプリン−Ｎ−（３−スルホプロピルアミノ）イミドが得られた（ＵＶ−ＶＩＳスペクトル：水中で３４４、４１７、５２８及び８２２ｎｍ）。
Ｐｄ−バクテリオプルプリン−Ｎ−（３−スルホプロピルアミノ）イミド（１０ｍｇ）を、終夜、ＮＨＳ（２０ｍｇ）と、ＤＭＳＯ（３ｍｌ）中のＥＤＣ（２０ｍｇ）の存在下で反応させた。得られた活性エステルを、ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ（５：１）を用いたシリカカラムで精製し、乾燥させ、さらに使用するまでアルゴン下で暗所に保った。
環状ＲＧＤｆＫ（５ｍｇ）を１ｍｌのＤＭＳＯに溶かし、１ｍｌのＤＭＳＯ中の活性錯体（５ｍｇ）に加え、反応混合物を室温で２４時間インキュベーションし、アルゴン下で攪拌した。得られたコンジュゲート１９を、ＨＰＬＣを用いて精製し、質量分析によって同定した（ＥＳＩ−ＭＳ、陽性モード、１４１５ｍ／ｚ）。
（実施例８）
コンジュゲート２１の合成
以下のようにして、コンジュゲート２０の合成から開始して表題化合物を調製した。
（ｉ）コンジュゲート２０の合成
メソ−テトラ（４−カルボキシフェニル）ポルフィン（２０ｍｇ、２５μｍｏｌ）を、ＤＭＳＯ（６ｍｌ）中のスルホ−ＮＨＳ（４ｍｇ、３６μｍｏｌ）及びＥＤＣ（６ｍｇ、３０μｍｏｌ）と混合し、室温で２４時間攪拌した。その後、環状ＲＧＤｆＫ（２０ｍｇ、３３μｍｏｌ）を加え、反応混合物をさらに２４時間攪拌し、その後、蒸発乾固し、水に再度溶かし、調製用Ｃ１８カラムのＨＰＬＣで、０．２％の酢酸中のアセトニトリルの勾配溶出、３０〜５０％、１５分間の間、流速６ｍｌ／分を用いて精製した。精製したコンジュゲート２０を減圧下で乾燥させ、−２０℃で保管した。
（ｉｉ）コンジュゲート２１の合成
コンジュゲート２０（４ｍｇ）を５０％のメタノール水溶液に溶かし、酢酸銅（２ｍｇ）及びアスコルビン酸ナトリウム（２ｍｇ）の水溶液を加えた。反応は２分間で完了した（分光光度法によって監視した）。生成物を、ＲＰ−１８カートリッジ（Ｌｉｃｈｒｏｌｕｔ、Ｍｅｒｃｋ）で、最初に未反応の酢酸銅及びアスコルビン酸塩を洗い流すために水を用いて、その後、主化合物を溶出させるためにメタノールを用いて精製し、コンジュゲート２１、これを回収し、蒸発させた（ＵＶ−ＶＩＳスペクトル：水中で４１８及び５３８ｎｍ）。
（実施例９）
コンジュゲート２２の合成
上記実施例８（ｉ）で得られたコンジュゲート２０（４ｍｇ）及びガドリニウムアセチルアセトネート（１０ｍｇ）を、既に記載されているように（Ｈｏｒｒｏｃｋｓ他、１９７８）、イミダゾール（０．３ｇ）中、２１０℃で加熱した。反応は５０分間で完了した（分光光度法によって監視した）。イミダゾールの昇華後、実施例８（ｉ）に記載のように生成物を水に再度溶かし、ＨＰＬＣで精製した。
（実施例１０）
コンジュゲート２３の合成
化合物１０の合成から開始してコンジュゲート２３を調製した。
（ｉ）化合物１０の合成
Ｐｄ−Ｂｐｈｅｉｄ ａ（化合物７）（１００ｍｇ）をＮ−メチルピロリドン（１ｍｌ）及び３−アミノ−２−プロパンジオール（４０５ｍｇ）に溶かし、溶液を３時間、室温、アルゴン雰囲気下で混合した。生成物１０を、０．２％の酢酸／アセトニトリルを用いたＹＭＣ−Ｃ１８調製用カラムを使用したＨＰＬＣで精製した。収率：８６％。分析は、酢酸アンモニウム、ｐＨ４．５／アセトニトリルを用いたＹＭＣ−Ｃ１８分析用カラムを使用したＬＣ−ＭＳで行った。ＥＳＩ−ＭＳ、陽性モード、８０５ｍ／ｚ。
（ｉｉ）コンジュゲート２３の合成
化合物１０（５０ｍｇ）、ＮＨＳ（８０ｍｇ）及びＤＣＣ（２１６ｍｇ）を乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（８ｍｌ）に溶かした。溶液を９０分間、室温、アルゴン雰囲気下で攪拌した。形成された活性エステルを、０．２％の酢酸／アセトニトリルを用いたＹＭＣ−Ｃ１８調製用カラムを使用したＨＰＬＣで精製し、酢酸アンモニウム、ｐＨ４．５／アセトニトリルを用いたＹＭＣ−Ｃ１８分析用カラムを使用したＬＣ−ＭＳで分析し、質量分析によって同定した：ＥＳＩ−ＭＳ、陽性モード、９０２ｍ／ｚ。
活性エステル（１０ｍｇ）を乾燥Ｎ−メチルピロリドン（１ｍｌ）に溶かした。環状ＲＧＤｆＫ（８ｍｇ）及びトリエチルアミン（１０μｌ）を加え、溶液を７５分間攪拌した。生成物を、０．２％の酢酸／アセトニトリルを用いたＹＭＣ−Ｃ１８調製用カラムを使用したＨＰＬＣで精製した。収率：５０％。酢酸アンモニウム、ｐＨ４．５／アセトニトリルを用いたＹＭＣ−Ｃ１８分析用カラムを使用したＬＣ−ＭＳで分析を行った：ＥＳＩ−ＭＳ、陽性モード、１３９３ｍ／ｚ。
（実施例１１）
コンジュゲート２４の合成
化合物８（１００ｍｇ）を、ＤＭＦ（５ｍｌ）中のＮＨＳ（７０ｍｇ）及びＮ−シクロヘキシルカルボジイミド−Ｎ’−メチルポリスチレン（１２０ｍｇ）で活性化させた。溶液を５０℃で１５時間攪拌し、焼結ガラスを通して濾過した。環状ＲＧＤｆＫ（１００ｍｇ）を、Ｎ−メチルモルホリン（１００μｌ）を含むＤＭＦ（５ｍｌ）に溶かし、濾液に加えた。混合物をアルゴン雰囲気下、室温で２４時間攪拌し、溶媒を真空下で蒸発させ、生成物２４を、酢酸アンモニウム、ｐＨ４．５／アセトニトリルを用いたＹＭＣ−Ｃ１８調製用カラムを使用したＨＰＬＣで精製した。収率：２３％。同じ条件下のＹＭＣ−Ｃ１８分析用カラムを用いたＬＣ−ＭＳで分析を行った。ＵＶ−ＶＩＳスペクトル（ＨＰＬＣ）：３３２、３８６、５１６、及び７５０ｎｍ。ＥＳＩ−ＭＳ、陽性モード、１４２５ｍ／ｚ。
（実施例１２）
コンジュゲート２６の合成
Ｆｍｏｃ脱保護したＧＲＧＤＳＰ樹脂（０．３５ｍｍｏｌ）に、６ｍｌのＤＭＦ中の化合物２５（５３０ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ、ＰｙＢＯＰ（どちらも０．７ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（２．１ｍｍｏｌ）の混合物を加え、反応を２時間、アルゴン雰囲気下で動揺させた。ＤＭＦ（１０×５ｍｌ）及びＤＣＭ（５×５ｍｌ）で洗浄した後、樹脂を真空下で少なくとも３時間乾燥させた。その後、ペプチドコンジュゲートを樹脂から切断し、８５：５：５：５のＴＦＡ／チオアニソール／Ｈ２Ｏ／トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）（１０ｍｌ）のカクテル溶液を１０分間、０℃で、その後、１時間、室温、Ａｒ雰囲気下で使用することによって、脱保護した（Ａｒｇ、Ｐｂｆ；Ａｓｐ、ＯｔＢｕ）。樹脂を濾過し、カクテル溶液（４ｍｌ）で洗浄し、合わせた濾液をＮ２流によってその体積の約半分まで蒸発させた。冷Ｅｔ２０（３０ｍｌ）を加えた後、暗色沈殿物が現れた。Ｅｔ２Ｏ層の遠心分離及び傾瀉、並びに冷Ｅｔ２Ｏ（２×３０ｍｌ）でさらに処理することにより、粗暗色固形物が得られ、これをＲＰ−ＨＰＬＣによってさらに精製した（２６４ｍｇ；５８％）。酢酸アンモニウム、ｐＨ４．５／アセトニトリルを用いたＹＭＣ−Ｃ１８分析用カラムを使用したＬＣ−ＭＳで分析を行った：ＥＳＩ−ＭＳ、陽性モード、１３０６ｍ／ｚ。
（実施例１３）
コンジュゲート２８〜３１の合成
以下のようにして、メタレート化されていないＢｐｈｅｉｄ−環状ＲＧＤｆＫコンジュゲート２７の合成から開始して表題化合物を調製した。
（ｉ）環状ＲＧＤｆＫの固相合成
Ｆｍｏｃ−Ｃα−アリル保護したアスパラギン酸を塩化２−クロロトリチル樹脂上に付着させた。次に、Ｆｍｏｃ化学によってグリシン、ＮＧ−Ｐｂｆアルギニン、Ｎε−Ｄｄｅリシン、及びフェニルアラニンを樹脂上に付着させて、ｆＫＲＧＤペプチジル樹脂を形成した。その後、２％−ピペリジン／ＤＭＦを用いてＮ末端のＦｍｏｃ基を除去し、アスパラギン酸残基上のＣα−アリル基を、ＤＣＭ中のテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム及び１，３−ジメチルバルビツール酸（ＤＭＢＡ）を用いて除去した。ＨＯＢｔ／ＰｙＢＯＰ及びＤＩＥＡの存在下でペプチドを環化させた。４％−ヒドラジン／ＤＭＦを用いてリシン残基のε−アミンを切断した。
（ｉｉ）コンジュゲート２７の合成
ＰｙＢＯＰ／ＨＯＢｔ（０．６ｍｍｏｌ）をカップリング剤として用い、ＤＩＥＡ（１．８ｍｍｏｌ）を基材として用いて、Ｂｐｈｅｉｄ（３、０．６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ中のｆＫＲＧＤペプチジル樹脂（０．３ｍｍｏｌ）上のε−ＮＨ２−Ｌｙｓと結合させて、コンジュゲート２７が得られた。
（ｉｉｉ）コンジュゲート２８〜３１の合成
コンジュゲート２７（０．１ｍｍｏｌ）を樹脂上で、ＤＭＦ中の表１中の適切なアミン（５〜６ｍｍｏｌ）で、室温で２時間処理した。その後、過剰のアミンを洗い流し、生成物を樹脂から切断し、ＴＦＡ含有カクテルで脱保護し、最後にＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。酢酸アンモニウム、ｐＨ４．５／アセトニトリルを用いたＹＭＣ−Ｃ１８分析用カラムを使用したＬＣ−ＭＳで分析を行った。結果を表１に示す。
表１．コンジュゲート２８〜３１の収率及びＥＳＩ−ＭＳ
Figure 2010502574
（実施例１４）
コンジュゲート３２の合成
コンジュゲート３２は、ペプチジルアミン環状ＲＧＤＫ−ＮＨ２（材料及び方法に記載のように得た）及びＢｐｈｅｉｄ ａ（３）を、ＤＭＦ溶液中、ＤＣＣの存在下でカップリングさせ、次いでＴＦＡを用いてＰｂｆ及びＯ−ｔＢｕの脱保護を行うことによって得た。生成物をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。収率：５３％。酢酸アンモニウム、ｐＨ４．５／アセトニトリルを用いたＹＭＣ−Ｃ１８分析用カラムを使用したＬＣ−ＭＳで分析を行った：ＥＳＩ−ＭＳ、陽性モード、１１３５ｍ／ｚ。
（実施例１５）
コンジュゲート３３の合成
コンジュゲート３３は、実施例１１のコンジュゲート２４について記載した方法と同様に、化合物８を直鎖状ペプチドＧＲＧＤＳＰＫ（材料及び方法に記載のように得た）とコンジュゲートさせることによって得た。収率：５５％。酢酸アンモニウム、ｐＨ４．５／アセトニトリルを用いたＹＭＣ−Ｃ１８分析用カラムを使用したＬＣ−ＭＳで分析を行った：ＥＳＩ−ＭＳ、陽性モード、１５３７ｍ／ｚ。
（実施例１６）
コンジュゲート３４の合成
コンジュゲート３４は、実施例１１のコンジュゲート２４について記載した方法と同様に、化合物８を直鎖状ペプチド（ＧＲＧＤＳＰ）４Ｋ（材料及び方法に記載のように得た）とコンジュゲートさせることによって得た。収率：４１％。酢酸アンモニウム、ｐＨ４．５／アセトニトリルを用いたＹＭＣ−Ｃ１８分析用カラムを使用したＬＣ−ＭＳで分析を行った。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、陽性モード、３２９１（Ｍ＋２Ｎａ）ｍ／ｚ。
（実施例１７）
コンジュゲート３５の合成
コンジュゲート３５は、実施例１１のコンジュゲート２４について記載した方法と同様に、化合物８を環状ＲＧＤｆ−Ｎ（Ｍｅ）Ｋ（材料及び方法に記載のように得た）とコンジュゲートさせることによって得た。収率：５８％。酢酸アンモニウム、ｐＨ４．５／アセトニトリルを用いたＹＭＣ−Ｃ１８分析用カラムを使用したＬＣ−ＭＳで分析を行った：ＥＳＩ−ＭＳ、陽性モード、１４３９ｍ／ｚ。
（実施例１８）
コンジュゲート３６の合成
コンジュゲート３６は、実施例１１のコンジュゲート２４について記載した方法と同様に、化合物８を環状二量体ペプチド（環状ＲＧＤｙＫ）２（材料及び方法に記載のように得た）とコンジュゲートさせることによって得た。収率：２７％。酢酸アンモニウム、ｐＨ４．５／アセトニトリルを用いたＹＭＣ−Ｃ１８分析用カラムを使用したＬＣ−ＭＳで分析を行った。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、陽性モード、２２４５（Ｍ＋２Ｎａ）ｍ／ｚ。
（実施例１９）
コンジュゲート３７の合成
コンジュゲート３７は、Ｐｄ−Ｂｐｈｅｉｄ（化合物７）及びペプチドＲＧＤから合成した。ペプチドは、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−ＯＨと樹脂に結合したＨ−Ａｓｐ−Ｏ−アリル残基とのカップリングによる固相手順によって調製した。
（ｉ）保護したジペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙの調製
１００ｍｌの乾燥ＤＣＭ中のＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（４．１６２ｇ；１４ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（９．７５５ｇ；５６ｍｍｏｌ）の溶液を、１０ｇの塩化２−クロロトリチル樹脂（１．４ｍｍｏｌ／ｇ）と共に１時間、室温（ｒｔ）で攪拌した。ＤＭＦ／ＤＣＭ（１：１）中の５％のピペリジン、次いでＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することによってＦｍｏｃ基を除去した。その後、ＤＭＦ（１３０ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（１８．１７ｇ；２８ｍｍｏｌ）を、ＨＯＢｔ（４．２９ｇ；２８ｍｍｏｌ）及びＤＩＣ（４．３４ｍｌ；２８ｍｍｏｌ）を用いて１５分間、室温で活性化させ、反応器に加えた。混合物を２時間、室温で攪拌した。ペプチジル樹脂を洗浄し、真空下で３時間乾燥させた。ＡｃＯＨ／２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）／ＤＣＭ（１：１：３）のカクテル溶液と共に１時間、室温で攪拌することによって、保護したジペプチドを樹脂から切断した。冷Ｅｔ２Ｏ（１ｌ）で処理した後、油性残渣が固化した。冷Ｅｔ２Ｏで濾過及び洗浄することにより、白色沈殿物（８．６４ｇ；８７．５％）が約９９％の均一性（ＨＰＬＣ）で得られた。
（ｉｉ）トリペプチドＲＧＤの合成
上記ステップ（ｉ）で得られたジペプチドへの第３のアミノ酸の付着は、塩化２−クロロトリチル樹脂（０．５ｇ；１．４ｍｍｏｌ／ｇ）を、ＤＣＭ中のＦｍｏｃ−Ａｓｐ−Ｏ−アリル（１３８．４ｍｇ；０．３５ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（２４４μｌ；１．４ｍｍｏｌ）溶液と共に、１時間、室温で攪拌して、約０．７ｍｍｏｌ／ｇの開始量を得ることによって開始した。その後、樹脂を洗浄し、上述のようにＦｍｏｃを除去した。Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−ＯＨ（３７１ｍｇ；０．５２５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（８０．４ｍｇ；０．５２５ｍｍｏｌ）及びＤＩＣ（８１μｌ；０．５２５ｍｍｏｌ）を２．５ｍｌのＤＭＦに溶かし、室温で２０分間攪拌した。生じた溶液を洗浄したＨ−Ａｓｐ−Ｏ−アリル樹脂に加え、混合物を２時間、室温で動揺させた。ペプチジル樹脂を洗浄し、Ｆｍｏｃを除去した。
（ｉｉｉ）コンジュゲート３７の合成
３ｍｌのＤＭＦ中の化合物７（２６８ｍｇ；０．３７５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（５７．４ｍｇ；０．３７５ｍｍｏｌ）及びＤＩＣ（５８μｌ；０．３７５ｍｍｏｌ）の混合物を３０分間、室温で攪拌し、上記（ｉｉ）で得られたＦｍｏｃ−脱保護したトリペプチジル樹脂のアリコート（約０．１２５ｍｍｏｌ）に加えた。混合物を２時間、室温で動揺させ、７と直鎖状トリペプチドＲＧＤとのコンジュゲートが得られた。この反応及び修飾ペプチジル樹脂を用いた続く操作のすべては、アルゴン雰囲気中、暗所で行った。洗浄後、樹脂をＤＭＦ中のエチレンジアミン（２５１μｌ；３７５ｍｍｏｌ）を用いて１時間、室温で処理し、その後、洗浄した。アリル保護基を除去するために、樹脂をＤＣＭ中の［（Ｃ６Ｈ５）３Ｐ］４Ｐｄ０（８７ｍｇ；０．０７５ｍｍｏｌ）及びＤＭＢＡ（１３７ｍｇ；０．８７５ｍｍｏｌ）の溶液と共に２時間、室温で反応させた。
樹脂上での環化は、ＤＭＦ中のＰｙＢＯＰ（１９５ｍｇ；０．３７５ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（１３１μｌ；０．７５ｍｍｏｌ）の溶液を２時間、室温で用いた、脱保護したＡｓｐ残基をエチレンジアミノ部分と結合させることによって行った。樹脂を洗浄し、真空下で３時間乾燥させた。カクテル溶液ＴＦＡ／チオアニソール／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ／ＥＤＴ（８２．５：５：５：５：２．５）を１０分間０℃で、その後、１時間、室温で使用することによって、ペプチドコンジュゲートを樹脂から切断した。冷Ｅｔ２Ｏ（２５ｍｌ）を加えた後、暗色固形物が得られた。粗生成物（９５ｍｇ）をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製して、２ｍｇの純粋な（９８％）環状ＲＧＤコンジュゲート３７が得られた。ＥＳＩ−ＭＳ１０８７（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ。
（実施例２０）
コンジュゲート３８の合成
合成は０．１７５ｍｍｏｌのスケールで、実施例１９に記載した手順と同じ手順を用いて実施したが、Ｐｄ−Ｂｐｈｅｉｄ７の代わりに化合物Ｂｐｈｅｉｄ３から開始した。粗生成物（１６０ｍｇ）をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製して、１７ｍｇの純粋な（９８％）環状ＲＧＤコンジュゲート３８が得られた。ＥＳＩ−ＭＳ９８２（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ。
（実施例２１）
コンジュゲート３９の合成
手順は実施例１９と同様であるが、Ｂｐｈｅｉｄ残基とＡｓｐ残基との間の「橋」形成にはエチレンジアミンの代わりに１，４−ビス（３−アミノプロピル）−ピペラジンを用いた。粗生成物（１５８ｍｇ）をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製して、１２．５ｍｇの純粋な（９９％）環状ＲＧＤコンジュゲート３９が得られた。ＥＳＩ−ＭＳ１１２２（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ。
（実施例２２）
コンジュゲート４０の合成
コンジュゲート４０は、コンジュゲート２４について記載した方法と類似の方法によって得たが、直鎖状ＲＧＤペプチド模倣体５−（６−グアニジノ−ヘキサノイルアミノ）−ペンタン酸（ＲＧＤ−ＰＭ１）を用いた。収率：４２％。酢酸アンモニウム、ｐＨ４．５／アセトニトリルを用いたＹＭＣ−Ｃ１８分析用カラムを使用したＬＣ−ＭＳで分析を行った：ＥＳＩ−ＭＳ、陽性モード、１１２３ｍ／ｚ。
（実施例２３）
コンジュゲート４１の合成
コンジュゲート４１は、コンジュゲート２４について記載した方法と類似の方法によって得たが、直鎖状ＲＧＤペプチド模倣体１−（４−グアニジノ−ブチリル）−ピペリジン−３−カルボニル］−アミノ］−ヘプタン酸（ＲＧＤ−ＰＭ２）を用いた。収率：６６％。酢酸アンモニウム、ｐＨ４．５／アセトニトリルを用いたＹＭＣ−Ｃ１８分析用カラムを使用したＬＣ−ＭＳで分析を行った：ＥＳＩ−ＭＳ、陽性モード、１２２０ｍ／ｚ。
（実施例２４）
コンジュゲート４２の合成
コンジュゲート４２は、実施例１１のコンジュゲート２４について記載した方法と類似の方法によって得たが、ペプチド環状ＲＡＤｆＫを用いた。収率：３０％。酢酸アンモニウム、ｐＨ４．５／アセトニトリルを用いたＹＭＣ−Ｃ１８分析用カラムを使用したＬＣ−ＭＳで分析を行った：ＥＳＩ−ＭＳ、陽性モード、１４３９ｍ／ｚ。
（実施例２５）
コンジュゲート４３の合成
実施例１３に記載のように、バクテリオフェオホルビド−１７３−（環状ＲＧＤｆＫ）アミドコンジュゲート２７の合成から開始して表題化合物を調製した。
コンジュゲート２７（０．１ｍｍｏｌ）を樹脂上で、ＤＭＦ中の１，３−プロピレンジアミン（６ｍｍｏｌ）を用いて、室温で２時間処理した。その後、過剰のアミンを洗い流し、無水ＤＭＦ（３０ｍｌ）中のＤＴＰＡ二酸無水物（０．２ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１００ｍｌ）を加えた。アルゴン雰囲気下で１時間動揺した後、蒸留水（５０ｍｌ）を加え、次いでさらに３０分間動揺した。生成物４３を樹脂から切断し、ＴＦＡ含有カクテルで脱保護し、最後にＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した（６１ｍｇ、３７％）。水／アセトニトリルを用いたＹＭＣ−Ｃ１８分析用カラムを使用したＬＣ−ＭＳ。ＥＳＩ−ＭＳで分析を行った、陰性モード、１６４３ｍ／ｚ。
（実施例２６）
コンジュゲート４４の合成
酢酸ナトリウムで緩衝した水溶液（０．１Ｎ、ｐＨ５．５）中の塩化ガドリニウム（０．１ｍｍｏｌ）を、２ｍＬのＤＭＦ中のコンジュゲート４３（６μｍｏｌ）の溶液に加えた。混合物を周囲温度で終夜、攪拌しながら置いた。金属キレートの形成をＬＣ−ＭＳによって確認した（１７９９ｍ／ｚ）。反応混合物を蒸発させ、生成物を、ＲＰ−１８カートリッジ（Ｌｉｃｈｒｏｌｕｔ、Ｍｅｒｃｋ）で、最初に未反応のガドリニウム塩を洗い流すために水を用いて、その後、主化合物のコンジュゲート４４を溶出させるためにメタノールを用いて精製し、これを回収し、蒸発させた（８ｍｇ、７３％）。
ＩＩ．生物学セクション
材料及び方法
（ｉ）Ｅｕで標識したＲＧＤ−４Ｃ。ＲＧＤ−４Ｃ（１０μｌのＤＤＷ中に２０ｎｍｏｌ）を、イソチオシアナトフェニル−ＤＴＰＡ−Ｅｕ（１５０ｎｍｏｌ、５０μｌ）を含む１００μｌのＫ−リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．５）に加えた。混合物を終夜、室温で、常に攪拌しながらインキュベーションした。反応を停止させるために、１μｌのトリス−Ｃｌ（１Ｍ、ｐＨ７．５）を加え、混合物を５分間攪拌し、その後、Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃ−１８カートリッジに載せ、遊離Ｅｕを溶出させるためにＤＤＷで洗浄した。その後、カラムを５０％のエタノール水溶液で洗浄し、画分（２５０〜５００μｌ）を回収し、その蛍光を測定した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究
（ｉｉ）細胞培養。マウス胚性心臓内皮細胞（Ｈ５Ｖ）の単層を、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのグルタミン、０．０６ｍｇ／ｍｌのペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２中、３７℃、８％のＣＯ２で培養した。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、２０％の熱失活ＦＣＳ（５６℃、３０分間）、２ｍＭのグルタミン、５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン、２５μｇ／ｍｌの内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）、５ＩＵ／ｍｌのヘパリンを含むＭ１９９培地（グルタミン及びアール塩を含む）中、３７℃、５％のＣＯ２で維持した。Ｈ５Ｖ細胞は、マリオネグリ薬理学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ Ｍａｒｉｏ Ｎｅｇｒｉ）、Ｍｉｌａｎ、イタリアのＡｎｎｕｎｃｉａｔａ Ｖｅｃｃｉ博士からご提供いただいた。ＨＵＶＥＣ細胞は、ランバム病院（Ｒａｍｂａｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）、Ｈａｉｆａ、イスラエルから入手した。
（ｉｉｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養実験のための、増感剤、ペプチド及びそのコンジュゲートの可溶化。水溶性化合物８及びコンジュゲート１１を、それぞれの実験について記載したように、使用前に、培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）又は培地中に１０％のＦＣＳ又は培地中に１０μＭのＢＳＡ又はＰＢＳに溶かした。非水溶性化合物（ＲＧＤ−４Ｃ、環状ＲＧＤｆＫ、化合物１０及びコンジュゲート２３）は、使用前に１００％のＤＭＳＯに溶かし、培地又はＰＢＳで２％ｖ／ｖの最終ＤＭＳＯ濃度まで希釈した。化合物２４は、使用前に１００％のＤＭＳＯに溶かし、生理食塩水で５％ｖ／ｖの最終ＤＭＳＯ濃度まで希釈した。
（ｉｖ）光源。ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究用の光源は、高域フィルター（λ＞６５０ｎｍ、Ｓａｆｅｌｉｇｈｔフィルター１Ａ Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．、ニューヨーク中Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、米国）及び４ｃｍの水フィルターを備えた、自家製の１００Ｗハロゲンランプであった。ランプを用いて、培養プレートを下から室温、暗室内で照射（２０ｍＷ／ｃｍ２／１０分間（１２Ｊ／ｃｍ２））した。
（ｖ）ＲＧＤペプチド−感光剤のコンジュゲートの光毒性アッセイ。標準の条件下におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでの生体色素の光線力学的有効性を決定するために、細胞を９６ウェルプレート内で培養し、示した実験プロトコルに従って、０〜２５μＭのコンジュゲートした又はコンジュゲートしていない感光剤と共に、様々な培地条件下（培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２；培地中に１０％のＦＣＳ又は培地中に１０μＭのＢＳＡ）、過剰の遊離ペプチド（１ｍＭまで１００倍）を存在させずに又は存在させて、１５又は９０分間、３７℃又は４℃でプレインキュベーションした。細胞を洗浄し、照射した（２０ｍＷ／ｃｍ２、１０分間）。プレートを培養インキュベーター内に２４時間戻した。細胞の生存は、ニュートラルレッド細胞生存度アッセイを用いて決定した。細胞の生存は、未処置の対照中に蓄積された色素の割合として計算した。３つ組の決定を実施し、代表的な実験を示した。３種類の対照を用いた：（ｉ）明対照：生体色素を存在させずに照射した細胞；（ｉｉ）暗対照：生体色素で処置したが暗所に保った細胞；及び（ｉｉｉ）暗所に保った未処置の細胞。
（ｖｉ）ニュートラルレッド細胞生存度アッセイ。光感作及び２４時間のインキュベーション期間（３７℃）後、細胞の生存は、ニュートラルレッド（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）の蓄積によって決定した。アッセイブランクを減算した後、純光学密度（５７０ｎｍ）を３つ組の決定の平均値として計算した。細胞の生存は、未処置の対照中に蓄積された色素の割合として計算した。
（ｖｉｉ）細胞剥離（円形化）アッセイ：Ｈ５Ｖ細胞を３ｃｍの皿中で２４〜４８時間、単層として培養し、１００μＭのＲＧＤ−４Ｃと共に４℃又は３７℃で１時間、さらにインキュベーションした。細胞を１回洗浄し、３時間、新鮮な培地中、３７℃で再度インキュベーションした。同様に、ＨＵＶＥＣを、ゼラチンでプレコーティングした６ウェルプレート中で４８時間、単層として培養し、１００μＭのＲＧＤ−４Ｃと共に３７℃で１時間インキュベーションした。細胞を１回洗浄し、２４時間、新鮮な培地中、３７℃で再度インキュベーションした。光学顕微鏡観察を用いて細胞の形態学的変化を記録した。
ｉｎ ｖｉｖｏ研究
（ｖｉｉｉ）動物：雄ＣＤ１ヌードマウス（８週齢、約３０ｇ）を飼育し、食糧及び水を自由に摂取させるように、ワイツマン科学研究所（Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエルの研究機関内の動物の管理及び使用に関する委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の指針（１９９６）に従った動物施設内で取り扱った。
（ｉｘ）腫瘍モデルの異種移植、移植及び転移。培養したラットＣ６神経膠腫の細胞単層を、ゴム製ポリスマンを用いて生理食塩水下で掻爬した。ラットＣ６神経膠腫の単細胞懸濁液（２〜４×１０６個の細胞／マウス、５０μｌ）をマウスの背中に皮下（ｓ．ｃ．）移植した。グリア細胞株のＣ６は、一連の交互培養及び動物継代後に、Ｎ−ニトロソメチル尿素によって誘発させたラットグリア腫瘍からクローニングした。腫瘍は、２〜３週間以内に処置できる大きさ、即ち直径７〜９ｍｍに達した。ラットＣ６神経膠腫細胞は、ワイツマン科学研究所、Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエルのＭｉｃｈａｌ Ｎｅｅｍａｎ教授にご提供いただいた。
培養した、ルシフェラーゼで形質移入したＢＡＬＢ／ｃＣＴ２６ｌｕｃ結腸癌の細胞単層を、ゴム製ポリスマンを用いて生理食塩水下で掻爬した。ＣＴ２６ｌｕｃ（２〜４×１０６個の細胞／マウス、５０μｌ）の単細胞懸濁液をマウスの背中に皮下（ｓ．ｃ．）移植した。ＣＴ２６とは、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチルウレタン−（ＮＮＭＵ）で誘発させた、未分化の結腸癌細胞系である。これをクローニングしてＣＴ２６ＷＴと呼ばれる細胞系を作製し、これにルシフェラーゼを安定して形質導入して、致死的サブクローンＣＴ２６ｌｕｃが得られた。腫瘍は、１．５〜２週間以内に処置できる大きさ、即ち直径７〜９ｍｍに達した。ＣＴ２６ｌｕｃ細胞は、Ｄｉｎａ Ｐｒｅｉｓｅ、ワイツマン科学研究所、Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエルにご提供いただいた。
培養した、ルシフェラーゼで形質移入したＢＡＬＢ／ｃｆＣ３Ｈ ４Ｔ１ｌｕｃ乳腺腫瘍の細胞単層を、ゴム製ポリスマンを用いて生理食塩水下で掻爬した。４Ｔ１ｌｕｃ（２〜４×１０６個の細胞／マウス、５０μｌ）の単細胞懸濁液をマウスの背中に皮下（ｓ．ｃ．）移植した。４Ｔ１とは、突然変異原処理を行わずに４１０．４腫瘍から選択される６−チオグアニン耐性細胞系であり、これにルシフェラーゼを安定して形質導入して、致死的サブクローン４Ｔ１ｌｕｃが得られた（Ｓｈｉｍｒｉｔ Ｂｅｎ−Ｚａｋｅｎ、ワイツマン科学研究所、Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエルにご提供いただいた）。腫瘍は、１週間以内に処置できる大きさ、即ち直径７〜９ｍｍに達した。
培養した転移性ヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ＡＴＣＣ、米国）の単層を、ゴム製ポリスマンを用いて生理食塩水下で掻爬した。ラットヒト乳癌の単細胞懸濁液（２〜４×１０６個の細胞／マウス、５０μｌ）をマウスの背中に皮下移植した。腫瘍は、１週間以内に処置できる大きさ、即ち直径７〜９ｍｍに達した。
培養したヒトＯＶＣＡＲ−８卵巣腺癌の細胞単層（Ｍｏｒｄｅｃｈａｉ Ｌｉｓｃｏｖｉｔｚ教授、ワイツマン科学研究所、Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエルにご提供いただいた）を、ゴム製ポリスマンを用いて生理食塩水下で掻爬した。ヒトＯＶＣＡＲ−８卵巣腺癌の単細胞懸濁液（２〜４×１０６個の細胞／マウス、５０μｌ）をマウスの背中に皮下移植した。ＯＶＣＡＲ−８は、転移性疾患に罹患していない、化学療法処置した患者に由来する。腫瘍は、３〜４週間以内に処置できる大きさ、即ち直径７〜９ｍｍに達した。
培養したＭＬＳヒト癌腫の細胞単層（Ｍｉｃｈａｌ Ｎｅｅｍａｎ教授、ワイツマン科学研究所、Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエルにご提供いただいた）を、ゴム製ポリスマンを用いて生理食塩水下で掻爬した。ヒトＭＬＳ細胞の単細胞懸濁液（２〜４×１０６個の細胞／マウス、５０μｌ）をマウスの背中に皮下移植した。腫瘍は、１週間以内に処置できる大きさ、即ち直径７〜９ｍｍに達した。
鼠径部転移。生理食塩水中に回収した、培養したＣＴ２６ｌｕｃ細胞（１×１０６個の細胞／マウス、２０μｌ）を、麻酔下のマウスの後肢の遠位背側の足に皮下注射した。皮膚下に注射した際、血管を貫通していないことを確認するために、シリンジのハンドルを引いた。このようにして、腫瘍細胞の全身播種を回避した。原発腫瘍は３週間以内に６〜８ｍｍの大きさまで成長した。鼠径部内への転移は、本明細書中に記載のようにＸｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステム及び触診を用いて検査した。
肺転移モデル。生理食塩水中に回収した、培養したＣＴ２６ｌｕｃ又は４Ｔ１ｌｕｃ細胞（０．８〜１×１０６個の細胞／マウス、３００μｌ）を、麻酔下のマウスの尾部の空虚に静脈内注射した。肺への肺転移は、本明細書中に記載のように、細胞の注射の２〜３週間後に、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステムを用いて検査した。
腫瘍が直径≧１５ｍｍに達した際にマウスを屠殺した（ワイツマン科学研究所の指針に従って）。
（ｘ）麻酔：マウスは、５０μｌのケタミン（１００ｍｇ／ｍｌ；Ｒｈｏｎｅ Ｍｅｒｉｅｕｘ、Ｌｙｏｎ、フランス）及びキシラジン（２％；Ｖｉｔａｍｅｄ、Ｂｅｎｙａｍｉｎａ、イスラエル）の混合物（８５：１５、体積：体積）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射することによって麻酔した。
（ｘｉ）光源：ｉｎ ｖｉｖｏ研究用の光源は、使用する感光剤に応じて、７６３ｎｍ又は７５５ｎｍのダイオードレーザー（１Ｗ；Ｃｅｒａｍｏｐｔｅｃ、Ｂｏｎｎ、ドイツ）である。
（ｘｉｉ）動物実験のための、増感剤及びそのコンジュゲートの可溶化。水溶性コンジュゲート１１は、使用前にＰＢＳに溶かした。水に不溶性のコンジュゲート２４は、使用前に１００％のＤＭＳＯに溶かし、生理食塩水又はＰＢＳで５％ｖ／ｖの最終ＤＭＳＯ濃度まで希釈した。
（ｘｉｉｉ）Ｐｄ含有化合物の体内分布。麻酔下のマウスに様々な感光剤（生体色素）コンジュゲートを静脈内注射した（尾部静脈）（対照群：未処置）。マウスを示した時点で屠殺し、示した器官並びに組織（血液、腫瘍、腸管、肝臓、脾臓、腎臓、精巣、心臓、肺、脳、皮膚、筋肉及び脂肪）の試料を事前に秤量したバイアルに入れ、すぐに凍結し、分析するまで−２０°、暗所で保管した。試料の調製には２つの方法を使用した：（１）それぞれの試料を解凍し、ＤＤＷ（１：１０ｗ／ｖ）中でホモジナイズした。ホモジネートのアリコート（５００μｌ）をエッペンドルフ試験管内で凍結乾燥した。その後、６０μｌのＨＮＯ３（７０％、ＴｒａｃｅＳｅｌｅｃｔ、Ｆｌｕｋａ）をそれぞれの乾燥試料に加え、１時間９０℃でインキュベーションした、ＤＤＷで３ｍｌまで希釈した。（２）それぞれの試料をＨＮＯ３（７０％、ＴｒａｃｅＳｅｌｅｃｔ、Ｆｌｕｋａ）で希釈した（１：２ｗ／ｖ）。試料を３０分間、沸騰水中で超音波処理し、少なくとも４８時間、室温で静置した。その後、それぞれの試料からの１４０μｌを３．３６ｍｌのＤＤＷに加えて合計体積３．５ｍｌが得られ、１時間９０℃でインキュベーションした。Ｐｄ濃度は、ＩＣＰ−ＭＳによって決定した。
（ｘｉｖ）ＥＬＡＮ−６０００装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ＣＴ）を用いて誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）を行って、Ｐｄ濃度を決定した。
（ｘｖ）ｉｎ ｖｉｖｏ蛍光光学イメージングシステム：使用した平面蛍光光学イメージングシステムは、−１０５℃まで冷却した１インチ（２．５４ｃｍ）ＣＣＤカメラを備えたＸｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステム１００シリーズであった。視界は１５ｃｍであった。Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステムとは、ｉｎ ｖｉｖｏ（完全な生きた動物）イメージングに最適化された高感度の微光レベルシステムである。ＩＶＩＳイメージングシステムとは、モジュールソフトウェア及びハードウェアのシステムである。２つの画像を撮影した。最初の画像は白黒であり、動物の写真を提供する。２番目の画像は放出された光子データのカラーのオーバーレイであり、本例の場合は、以下に記述するように、化合物のＮＩＲ蛍光（６８０〜７２０ｎｍの励起フィルター及び７８０〜８１０ｎｍの発光フィルター）又は生物発光（５６０ｎｍ）である。高い信号対雑音比を得るために、ＣＣＤ積分時間は１０〜２０秒間であった。動的蛍光イメージは本発明のコンジュゲートを注射した直後に取得し、約２時間続けた。また、蛍光イメージを、イソフルラン麻酔下でも、コンジュゲートを最初に注射した７２時間後まで得た。注射した用量は、１４０〜２５０ｎｍｏｌ／動物で変動した。高い信号対雑音比を維持するために、ＣＣＤ積分時間は２０秒間であった。画像収集が完了した後、データの分析及び処理は、ＩＶＩＳイメージングシステム１００シリーズのハードウェアをサポートするＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ（登録商標）ソフトウェアによって行った。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ（登録商標）ソフトウェアとは、ＩＶＩＳシステムを実行し、画像表示及び分析のツールを提供する、Ｘｅｎｏｇｅｎが開発したカスタムソフトウェアパッケージである。
（ｘｖｉ）ルシフェリンアッセイ。マウスに移植したＣＴ２６ｌｕｃ及び４Ｔ１ｌｕｃ腫瘍細胞の局在化及び生存度をｉｎ ｖｉｖｏ生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって正確に評価した。本発明よれば、ＢＬＩはレポーターの酵素ホタルルシフェラーゼの発光特性に依存し、これは、その基質Ｄ−ルシフェリンのオキシルシフェリンへの変換を触媒し、光子の発光をもたらす。ルシフェリンとは、様々な生物発光生物の細胞中に見つかる化学物質である。ルシフェリンがルシフェラーゼ及びＡＴＰの触媒効果で酸化された際、青色がかった緑色の光が生じる。ホタルルシフェリンは、その発光スペクトルの特性により、ｉｎ ｖｉｖｏ生物光子イメージングにおける特に良好なレポーターである。ホタルルシフェラーゼの発光ピーク（５６０ｎｍ）は可視光のスペクトル範囲内に含まれ、ＩＶＩＳシステムなどの微光イメージングシステムで検出及び定量することができる。イメージングの前に、マウスにＤ−ルシフェリンを腹腔内注射した（全身イメージングには５５ｍｇ／体重１ｋｇ；肺及びリンパ節の転移のイメージングには７７ｍｇ／体重１ｋｇ）。Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステム１００シリーズを用いてｉｎ ｖｉｖｏ画像を取得し、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ（登録商標）２．５ソフトウェアを用いて分析した。ルシフェリンはいくつかの方法で使用することができる。これは、ｉｎ ｖｉｖｏでの光の生成を監視するために使用することができ、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステムを用いて監視することができる。
（ｘｖｉｉ）ＰＤＴプロトコル。様々な腫瘍異種移植を保有するＣＤ−１ヌード雄マウスに麻酔し、２４（５〜２４ｍｇ／体重１ｋｇ）又は８（９ｍｇ／体重１ｋｇ）を尾部静脈から静脈内注射した。腫瘍を、３．５、６、８、１２及び２４時間後に、５〜３０分間、３０〜３６０Ｊ／ｃｍ２の光用量で経皮的に照射した。照射の強度：１００〜２００ｍＷ／ｃｍ２。処置後、マウスをケージに戻した。処置後９０日間の間腫瘍を有さなかった場合にマウスは治癒したとみなされた。腫瘍の直径が１５ｍｍに達した際にマウスを安楽死させた。使用した対照は以下のとおりであった：（１）暗対照、マウスに生体色素を静脈内注射し、照射しなかった；（２）明対照、生体色素を注射せずにマウスを照射した；（３）未処置の対照；（４）化合物８単独：マウスに８を静脈内注射し、示した時点後に照射した。（５）８及び環状ＲＧＤｆＫの混合物：マウスに８及び環状ＲＧＤｆＫの混合物を静脈内注射し、示した時点後に照射した。（６）環状ＲＧＤｆＫ単独：マウスに環状ＲＧＤｆＫを静脈内注射し、示した時点後に照射した。画像はＰＤＴ後の示した時点で撮影した。
（ｘｖｉｉｉ）ＭＲＩ測定。腫瘍の位置を見つけるために、造影剤を投与する前に慣用のスピンエコー画像を取得した。９を注射する前並びにその２、５、１０、２０及び３０分間後にＩＲスナップ画像を得た。ＩＲスナップイメージングに用いたパラメータは、ＴＲ／ＴＥ＝９．２／２．７ミリ秒、視界（ＦＯＶ）＝５ｃｍ、実験の数（ＮＥＸ）＝１、画像マトリックス＝１２８×１２８、切片の厚さ２ｍｍ、及び１０°のフリップ角。０．０５秒、０．２５秒、０．４秒、１．８秒、２．５秒、３．６秒、及び５秒の反転時間を用いた一連の７つの画像をＴ１評価に用いた。
（実施例２６）
環状ペプチドＲＧＤ−４Ｃの結合パラメータ及び生物活性の評価
環状ノナペプチドＲＧＤ−４Ｃの結合パラメータ及び生物活性を、それが血管感光剤の標的化に適切であるかどうかを試験するために特徴づけた。
ＲＧＤ−４Ｃ結合活性の特徴づけ
（ｉ）Ｅｕで標識したＲＧＤ−４Ｃの調製。Ｅｕで標識したＲＧＤ−４Ｃを用いた時間分解発光分光分析を使用して内皮細胞上に発現されるαｖβ３インテグリン受容体の結合パラメータ特徴（親和性、特異性及び受容体／細胞の数）を決定した。この目的で、材料及び方法に記載のようにイソチオシアナトフェニル−ＤＴＰＡ−Ｅｕを直接コンジュゲートさせることによって、ＲＧＤ−４ＣをＥｕで標識した。Ｅｕ−ＲＧＤ−４Ｃの遊離イソチオシアナトフェニル−ＤＴＰＡ−Ｅｕからの分離は、Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃ−１８を用いて実施した。材料及び方法に記載のように、カラムを５０％のエタノール水溶液で洗浄し、画分を回収し、その蛍光を測定した。１００％のエタノールでさらに洗浄することでは、どのような顕著な量のＥｕ含有物質もカラムに保持されていたことが示されなかった。最終生成物のＥｕ−ＲＧＤ−４Ｃは、単一ピークとして定量的に溶出され（図３Ａ）、これは質量スペクトル分析によって確認した（１４９９ｍ／ｚ）（図３Ｂ）。
（ｉｉ）αｖβ３インテグリン受容体結合アッセイ。Ｅｕ−ＲＧＤ−４Ｃとインテグリン受容体との結合活性は、培養中のマウスＨ５Ｖ内皮細胞を用いて決定した。結合アッセイには、Ｈ５Ｖ細胞を４８ウェルプレート（１０５／ウェル）に蒔いて４８時間置いた。プレートを４℃でインキュベーションし（受容体のエンドサイトーシスを阻害するため）、氷冷結合緩衝液（ＤＭＥＭ：Ｆ−１２中の０．１％のＢＳＡ）で１回洗浄し、１μＭのＲＧＤ−４Ｃを存在させずに（全結合）又は存在させて（非特異的結合）、２時間、漸増する濃度のＥｕ−ＲＧＤ−４Ｃと共にインキュベーションした。氷冷結合緩衝液で３回洗浄することによってインキュベーションを停止し、細胞を溶解してキレート化したＥｕを放出させるために増強溶液を加えた（３００μｌ／ウェル）。それぞれのウェルから試料（２００μｌ）を採り、時間分解蛍光光度法を用いて蛍光を決定した。それぞれの濃度について合計値から非特異的結合を減算することによって、純特異的結合を計算した。加えたリガンドの合計に対する非特異的結合の割合は、４．９％±２．４％（平均±ＳＤ）であった。全結合対非特異的結合の比は、低リガンド濃度での約１から最高濃度での約４まで増加した。代表的な実験について、結合の結果及びスキャッチャード分析をそれぞれ図４及び図５に示す。
リガンドの結合パラメータの値をスキャッチャード分析から計算した：（１／Ｋｄ＝Ｋａ、試験した化合物の親和性）及びＢｍａｘ（結合部位の最大数）はそれぞれ３７．２〜４１．３ｎＭ及び４．３〜７．７ｎＭ（１００〜１８０万個の受容体／細胞）であった。したがって、Ｅｕ−ＲＧＤ−４ＣはＨ５Ｖ内皮細胞と特異的に結合する。５これらの結果は、ＲＧＤ−４Ｃがαｖβ３インテグリン受容体の強力なリガンドである（〜１００ｎＭの親和定数）という他者の報告を裏づけている。αｖβ３インテグリン受容体に対する特異的結合は、以下のような単離したαｖβ３の結合アッセイを用いてさらに実証した。
（ｉｉｉ）固相受容体アッセイ。時間分解蛍光光度法を用いて、Ｅｕ−ＲＧＤ−４Ｃと単離したαｖβ３インテグリン受容体との結合を決定した。マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｂ）のそれぞれのウェルを、５０μｌの精製した受容体（ＰＢＳ中に１μｇ／ｍｌ）で、４℃で終夜振盪することによってコーティングした。その後、受容体溶液を除去し、それぞれのウェルを２００μｌの乳（１％ｗ／ｖのＰＢＳ中の粉乳、１時間、室温）でブロッキングした。その後、プレートを２００μｌのＰＢＳで１回洗浄し、一定量のＥｕ−ＲＧＤ−４Ｃ（１０００万Ｆ．Ｕ．／ウェル）を存在させて、漸増する濃度のＲＧＤ−４Ｃと共に、１時間３７℃でインキュベーションした。リガンド／競合相手の溶液を除去し、それぞれのウェルを２００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。キレート化したＥｕを放出させるために増強溶液を加えた（２００μｌ／ウェル）。それぞれのウェルから試料（１００μｌ）を採り、時間分解蛍光光度法を用いて蛍光を決定した（図６）。これらの実験条件下では、１００μＭのＲＧＤ−４Ｃは、Ｅｕ−ＲＧＤ−４Ｃと単離した受容体との結合を５０％低下させた。この値は、最も高いＲＧＤ−４Ｃ濃度においてでも、Ｅｕ−ＲＧＤ−４Ｃ結合の最も高い弱毒化を表している。
ＲＧＤ−４Ｃの生物活性の特徴づけ
ＲＧＤ−４Ｃ結合の生物学的効果を、材料及び方法に記載の細胞円形化アッセイを用いて、Ｈ５Ｖ細胞及びヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）において特徴づけた。光学顕微鏡観察を用いて細胞の形態学的変化を記録した。図７Ｂに見られるように、１００μＭの濃度のＲＧＤ−４Ｃにより、皿から９９％のＨ５Ｖ内皮細胞の剥離（ｎ＝２００）が誘発され、一方で、ＲＧＤ−４Ｃが存在しない場合には５％の円形化細胞しか観察されなかった（図７Ａ参照）。新鮮な培地を用いて３時間、再度インキュベーションした後に細胞が回復したので、この効果は可逆的であった（以前にＲＧＤ−４Ｃが存在していた場合の皿中に８％の円形化細胞と、ＲＧＤ−４Ｃが存在しない場合の６％）。
Ｈ５Ｖ細胞と同様に、新鮮な培地を用いて２４時間、再度インキュベーションすることによって細胞が回復したので１００μＭのＲＧＤ−４Ｃにより、可逆的な形でＨＵＶＥＣの皿からの剥離が誘発された（図８：上パネルは、漸増する濃度のＲＧＤ−４Ｃ（０〜２００μＭ）の存在下におけるＨＵＶＥＣ細胞の剥離を示し、下パネルは、培地を新鮮なものに交換した２４時間後の細胞の回復を示す）。
したがって、十分に洗浄し、続いて試験した内皮細胞を３時間（Ｈ５Ｖ）又は２４時間（ＨＵＶＥＣ）培養物中に維持することによってＲＧＤ−４Ｃを除去することで、その接着能力の完全な回復がもたらされるので、ＲＧＤ−４Ｃの効果は可逆的なものである。
（実施例２７）
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのコンジュゲート２４の結合、細胞の取り込み及び局在化
ＲＧＤ−ＢＣｈｌコンジュゲートの結合パターンは、その作用機構を理解するために非常に重要である。コンジュゲート２４は検出可能なＮＩＲ蛍光を提示し、蛍光顕微鏡観察を用いてその細胞結合及び局在化をｉｎ ｖｉｔｒｏで決定した。培養したＨ５Ｖ内皮細胞を、２５μＭの２４と共に、１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で、２時間３７℃でインキュベーションした。その後、細胞培養物を洗浄し、ＰＢＳ＋＋を加えた。カスタム作製した蛍光顕微鏡を用いて、２４を５２０ｎｍで励起させ、放出された蛍光を７８０ｎｍで検出した。
図９に示すように、コンジュゲート２４は内皮細胞内に浸透し、核の周りに顆粒様構造で濃縮された。
比較する目的で、コンジュゲートしていない化合物８の細胞取り込みを測定した。培養したＨ５Ｖ細胞を、１０％のＦＣＳ又は７５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で、２０分間又は２時間、３７℃で、２５μＭの２４又は８と共にインキュベーションした。その後、細胞培養物を洗浄し、ＰＢＳ＋＋を加えた。励起を５２０ｎｍで実施し、放出された蛍光を７８０ｎｍで検出した。図１０は、コンジュゲートの細胞取り込みが化合物８よりも速かったことを実証している。
とりわけ、高い血清濃度（７５％対１０％のＦＣＳ）はコンジュゲート２４の細胞取り込みを弱めている。本発明者らのグループが行った定量的な構造機能関係性の研究は、血清タンパク質との相互作用における感光剤の構造の役割を重視している。これらの研究は、処置した細胞内に入る及びそれから出る化合物８の輸送において血清アルブミンが能動的に関与していることを示唆している。さらに、８の細胞取り込み、クリアランス及び光毒性は、連続的な、受容体に媒介される取り込み及び分泌を受けるＢＳＡ分子によって媒介されている。コンジュゲート２４に関しては、バクテリオクロロフィル部分の血清アルブミンに対する親和性は、インテグリン受容体αｖβ３に対するコンジュゲートの生体利用度を改変する。このことは、高い血清タンパク質濃度の存在下において観察される細胞蓄積の低下を説明することができる（図１０）。試験したそれぞれの時点において化合物８よりもコンジュゲート２４のｉｎ ｖｉｔｒｏ蓄積が高いことは、コンジュゲートしていない８のように、ＲＧＤコンジュゲートが、インテグリン受容体に媒介されるエンドサイトーシス又は／及び非特異的エンドサイトーシスによって細胞に入ることができることによって説明することができる。
（実施例２８）
コンジュゲート２４及び化合物８のｉｎ ｖｉｖｏ体内分布
本発明のコンジュゲートは、潜在的な薬物担体である。したがって、そのｉｎ ｖｉｖｏ体内分布は重要である。標的組織中のコンジュゲートのレベルを定量化するために、イオン結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）を用いて標的器官中の中心Ｍ原子（例えば、Ｐｄ、Ｃｕ）を追跡した。中心金属原子の安定結合は、標的器官中の化合物の時間依存性の濃度を監視及び正確に決定することを可能にする。コンジュゲート２４及び化合物８の体内分布を、材料及び方法に記載のように、試料調製の方法（２）を用いて、ラットＣ６神経膠腫の腫瘍異種移植を有するＣＤ１−ヌード雄マウスにおいて決定した。マウスＣＴ２６ｌｕｃ結腸癌の腫瘍移植片を保有するＣＤ１−ヌード雄マウス及び４Ｔ１ｌｕｃ乳腺癌のマウスの腫瘍移植片を保有するＣＤ１−ヌード雄マウスにおいても、２４の体内分布を決定した。
図１１Ａ〜１１Ｄに示す結果は、注射の８時間後までの様々な腫瘍組織中のコンジュゲート２４の蓄積、及び血液中のコンジュゲートレベルの連続的な低下を示す。さらに、２４の体内分布パターンは、腫瘍源（ラットＣ６神経膠腫（図１１Ａ）、マウスＣＴ２６ｌｕｃ結腸癌（図１１Ｂ）、及びマウス４Ｔ１乳癌（図１１Ｃ）とは独立しているように見える。
ラットＣ６神経膠腫の腫瘍異種移植を有するＣＤ１ヌードマウスに注射した化合物８の体内分布は、図１２に示すように、完全に異なる画像を表した。化合物８は対象から急速に除去され、どの時点でも腫瘍組織中の選択的な蓄積又は保持を示さなかった。腫瘍組織中のコンジュゲート２４の蓄積は、化合物８とは対照的に最大値が注射の８時間後であり（図１２）、潜在的な薬物担体２４を薬物の標的化の目的として用いることができ、腫瘍及び血管形成のイメージングに適用できることを示している。
さらに、腫瘍組織内の蓄積されたコンジュゲートの濃度はμＭレベルに達したが、一方で、他の金属キレート剤とコンジュゲートさせた標識した環状ＲＧＤｆＫ及び環状ＲＧＤｆＫは、ｎＭ範囲の濃度にしか達しなかったことが他のグループによって報告されていることに、注目されたい（Ｈａｕｂｎｅｒ他、２００１；Ｊａｎｓｓｅｎ他、２００２ａ；Ｊａｎｓｓｅｎ他、２００２ｂ；Ｔｅｍｍｉｎｇ、２００５）。これらの報告された結果は、コンジュゲートしたペプチドが急速に腫瘍に取り込まれ、最大ピーク濃度がコンジュゲートの構造に応じて注射の３０分後、１時間後又は２時間後であったことを実証している。したがって、Ｍ−Ｂｃｈｌ誘導体単独又は他のキレート剤とコンジュゲートさせたＧＲＤ含有ペプチドのどちらも比較して顕著に増加している本発明のコンジュゲートの腫瘍の取り込みは、ＲＧＤ含有ペプチドとＢＣｈｌ部分とのコンジュゲーションに寄与している可能性がある。
腫瘍組織及び血液中の２４の相対レベルを図１１Ｄに例示し、注射の８時間後にコンジュゲートは腫瘍において最大濃度に達したが、注射の２４時間後に、血液及び周辺の正常組織と比較した腫瘍中のその濃度は、選択的血管標的のイメージング（ＶＴＩ）及び場合によっては血管標的のＰＤＴ（ＶＴＰ）が可能となるほど依然として十分に高いことが示されている。
他の器官と比較した腫瘍組織中のコンジュゲートの濃度は、細胞がαｖβ３インテグリンを発現しないことが知られている腫瘍（例えばＣＴ２６ｌｕｃ）中で顕著に低いことに注目されたい。したがって、αｖβ３陰性腫瘍において観察された蓄積は、その血管取り込みによるものである可能性が高い。
（実施例２９）
コンジュゲート１５のｉｎ ｖｉｖｏ体内分布
Ｃｕ−コンジュゲート１５の体内分布を、６〜８週齢の、２０〜２３ｇの重さ且つ６〜９ｍｍ３の乳房組織から得たヒト腺癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）の腫瘍を保有する雌ＣＤ−１ヌードマウスで決定した。コンジュゲート（５％のＤＭＳＯ／ＰＢＳ中の３０ｍｇ／ｍｌ）を尾部静脈に注射し、選択した時点で動物を屠殺した。Ｃｕ濃度は、材料及び方法に記載のようにＩＣＰ−ＭＳによって決定した。時間０を減算した後のＩＣＰ−ＭＳの結果を図１３に示す。
得られたデータは、腫瘍中の１５の明らかな蓄積を示し、ピークは、注射の８〜１２時間後に周辺の正常組織と比較して約３倍の強度であった。
（実施例３０）
コンジュゲート４２のｉｎ ｖｉｖｏ体内分布
ＲＧＤ／インテグリンの認識の実際の役割を評価するために、ペプチド中のグリシンをアラニンで置き換えたコンジュゲート４２の体内分布を測定し、コンジュゲート２４の体内分布と比較した。１つのアミノ酸のみを置換することが、インテグリンの認識を妨害することは、他者によって実証されている（Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ及びＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９８７）。主に、ＲＡＤ又はＲＧＥペプチドをこの目的で使用した。体内分布アッセイは、上記実施例２６に記載のように、マウスＣＴ２６ｌｕｃ結腸癌細胞の腫瘍移植片を有するＣＤ１ヌード雄マウスを用いて行い、Ｐｄ濃度は、ＩＣＰ−ＭＳによって決定した。ＩＣＰ−ＭＳの結果を図１４Ａに示す。
コンジュゲート２４及びコンジュゲート４２の体内分布の比較（図１４Ｂ）により、腫瘍組織中のＲＧＤコンジュゲートの取り込みはＲＡＤコンジュゲートよりも速く、２４時間まではより高い度合であったことが実証された。コンジュゲート２４は、注射の８時間後に最大ピーク濃度で腫瘍組織中に蓄積され、血液中のコンジュゲートレベルは連続的に低下したが、一方で、注射の８時間後における腫瘍組織及び血液の４２の濃度はほとんど同じであった。重要なことに、非特異的結合により、どちらのコンジュゲートも投与後に持続した基底レベルを示した。しかし、腫瘍部位中のＲＧＤコンジュゲートの蓄積はＲＡＤコンジュゲートと比較して２倍であった。
（実施例３１）
コンジュゲート２４又は化合物８を用いた処置後の、ラットＣ６神経膠腫異種移植を保有するマウスのｉｎ ｖｉｖｏ蛍光イメージング
動的蛍光イメージを、ラットＣ６神経膠腫異種移植を保有するＣＤ−１ヌード雄マウスから得た。蛍光イメージは、材料及び方法に記載のようにＩＶＩＳシステムを用いて得た。注射した感光剤（化合物８又はコンジュゲート２４）のクリアランスは、蛍光イメージングによってマウスで測定し、図１５に実証した。右後肢の後側にラットＣ６神経膠腫異種移植を保有するマウスに、２００ｎｍｏｌ用量のコンジュゲート８（上の画像のマウス）又は２００ｎｍｏｌ用量の２４（下の画像のマウス）を注射し、画像は注射後４、２４、４８及び７２時間に撮影した。
肝臓及び脾臓からの残留蛍光を除いては、化合物８で処置した動物において、注射の４時間後より後の時間では特異的なシグナルは見られず、これは、ＩＣＰ−ＭＳデータと一致している（図１２）。コンジュゲート２４は、腫瘍、脾臓、肝臓及び動物の頭部の下の脂肪こぶ中に蓄積すると考えられる。これらのイメージングの結果をＩＣＰ−ＭＳの結果と組み合わせると、イメージング及び恐らくはＶＴＰによる腫瘍の処置の最良の時間窓は、薬物を投与した８〜２４時間後であることが示唆される。
（実施例３２）
コンジュゲート２４を用いた処置後の、ルシフェラーゼで形質移入したマウスＣＴ２６ｌｕｃ結腸癌移植片を保有するマウスの動的蛍光イメージング
ルシフェラーゼで形質移入した細胞系は、生きている場合はルシフェリンの存在下で可視光を生じる。ルシフェリン発光により、生腫瘍細胞を監視することが可能となり、したがって、コンジュゲートの腫瘍部位でのホーミング、そのイメージング能力及びＶＴＰの有効性を確証する手段が提供される。
ルシフェリン生物発光によるコンジュゲートの励起の仮定的な可能性を回避するために、蛍光イメージを記録し、その後にやっと、動物にルシフェリンを腹腔内注射し、形質移入した腫瘍細胞の生物発光を検出した。
結果は、コンジュゲート２４に由来するＮＩＲ蛍光シグナルの領域及び腫瘍細胞自体に由来する内在性生物発光シグナルの領域が完全に重なっていることを示している。
動的蛍光イメージを、ルシフェラーゼで形質移入したマウスＣＴ２６ｌｕｃ結腸癌の移植片を有するＣＤ−１ヌード雄マウスから、インテグリン受容体標的化コンジュゲート２４を静脈内注射した後に得た。図１６Ｂ〜１６Ｃは、右後肢の後側に移植片を保有するマウスの、２００ｎｍｏｌ用量のコンジュゲート２４を注射した２４時間後の蛍光及び発光イメージを示す。蛍光及び発光イメージは、材料及び方法に記載のようにＸｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステムを用いて取得した。
結果は、コンジュゲート２４に由来するＮＩＲ蛍光シグナルの領域及び腫瘍細胞自体に由来する内在性生物発光シグナルの領域が完全に重なっていることを示している。
（実施例３３）
コンジュゲート２４を用いた処置後の、ルシフェラーゼで形質移入した４Ｔ１ｌｕｃ乳腺癌移植片を保有するマウスの動的蛍光イメージング
動的蛍光イメージを、ルシフェラーゼで形質移入したマウス４Ｔ１ｌｕｃ乳腺癌の移植片を保有するＢＡＬＢ／ｃ雌マウスから、インテグリン受容体標的化コンジュゲート２４を静脈内注射した後に得た。図１７Ａ〜１７Ｃは、右後肢の後側にルシフェラーゼで形質移入した皮下のマウス４Ｔ１乳腺癌の移植片を保有する２匹の雌マウスの、２００ｎｍｏｌ用量のコンジュゲート２４を注射した２４時間後の蛍光及び発光イメージの写真を示す。蛍光及び発光イメージは、材料及び方法に記載のようにＩＶＩＳシステムを用いて得た。
結果は、コンジュゲート２４に由来するＮＩＲ蛍光シグナルの領域及び腫瘍細胞自体に由来する内在性生物発光シグナルの領域が完全に重なっていることを示している。
（実施例３４）
コンジュゲート２６を用いた処置後の、子宮癌（ＭＬＳ）を保有するマウスの動的蛍光
コンジュゲート２６（８ｍｇ／ｋｇ）を、ＭＬＳ子宮癌を保有する動物に静脈内注射した。８及び１４時間後にＩＶＩＳの画像を撮影した。図１８に示すように、コンジュゲートは８時間後には蓄積を示さなかったが、１４時間では高レベルの蛍光が腫瘍及び肝臓の領域中で観察された。
（実施例３５）
コンジュゲート２４とαｖβ３インテグリン受容体とのｉｎ ｖｉｖｏ結合特異性の蛍光イメージングによる実証
特異的結合とは、コンジュゲートしていない増感剤によって阻害されるものと定義される。したがって、コンジュゲート２４のｉｎ ｖｉｖｏ結合特異性を実証するために、同じ結合部位の結合に対して遊離環状ＲＧＤｆＫと競合させることによって、その蓄積を遮断する試みを実施した。１４０ｎｍｏｌのコンジュゲート２４を単独で投与した（図１９、両パネルの左側のマウス、右後肢の後側に腫瘍を有する）、又はＣ６神経膠腫異種移植を保有するマウスに過剰の「遊離」（８．５μｍｏｌ）環状ＲＧＤｆＫペプチドを注射した１時間後に１４０ｎｍｏｌのコンジュゲート２４を投与した（図１９、両パネルの右側のマウス、左後肢の後側に腫瘍を有する）２４時間に蛍光イメージングを行った。同じ曝露時間の遮断した受容体異種移植の蛍光イメージを、図１９に、定性的な比較を可能にするために同じ均等カラースケールで例示する。腫瘍に由来する蛍光強度は、コンジュゲート２４を単独で投与した場合に、イメージング剤を投与する１時間前にペプチド環状ＲＧＤｆＫを投与した場合よりも高かった。正常組織では、取り込みは環状ＲＧＤｆＫを事前に投与することによって影響を受けなかった。
結果は、腫瘍領域中のコンジュゲート２４の取り込みが、（ｉ）反対側の正常組織領域よりも顕著に高かったこと；及び（ｉｉ）環状ＲＧＤｆＫを過剰量で事前に注射することによって遮断されたことを示している。総合すると、「遊離」環状ＲＧＤｆＫがコンジュゲート２４の蓄積を阻害し、また、環状ＲＧＤｆＫを過剰量で事前に投与することから生じるコンジュゲート２４の取り込みの低下が、αｖβ３受容体に対するコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏの分子特異性を確証すると、結論づけることができる。
（実施例３６）
コンジュゲート４２を用いた処置後の動的蛍光イメージング
ＲＧＤ／インテグリンのｉｎ ｖｉｖｏの認識の実際の役割を評価するために、動的蛍光イメージを、後肢の後側にＣＴ２６ｌｕｃ移植片を保有するＣＤ−１ヌード雄マウスから、コンジュゲート２４（図２０、それぞれのパネルの左側のマウス）又はペプチド中のグリシンをアラニンで置き換えたコンジュゲート４２（環状ＲＡＤｆＫ）；それぞれのパネルの右側のマウス）を投与した２４時間後に得た。腫瘍組織におけるＲＧＤコンジュゲートの蛍光シグナルは注射の３．５〜４時間後に最大に達するので、画像は注射の４時間後に撮影した。重要なことに、非特異的結合により、どちらのコンジュゲートも投与後に持続した基底レベルの蛍光を示した。しかし、腫瘍部位中のＲＧＤコンジュゲートの蛍光強度はＲＡＤコンジュゲートよりも明らかに高かった。これらの結果は、腫瘍組織中にほぼ２倍のＲＧＤコンジュゲートの蓄積を示すＩＣＰ−ＭＳ測定によって、定量的に支持されている（上記実施例３０及び図１４Ａ参照）。
ＣＴ２６ｌｕｃ細胞はαｖβ３を欠くので（但し、ある程度のαｖβ５を発現する可能性がある）（Ｙａｏ他、２００５；Ｂｏｒｚａ他、２００６）、腫瘍からの２４のより高い蛍光は、恐らく、新生内皮αｖβ３インテグリンとのそのライゲーション（ＲＧＤトリペプチドを介する）に由来する。
図２１は、ヒト卵巣腺癌ＯＶＣＡＲ−８、マウス結腸癌ＣＴ２６ｌｕｃ、ヒト上皮子宮癌ＭＬＳ、及びマウス乳腺癌４Ｔ１ｌｕｃ細胞系に由来する腫瘍を保有するＣＤ１ヌードマウスの、コンジュゲート２４を投与した２４時間後の蛍光イメージを示す。インテグリンαｖβ３は、一部の種類の固形腫瘍細胞上で発現される。上記細胞系に関しては、ＭＬＳ（Ｓｃｈｉｆｆｅｎｂａｕｅｒ他、２００２）及び４Ｔ１ｌｕｃ（Ｍｉ他、２００６）は、その細胞表面上にインテグリンαｖβ３受容体を過剰発現し、一方で、マウスＣＴ２６ｌｕｃはインテグリンαｖβ３受容体を欠くが、ある程度のαｖβ５を発現し（Ｙａｏ他、２００５；Ｂｏｒｚａ他、２００６）、ＯＶＣＡＲ−８はαｖインテグリンを欠く（Ｒｏｓｓ他、２０００）。実際、蛍光シグナルはインテグリンαｖβ３陽性細胞（ＭＬＳ及び４Ｔ１ｌｕｃ）でインテグリンαｖβ３陰性細胞（ＣＴ２６ｌｕｃ及びＯＶＣＡＲ−８）よりも顕著に高く、これは恐らく、腫瘍細胞自体中のさらなる蓄積によるものである。２つのαｖβ３陰性腫瘍（ＣＴ２６ｌｕｃ及びＯＶＣＡＲ−８）間で観察された化合物の蓄積の差異は、恐らく、（ｉ）これらはどちらもαｖβ３インテグリンを欠くので、その血管新生の差によるものであること、（ｉｉ）これらはＲＧＤ−ＢＣｈｌのコンジュゲートと特異的に結合することができるαｖβ５を発現するので、ＣＴ２６ｌｕｃ腫瘍細胞自体中のさらなる蓄積によるものである可能性があることを反映している。
（実施例３７）
肺転移の動的蛍光イメージング
肺の乳癌転移の４Ｔ１ｌｕｃモデルの検出は、コンジュゲート２４によって、ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスに注射した注射の２４時間後（１５ｍｇ／ｋｇ）に可能となった（図２２）。これらの結果は、肺の転移領域中の２４の取り込みを、蛍光によって比較的高い精度で監視できることを示している。
次に、ＣＴ２６ｌｕｃモデルの肺の転移を、２４を注射した後の時間の関数として検出した（４、９及び２４時間、１５ｍｇ／ｋｇ；図２３Ａ〜２３Ｉ）。ＣＴ２６ｌｕｃ肺転移を保有する、コンジュゲートを注射しなかったＣＤ−１ヌード雄マウス（図２３Ｇ、２３Ｈ）、及び肺転移を有さない、コンジュゲート２４を静脈内注射したＣＤ−１ヌード雄マウス（図２３Ｉ）を対照として使用した。蛍光イメージング結果により、転移領域中の２４の取り込みが周辺の正常組織領域よりも顕著に高く、最良の腫瘍対バックグラウンドの比は投与した２４時間後であったことが示された。
（実施例３８）
リンパ節転移の動的蛍光イメージング
その左脚の後側にＣＴ２６ｌｕｃ原発腫瘍を保有し、近傍のリンパ節に転移を有するＣＤ−１ヌード雄マウスの画像をとり、コンジュゲート２４（１５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射した２４時間後に写真撮影した。リンパ節中のＣＴ２６ｌｕｃ転移の検出は、コンジュゲート２４の局在化によって可能となった。白黒写真、ルシフェルンとルシフェラーゼで形質移入した腫瘍細胞との反応に由来する生物発光シグナル、及びマウスの蛍光イメージを図２４に示す。
これらの結果は、原発及び転移領域（肺、リンパ節）のどちらにおける腫瘍も、蛍光によって比較的高い精度で監視できることを示している。
（実施例３９）
化合物９を造影剤として用いた、ラットＣ６神経膠腫異種移植を保有するマウスのｉｎ ｖｉｖｏ磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）
測定は、Ｃ６神経膠腫異種移植（直径１０〜１５ｍｍ；左脇、皮下）を保有するＣＤ１ヌード雄マウス（平均重量約３０ｇ）で行った。７匹のマウスを、Ｍｎ−１３２−ＯＨ−Ｂｐｈｅｉｄ（化合物９）（１５μｍｏｌ／ｋｇ）で増強したＭＲＩに使用した。
シグナル強度比及び緩和能比の計算したグラフにより、１５μｍｏｌ／ｋｇの用量の化合物９により、腫瘍／正常の緩和能の比が０．８〜１．０から約１．４まで、物質を注射した約１０分後に増加したことが明らかとなった。９で得られた造影効果は、Ｇｄ含有造影剤について知られているものよりも高かった。
Ｇｄ剤と比較して化合物９でより高い造影が得られたこと、及びＭＲシグナルの長い組込みを可能にする、腫瘍中に対応するＭｎ含有環状ＲＧＤｆＫコンジュゲート１２の持続した滞留が予測されることを総合して、本発明者らは、本コンジュゲートを用いて、Ｇｄ−ＤＴＰＡなどの他の造影剤を超える優れたイメージングを期待する。
（実施例４０）
ｉｎ ｖｉｔｒｏの標的化した光毒性
ＲＧＤペプチド−感光剤のコンジュゲート対コンジュゲートしていない感光剤の光線力学的力価を評価するために、コンジュゲート２３及びコンジュゲートしていない感光剤１０の光毒性を、培養したＨ５Ｖ内皮細胞のＰＤＴ後の生存を監視することによって決定した。
Ｈ５Ｖ細胞を、９０分間３７℃で、０〜２５μＭのコンジュゲート２３又は化合物１０と共に、様々な培地条件でインキュベーションし、照射し、その生存を、材料及び方法に記載のようにニュートラルレッド生存度アッセイを用いて決定した。感光剤で処置した様々な条件下のＨ５Ｖ細胞の用量応答性の生存曲線を図２５Ａ〜２５Ｃに示す：培地中に１０％のＦＣＳ（図２５Ａ）、培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２（２５Ｂ）及び培地中に１０μＭのＢＳＡ（２５Ｃ）。
様々な培地中のコンジュゲート２３及び化合物１０の光毒性効果は、光及び薬物の濃度に依存性であることが見出された。ＬＤ５０値に基づいて、本発明者らは、コンジュゲート２３の光線力学的力価がコンジュゲートしていない感光剤１０よりも高いと結論づけることができる。
標的化した光毒性とは、遊離リガンドによって阻害されるものと定義することができる。したがって、さらなる実験により、コンジュゲート２３の細胞結合に対して競合する遊離環状ＲＧＤｆＫを投与することによって光毒性を遮断することを試みた。Ｈ５Ｖ細胞を、９０分間３７℃で、０〜２５μＭの化合物１０又はコンジュゲート２３と共に、様々な培地中（培地中に１０％のＦＣＳ又は培地中に１０μＭのＢＳＡ）、遊離の過剰の環状ＲＧＤｆＫを存在させずに又は存在させて（１ｍＭまで１００倍）インキュベーションした。上述のように、細胞を照射し、細胞の生存を、ニュートラルレッド生存度アッセイを用いて決定した。
処置した細胞の用量応答性の生存曲線を表す図２６Ａ〜２６Ｄに示すように、また表２に提示するＬＤ５０値によって示されるように、２３及び１０の光毒性効果は過剰の環状ＲＧＤｆＫの存在によって影響を受けなかった。
表２．過剰の遊離ペプチドが存在しない又は存在する場合の、様々な反応条件下におけるコンジュゲート２３及び化合物１０のＬＤ５０値
Figure 2010502574
これらの結果は、コンジュゲートがインテグリン非依存性液相エンドサイトーシスを介して細胞内に入り、したがって遊離環状ＲＧＤｆＫはコンジュゲートとの細胞結合に対して競合できないことを示唆している。インテグリン非依存性の細胞侵入は、コンジュゲート、感光剤部分又は環状ＲＧＤｆＫペプチドの部分のいずれかに起因することができる。インテグリン非依存性液相エンドサイトーシスによる環状ＲＧＤｆＫの内部移行が細胞表面上の機能的インテグリン受容体の数を変更させないことを示す１つの報告の文献が存在する（Ｈａｒｔ他、１９９４；Ｃａｓｔｅｌ他、２００１）。
エンドサイトーシスの説を試験するために、また、エンドサイトーシスプロセスは時間及び温度に依存性であるので、Ｈ５Ｖ細胞を、３７℃及び４℃で１５分間、０〜２０μＭのコンジュゲート２３と共に、１０％のＦＣＳを含む培地中で、過剰の環状ＲＧＤｆＫを存在させて又は存在させずに（１ｍＭまで１００倍）、インキュベーションした。細胞を照射し、その生存を上述のように決定した。処置したＨ５Ｖ細胞の用量応答性の生存曲線を図２７Ａ〜２７Ｂに示す。
３７℃又は４℃で１５分間のインキュベーションで測定されたＬＤ５０値は、細胞を３７℃で９０分間インキュベーションした際に得られた値と比較して増加した（表２）。コンジュゲート２３のＬＤ５０値は、３７℃及び４℃で１５分間のインキュベーションした後に、それぞれ３．５μＭ及び２０μＭに変化し、それと比べて、３７℃で９０分間のインキュベーションでは１μＭが得られた。温度を下げた際にＬＤ５０値が増加することは、コンジュゲートの取り込みにおけるエンドサイトーシスの役割の可能性の仮説を支持している。
予想外に、コンジュゲート２３の光細胞毒性効果は、過剰の環状ＲＧＤｆＫの存在によって遮断されないだけでなく、実際、３７℃又は４℃で１５分間のインキュベーションした２３の光線力学的活性は、遊離環状ＲＧＤｆＫが存在する場合でより高かった。過剰の遊離ペプチドが、細胞の皿からの剥離の増強及び／又は誘発されたアポトーシスシグナル伝達により、細胞がコンジュゲートのＰＤＴ効果に対してより高感度となることを引き起こしている可能性がある。
コンジュゲート２４の光毒性は、培養したＨ５Ｖ内皮細胞のＰＤＴ後の生存を監視することによって決定した。Ｈ５Ｖ細胞を、２時間３７℃で、０〜２５μＭのコンジュゲート２４と共に、１０％のＦＣＳを含む培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で、インキュベーションした。細胞を照射し、その生存を上述のように決定した。
用量応答性の生存曲線（図２８）に示すように、３７℃で２時間インキュベーションした後のＨ５Ｖ細胞に対するコンジュゲート２４の光毒性効果は、光及び薬物の濃度に依存性であることが見出された。
第３のコンジュゲート１１及び化合物８の光毒性も、Ｈ５Ｖ内皮細胞を用いて決定した。細胞を９０分間３７℃で、０〜２０μＭのコンジュゲート１１又は化合物８の存在下、培地中に１０μＭのＢＳＡ中で、インキュベーションし、照射したその生存を上述のように決定した。
用量応答性の生存曲線（図２９）に示すように、コンジュゲート１１及び化合物８の光毒性効果は、光及び薬物の濃度に依存性であることが見出された。ＬＤ５０値を表３に示す。
表３．過剰の遊離ペプチドが存在しない及び存在する場合の、コンジュゲート１１及び化合物８のＬＤ５０値
Figure 2010502574
環状ＲＧＤｆＫペプチドについては、遊離環状ＲＧＤ−４Ｃを細胞培養物に加えることによるコンジュゲート１１の光毒性の遮断は失敗した（図３０Ａ〜３０Ｂ、表３）。Ｈ５Ｖ細胞を、９０分間３７℃で、０〜１０μＭのコンジュゲート１１又は化合物８と共に、培地中に１０μＭのＢＳＡ中、過剰のＲＧＤ−４Ｃを存在させずに又は存在させて（１ｍＭ）、インキュベーションした。細胞を照射し、その生存を上述のように決定した。
ここでも、この結果は、感光剤の部分（化合物８）が、遊離エンドサイトーシスを介したコンジュゲート１１の細胞取り込みを決定することを示唆している。
（実施例４１）
コンジュゲート２４を用いたラットＣ６神経膠腫腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏＰＤＴ
上記結果に基づいて、本発明者らは、コンジュゲート２４を用いた固形腫瘍のＰＤＴの新しい処置プロトコルを開発した。プロトコルのパラメータは、処置時間（薬物−光の間隔）−薬物を投与した３〜２４時間後に照射；用量（ｍｇ／ｋｇ）−５〜２４ｍｇ／ｋｇ；照射時間（分間）−５〜３０分間；照射強度（ｍＷ／ｃｍ２）−１００〜２００ｍＷ／ｃｍ２；送達エネルギー（Ｊ／ｃｍ２）−３０〜３６０Ｊ／ｃｍ２を含むべきである。
使用した最初の腫瘍モデルはラットＣ６神経膠腫腫瘍異種移植を含んでおり、これは、これらの腫瘍細胞が、腫瘍の新生血管構造上に発現されるインテグリンαｖβ３に加えて、αｖβ３（Ｚｈａｎｇ他、２００６）及びαｖβ５インテグリン（Ｍｉｌｎｅｒ他、１９９９）を発現するからである。
Ｃ６神経膠腫移植片を保有するＣＤ−１ヌード雄マウスに、１５又は２４ｍｇ／身体１ｋｇの用量のコンジュゲート２４又は９ｍｇ／身体１ｋｇの用量の化合物８を静脈内注射した。
それぞれのプロトコルについて、本発明者らは少なくとも３匹の動物を使用したが、死亡率が高いため、限定された数の動物しか残らなかった。結果を表４に示す。
表４．ラットＣ６神経膠腫を保有するマウスにコンジュゲート２４を適用する様々なＶＴＰプロトコルの治療の結果。
Figure 2010502574
最適と考えられ、最良の治療結果をもたらしたプロトコルを、表４に太字で示す：１５ｍｇ／ｋｇ、注射の８時間後に１５分間の照射（９０Ｊ／ｃｍ２）、及び２４ｍｇ／ｋｇ、注射の８時間後に１０分間の照射（６０Ｊ／ｃｍ２）。
図３１Ａ及び３１Ｂは、これらのプロトコルのそれぞれの治療結果を示す。暗対照では（図３１Ｃ）、マウスにコンジュゲート２４を静脈内注射し、照射しなかった；明対照では（図３１Ｄ）、コンジュゲート２４を注射せずにマウスを照射した；コンジュゲートしていない感光剤の対照では（図３１Ｅ）、マウスに化合物８を静脈内注射し、８時間後に照射した。
様々な対照はＰＤＴ効果を示さなかった。対照的に、コンジュゲート２４及び光で処置した動物は、ＰＤＴで処置した数時間後に大規模な浮腫を示し、これは、ＰＤＴの３日後に皮下で炎症及び壊死に発達した。腫瘍の平坦化及び長期の腫瘍回帰並びに創傷治癒が観察された。
（実施例４２）
コンジュゲート２４を用いたマウスＣＴ２６結腸腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏＰＤＴ
ラットＣ６神経膠腫モデルを用いては、ＶＴＰの結果の即座の評価を得ることができず、これは、スクリーニングプロセスの過程の主要な不利点である。この問題に打ち勝つために、本発明者らは、ルシフェラーゼで形質移入した細胞からなるマウスＣＴ２６ｌｕｃ結腸癌モデルを用い、これは、治療効果の素早い評価を可能にする。
表５に示すように、ＣＴ２６ｌｕｃ腫瘍を保有するＣＤ−１ヌード雄マウスを、コンジュゲートを用いた様々なＰＤＴプロトコルに供した。
表５．マウスＣＴ２６ｌｕｃ結腸癌を保有するマウスにコンジュゲート２４を適用する様々なＶＴＰプロトコルの治療の結果。
Figure 2010502574
図３２Ａ〜Ｅは、ＣＴ２６ｌｕｃ腫瘍を保有するマウスに１５ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート２４、注射の８時間後に１０分間の照射（６０Ｊ／ｃｍ２）を施用した治療の結果を示す（表５の太字のプロトコル）。３２Ａ−コンジュゲート２４を１５ｍｇ／ｋｇで静脈内注射し、注射の８時間後に１０分間の照射（６０Ｊ／ｃｍ２）。３２Ｂ−ＩＶＩＳシステムを用いて、３２Ａで記載したマウスにルシフェリンを腹腔内注射した後に撮影したオーバーレイ画像。最初の画像は白黒であり、動物の写真である。２番目の画像は、放出された光子データのカラーのオーバーレイである。すべての画像は同スケールに正規化している。３２Ｃ−Ｂに示したデータの生物発光シグナルの定量（光子／秒／ｃｍ２）。３２Ｄ−化合物８を単独で用いた対照：マウスに化合物８を静脈内注射し、８時間後に照射した。３２Ｅ−化合物８及び環状ＲＧＤｆＫの混合物を用いた対照：マウスに化合物８及び環状ＲＧＤｆＫの混合物を静脈内注射し、８時間後に照射した。３２Ｆ−環状ＲＧＤｆＫを単独で用いた対照：マウスに環状ＲＧＤｆＫを静脈内注射し、８時間後に照射した。画像はＰＤＴ後の示した時点で撮影した。
図３２Ｂは、図３２Ａで記載したマウスにルシフェリンを腹腔内注射した後にＩＶＩＳシステムで撮影したオーバーレイ画像である。図３２Ｃは、図３２Ｂに示した生物発光の定量的な説明を提供する。使用した対照は、（１）化合物８単独（図３２Ｄ）；（２）コンジュゲートしていない化合物８及び環状ＲＧＤｆＫの混合物（図３２Ｅ）；並びに（３）環状ＲＧＤｆＫ単独（図３２Ｆ）であった。様々な対照はＰＤＴ効果を示さなかった。対照的に、標的化したコンジュゲートで処置した動物はＰＤＴの４日後以内に壊死を生じた（図３２Ａ）。残留腫瘍細胞からの顕著な生物発光シグナルがＰＤＴの８日後に現れるが（図３２Ｂ）、腫瘍は触診も視覚的検出もされなかった。応答したすべての動物で、創傷治癒及び腫瘍の平坦化が観察された。
図３３は、表５にアスタリスクで示したプロトコルのカプラン−メイヤー曲線を示す。
（実施例４３）
コンジュゲート１３を用いた乳房腫瘍の腫瘍診断及びＰＤＴ処置
以下のようにして、ヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ＡＴＣＣ）を赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）で形質移入した。
プラスミド−細胞の形質移入に用いたプラスミドは、ＲＦＰ遺伝子及びハイグロマイシンの耐性遺伝子を保有するｐＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ−Ｈｙｇ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）から、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ遺伝子をｐＤｓＲｅｄ２で置き換えた（ｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１プラスミドから）であった。
形質移入プロセス−形質移入プロセスには、リポフェクタミン（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造者のプロトコルに従って使用した：４μｇのＤＮＡを５分間、２５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（製造者Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから供給）と共にインキュベーションした。別の試験管中で、１０μｌのリポフェクタミンを５分間、２５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地と共にインキュベーションした。インキュベーション後、ＤＮＡ及びリポフェクタミンの溶液を混合し、２０分間、室温でインキュベーションし、内容物を、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が５０〜６０％コンフルエントな６ウェルプレートのうちの１つに均等に分散させた。
安定クローンの選択−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を形質移入した２４時間後、プレートを蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）下で確認した。一過性の形質移入がこの段階で検出可能であった。培地を、２５０μｇ／ｍｌの濃度の抗生物質（ハイグロマイシン）を含む新鮮な培地で置き換えた。プレートがコンフルエントに達した際、トリプシンで３０〜６０秒間処理した後に細胞を培養プレートから剥離し、０．５個の細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに蒔いた。１つのクローンしか含まず、クローンが蛍光であったウェルを回収し、６ウェルプレートに蒔いた。コンフルエントに達した後、これらを１０ｃｍのプレートにさらに蒔いた。図３４Ａ〜３４Ｂは、それぞれ１秒間及び３秒間の曝露後の、蛍光ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ＲＦＰクローン３（ハイグロマイシンに耐性）を示す。
ＰＤＴ実験には、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ＲＦＰ細胞（４×１０６個）をマウスの背中に皮下移植し、腫瘍を２〜３週間以内に処置できる大きさ（６〜８ｍｍ）まで発達させた。
ＰＤＴプロトコル：麻酔したマウスにコンジュゲート１３（７．５ｍｇの薬物／体重１ｋｇ）を静脈内注射した。腫瘍を１０分間照射した。使用した薬物と光の間隔は、薬物注射の８時間後であった。７５５ｎｍの１００ｍＷ／ｃｍ２のダイオードレーザー（ＣｅｒａｍＯｐｔｅｃ、ドイツ）を用いた、マウス皮膚を通した経皮照射を使用した。処置後、マウスをケージに戻した。暗対照群では、マウスに増感剤コンジュゲート１３を静脈内注射し、暗所ケージ内に２４時間入れた。明対照群では、１００ｍＷ／ｃｍ２を用いてマウスを１０分間照射した。ＰＤＴ後の最初の２日間、必要に応じてマウスに鎮痛剤を与え（毎日２．５ｍｇ／ｋｇのＦｌｕｎｅｘｉｎ）、３日間、飲料水中にＯｘｙｃｏｄｅを与えた。動物生存の終点は、腫瘍の大きさが動物重量の１０％に達した場合である。マウスをこの時点（９０日間まで）で頸椎脱臼によって屠殺した。
図３５Ａ〜３５Ｂは、ＰＤＴに対するヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰの局所応答の２つの代表的な例を示す。その背中にＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ異種移植（〜０．５ｃｍ３）を有するマウスに７．５ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１３を静脈内注射し、７５５ｎｍの１００ｍＷ／ｃｍ２のダイオードレーザーを用いてマウス皮膚を通して８時間後に照射した。３５Ａ−０日目（処置前）並びに処置後の１、４、７、１２及び９０日目に撮影した写真。４日目には部分的壊死が見られ、７日目には腫瘍の平坦化が観察され、９０日後には創傷が治癒し、動物は治癒した。３５Ｂ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ同所性腫瘍を保有するＣＤ−１ヌード雄マウスのｉｎ ｖｉｖｏの全身赤色蛍光イメージング。処置の９０日後にはシグナルが検出されなかった。
原発乳癌中の感光剤の蓄積を研究するために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ細胞（４×１０６個）をマウスの乳腺パッド中に正所性移植した。３〜４週間以内に腫瘍が所望の大きさまで、即ち１ｃｍ３より大きく発達した。
蓄積の評価には、８５：１５のケタミン：キシラジンの３０μｌの混合物を腹腔内注射することによってマウスを麻酔し、１５ｍｇの薬物／体重１ｋｇのコンジュゲート１３を尾部静脈に静脈内注射した。腫瘍細胞及びコンジュゲート１３のどちらの蛍光も、ＩＶＩＳ（登録商標）１００イメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ）によって監視した。腫瘍イメージングのメインフィルター設定は、以下を含む：励起フィルター５００〜５５０ｎｍ、発光フィルター５７５〜６５０ｎｍ；組織の自己蛍光を減算するためのバックグラウンドフィルター設定：励起フィルター４６０〜４９０ｎｍ、発光フィルター５７５〜６５０ｎｍ。感光剤イメージングのメインフィルター設定：励起フィルター６６５〜６９５ｎｍ、発光フィルター８１０〜８７５ｎｍ。
画像は、薬物注射後１５分、１、２、３、４．５、６、７．５、９、２４時間、２、３、４、５、６、７日間の時点で撮影した。結果を図３６及び３７に示す。
図３６は、同所性ヒト乳房ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ原発腫瘍におけるコンジュゲート１３の蓄積を示している（腫瘍の大きさ約１ｃｍ３）。画像は、薬物注射の１５分間から２４時間後に撮影した。上パネル−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ同所性腫瘍を保有するＣＤ−１ヌード雌マウスのｉｎ ｖｉｖｏの全身赤色蛍光イメージング。下パネル−コンジュゲート１３の蓄積のｉｎ ｖｉｖｏの全身ＮＩＲ蛍光イメージング。薬物は最初の２４時間の間、腫瘍中に特異的な蓄積を示さなかった。
図３７は、同所性ヒト乳房ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ原発腫瘍におけるコンジュゲート１３の蓄積を示している（腫瘍の大きさ約１ｃｍ３）。画像は、薬物注射の１日から６日後に撮影した。上パネル−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＲＦＰ同所性腫瘍を保有するＣＤ−１ヌード雌マウスのｉｎ ｖｉｖｏの全身赤色蛍光イメージング。下パネル−コンジュゲート１３の蓄積のｉｎ ｖｉｖｏの全身ＮＩＲ蛍光イメージング。薬物は腫瘍中の蓄積を示し、注射の２日後に腫瘍中に特異的なピーク濃度に達した。
Figure 2010502574
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付属書
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Claims (159)

  1. ＲＧＤ含有ペプチド又はＲＧＤペプチド模倣体とポルフィリン、クロロフィル又はバクテリオクロロフィルから選択される感光剤とのコンジュゲートであって、感光剤が、１０、１５、２０位のそれぞれで４−メチルフェニル又はアセチル化グルコシルオキシフェニルによって、５位でスペーサーアームを介してポルフィリン大環状分子と連結した直鎖状ＲＧＤ含有ペプチドの残基によって置換されている、メタレート化されていないポルフィリンであるコンジュゲートを除外したコンジュゲート。
  2. 感光剤が以下の式のテトラアリールポルフィリンである、請求項１に記載のコンジュゲート：
    Figure 2010502574
    ［式中、
    Ａｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３、及びＡｒ４は、同一又は異なり、それぞれ、炭素環アリール、ヘテロアリール及び混合カルボアリール−ヘテロアリール基から選択されるアリール基であり、アリール基のそれぞれは、未置換であるか、又は、ハロゲン原子、アリールがフェニルの場合はＣ２〜Ｃ８アルキル、アリールがヘテロアリール若しくは混合カルボアリール−ヘテロアリールの場合はＣ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ、カルボキシ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルアミノ、アミノ−（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノ、トリ−（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアンモニウム、ヒドロキシ、及びＣＯＮＨ２から選択される１つ若しくは複数の置換基によって置換されており、Ａｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３、及びＡｒ４のうちの少なくとも１つは、その置換基のうちの１つ又は架橋基を介して前記少なくとも１つのアリール基と連結したＲＧＤ含有ペプチド又はＲＧＤペプチド模倣体によって置換されており；
    ｎは、置換基が中性の場合は０であるか、又は、ｎは１〜４の整数であり；
    Ｘは、アリール基が正荷電の場合は製薬上許容される陰イオンであるか、又は、アリール基が負荷電の場合は製薬上許容される陽イオンであり；
    Ｍは、２Ｈであるか、又は、Ｍｇ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｓｎ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｉｎ、Ｅｕ、Ｆｅ、Ａｕ、Ａｌ、Ｇｄ、Ｅｒ、Ｙｂ、Ｌｕ、Ｇａ、Ｙ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｃｒ、Ｍｏ、Ｐ、Ｒｅ、Ｔｌ及びＴｃ並びにその同位体からなる群から選択される原子である］。
  3. 炭素環アリール基が、それ自体で又は混合カルボアリール−ヘテロアリール基の一部として、置換された又は未置換の単環又は二環状芳香族基であり、前記ヘテロアリール基が、それ自体で又は混合カルボアリール−ヘテロアリール基の一部として、Ｏ、Ｓ及びＮからなる群から選択される１〜３個のヘテロ原子を含む、置換された又は未置換の５〜６員の芳香環である、請求項２に記載のコンジュゲート。
  4. 前記炭素環アリール基が、フェニル、ビフェニル及びナフチルからなる群から選択され、前記ヘテロアリール基が、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、チアゾリル、ピリジル、ピリミジル、及びトリアジニルからなる群から選択される、請求項３に記載のコンジュゲート。
  5. 炭素環アリール及び／又はヘテロアリール基のうちの１〜３個が、１つ又は複数のカルボキシ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルアミノ、アミノ−（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノ、ヒドロキシ、又はＣＯＮＨ２基によって置換されている、請求項３又は４に記載のコンジュゲート。
  6. Ｍが、２Ｈであるか、又は、Ｐｄ、Ｃｕ、Ｍｎ及びＧｄから選択される金属である、請求項２に記載のコンジュゲート。
  7. ＲＧＤ含有ペプチドがすべてＬ、すべてＤ又はＬ，Ｄの直鎖状又は環状ペプチドであり、アミノ酸が天然又は非天然のアミノ酸であり得る、請求項２に記載のコンジュゲート。
  8. ＲＧＤ含有ペプチドが環状ペプチドである、請求項７に記載のコンジュゲート。
  9. 環状ペプチドが、−ＣＯ−ＮＨ−基を介してポルフィリン部分の少なくとも１つのアリール基と連結している、請求項８に記載のコンジュゲート。
  10. 前記環状ペプチドがペンタペプチドの環状ＲＧＤｆＫ（配列番号１）である、請求項８又は９に記載のコンジュゲート。
  11. 前記環状ペプチドがノナペプチドＲＧＤ−４Ｃ（配列番号２）である、請求項８又は９に記載のコンジュゲート。
  12. （ｉ）メソ−５−（４−環状ＲＧＤｆＫ−ベンズアミド）−１０，１５，２０−トリス（４−カルボキシフェニル）ポルフィン（２０）；（ｉｉ）銅（ＩＩ）メソ−５−（４−環状ＲＧＤｆＫ−ベンズアミド）−１０，１５，２０−トリス（４−カルボキシ−フェニル）ポルフィン（２１）；及び（ｉｉｉ）ガドリニウム（ＩＩＩ）メソ−５−（４−環状ＲＧＤｆＫ−ベンズアミド）−１０，１５，２０−トリス（４−カルボキシフェニル）ポルフィン（２２）から選択される、請求項１０に記載のコンジュゲート。
  13. 感光剤が、式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩのクロロフィル又はバクテリオクロロフィル、並びにその製薬上許容される塩及び光学異性体：
    Figure 2010502574
    ［式中、
    Ｍは、２Ｈ、又はＭｇ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｓｎ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｉｎ、Ｅｕ、Ｆｅ、Ａｕ、Ａｌ、Ｇｄ、Ｅｒ、Ｙｂ、Ｌｕ、Ｇａ、Ｙ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｃｒ、Ｍｏ、Ｐ、Ｒｅ及びＴｃ、Ｔｌ並びにその同位体からなる群から選択される原子を表し；
    Ｘは、Ｏ又はＮ−Ｒ７であり；
    Ｒ１、Ｒ’２及びＲ６は、それぞれ独立して、Ｙ−Ｒ８、−ＮＲ９Ｒ’９若しくは−Ｎ＋Ｒ９Ｒ’９Ｒ”９Ａ−であるか；又は、Ｒ１及びＲ６は、一緒になって、ＲＧＤペプチド又はＲＧＤペプチド模倣体残基を含む環を形成し；
    Ｙは、Ｏ又はＳであり；
    Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ又はＣＯＯＲ９であり；
    Ｒ３は、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル又はＣ１〜Ｃ１２アルコキシであり；
    Ｒ４は、−ＣＨ＝ＣＲ９Ｒ’９、−ＣＨ＝ＣＲ９Ｈａｌ、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＮＲ９Ｒ’９、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−Ｎ＋Ｒ９Ｒ’９Ｒ”９Ａ−、−ＣＨＯ、−ＣＨ＝ＮＲ９、−ＣＨ＝Ｎ＋Ｒ９Ｒ’９Ａ−、−ＣＨ２−ＯＲ９、−ＣＨ２−ＳＲ９、−ＣＨ２−Ｈａｌ、−ＣＨ２−Ｒ９、−ＣＨ２−ＮＲ９Ｒ’９、−ＣＨ２−Ｎ＋Ｒ９Ｒ’９Ｒ”９Ａ−、−ＣＨ２−ＣＨ２Ｒ９、−ＣＨ２−ＣＨ２Ｈａｌ、−ＣＨ２−ＣＨ２ＯＲ９、−ＣＨ２−ＣＨ２ＳＲ９、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ９Ｒ’９、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ＋Ｒ９Ｒ’９Ｒ”９Ａ−、−ＣＯＣＨ３、Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＲ９Ｒ’９、−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＲ９Ｈａｌ、−Ｃ（ＣＨ３）＝ＮＲ９、−ＣＨ（ＣＨ３）＝Ｎ＋Ｒ９Ｒ’９Ａ−、−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｈａｌ、−ＣＨ（ＣＨ３）−ＯＲ９、−ＣＨ（ＣＨ３）−ＳＲ９、−ＣＨ（ＣＨ３）−ＮＲ９Ｒ’９、−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｎ＋Ｒ９Ｒ’９ Ｒ’９Ａ−、又は−Ｃ≡ＣＲ９であり；
    Ｒ’４は、メチル又はホルミルであり；
    Ｒ５は、＝Ｏ、＝Ｓ、＝Ｎ−Ｒ９、＝Ｎ＋Ｒ９Ｒ’９Ａ−、＝ＣＲ９Ｒ’９、又は＝ＣＲ９−Ｈａｌであり；
    Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ’９及びＲ”９は、それぞれ独立して：
    （ａ）Ｈ；
    （ｂ）Ｃ１〜Ｃ２５ヒドロカルビル；
    （ｃ）ハロゲン、ニトロ、オキソ、ＯＲ、ＳＲ、エポキシ、エピチオ、−ＮＲＲ’、−ＣＯＮＲＲ’、−ＣＯＮＲ−ＮＲＲ’、−ＮＨＣＯＮＲＲ’、−ＮＨＣＯＮＲＮＲＲ’、−ＣＯＲ、ＣＯＯＲ”、−ＯＳＯ３Ｒ、−ＳＯ３Ｒ”、−ＳＯ２Ｒ、−ＮＨＳＯ２Ｒ、−ＳＯ２ＮＲＲ’、＝Ｎ−ＯＲ、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−ＮＲＲ’、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＲ、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ、−ＯＰＯ３ＲＲ’、−ＰＯ２ＨＲ、及び−ＰＯ３Ｒ”Ｒ”からなる群から選択される１つ又は複数の官能基によって置換されたＣ１〜Ｃ２５ヒドロカルビル（式中、Ｒ及びＲ’は、それぞれ独立して、Ｈ、ヒドロカルビル若しくはヘテロシクリルであり、Ｒ’はさらに、ＲＧＤペプチド若しくはＲＧＤペプチド模倣体の残基であってよいか、又は、Ｒ及びＲ’は、それらが付着しているＮ原子と一緒になって、Ｏ、Ｓ及びＮから選択されるさらなるヘテロ原子を任意選択で含む５〜７員の飽和環を形成し、さらなるＮ原子は置換されていてもよく、Ｒ”は、Ｈ、陽イオン、ヒドロカルビル又はヘテロシクリルである）；
    （ｄ）正荷電基、負荷電基、生理的条件下で正荷電基に変換される塩基性基、及び生理的条件下で負荷電基に変換される酸性基からなる群から選択される１つ又は複数の官能基によって置換されたＣ１〜Ｃ２５ヒドロカルビル；
    （ｅ）１つ若しくは複数のヘテロ原子及び／又は１つ若しくは複数の炭素環若しくはヘテロ環部分を含むＣ１〜Ｃ２５ヒドロカルビル；
    （ｆ）１つ若しくは複数のヘテロ原子及び／又は１つ若しくは複数の炭素環若しくはヘテロ環部分を含み、上記（ｃ）及び（ｄ）で定義した１つ又は複数の官能基によって置換されたＣ１〜Ｃ２５ヒドロカルビル；
    （ｇ）アミノ酸残基、ペプチド、タンパク質、単糖、オリゴ糖、多糖、又は多座配位子及び金属とのそのキレート錯体によって置換されたＣ１〜Ｃ２５ヒドロカルビル；或いは
    （ｈ）アミノ酸残基、ペプチド、タンパク質、単糖、オリゴ糖、多糖；又は多座配位子及び金属とのそのキレート錯体であり；
    Ｒ７はさらに、−ＮＲＲ’であってよく、Ｒ及びＲ’は、それぞれ、Ｈ、又は負荷電基、好ましくはＳＯ３ −によって任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ２５ヒドロカルビルであり；
    Ｒ８はさらに、Ｈ＋、又はＲ１、Ｒ’２及びＲ６がそれぞれ独立してＹ−Ｒ８である場合は陽イオンＲ＋ １０であってよく；
    Ｒ＋ １０は、金属、アンモニウム基又は有機陽イオンであり；
    Ａ−は、生理的に許容される陰イオンであり；
    ｍが０又は１であり；
    ７〜８位の点線は、任意選択の二重結合を表す］であり、前記式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩのクロロフィル又はバクテリオクロロフィル誘導体が少なくとも１つのＲＧＤ含有ペプチド又はＲＧＤペプチド模倣体の残基を含む、請求項１に記載のコンジュゲート。
  14. Ｃ１〜Ｃ２５ヒドロカルビルのうちいずれかがＣ１〜Ｃ２５アルキル、アルケニル又はアルキニルである、請求項１３に記載のコンジュゲート。
  15. アルキルがＣ１〜Ｃ１０アルキルである、請求項１４に記載のコンジュゲート。
  16. アルキルがＣ２〜Ｃ３アルキルである、請求項１５に記載のコンジュゲート。
  17. ７〜８位の点線が二重結合を表し、感光剤が式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩのクロロフィルである、請求項１３に記載のコンジュゲート。
  18. ７〜８位の点線が存在せず、感光剤が式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩのバクテリオクロロフィルである、請求項１３に記載のコンジュゲート。
  19. それぞれのＲ４が、独立して、アセチル、ビニル、エチル、若しくは１−ヒドロキシエチル基、又は前記１−ヒドロキシエチル基のエーテル若しくはエステルである、請求項１２に記載のコンジュゲート。
  20. 感光剤が式Ｉ又はＩＩのバクテリオクロロフィルであり、３位のＲ４がアセチルであり、８位のＲ４がエチルであり、Ｒ’４がメチルであり、７〜８位が水素化されている、請求項１３に記載のコンジュゲート。
  21. 感光剤が式Ｉ又はＩＩのクロロフィルであり、３位のＲ４がビニルであり、８位のＲ４がエチルであり、Ｒ’４がメチルであり、７〜８位に二重結合が存在する、請求項１３に記載のコンジュゲート。
  22. 前記式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩのクロロフィル又はバクテリオクロロフィルが、ＣＯＯ−、ＣＯＳ−、ＳＯ３ −、若しくはＰＯ３ ２−から選択される少なくとも１つの負荷電基、又はＣＯＯＨ、ＣＯＳＨ、ＳＯ３Ｈ、若しくはＰＯ３Ｈ２から選択される、生理的ｐＨで負荷電基に変換される少なくとも１つの酸性基、又はその塩を含む、請求項１３に記載のコンジュゲート。
  23. 前記クロロフィル又はバクテリオクロロフィルが式ＩＩのものであり、Ｒ６が−ＮＲ９Ｒ’９であり、Ｒ９がＨであり、Ｒ’９がＳＯ３Ｈ又はそのアルカリ塩によって置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキルである、請求項２２に記載のコンジュゲート。
  24. Ｒ６が−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋ又は−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＳＯ３Ｋである、請求項２３に記載のコンジュゲート。
  25. 前記式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩのクロロフィル又はバクテリオクロロフィルが少なくとも１つの正荷電基を含む、請求項１３に記載のコンジュゲート。
  26. 前記正荷電基が、−Ｎ＋（ＲＲ’Ｒ”）、−（Ｒ）Ｎ−Ｎ＋（ＲＲ’Ｒ”）、Ｏ←Ｎ＋（ＲＲ’）−、＞Ｃ＝Ｎ＋（ＲＲ’）、−Ｃ（＝ＮＲ）−Ｎ＋ＲＲ’Ｒ”及び−（Ｒ）Ｎ−Ｃ（＝ＮＲ）−Ｎ＋ＲＲ’Ｒ”基から選択されるＮ含有基に由来する陽イオンであり、Ｒ、Ｒ’及びＲ”が、それぞれ独立して、Ｈ、ヒドロカルビル若しくはヘテロシクリルであるか、又は、Ｒ、Ｒ’及びＲ”のうちの２つが、それらが付着しているＮ原子と一緒になって、Ｏ、Ｓ若しくはＮから選択される１つ若しくは複数のヘテロ原子を任意選択で含み、且つ追加のＮ原子でさらに任意選択で置換されている３〜７員の飽和環を形成する、請求項２５に記載のコンジュゲート。
  27. 前記陽イオンが末端基又はアルキル鎖内に位置する基である、請求項２６に記載のコンジュゲート。
  28. 前記陽イオンが式−Ｎ＋（ＲＲ’Ｒ”）のアンモニウム基であり、Ｒ、Ｒ’及びＲ”のそれぞれが、独立して、Ｈ、ヒドロカルビル若しくはヘテロシクリルであるか、又は、Ｒ、Ｒ’及びＲ”のうちの２つが、Ｎ原子と一緒になって、Ｏ、Ｓ若しくはＮ原子を任意選択で含み、且つ追加のＮ原子でさらに任意選択で置換されている３〜７員の飽和環を形成する、請求項２６に記載のコンジュゲート。
  29. 前記３〜７員の飽和環が、追加のＮ原子でハロ、ヒドロキシル若しくはアミノによって任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルによって任意選択で置換されたアジリジン、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、チオモルホリン、アゼピン又はピペラジンからなる群から選択される、請求項２８に記載のコンジュゲート。
  30. 前記正荷電基が、１つ又は複数のＮ原子及び任意選択でＯ又はＳ原子を含む芳香族ヘテロ環化合物に由来する陽イオンである、請求項２５に記載のコンジュゲート。
  31. 前記陽イオンが、ピラゾリウム、イミダゾリウム、オキサゾリウム、チアゾリウム、ピリジニウム、キノリニウム、イソキノリニウム、ピリミジニウム、１，２，４−トリアジニウム、１，３，５−トリアジニウム及びプリニウムから選択される、請求項３０に記載のコンジュゲート。
  32. 前記少なくとも１つの正荷電基が、−Ｏ＋（ＲＲ’）、−Ｓ＋（ＲＲ’）、−Ｓｅ＋（ＲＲ’）、−Ｔｅ＋（ＲＲ’）、−Ｐ＋（ＲＲ’Ｒ”）、−Ａｓ＋（ＲＲ’Ｒ”）、−Ｓｂ＋（ＲＲ’Ｒ”）、及び−Ｂｉ＋（ＲＲ’Ｒ”）からなる群から選択されるオニウム基であり、Ｒ、Ｒ’及びＲ”が、それぞれ独立して、Ｈ、ヒドロカルビル又はヘテロシクリルである、請求項２５に記載のコンジュゲート。
  33. 生理的条件下で正荷電基に変換される少なくとも１つの塩基性基を含む、請求項１３に記載のコンジュゲート。
  34. 前記塩基性基が末端基又はアルキル鎖内に位置する基である、請求項３３に記載のコンジュゲート。
  35. 前記少なくとも１つの塩基性基が、−ＮＲＲ’、−Ｃ（＝ＮＲ）−ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ−ＮＲ’Ｒ”、−（Ｒ）Ｎ−Ｃ（＝ＮＲ）−ＮＲ’Ｒ”、Ｏ←ＮＲ−、又は＞Ｃ＝ＮＲであり、Ｒ、Ｒ’及びＲ”のそれぞれが、独立して、Ｈ、任意選択で置換されたヒドロカルビル若しくはヘテロシクリルであるか、又は、Ｒ、Ｒ’及びＲ”のうちの２つが、Ｎ原子と一緒になって、Ｏ、Ｓ若しくはＮ原子を任意選択で含み、且つ追加のＮ原子でさらに任意選択で置換されている３〜７員の飽和環を形成する、或いは、塩基性基がＮ含有芳香族ヘテロ環基である、請求項３３に記載のコンジュゲート。
  36. 前記３〜７員の飽和環が、追加のＮ原子でハロ、ヒドロキシル若しくはアミノによって任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルによって任意選択で置換された、アジリジン、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、チオモルホリン、アゼピン又はピペラジンから選択され、前記Ｎ含有芳香族ヘテロ環基が、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、ピリジル、キノリニル、イソキノリニル、ピリミジル、１，２，４−トリアジニル、１，３，５−トリアジニル又はプリニルである、請求項３５に記載のコンジュゲート。
  37. 感光剤が式ＩＩのクロロフィル又はバクテリオクロロフィルであり、Ｒ６が塩基性基−ＮＲ９Ｒ’９であり、Ｒ９がＨであり、Ｒ’９が塩基性基−ＮＨ−（ＣＨ２）２〜６−ＮＲＲ’によって置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｒ及びＲ’のそれぞれが、独立して、Ｈ、ＮＨ２によって任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルであるか、又は、Ｒ及びＲ’が、Ｎ原子と一緒になってＯ若しくはＮ原子を任意選択で含み、且つ追加のＮ原子でさらに−（ＣＨ２）２〜６−ＮＨ２によって任意選択で置換されている、５〜６員の飽和環を形成する、請求項３５に記載のコンジュゲート。
  38. 感光剤が式ＩＩのバクテリオクロロフィルであり、Ｒ６が−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−１−モルホリノ、又は−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ピペラジノ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２である、請求項３７に記載のコンジュゲート。
  39. 感光剤が式ＩＩのクロロフィル又はバクテリオクロロフィルであり、Ｒ１及びＲ６が、一緒になって、ＲＧＤペプチド若しくはＲＧＤペプチド模倣体を含む環を形成するである、請求項１３に記載のコンジュゲート。
  40. 感光剤が式ＩＩＩのクロロフィル又はバクテリオクロロフィルであり、Ｘが−ＮＲ７であり、Ｒ７が−ＮＲＲ’であり、ＲがＨであり、Ｒ’が、ＳＯ３−によって置換されたＣ２〜６−アルキル又はそのアルカリ塩である、請求項１３に記載のコンジュゲート。
  41. 感光剤が式ＩＩＩのバクテリオクロロフィルであり、Ｘが−ＮＲ７であり、Ｒ７が−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＳＯ３Ｋである、請求項４０に記載のコンジュゲート。
  42. Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９又はＲ’９が、それぞれ、１つ又は複数の−ＯＨ基によって置換されたＣ１〜６−アルキルである、請求項１３に記載のコンジュゲート。
  43. 感光剤が式ＩＩのクロロフィル又はバクテリオクロロフィルであり、Ｒ６が−ＮＲ９Ｒ’９であり、Ｒ９がＨであり、Ｒ’９がＨＯＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−である、請求項４２に記載のコンジュゲート。
  44. 感光剤が式ＩＩのクロロフィル又はバクテリオクロロフィルであり、Ｒ６が−ＮＲ９Ｒ’９であり、Ｒ９がＨであり、Ｒ’９が、多座配位子又は金属とのそのキレート錯体によって置換されたＣ１〜６−アルキルである、請求項１３に記載のコンジュゲート。
  45. 感光剤が式ＩＩのバクテリオクロロフィルであり、前記多座配位子がＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ又はＤＯＴＡであり、Ｒ６が−ＮＲ９Ｒ’９であり、Ｒ９がＨであり、Ｒ’９が、多座配位子又は金属とのそのキレート錯体によって置換されたＣ１〜６−アルキルである、請求項４４に記載のコンジュゲート。
  46. Ｒ６が−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−ＤＴＰＡである、請求項４５に記載のコンジュゲート。
  47. ＤＴＰＡがＧｄとキレート化している、請求項４６に記載のコンジュゲート。
  48. Ｍが、２Ｈであるか、又は、Ｐｄ、Ｍｎ、若しくはＣｕから選択される金属である、請求項１３に記載のコンジュゲート。
  49. 感光剤が式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩのバクテリオクロロフィルである、請求項４８に記載のコンジュゲート。
  50. 感光剤が式Ｉのバクテリオクロロフィルであり、ＭがＰｄである、請求項４９に記載のコンジュゲート。
  51. 感光剤が式ＩＩのバクテリオクロロフィルであり、ＭがＰｄである、請求項４９に記載のコンジュゲート。
  52. 感光剤が式ＩＩＩのバクテリオクロロフィルであり、ＭがＰｄである、請求項４９に記載のコンジュゲート。
  53. 感光剤が式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩのクロロフィルである、請求項４９に記載のコンジュゲート。
  54. 感光剤が式ＩＩのクロロフィルであり、Ｍが２Ｈ、Ｃｕ又はＭｎである、請求項４９に記載のコンジュゲート。
  55. 感光剤が式ＩＩのバクテリオクロロフィルであり、ＭがＰｄ、Ｍｎ、Ｃｕ又は２Ｈであり；ｍが０であり；Ｒ１がＮＨ−Ｐであり、Ｐが、ＮＨ−に直接又はスペーサーを介して連結しているＲＧＤ含有ペプチド又はＲＧＤペプチド模倣体の残基であり；Ｒ’２がメトキシであり；Ｒ４が、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４がメチルであり；Ｒ６が−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３ −Ｍｅ＋であり、Ｍｅ＋がＮａ＋又はＫ＋である、請求項１３に記載のコンジュゲート。
  56. 感光剤が式ＩＩのバクテリオクロロフィルであり、ＭがＰｄ又は２Ｈであり；ｍが０であり；Ｒ１がＮＨ−Ｐであり、Ｐが、ＮＨ−に直接又はスペーサーを介して連結しているＲＧＤ含有ペプチド又はＲＧＤペプチド模倣体の残基であり；Ｒ’２がメトキシであり；Ｒ４が、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４がメチルであり；Ｒ６が−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＯＨである、請求項１３に記載のコンジュゲート。
  57. 感光剤が式ＩＩＩのバクテリオクロロフィルであり、ＭがＰｄであり；Ｒ１がＮＨ−Ｐであり、Ｐが、ＮＨ−に直接又はスペーサーを介して連結しているＲＧＤ含有ペプチド又はＲＧＤペプチド模倣体の残基であり；Ｒ４が、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４がメチルであり；ＸがＮ−Ｒ７であり、Ｒ７が−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＳＯ３ −Ｍｅ＋であり、Ｍｅ＋がＮａ＋又はＫ＋である、請求項１３に記載のコンジュゲート。
  58. 感光剤が式Ｉのバクテリオクロロフィルであり、ＭがＭｎであり；Ｒ１がＮＨ−Ｐであり、Ｐが、ＮＨ−に直接又はスペーサーを介して連結しているＲＧＤ含有ペプチド又はＲＧＤペプチド模倣体の残基であり；Ｒ２がＯＨであり；Ｒ３がＣＯＯＣＨ３であり；Ｒ４が、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４がメチルであり；Ｒ５がＯである、請求項１３に記載のコンジュゲート。
  59. 感光剤が式ＩＩのクロロフィルであり、ＭがＭｎ、Ｃｕ又は２Ｈから選択され；Ｒ１がＮＨ−Ｐであり、Ｐが、ＮＨ−に直接又はスペーサーを介して連結しているＲＧＤ含有ペプチド又はＲＧＤペプチド模倣体の残基であり；Ｒ４が、３位ではビニルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４がメチルであり；Ｒ６が−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３ −Ｍｅ＋であり、Ｍｅ＋がＮａ＋又はＫ＋である、請求項１３に記載のコンジュゲート。
  60. 感光剤が式ＩＩのバクテリオクロロフィルであり、Ｍが２Ｈであり；ｍが０であり；Ｒ１がＮＨ−Ｐであり、Ｐが、ＮＨ−に直接又はスペーサーを介して連結しているＲＧＤ含有ペプチド又はＲＧＤペプチド模倣体の残基であり；Ｒ’２がメトキシであり；Ｒ４が、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４がメチルであり；Ｒ６が−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２である、請求項１３に記載のコンジュゲート。
  61. 感光剤が式ＩＩのバクテリオクロロフィルであり、Ｍが２Ｈであり；ｍが０であり；Ｒ１がＮＨ−Ｐであり、Ｐが、ＮＨ−に直接又はスペーサーを介して連結しているＲＧＤ含有ペプチド又はＲＧＤペプチド模倣体の残基であり；Ｒ’２がメトキシであり；Ｒ４が、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４がメチルであり；Ｒ６が−ＮＨ−（ＣＨ２）２−モルホリノである、請求項１３に記載のコンジュゲート。
  62. 感光剤が式ＩＩのバクテリオクロロフィルであり、Ｍが２Ｈであり；ｍが０であり；Ｒ１がＮＨ−Ｐであり、Ｐが、ＮＨ−に直接又はスペーサーを介して連結しているＲＧＤ含有ペプチド又はＲＧＤペプチド模倣体の残基であり；Ｒ’２がメトキシであり；Ｒ４が、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４がメチルであり；Ｒ６が−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ピペラジノ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２である、請求項１３に記載のコンジュゲート。
  63. ＲＧＤ含有ペプチドがすべてＬ、すべてＤ又はＬ，Ｄの直鎖状又は環状ペプチドである、請求項１３に記載のコンジュゲート。
  64. ＲＧＤ含有ペプチドが４〜１００、好ましくは５〜５０、５〜３０、５〜２０、より好ましくは５〜１０個のアミノ酸残基からなる、請求項６３に記載のコンジュゲート。
  65. ＲＧＤ含有ペプチドが４、５、６、７、９又は２５個のアミノ酸残基からなる、請求項６４に記載のコンジュゲート。
  66. ＲＧＤ含有ペプチドが５個のアミノ酸残基からなる、請求項６５に記載のコンジュゲート。
  67. アミノ酸が天然アミノ酸である、請求項６３から６６までのいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  68. 天然アミノ酸がＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、及びＶａｌから選択される、６７に記載のコンジュゲート。
  69. 天然アミノ酸が修飾されている、請求項６７に記載のコンジュゲート。
  70. 修飾が、Ｄ−修飾、ペプチド結合のＮ−アルキル化、Ｌｙｓのアミノ末端基又は遊離アミノ基のアシル化又はアルキル化、Ａｓｐ又はＧｌｕのカルボキシ末端基又は遊離カルボキシ基のエステル化又はアミド化、及びＳｅｒ又はＴｙｒのヒドロキシル基のエステル化又はエーテル化を含む、請求項６９に記載のコンジュゲート。
  71. 修飾がＮ−メチル化である、請求項７０に記載のコンジュゲート。
  72. 修飾がＤ−修飾である、請求項７０に記載のコンジュゲート。
  73. ＲＧＤ含有ペプチドが非天然アミノ酸を含む、請求項６３から６６までのいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  74. 非天然アミノ酸が、４−アミノ酪酸（Ａｂｕ）、２−アミノアジピン酸、ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、ヒドロキシリシン、ホモセリン、ホモバリン、ホモロイシン、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、及びナフチルアラニン（Ｎａｌ）から選択される、請求項７３に記載のコンジュゲート。
  75. ＲＧＤ含有ペプチドが環状である、請求項６３から６５までのいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  76. 前記環状ペプチドがペンタペプチドの環状ＲＧＤｆＫ（配列番号１）であり、ｆがＤ−Ｐｈｅを示す、請求項７５に記載のコンジュゲート。
  77. 前記環状ペプチドが本明細書中でＲＧＤ−４Ｃ（配列番号２）と命名したノナペプチドである、請求項７５に記載のコンジュゲート。
  78. 前記環状ペプチドがテトラペプチドの環状ＲＧＤＫ（配列番号４）である、請求項７５に記載のコンジュゲート。
  79. 前記環状ペプチドがペンタペプチドの環状ＲＧＤｆ−ｎ（Ｍｅ）Ｋ（配列番号７）であり、ｆがＤ−Ｐｈｅを示す、請求項７５に記載のコンジュゲート。
  80. 前記環状ペプチドがペンタペプチドの環状ＲＧＤｙＫ（配列番号８）であり、ｙがＤ−Ｔｙｒを示す、請求項７５に記載のコンジュゲート。
  81. ＲＧＤ含有ペプチドが直鎖状である、請求項６３から６６までのいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  82. 前記直鎖状ペプチドがヘキサペプチドのＧＲＧＤＳＰ（配列番号３）である、請求項８１に記載のコンジュゲート。
  83. 前記直鎖状ペプチドがヘプタペプチドのＧＲＧＤＳＰＫ（配列番号５）である、請求項８１に記載のコンジュゲート。
  84. 前記直鎖状ペプチドが配列（ＧＲＧＤＳＰ）４Ｋ（配列番号７）を有する、請求項８１に記載のコンジュゲート。
  85. ＲＧＤペプチド模倣体を含む、請求項１３に記載のコンジュゲート。
  86. 前記ＲＧＤペプチド模倣体が、１１個の原子の鎖によって間隔が空いたグアニジン及びカルボキシル末端基を含む非ペプチド化合物であり、前記原子のうちの少なくとも５個が炭素原子であり、前記鎖が１つ又は複数のＯ、Ｓ又はＮ原子を含み、オキソ、チオキソ、ハロゲン、アミノ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ヒドロキシル、若しくはカルボキシによって任意選択で置換され得るか、又は、前記鎖の１つ若しくは複数の原子が３〜６員の炭素環若しくはヘテロ環を形成し得る、請求項８５に記載のコンジュゲート。
  87. 前記ＲＧＤペプチド模倣体が鎖中にＮ原子を含み、オキソ基によって置換されている、請求項８６に記載のコンジュゲート。
  88. 前記ＲＧＤペプチド模倣体が以下の式を有する、請求項８６に記載のコンジュゲート：
    Ｈ２Ｎ−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ−（ＣＨ２）５−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２）−（ＣＨ２）２−ＣＯＯＨ。
  89. 感光剤が式ＩＩのバクテリオクロロフィルであり、ＭがＰｄであり；ｍが０であり；Ｒ１がＮＨ−Ｐであり、ＰがＲＧＤペプチド模倣体の残基であり；Ｒ’２がメトキシであり；Ｒ４が、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４がメチルであり；Ｒ６が−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋである、請求項８８に記載のコンジュゲート（コンジュゲート４０）。
  90. 感光剤が式ＩＩのバクテリオクロロフィルであり、ＭがＰｄであり；ｍが０であり；Ｒ１がＮＨ−Ｐであり、ＰがＲＧＤペプチド模倣体の残基であり；Ｒ’２がメトキシであり；Ｒ４が、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４がメチルであり；Ｒ６が−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋである、請求項８６に記載のコンジュゲート（コンジュゲート４１）。
  91. Ｒ１及びＲ６が、一緒になって、−ＮＨ−ＲＧＤ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−又は−ＮＨ−ＲＧＤ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ピペラジノ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−を含む環を形成する、請求項３９に記載のコンジュゲート。
  92. 感光剤が式ＩＩのバクテリオクロロフィルであり、ｍが０であり；Ｒ’２がメトキシであり；Ｒ４が、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４がメチルであり；Ｒ１及びＲ６が、一緒になって、−ＮＨ−ＲＧＤ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−を含む環を形成し、且つＭがＰｄであるか（コンジュゲート３７）、若しくはＭが２Ｈであり（コンジュゲート３８）であるか、又は、Ｒ１及びＲ６が、一緒になって、−ＮＨ−ＲＧＤ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ピペラジノ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−を含む環を形成し、且つＭがＰｄである（コンジュゲート３９）、請求項９１に記載のコンジュゲート。
  93. 感光剤が式ＩＩのクロロフィルであり、Ｍが２Ｈであり；Ｒ１がＮＨ−Ｐであり、Ｐが配列番号１のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ４が、３位ではビニルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４がメチルであり；Ｒ６が−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋである、請求項５９に記載のコンジュゲート（コンジュゲート１６）。
  94. 感光剤が式ＩＩのクロロフィルであり、ＭがＭｎであり；Ｒ１がＮＨ−Ｐであり、Ｐが配列番号１のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ４が、３位ではビニルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４がメチルであり；Ｒ６が−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋである、請求項５９に記載のコンジュゲート（コンジュゲート１７）。
  95. 感光剤が式ＩＩのクロロフィルであり、ＭがＣｕであり；Ｒ１がＮＨ−Ｐであり、Ｐが配列番号１のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ４が、３位ではビニルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４がメチルであり；Ｒ６が−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋである、請求項５９に記載のコンジュゲート（コンジュゲート１８）。
  96. 感光剤が式Ｉのバクテリオクロロフィルであり、ＭがＭｎであり；Ｒ１がＮＨ−Ｐであり、Ｐが配列番号１のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ２がＯＨであり；Ｒ３がＣＯＯＣＨ３であり；Ｒ４が、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４がメチルであり；Ｒ５がＯである、請求項５８に記載のコンジュゲート（コンジュゲート１２）。
  97. 感光剤が式Ｉのバクテリオクロロフィルであり、Ｍが２Ｈであり；Ｒ１がＮＨ−Ｐであり、Ｐが配列番号１のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ２がＯＨであり；Ｒ３がＣＯＯＣＨ３であり；Ｒ４が、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４がメチルであり；Ｒ５がＯである、請求項５８に記載のコンジュゲート（コンジュゲート２７）。
  98. 感光剤が式Ｉのバクテリオクロロフィルであり、Ｍが２Ｈであり；Ｒ１がＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−Ｐであり、Ｐが配列番号４のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ２がＯＨであり；Ｒ３がＣＯＯＣＨ３であり；Ｒ４が、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４がメチルであり；Ｒ５がＯである、請求項５８に記載のコンジュゲート（コンジュゲート３２）。
  99. 感光剤が式ＩＩのバクテリオクロロフィルであり、ＭがＰｄであり；ｍが０であり；Ｒ１がＮＨ−Ｐであり、Ｐが配列番号２のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ’２がメトキシであり；Ｒ４が、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４がメチルであり；Ｒ６が−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋである、請求項５５に記載のコンジュゲート（コンジュゲート１１）。
  100. 感光剤が式ＩＩのバクテリオクロロフィルであり、Ｍが２Ｈであり；ｍが０であり；Ｒ１がＮＨ−Ｐであり、Ｐが配列番号１のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ’２がメトキシであり；Ｒ４が、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４がメチルであり；Ｒ６が−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋである、請求項５５に記載のコンジュゲート（コンジュゲート１３）。
  101. 感光剤が式ＩＩのバクテリオクロロフィルであり、ＭがＭｎであり；ｍが０であり；Ｒ１がＮＨ−Ｐであり、Ｐが配列番号１のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ’２がメトキシであり；Ｒ４が、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４がメチルであり；Ｒ６が−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋである、請求項５５に記載のコンジュゲート（コンジュゲート１４）。
  102. 感光剤が式ＩＩのバクテリオクロロフィルであり、ＭがＣｕであり；ｍが０であり；Ｒ１がＮＨ−Ｐであり、Ｐが配列番号１のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ’２がメトキシであり；Ｒ４が、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４がメチルであり；Ｒ６が−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋである、請求項５５に記載のコンジュゲート（コンジュゲート１５）。
  103. 感光剤が式ＩＩのバクテリオクロロフィルであり、ＭがＰｄであり；ｍが０であり；Ｒ１がＮＨ−Ｐであり、Ｐが配列番号１のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ’２がメトキシであり；Ｒ４が、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４がメチルであり；Ｒ６が−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋである、請求項５５に記載のコンジュゲート（コンジュゲート２４）。
  104. 感光剤が式ＩＩのバクテリオクロロフィルであり、ＭがＰｄであり；ｍが０であり；Ｒ１がＮＨ−Ｐであり、Ｐが配列番号１のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ’２がメトキシであり；Ｒ４が、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４がメチルであり；Ｒ６が−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＳＯ３Ｋである、請求項５７に記載のコンジュゲート（コンジュゲート１９）。
  105. 感光剤が式ＩＩのバクテリオクロロフィルであり、Ｍが２Ｈであり；ｍが０であり；Ｒ１がＮＨ−Ｐであり、Ｐが配列番号３のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ’２がメトキシであり；Ｒ４が、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４がメチルであり；Ｒ６が−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋである、請求項５５に記載のコンジュゲート（コンジュゲート２６）。
  106. 感光剤が式ＩＩのバクテリオクロロフィルであり、ＭがＰｄであり；ｍが０であり；Ｒ１がＮＨ−Ｐであり、Ｐが配列番号５のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ’２がメトキシであり；Ｒ４が、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４がメチルであり；Ｒ６が−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋである、請求項５５に記載のコンジュゲート（コンジュゲート３３）。
  107. 感光剤が式ＩＩのバクテリオクロロフィルであり、ＭがＰｄであり；ｍが０であり；Ｒ１がＮＨ−Ｐであり、Ｐが配列番号６のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ’２がメトキシであり；Ｒ４が、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４がメチルであり；Ｒ６が−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋである、請求項５５に記載のコンジュゲート（コンジュゲート３４）。
  108. 感光剤が式ＩＩのバクテリオクロロフィルであり、ＭがＰｄであり；ｍが０であり；Ｒ１がＮＨ−Ｐであり、Ｐが配列番号７のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ’２がメトキシであり；Ｒ４が、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４がメチルであり；Ｒ６が−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋである、請求項５５に記載のコンジュゲート（コンジュゲート３５）。
  109. 感光剤が式ＩＩのバクテリオクロロフィルであり、ＭがＰｄであり；ｍが０であり；Ｒ１がＮＨ−ＣＨ［（−（ＣＨ２）２−ＣＯ−ＮＨ−Ｐ］２であり、Ｐが配列番号８のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ’２がメトキシであり；Ｒ４が、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４がメチルであり；Ｒ６が−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｋである、請求項５５に記載のコンジュゲート（コンジュゲート３６）。
  110. 感光剤が式ＩＩのバクテリオクロロフィルであり、ＭがＰｄであり；ｍが０であり；Ｒ１がＮＨ−Ｐであり、Ｐが配列番号１のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ’２がメトキシであり；Ｒ４が、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４がメチルであり；Ｒ６が−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２ＯＨである、請求項５６に記載のコンジュゲート（コンジュゲート２３）。
  111. 感光剤が式ＩＩのバクテリオクロロフィルであり、Ｍが２Ｈであり；ｍが０であり；Ｒ１がＮＨ−Ｐであり、Ｐが配列番号１のＲＧＤ含有ペプチドの残基であり；Ｒ’２がメトキシであり；Ｒ４が、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４がメチルであり；Ｒ６が、−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−ＣＯ−ＤＴＰＡ（コンジュゲート４３）又はＧｄとのそのキレート錯体（コンジュゲート４４）である、請求項１３に記載のコンジュゲート。
  112. ＭがＰｄであり；Ｒ１がＣＯＯＨであり；Ｒ’２がメトキシであり；Ｒ４が、３位ではアセチルであり、８位ではエチルであり；Ｒ’４がメチルであり；Ｒ６が−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＯＨである、請求項１３に記載の式ＩＩのバクテリオクロロフィル（化合物１０）。
  113. 請求項１に記載の、ＲＧＤ含有ペプチド又はＲＧＤペプチド模倣体とポルフィリン、クロロフィル又はバクテリオクロロフィルから選択される感光剤のコンジュゲート及び製薬上許容される担体を含む薬剤組成物。
  114. 感光剤が請求項２から１２までのいずれか一項に記載のポルフィリンである、請求項１１３に記載の薬剤組成物。
  115. 感光剤が、請求項１３に記載の式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩのクロロフィル又はバクテリオクロロフィルである、請求項１１３に記載の薬剤組成物。
  116. 感光剤が式ＩＩのクロロフィルである、請求項１１５に記載の薬剤組成物。
  117. クロロフィルコンジュゲートがコンジュゲート１６、１７及び１８から選択される、請求項１１６に記載の薬剤組成物。
  118. 感光剤が式Ｉのバクテリオクロロフィルである、請求項１１５に記載の薬剤組成物。
  119. バクテリオクロロフィルＩのコンジュゲートがコンジュゲート１２、２７及び３２から選択される、請求項１１８に記載の薬剤組成物。
  120. 感光剤が式ＩＩＩのバクテリオクロロフィルである、請求項１１５に記載の薬剤組成物。
  121. バクテリオクロロフィルＩＩＩのコンジュゲートがコンジュゲート１９である、請求項１２０に記載の薬剤組成物。
  122. 感光剤が式ＩＩのバクテリオクロロフィルである、請求項１１５に記載の薬剤組成物。
  123. バクテリオクロロフィルＩＩがＲＧＤペプチドとコンジュゲートしている、請求項１２２に記載の薬剤組成物。
  124. バクテリオクロロフィルＩＩが配列番号１のＲＧＤペプチドとコンジュゲートしている、請求項１２３に記載の薬剤組成物。
  125. バクテリオクロロフィルＩＩのコンジュゲートがコンジュゲート１３、１５、２３、２８、２９、３０、３１、４３、及び４４から選択される、請求項１２４に記載の薬剤組成物。
  126. バクテリオクロロフィルＩＩコンジュゲートがコンジュゲート２４である、請求項１２４に記載の薬剤組成物。
  127. バクテリオクロロフィルＩＩが配列番号２〜８のペプチドから選択されるＲＧＤペプチドとコンジュゲートしている、請求項１２３に記載の薬剤組成物。
  128. バクテリオクロロフィルＩＩがコンジュゲート１１、２６、３３、３４、３５、及び３６から選択されるコンジュゲートである、請求項１２７に記載の薬剤組成物。
  129. バクテリオクロロフィルＩＩがＲＧＤペプチド模倣体とコンジュゲートしている、請求項１２２に記載の薬剤組成物。
  130. バクテリオクロロフィルＩＩがコンジュゲート４０及び４１から選択される、請求項１２９に記載の薬剤組成物。
  131. 光線力学的治療（ＰＤＴ）のための、請求項１１３から１３０までのいずれか一項に記載の薬剤組成物。
  132. 血管標的のＰＤＴ（ＶＴＰ）のための、請求項１３１に記載の薬剤組成物。
  133. 腫瘍のＶＴＰのための、請求項１３２に記載の薬剤組成物。
  134. 前記腫瘍が原発腫瘍又は黒色腫、結腸、乳房、肺、前立腺、脳若しくは頭頸部の癌からの転移である、請求項１３３に記載の薬剤組成物。
  135. 非新生物組織のＶＴＰのための、請求項１３２に記載の薬剤組成物。
  136. 加齢黄斑変性症を処置するための、請求項１３５に記載の薬剤組成物。
  137. 脂肪組織への血管供給を制限することによって肥満症を処置するための、請求項１３５に記載の薬剤組成物。
  138. 診断目的での、請求項１１３から１３０までのいずれか一項に記載の薬剤組成物。
  139. 器官及び組織の可視化のための、請求項１３８に記載の薬剤組成物。
  140. 腫瘍の診断のための、請求項１３８に記載の薬剤組成物。
  141. 感光剤中のＭが、２Ｈ又はＣｕ、Ｐｄ Ｇｄ、Ｐｔ、Ｚｎ、Ａｌ、Ｅｕ、Ｅｒ、Ｙｂ若しくはその同位体から選択される金属である、動的蛍光イメージングによる腫瘍診断のための、請求項１４０に記載の薬剤組成物。
  142. 感光剤中のＭが、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９９ｍＴｃ、６７Ｇａ、２０１Ｔｌ、１９５Ｐｔ、６０Ｃｏ、１１１Ｉｎ及び５１Ｃｒから選択される放射性同位体である、放射線診断技術による腫瘍診断のための、請求項１４０に記載の薬剤組成物。
  143. 前記放射線診断技術が陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）であり、Ｍが６４Ｃｕ又は６７Ｃｕである、請求項１４２に記載の薬剤組成物。
  144. 前記放射線診断技術が単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＴ）であり、Ｍが、９９ｍＴｃ、６７Ｇａ、１９５Ｐｔ、１１１Ｉｎ、５１Ｃｒ及び６０Ｃｏから選択される放射性同位体である、請求項１４２に記載の薬剤組成物。
  145. Ｍが、Ｍｎ３＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ３＋、Ｅｕ３＋、Ｇｄ３＋及びＤｙ３＋から選択される常磁性金属であるか、又は、感光剤が多座配位子の金属キレート錯体によって置換され、金属が本明細書中で既に定義したとおりである、分子磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）による腫瘍診断のための、請求項１４０に記載の薬剤組成物。
  146. Ｍが、１０３Ｐｄ、１９５Ｐｔ、１０５Ｒｈ、１０６Ｒｈ、１８８Ｒｅ、１７７Ｌｕ、１６４Ｅｒ、１１７ｍＳｎ、１５３Ｓｍ、９０Ｙ、６７Ｃｕ及び３２Ｐから選択される放射性同位体である、腫瘍の放射線療法のための、請求項１１３に記載の薬剤組成物。
  147. （ａ）腫瘍を有することが疑われる対象に、Ｍが、２Ｈであるか、又は、Ｃｕ、Ｐｄ Ｇｄ、Ｐｔ、Ｚｎ、Ａｌ、Ｅｕ、Ｅｒ、Ｙｂ又はその同位体から選択される金属である、請求項１から１１２までのいずれか一項に記載のコンジュゲートを投与するステップと；
    （ｂ）標準の手順によって対象を照射し、疑われる領域の蛍光を測定するステップであって、より高い蛍光が腫瘍部位を示すステップと
    を含む、動的蛍光イメージングによって腫瘍を診断する方法。
  148. （ａ）腫瘍を有することが疑われる対象に、Ｍが、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９９ｍＴｃ、６７Ｇａ、２０１Ｔｌ、１９５Ｐｔ、６０Ｃｏ、１１１Ｉｎ又は５１Ｃｒからなる群から選択される放射性同位体である、請求項１から１１２までのいずれか一項に記載のコンジュゲートを投与するステップと、
    （ｂ）対象をイメージングスキャナー内で走査し、疑われる領域の放射線レベルを測定するステップであって、増強した放射線が腫瘍部位を示すステップと
    を含む、放射線診断技術によって腫瘍を診断する方法。
  149. 前記放射線診断技術が陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）であり、Ｍが６４Ｃｕ又は６７Ｃｕである、請求項１４８に記載の方法。
  150. 前記放射線診断技術が単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＴ）であり、Ｍが９９ｍＴｃ、６７Ｇａ、１９５Ｐｔ、１１１Ｉｎ、５１Ｃｒ及び６０Ｃｏからなる群から選択される放射性同位体である、請求項１４８に記載の方法。
  151. （ａ）腫瘍を有することが疑われる対象に、Ｍが常磁性金属である、請求項１から１１２までのいずれか一項に記載のコンジュゲートを投与するステップと；
    （ｂ）前記投与の前に患者の体内の目的の標的領域の少なくとも１つのＭＲ画像、その後に１つ又は複数のＭＲ画像を作成することによって、患者を磁気共鳴画像法に供するステップと
    を含む、腫瘍診断のための分子磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）方法。
  152. （ａ）腫瘍を有することが疑われる患者に、Ｍが、Ｍｎ３＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ３＋、Ｅｕ３＋、Ｇｄ３＋及びＤｙ３＋から選択される常磁性金属である前記コンジュゲートを投与するステップと；
    （ｂ）０時点及びその後の２番目以降の時点でＭＲ画像を作成するステップと；
    （ｃ）データを処理及び分析して腫瘍の存在の有無を診断するステップと
    を含む、請求項１５１に記載のＭＲＩ方法。
  153. 感光剤−ペプチドのコンジュゲートを用いた蛍光イメージングによって腫瘍を診断する方法において、請求項１から１１２までのいずれか一項に記載のコンジュゲートを使用する改良方法。
  154. 感光剤−ペプチドのコンジュゲートを用いたＰＥＴ又はＳＰＥＴ走査によって腫瘍を診断する方法において、請求項１から１１２までのいずれか一項に記載のコンジュゲートを使用する改良方法。
  155. 感光剤−ペプチドのコンジュゲートを用いたＭＲＩによって腫瘍を診断する方法において、請求項１から１１２までのいずれか一項に記載のコンジュゲートを使用する改良方法。
  156. （ａ）必要としている個体に、請求項１から１１２までのいずれか一項に記載のコンジュゲートを投与するステップと；
    （ｂ）腫瘍の局所を照射するステップと
    を含む、腫瘍の光線力学的治療の方法。
  157. 感光剤−ペプチドのコンジュゲートを用いた光線力学的治療の方法において、請求項１から１１２までのいずれか一項に記載のコンジュゲートを使用する改良方法。
  158. 必要としている個体に、請求項１から１１２までのいずれか一項に記載のコンジュゲートを投与するステップを含み、Ｍが、１０３Ｐｄ、１９５Ｐｔ、１０５Ｒｈ、１０６Ｒｈ、１８８Ｒｅ、１７７Ｌｕ、１６４Ｅｒ、１１７ｍＳｎ、１５３Ｓｍ、９０Ｙ、６７Ｃｕ及び３２Ｐからなる群から選択される放射性同位体である、腫瘍の放射線療法の方法。
  159. 前記腫瘍が原発腫瘍又は黒色腫、結腸、乳房、肺、前立腺、脳若しくは頭頸部の癌からの転移である、請求項１４６から１５８までのいずれか一項に記載の方法。
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