ES2627377T3

ES2627377T3 - Peptidomiméticos que contienen RGD y sus usos

Info

Publication number: ES2627377T3
Application number: ES09774982.4T
Authority: ES
Inventors: Doron Eren; Tamar Yechezkel; Yoseph Salitra; Natalia Koudinova
Original assignee: Steba Biotech SA
Current assignee: Steba Biotech SA
Priority date: 2008-10-23
Filing date: 2009-10-22
Publication date: 2017-07-27
Anticipated expiration: 2029-10-22
Also published as: MX2011004252A; AU2009305893A1; ZA201103712B; EP2358737A2; US8673270B2; RU2519736C2; AU2009305893B2; CN102264756B; PL2358737T3; RU2011120332A; LT2358737T; WO2010046900A2; WO2010046900A3; CA2741207A1; EP2358737B1; DK2358737T3; PT2358737T; BRPI0920108A2; JP2012506419A; HUE033118T2

Abstract

Un peptidomimético cíclico que contiene arginina-glicina-ácido aspártico (RGD) de la fórmula general I:**Fórmula** donde el resto de arginina está unido por su grupo α-amino al C>=O de la cadena principal; X es -NH-R-, -O-R-, o -S-R-, en donde R es un radical hidrocarbileno derivado de etano, eteno o ciclopropano; y A1 es un resto de aminoácido que lleva un grupo amino en su cadena lateral, unido por su grupo carboxilo al NH de la cadena principal y por su grupo amino de cadena lateral al grupo α-carboxilo del residuo de ácido aspártico, dicho aminoácido se selecciona de ácido diaminopropiónico (Dap), ornitina (Orn) o lisina (Lys).

Description

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En otras realizaciones preferidas, el agente citotóxico es un inhibidor mitótico tal como el paclitaxel, utilizado actualmente en el tratamiento de pacientes con cáncer de pulmón, ovario, de mama, de cabeza y cuello y formas avanzadas del sarcoma de Kaposi, así como para la prevención de la restenosis, un inhibidor de topoisomerasa I tal como la camptotecina, o un inhibidor de la topoisomerasa II tal como la elipticina.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un conjugado de un peptidomimético cíclico que contiene RGD y un resto de carga útil como se ha definido anteriormente, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En una realización, la composición farmacéutica comprende un conjugado de un peptidomimético cíclico como se ha definido anteriormente, es decir, un peptidomimético cíclico de la fórmula general I y un resto de una sonda fluorescente. En realizaciones preferidas, la composición farmacéutica comprende un conjugado seleccionado del grupo de conjugados que consiste en los conjugados 1, 4, 5, 7, 8, 11-14, 16-20, 28 y 33 definidos anteriormente. Dichas composiciones farmacéuticas se pueden usar con fines de diagnóstico, preferiblemente, para la visualización de órganos y tejidos, por ejemplo, en métodos de formación de imágenes dirigidas vascularmente (VTI), más preferiblemente, para el diagnóstico de tumores.

En otra realización, la composición farmacéutica comprende un conjugado de un peptidomimético cíclico como se ha definido anteriormente, es decir, un peptidomimético cíclico de fórmula general I y un resto de un fotosensibilizador como se ha definido anteriormente. En una realización preferida, la composición farmacéutica comprende un conjugado seleccionado del grupo de conjugados que consiste en los conjugados 34 y 37-40 definidos anteriormente. Tales composiciones pueden usarse en terapia fotodinámica (PDT). En una realización, la composición farmacéutica es para su uso en oncología, particularmente para PDT de tumores. Cualquier tumor sólido adecuado está abarcado por la invención, tanto tumores primarios como metástasis, de tumores seleccionados de melanoma, cáncer de colon, mama, pulmón, próstata, cerebro o cabeza y cuello. En otra realización, la composición farmacéutica es para su uso en enfermedades no oncológicas, para PDT de tejido u órgano no neoplásico. En una realización, la composición farmacéutica se usa para el tratamiento de enfermedades vasculares tales como degeneración macular relacionada con la edad (AMD) o trastornos tales como la obesidad, limitando el suministro vascular al tejido adiposo e inhibiendo así su crecimiento.

En una realización adicional, la composición farmacéutica comprende un conjugado de un peptidomimético cíclico como se ha definido anteriormente, es decir, un peptidomimético cíclico de fórmula general I y un resto de un agente capaz de quelarse a un radionúclido. En una realización preferida, la composición farmacéutica comprende los conjugados 35 ó 36 definidos anteriormente. Dichas composiciones, cuando se marcan con radionúclidos adecuados, pueden usarse para radiodiagnóstico por imágenes o radioterapias.

En otra realización más, la composición farmacéutica comprende un conjugado de un peptidomimético cíclico como se ha definido anteriormente, es decir, un peptidomimético cíclico de fórmula general I y un resto de un agente citotóxico como se ha definido anteriormente. Tales composiciones pueden usarse para quimioterapia dirigida.

La composición farmacéutica proporcionada por la presente invención puede prepararse por técnicas convencionales, por ejemplo, como se describe en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª Ed., 1995. La composición puede estar en forma sólida, semisólida o líquida y puede incluir adicionalmente cargas, vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables, y otros ingredientes inertes y excipientes. Además, la composición farmacéutica se puede diseñar para una liberación lenta del conjugado. La composición puede administrarse por cualquier ruta adecuada, p. ej. intravenosa, oral, parenteral, rectal o transdérmica. La dosificación dependerá del estado del paciente y se determinará según se considere apropiado por el médico.

La vía de administración puede ser cualquier ruta, que transporte eficazmente el compuesto activo al sitio de acción apropiado o deseado, prefiriéndose la vía intravenosa. Si se utiliza un vehículo sólido para la administración oral, la preparación puede comprimirse, colocarse en una cápsula de gelatina dura en forma de polvo o de gránulos o puede estar en forma de pastilla. Si se utiliza un vehículo líquido, la preparación puede estar en forma de un jarabe, emulsión o cápsula de gelatina blanda. Los comprimidos, grageas o cápsulas, que tienen talco y/o un vehículo o aglutinante de carbohidrato, son particularmente adecuados para la aplicación oral. Los vehículos preferidos para comprimidos, grageas o cápsulas incluyen lactosa, almidón de maíz y/o almidón de patata.

En aún otro aspecto, la presente invención se refiere a un conjugado de un peptidomimético cíclico que contiene RGD y un resto de carga útil como se ha definido anteriormente, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo con fines de diagnóstico, terapia fotodinámica (PDT), radiodiagnóstico por imágenes o radioterapia, o quimioterapia dirigida.

La invención se ilustrará ahora mediante los siguientes Ejemplos.

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1(vii) Síntesis del conjugado peptidomimético cíclico de DTPA identificado en el presente documento comoconjugado 35 -Método G

La síntesis del péptido cíclico se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente para el Método A. Tras la desprotección con Fmoc, se añadió una disolución de DTPA-tetra (t-Bu éster) (0,42 mmol) en DMF (3 ml) activado

5 por HATU (0,42 mmol), se añadieron HOAt (0,42 mmol) y DIEA (0,42 mmol) a la resina de peptidilo (0,14 mmol) y se agitaron durante 2 horas a TA. La resina se lavó con DMF (4 ml, 5 veces, 1 min cada vez). La escisión del péptido de la resina se realizó como se describe en Materiales y Métodos.

1(viii) Síntesis del conjugado peptidomimético cíclico de DOTA identificado en el presente documento como conjugado 36 -Método H

10 La síntesis de péptido cíclico se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente para el Método A. Después de la desprotección con Fmoc, se añadió una solución de DOTA-tris (t-Bu éster) (0,42 mmol) en DMF (3 ml) activado por HATU (0,42 mmol), se añadió HOAt (0,42 mmol) y DIEA (0,42 mmol) a la resina de peptidilo (0,14 mmol) y se agitó durante 3 horas a 60ºC. La resina se lavó con DMF (4 ml, 5 x 1 min). La escisión del péptido de la resina se realizó como se describe en Materiales y Métodos.

15 La tabla 1 enumera los conjugados sintetizados y sus características estructurales.

Tabla 1: Conjugados basados en peptidomiméticos cíclicos de la fórmula general I sintetizada y método de síntesis

Conjugado: X* R* A1* Espaciador Carga útil Método MW

1: NHR (CH2)2 Dap - BTA A 1217,3

2 (Referencia): NUEVA HAMPSHIRE - Dap - BTA B 1189,8

3 (Referencia): NHR (CH2)2 Dab - BTA A 1231,3

4: NHR (CH2)2 Orn - BTA A 1245,3

5: NHR (CH2)2 Lys - BTA A 1259,4

6 (Referencia): NHR (CH2)2 Lys - BTA A 1259,4

7: O (CH2)2 Dap - BTA D 1218,2

8: O (CH2)2 Lys - BTA D 1260,3

9: NHR (CH2)2 Dap Gly BTA C 1275,2

10: NHR (CH2)2 Dap Resto beta-Ala BTA C 1289,2

11: NHR (CH2)2 Dap Resto GABA BTA C 1303,2

12: NHR (CH2)2 Dap Resto beta-Ala FITC E 960,7

13: NHR (CH2)2 Lys Resto beta-Ala FITC E 1002,7

14: NHR (CH2)2 Lys Resto GABA FITC E 1016,7

15 (Referencia): NHR imagen14 Orn - BTA A 1321,2

16: NHR (CH2)2 Lys - Dansilo F 776,3

Conjugado: X* R* A1* Espaciador Carga útil Método MW

17: NHR (CH2)2 Lys Gly Dansilo F 833,6

18: NHR (CH2)2 Orn - Dansilo F 762,3

19: NHR (CH2)2 Salto - Dansilo F 734,3

20: NHR (CH2)2 Salto Gly Dansilo F 791,5

21 (Referencia): NHR (CH2)4 Orn - Dansilo F 789,7

22 (Referencia): NHR (CH2)4 Orn Resto beta-Ala Dansilo F 860,72

23** (Referencia): NHR imagen15 Orn - BTA A 1285,4

24 (Referencia): NHR (CH2)3 Orn - BTA A 1259,8

25 (Referencia): NHR (CH2)4 Orn - BTA A 1273,4

26 (Referencia): NHR (CH2)6 Orn - BTA A 1301,4

27: NHR (CH2)2 Dap Resto Phe BTA C 1364,4

28: NHR (CH2)2 Dap Resto D -Phe BTA C 1364,4

29: NHR (CH2)2 Dap Resto 1-Nal BTA C 1414,4

30: NHR (CH2)2 Dap Resto D-1-Nal BTA C 1414,4

31: NHR (CH2)2 Dap Resto ácido 3-(aminometil) benzoico BTA C 1350,4

32: NHR (CH2)2 Dap -HN-(CH2)2-NH- BTA C 1304,2

33: NHR (CH2)2 Dap -HN-(CH2)4-NH- BTA C 1332,2

34: NHR (CH2)2 Dap - Pd-BTA A 1321,3

35: NHR (CH2)2 Dap - DTPA G 875,0

36: NHR (CH2)2 Dap - DOTA H 887,0

* X, R y A1 se definen de acuerdo con las definiciones de la fórmula general I. ** R junto con el átomo de nitrógeno unido al mismo forman un anillo heterocíclico saturado.

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Ejemplo de referencia 2. Síntesis de conjugados de BTA basados en peptidomiméticos cíclicos quecontienen RGD de fórmula general II

En un recipiente de reacción equipado con un fondo de vidrio sinterizado, se hinchó la resina MBHA amida Rink (300 mg, sustitución 0,58 mmol/g) en DMF por agitación durante la noche. El grupo Fmoc se retiró de la resina tras el tratamiento con piperidina al 20% en DMF durante 15 min (3 ml). Esta acción se repitió dos veces. La resina se lavó con DMF (4 ml, 2 min, 5 veces). Se realizó el acoplamiento de Fmoc-Dap(Alloc)-OH, así como de Fmoc-Dab(Alloc)-OH, Fmoc-Orn(Alloc)-OH y Fmoc-Lys(Alloc)-OH a la resina por la adición de una disolución de DMF (2,5 ml) de Fmoc-Dap(Alloc)-OH (0,52 mmol), preactivada (durante 15 min) con HOBt (0,52 mmol) y DIC (0,52 mmol), y tiempo de acoplamiento 1 h. Después del acoplamiento, la resina se lavó con DMF (4 ml, 2 min, 5 veces). La terminación del acoplamiento se controló mediante un ensayo cualitativo de ninhidrina (Prueba Kaiser). La eliminación de Fmoc y el lavado con DMF después de la desprotección con Fmoc se llevaron a cabo como se ha descrito anteriormente. Se realizó el acoplamiento de Fmoc-Asp(O-tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH y Fmoc-Lys(Dde)-OH y la desprotección de Fmoc entre cada acoplamiento se realizó bajo las mismas condiciones descritas para FmocDap(Alloc)-OH.

Procedimiento general para el acoplamiento del éster alílico de aminoácidos a la resina de amida de pentapeptido Lys(Dde)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(O-tBu)-X

Se disolvió éster alílico de aminoácidos en forma de una sal de TsOH (0,87 mmol) en DCM (7 ml). Se añadió DIEA (1,05 mmol) a la solución y se agitó durante 1 min seguido de la adición de BTC (0,29 mmol) y DIEA (2,6 mmol). La solución obtenida se añadió a 0,174 mmol de resina de peptidilo, se lavó previamente con DCM y se dejó reaccionar durante 1 h. Después del acoplamiento, la resina se lavó con DCM (3 x 6 ml, 1 min cada uno) y DMF (6 veces x 6 ml, 1 min cada uno). La terminación del acoplamiento se controló mediante un ensayo cualitativo de ninhidrina.

Después de acoplar el éster alílico de aminoácido y el lavado con DMF, la resina se lavó con DCM (4 veces, 4 ml, 1 min cada uno). La desprotección de Alilo y Alloc se llevó a cabo mediante agitación de la peptidil-resina con una solución de [(C6H5)3P]4Pd0 (0,21 mmol) y DMBA (2,61 mmol) en DCM (5 ml) durante 2 horas a temperatura ambiente bajo argón. La resina se lavó con DCM (3x5 ml, 1 min), DMF (3x5 ml, 1 min), sal sódica de ácido dietilditiocarbámico (0,5% en DMF, 4x5 ml, 2 min) y finalmente con DMF (5x5 ml, 1 min). La ciclación en resina se realizó usando una solución de PyBOP (0,52 mmol) y DIEA (1,04 mmol) en DMF (4 ml) durante 2 horas a TA. Después de la ciclación, el grupo Dde se eliminó por la adición de monohidrato de hidrazina al 2% en DMF (3 veces, 3 min cada vez) seguido de lavado con DMF (4 ml, 6 veces, 2 min cada vez). La conjugación de BTA a la resina de peptidilo no protegida, así como la escisión del péptido de la resina, se realizaron como se describe en Materiales y Métodos. Los productos se purificaron mediante RP-HPLC.

La Tabla 2 enumera los conjugados sintetizados y sus características estructurales.

Tabla 2: Conjugados basados en peptidomiméticos cíclicos de la fórmula general II sintetizada

Conjugado: A1* A2* A3* Espaciador Carga útil MW

41 (Referencia): Lys Phe Dap - BTA 1449,4

42 (Referencia): Lys Val Dap - BTA 1401,38

43 (Referencia): Lys Dhe Dap - BTA 1449,38

44 (Referencia): Lys Gly Dap - BTA 1359,33

45 (Referencia): Lys Áspid Dap - BTA 1418,31

46 (Referencia): Lys Phe Dab - BTA 1463,4

47 (Referencia): Lys Phe Orn - BTA 1477,4

48 (Referencia): Lys Phe Lys - BTA 1491,4

* A1, A2 y A3 se definen de acuerdo con las definiciones de la fórmula general II,

Ejemplo 3 El tamaño del anillo de un peptidomimético cíclico de la fórmula general I afecta la actividadbiológica del conjugado basado en el mismo

Con el fin de examinar si el tamaño de anillo del peptidomimético cíclico que contiene RGD de fórmula general I afecta la actividad biológica del conjugado, la actividad de diversos conjugados de sondas fluorescentes basados en

5 peptidomiméticos cíclicos de fórmula general I que tiene diferentes tamaños de anillo fue probada en ambos el modelo de carcinoma ovárico in vivo y el ensayo de unión in vitro usando células de carcinoma de ovario humano, como se describe en Materiales y Métodos.

El tamaño de anillo del peptidomimético cíclico que contiene RGD se cambió alterando dos parámetros estructurales del compuesto cíclico, en particular, (i) el residuo de aminoácido unido por enlaces amida a través de su grupo 10 carboxilo αo de cadena lateral a la cadena principal NH y a través de su grupo amino de cadena α o lateral al grupo α-carboxilo del residuo de ácido aspártico, es decir, el radical A1 en la fórmula general I; y (ii) el radical que forma un puente con la cadena principal de carbonilo y la cadena principal de NH, es decir, el radical X en la fórmula general I. Los restos de aminoácidos específicos usados fueron restos del ácido diaminopropiónico (Dap), ácido diaminobutírico (Dab), ornitina (Orn), y lisina (Lys), que tienen de una a cuatro unidades de metileno,

15 respectivamente, en la cadena lateral; y los diferentes radicales X utilizados fueron NH, NH(CH2)2, NH(CH2)3, NH(CH2)4 y NH(CH2)6, los cuales, junto con la cadena principal NH, forman un resto de hidrazina, diaminoetano, diaminopropano, diaminobutano y diaminohexano, respectivamente, formando un puente con A1 y el carbonilo de la cadena principal.

La Tabla 3 muestra los diversos conjugados sonda fluorescentes ensayados y su actividad biológica. Como se

20 muestra, la actividad de los conjugados ensayados aumentó con el aumento del tamaño del anillo del peptidomimético cíclico de 16 átomos a 18-20 átomos; sin embargo, disminuyó con el aumento del tamaño del anillo. Estos resultados indican que mientras que el enlace de urea une el grupo α-amino del residuo de arginina y el radical X hace que el peptidomimético cíclico sea más rígido, un anillo más grande que tenga hasta 18-20 átomos es más flexible para adoptar la conformación deseada para unirse a la integrina. Por otra parte, en los casos en los que

25 el tamaño del anillo del peptidomimético cíclico sea superior a 20 átomos, el peptidomimético cíclico probablemente no puede adoptar la conformación deseada para la unión a la integrina.

Tabla 3: La actividad biológica de conjugados sonda fluorescentes basados en peptidomiméticos cíclicos de fórmula general I que tienen diferentes tamaños de anillo

Conjugado: Tamaño del anillo (átomos) Modelo de carcinoma ovárico (in vivo) Ensayo de unión a integrina (in vitro)

2 (Referencia): 16 Fluorescencia se extiende por todo el cuerpo hasta 6 horas. A las 10 h, señal baja en hígado y tumor. Aclaramiento completo a las 21 h. Sin enlace

6 (Referencia): 17 Fluorescencia se extiende por todo el cuerpo hasta 6 horas. A las 8 h, señal fuerte en el hígado. Aclaramiento completo a las 15 h. Sin enlace

1: 18 Fluorescencia se extiende por todo el cuerpo hasta 10 horas con señales fuertes en el hígado y el tumor. A las 2472 horas, sólo en el tumor. Unión

19: 18 A las 8 h, fuerte acumulación en el tumor pero no en el riñón o el hígado. imagen16

3 (Referencia): 19 Fluorescencia se extiende por todo el cuerpo durante 8 horas. A las 10 h, señal fuerte en hígado y tumor. A las 14 horas, sólo en el tumor. La mayoría del fármaco se limpia a las 23 h. Sin enlace

4: 20 Fluorescencia se extiende por todo el cuerpo durante 8 horas. A las 10 h, señal fuerte en hígado y tumor. A las 14 horas, sólo en el tumor. La mayoría del fármaco se limpia a las 23 h. Unión

18: 20 A las 8 h, fuerte acumulación en el tumor pero no en el riñón imagen17

imagen18: imagen19 o el hígado. imagen20

5: 21 Fluorescencia se extiende por todo el cuerpo hasta 8 horas con puntos altos en el hígado y el tumor. A las 10 h, sólo en hígado y tumor. A las 12-23 horas, sólo en el tumor. Unión

16: 21 A las 8 h, fuerte acumulación en el tumor pero débil en riñón e hígado. imagen21

24 (Referencia): 21 Acumulación en el tumor y el hígado hasta 14 horas con el nivel máximo a las 11 h. Aclaramiento completo a las 48 h. Unión débil

25 (Referencia): 22 Acumulación en el tumor hasta 28 horas con nivel máximo a las 8-11 horas. Aclaramiento completo a las 48 h. Unión débil

21 (Referencia): 22 A las 8 h, fuerte acumulación en el tumor pero no en el riñón o el hígado. imagen22

26 (Referencia): 24 Acumulación en el tumor y el hígado hasta 14 horas con el nivel máximo a las 8 h. Aclaramiento completo a las 24 h. Sin enlace

* La caracterización de cada conjugado se presenta en la tabla 1 anterior.

Ejemplo 4 El tamaño y la estructura del residuo de diamina en un peptidomimético cíclico de la fórmulageneral I afecta la actividad biológica del conjugado basado en el mismo

Con el fin de examinar si el tamaño y la estructura del residuo de diamina, unido por enlaces amida al grupo

5 carboxilo α o de cadena lateral del residuo de aminoácido A1 en la fórmula general I y, a través del carbonilo de la cadena principal, al grupo α-amino del residuo de arginina, afecta a la actividad biológica del conjugado, la actividad de diversos conjugados de BTA basados en peptidomiméticos cíclicos de fórmula general I que tienen diferentes residuos de diamina como se definió anteriormente se ensayaron en ambos modelo de carcinoma ovárico in vivo y ensayo de unión in vitro usando células de carcinoma de ovario humano, como se describe en Materiales y Métodos.

10 Los conjugados específicos ensayados fueron los conjugados 4, 24 (Referencia), 25 (Referencia), 15 (Referencia) y 23 (Referencia), en los que el residuo de aminoácido A1 Es ornitina; la molécula de BTA está unida al N-terminal del anillo peptidomimético sin un espaciador; y el radical designado X en la fórmula general I es -NH(CH2)2-4-, 1,3dimetilbenceno-1,3-diilo o piperidin-1,4-diilo, respectivamente.

La Tabla 4 muestra los diversos conjugados ensayados y su actividad biológica. Como se muestra, la actividad

15 biológica del conjugado 4 fue la más alta entre los conjugados en que los residuos de alquildiamina forman un puente con A1 y la cadena principal C=O, lo que indica que la actividad biológica de estos conjugados disminuye a medida que aumenta la longitud de la cadena alquílica. Además, cuando el anillo peptidomimético se vuelve rígido, como en los casos de los conjugados 15 (Referencia) y 23 (Referencia) en los que se usaron radicales distintos de los residuos de alquildiamina, no se midió ninguna actividad biológica, lo que indica que el anillo peptidomimético en

20 dichos conjugados adopta una conformación que es indeseable para la interacción con la integrina.

Tabla 4: La actividad biológica de los conjugados de BTA basados en peptidomiméticos cíclicos de fórmula general I que tienen diferentes unidades de diamina que se enlazan mediante enlaces amida al resto de arginina y al residuo de aminoácido designado A1

Conjugado: Residuo de diamina Modelo de carcinoma ovárico (in vivo) Ensayo de unión a integrina (in vitro)

4: -NH-(CH2)2-NH- A las 10 h, señal fuerte en hígado y tumor. A las 14 horas, sólo en el tumor. La mayoría del fármaco se elimina a las 23 h. Unión

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24 (Referencia): -NH-(CH2)3-NH- Acumulación en el tumor y el hígado hasta 14 horas con el nivel máximo a las 11 h. Aclaramiento completo a las 48 h. Unión débil

25 (Referencia): -NH-(CH2)4-NH- Acumulación en el tumor hasta 28 horas con nivel máximo a las 8-11 horas. Aclaramiento completo a las 48h. Unión débil

15 (Referencia): imagen23 Fuerte acumulación en el tumor hasta 24 h. Sin enlace

23 (Referencia): imagen24 Alta fluorescencia se extiende por todo el cuerpo hasta 48 h. Sin enlace

* La caracterización de cada conjugado se presenta en la tabla 1 anterior.

Ejemplo 5. El espaciador que une el resto de carga útil con un peptidomimético cíclico de la fórmula generalI afecta a la actividad biológica del conjugado

En este experimento, la actividad biológica de varios conjugados de sondas fluorescentes basados en peptidomiméticos cíclicos de fórmula general I que tienen diferentes espaciadores que unen el resto de sonda fluorescente y el N-terminal del peptidomimético cíclico, es decir, el grupo amino de α o la cadena lateral del residuo de aminoácido A1, se probó en ambos modelo de carcinoma ovárico in vivo y ensayo de unión in vitro usando células de carcinoma de ovario humano, como se describe en Materiales y Métodos. Los espaciadores específicos utilizados eran restos de diversos aminoácidos naturales o sintéticos, en particular, glicina, β-alanina, fenilalanina, Dfenilalanina, 1-naftilalanina (1-Nal), D-1-naftilalanina (D-1-Nal) , Ácido gamma-aminobutírico (GABA) y ácido 3(aminometil)benzoico.

La Tabla 5 muestra los diversos conjugados ensayados y su actividad biológica. Como se muestra, el conjugado 1, que no tiene separador entre la molécula de BTA y el peptidomimético cíclico mostró una actividad biológica alta, probablemente debido al hecho de que la molécula de BTA no interfiere con la unión del peptidomimético cíclico a la integrina. Contrariamente a esto, los conjugados en los que se usaron restos de glicina o β-alanina como espaciadores, que tenían una mayor distancia entre el peptidomimético cíclico y la molécula de BTA, mostraron menor actividad biológica, probablemente debido al volumen de la molécula de BTA. En el caso del conjugado 11, en el que se usó un resto de GABA como espaciador, es decir, la distancia entre el peptidomimético cíclico y la molécula de BTA se incrementó adicionalmente, tanto los resultados in vitro como in vivo mostraron una fluorescencia alta, posiblemente indicando que GABA era lo suficientemente largo para dar más libertad al anillo peptidomimético para unirse a la integrina; sin embargo, no demasiado largo para causar el plegamiento de la molécula de BTA sobre el anillo peptidomimético.

En los casos en que se usaron sondas fluorescentes más pequeñas, es decir, FITC o dansilo, la distancia entre la sonda fluorescente y el terminal N del anillo peptidomimético no tuvo influencia sobre la actividad biológica del conjugado.

Los conjugados 27 y 28, en los que la fenilalanina y los restos de D-fenilalanina, respectivamente, se usaron como espaciadores, fueron más activos que los conjugados 9, en los que se usó un resto de glicina como espaciador, probablemente debido a la cadena lateral aromática de fenilalanina, que proporciona interacción con la bolsa hidrófoba de la integrina. La actividad biológica del conjugado 28, que fue mayor que la del conjugado 27 puede indicar adicionalmente que la configuración D de la fenilalanina puede encajar con la bolsa hidrófoba de la integrina mejor que la configuración L, mejorando así la unión.

Los conjugados 32 y 33, en los que se usaron residuos de 1,2-etilendiamina y 1,4-diaminobutano, respectivamente, como espaciadores y se formó un enlace de urea entre el anillo peptidomimético y el resto BTA, tenían casi la misma actividad biológica que los conjugados 10 y 11, Indicando que el enlace de urea tiene casi la misma actividad que el enlace amida y no influye en la conformación del peptidomimético.

Tabla 5: La actividad biológica de conjugados sonda fluorescentes basados en peptidomiméticos cíclicos de la fórmula general I que tienen diferentes espaciadores

Conjugado: Espaciador Modelo de carcinoma ovárico (in vivo) Ensayo de unión a integrina (in vitro)

1: - Fluorescencia se extiende por todo el cuerpo hasta 10 horas con señales fuertes en el hígado y el tumor. A las 24-72 horas, sólo en el tumor. Unión

19: - A las 8 h, fuerte acumulación en el tumor pero no en el riñón o el hígado. imagen25

9: Resto Gly Aclaración completa a las 8 h. Baja unión

20: Resto Gly A las 8 h, fuerte acumulación en el tumor pero no en el riñón o el hígado. imagen26

10: Resto beta-Ala Fluorescencia se extiende por todo el cuerpo y desaparece muy rápido. Sin enlace

12: Resto beta-Ala A las 8 h, acumulación en el tumor y el riñón. Unión

11: Resto GABA Fluorescencia se extiende por todo el cuerpo hasta 12 horas con fuertes señales en el hígado y el tumor. A las 24 horas, principalmente en el tumor. Fuerte unión

27: Resto Phe A las 8-14 horas, sólo en el tumor. Aclaramiento completo a las 24 h. Unión débil

28: Resto D-Phe A las 8-24 horas, sólo en el tumor. Aclaramiento completo a las 48 h. Fuerte unión

16: - A las 8 h, fuerte acumulación en el tumor pero débil en riñón e hígado. imagen27

17: Resto Gly A las 8 h, fuerte acumulación en el tumor pero no en el riñón o el hígado. imagen28

13: Resto beta-Ala A las 8 h, acumulación en el tumor y en el riñón. Unión

14: Resto GABA A las 8 h, debilidad acumulada en el tumor y fuerte en el riñón. Unión

29: Resto 1-Nal A las 8 h, acumulación sólo en tumor y permanece allí hasta 24 h. Unión débil

30: Resto D-1-Nal A las 24 h, acumulación en el tumor. La señal del cuerpo es alta. Unión débil

31: 3-(aminometil) benzoico A las 8 h, acumulación sólo en tumor y permanece allí hasta 24 h. Unión débil

32: NH-(CH2)2-NH A las 24 horas, acumulación en el tumor y permanece allí durante más de 72 horas. Unión débil

33: NH-(CH2)4-NH A las 24 h, acumulación en el tumor y permanece allí durante más de 5 días. Fuerte unión

* La caracterización de cada conjugado se presenta en la tabla 1 anterior.

Ejemplo 6 La actividad biológica de los conjugados basados en peptidomiméticos cíclicos de fórmulageneral I en los que se forma un resto de urea con el grupo α-amino del residuo de arginina es similar a la delos conjugados en los que se forma un resto de carbamato

5 En este experimento se comparó la actividad biológica de conjugados, en particular, conjugados de BTA, a base de peptidomiméticos cíclicos de fórmula general I en los que se forma un resto de urea con el grupo α-amino del residuo de arginina, con la de los conjugados en los que se forma un resto carbamato.

Los conjugados específicos ensayados fueron los conjugados 1 y 5, en los que el residuo de aminoácido A1 en la fórmula general I es un ácido diaminopropiónico o un residuo de lisina, respectivamente; la molécula BTA está unida

10 al N-terminal del peptidomimético cíclico sin un espaciador; y el radical designado como X en la fórmula general I es -NH(CH2)2-; y los conjugados 7 y 8 que tienen una estructura similar en la que el radical designado como X es O(CH2)2-en lugar de -NH (CH2)2. La actividad biológica de los conjugados se ensayó en el modelo de carcinoma de colon, así como en el carcinoma de ovario en ambos ensayos de unión in vivo e in vitro que utilizan células de carcinoma de ovario humano, como se describe en Materiales y Métodos.

15 La actividad biológica de los conjugados 1 y 5 en el modelo de carcinoma ovárico se describe en la Tabla 3. Como se muestra en la Tabla 6, los conjugados en los que se forma un resto de urea con el grupo α-amino del residuo de arginina tenían una actividad similar a la de los conjugados correspondientes en los que se forma un resto de carbamato, indicando que la naturaleza del resto formado con el grupo α-amino del residuo de arginina no afectaba a la actividad biológica del conjugado.

20 Tabla 6: La actividad biológica de los conjugados BTA basados en peptidomiméticos cíclicos de la fórmula general I en los que se forma un resto urea vs. carbamato con el grupo α-amino del residuo de arginina

Conjugado: Modelo de carcinoma de colon/ovario (in vivo) Ensayo de unión a integrina (in vitro)

1: Colon -Ortotópico: acumulación en el tumor hasta 8 h. Aclaración completa a las 12 h. Unión

5: Colon -SC: la fluorescencia se extiende por todo el cuerpo durante 8 horas. A las 10 h, señal fuerte en hígado y tumor. A las 14-24 horas, sólo en el tumor (n = 1); Ortotópico: acumulación en el tumor hasta 8 h. Aclaración completa a las 12 h. Unión

7: Colon -la fluorescencia se extiende por todo el cuerpo hasta 8 horas. A las 1024 horas, sólo en el tumor. imagen29

imagen30: Ovario -la fluorescencia se extiende por todo el cuerpo hasta 8 horas. A las 10-24 horas, sólo en el tumor. Unión

8: Colon -la fluorescencia se extiende por todo el cuerpo hasta 6 horas. A las 8 h, se acumula en el tumor y el hígado. A las 12-14 horas, sólo en el tumor. Aclaración casi completa a las 24 hrs. imagen31

imagen32: Ovario -la fluorescencia se extiende por todo el cuerpo hasta 6 horas. A las 8 h, en el tumor y el hígado. A las 14 horas, sólo en el tumor. Aclaración casi completa a las 24 h. Unión

* La caracterización de cada conjugado se presenta en la tabla 1 anterior.

Ejemplo 7. La actividad biológica de los conjugados derivados de BTA basados en peptidomiméticoscíclicos de la fórmula general I en la que el resto taurina del BTA se sustituye por diferentes diaminas es

25 similar a la de los conjugados no derivatizados correspondientes

Cuatro diferentes conjugados de derivados de bacterioclorofila basados en peptidomiméticos cíclicos de la fórmula general I, conjugados identificados en la presente invención como 37-40, fueron sintetizados, y su actividad biológica analizada en células de carcinoma de ovario humano MLS utilizando el ensayo de unión a integrina. Estos conjugados se basaron en los conjugados 1 y 4 en los que el resto taurina (-NH-(CH2)2-SO3H) en el resto BTA se

30 reemplazó por diferentes nucleófilos, en particular, -NH-(CH2)2-NH2 y -NH-(CH2)2-NH-CH3.

El peptidomimético cíclico para estos conjugados se sintetizó de acuerdo con el Método A descrito anteriormente. Después de la ciclización y la eliminación de Dde, se añadió a la resina de peptidilo una solución de Bfeida (2 eq), activada por PyBoP (2 eq), HOBt (2 eq), DIEA (6 eq) en DMF y se agitó durante 2 h bajo argón. La resina se lavó con DMF ocho veces (monitorización por ensayo de ninhidrina). Se añadió una disolución de diamina (30 eq) en

5 DMF a la resina de peptidilo y se agitó durante 1 h bajo argón seguido de lavado con DMF. El péptido se escindió de la resina como se describe en Materiales y Métodos, y los conjugados crudos se purificaron por RP-HPLC. Como se muestra en la Tabla 7, la actividad biológica de todos estos conjugados fue similar, indicando que en estos casos, el grupo amino no tiene efecto sobre la actividad biológica y su comportamiento es casi el mismo que el del sulfonato en la taurina.

10 Tabla 7: La actividad biológica de varios conjugados BTA sustituidos basados en peptidomiméticos cíclicos de la fórmula general I

Conjugado: X* A1* Espaciador Sonda J* Ensayo de unión a integrina (in vitro)

1: NH (CH2)2 Dap - BTA - Unión

37: NH (CH2)2 Dap - BTA sustituido -NH-(CH2)2-NH2 Unión

38: NH (CH2)2 Dap - BTA sustituido -NH(CH2)2-NH-CH3 Unión

39: NH (CH2)2 Orn - BTA sustituido -NH-(CH2)2-NH2 Unión

40: NH (CH2)2 Orn - BTA sustituido -NH(CH2)2-NH-CH3 Unión

* X y A1 se definen de acuerdo con las definiciones de la fórmula general I. * J representa el nucleófilo específico que sustituye la taurina en BTA.

Ejemplo de referencia 8: El tamaño del anillo de un peptidomimético cíclico de la fórmula general II afecta ala actividad biológica del conjugado basado en el mismo

15 Con el fin de examinar si el tamaño del anillo del peptidomimético cíclico de fórmula general II afecta a la actividad biológica del conjugado, la actividad de varios conjugados de BTA basados en peptidomiméticos cíclicos de fórmula general II que tienen los mismos residuos de aminoácidos A1 (Lys) y A2 (Phe), pero diferentes residuos de aminoácidos A3, en particular, Dap, Dab, Orn y Lys, que tienen de una a cuatro unidades de metileno, respectivamente, en la cadena lateral, se ensayaron en ambos modelo de carcinoma ovárico in vivo y ensayo de

20 unión in vitro utilizando células de carcinoma de ovario humano, como se describe en Materiales y Métodos.

La Tabla 8 muestra los diversos conjugados BTA ensayados y su actividad biológica. Como se muestra, la actividad biológica de los conjugados probados disminuyó al aumentar el tamaño del anillo del peptidomimético cíclico de 20 átomos a 23 átomos, indicando que un tamaño de anillo mayor de 20 átomos no encajaba en el sitio de unión de la integrina.

25 Tabla 8: La actividad biológica de conjugados de BTA basados en peptidomiméticos cíclicos de fórmula general II que tienen diferentes tamaños de anillo

Conjugado: Tamaño del anillo (Nº de átomos) Modelo de carcinoma ovárico (in vivo) Ensayo de unión a integrina (in vitro)

41 (Referencia): 20 Acumulación en el tumor hasta 8 h. Aclaración completa a las 12 h. Unión

46 (Referencia): 21 imagen33 Unión débil

47 (Referencia): 22 imagen34 Unión débil

Conjugado: Tamaño del anillo (Nº de átomos) Modelo de carcinoma ovárico (in vivo) Ensayo de unión integrina (in vitro) a

48 (Referencia): 23 imagen35 Unión débil

* La caracterización de cada conjugado se presenta en la Tabla 2 anterior.

Ejemplo de Referencia 9: Las características del residuo de aminoácido A2 en un peptidomimético cíclico dela fórmula general II afecta a la actividad biológica del conjugado basado en el mismo

Con el fin de examinar si el tamaño y la estructura del residuo aminoácido A2 en el peptidomimético cíclico de

5 fórmula general II, unido a través de su grupo α-amino al C=O de la cadena principal y a través de su grupo αcarboxilo al resto de aminoácido A3, afecta a la actividad biológica del conjugado, teniendo la actividad de varios conjugados de BTA basados en peptidomiméticos cíclicos de fórmula general II los mismos residuos de aminoácidos A1 (Lys) y A3 (Dap), pero diferentes residuos de aminoácidos A2, en particular, Phe, Val, D-Phe, Gly y Asp, se ensayaron en ambos el modelo de carcinoma ovárico in vivo y el ensayo de unión in vitro utilizando células de

10 carcinoma de ovario humano, como se describe en Materiales y Métodos.

La Tabla 9 muestra los diversos conjugados BTA ensayados y su actividad biológica. Como se muestra, la actividad biológica de los conjugados 41 (Referencia), 42 (Referencia) y 43 (Referencia), que tienen residuos de aminoácidos hidrofóbicos A2, fue mayor que la de los conjugados 44 (Referencia) y 45 (Referencia), que son más polares, posiblemente debido a las interacciones hidrofóbicas con la bolsa hidrófoba en el sitio de unión de la integrina. El 15 hecho de que el conjugado 43 (Referencia) era menos activo que el conjugado 41 (Referencia) puede deberse a la configuración del primero, lo que sugiere que la configuración D no encaja completamente en la cavidad hidrofóbica.

Tabla 9: La actividad biológica de los conjugados de BTA basados en peptidomiméticos cíclicos de fórmula general II que tiene diferentes residuos de aminoácidos A2

Conjugado: A2 Actividad biológica (carcinoma de ovario)

41 (Referencia): Phe In vitro: Unión

imagen36: imagen37 In vivo: Se acumula en el carcinoma ovárico MLS, permanece en el tumor hasta 24 horas después de la inyección y se limpia del cuerpo y del tumor a las 48 horas.

imagen38: imagen39 Ortotópico: A las 11 horas después de la inyección, la alta fluorescencia es detectable en el área del tumor, éter SC u ortotópico. A las 24 h, el fármaco se eliminó del cuerpo, pero en el área tumoral el nivel de fluorescencia era todavía detectable hasta 3 días después de la inyección. La acumulación del fármaco no depende del sitio de implantación.

42 (Referencia): Val In vitro: Unión

imagen40: imagen41 In vivo: Este compuesto se acumula en tumores ováricos y de colon a las 24 horas después de la inyección y permanece allí hasta 72 horas.

43 (Referencia): Dhe In vitro: Unión débil

44 (Referencia): Gly In vitro: Ninguna unión

45 (Referencia): Asp In vitro: Ninguna unión

* La caracterización de cada conjugado se presenta en la Tabla 2 anterior.

20 Ejemplo 10. La unión competitiva de varios conjugados BTA de la presente invención a la integrina αvβ3 humana

En este estudio, el nivel de unión competitiva, es decir, el IC50, de varios conjugados de BTA de la presente invención a la integrina αvβ3 humana se ensayó frente a la biotina-c[RGDfK], como se describe en Material y Métodos. Los conjugados específicos ensayados fueron los conjugados 1, 4, 5, 7, 11 y 28 (basados en los

5

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peptidomiméticos cíclicos que contienen RGD de la fórmula general I, véase el Ejemplo 1), así como el conjugado 41 (Referencia) (basado en un peptidomimético cíclico que contiene RGD de fórmula general II, véase el Ejemplo 2), y los valores IC50 medidos para estos conjugados se presentan en la Tabla 10.

Como se muestra, los conjugados 1, 7, 28 y 41 (Referencia) mostraron el IC50 más bajo (10-4 M), es decir, la actividad biológica más alta; el IC50 del conjugado 4 fue ligeramente superior (3x10-4 M); y el IC50 de los conjugados 5 y 11 fue el más alto (3x10-3 M).

Tabla 10: El nivel de unión competitiva (IC50) de varios conjugados de BTA de la presente invención a integrina αvβ3

Conjugado: IC50 (M) a integrina αvβ3 humana

1: 10-4

4: 3x10-4

5: 3x10-3

7: 10-4

11: 3x10-3

28: 10-4

41 (Referencia): 10-4

* La caracterización de cada uno de los conjugados 1, 4, 5, 7, 11 y 28, y del conjugado 41, se presenta en la Tabla 1 y la Tabla 2, respectivamente, en este documento anteriormente.

Ejemplo 11. Los conjugados 1, 4 y 41 (Referencia) se acumulan en el núcleo necrótico de los tumoresnecróticosMDA

En este estudio, se examinaron el patrón específico de acumulación de los conjugados 1, 4 y 41 (Referencia) en lesiones primarias ortotópicas del modelo de carcinoma mamario, monitorizadas por la señal de fluorescencia generada por el tumor, y la señal de fluorescencia generada por estos conjugados. También se determinó la localización de los conjugados en los tumores a medida que progresaba el tiempo. Los animales se trataron como se describe en Materiales y Métodos, y la fluorescencia de ambas células tumorales y los conjugados 1, 4 y 41 (Referencia) fueron monitoreados por IVIS® 100 Imaging System desde el día 1 hasta el 7.

Las Figs. 1A, 1B y 1C muestran los patrones de acumulación de los conjugados 1, 4 y 41 (Referencia), respectivamente, en el tumor principal primario ortotópico MDA-MB-231-RFP de mama humano ortotópico en la almohadilla mamaria de ratones desnudos hembra CD-1, utilizando el Xenogen IVIS® System. Las imágenes completas de los animales se registraron concomitantemente usando conjuntos de filtros que comprenden un filtro de excitación de 500-550 nm y un filtro de emisión de 575-650 nm. Conjunto de filtros de fondo para la sustracción de la auto fluorescencia del tejido: filtro de excitación 460-490 nm y filtro de emisión 575-650 nm. Conjunto de filtros principal de imágenes fotosensibilizadoras: filtro de excitación 665-695 nm, filtro de emisión 810-875 nm.

Todos los conjugados se acumularon en el tumor mientras que se eliminaban por completo del hígado, proporcionando una formación de imágenes selectiva del tumor a ≥ 3 días al final del período de seguimiento a los 7 días después de la inyección y después un aclaramiento muy lento. El tamaño y la ubicación del tumor no cambió a lo largo del experimento como se ve por el rojo de las imágenes de cuerpo entero in vivo. Como se muestra en las Figs. 2A, 2B y 2C, la localización de estos conjugados seis días después de la inyección se encuentra en el área necrótica del tumor.

Ejemplo 12. La actividad biológica delos conjugados 1, 4 y 41 (Referencia) en células de cáncer de próstata

En este estudio, se examinó la actividad biológica de los conjugados 1, 4 y 41 (Referencia) en células de cáncer de próstata LNCaP que expresaban integrina αvβ3 . Como se muestra anteriormente, estos conjugados específicos mostraron actividad en células de carcinoma de ovario, carcinoma de colon y cáncer de mama.

La acumulación de los conjugados en el tumor implantado se monitorizó a las 8, 11, 14, 24 y 48 horas después de la inyección usando el sistema Xenograph IVIS® y como se muestra en las Figs. 3A, 3B y 3C, referentes a los conjugados 1, 4 y 41 (Referencia), respectivamente, se observó el nivel de fluorescencia más alto en el área tumoral

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Claims

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