PT2358737T - Peptidomiméticos que contêm rgd e utilizações dos mesmos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃOÃ PEPTIDOMIMÉTICOSÁQUEÁCONTÊMARGDÁEÂUTILIZAÇÕESÁDOSÂMESMOSÁ

CAMPOÁTÉCNICO A presente invenção refere-se a novos peptidomiméticos cíclicos que contêm arginina-glicina-ãcido aspãrtico (RGD) e utilizações dos mesmos, por exemplo, em diagnóstico e tratamento de cancro. Á Abreviaturas:Á AcOH,Á ácido acético; Alloc, aliloxi carbonilo; Bpheide,Á Bacteriofeoforbida; BTA, (BPheide taurina amida), S^oxo-lS-metoxi carbonilmetil- rodobacterioclorina 131-(2-sulfoetil) amida; BTC,Á Bis (triclorometil) carbonato; Dab,Áácido diaminobutírico; Dap,Á ácido diaminopropiónico,- DCM,Á diclorometano; Dde,Á 1 - (4,4-dimetil- 2,6-dioxociclohexilideno) etilo; DIC,Á di i sopropilcarbodi imida; DIEA, Á di i sopropilet ilamina; DMBA,Á ácido dimetilbarbitúrico; DMF,ÁN,N-dimetil formamida; DMSO,Á sulfóxido de dimetilo; DOTA, ácido 1,4,7,10- tetraazaciclododecano-1,4,7,10- tetraacético; DTPA,à ácido dietilenotriaminapentaacético; Et20, dietil éter; FITC,Á isotiocianato de fluoresceína; Fmoc,Á fluorenilmetoxicarbonilo; GABA,à ácido γ-aminobutírico; HATU, hexafluorofosfato de 0-(7-azabenzotriazol-l-il)- 1,1,3,3-tetrametil-urónio; HOAt,Á l-hidroxi-7- azabenzotriazol; HOBt ,ÁN-hidroxibenzotriazol; Lys,Á lisina,· MeOH,Á metanol; Nal,Á naftilalanina; Orn,Á ornitina; Pbf,Á 2,2,4,6,7-pentametil-dihidrobenzofurano-5-sulfonilo; PyBOP, hexafluorofosfato de benzotriazol-l-il-oxi-tris- pirrolidino-fosfónio; RP-HPLC,Á cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa; TA,Átemperatura ambiente; TFA, ácido trifluoroacético, TFE,à trifluoroetanol; TIS, triisopropilsilano.

ANTECEDENTESÁDAÁTÉCNICA O motivo de arginina-glicina-ácido aspártico (Arg-Gly-

Asp; RGD) de componentes de matriz extracelular (ECM) tais como fibronectina (Pierschbacher e Ruoslahti, 1984) e vitronectina liga-se a integrinas (Ruoslahti e Pierschbacher, 1987; D'Souza SE et al., 1991; Joshi et al, 1993; Koivunen et al., 1994). A adesão mediada por integrina leva a eventos de sinalização intracelular que regulam sobrevivência, proliferação e migração celular. Cerca de 25 integrinas são conhecidos, e pelo menos oito deles ligam-se o motivo de RGD como a sequência de reconhecimento primário nos seus ligandos.

Dados obtidos por métodos de apresentação em fago (Pasqualini e Ruoslahti, 1996) que rastreiam péptidos que contêm RGD têm mostrado sua ligação seletiva ao revestimento endotelial de vasos sanguíneos tumorais (Ruoslahti, 1996; Pasqualini et al., 1997).

Por causa da expressão de integrinas ser relatada como sendo alta em células endoteliais (ECs) ativadas, mas mais restrita em quiescentes, pequenos péptidos sintéticos que contêm RGD foram propostas como antagonistas que prejudicam o crescimento de células vasculares endoteliais e tumorais. Os péptidos de RGD também retardam a transmissão de sinal, afetam a migração celular e induzem regressão ou apoptose de célula tumoral (Su et al., 2002) . Análogos de RGD são usados em imagiologia de tumor (Haubner et al., 2001), abordagens de anti-angiogénese (Kawaguchi et al., 2001; Pasqualini et al., 2000) , e em ter como alvo o tumor de radionucleótidos (van Hagen et al., 2000) e fármacos quimioterápicos (Arap et al., 1998; Zitzmann et al., 2002) .

As integrinas são também expressas em células de cancro e desempenham um importante papel na invasão, metástase, proliferação e apoptose de células de cancro. A invasão metastática de células tumorais em órgãos preferidos pode representar fenómenos de homing das células que dependem da interação adesiva entre as células tumorais e marcadores endoteliais específicos a órgão (Ruoslahti e

Rajotte, 2000) . Através da ligação à integrina de células endoteliais ou tumorais, péptidos de RGD são capazes de modular o tráfego de células in vivo pela inibição de uniões de célula tumoral-ECM e célula tumoral-EC, que são obrigatórias para processos metastáticos. Diversos estudos têm indicado que compostos que contêm RGD podem interferir com processos metastáticos de célula tumoral in vitro (Goligorsky et al., 1998; Romanov e Goligorsky 1999) e in vivo (Saiki et al., 1989; Hardan et al., 1993).

Os péptidos que são específicos para integrinas individuais são de considerável interesse e de possível importância médica. A integrina ανβ3 foi a primeira integrina que se mostrou estar associada a angiogénese de tumor. Os péptidos de RGD que bloqueiam especificamente a integrina ανβ3 mostram-se prometedores como inibidores de angiogénese de tumor e retina, de osteoporose e em ter como alvo fármacos para a vasculatura tumoral (Assa-Munt et al., 2001) . 0 acoplamento do fãrmaco anticancro doxorubicina ou um péptido proapoptótico a um péptido de RGD que se liga a integrina ο:νβ3 produz compostos que são mais ativos e menos tóxicos que fármacos não modificados quando testados contra tumores de xenoenxerto em ratinhos (Ruoslahti, 2000; Arap et al. , 1998; Arap et al. , 2002; Ellerby et al., 1999). Consequentemente, uma grande quantidade de trabalhos foi investida em projetar e produzir péptidos e peptidomiméticos de ligação a integrina (Haubner et al., 1996; Locardi et al., 1999; Lark et al., 1999; Raboisson et al., 2006; Belvisi et al., 2005; Dijkgraaf et al., 2006; Banfi et al., 2007; documento US 5.849.692). 0 documento US 6.576.239, documento EP 0927045 e documento WO 98/010795 revelam um conjugado que compreende um péptido de homing de tumor que compreende a sequência de aminoácidos RGD ou NGR, o dito péptido ligado a uma fração terapêutica ou de diagnóstico, contanto que a dita fração não seja uma partícula de fago. A fração terapêutica pode ser um agente citotóxico ou um agente quimioterápico contra o cancro tal como doxorubicina. 0 conjugado seletivamente regressa (homes) à vasculatura angiogénica após a administração in vivo. 0 péptido de homing de tumor pode ser um péptido linear ou cíclico de até 20 ou 30 aminoãcidos ou de 50-100 aminoãcidos de comprimento. Um péptido preferido é o nonapéptido cíclico CDCRGDCFC ou H-Cys*-Asp-Cys*-Arg-Gly-Asp-Cys*-Phe-Cys*-NH2. 0 documento WO 2008/023378 revela um conjugado de um péptido que contém RGD ou um peptidomimético de RGD e um fotossensibilizador selecionado a partir de uma porfirina, uma clorofila ou uma bacterioclorofila.

SUMARIO DA INVENÇÃO

Num aspeto, a presente invenção refere-se a um peptidomimético cíclico que contém RGD da fórmula geral I: em que

o resíduo de arginina é ligado via seu grupo a-amino ao C=0 de estrutura principal; X é -NH-R-, -0-R-, ou -S-R-, em que R é um radical hidrocarbileno derivado de etano, eteno ou ciclopropano; e A], é um resíduo de aminoácido que carrega um grupo amino na sua cadeia lateral, ligado via seu grupo carboxilo à estrutura principal NH e via seu grupo amino de cadeia lateral ao grupo a-carboxilo do resíduo de ácido aspártico, o dito aminoácido é selecionado a partir de ácido diaminopropiónico (Dap), ornitina (Orn) ou lisina (Lys).

Num outro aspeto, a presente invenção refere-se a um conjugado do peptidomimético cíclico que contém RGD definido acima e uma fração de uma carga útil selecionada a partir de uma sonda fluorescente, um fotossensibilizador, um agente quelante ou um agente citotóxico, ligado ao grupo a-amino do resíduo de aminoácido A± no peptidomimético, opcionalmente via um espaçador.

Num aspeto adicional, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica que compreende um conjugado de um peptidomimético cíclico que contém RGD e uma fração de carga útil como definido acima, ou um farmaceuticamente aceitável sal do mesmo, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser usadas para vários propósitos, por exemplo, (i) para propósitos de diagnóstico, em particular, para a visualização de órgãos e tecidos e para o diagnóstico de tumores, quando a carga útil é uma sonda fluorescente; (ii) para terapêutica fotodinâmica (PDT), em particular, para PDT de tumores ou tecidos não neoplásicos, quando a carga útil é um fotossensibilizador; (iii) para radioimagiologia ou radioterapêutica, quando a carga útil é um agente quelante; e (iv) para quimioterapia direcionada, quando a carga útil é um agente citotóxico.

Em ainda um aspeto adicional, a presente invenção refere-se a um conjugado de um peptidomimético cíclico que contém RGD e uma fração de carga útil como definido acima, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo para propósitos de diagnóstico, terapêutica fotodinâmica (PDT), radioimagiologia ou radioterapêutica, ou quimioterapia direcionada.

BREVEÁDESCRIÇÃOÁDOSÁDESENHOS

As Figs.à 1A-1CÁmostram os padrões de acumulação dos conjugados 1,4Á e 41 (Referência) (IA, 1B e 1C, respetivamente) em tumor grande primário MDA-MB-231-RFP de mama humano ortotópico na almofada mamária de ratinhos nude CD-I. Os ratinhos foram tratados como descrito em Materiais e Métodos, e a fluorescência de ambas as células tumorais e o conjugado foi monitorizada a partir do dia 1 a 7 usando o sistema Xenograph IVIS® (escala de cor em unidades de fotão/s/cm2/esterradiano). 0 painel superior mostra os sinais fluorescentes gerados pelo tumor (imagiologia de fluorescência vermelha) e o painel inferior mostra o sinal fluorescente gerado pelo conjugado (imagiologia de fluorescência infravermelho próximo). A correspondência dos sinais gerados pelo tumor e pelo conjugado sugere a acumulação do conjugado nos tumores.

As Figs. Á2A- 2CÁmos t ram a acumulação dos conjugados 1,Á 4Áe 41Á (Referência) (2A, 2BÁe 2C,Árespetivamente) na área necrótica do tumor de cancro de mama. Os ratinhos foram tratados como descrito em Materiais e Métodos, e a fluorescência foi monitorizada seis dias após a injeção usando o sistema Xenograph IVIS® (escala de cor em unidades de fotão/s/cm2/esterradiano). Como mostrado, a área necrótica na parte central do tumor extingue fluorescência vermelha (painel esquerdo), mas mostra acumulação do conjugado (painel direito).

As Figs.Á3A-3CÁmostram a acumulação dos conjugados 1,4Á e 41Á (Referência) (3A, 3BÁ e 3C,Á respetivamente) em tumor de cancro de próstata LNCaP em comparação com tumor de ovário MLS. Os ratinhos foram tratados como descrito em Materiais e Métodos, e a acumulação do conjugado no tumor implantado foi monitorizado em certos pontos de tempo (8, 11, 14, 24 e 48 h para o conjugado 1;Á8, 14, 24 e 48 h para o conjugado 4; e 8, 12 e 24 h para o conjugado 41) após a injeção usando o sistema Xenograph IVIS®. Os perfis de acumulação dos conjugados em tumores de próstata (painel superior) e de ovário (painel inferior) foram quase os mesmos, em que em ambos casos, o nível fluorescente mais alto foi observado a 8-11 (conjugado 1), 8-14 (conjugado 4) ou 8-12 (conjugado 41Á (Referência) ) h após injeção e o conjugado permaneceu no tumor até 48 h no caso dos conjugados 1Á e 4,Á ou 24 h no caso do conjugado 41Á (Referência). A seta na imagem esquerda superior mostra o lugar do tumor de próstata. A imagem direita em cada painel mostra os órgãos excitados 14 h após injeção, em que o nível fluorescente alto observado no fígado e rim sugere a depuração do conjugado através destes órgãos.

MODOSÁPARAÁLEVARÂAACABOÂAAINVENÇÃO

Num aspeto, a presente invenção proporciona novos peptidomiméticos cíclicos que contêm arginina-glicina-ãcido aspártico (Arg-Gly-Asp; RGD), que são ligandos de integrina ανβ3 e ανβ5, como definido acima.

Os termos "peptidomimético cíclico que contém RGD", "peptidomimético cíclico" e "ligando de integrina ανβ3 e ανβ5" usados no presente documento de maneira intercambiável referem-se a um composto não peptídico cíclico que contém a sequência de RGD, também denominada como o motivo de RGD, que mimetiza péptidos que têm o motivo de RGD. 0 peptidomimético cíclico da presente invenção pode ser qualquer composto cíclico que tem a fórmula geral I, como definido acima.

Como mostrado em pormenores no EsquexnaÃlÃa seguir no presente documento, o peptidomimético cíclico que contém RGD da fórmula geral I é um composto cíclico que contém o motivo de RGD, em que um resíduo de um aminoácido que tem um grupo amino de cadeia lateral (Ai) é ligado por ligações de amida, via seu grupo amino de cadeia lateral ao grupo a-carboxilo do resíduo de ácido aspártico no motivo de RGD num lado, e via seu grupo carboxilo a uma estrutura principal NH no outro lado, e a dita estrutura principal NH é ligado ao grupo α-amino do resíduo de arginina no motivo de RGD via várias unidades de ligação em ponte possíveis. 0 termo "hidrocarbileno" refere-se a um radical divalente que contém somente átomos de carbono e hidrogénio que pode ser saturado ou insaturado, cíclico ou acíclico, que pode ser derivado de etano, eteno ou ciclopropano.

EsquemaÁl:ÁEstruturas pormenorizadas do peptidomimético cíclico da fórmula qeral I

No grupo NHR, R é um hidrocarbileno como definido acima. 0 termo "aminoácido" refere-se a ambos aminoácidos natural e não natural nos seus estereoisómeros L e D, e inclui aminoácidos que têm um grupo amino de cadeia lateral, mais particularmente lisina (Lys), ácido diaminopropiónico (Dap) e ornitina (Orn).

Numa forma de realização, o peptidomimético cíclico que contém RGD da presente invenção é um composto cíclico da fórmula geral I, em que X é -NH-R-, isto é, uma fração de ureia ê formada com o grupo a-amino do resíduo de arginina, e R é um hidrocarbileno derivado de etano, eteno ou ciclopropano.

Numa outra forma de realização, o peptidomimético cíclico que contém RGD da presente invenção é um composto cíclico da fórmula geral I, em que X é -0-R-, isto é, uma fração de carbamato é formada com o grupo a-amino do resíduo de arginina, e R é um hidrocarbileno derivado de etano, eteno ou ciclopropano.

Em ainda uma outra forma de realização, o peptidomimético cíclico que contém RGD da presente invenção é um composto cíclico da fórmula geral I, em que X é -S- ou -S-R-, isto é, uma fração de carbamotio é formada com o grupo a-amino do resíduo de arginina, e R é um hidrocarbileno derivado de etano, eteno ou ciclopropano.

Os peptidomiméticos cíclicos que contêm RGD da presente invenção podem ser preparados por qualquer método conhecido na especialidade, por exemplo, como descrito em Materiais e Métodos a seguir no presente documento.

Em certas formas de realização preferidas, o peptidomimético cíclico que contém RGD da presente invenção é um composto cíclico da fórmula geral I, em que X é -NH-R-, R é um hidrocarbileno derivado de etano e Ai, é Dap, Orn ou Lys.

Noutras formas de realização preferidas, o peptidomimético cíclico que contém RGD da presente invenção é um composto cíclico da fórmula geral I, em que X é -NH-R-, R é um hidrocarbileno derivado de ciclopropano e Αχ é Orn.

Em formas de realização adicionais preferidas, o peptidomimético cíclico que contém RGD da presente invenção é um composto cíclico da fórmula geral I, em que X é -0-R-, R é um hidrocarbileno derivado de etano e Αχ é Dap ou Lys.

Os ligandos de integrina ανβ3 e ανβδ da presente invenção acumulam-se em tumores que expressam ανβ3 e ανβ5 tal como carcinoma de ovário, cancro de cólon, mama e próstata, e portanto podem ser usados em ambos métodos de diagnóstico e terapêuticos por conjugação a várias frações de "carga útil".

Num outro aspeto, a presente invenção assim refere-se a um conjugado de um peptidomimético cíclico que contém RGD definido acima, isto é, um peptidomimético cíclico da fórmula geral I, e uma fração de uma carga útil selecionada a partir de uma sonda fluorescente, um fotossensibilizador, um agente quelante ou um agente citotóxico, ligado ao grupo α-amino do resíduo de aminoãcido A], no peptidomimético opcionalmente via um espaçador.

Numa forma de realização, a fração de carga útil do conjugado é ligado diretamente ao resíduo de aminoãcido A:1. do peptidomimético cíclico.

Numa outra forma de realização, a fração de carga útil é ligado ao resíduo de aminoãcido Ai do peptidomimético cíclico via um espaçador. 0 espaçador que liga a fração de carga útil ao resíduo de aminoãcido Αλ no peptidomimético cíclico da presente invenção pode ser selecionado a partir de uma fração de um aminoãcido natural ou não natural, uma fração de um péptido pequeno que tem não mais de 8 aminoácidos, um resíduo de diamina, um Ci-C25 hidrocarbileno, ou um polímero solúvel.

Numa forma de realização, o espaçador é uma fração de um aminoãcido natural ou não natural tal como Gly, β-alanina (β- Ala), Phe, D-Phe, 1-naftilalanina (1-Nal), D-l-naftilalanina (D-l-Nal), ácido γ-aminobutírico (GABA) e ácido 3-(aminometil) benzoico. Estes espaçadores são ligados via seu grupo a-carboxilo ao grupo a-amino de Ai e via seu grupo a- amino a um grupo carboxilo da carga útil.

Numa outra forma de realização, o espaçador é uma fração de um péptido pequeno que tem não mais de oito aminoácidos. Estes espaçadores são ligados via seu grupo carboxilo C-terminal ao grupo a-amino de A± e via seu grupo amino N-terminal a um grupo carboxilo da carga útil.

Numa forma de realização adicional, o espaçador é um resíduo de diamina da fórmula geral -HN-R'-NH-, em que R' está ausente ou é um radical divalente que contém somente átomos de carbono e hidrogénio que pode ser saturados ou insaturado, linear ou ramificado, cíclico ou acíclico, ou aromático, que pode ser derivado de um Ci-Ci2 alcano, um C2-C12 alceno, um C2-Ci2 alcino, um C3”C10 cicloalcano, um C3-C10 cicloalceno, um hidrocarboneto CS-C;L4 mono- ou policíclico aromático, ou um hidrocarboneto Cs-Ci4 mono- ou policíclico aromático substituído por um ou dois C:L-C2 alquilo, C2 alcenilo ou C2 alcinilo. Exemplos de diaminas das quais tais resíduos podem ser derivados incluem hidrazina, 1,2-etilenodiamina, 1,3-propilenodiamina, 1,4- diaminobutano, 1,5-diaminopentano, 1,6-diaminohexano, 1,7-diaminoheptano, 1,8-diaminooctano, 1,9-diaminononano, 1,5-diaminodecano, 1,11-diaminoundecano, 1,12-diaminododecano, p-fenilenodiamina, ciclopentano 1,3-diamina, ciclohexano 1,4-diamina, cicloheptano 1,4-diamina, ciclooctano 1,5-diamina, naftaleno-2,β-diamina e 9H-fluoreno-3-6-diamina.

Em ainda uma outra forma de realização, o espaçador é um Οχ-C25 hidrocarbileno, preferentemente um Ci-Ci0 alquileno ou fenileno, substituído por dois grupos funcionais terminais através dos quais o espaçador é ligado ao a-amino do aminoãcido Αχ do peptidomimético cíclico por um lado, e à fração de carga útil por outro lado. Tais grupos funcionais terminais podem ser selecionados a partir de OH, COOH, S03H, COSH ou MH;., assim formando um grupo éter, éster, amida, ureia, tioamida ou sulfonamida.

Em ainda uma outra forma de realização, o espaçador é um polímero solúvel tal como polietileno glicol de cadeia linear ou ramificada (PEG) ou copolímeros do mesmo, polilãctido (PLA) ou copolímeros do mesmo, poliésteres que têm grupos funcionais adequados com base em PLA, poliglicolido (PGA), policaprolactona (PCL), ou seus copolímeros, ou poliamidas com base em polimetacrilamida ou seus copolímeros, os ditos polímeros tendo grupos funcionais adequados para os quais se liga ao resíduo de aminoácido Ai do peptidomimético cíclico e à fração de carga útil, os ditos grupos funcionais sendo, por exemplo, hidroxi, amino, carboxilo, mercapto, grupo de ácido sulfónico. 0 Exemplo 1 a seguir no presente documento descreve a síntese de vários conjugados, identificados no presente documento pelos números arábicos 1-36Á em negrito, em que diferentes ligandos de integrina ανβ:3 e ανβ5 da fórmula geral I são ligados diretamente ou via um espaçador a uma sonda fluorescente, em particular, BTA, FITC ou dansilo; um derivado de bacterioclorofila, em particular, Pd-BTA; ou um agente quelante, em particular, DTPA ou DOTA. A lista dos conjugados preparados, bem como suas caraterísticas estruturais, é sumarizada no QuadroÁ 1. 0 Exemplo de Referência 2 descreve a síntese de vários conjugados, identificados no presente documento pelos números arábicos 41-48Á (Referência) em negrito, em que diferentes ligandos de integrina ανβ3 e ανβ5 da fórmula geral II são ligados diretamente a uma fração da sonda fluorescente BTA como uma carga útil modelo. A lista dos conjugados preparados, bem como suas caraterísticas estruturais, é sumarizada no QuadroÁ 2.Á As estruturas químicas das várias frações de carga útil usadas, quando ligadas a um peptidomimético cíclico, são representadas no EsquemaÁ2.

Os conjugados 1-36Á foram testados para ligação às células de carcinoma de ovário humano MLS, usando ambos ensaio de ligação de integrina in vitro e modelo de carcinoma de ovário in vivo. Alguns destes conjugados foram testados para ligação à célula de carcinoma de cólon humano HT29 também, ambos in vivo e in vitro, e os conjugados lÁe 4Âforam testados ainda para ligação às células de cancro de próstata LNCaP, ambos in vitro e in vivo. Os conjugados 41-48Ά (Referência) foram testados para ligação às células de carcinoma de ovário humano MLS, usando ensaio de ligação de integrina in vitro, e os conjugados ativos foram testados usando um modelo de carcinoma de ovário in vivo também. Os conjugados 41Á(Referência) e 42Á(Referência) foram testados para ligação às células de carcinoma de cólon humano HT29, ambos in vivo e in vitro, e o conjugado 41Á(Referência) foi testado ainda para ligação às células de cancro de próstata LNCaP, ambos in vitro e in vivo.

Ao rastrear a atividade biológica de diferentes conjugados com base em peptidomiméticos cíclicos que contêm RGD da fórmula geral I, descobriu-se que certas caraterísticas estruturais do peptidomimético cíclico, isto é, o tamanho de anel do composto cíclico e o tamanho e estrutura do resíduo de diamina presente em alguns dos compostos cíclicos, bem como o espaçador que liga o composto cíclico e a fração de carga útil, pode afetar a atividade biológica do conjugado como descrito a seguir no presente documento. 0 Exemplo 3 a seguir no presente documento mostra a atividade biológica de vários conjugados de sonda fluorescente que compreendem peptidomiméticos cíclicos da fórmula geral I com diferentes tamanhos de anel. 0 tamanho de anel do peptidomimético cíclico foi alterado por meio da alteração de dois parâmetros estruturais do composto cíclico, em particular, (i) o resíduo de aminoácido ligado via seu grupo α-carboxilo ou de cadeia lateral à estrutura principal NH e via seu grupo a-amino ou de cadeia lateral ao grupo a-carboxilo do resíduo de ácido aspártico, isto é, Ai na fórmula geral I; e (ii) o radical que une por ponte o carbonilo de estrutura principal e a estrutura principal NH, isto é, radical X na fórmula geral I. Os resíduos específicos de aminoácido Ai usados foram os resíduos de Dap, Dab (Referência) , Orn ou Lys, que têm uma a quatro unidades de metileno na cadeia lateral, respetivamente; e os diferentes radicais X usados foram -NH- (Referência), -NH (CH2) 2-4- e -NH (CH2) 6 -, que, juntamente com a estrutura principal NH, formam uma fração de hidrazina ou uma certa alquildiamina. Como particularmente mostrado, a atividade biológica dos conjugados testados aumentou com o aumento do tamanho de anel do peptidomimético cíclico de 16 átomos a 19-20 átomos; no entanto, diminuiu com o aumento adicional do tamanho de anel. Estes resultados indicam que enquanto que a ligação de ureia que une por ponte o grupo α-amino do resíduo de arginina e radical X torna o composto cíclico mais rígido, um anel maior que tem até 19-20 átomos é mais flexível para adotar a conformação desejada para ligação à integrina. Por outro lado, em casos em que o tamanho de anel do peptidomimético cíclico é maior que 20 átomos, o composto cíclico provavelmente não pode adotar a conformação desejada para ligação à integrina. 0 Exemplo 4 mostra a atividade biológica de vários conjugados de BTA que compreendem peptidomiméticos cíclicos da fórmula geral I que têm diferentes resíduos de diamina ligados por ligações de amida ao grupo a-carboxilo ou de cadeia lateral do resíduo de aminoácido A1( e, via a estrutura principal C=0, ao grupo a-amino do resíduo de arginina. Os conjugados específicos testados foram tais em que o resíduo de aminoácido Ai é Orn, a fração de BTA é diretamente ligada ao N-terminal do anel peptidomimético, e o radical designado X é um radical da fórmula - NH(CH2)2-4“/ 1,3-dimetilbenzeno- 1,3-diilo ou piperidina-l,4-diilo. Como particularmente mostrado, a atividade biológica dos conjugados em que um resíduo de alquildiamina está a unir por ponte Ai e a estrutura principal C=0 diminuiu com o aumento do comprimento da cadeia de alquilo. Além disso, em casos em que o radical designado X tenha sido derivado de m-xileno ou piperidina, nenhuma atividade biológica foi medida, indicando que os anéis peptidomiméticos em tais conjugados são rígidos e adotam uma conformação indesejável para a interação com a integrina. 0 Exemplo 5 mostra a atividade biológica de vários conjugados de sonda fluorescente que compreendem peptidomiméticos cíclicos da fórmula geral I que têm diferentes espaçadores que ligam o N-terminal do peptidomimético cíclico e a fração de sonda fluorescente. Os espaçadores específicos usados foram frações de diferentes aminoácidos naturais ou não naturais, em particular, Gly, β-Ala, Phe, D-Phe, 1-Nal, D-l-Nal, GABA e ácido 3 -(aminometil) benzoico, ou resíduos de diferentes diaminas, em particular, 1,2-etilenodiamina e 1,4-diaminobutano. Como mostrado, os conjugados de BTA em que a fração de sonda fluorescente é diretamente ligada ao peptidomimético cíclico mostraram alta atividade biológica, provavelmente, porque a fração de BTA não interfere com a ligação do composto cíclico à integrina. Ao contrário disso, os conjugados em que frações de Gly ou β-Ala foram usadas como espaçadores, que têm uma distância aumentada entre o peptidomimético cíclico e a fração de BTA, mostraram atividade mais baixa, provavelmente devido ao volume da fração de BTA. De maneira interessante, quando a distância entre o peptidomimético cíclico e a fração de BTA foi aumentada ainda mais usando uma fração de GABA como um espaçador, a atividade biológica do conjugado foi maior que essa dos conjugados em que frações de Gly ou β-Ala foram usadas como espaçadores, possivelmente indicando que GABA é longo o suficiente para dar mais liberdade ao peptidomimético cíclico de ligar-se à integrina; no entanto, não longo demais para causar a dobragem da fração de BTA sobre o anel peptidomimético. Nos casos em que FITC e dansilo, que são menores que BTA, forem usados, a distância entre a fração de sonda fluorescente e o N-terminal do peptidomimético cíclico não tinha influência sobre a atividade biológica do conjugado. Como mostrado ainda, os conjugados de BTA em que frações de Phe, 1-Nal, D-Phe ou D-1-Nal foram usadas como espaçadores foram mais ativos que o conjugado correspondente em que uma fração de Gly foi usada, provavelmente, por causa da cadeia lateral aromática de fenilalanina ou naftilalanina, que proporciona interação com um bolso hidrofóbico da integrina. É digno de nota que a atividade biológica do conjugado em que uma fração de D-Phe foi usada como um espaçador foi maior que essa dos conjugados em que frações de Phe ou 1-Nal foram usadas, indicando que a configuração D pode ajustar o bolso hidrofóbico da integrina melhor que a configuração L. D-1-

Nal é menos reativo que D-Phe, indicando que o anel fenilo se ajusta no bolso hidrofóbico melhor que o naftilo. Deveria ser notado que os conjugados 32Áe 33,Áem que os resíduos de 1,2-etilenodiamina ou 1,4-diaminobutano, respetivamente, foram usados como espaçadores e uma ligação de ureia é formada entre o peptidomimético cíclico e o espaçador, tiveram atividade biológica similar a essa dos conjugados lOÁe 11,Á indicando que a ligação de ureia tem quase a mesma atividade que a ligação de amida e não influencia a conformação do peptidomimético. A forte atividade biológica do conjugado 33,Áem comparação com essa do conjugado 32,Á pode ser devido à distância de quatro unidades de metileno entre o anel peptidomimético e a fração de carga útil, que dã mais liberdade ao anel peptidomimético para interagir com o local de ligação da integrina.

Por outro lado, o Exemplo 6 mostra que conjugados de BTA que compreendem peptidomiméticos cíclicos da fórmula geral I em que uma fração de ureia é formada com o a-amino do resíduo de arginina tiveram uma atividade biológica similar a essa dos conjugados correspondentes em que uma fração de carbamato é formada, indicando que a natureza da fração formada com o a-amino do resíduo de arginina não tem efeito sobre a atividade biológica do conjugado. 0 Exemplo 7 descreve a síntese de quatro conjugados de derivado de bacterioclorofila não metalado identificados no presente documento pelos números arábicos 37-40,Á que consistem em diferentes ligandos de integrina ανβ3 e ανβ5 da fórmula geral I ligados diretamente a uma fração de derivado de BTA em que a taurina foi substituída por um nucleófilo diferente. Como mostrado, a atividade biológica destes conjugados, medida usando um ensaio de ligação de integrina in vitro, foi similar, indicando que nestes casos, o grupo amino não tem efeito sobre a atividade biológica e seu comportamento é quase o mesmo que esse do sulfonato na taurina.

Ao rastrear a atividade biológica de diferentes conjugados com base em peptidomiméticos cíclicos que contêm RGD da fórmula geral II, descobriu-se que certas caraterísticas estruturais do peptidomimético cíclico, isto é, o tamanho de anel do composto cíclico e as caraterísticas do resíduo de aminoácido A2, podem afetar a atividade biológica do conjugado como descrito a seguir no presente documento.

Os Exemplos de Referência 8-9 a seguir no presente documento mostram a atividade biológica de vários conjugados de BTA que compreendem peptidomiméticos cíclicos da fórmula geral II com tamanho de anel diferente. 0 tamanho de anel do peptidomimético cíclico foi alterado por meio da alteração de dois parâmetros estruturais do composto cíclico, em particular, (i) o resíduo de aminoácido ligado ao grupo a- carboxilo do resíduo de ácido aspártico e ao grupo carboxilo de A2, isto é, o resíduo de aminoácido A3; e (ii) o resíduo de aminoácido ligado via seu grupo a-amino ao C=0 de estrutura principal e via seu grupo a-carboxilo ao resíduo de aminoácido A3, isto é, o resíduo de aminoácido A2. Com a finalidade de estudar o efeito de A3 sobre a atividade de conjugado, os conjugados de BTA que têm os mesmos resíduos de aminoácido Ai e A2, mas resíduo de aminoácido A3 diferente, em particular, Dap, Dab, Orn e Lys, que têm uma a quatro unidades de meti leno na cadeia lateral, respetivamente, foram testados. Do mesmo modo, com a finalidade de estudar o efeito de A2 sobre a atividade de conjugado, os conjugados de BTA que têm os mesmos resíduos de aminoácido Ai e A3, mas resíduo de aminoácido A2 diferente, em particular, Phe, Vai, D-Phe, Gly e Asp, foram testados. Como mostrado no Exemplo 8, a atividade biológica dos conjugados testados diminuiu com o aumento do tamanho de anel do peptidomimético cíclico de 20 átomos a 23 átomos, indicando que o tamanho de anel ótimo é de 20 átomos e que tamanhos de anel maiores não se ajustam ao local de ligação da integrina. O Exemplo 9 mostra que a atividade biológica dos conjugados com um resíduo de aminoãcido A2 hidrofóbico foi maior que essa dos conjugados que são mais polares, possivelmente devido às interações hidrofóbicas com o bolso hidrofóbico no local de ligação da integrina, e sugere ainda que a configuração D não se ajusta completamente ao bolso hidrofóbico. 0 Exemplo 10 mostra o nível de ligação competitiva de certos conjugados da presente invenção à integrina ανβ5 humana, usando um ensaio in vitro, e especificamente demonstra que os conjugados 1,Á4,Á7,Á28Âe 41Á(Referência) , que têm quantitativamente a mesma ligação in vitro, são mais ativos que os conjugados 5Ae 11. 0 Exemplo 11 descreve um estudo em que os padrões de acumulação dos conjugados 1,Â4Áe 41Ά(Referência) em tumores grandes de cancro de mama foram monitorizados a partir do dia 1 a 7 após a injeção. Como mostrado, estes conjugados acumularam na área necrótica do tumor, indicando que os conjugados da presente invenção podem ser usados para utilizações de diagnóstico uma vez que a deteção de núcleos necrõticos é um importante marcador de prognóstico em vários tipos de cancro, por exemplo, cancro de mama, e a deteção de margens de tumor é essencial para a remoção total do tumor. O Exemplo 12 descreve um estudo em que os padrões de acumulação dos conjugados 1,Á 4, e 41Á (Referência) em células de cancro de próstata que expressa integrina ανβ3 foram monitorizados até 2 dias após a injeção. Como mostrado, o nível fluorescente mais alto foi observado na área de tumor a 8 a 11-14 h após injeção, e o conjugado permaneceu no tumor durante até 48 h nos casos dos conjugados 1Á e 4,Á e até 24 h no caso do conjugado 41Á (Referência). Como mostrado ainda, os perfis de acumulação destes conjugados em tumores de próstata e de ovário foram quase os mesmos. 0 Exemplo 13 descreve um estudo de toxicidade dos conjugados 1,4Á e 41Á (Referência) , que mostra que 5 dias após injeção dos ditos conjugados, numa dose de 50 mg/kg, nenhuma evidência de necrose ou inflamação no fígado ou no rim foi observado, sugerindo que estes conjugados não são tóxicos na dose testada.

Em vista de tudo o que foi mencionado acima, numa forma de realização, a fração de carga útil do conjugado da presente invenção é uma fração de uma sonda fluorescente tal como BTA, FITC, dansilo, rodamina, eosina e eritrosina.

Em formas de realização preferidas, o conjugado da presente invenção é um conjugado do peptidomimético cíclico que contém RGD da fórmula geral I e uma fração de uma sonda fluorescente, em que a dita sonda fluorescente é BTA, ligada diretamente a A1( X é -NH-R-, R é um hidrocarbileno derivado de etano, e A1( é Dap, Orn, ou Lys (identificados no presente documento como conjugados 1, 4 e 5, respetivamente).

Noutras formas de realização preferidas, o conjugado da presente invenção é um conjugado do peptidomimético cíclico que contém RGD da fórmula geral I e uma fração de uma sonda fluorescente, em que a dita sonda fluorescente é dansilo, ligado diretamente a A:L, X é -NH-R-, R é um hidrocarbileno derivado de etano, e Ai é Dap, Orn ou Lys (identificados no presente documento como conjugados 19, 18 e 16, respetivamente).

Em formas de realização adicionais preferidas, o conjugado da presente invenção é um conjugado do peptidomimético cíclico que contém RGD da fórmula geral I e uma fração de uma sonda fluorescente, em que a dita sonda fluorescente é BTA, ligado diretamente a Alf X é -0-R-, R é um hidrocarbileno derivado de etano, e A± é Dap ou Lys (identificados no presente documento como conjugados 7Ãe 8, respetivamente).

Em ainda outras formas de realização preferidas, o conjugado da presente invenção é um conjugado do peptidomimético cíclico que contém RGD da fórmula geral I e uma fração de uma sonda fluorescente, em que a dita sonda fluorescente é BTA, ligado via um espaçador a Αχ, X é -NH-R-, R é um hidrocarbileno derivado de etano, A1 é Dap, e o espaçador é uma fração de GABA ou D-Phe, ou um resíduo de 1,4-diaminobutano (identificados no presente documento como conjugados 11, 28 e 33, respetivamente).

Em ainda formas de realização adicionais preferidas, o conjugado da presente invenção ê um conjugado do peptidomimético cíclico que contém RGD da fórmula geral I e uma fração de uma sonda fluorescente, em que a dita sonda fluorescente é FITC, ligado via um espaçador a Αχ, X é -NH-R-, Ré um hidrocarbileno derivado de etano, e (a) Ai é Dap, e o espaçador é uma fração de β-Ala (identificado no presente documento conjugado 12) ; ou (b) Αχ é Lys, e o espaçador é uma fração de β-Ala ou GABA (identificados no presente documento como conjugados 13 e 14, respetivamente).

Em ainda formas de realização adicionais preferidas, o conjugado da presente invenção é um conjugado do peptidomimético cíclico que contém RGD da fórmula geral I e uma fração de uma sonda fluorescente, em que a dita sonda fluorescente é dansilo, ligado via um espaçador a Αχ, X é -NH-R-, R é um hidrocarbileno derivado de etano, Αχ é Dap ou Lys, e o espaçador é uma fração de Gly (identificados no presente documento como conjugados 20 e 17, respetivamente). A terapêutica fotodinâmica (PDT) é um tratamento não cirúrgico de tumores em que fármacos não tóxicos, chamados agentes fotossensibilizadores, são administrados juntamente com luz para gerar espécies de oxigénio reativo citotõxico in situ, que podem inativar as células. Ao ser uma modalidade de tratamento binário, PDT proporciona uma maior especificidade e tem o potencial de ser mais seletivo, apesar disso não menos destrutivo, ao comparar com quimioterapia ou radioterapia comummente usada.

As porfirinas foram utilizadas como os agentes fotossensibilizadores primários em clínicas. Ótima penetração de tecido pela luz aparentemente ocorre entre 650-800 nm. Porfímero de sódio (Photofrin®, Axcan Pharma Inc.) é uma mistura complexa e inseparável de monómeros, dímeros, e oligómeros de cadeia mais alta obtidos a partir de hematoporfirina-IX pelo tratamento com ácidos que tem recebido a aprovação da FDA para o tratamento de cancros de pulmão de célula não pequena endobrônquica e esofágica.

Devido à sua absorção intensa em regiões espetrais favoráveis (650-850 nm) e sua pronta degradação após tratamento, derivados de clorofila e bacterioclorofila foram identificados como excelentes sensibilizadores para PDT de tumores e como tendo propriedades superiores em comparação com porfirinas. Em particular, bacterioclorofilas são de potencial vantagem em comparação com as clorofilas uma vez que mostram bandas intensas de infravermelho próximo, isto é, em comprimentos de onda consideravelmente mais longos que os derivados de clorofila.

Ter como alvo os reagentes fotodinâmicos para a destruição da vasculatura de tumor, ao contrário das células tumorais por si mesmas, pode oferecer vantagens terapêuticas uma vez que o crescimento e desenvolvimento de célula tumoral dependem criticamente de fornecimento de contínuo oxigénio e nutriente. Além disso, ter como alvo a camada de célula endotelial vascular de tumor (EC) é esperado evitar a fraca penetração de estroma de tumor pelas macromoléculas terapêuticas. Embora os vasos sanguíneos tumorais pudessem ser afetados pelo microambiente de tumor e adquirir uma "assinatura" associada a tumor, não são malignos e é menos provável que desenvolvam resistência a fãrmaco. Além disso, quando um agente antivascular alvo é também ativo contra as células tumorais, ganhos adicionais em eficácia podem ser esperados. Assim, por meio da combinação de propriedades antivasculares com atividades citotóxicas antitumorais num fãrmaco, pode-se esperar que a sua eficácia aumente e a dose citotóxica eficaz requerida pode, consequentemente, diminuir. 0 direcionamento vascular seletivo pode basear-se na suscetibilidade diferencial e consequente resposta aos agentes terapêuticos de vasos sanguíneos de tumor e normais. Alternativamente, a endocitose diferencial pode promover a absorção seletiva de agentes terapêuticos citotóxicos ou outros agentes terapêuticos. As integrinas ανβ3, (Χνβ5 e α5βι foram identificadas em padrões de expressão típicos para células endoteliais vasculares angiogénicas associadas, por exemplo, a tumores.

Estratégias diferentes foram perseguidas para atingir esta meta. Péptidos, peptidomiméticos ou anticorpos em circulação que têm como alvo locais específicos na vasculatura são atrativos como veículos para agentes terapêuticos e de diagnóstico que oferecem vantagens teóricas sobre tais conjugados que têm como alvo diretamente células tumorais, principalmente situadas além das barreiras fisiológicas tais como a parede de vaso sanguíneo.

Chaleix et ai. (2003) revelam a síntese de conjugados de RGD-porfirina como candidatos potenciais para aplicação de PDT, em que o macrociclo de porfirina não metalado é substituído em cada uma das posições 10, 15, 20 por 4-metilfenilo ou acetilatedglucosiloxifenilo e na posição 5 por um resíduo de um péptido linear que contém RGD ligado ao macrociclo via um braço de espaçador.

Numa outra forma de realização, a fração de carga útil do conjugado da presente invenção é assim uma fração de um fotossensibilizador tal como uma porfirina, uma clorofila ou uma bacterioclorofila. É um objeto da presente invenção proporcionar conjugados de fotossensibilizador que têm como alvo especificamente o sensibilizador à vasculatura de tumor. Existem algumas vantagens para ter como alvo o fotossensibilizador vascular sobre o direcionamento vascular com quimioterapia convencional. Primeiro, durante a acumulação de um fármaco convencional alvo, é com frequência ativo, a não ser que seja um profármaco, enquanto o fotossensibilizador alvo não é ativo até estar localmente iluminado. Segundo, um fármaco convencional alvo irá ligar-se e atuará também nos alvos indesejáveis que apresentam o endereço de homing enquanto que o fotossensibilizador alvo será ativado somente no local iluminado relevante. Além disso, PDT com fotossensibilizadores tidos como alvo para as assinaturas endoteliais neovasculares em tumor pode ser notavelmente seletivo na indução de lesão de célula endotelial fotodinãmica.

Uma vez que se relatou que a integrina ανβ3 desempenha um papel importante em metástase e angiogénese de tumor, que envolvem o crescimento de novos vasos sanguíneos de vasculaturas pré-existentes durante o crescimento tumoral, pode ser um marcador viável para o crescimento e espalhamento tumoral. Portanto, métodos de imagiologia não invasivos para a monitorização visual de expressão de integrina ανβ3 em tempo real proporcionam oportunidades para avaliar a intervenção terapêutica bem como para a deteção de metástase.

As integrinas ligam o citoesqueleto intracelular de células com a matriz extracelular por meio do reconhecimento do motivo de RGD. Os péptidos de RGD interagem com os locais de recetor de integrina, que podem iniciar processos de sinalização celular e influenciam muitas doenças diferentes. Assim, a local de ligação de RGD de integrina é um atrativo alvo farmacêutico. A integrina c*vp3 tem um local de ligação a RGD e péptidos ou peptidomiméticos que contêm a sequência de RGD regressam a, e agem como antagonistas de, integrina ανβ3.

Nos conjugados bifuncionais da presente invenção, a propriedade de homing é proporcionada pelo peptidomimético cíclico que contém RGD enquanto o efeito de PDT é proporcionado pelo fotossensibilizador. Estes conjugados deveriam ser capazes de direcionar o sensibilizador a neovasos de tumores sólidos primários e possivelmente metástases respetivas para o propósito de diagnóstico e para destruição fotodinâmica. Podem atuar ainda como agentes antiangiogénicos e iniciar a destruição apoptótica de células tumorais expostas ao sangue e neo-endoteliais.

Em formas de realização preferidas, a fração de carga útil é uma porfirina, um derivado de clorofila ou bacterioclorofila que pode ser metalado ou não metalado e opcionalmente substituído na periferia por substituintes diferentes tais como alquilo, arilo, heteroarilo e/ou grupos funcionais. Estes grupos funcionais podem ser selecionados a partir de grupos positivamente carregados, grupos negativamente carregados, grupos básicos que são convertidos aos grupos positivamente carregados sob condições fisiológicas, e grupos ácidos que são convertidos aos grupos negativamente carregados sob condições fisiológicas. 0 termo "um grupo positivamente carregado" refere-se a um catião derivado de um grupo que contém N ou de um grupo õnio que não contém N. Uma vez que o endotélio do tumor é caraterizado por um número aumentado de locais aniónicos, grupos positivamente carregados ou grupos básicos que são convertidos aos grupos positivamente carregados sob condições fisiológicas podem aumentar a eficácia de direcionamento dos conjugados da presente invenção. 0 termo "um grupo negativamente carregado" refere-se a um anião derivado de um ácido e inclui carboxilato (COO), tiocarboxilato (COS“) , sulfonato (S03~) , e fosfonato (P032~) , e o "grupo ácido que é convertido a um grupo negativamente carregado sob condições fisiológicas" inclui os grupos de ácido carboxílico (-COOH), tiocarboxílico (-COSH), sulfónico (-S03H) e fosfónico (-P03H2) .

Em formas de realização mais preferidas, a fração de carga útil é uma clorofila ou, o mais preferente, um derivado de bacterioclorofila que pode ser um derivado natural ou um derivado sintético não natural de clorofila ou bacterioclorofila, incluindo compostos em que modificações foram feitas no macrociclo, e/ou na periferia e/ou o átomo de Mg central pode estar ausente ou é substituído por outro átomo de metal adequado para o propósito de diagnóstico e/ou para o propósito de PDT. Exemplos de tais metais incluem Pd, Pt, Co, Ni, Sn, Cu, Zn, Mn, Em, Eu, Fe, Au, AI, Gd, Er, Yb, Lu, Ga, Y, Rh, Ru, Si, Ge, Cr, Mo, Re, TI e Tc e isótopos dos mesmos.

Numa forma de realização preferida particular, o conjugado da presente invenção é um conjugado do peptidomimético cíclico que contém RGD da fórmula geral I e uma fração de um derivado de bacterioclorofila, em que o dito derivado de bacterioclorofila é Pd-BTA, ligado diretamente a Αχ, X é -NH-R-, R é um hidrocarbileno derivado de etano e Ax é Dap (identificado no presente documento como conjugado 34).

Numa forma de realização adicional, a fração de carga útil do conjugado da presente invenção é um agente quelante, isto é, um agente capaz de quelar um radionuclídeo tal como tecnécio-99m (99mTc) . Exemplos de tais agentes quelantes incluem DTPA e DOTA. Tais conjugados podem ser úteis como agentes de radioimagiologia e radioterápicos.

Em formas de realização preferidas, o conjugado da presente invenção é um conjugado do peptidomimético cíclico que contém RGD da fórmula geral I e uma fração de um agente quelante, em que o dito agente quelante é DTPA ou DOTA, ligado diretamente a Alf X ê -NH-R-, R é um hidrocarbileno derivado de etano e A± ê Dap (identificados no presente documento como conjugados 35 e 36, respetivamente).

Uma vez que a maior parte dos atualmente usados agentes quimioterãpicos é tóxica também a células normais, o desenvolvimento de quimioterapia direcionada, isto é, fármacos quimioterãpicos especificamente direcionados às células tumorais, é de alta importância. Os conjugados de péptidos citotóxicos alvo são moléculas híbridas compostas de um veículo de péptido, que se liga a recetores em células tumorais e uma fração citotóxica. Esta abordagem efetivamente aumenta a especificidade e eficácia do agente citotóxico em quimioterapia, e deveria diminuir efeitos secundários tóxicos também.

Assim, em ainda uma forma de realização adicional, a fração de carga útil do conjugado da presente invenção é um agente citotóxico.

Numa forma de realização preferida, o agente citotóxico da presente invenção é um agente quimioterãpico de antraciclina. 0 agente quimioterãpico de antraciclina pode ser qualquer agente quimioterãpico da família da antraciclina incluindo doxorubicina (também conhecida como adriamicina), daunorubicina, epirubicina, idarubicina e mitoxantrona. Numa forma de realização mais preferida, o agente quimioterãpico de antraciclina é doxorubicina, que é uma antraciclina que contém quinina e é o mais amplamente prescrito e eficaz agente quimioterãpico utilizado em oncologia. Doxorubicina é indicado numa ampla gama de malignidades humanas, incluindo tumores da bexiga, estômago, ovário, pulmão e tiroide, e é um dos agentes mais ativos disponíveis para o tratamento de cancro de mama e outras indicações, incluindo leucemias mielogenosas e linfoblásticas agudas, linfornas de Hodgkin e não-Hodgkin, tumores ósseos osteogénicos e de Ewing, sarcomas de tecido mole, e cancros pediátricos tais como neuroblastoma e tumores de Wilms.

Noutras formas de realização preferidas, o agente citotóxico é um inibidor mitótico tal como paclitaxel, atualmente usado para o tratamento de pacientes com cancro de pulmão, de ovário, cancro de mama, de cabeça e pescoço, e formas avançadas de sarcoma de Kaposi, bem como para a prevenção de restenose, um inibidor de topoisomerase I tal como camptotecina, ou um inibidor de topoisomerase II tal como elipticina.

Num aspeto adicional, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica que compreende um conjugado de um peptidomimético cíclico que contém RGD e uma fração de carga útil como definido acima, ou um sal farmacêutico aceitável do mesmo, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Numa forma de realização, a composição farmacêutica compreende um conjugado de um peptidomimético cíclico como definido acima, isto é, um peptidomimético cíclico da fórmula geral I, e uma fração de uma sonda fluorescente. Em formas de realização preferidas, a composição farmacêutica compreende um conjugado selecionado a partir do grupo dos conjugados que consiste nos conjugados 1,Ã4,Ã5,Ã7,Ã8,Ã11-14,Á 16-20,Á 28 e 33 definidos acima. Tais composições farmacêuticas podem ser usadas para propósitos de diagnóstico, preferentemente, para a visualização de órgãos e tecidos, por exemplo, em métodos de imagiologia vascular-direcionada (VTI), mais preferentemente, para o diagnóstico de tumores.

Numa outra forma de realização, a composição farmacêutica compreende um conjugado de um peptidomimético cíclico como definido acima, isto é, um peptidomimético cíclico da fórmula geral I, e uma fração de um fotossensibilizador como definido acima. Numa forma de realização preferida, a composição farmacêutica compreende um conjugado selecionado a partir do grupo dos conjugados que consiste nos conjugados 34Áe 37-40 definido acima. Tais composições podem ser usadas em terapêutica fotodinâmica (PDT) . Numa forma de realização, a composição farmacêutica é para utilização em oncologia, particularmente para PDT de tumores. Qualquer tumor sólido adequado é abrangido pela invenção, ambos tumores primários e metástase, de tumores selecionados a partir de melanoma, cancro de cólon, mama, pulmão, próstata, cérebro ou cabeça e pescoço. Numa outra forma de realização, a composição farmacêutica é para utilização em doenças não oncológicas, para PDT de tecido ou órgão não neoplásico. Numa forma de realização, a composição farmacêutica é usada para o tratamento de doenças vasculares tais como degeneração macular relacionada com a idade (AMD) ou distúrbios tais como obesidade por meio da limitação de fornecimento vascular ao tecido adiposo e assim inibindo o seu crescimento.

Numa forma de realização adicional, a composição farmacêutica compreende um conjugado de um peptidomimético cíclico como definido acima, isto é, um peptidomimético cíclico da fórmula geral I, e uma fração de um agente capaz de quelar um radionuclídeo. Numa forma de realização preferida, a composição farmacêutica compreende o conjugado 35 ou 36 definido acima. Tais composições, quando marcadas com radionuclídeos adequados, podem ser usadas para radioimagiologia ou radioterapia.

Em ainda uma outra forma de realização, a composição farmacêutica compreende um conjugado de um peptidomimético cíclico como definido acima, isto é, um peptidomimético cíclico da fórmula geral I, e uma fração de um agente citotóxico como definido acima. Tais composições podem ser usadas para quimioterapia direcionada. A composição farmacêutica proporcionada pela presente invenção pode ser preparada por técnicas convencionais, por exemplo, como descrito em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a Ed., 1995. A composição pode estar em forma sólida, semissólida ou líquida e pode incluir ainda cargas, veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis, e outros ingredientes e excipientes inertes. Além disso, a composição farmacêutica pode ser projetada para uma libertação lenta do conjugado. A composição pode ser administrada por qualquer via adequada, por exemplo, intravenosamente, oralmente, parentericamente, retalmente, ou transdermicamente. A dosagem dependerá do estado do paciente, e será determinada como se considere apropriado pelo praticante. A via de administração pode ser qualquer via, que efetivamente transporta o composto ativo ao local de ação apropriado ou desejado, a via intravenosa é a preferida. Se um veículo sólido for usado para administração oral, a preparação pode ser comprimida, colocada numa cápsula de gelatina dura em forma de pó ou pélete ou pode ser na forma de uma pastilha. Se um veículo líquido for usado, a preparação pode ser na forma de um xarope, emulsão ou cápsula de gelatina mole. Comprimidos, drágeas ou cápsulas que têm talco e/ou um veículo ou ligante de hidrato de carbono são particularmente adequados para aplicação oral. Veículos preferíveis para comprimidos, drágeas ou cápsulas incluem lactose, amido de milho e/ou amido de batata.

Em ainda um aspeto adicional, a presente invenção refere-se a um conjugado de um peptidomimético cíclico que contém RGD e uma fração de carga útil como definido acima, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo para propósitos de diagnóstico, terapêutica fotodinâmica (PDT), radioimagiologia ou radioterapia, ou quimioterapia direcionada. A invenção será agora ilustrada pelos seguintes Exemplos.

EXEMPLOS

MateriaisÁeÁMétodos (i) Materiais. Resina de 2-clorotritilcloreto, Fmoc-Asp-O-Alilo, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-β-Ala-OH, Fmoc-GABA-OH, mono Fmoc-diaminas, HOBt, PyBOP, HATU e HOAt foram comprados de Novabiochem (USA). Fmoc-Dap(Alloc)-OH, Fmoc-Dab(Alloc)-OH e Fmoc-Lys(Alloc)-OH foram comprados de Bachem (Suíça). Fmoc-Om(Alloc)-OH, l-Fmoc-4-cloridrato de aminopiperidina e 4-(Boc-aminometil)-anilina foram comprados de NeoMPS (France). FITC, cloreto de dansilo, DIEA, DIG, DMBA, sal de sódio de ácido dietilditiocarbâmico, TFE, TIS, TFA, DCM seco e MeOH foram comprados de Sigma (USA) . Tetrakis (trifenilfosfina) paládio foi comprado de Acros (Bélgica) . DMF, DCM e acetonitrilo foram comprados de J.T.Baker (EUA). DTPA e DOTA foram comprados de Macrocyclics (EUA).

Os espetros de UV-Vis foram obtidos usando um espetrofotómetro Shimadzu 1240UV-Vis. A análise HPLC MS foi obtida usando um HPLC Agilent 1100 equipado com uma coluna de fase reversa YMC Pro-RP-Ci8, ligado a um espetrómetro massa de quadrante único Applied Biosystems 150EX. As análises HPLC foram realizadas (a não ser que indicado de outro modo) em condições padrão: 20-95 % de acetonitrilo em água (pH=4,5, mantido por ácido acético) gradiente ao longo de 30 minutos, numa taxa de fluxo de 0,2 ml/min. A HPLC preparativa foi realizada usando um sistema Waters Delta Prep 4000 equipado com um detetor de absorvância sintonizável Waters 486 UV-VIS e coletor de fração Waters, controlado pelo programa Millenium v3.05. A taxa de fluxo foi ajustada a 75 ml/min, usando uma coluna preparativa (Vydac C18, 218TP101550, 50 x 250 mm, 10-15 pm). Os solventes usados na purificação por HPLC foram Solvente A (50 mM de solução de acetato de amónio em H20) e Solvente B (acetonitrilo). As placas de ELISA foram lidas num instrumento Thermo Labsystems Multiscan Spectrum. A imagiologia fluorescente foi levada a cabo usando um Sistema de Imagiologia Xenogen IVIS® da Série 100 (Alameda, Califórnia). (ii) Procedimento geral para o acoplamento de mono Fmoc-diamina a resina H-Arg(Pbf) -Gly-Asp (a0-Alil) -2-clorotritilo. Cloridrato de mono Fmoc-diamina (1,05 mmol) foi dissolvido em DCM (10 ml) . DIEA (1,26 mmol) foi adicionado à solução e agitado durante 1 min seguido de adição de BTC (0,35 mmol) e DIEA (3,15 mmol). A solução obtida foi adicionada a 0,21 mmol de resina peptidilo, pré-lavada com DCM, e foi deixada a reagir durante 1 h. Após acoplamento, a resina foi lavada com DCM (3x6 ml, 1 min cada) e DMF (6x6 ml, 1 min cada). A conclusão do acoplamento foi monitorizada por teste de ninhidrina qualitativo (Teste de Kaiser). (iii) Procedimento geral para o acoplamento de BTA ou Pd-BTA à resina peptidilo. BTA (0,42 mmol), PyBOP (0,42 mmol) e HOBt (0,42 mmol) foram dissolvidos em DMF (10 ml), e DIEA (1,89 mmol) foi então adicionado à solução e agitado durante 5 min. A solução obtida foi adicionada a 0,21 mmol de resina peptidilo e foi agitada durante 2 h sob árgon. Após acoplamento, a resina foi lavada com DMF (6-8x6 ml, 1 min). A conclusão do acoplamento foi monitorizada por teste de ninhidrina qualitativo. 0 acoplamento de Pd-BTA à resina peptidilo cíclico foi realizado sob as mesmas condições de acoplamento que as descritas para BTA. (iv) Procedimento geral para o acoplamento de FITC à resina peptidilo. Uma solução de FITC (0,63 mmol) em DMF (5 ml) foi adicionada a 0,21 mmol de resina peptidilo e foi agitada durante 1,5 h. Após acoplamento, a resina foi lavada com DMF (6x6 ml, 1 min cada). A conclusão do acoplamento foi monitorizada por teste de ninhidrina qualitativo. (v) Procedimento geral para o acoplamento de cloreto de dansilo à resina peptidilo. Uma solução de cloreto de dansilo (1,05 mmol) e DIEA (1,47 mmol) em D CM (5 ml) foi adicionada a 0,21 mmol de resina peptidilo, pré-lavada com DCM, e foi deixada a reagir durante 1 h. Após acoplamento, a resina foi lavada com DCM (5x5 ml, 1 min) e DMF (2x5 ml, 1 min) . A conclusão do acoplamento foi monitorizada por teste de ninhidrina qualitativo. (vi) Reparação de dipéptido protegido Fmoc-Arg(Pbf) -Gly-OH, um bloco de construção para a síntese de péptido. Uma solução de Fmoc-Gly-OH (4,162 g; 14 mmol) e DIEA (9,755 g; 56 mmol) em DCM seco (100 ml) foi agitada com 10 g de resina cloreto de 2-clorotritilo (substituição 1,4 mmol/g) durante 1 h à TA. A mistura foi transferida a um reator equipado com um fundo de vidro sinterizado e a resina foi lavada com DCM/MeOH/DIEA (17:2:1) (3x100 ml), DCM (3x100 ml), DMF (3x100 ml), DCM (2x100 ml), MeOH (2x100 ml) e DMF/DCM (1:1) (3x100 ml) . 0 grupo Fmoc foi removido pelo tratamento com 5 % de piperidina em DMF/DCM (1:1) (100 ml, 10 min), seguido de 20 % de piperidina em DMF (100 ml, 5 min e 2x15 min) e lavando a resina com DMF (7x100 ml). Fmoc-Arg(Pbf)-OH (18,17 g; 28 mmol) em DMF (130 ml) foi ativado com DIC (4,34 ml; 28 mmol) e HOBt (4,29 g; 28 mmol) durante 15 min à TA e foi adicionado ao recipiente de reação. A mistura foi agitada durante 2 h à TA. A resina peptidilo foi lavada com DMF (5x100 ml), DCM (3x100 ml), MeOH (2x100 ml) e DCM (3x100 ml), e foi seca em vácuo durante 3 h. 0 dipéptido protegido foi clivado da resina por meio de agitação com uma solução de AcOH/TFE/DCM (1:1:3) (250 ml) durante 1 h à TA. A resina foi filtrada e lavada com a mesma solução (3x50 ml). Os filtrados combinados foram misturados

com n-hexano para remover AcOH como um azeótropo e foram evaporados para dar um resíduo oleoso, que solidificou após tratamento com éter frio (1 1) . A filtração e lavagem com éter frio (150 ml) propiciaram um pó branco (8,64 g; 87,5 °) com homogeneidade de cerca de 99 0 (HPLC) . Cssí^NsOsS. MS (LC-MS) calculado m/z=705,84; encontrado: 706,30 (M+H). O produto foi usado sem purificação adicional. (vii) Procedimento geral para a clivagem do

conjugado de péptido da resina. Após conjugação, a resina peptidilo foi lavada com DMF (5x3 ml) e DCM (5x3 ml), e foi então seca sob pressão reduzida durante 3 h. 0 conjugado de péptido foi clivado da resina usando um coquetel de clivagem de TFA/tioanisol/H20/TIS (85:5:5:5) (6 ml) durante 5 min

a 0 IEI C e então durante 1 h à TA. A resina foi filtada e lavada com o mesmo coquetel de clivagem (4 ml) . Os filtrados combinados foram evaporados por uma corrente de N2 até cerca de metade do volume, e o péptido foi precipitado pela adição de éter frio (25 ml). A centrifugação e decantação da camada de éter e tratamento adicional com éter frio (2x25 ml) propiciaram o péptido protegido que foi seco em vácuo durante 6 h. O produto bruto foi purificado por meio de RP-HPLC. (viii) Teste de ligação a integrina por meio de ELISA. Tiras de imunomódulo Nunc (Nunclon, Cat#167008, Daniel Biotech, Israel) foram revestidas durante a noite com 2 ug/ml de integrina humana ανβ3 (Chemicon, Cat#CCi020, Biotest, Israel) dissolvidos em tampão de carbonato-bicarbonato a 0,06 M. Tiras foram bloqueadas durante 2 h à TA com 2 ° de albumina de soro bovino (BSA) (Sigma, Cat#A-9647, Israel) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) (Biological Industries, Israel). Uma mistura de c[RGD- fK]-biotina (10“3 M) e um composto de teste em concentrações diferentes (10' 2, IO'3, 10“4 e 10“3 M) diluído em tampão de ensaio (50 mM de Tris HC1, pH=7,7, 0,5 0 de BSA, 0,15 M de NaCl, 0,01 0 de Tween 20) foi adicionado às tiras revestidas e foi incubado durante a noite à TA com agitação. Após lavar com PBS, anticorpos anti-biotina marcados por fosfatase alcalina (1:200) (Miltenyi Biotec, Almog, Israel) foram adicionados e incubados durante 1 h à TA. As amostras foram incubadas com substrato de fosfato de p-nitrofenilo (p-NPP, Calbiochem, Mercury, Israel) e lidas a 405 nm. (ix) Modelo de carcinoma de ovário in vivo. Ratinhos nude CD-I fémeas (7-9 semanas de idade, 23-28 g) foram anestesiados e implantados subcutaneamente (SC) com suspensão de células de carcinoma de ovário humano MLS (obtida do Prof. M. Neeman, the Weizmann Institute of Science, Israel) (2-3xlOb células/ratinho). Os tumores alcançaram tamanho de tratamento, diâmetro 6-8 mm, dentro de 2-3 semanas.

Os animais foram anestesiados por meio de gás com mistura de 7:3 N20:02 que contém 2 ° de isofluorano (Medeva, Betlehem, PA) ou por injeção intraperitoneal (IP) com mistura de 5 mg/kg de cetamina (Rhone Merieux, Lyon, França) e 1 mg/kg de pompun (Bayer, Leverkusen, Alemanha) (85:15, v:v). (x) Modelo de carcinoma de cólon in vivo. Este modelo é similar ao modelo de carcinoma de ovário in vivo descrito em (ix) acima, exceto pelo facto de que células de carcinoma de cólon humano HT29 (ATCC, EUA, 2-3xl06 células/ratinho) foram usadas ao invés de células de carcinoma de ovário humano MLS. (xi) Modelo de cancro de próstata in vivo. As células LNCaP (3xl06 células/ratinho) foram implantadas SC nas costas de ratinhos com imunodeficiência combinada grave (SCID). Os tumores foram deixados a crescer durante 60-70 dias. Quando o tumor alcançou o tamanho de tratamento (0,7-0,8 cm3), os animais foram anestesiados e a solução de composto de teste foi intravenosamente (IV) injetado. As imagens em IVIS foram tomadas a 8, 11, 14, 24 e 48 h após injeção. (xii) Modelo de cancro de mama in vivo. Ratinhos nude CD-I fémeas (6-8 semanas de idade, 20-25 g, obtidos junto à Harlan Biotech Israel, Rehovot, Israel) foram implantados com células de cancro de mama humano MDA-MB-231-RFP (4xl06 células/ratinho). Estas células são, de facto, células de cancro de mama humano MDA-MB-231 (ATCC, EUA) transfectadas com gene de proteína de fluorescência vermelha (RFP) assim possuindo fluorescência vermelha. Quando os tumores alcançaram o tamanho de 1-1,5 cm3 para tumores necrõticos, os ratinhos foram anestesiados por injeção IP de 30 μΐ de mistura de 85:15 cetamina:xilazina, e o conjugado de teste (15 mg/kg) foi então injetado à veia da cauda. (xiii) Protocolo fluorescente de imagiologia para conjugados de BTA-RGD. Os compostos de teste (8 mg/kg) foram injetados na veia da cauda de ratinhos que portam tumor anestesiados IP. As imagens de animais anestesiados com gãs foram tomadas a 6, 8, 10, 12, 14 e 24 h (em alguns casos também a 48 e 72 h) após injeção usando Sistema de Imagiologia IVIS® da Série 100. Os filtros de excitação e emissão foram ajustados no IVIS a 710-760 nm e a 810-860 nm, respetivamente. 0 filtro de emissão com comprimento de onda mais próximo ao pico de emissão do composto foi selecionado entre os filtros disponíveis na configuração padrão de IVIS. (xiv) Protocolo fluorescente de imagiologia para conjugados de FITC-RGD. Os compostos de teste (8 mg/kg) foram inj etados na veia da cauda de ratinhos que portam tumor anestesiados IP. As imagens de animais anestesiados com gás foram tomadas a 6 e 8 h após injeção. Os animais foram sacrificados a 8 h, os órgãos (tumor, rim, fígado) foram excitados e as imagens dos órgãos foram tomadas usando Sistema de Imagiologia IVIS® da Série 100. Os filtros de excitação e emissão foram ajustados no IVIS a 445-490 nm e a 515-575 nm, respetivamente. 0 filtro de emissão com comprimento de onda mais próximo ao pico de emissão de FITC foi selecionado entre os filtros disponíveis na configuração padrão de IVIS. (xv) Ensaio de ligação in vitro. As células de carcinoma de ovário humano MLS foram cultivadas como monocamadas em meio essencial mínimo (MEM-alfa) que contém 1 g/1 de D-glucose, pH 7,4, 10 % de soro de vitelo fetal (FCS), glutamina (2 mM), penicilina (0,06 mg/ml) e estreptomicina (0,1 mg/ml), e foram crescidas a 37 °C em atmosfera humidificada de C02 a 5 %. A 48 h antes da experiência, as células foram semeadas em placas de 6 poços (3xlOb células/poço).

Expressão de integrina ανβ3 em células MLS. As células foram crescidas em lamelas cobre-objetos. Após a inanição de soro durante a noite, fixação com 4 % de paraformaldeído (Sigma, Israel) e permeabilização com 0,2 % de Triton X-100 (Sigma, Israel), as células foram incubadas em solução de bloqueio (10 % de soro de cavalo) (Biological Industries, Israel) durante 1 h à TA. As células foram então incubadas com anticorpos anti-integrina humana ανβ3 de ratinho (1:100) (Chemicon, Biotest, Israel) durante 1 h à TA. IgG secundária anti-ratinho marcadas com FITC de coelho (1:200) (Sigma, Israel) foram aplicadas às células durante 1 h à TA. A imagiologia foi realizada por meio de microscópio fluorescente (Nikon 0ptiphot2, Japão) equipado com uma máquina fotográfica digital (DVC Company, Inc ., Austin, TX) .

Ensaio de ligação in vitro. Os conjugados de RGD foram inicialmente dissolvidos em DMSO para produzir 4xl0"3 M. As soluções stock foram então diluídas 1:40 em meio de cultura e adicionadas em células MLS ou HT2 9 (100 μΜ/poço). As células foram incubadas a 37 °C em atmosfera humidificada de C02 a 5 0 durante 3 h. As células foram então lavadas 3 vezes com PBS e as imagens foram realizadas num Sistema de Imagiologia Xenogen IVIS® da Série 100. Os filtros de excitação e emissão ajustados no IVIS para BTA-RGD foram 710-760 nm e 810-860 nm, respetivamente, e para FITC-RGD foram 445-490 nm e 515-575 nm, respetivamente. (xvi) Experiências de ligação competitiva (determinação de IC50) . As tiras de imunomódulo MAXISORP (Nunc, Danyel Biotech, Israel) foram revestidas com 50 μΐ/poço de 2 ug/ml de integrina humana ανβ3 (Chemicon, EUA) durante a noite e bloqueadas com 2 0 de BSA (Sigma, Israel) durante 2 h à TA. Após lavar com tampão Tween de solução salina tamponada Tris (TBST) , uma mistura de péptido de RGD c [RGDfK] -biotina (10"3M) e o conjugado de RGD testado em concentrações diferentes (10“2, 10'3, IO'4 e 10"5 M) foi adicionado em triplicatas e foi incubado durante a noite e agitado à TA. Após lavar com tampão PBS, anticorpos anti-biotina marcados por fosfatase alcalina (1:200) (Miltenyi Biotec, Alemanha) foram adicionados e incubados durante 1 h à TA. As amostras foram incubadas com substrato p-NPP e lidas a 405 nm em Espetro Multiscan (Labotal, Israel). Os dados foram colocados em gráfico de dependência de percentual de ligação fora de concentração de conjugado de RGD e o valor de IC50 foi determinado.

ExemploA l.Á Sínteseà dos conjugadosÁ coxnÁ baseÁ emÁ peptidomiméticosÃcíclicosÁqueÁcontêxnÂRGDÃdaÃfõrmulaÃgeralÁIà 1(i) Síntese de conjugados de BTA- e Pd-BTA-peptidomimético

cíclico identificados no presente documento como conjugados 1, 3-6, 15, 23-26 e 34 - Método A

Resina tripéptido Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Asp(“O-Alil)-2-clorotritilo foi preparada numa fase sólida por meio de acoplamento de Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH ao resíduo H-Asp-O-Alilo ligado a resina. A união do primeiro aminoãcido foi realizada por meio de agitação de resina cloreto de 2-clorotritilo (300 mg, substituição 1,4 mmol/g) com uma solução de Fmoc-Asp-0-Alilo (83 mg, 0,21 mmol) e DIEA (147 μΐ, 0,84 mmol) em 5 ml de DCM seco durante 1 h à TA para dar uma carga de cerca de 0,7 mmol/g. Após a conclusão do acoplamento, a resina foi tratada (lavagens e remoção com Fmoc) como descrito em Materiais e Métodos com volumes correspondentes de solução de solventes e reagentes. Fmoc- Arg(Pbf)-Gly-OH (223 mg, 0,315 mmol) , HOBt (48 mg, 0,315 mmol) e DIC (49 μΐ, 0,315 mmol) foram dissolvidos em 5 ml de DMF e agitados à TA durante 20 min. A solução resultante foi adicionada à resina H-Asp-O-Alilo lavada e a mistura foi agitada durante 2 h à TA. A resina peptidilo foi lavada com DMF (5x5 ml). A remoção de grupo Fmoc foi levada a cabo pela adição de 20 % de piperidina (5 ml) em DMF (2x15 min) seguido de lavagem com DMF (7x5 ml, 1 min). 0 acoplamento de mono Fmoc-diamina foi realizado como descrito em Materiais e Métodos seguido de desproteção com Fmoc e lavagem com DMF. 0 acoplamento de Fmoc-Lys(Alloc)-OH, bem como de Fmoc-Dap(Alloc)-OH, Fmoc-Dab(Alloc)-OH e Fmoc-Orn(Alloc)-OH, ao tetra-péptido foi realizado pela adição de uma solução de DMF (5 ml) de Fmoc-Lys(Alloc)-OH (0,63 mmol), pré-ativada (durante 15 min) com HOBt (0,63 mmol) e DIC (0,63 mmol), e tempo de acoplamento de 1 h. Após o acoplamento, a resina foi lavada com DMF (6x5 ml, 1 min) . A conclusão do acoplamento foi monitorizada por teste de ninhidrina qualitativo (Teste de Kaiser). A desproteção de Alilo e Alloc ocorreu por meio de agitação da resina peptidilo com uma solução de [ (C6H5) 3P] 4Pd° (0,252 mmol) e DMBA (3,57 mmol) em DCM (5 ml) durante 2 h â TA sob árgon. A resina foi lavada com DCM (3x5 ml, 1 min), DMF (3x5 ml, 1 min), sal de sódio de ácido dietilditiocarbâmico (0,5 0 em DMF, 4x5 ml, 2 min) e finalmente com DMF (5x5ml, 1 min) . A ciclização em resina foi feita usando uma solução de PyBOP (0,63 mmol) e Dl EA (1,26 mmol) em DMF (4 ml) durante 2 h à TA.

Após desproteção com Fmoc, a conjugação de BTA à resina peptidilo não protegida, bem como clivagem do péptido da resina, foram realizadas como descrito em Materiais e Métodos. Os produtos foram purificados por meio de RP-HPLC. l(ii) Síntese do conjugado de BTA-peptidomimético cíclico identificado no presente documento como conjugado 2 Método B A síntese de resina H-Arg(Pbf)-Gly-Asp (aO-Alil)-2-clorotritilo foi levada a cabo como descrito acima para o Método A.

Acoplamento de cloridrato de Fmoc-NH-NH2 ao tripêptido não protegido. O cloridrato de mono Fmoc-hidrazina (1,05 mmol) foi dissolvido numa mistura 1:1 de dioxano e 1,3-dicloropropano (10 ml). DlEA (1,26 mmol) foi adicionado a esta solução e foi agitado durante 1 minuto seguido de adição de BTC (0,35 mmol) e DlEA (3,15 mmol). A solução foi adicionada à resina peptidilo (0,21 mmol) (pré-lavado com 1: 1 dioxano: 1,3-dicloropropano) e foi deixada a reagir durante 1 h a 55 H C. Após o acoplamento, a resina <6i lavada com DCM (3x6 ml, 1 min) seguido de DMF (6x6 ml, 1 min). A conclusão do acoplamento foi monitorizada por teste de ninhidrina qualitativo (Teste de Kaiser). 0 resto da síntese foi como descrito para o Método A. O produto foi purificado por meio de RP-HPLC.

l(iii) Síntese dos conjugados de BTA-peptidomimético cíclico identificados no presente documento como conjugados 9-11 e 27-33 - Método C A síntese do ciclopentapéptido foi levada a cabo como descrito acima para o Método A.

Acoplamento dos espaçadores de aminoácidos ao ciclopentapéptido. 0 aminoácido Fmoc (0,63 mmol de Fmoc-Gly- OH, Fmoc-p-Ala-OH, Fmoc-GABA-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-D-Phe-OH, Fmoc-l-Nal-OH, Fmoc-D-l-Nal-OH ou ácido Fmoc- 3-aminometilbenzoico) foi dissolvido em DMF (5 ml) e HOBt (0,63 mmol) e DIC (0,63 mmol) foram então adicionados e deixados a reagir durante 15 min. A solução foi adicionada à resina ciclopentapéptido-2-clorotritilo desprotegido com Fmoc (0,21 mmol) e foi agitada durante 1 h. A resina foi lavada com DMF (6x5 ml, 1 min) seguido de desproteção com

Fmoc. 0 acoplamento de BTA e clivagem do péptido da resina foram realizados como descrito em Materiais e Métodos. Os produtos foram purificados por meio de RP-HPLC.

Acoplamento dos espaçadores de diaminas ao ciclopentapéptido. Cloridrato de mono Fmoc-diamina (1,05 mmol de cloridrato de Fmoc-etilenodiamina ou cloridrato de Fmoc-diaminobutano) foi dissolvido em DCM (10 ml) . DIEA (1,26 mmol) foi adicionado à solução e agitado durante 1 min seguido de adição de BTC (0,35 mmol) e DIEA (3,15 mmol) . A solução obtida foi adicionada a 0,21 mmol de resina peptidilo, pré-lavada com DCM, e foi deixada a reagir durante 1 h. Após o acoplamento, a resina foi lavada com DCM (3x6 ml, 1 min cada) e DMF (6x6 ml, 1 min cada). A conclusão do acoplamento foi monitorizada por teste de ninhidrina qualitativo (Teste de Kaiser) . 0 acoplamento de BTA e clivagem do péptido da resina foram realizados como descrito em Materiais e Métodos. Os produtos foram purificados por meio de RP-HPLC.

1(iv) Síntese dos conjugados de BTA-peptidomimético cíclico identificados no presente documento como conjugados 7 e 8A-Á Método D A síntese de resina H-Arg(Pbf)-Gly-Asp (“O-Alil)-2-clorotritilo foi levada a cabo como descrito acima para o Método A.

Acoplamento de Fmoc-Glicinol ao tripêptido desprotegido com Fmoc. Fmoc-Glicinol (1,05 mmol) foi dissolvido em DCM (10 ml), e BTC (0,35 mmol) foi então adicionado a esta solução seguido de adição de Dl EA (3,15 mmol) . Após agitação durante 5 min, a solução obtida foi adicionada a resina peptidilo (0,21 mmol) pré-lavada com DCM e deixada a reagir durante 1 h à TA. A resina foi lavada com DCM (3x6 ml, 1 min) e DMF (6x6 ml 1 min) . A conclusão do acoplamento foi monitorizada por teste de ninhidrina qualitativo (Teste de Kaiser). 0 resto da síntese foi levada a cabo como descrito para o Método A. A clivagem do conjugado de péptido da resina foi realizada com solução de TFA (6 ml) que contém 15 % de DCM + 5 % de TIS e 5 % de tioanisol. Os produtos foram purificados por meio de RP-HPLC.

1(v) Síntese de conjugados de FITC-peptidomimêtico cíclico identificados no presente documento como conjugados 12-14Á.-Á. Método E A síntese de ciclopentapéptido foi levada a cabo como descrito acima para o Método A. Após desproteção com Fmoc, uma solução de Fmoc-p-Ala-OH ou Fmoc-GABA-OH (0,63 mmol), HOBt (0,63 mmol) e DIC (0,63 mmol) em DMF (5 ml) foi misturada durante 15 min, foi adicionada à resina peptidilo (0,21 mmol) e foi deixada a reagir durante 1 h. A resina foi lavada com DMF (6x5 ml, 1 min). A remoção do grupo Fmoc foi levada a cabo pela adição de 20 % de piperidina em DMF (2x15 ml, 15 min) seguido de lavagem com DMF (6x5 ml, 1 min). 0 acoplamento de FITC à resina peptidilo não protegida e clivagem do péptido da resina foram realizados como descrito em Materiais e Métodos. Os produtos foram purificados por meio de RP- HPLC.

1(vi) Síntese de conjugados de dansil-peptidomimético cíclico identificados no presente documento como conjugados 16-22 - Método F A síntese de cíclico péptido foi levada a cabo como descrito acima para o Método A, e após desproteção com Fmoc, os compostos foram feitos reagir diretamente com cloreto de dansilo como descrito em Materiais e Métodos.

Os compostos que contêm um espaçador foram feitos reagir primeiro com Fmoc-Gly-OH ou, alternativamente, com Fmoc-6-Ala-0H, sob as mesmas condições como descrito para o Método E, seguido de acoplamento com cloreto de dansilo. A clivagem do péptido da resina foi realizada como descrito em Materiais e Métodos. Os produtos foram purificados por meio de RP-HPLC.

1(vii) Síntese do conjugado de DTPA-peptidomimético cíclico identificado no presente documento como conjugado 35 -Método G A síntese de cíclico péptido foi levada a cabo como descrito acima para o Método A. Após desproteção com Fmoc, uma solução de DTPA-tetra (éster t-Bu) (0,42 mmol) em DMF (3 ml) ativado por HATU (0,42 mmol) , HOAt (0,42 mmol) e DIEA (0,42 mmol) foi adicionado à resina peptidilo (0,14 mmol) e agitado durante 2 h à TA. A resina foi lavada com DMF (4 ml, 5 vezes, 1 min por vez) . A clivagem do péptido da resina foi realizada como descrito em Materiais e Métodos.

l(viií) Síntese do conjugado de DOTA-peptidomimético cíclico identificado no presente documento como conjugado 36 - Método H A síntese de cíclico péptido foi levada a cabo como descrito acima para o Método A. Após desproteção com Fmoc, uma solução de DOTA-tris (éster t-Bu) (0,42 mmol) em DMF (3 ml) ativado por HATU (0,42 mmol), HOAt (0,42 mmol) e DIEA (0,42 mmol) foi adicionada à resina peptidilo (0,14 mmol) e agitada durante 3 h a 60 °C. A resina foi lavada com DMF (4 ml, 5x1 min). A clivagem do péptido da resina foi realizada como descrito em Materiais e Métodos. 0 Quadro 1Á lista os conjugados sintetizados e as caraterísticas estruturais dos mesmos.

QuadroÁl:ÁConjugados com base em peptidomiméticos cíclicos da fórmula qeral I sintetizados e método de síntese

ExemploÁdeÁRef erênciaÁ2 . Á SinteseAdeÁ conj ugadosÁdeÁBTAÁ camÁ baseÁemÁpeptidomiméticosÁcíclicosÁqueÁcontêmÁRGDÁdaÁfõrmulaÁ geralÁII

Num recipiente de reação equipado com um fundo de vidro sinterizado, resina rink amide MBHA (300 mg, substituição 0,58 mmol/g) foi swelled em DMF by agitação durante a noite. 0 grupo Fmoc foi removido da resina após tratamento com 20 % de piperidina em DMF durante 15 min (3 ml). Esta ação foi repetida duas vezes. A resina foi lavada com DMF (4 ml, 2 min, 5 vezes) . 0 acoplamento de Fmoc-

Dap(Alloc)-OH, bem como de Fmoc-Dab(Alloc)-OH, Fmoc-Orn(Alloc)-OH e Fmoc-Lys(Alloc)-OH, à resina foi realizado pela adição de uma solução de DMF (2,5 ml) de Fnaoc-Dap(Alloc)-OH (0,52 mmol), pré-ativado (for 15 min) com HOBt (0,52 mmol) e DIC (0,52 mmol), e tempo de acoplamento 1 h. Após o acoplamento, a resina foi lavada com DMF (4 ml, 2 min, 5 vezes) . A conclusão do acoplamento foi monitorizada por teste de ninhidrina qualitativo (Teste de Kaiser) . A remoção de Fmoc e lavagem com DMF após desproteção com Fmoc foram levadas a cabo como descrito acima. 0 acoplamento de Fmoc-Asp(0- tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH e Fmoc-Lys(Dde)-OH, e a desproteção com Fmoc entre cada acoplamento, foram realizados sob as mesmas condições como descrito para Fmoc-Dap(Alloc)-OH.

Procedimento geral para o acoplamento de éster alílico de aminoãcido à resina pentapéptido Lys (Dde) -Arg (Pbf) -Gly-Asp(0- tBu)-X-rink amide Éster alílico de aminoãcido como um sal de TsOH (0,87 mmol) foi dissolvido em DCM (7 ml) . DIEA (1,05 mmol) foi adicionado à solução e agitado durante 1 min seguido de adição de BTC (0,29 mmol) e DIEA (2,6 mmol) . A solução obtida foi adicionada a 0,174 mmol de resina peptidilo, pré-lavada com DCM, e foi deixada a reagir durante 1 h. Após o acoplamento, a resina foi lavada com DCM (3x6 ml, 1 min cada) e DMF (6 vezes x 6 ml, 1 min cada). A conclusão do acoplamento foi monitorizada por teste de ninhidrina qualitativo.

Após o acoplamento de éster alílico de aminoãcido e lavagem com DMF, a resina foi lavada com DCM (4 vezes, 4 ml, 1 min cada). A desproteção de Alilo e Alloc ocorreu por meio de agitação da resina peptidilo com uma solução de [ (C6H5) 3P] 4Pd° (0,21 mmol) e DMBA (2,61 mmol) em DCM (5 ml) durante 2 h à TA sob ãrgon. A resina foi lavada com DCM (3x5 ml, 1 min), DMF (3x5 ml, 1 min), sal de sódio de ácido dietilditiocarbâmico (0,5 0 em DMF, 4x5 ml, 2 min) e finalmente com DMF (5x5ml, 1 min) . A ciclização em resina foi feita usando uma solução de PyBOP (0,52 mmol) e DIEA (1,04 mmol) em DMF (4 ml) durante 2 h à TA. Após ciclização, o grupo Dde foi removido pela adição de 2 0 monoidrato de hidrazina em DMF (3 vezes, 3 min por vez) seguido de lavagem com DMF (4 ml, 6 vezes, 2 min por vez) . A conjugação de BTA à resina peptidilo não protegido, bem como clivagem do péptido da resina, foram realizados como descrito em Materiais e Métodos. Os produtos foram purificados por meio de RP-HPLC. 0 QuadroÁ 2Á lista os conjugados sintetizados e as caraterísticas estruturais dos mesmos.

QuadroÁ2:ÁConjugados com base em peptidomiméticos cíclicos _da fórmula geral II sintetizados_

Exemp 1 oÃ3 . ÁOÁtamanhoÁdeÁanelÁdeÁumÁpeptidomiméticoÁcíclicoÁ daÁfórmulaÁgeralÁIÁafetaÁaÁatividadeÁbiológicaÁdoÁconjugadoÁ comÃbaseÁnoÁmesmo

Com a finalidade de examinar se o tamanho de anel do peptidomimético cíclico que contém RGD da fórmula geral I afeta a atividade biológica do conjugado, a atividade de vários conjugados de sonda fluorescente com base em peptidomiméticos cíclicos da fórmula geral I que têm tamanho de anel diferente foi testada em ambos modelo de carcinoma de ovário in vivo e ensaio de ligação in vitro usando células de carcinoma de ovário humano, como descrito em Materiais e Métodos. 0 tamanho de anel do peptidomimético cíclico que contém RGD foi alterado por meio da alteração de dois parâmetros estruturais do composto cíclico, em particular, (i) o resíduo de aminoácido ligado por ligações de amida via seu grupo α-carboxilo ou de cadeia lateral a estrutura principal NH e via seu grupo a-amino ou de cadeia lateral ao grupo α-carboxilo do resíduo de ácido aspártico, isto é, radical Ai na fórmula geral I; e (ii) o radical que une por ponte o carbonilo de estrutura principal e o NH de estrutura principal, isto é, o radical X na fórmula geral I. Os resíduos específicos de aminoácido usados foram os resíduos de ácido diaminopropiónico (Dap), ácido diaminobutírico (Dab), ornitina (Orn) e lisina (Lys), que têm uma a quatro unidades de metileno, respetivamente, na cadeia lateral; e os diferentes radicais X usados foram NH, NH (CH2) 2/ NH (CH2) 3/ NH (CH2) 4 e NH (CH2) 6, que, juntamente com o NH de estrutura principal, formam uma fração de hidrazina, diaminoetano, diaminopropano, diaminobutano e diaminohexano, respetivamente, que une por ponte Αλ e o carbonilo de estrutura principal. 0 QuadroÁ 3Ά mostra os vários conjugados de sonda fluorescente testados e a atividade biológica dos mesmos. Como mostrado, a atividade dos conjugados testados aumentou com o aumento do tamanho de anel do peptidomimético cíclico de 16 átomos a 18-20 átomos; no entanto, diminuiu com o aumento adicional do tamanho de anel. Estes resultados indicam que enquanto que a ligação de ureia que une por ponte o grupo a-amino do resíduo de arginina e radical X torna o peptidomimético cíclico mais rígido, um anel maior que tem até 18-20 átomos é mais flexível para adotar a conformação desejada para ligação à integrina. Por outro lado, em casos em que o tamanho de anel do peptidomimético cíclico é maior que 20 átomos, o peptidomimético cíclico provavelmente não pode adotar a conformação desejada para ligação à integrina.

QuadroÁ3:ÁA atividade biológica de conjugados de sonda fluorescente com base em peptidomiméticos cíclicos da fórmula aeral I crue têm tamanho de anel diferente

Exemp1οΆ4.ÃOÁ tamanhoÃeÁes truturaÁdoAresíduoÁdeÁdiaminaÁnumA peptidomiméticoÁ cíclicoÁ daÁ fórmulaà geralÁ IÁ afetaÁ aÁ atividadeÁbiológicaÁdoÁconjugadoÁcomÁbaseÁnoÁinesino

Com a finalidade de examinar se o tamanho e estrutura do resíduo de diamina, ligado por ligações de amida ao grupo a-carboxilo ou de cadeia lateral do resíduo de aminoãcido A± na fórmula geral I e, via o carbonilo de estrutura principal, ao grupo a-amino do resíduo de arginina, afeta a atividade biológica do conjugado, a atividade de vários conjugados de BTA com base em peptidomiméticos cíclicos da fórmula geral I que têm resíduos de diamina diferentes como definido acima foi testada em ambos modelo de carcinoma de ovário in vivo e ensaio de ligação in vitro usando células de carcinoma de ovário humano, como descrito em Materiais e Métodos.

Os conjugados específicos testados foram conjugados 4,Ã 24Á (Referência) , 25Á (Referência) , 15Á (Referência) e 23Á (Referência) , em que o resíduo de aminoãcido A3. é ornitina; a molécula de BTA é ligada ao N-terminal do anel peptidomimético sem um espaçador; e o radical designado X na fórmula geral I é - NH (CH2) 2-4~, 1,3-dimetil- benzeno-1,3-diilo ou piperidina-1,4-diilo, respetivamente, OÃQuadroÁ4Ámostra os vários conjugados testados e a atividade biológica dos mesmos. Como mostrado, a atividade biológica do conjugado 4Á foi a mais alta entre os conjugados em que resíduos de alquildiamina estão a unir por ponte A1 e o C=0 de estrutura principal, indicando que a atividade biológica destes conjugados diminui conforme o comprimento da cadeia de alquilo aumenta. Além disso, quando o anel peptidomimético se torna rígido, como nos casos dos conjugados 15Á (Referência) e 23Á (Referência) em que radicais diferentes de resíduos de alquildiamina foram usados, nenhuma atividade biológica foi medida, indicando que o anel peptidomimético em tais conjugados adota uma conformação que é indesejável para a interação com a integrina.

QuadroÁ4:ÁA atividade biológica de conjugados de BTA com base em peptidomiméticos cíclicos da fórmula geral I que têm unidades de diamina diferentes que ligam via ligações de amida o resíduo de arginina e o resíduo de aminoácido designado Ai

ExemploÃS.ÁOÁespaçadorÁqueÁligaÁaÁfraçãoÁdeÁcargaÁútilÁaÁumÁ peptidomiméticoÁ cíclicoÁ daÁ fórmulaÁ geralÁ IÁ afetaÁ aÁ atividadeÁbiolõgicaÂdoÁconjugado

Nesta experiência, a atividade biológica de vários conjugados de sonda fluorescente com base em peptidomiméticos cíclicos da fórmula geral I que têm diferentes espaçadores que ligam a fração de sonda fluorescente e o N-terminal do peptidomimético cíclico, isto é, o grupo a-amino ou de cadeia lateral do resíduo de aminoãcido Ai foi testado em ambos modelo de carcinoma de ovário in vivo e ensaio de ligação in vitro usando células de carcinoma de ovário humano, como descrito em Materiais e Métodos. Os espaçadores específicos usados foram frações de vários aminoácidos naturais ou sintéticos, em particular, glicina, β-alanina, fenilalanina, D-fenilalanina, 1-naftilalanina (1-Nal), D-l-naftilalanina (D-l-Nal), ácido γ-aminobutírico (GABA) e ácido 3-(aminometil) benzoico. 0 QuadroÁ 5Á mostra os vários conjugados testados e a atividade biológica dos mesmos. Como mostrado, o Conjugado 1Ã que não tem espaçador entre a molécula de BTA e o peptidomimético cíclico mostrou alta atividade biológica, provavelmente devido ao facto de que a molécula de BTA não interfere com a ligação do peptidomimético cíclico à integrina. Ao contrário disso, os conjugados em que frações de glicina ou β-alanina foram usadas como espaçadores, que têm uma distância aumentada entre o peptidomimético cíclico e a molécula de BTA, mostraram atividade biológica mais baixa, provavelmente, por causa do volume da molécula de BTA. No caso do conjugado ll,Áem que uma fração de GABA foi usada como um espaçador, isto é, a distância entre o peptidomimético cíclico e a molécula de BTA foi aumentada ainda mais, ambos os resultados in vitro e in vivo mostraram alta fluorescência, possivelmente indicando que GABA é longo o suficiente para dar mais liberdade ao anel peptidomimético de ligar-se à integrina; no entanto, não longo demais para causar a dobragem da molécula de BTA sobre o anel peptidomimético.

Nos casos em que sondas fluorescentes menores, isto é, FITC ou dansilo, foram usados, a distância entre a sonda fluorescente e o N-terminal do anel peptidomimético não tinha influência sobre a atividade biológica do conjugado.

Os conjugados 27Âe 28,Áem que frações de fenilalanina e D-fenilalanina, respetivamente, foram usadas como espaçadores, foram mais ativos que o conjugado 9,Áem que uma fração de glicina foi usada como o espaçador, provavelmente, por causa da cadeia lateral aromática de fenilalanina, que proporciona interação com o bolso hidrofóbico da integrina. A atividade biológica do conjugado 28,Áque foi maior que essa do conjugado 27Ápode indicar ainda que a configuração D da fenilalanina pode ajustar o bolso hidrofóbico da integrina melhor que a configuração L, assim melhorando a ligação.

Os conjugados 32Ã e 33,Ã em que resíduos de 1,2-etilenodiamina e 1,4-diaminobutano, respetivamente, foram usados como espaçadores e uma ligação de ureia foi formada entre o anel peptidomimético e a fração de BTA, tiveram quase a mesma atividade biológica que os conjugados lOÁe 11,Ã indicando que a ligação de ureia tem quase a mesma atividade que a ligação de amida e não influencia a conformação do peptidomimético.

QuadroÁ5:ÁA atividade biológica de conjugados de sonda fluorescente com base em peptidomiméticos cíclicos da fórmula geral I que têm diferentes espaçadores

ExemploÁ6. ÁAÁatividadeÁbiológicaÁdosÁconjugadosÁcomÁbaseÁemÁ peptidomiméticosÁ cíclicos daÁ fõrmula geralÁ Ià emÁ queÁ umaÁ fraçãoÁdeAureiaAéAformadaÁcomAoÁgrupaÃot-aminoÁdoÃresíduoAdeà argininaÁéÁsimilarÁaÁessaÁdosÁconjugadosÁemÁqueÁumaÁf raçãoÁ deÁcarbamatoÁêÁformada

Nesta experiência, a atividade biológica dos conjugados, em particular conjugados de BTA, com base em peptidomiméticos cíclicos da fórmula geral I em que uma fração de ureia é formada com o grupo a-amino do resíduo de arginina foi comparada com essa dos conjugados em que uma fração de carbamato é formada.

Os conjugados específicos testados foram conjugados 1Á e 5,Áem que o resíduo de aminoãcido Ai, na fórmula geral I é um ácido diaminopropiõnico ou resíduo de lisina, respetivamente; a molécula de BTA é ligada ao N-terminal do peptidomimético cíclico sem um espaçador; e o radical designado X na fórmula geral I é -NH (CH2) 2-; e os conjugados 7Áe 8Áque têm uma estrutura similar em que o radical designado X é -0 (CH2) 2- ao invés de -NH (CH2) 2- · A atividade biológica dos conjugados foi testada em modelo de carcinoma de cólon bem como em carcinoma de ovário em ambos ensaios de ligação in vivo e in vitro usando células de carcinoma de ovário humano, como descrito em Materiais e Métodos. A atividade biológica dos conjugados lÁe 5Âem modelo de carcinoma de ovário é descrito no Quadro 3. Como mostrado no QuadroÁ6,Áos conjugados em que uma fração de ureia é formada com o grupo a-amino do resíduo de arginina tiveram uma atividade similar a essa dos conjugados correspondentes em que uma fração de carbamato é formada, indicando que a natureza da fração formada com o grupo examino do resíduo de arginina não afeta a atividade biológica do conjugado.

QuadroÁ6:ÁA atividade biológica de conjugados de BTA com base em peptidomiméticos cíclicos da fórmula geral I em que um ureia vs. uma fração de carbamato é formada com o grupo a-amino do resíduo de arginina

ExemploÂ7 .ÁAÁatividadeÂbiológicaÂdeÂconjugadosÂdeÂderivado de BTA com base em peptidomiméticos cíclicos daÁ fõrmula ger al I em queà oà resíduo deÁ taurina doÁ BTA é substituído porÂdiferentesÂdiaminasÂéÂsimilarÂaÂessaÂdosÂconjugadosÂnão derivatizadosÁcorrespondentes

Quatro conjugados de derivado de bacterioclorofila diferentes com base em peptidomiméticos cíclicos da fórmula geral I, identificados no presente documento como conjugados 37-40, foram sintetizados, e sua atividade biológica em células de carcinoma de ovário humano MLS foi testada usando a ensaio de ligação de integrina. Estes conjugados foram com base nos conjugados lÁe 4Áem que o resíduo de taurina (-NH- (CH2) 2-S03H) na fração de BTA foi substituído por nucleófilos diferentes, em particular, -NH-(CH2) 2-NH2 e-NH- (CH2) 2-NH-CH3 . 0 peptidomimético cíclico para estes conjugados foi sintetizado de acordo com o Método A descrito acima. Após ciclização e remoção de Dde, uma solução de Bpheide (2 eq), ativada por PyBoP (2 eq) , HOBt (2 eq) , DlEA (6 eq) em DMF foi adicionada à resina peptidilo e agitada durante 2 h sob árgon. A resina foi lavada com DMF oito vezes (monitorização por teste de ninhidrina). Uma solução de diamina (30 eq) em DMF foi adicionada à resina peptidilo e agitada durante 1 h sob árgon seguido de lavagem com DMF. 0 péptido foi clivado da resina como descrito em Materiais e Métodos, e os conjugados brutos foram purificados por meio de RP-HPLC. Como mostrado no QuadroÁ 7,Á a atividade biológica de todos estes conjugados foi similar, indicando que nestes casos, o grupo amino não tem efeito sobre a atividade biológica e seu comportamento é quase o mesmo que esse do sulfonato em taurina.

QuadroÁ?.* A atividade biológica de vários conjugados de BTA substituídos com base em peptidomiméticos cíclicos da fórmula geral I

ExemploÁ deÁ Referência 8:à Oà tamanhoÁ deÁ anelÁ deÁ umÁ peptidomimético cíclicoà daÁ fõrmulaÁ geralÁ IIà afetaÁ aÁ atividadeÁbiológicaÁdoÁconjugadoÁcomÁbaseÁnoÁmesnio

Com a finalidade de examinar se o tamanho de anel do peptidomimético cíclico da fórmula geral II afeta a atividade biológica do conjugado, a atividade de vários conjugados de BTA com base em peptidomiméticos cíclicos da fórmula geral II que têm os mesmos resíduos de aminoácido Ai (Lys) e A2 (Phe), mas diferentes resíduos de aminoácido A3, em particular, Dap, Dab, Orn e Lys, que têm uma a quatro unidades de metileno, respetivamente, na cadeia lateral, foi testada em ambos modelo de carcinoma de ovário in vivo e ensaio de ligação in vitro usando células de carcinoma de ovário humano, como descrito em Materiais e Métodos. 0 QuadroÁ8Ámostra os vários conjugados de BTA testados e a atividade biológica dos mesmos. Como mostrado, a atividade biológica dos conjugados testados diminuiu com o aumento do tamanho de anel do peptidomimético cíclico de 20 átomos a 23 átomos, indicando que um tamanho de anel maior que 20 átomos não se ajusta ao local de ligação da integrina.

QuadroÁ8:ÁA atividade biológica de conjugados de BTA com base em peptidomimético cíclico da fórmula geral II que tem _tamanho de anel diferente_

Exemplo deÁ ReferênciaÁ 9 :Á AsÁ caraterísticas doÁ resíduo deÁ aminoácidoÁA2AnumApeptidomiméticoÁc£clicoÁdaÁfórmulaAgeralÁ IIÁ afetamÁ aÂatividadeÁbiolôgicaÁ doÁ conjugadoÁ comÁbaseÁ noÁ mesmo

Com a finalidade de examinar se o tamanho e a estrutura do resíduo de aminoácido A2 no peptidomimético cíclico da fórmula geral II, ligado via seu grupo a-amino ao C=0 de estrutura principal e via seu grupo a-carboxilo ao resíduo de aminoácido A3, afeta a atividade biológica do conjugado, a atividade de vários conjugados de BTA com base em peptidomiméticos cíclicos da fórmula geral II que têm os mesmos resíduos de aminoácido Ax (Lys) e A3 (Dap) , mas diferentes resíduos de aminoácido A2, em particular, Phe, Vai, D-Phe, Gly e Asp, foi testada em ambos modelo de carcinoma de ovário in vivo e ensaio de ligação in vitro usando células de carcinoma de ovário humano, como descrito em Materiais e Métodos. 0 QuadroA9Ãmostra os vários conjugados de BTA testados e a atividade biológica dos mesmos. Como mostrado, a atividade biológica dos conjugados 41Á (Referência), 42Á (Referência) e 43Á (Referência), que têm resíduos

hidrofóbicos de aminoácido A2, foi maior que essa dos conjugados 44Á (Referência) e 45Á(Referência), que são mais polares, possivelmente devido às interações hidrofóbicas com o bolso hidrofóbico no local de ligação da integrina. 0 facto de que o conjugado 43Á (Referência) ter sido menos ativo que o conjugado 41Á (Referência) pode ser devido à configuração do anterior, sugerindo que a configuração D não se ajusta completamente ao bolso hidrofóbico.

QuadroÁ9:ÁA atividade biológica de conjugados de BTA com base em peptidomimético cíclico da fórmula geral II que tem diferentes resíduos de aminoãcido A2

ExemploÁlO.ÁLigaçãoÁcompetitivaÁdeÁváriosÁconjugadosÁdeÁBTAÁ daÁpresenteÁinvençãoÁaÁintegrinaÁhumana avp3

Neste estudo, o nível de ligação competitiva, isto é, a IC50, de vários conjugados de BTA da presente invenção a integrina humana ανβ3 foi testado contra biotina-c[RGDfK] , como descrito em Material e Métodos. Os conjugados específicos testados foram os conjugados l,Â4,A5,Â7,ÂllÂe 28Á(com base em peptidomiméticos cíclicos que contêm RGD da fórmula geral I, veja-se o Exemplo 1), bem como o conjugado 41Á (Ref erência) (com base num peptidomimético cíclico que contém RGD da fórmula geral II, veja-se o Exemplo 2), e os valores IC5o medidos para estes conjugados são apresentados no QuadroÁlO.

Como mostrado, os conjugados 1,Ã 7 ,Á 2 8Á e 41Ã (Referência) mostraram a IC50 mais baixa (10‘4 M) , isto é, a atividade biológica mais alta; a IC50 do conjugado 4Â foi ligeiramente mais alta (3xlCT4 M) ; e a IC50 dos conjugados 5Á e HÁfoi a mais alta (3xl0“3 M) .

QuadroÁlO:Á0 nível de ligação competitiva (IC5o) de vários conjugados de BTA da presente invenção a integrina humana _0^νβ3_

ExemploÂll. OsÁconjugadosÁ 1,Á4ÁeÁ41Á (Referência)ÃacumulamÁ noÁnúcleoÁnecróticoÂdeÂtumoresÂnecrõticosÂdeÁMDA

Neste estudo, o padrão de acumulação específico dos conjugados 1,Á 4Â e 41Â (Referência) em lesões primárias ortotópicas de modelo de carcinoma mamário, monitorizado por meio de sinal de fluorescência gerado pelo tumor, e o sinal de fluorescência gerado por estes conjugados foram examinados. A localização dos conjugados nos tumores à medida que passa o tempo foi também determinada. Os animais foram tratados como descrito em Materiais e Métodos, e a fluorescência de ambos células tumorais e os conjugados 1,Á 4Áe 41Á(Referência) foi monitorizada por meio de sistema de imagiologia IVIS® 100 a partir do dia 1 a 7.

As Figs.ÁlA,ÁlBÁe ICÁmostram os padrões de acumulação dos conjugados l,Á4Ãe 41Á(Referência), respetivamente, em tumor grande primário MDA-MB-231-RFP de mama humano ortotópico na almofada mamária de ratinhos CD-I nude fémeas, usando o Sistema Xenogen IVIS®. As imagens de animal completas foram registadas concomitantemente usando conjuntos de filtro que compreendem filtro de excitação 500-550 nm e filtro de emissão 575-650 nm. 0 conjunto de filtro de fundo para subtração da autofluorescência de tecido: filtro de excitação 460-490 nm e filtro de emissão 575-650 nm. Conjunto de filtro principal de imagiologia de fotossensibilizador: filtro de excitação 665-695 nm, filtro de emissão 810-875 nm.

Todos os conjugados acumulados no tumor enquanto se depurava completamente do fígado, proporcionando uma imagiologia seletiva de tumor a >3 dias para o final do período de acompanhamento a 7 dias após a inj eção e uma depuração extremamente lenta depois disso. 0 tamanho de tumor e localização não mudaram ao longo da experiência como visto pelas imagens corpo inteiro vermelho in vivo. Como mostrado nas Figs.Á2A,Á2BÁe 2C, a localização destes conjugados seis dias após a injeção é na área necrótica do tumor.

ExemploÁ12 . ÁAÁatividadeÁbiolõgicaÁdosÁconjugadosÁl, Á4ÁeÁ41Á (Referência)Ãem célulasÂdeÂcancroÁdeÁpróstata

Neste estudo, a atividade biológica dos conjugados 1, 4Áe 41Á(Referência) em células de cancro de próstata LNCaP que expressam integrina ανβ3 foi examinado. Como mostrado acima, estes conjugados específicos mostraram atividade em células de carcinoma de ovário, carcinoma de cólon e cancro de mama. A acumulação dos conjugados no tumor implantado foi monitorizada a 8, 11, 14, 24 e 48 h após a injeção usando o sistema Xenograph IVIS®, e como mostrado nas Figs.Á3A,Á3BÁe 3C,Âem referência aos conjugados 1, Á 4Á e 41Á (Referência) , respetivamente, o nível fluorescente mais alto foi observado na área de tumor a 8 a 11-14 h após injeção, e o conjugado permaneceu no tumor durante até 48 h nos casos dos conjugados lÁe 4,Áe até 24 h no caso do conjugado 41Á (Referência). Como mostrado ainda, os perfis de acumulação destes conjugados em tumores de próstata e de ovário foram quase os mesmos.

Exemploà 13.Á ΑΆ toxicidadeÁ dosÁ conjugadosÁ 1,Á 4Ά eÁ 41Ά (Referência)ÁemAratos 0 estudo de toxicidade dos conjugados 1,4Á e 41Á (Referência) foi realizado em ratos Wistar (5 fémeas, 170-190 g, e 5 machos, 288-315 g). Os vários conjugados em dose de 50 mg/kg foram injetados na veia da cauda durante 1-2 min. Os animais sobreviveram e não mostraram quaisquer problemas de comportamento ou motilidade. Após cinco dias, nenhuma evidência de necrose ou inflamação foi encontrada no fígado ou nos rins destes animais, sugerindo que estes conjugados não são tóxicos na dose testada.

EsquemaÁ 2 :Á As estruturas químicas das várias frações de carga útil usadas, ligadas ao peptidomimético cíclico (marcado como "Péptido") da presente invenção

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Claims (18)

REIVINDICAÇÕESÃ

1. Um peptidomimético cíclico que contém arginina-glicina-ácido aspártico (RGD) da fórmula geral I: I em que

o resíduo de arginina é ligada via seu grupo a-amino ao C=0 de estrutura principal; X é -NH-R-, -0-R-, ou -S-R-, em que R é um radical hidrocarbileno derivado de etano, eteno ou ciclopropano; e A], é um resíduo de aminoácido que carrega um grupo amino na sua cadeia lateral, ligado via seu grupo carboxilo à estrutura principal NH e via seu grupo amino de cadeia lateral ao grupo cx-carboxilo do resíduo de ácido aspártico, o dito aminoácido é selecionado a partir de ácido diaminopropiõnico (Dap), ornitina (Orn) ou lisina (Lys).

2. 0 peptidomimético cíclico que contém RGD de acordo com a reivindicação 1, em que X ê -NH-R, -0-R- ou -S-R-, e R é um hidrocarbileno derivado de etano.

3. 0 peptidomimético cíclico que contém RGD de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que: (i) X é -NH-R-, R é um hidrocarbileno derivado de etano, e A± é Dap, Orn ou Lys; ou (ii) X é -0-R-, R é um hidrocarbileno derivado de etano, e Ai é Dap ou Lys.

4. Um conjugado do peptidomimético cíclico que contém RGD de qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e uma fração de uma carga útil selecionada a partir de uma sonda fluorescente, um fotossensibilizador, um agente quelante, ou um agente citotóxico, ligado ao grupo a-amino do resíduo de aminoácido Ai no peptidomimético, opcionalmente via um espaçador.

5. 0 conjugado de acordo com a reivindicação 4, em que o dito espaçador é selecionado a partir de uma fração de um aminoácido natural ou não natural, uma fração de um péptido pequeno que tem não mais de 8 aminoácidos, um resíduo de diamina, um C1-C25 hidrocarbileno, ou um polímero solúvel.

6. 0 conjugado de acordo com a reivindicação 5, em que o dito aminoácido é glicina (Gly), β-alanina (β-Ala), fenilalanina (Phe), D- fenilalanina (D-Phe), 1-naftilalanina (1 -Nal), D-l-naftilalanina (D-l-Nal), ácido γ-aminobutírico (GABA) ou ácido 3-(aminometil) benzoico; o dito resíduo de diamina é -HN- (CH2) 2-NH- ou -HN- (CH2) 4-NH- ; o dito C1.-C25 hidrocarbileno é um C1-C10 alquileno ou fenileno, substituído por dois grupos funcionais terminais tais como OH, COOH, S03H, COSH ou NH2, assim formando grupos éter, éster, amida, tioamida ou sulfonamida; e o dito polímero solúvel é selecionado a partir de polietileno glicol de cadeia linear ou ramificada (PEG) ou copolímeros do mesmo, poliláctido (PLA) ou copolímeros do mesmo, poliésteres que têm grupos funcionais adequados com base em PLA, poliglicólido (PGA), policaprolactona (PCL), ou seus copolímeros, ou poliamidas com base em polimetacrilamida ou seus copolímeros, os ditos polímeros tendo grupos funcionais adequados.

7. 0 conjugado de qualquer uma das reivindicações 4 a 6, em que a carga útil é uma sonda fluorescente, um fotossensibilizador, um agente quelante, ou um agente citotóxico.

8. 0 conjugado de acordo com a reivindicação 7, em que a dita sonda fluorescente é BPheide taurina amida (BTA), isotiocianato de fluorenilo (FITC), dansilo, rodamina, eosina ou eritrosina; o dito fotossensibilizador é uma porfirina, uma clorofila ou uma bacterioclorofila, preferentemente uma clorofila ou um derivado de bacterioclorofila, mais preferentemente um derivado de bacterioclorofila; o dito agente quelante é DTPA ou DOTA; e o dito agente citotóxico é um agente quimioterãpico de antraciclina selecionado a partir de doxorubicina, daunorubicina, epirubicina, idarubicina ou mitoxantrona, preferentemente doxorubicina, um inibidor mitótico, preferentemente paclitaxel, um inibidor de topoisomerase I, preferentemente camptotecina, ou um inibidor de topoisomerase II, preferentemente elipticina.

9. 0 conjugado de acordo com a reivindicação 4, em que: (i) a carga útil é BTA, ligado diretamente a Alr X é -NH-R-, R é um hidrocarbileno derivado de etano, e Alt é Dap, Orn, ou Lys; (ii) a carga útil é dansilo, ligado diretamente a Ai, X é -NH-R-, R é um hidrocarbileno derivado de etano, e Αχ é Dap, Orn ou Lys; (iii) a carga útil é BTA, ligado diretamente a A1( X é -0-R-, R é um hidrocarbileno derivado de etano, e Αχ é Dap ou Lys; (iv) a carga útil é BTA, ligado via um espaçador a Αχ, X é -NH-R-, R é um hidrocarbileno derivado de etano, A:L é Dap, e o espaçador é uma fração de GABA ou D-Phe, ou um resíduo de 1,4-diaminobutano; (v) a carga útil é FITC, ligado via um espaçador a Αχ, X é -NH-R-, R é um hidrocarbileno derivado de etano, e: (a) Αχ é Dap, e o espaçador é uma fração de β-Ala; ou (b) Ai é Lys, e o espaçador é uma fração de β-Ala ou GABA; (vi) a carga útil é dansilo, ligado via um espaçador a A1? X é -NH-R-, R é um hidrocarbileno derivado de etano, Αχ é Dap ou Lys, e o espaçador é uma fração de Gly; (vii) a carga útil é o derivado de bacterioclorofila Pd-BTA, ligado diretamente a Αχ, X é -NH-R-, R é um hidrocarbileno derivado de etano, e Αχ é Dap; (viii) a carga útil é DTPA ou DOTA, ligado diretamente a Αχ, X é -NH-R-, R é um hidrocarbileno derivado de etano, e Αχ é Dap; (ix) a carga útil é uma BTA substituída em que o resíduo de taurina é substituído por -NH- (CH2) 2-NH2, a dita BTA substituída é ligada diretamente a Αχ, X é -NH-R-, R é um hidrocarbileno derivado de etano, e A1( é Dap ou Orn; ou (x) a carga útil é uma BTA substituída em que o resíduo de taurina é substituído por -NH-(CH2) 2-NH-CH3, a dita BTA substituída é ligada diretamente a A1( X é -NH-R-, Ré um hidrocarbileno derivado de etano, e Αχ é Dap ou Orn.

10. Uma composição farmacêutica que compreende um conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 9, ou um sal farmacêutico aceitável do mesmo, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

11. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 10, em que a carga útil é uma sonda fluorescente.

12. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, para propósitos de diagnóstico, preferentemente para a visualização de órgãos e tecidos, ou para o diagnóstico de tumores, mais preferentemente para o diagnóstico de tumor por meio de imagiologia dinâmica de fluorescência, técnica de radiodiagnóstico tal como tomografia por emissão de positrões (PET) ou tomografia por emissão de fotão único (SPET), ou imagiologia de ressonância magnética molecular (MRI).

13. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 10, em que a carga útil é um fotossensidi1izador.

14. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 13, para terapêutica fotodinâmica (PDT), preferentemente para PDT de tumores ou tecido não neoplãsico, mais preferentemente para PDT de um tumor primário ou uma metãstase de melanoma, cancro de cólon, mama, pulmão, próstata, cérebro ou cabeça e pescoço, ou para o tratamento de degeneração macular relacionada com a idade, ou para o tratamento de obesidade por meio da limitação de fornecimento vascular ao tecido adiposo.

15. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 10, em que a carga útil é um agente quelante.

16. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 15, para utilização em radioimagiologia ou radioterapia.

17. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 10, em que a carga útil é um agente citotóxico, preferentemente para utilização em quimioterapia direcionada.

18. Um conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 4 a S, ou um sal farmacêutico aceitável do mesmo, para propósitos de diagnóstico, terapêutica fotodinãmica (PDT), radioimagiologia ou radioterapia, ou quimioterapia direcionada.