JPH07503944A - Ａｒｇ−ｇｌｙ−ａｓｐ配列の非ペプチド代替物およびそれらからなる医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＡＲＧ−ＧＬＹ−ＡＳＰ配列の非ペプチド代替物およびそれらからなる医薬組成 物 発明の分野および背景 本発明は、末端グアニジノおよびカルボキシル官能基を有する新規な非ペプチド 性化合物、それらの製造、ならびに幾つかの病理学的疾患の処置のためのそれら からなる医薬組成物に関する。

様々な細胞種が、他の細胞または細胞間基質（ＥＣＭ）の成分に接着しまたそれ らと相互作用する能力は、隣接細胞間およびそれらの細胞内のシグナリングを介 する細胞機能および組織統合性の維持に必須である（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、　１９ ９０　；　Ｈｙｎｅｓ。

１９９２　；　Ｓｈｉｍｉｚｕら、　１９９１）。細胞質の可溶性もしくは不溶 性成分１間質マトリックスまたはＥＣＭとの細胞性相互作用は、リンパ球、腫瘍 細胞および血小板を包含する大部分の細胞種上に存在する。インテグリンと命名 された細胞表面受容体のファミリーを介して主に行われる（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ 、　＋９９１　；Ｈｙｎｅｓ、　１９９２　）。

インテグリンは、非共有結合で結合するアルファ（α）およびベータ（β）サブ ユニットからなるヘテロダイマー分子である。１１個のαおよび６個のβサブユ ニットが同定されている。αおよびβサブユニットの組合わせがある種の組織お よび細胞種において高い適合性を示すが、他の場合には分解する。

インテグリンは、細胞外のＥＣＭを、細胞内のアクチン含有細胞骨格と統合させ るのに重要な役割を果たしている。それらは二頭であり、その細胞外部分は多く の場合、これらのリガンド内のＲＧＤ　（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）配列を認識 する接着蛋白質の結合に関与し、細胞内部分は細胞骨格の要素と相互作用する。

数種のインテグリン受容体の標的エピトープはＲＧＤ配列であり、数種のマトリ ックス関連接着糖蛋白質、たどえばフィブロネクチン（ＦＮ）、ビトロネクチン （ＶＮ）、フィブリノーゲン、トロンポスボンジン、およびフォノ・ビルプラン ト因子（Ｙａｍａｄａ　＆　Ｋｅｎｎｅｄｙ、　＋９８４　＋Ｈｙｎｅｓ、　１ ９９２　；　Ｒｏｕｓｌａｈｔｉ、　１９８８　；Ｄ″５ｏｕｚａら、　１９９ １ａ　）によって共有される細胞接着モチーフである。

これらの蛋白質中性質が一番よくわかっているものは、細胞間基質および細胞質 の大きく豊富な糖蛋白質、フィブロネクチンで、これはプロトタイプ細胞接着分 子として働く。フィブロネクチンは、真核細胞においては細胞の付着および伸展 を支持し、また細菌の細胞接着を仲介する多重機能蛋白質である。それは、グリ コサミノグリカン、ヘパリン、プロテオグリカン、フィブリンおよびコラーゲン を包含する多くの細胞表面およびマトリックス構成成分に結合し、様々な細胞応 答を誘発する（Ｈｙｎｅｓ、　＋９９０　）。

トリペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ　（ＲＧＤ）は、細胞の付着を仲介するフ ィブロネクチンの中心細胞結合ドメイン内における最小配列として同定された。

ＲＧＤ配列は、αＩＩＢβ３　（ＧＰＩＩｂ−１１１ａとも呼ばれる）、α３β １．（２５βｌ　（それぞれＶＬＡ−３およびＶＬＡ−５とも呼ばれる）および 大部分のαＶ−含有含有インリグリンむ数種の受容体によって認識される（Ｈｙ ｎｅｓ、　１９９２　；Ｅｌｉｃｅｓら。

１９９１　；　Ｓｈｉ叫ＺＵら、１９９の。細胞の活性化後に、これらの受容体 はＲ，ＧＤ−依存性細胞一７トリックス接着、または細胞凝集を仲介する（Ｐｈ ｉ　Ｉ　ｉｐｓら、１９９１：Ｄ’　５ｏｕｚａら、　１９９＋ａ　；Ａｄｌｅ ｒら、　＋９９１）、溶液中に存在する場合、ＲＧＤ配列を含有するペプチドは 、フィブロネクチンおよび他のＲＧＤ−含有マトリックス蛋白質とそれぞれのイ ンテグリン受容体への結合に関して競合し、細胞接着を防止する（Ｓｐｒｉｎｇ ｅｒ、　＋９９０　；　Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ　＆　Ｇｉａｎｃｏｔｔｉ、　＋９ ８９　）　。表面に固定化されたどきは、短い合成ＲＧＤペプチドはフィブロネ クチンの細胞結合性を模倣するが。

それらの相当するインテグリンに対するアフィニティーはネイティブなリガンド の場合の約１０”　〜１０’低い（Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓら、　１９８６）。

ＲＧＤモチーフはフィブロネクチンに限定されるものではなく、実際、１００種 以上もの蛋白質内に存在する。一部の蛋白質では、細胞接着活性はＲＧＤ配列に 帰せられているが、大部分の他の蛋白質では、ＲＣ；Ｄ配列は機能的には無関係 であるように思われる。それは、細胞接着分子に共通のモチーフであることが見 出され、血小板凝集、免疫応答、癌転移１組織への細胞遊走、病原微生物の感染 。

アフリカッメガエルおよびショウジヨウバエ胚の原腸形成に重大な役割を演じて いる。それらの表面に配列ＲＧＤを発現することが見出された数種の蛋白質が。

インビトロで、明白な生理学的理由もなく細胞の付着を促進することも、この結 合の一般性を指示している。

ＲＧＤペプチドの機能的活性は様々な細胞種で証明された。ＲＧＤペプチドがフ ィブリノーゲンおよび他の関連蛋白質の血小板（小徐核血球）への結合を阻止で きて、血栓形成に重要な、血小板凝集、細胞−細胞相互作用を阻止することはと くに重要である。この観察は、ＲＧＤペプチドが抗血栓剤として機能できる可能 性“を示すものである。

ＥＰ４１０５３９として公開された欧州特許出願にはＲＧＤ配列を含有する小さ な環状へキサペプチドであるフィブリノーゲン受容体アンタゴニストが記載され 、血小板凝集の阻止に有用であると主張されている。ＥＰ４０６４２８として公 開された欧州特許出願には、血小板凝集阻害剤および腫瘍転移抑制剤として有用 な細胞接着インヒビターであるＲＧＤ配列含有合成環状ペプチドが記載されてい る。ＥＰ３９４３２６として公開された欧州特許出願には、配列ＲＧＤがコンフ ォーメーション的に安定化した形で導入され、接着蛋白質たとえばビトロネクチ ンの結合のし　または人工装具や移植体を含めた医用デバイスのコーティングの ようなインビボ使用もしくは細胞培養基板のような基板のコーティングにおける インビ！・口使用ての細胞接着の促進に利用できる合成ペプチドが記載されてい る。ＥＰ３８４３６２として公開された欧州特許出願には、蛋白質−血小板接着 、細胞−細胞接着および血小板凝集のインヒビターとして有用な改良ペプチドが 記載されている。ＷＯ９０１１２９７として公開された国際出願には、ＲＧＤ配 列を含有する細胞付着促進結合部位である生物学的活性部位、およびペプチドの たとえば移植される人工装具のコーティング中の固体基質への付着を促進するの に有用な疎水性付着ドメインからなる接着ペプチドが記載されている。

ＲＧＤ−仲介認識の生理学的役割はこれらの生物学的過程を超えて広範囲に及ぶ ものと思われる。病原微生物はＲＧＤ−含有ＥＣＭ糖蛋白質に接着することがで きる。たとえば、　Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　ｃｒｕｚｉはフィブロネクチンに 接着し、フィブロネクチンＲＧＤ細胞付着ドメインから設計されたペプチドはＴ 、　ｃｒｕｚｉ感染を阻止することが明らかにされた（Ｏｕａｉｓｓｉ　ら、　 １９８６）。

興味あることに、い（つかの非−ＥＣＭ関連蛋白質がＲＧＤまたはＲＧＤ一様分 子を含有する。とくに、ＲＧＤ配列は、ヒト免疫不全ウィルスＩ型（ＨＩＶ−ｌ ）のトランス作用（ｔａｔ）因子中にも見出されている。ウィルスの複製を調節 する蛋白質は、他の疾患たとえばカボジ肉腫の表出も誘発する。可溶性のｔａｔ はＲＧＤ−依存性様式で数種のインテグリンに結合することが明らかにされてい る（Ｖｏｇ６１　ら、　１９９２）。

ＲＡＤ、ＲＥＤ、ＲＦＤおよびＲＹＤ配列を含有するペプチドは、インテグリン に無関係な免疫機能に干渉することが想定された。ＲＡＤＳ、ＲＦＤＳおよびＲ ＹＤＳ配列はそれぞれＣＤ４またはＭＨＣ−Ｉおよび■分子の機能的アドヒージ ョトーブを構成すると想定されてきた（Ｍａｚｅｒｏｌ　ｌｅｓら、１９９の。

抗原提示細胞上に存在するヒトＨＬＡ−ＤＲ抗原は、配列ＲＹＤＳを含有し、Ｔ 細胞ＣＤ４抗原によって認識される。ＣＤ４−　ＨＬＡ−ＤＲ相互作用との干渉 は不完全なＴ細胞活性化を生じる可能性が考えられる。

ペプチドＲＦＤＳを含有するヒト主要組織適合性複合系クラス■抗原（ＭＭＣ− Ｋ）から誘導された合成ペプチド、ならびにＲＡＤＳペプチドを含有するＴ細胞 ＣＤ４分子の免疫グロブリン様アミノ末端ドメインから誘導されたペプチドは。

抗原誘導ＨＬＡクラスー■−限定Ｔ細胞増殖性応答および抗体合成に対して特異 的な阻害作用を示すことが明らかにされた（Ｍａｚｅｒｏ　Ｉ　Ｉｅｓら、　１ ９８８）。

ＲＹＤＳ配列はフィブリノーゲンのＲＧＤ細胞結合ドメインを模倣することが示 されている。ＲＹＤ配列は、ＦＮ、フィブリノーゲン、ビトロネクチン等に特異 的な血小板インテグリンＧＰＩ［ｂ−１［Ｉａの結合部位に特異的なモノクロー ナル抗体のＣＤＲ−３（相補性決定領域）の必須部分として包含される。このＣ ＤＲ−３から誘導されるＲＹＤＳ部位含有１２−マーペプチドはそのＧＰＩＩｂ −ｍａ受容体へのＲＧＤ−依存性フィブリノーゲン結合を阻害した（Ｔａｕｂら 、　１９８９）。

ストレプトアビジンＲＹＤ−配列はまた。ＲＧＤ配列を模倣し、その蛋白質のＲ ＧＤ−依存性細胞結合および接着を仲介することが示されている（Ａｌｏｎら。

＋９９０）。最近、別経路でスプライスされたＦＮの細胞結合ドメインのＲＥＤ Ｖ配列は、その非ＲＧＤ依存性インテグリン受容体、α４β１へのＦＮ−結合に 関与することが明らかにされている（Ｍｏｕｌｄら、　１９９１　）。

さらに、ＤＧＲ配列を含有する逆位ペプチド５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇは 、ビトロネクチン−コート基板およびフィブロネクチン−コート基板上でのＢＨ Ｋ細胞およびヒナ胚線維芽細胞の伸展を阻止することが明らかにされた。ＤＧＲ −含有配列は、ＲＧＤＤ識に関わるインテグリン内のりガント−結合ポケットの 部分を構成することが示唆されている。少なくとも、それらは接着蛋白質上のＲ ＧＤ配列と相互作用して、それらのインテグリンとの相互作用を阻害もしくは遮 断するものと考えられる（Ｙａｍａｄａ　＆　Ｋｅｎｎｅｄｙ、　１９８７　） 。

ペプチドＲＧＤ類縁体の使用にはいくつかの欠点があり、それは主としてインビ ボにおける蛋白分解酵素によるペプチド結合の切断である。したがって、インテ グリンー仲介細胞機能のようなＲＧＤ認識に依存する生物学的相互作用に干渉す る有用なツールとして使用されるためには、蛋白分解的消化に抵抗性を示す機本 発明によれば、グアニジノおよびカルボキシル末端基からなりそれらの間に１１ 原子のスペーサー配列を有するある種の非ペプチド性化合物は、ＲＸＤまたはＤ ＧＲ認識［式中、ＸはＧ　（ｇｌｙ）、　Ｅ　（ｇｌｕ）、　Ｙ　（ｔｙｒ）、 　Ａ　（ａｌａ）またはＦ　（ｐｈｅ　）である］に依存する細胞または分子相 互作用の効果的なインヒビターであることが見出された。これらのＲＸＤおよび ＤＧＲ類縁体を本明細書においては、ｒＲＸＤ代替物」と呼ぶ。

したがって１本発明は、天然α−アミノ酸の配列をもたず、その少なくとも５個 は炭素原子である１１原子の配列を挟むグアニジノおよびカルボキシル末端官能 基からなり、細胞接着を阻害できる非ペプチド性化合物、ならびにその塩に関す る。

一実施態様においては９本発明の化合物は、一般式（式中、Ａは９原子の鎖であ り、その少なくとも３個は炭素原子で、残りはへテロ原子、たとえば窒素、酸素 および／または硫黄原子である）に相当する。９原子ＨＡは、飽和でも不飽和で も、置換されていても非置換でもよく、またＡ鎖の１個または２個以上の原子が 環のメンバーとして炭素環またはへテロ環基に包含されてもよい。

本発明はさらに１本発明の非ペプチド性化合物の製造方法に関する。

本発明のＲＸＤ代替物は、ＲＸＤおよびＤＧＲｇ識に依存する生物学的相互作用 、とくにインテグリンー仲介ＲＧＤ−依存性相互作用のそれらによる阻害に関連 する様々な適用を存する。したがって１本発明はまた。ある種の疾患、たとえば 血栓症、癌の転移、自己免疫疾患および他の免疫応答たとえばアレルギー、移植 片対宿主および宿主対移植片反応の処置、ならびに痘痕組織形成の阻害のための 、ＲＸＤ代替物からなる医薬組成物に関する。

図面の簡単な説明 図１はＳＦ−６，５，ＡＣ−１５，ＡＣ−４およびＡＣ−１４として同定された 本発明の化合物、ならびにＳＦ−６，６および５ＦＮ−Ｔｏとして同定された比 較用の化合物の化学構造を示す。

図２は、ＮＳ−８，ＮＳ−１１およびＮＳ−１５として同定された本発明の化合 物の化学構造を示す。

図３は、化合物ＳＦ−６，５（黒丸）およびＳＦ−６，６（白丸）による血小板 凝集阻害の用量依存曲線を示す。

図４は１本発明の化合物ＳＦ−６，５およびＡＣ−１５ならびに比較のための化 合物ＲＧＤ、ＧＲＧＤＳＰおよび５Ｆ−６，６による血小板凝集の阻害を例示す る。

図５は９本発明の化合物ＮＳ−８（白三角）、ＮＳ−１１（黒四角）およびＮＳ −１５（黒丸）による血小板凝集阻害を、ペプチドＲＧＤＳ　（斜線入り四角） と比較して例示する。

図６は、抗−ＧＰＩ［ｂ−ＩＩ［ａモノクローナル抗体（ＰＡＣ−１）の血小板 への結合能の１本発明の化合物ＳＦ−６，５（白三角）による阻害を、化合物５ Ｆ−６，６（黒丸）ならびにペプチドＧＲＧＤＳＰＫ（白丸）およびＧＲＧＥＳ Ｐ（黒三角）と比較して例示する。

対するＡｒｇおよびＡｓｐ残基の不可欠な役割を示した構造−機能研究に基づき 、既知のＲＧＤ−含有ペプチドのインテグリン上におけるそれらの推定部位への 結合アフィニティーに対する主要な寄与がＡｒｇおよびＡｓｐ残基それぞれのグ アニジニウムおよびカルボキシレート基に依存すること（Ｄ’　５ｏｕｚａら、 　１９９１ｂ　’）　、ならびに、ＲＧＤ−含有ペプチドがインテグリン特異性 を欠き、インテグリンと結合しないかまたは結合してもＲＧＤリガンドに比べて アフィニティーははるかに低いという証拠（Ｄ’　５ｏｕｚａら、　１９９１ｂ 　；Ｓｈｉｍｉｚｕら、１９９のに基づき、これらの２つの官能基の間には適当 な原子間隔が必須と思われるという事実を考慮した。さらに、必要な原子間距離 で適当な官能性を有する比較的フレキシブルな鎖分子でもＲＧＤ−含有ペプチド の場合と類似の官能効果を発揮できることが考慮された。

本明細書で用いられるｒＲＸＤ代替物」の語は、天然のα−アミノ酸残基の配列 をもたず、その少なくとも５個は炭素原子であり残部は炭素原子またはへテロ原 子たとえば窒素、酸素および／または硫黄原子である１１原子の鎖を挟むグアニ ジノおよびカルボキシル末端官能基からなる新規な非ペプチド性化合物、ならび にその塩を意味する。

末端の官能性グアニジノおよびカルボキシ基に隣接する２つの炭素原子は２図１ に示すように、置換されていないことが好ましい。残りの９個の原子鎖は、飽和 でも不飽和でも、ｉ換されていても非置換でもよい。

スペーサー鎖における置換基としては、それらに限定されるものではないが。

ハロゲン、アミノ、オキ′ムチオキソ、イミノ、ヒドロカルビル、ヘテロ環、カ ルボキシルおよびチオカルボキシルならびにそれらのエステル、カルボキシアミ ド、チオカルボキシアミド、カルバモイル、チオカルバモイル、ヒドロキシなら びにそれらのエーテルおよびエステル、メルカプトならびにそれらのエーテルお よびエステルのような基を挙げることができる。水素原子を有する基はすべて。

１　さらに、たとえばヒドロカルビルまたはへテロ環基で置換されてもよい。こ の場合のエステルおよびエーテルは、脂肪族、芳香族およびヘテロ環残基、好ま しくは、スペーサー鎖について上に指示したようにさらに置換されていてもよい ヒドロカルビルおよびヘテロ環基からなる。ヒドロキシル基のエステルはまた。

無機酸たとえばリン酸で形成されてもよい。さらに、スペーサー鎖の１個または ２（ｉ１以上の原子は少なくとも３員の炭素環またはへテロ環の部分を形成して もよい。

本明細書において［ヒドロカルビルｊの語は、脂肪族、脂環式およびアリール基 がら選ばれるＣ、−Ｃ，、飽和および不飽和基、たとえばアルキル、アルケニル 。

シクロアルキルおよびアリール基を意味する。好ましいヒドロカルビル基は０１ 〜Ｃ，さらに好ましくは０１〜Ｃ４アルキル基、およびフェニルである。

本明細書において「ヘテロ環」の語は、１個または２個以上のＮ、　Ｏおよび／ またはＳ原子を合作する飽和および不飽和３〜８．好ましくは５〜７員のへテロ 環基、たとえばピペリジルおよびピリジル基を意味する。

治療に使用するためには化合物は水溶性でなければならず、可溶性の化合物を生 じる任意の置換基が本発明に包含される。このような置換基の例には、鎖内に− ＧＯ−ＮＨ−もしくは−ＮＨ−Ｃｏ−基を形成するオキソ基、ならびにカルボキ シおよび／またはアミノ基がある。

本発明の好ましい一連の化合物には、１個または２個以上の−Ｃｏ−ＮＨ−を存 し、以下の式によって表される化合物が包含される。

（工ａ） 式ＩａおよびＩｂ中、ｎは少なくとも１．ｆ＆高８であり１式ＩｃおよびＩｄ中 。

ｘ、ｎおよびｍはそれぞれ少なくとも１で、Ｘ＋ｍ十ｎの合計は７である。この シリ・−ズの化合物の実例には１式を図１に示ｔＳＦ−６，５およびＡＣ−１５ と命名された化合物で、それぞれ式Ｉａにおいてｎが５および４の化合物、なら びに式を図１に示すＡＣ−４およびＡＣ−１４と命名された化合物で、それぞれ 式ＩｃにおいてＸが４．　ｎがＩ、ｍが２．またはＸが３．　ｎおよびｍがいず れも２の化合物がある。

本発明の他の化合物は、以下の式で例示される。

以上の−ＣＯ−ＮＨ−残基および炭素環とくにフェニル環またはへテロ環とくに ピペリジン環を有する化合物からなる。Ａｍの１個または２個以上の原子がこの ような環の一部を形成する場合は常に、それらは開いた鎖の原子間の環の最短の 鎖内力体発明によって構成される。これらの化合物は以下の式によって表される 。

上記式中２０およびｍはそれぞれ少なくとも！で、ｍ＋ｎの合計は式ｍｃで（よ ６、式Ｉｄでは５１式Ｉ［ａおよびｍｅでは４１式ｍｂでは３である。このシＩ Ｊ−ズの化合物の実例には１式を図２に示すＮＳ−８，ＭＳ−１１およびＮＳ− １５があり、それぞれ式ｍｃ　（ｎ−４，ｍ＝２）、Ｉ［［ｄ　（ｎ＝３．ｍ＝ ２）およびｍａ　（ｎ＝ｍ＝２）の化合物である。

好ましい化合物の他のフリーズは以下の式の化合物である。

上記式中、ｎは少なくとも１であり、最高９式ＩＶｃおよびｌＶｄ１こお０て（ よ７゜式ＩＶｂおよびＩＶｅにおいては８２式ＩＶａにおいては９である。

本発明はさらに、有機または無機塩基から誘導される本発明のｆ（：替物の塩を 包含する。

式１ａの化合物は以下の工程からなる方法によって製造される。すなわち。

（ａ）式ＺＮＨ−（ＣＨＩ　’）、−Ｃ０ＯＨ（式中、Ｚは保護基、たとえ（ｆ Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル、以下Ｎ−ｔ−Ｂｏｃである）のＮ−保護アミ ノカルボン酸の２式Ｈ，Ｎ−（ＣＨ，）ｉ−＋＋　−Ｃ０ＯＲ（式中、　Ｒ１よ 低級アルキルである）との、標準操作たとえば１，３−ジシクロヘキシルカルボ ジイミドびｌ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾールもしくはＮ−ヒドロキシスクシ ンイミドを用いたカップリング。

（ｂ）得られた式ＺＮＨ−（ＣＨＩ　）−−Ｃ０−ＮＨ−（ＣＨｔ）＊−−−Ｃ ＯＯＲの化合物からたとえばトリフルオロ酢酸による保護基の除去で式Ｈ，Ｎ− （ＣＨ，）、−Ｃ０−ＮＨ−（ＣＨ，）、、−Ｃ０ＯＲの化合物の生成：および （Ｃ）たとえば３．５−ジメチルピラゾールｌ−カルボキシアミジン硝酸塩との 反応による遊離アミノ基のグアニジノ基への変換、およびエステル基Ｒの同時除 去、である。

上記方法により、化合物ＳＦ−６，５およびＡＣ−１５は、ジクロロメタン中。

１、　３−ジシクロへキシルカルボジイミドおよび！−ヒドロキシベンゾトリア ゾールを用い、それぞれ、６−アミノヘキサン酸メチルエステルをＮ−ｔ−ブチ ルオキシカルボニル−５−アミノペンタン酸と、または５−アミノペンタン酸メ チルエステルをＮ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−６−アミノへキサン酸とカッ プリングさせることによって製造された。ブチルオキシカルボニル保護基をつい で。

ジクロロメタン９５０％トリフルオロ酢酸によって除去し、アミンをｐＨ９，５ で３，５−ジメチルピラゾール１−カルボキシアミジン硝酸塩を用いてグアニジ ンに変換した。メチル基はこの反応条件下に除去された。

式ＩＣ（７）化合物はメリーフィールド樹脂上、標準操作（Ｂａｒａｎｙ　＆　 Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ。

１９８０）に従い段階合成によって製造される。すなわち、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−ω −アミノ酸を製造し、セシウム塩性によってクロロメチル化ポリスチレン１％ジ ビニルベンゼンにカップリングする。ポリマー上でのカップリングは２倍過剰の Ｎ−を−Ｂｏｃ−ω−アミノ酸と、試薬としてＮ、　Ｎ’−ジシクロヘキシルカ ルボジイミドおよびｌ−ヒドロキシベンゾトリアゾールの等モル混合物を用いて 手動で実施できる。メチレンクロリド中５０％トリフルオロ酢酸による脱保護お よび同一条件下における次のＮ−ｔ−Ｂｏｃ−ω−アミノ酸へのカップリングに より、ポリマーにカップリングした最終生成物が得られる。脱保護および樹脂か らの切断は無水ＨＦで処理して行われる。粗生成物を５０％酢酸で抽出し、凍結 乾燥する。アミノ基のグアニジノ基への変換は、化合物Ｉａの製造に関して上述 したのと同様にして実施する。最終生成物は逆相クロマトグラフィ一ついで製造 ＨＰＬＣ精製によって精製する。

式Ｉｂの化合物は２式ＺＮＨ−（ＣＨ，）、−ＮＨ，で表されるモノ保護ジアミ ンを式ＨＯＯＣ−（ＣＨ，）＃−＊　−Ｃ０ＯＲ（式中、Ｒは低級アルキルであ る）のジカルボン酸モノアルキルエステルとカップリングさせ１式Ｉａの化合物 の製造の工程（ｂ）および（Ｃ）において上述したのと同様にして保護基の除去 およびアミノ基のグアニジノ基への変換を行う段階合成によって製造される。た とえば、ｎが３の場合は、Ｎ−モノベンジルオキシカルボニル−プロパンジアミ ンをスペリン酸のモノメチルエステルとカップリングさせる。

式Ｉｄの化合物は、最初に１式ＨＯＯＣ−（ＣＨｔ　）−−ＮＨｔのアミノカル ボン酸を式ＨＯＯＣ−（ＣＨ，）、−Ｃ０ＯＲ（式中、Ｒは低級アルキルである ）のジカルボン酸モノエステルとカップリングさせ、ついで式ＺＮＨ−（ＣＨ， ）、−ＮＨ，のモノ保護ジアミンとさらにカップリングさせ、上述のように保護 基の除去およびアミノ基のグアニジノ基への変換を行って製造される。

たとえば、Ｘが３で、ｎ＝ｍ＝２の場合は、β−アラニンをコハク酸モノメチル エステルとカップリングさせ、得られた化合物をＮ−モノベンジルオキシ力ルボ ニループロバンジアミンとカップリングさせる。

上記式Ｉ［ａ、ＩＩｂおよびＩＩｃの化合物のようにアミノまたはカルボキシル 基で置換された化合物は、メリーフィールド樹脂上、適当に置換されたアミノカ ルボン酸および／またはモノ保護ジアミン（化合物ＩＩｃ）を用い１段階合成に よって製造される。

式ｍａ−ｅの化合物はメリーフィールド樹脂上１式１ｃの化合物の製造について 上述した標準操作に従い１段階合成によって製造される。

式ＩＶａの化合物は２式ＺＮＨ−（ＣＨ２）、−ＮＨ，（式中、Ｚは保護基、た とえばＮ−ｔ−Ｂｏｃまたはベンジルオキシカルボニルである）のモノ保護ジア ミンを式Ｂｒ−（ＣＨ，）　１．−、−　Ｃ０ＯＲ（式中、Ｒは低級アルキルで ある）ノω−ブロモカルボン酸のアルキルエステルと、標準操作を用いて、たと えば溶媒としてジメチルホルムアミド、塩基としてトリエチルアミンを用いてカ ップリングさせる方法によって製造される。保護基の除去および一級アミンのグ アニジノ基への変換は式１ａの化合物の製造について上述したのと同様にして行 われる。たとえば、ｎが５の化合物を製造する場合は、Ｎ−モノベンジルオキシ カルボニル−ペンタンジアミンを５−ブロモ吉草酸のメチルエステルとカップリ ングさせる。

式ＩＶｂの化合物は１式ＺＮＨ−（ＣＨ，）、−ＯＨのＮ−保護アミノアルコー ルをを式ＨＯＯＣ−（ＣＨ，）、、−Ｃ０ＯＲのジカルボン酸モノエステルと。

カップリング剤として１．３−ジシクロへキシルカルボジイミドを用いてカップ リングさせる方法によって製造される。保護基の除去および一級アミンのグアニ ジノ基への変換は式Ｉａの化合物の製造について上述したのと同様にして行われ る。たとえば、ｎが５の化合物を製造する場合には、Ｎ−ｔ−ブチルオキシカル ボニルアミノペンタノールをアジピン酸モノメチルエステルとカップリングさせ る。

式ＩＶｃの化合物は１式Ｂｒ−（ＣＩ（２）−、−Ｃ０ＯＲのω−ブロモカルボ ン酸エステルとシアン酸ナトリウムを反応させ、弐〇ＣＮ−（ＣＨ２）＄−ａ　 −ＣＯＯＲのω−イソシアネートカルボン酸アルキルエステルを形成させる方法 によって製造される。これをさらに１式ＺＮＨ−（ＣＨ２’）、−ＮＨ，のモノ 保護ジアミンと反応させると式ＺＮＨ−（ＣＨｚ　）−−ＨＮＣＯＮＨ（ＣＨｔ 　）ｓ−−Ｃ０ＯＲの保護された尿素が生成する。保護基の除去および一級アミ ンのグアニジノ基への変換は式Ｉａの化合物の製造について上述したのと同様に して行われる。たとえば、ｎが３の化合物を製造する場合は、５−ブロモ吉草酸 のメチルエステルを５−イソシアネート吉草酸のメチルエステルに変換し、つい てこれをＮ−モノベンジルオキシカルボニル−プロパンジアミンと反応させる。

式ＩＶｄの化合物は、上述のように製造された弐〇〇Ｎ−（ＣＨ，）、−、−Ｃ ＯＯＲのω−イソシアネートカルボン酸アルキルエステルを式ＺＮＨ−（ＣＨ， ）、−ＯＨて表されるＮ−保護アミノアルコールと反応させ２式ＺＮＨ−（ＣＨ Ｉ　）、−０ＣＯ−ＮＨ（ＣＨ２）ｊ−＋＋　−Ｃ０ＯＲの保護カルバメートを 形成させることによって製造される。保護基の除去および一級アミンのグアニジ ノ基への変換は式Ｉａの化合物の製造について上述したのと同様にして行われる 。

たとえば、ｎが３の化合物を製造する場合は、５−イソシアネート吉草酸のメチ ルエステルを３−Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニルアミツブロバノールと反応さ せる。

式ＩＶｅの化合物は以下の工程：　（ａ）式ＣＨｓ　ｃｏｓ−（ＣＨＩ　）Ｉ− ｓ　−ＣＯＯＲのω−アセチルチオカルボン酸アルキルエステルを式Ｂｒ−（Ｃ Ｈ＝　）ｅ−−−Ｃ０ＯＲのω−ブロモカルボン酸アルキルエステルとチオ酢酸 ナトリウムの存在下に反応させて製造する工程、　（ｂ）式ＺＮＨ−（ＣＨｚ　 ）、−ＯＨのＮ−保護アミノアルコールをまずピリジン中ｐ−トルエンスルホニ ルクロリドとの反応によりそのトシレートに変換し１次にチオ酢酸ナトリウムと の反応により式ＺＮＨ−（ＣＨ，）、−５ＣＯＣＲ，に変換する工Ｌ　（ｃ）工 程（ａ）および（ｂ）において製造された化合物のアセテート基を塩基性条件下 たとえば炭酸ナトリウムを用いて除去して、相当するチオール化合物を製造する １乱および（ｄ）工程（Ｃ）の２つのチオールを、ついて酸化剤としてアザジカ ルボン酸ジエチルエステルを用いて反応させることにより２式ＺＮＨ−（ＣＨ， ’）、５Ｓ（ＣＬ　）＊−ｓ　−Ｃ０ＯＲの非対称ジスルフィドを形成させる工 程からなる方法によって製造される。たとえば、ｎが４の化合物を製造する場合 は、５−ブロモ吉草酸のメチルエステルをチオ酢酸ナトリウムとの反応により保 護チオールに変換し、またＮ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−４−アミノブタノ ールを相当するトシレートに変換し、ついでチオ酢酸ナトリウムで置換する。ア セテート基を塩基性条件下に除去し、得られたＮ−ｔ−ブチルオキソカルボニル −４−アミノブタンチオールを、得られた５−メルカプト吉草酸メチルエステル とアザシアカルボン酸ジエチルエステルを含有する溶液に添加する。

最終化合物はすべて、製造ＲＰ−１８カラム上で精製し、薄層クロマトグラフィ ー（単一スポット）および’　Ｈ−ＮＭＲスペクトルによって純粋と判定された 。

化合物は’　Ｈ−ＮＭＲおよびＦＡＢ−ＭＳスペクトルによって特徴づけられ、 これらは割り当てられた構造に一致した。

本発明のＲＸＤ代替物はＲＸＤの認識に依存する生物学的相互作用を阻害するこ とができる。本発明に包含されるＲＸＤパターンによって仲介される多様な認識 過程の例には、それらに限定されるものではないが、ＲＧＤ、ＲＹＤ、ＲＥＤ。

ＲＡＤ、ＲＦＤおよびＤＧＲ配列の関与する細胞および分子相互作用、とくにイ ンテグリン仲介ＲＧＤ依存性相互作用が包含される。

本発明の非ペプチド性ＲＸＤ代替物は細胞接着を阻害する。本明細書で用いられ るＦＩＨ胞接着Ｊの語は以−トの相互作用、ずなわぢ（ａ）血小板凝集によって 例示される細胞−細胞接着、（ｂ）ＥＣＭ＜７）ＲＧＤ−含有糖蛋白質に対する リンパ球および転移腫瘍細胞の接着によって例示される血清またはＥＣＭの糖蛋 白質に対する細胞接着、（ｃ）　Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｒｋｌｃｒｕｚｉのフィブ ロネクチンへの接着に、よっ゛ζ例示されるＥＣＭのＲＧＤ−含有糖蛋白質に対 する病原生物の付着、および（ｄ）ＨＩＶ−１のｔａｔ因子へのリンパ球の接着 によって例示されるＲＧＤ−含有卵−ＥＣＭ蛋白質に対する細胞接着を包含する 。

本発明の代替物は血小板凝集を阻害することができる。細胞間基質中および細胞 表面上に存在するＦＮとリンパ球および腫瘍細胞の相互作用は、細胞接着および 遊走に主要な役割を果たすものと考えられてきた。ＲＧＤ代替物の血小板凝集阻 害能を考慮して、それらがＦＮまたはＶＮへのＴリンパ球および腫瘍細胞の結合 も競合的に阻害できるか否かが試験された。このような阻害は、それらの重接着 蛋白質上のＲＧＤ配列に強く関連することが示されている（ｖａｎ　５ｅｖｅｎ ｔｅｒら。

１９９１　；　Ｓｈｉｍｉｚｕら、　１９９０　ＨＡｌｄｅｒら、　１９９１　 ；　Ｒｕｏａｌａｈｔｉ　ら、　１９８９）、回答は肯定的であった。結果は以 下の表ＩＡおよびＩＢに示す。

細胞接着のインヒビターとして１本発明の化合物は、フィブロネクチンおよびビ トロネクチンへの癌細胞の接着を阻害し、したがって転移を防止できる。それら はまた１組織へのリンパ球の遊走を遮断し、したがって免疫細胞に依存する幾つ かの免疫疾肛たとえばアレルギーを阻止する。それらは血小板凝集も阻害し。

したがって血小板性血栓、血栓塞栓症、冠状動脈および他の動脈の血管形成術後 の再閉鎖ならびに心筋梗塞の予防および／または処置に使用できる。さらに、こ の代替物は、ある種の抗原提示細胞との主要リンパ球の相互作用を阻害し、した がってＴ細胞の活性化を阻止する。これは自己免疫疾患の処置に有用である。線 維形成過程との関連での線維芽細胞によるフィブロネクチン認識との競合を介し て、この代替物は極めて初期段階において痘痕組織形成を阻害し、これは創傷治 癒過程に有用である。

したがって、好ましい一実施態様においては１本発明の化合物はＲＧＤ代替物で あり、ＲＧＤ依存性の細胞および分子相互作用の両者を阻害する。この点におい て９本発明の化合物は、血栓症、自己免疫疾患、転移、免疫疾患たとえばアレル ギー２移植片対宿主および宿主対移植片反応の一連の疾患の処置、ならびに痘痕 形成を阻止した創傷の治癒に有用である。

本発明の化合物は、経口および非経口経路たとえば静脈内、皮下もしくは筋肉内 注射を含む任意の適当な経路で患者に投与できる。有効でかつ実質的に非毒性の 量の化合物が処置に使用されることになる。有効態は、単回または数回に分割し た１日用量の基準で０．　０１−１ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは０．５■／ ｋｇである。

本発明はさらに、活性成分として本発明の代替物と、医薬的に許容される担体を 含有する医薬組成物を提供する。組成物は、単位投与剤形あたり本発明の化合物 またはその混合物を約０．　７〜７０ｍｇを含む錠剤、カプセル、溶液または懸 濁液の形態とすることができる。化合物は慣用の様式により、生理的に許容され るビークルまたは担体、賦形剤、結合剤、防腐剤、安定剤等と混和してもよい。

たとえば、静脈投与用の注射剤は食塩水中、たとえば７．４のｐＨレベルにｍ製 することができ、血小板凝集の阻害の達成に適している。

他に態様においては９本発明のＲＧＤ代替物は２人工装具または移植物たとえば 移植人工血管を含めた医用装具のコーティングのような、たとえば、インビボで 使用される表面への細胞接着の促進剤として使用することができて、それらへの 細胞の付着を促進することができる。これらはまた、基板たとえば細胞培養基板 のコーティングにインビトロで使用し、細胞接着を促進することができる。

以下の実施例は１本発明の原理を実例によって例示する意図であって１本発明を 限定するものではない。

実施例 例１．　６−アザ−ツーオキソ−１２−ブアニジノドデカン酸［ＳＦ−６，５］ の製造 １、　１．　Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−６−アミノへキサン酸［化合物２］の製造ジ−ｔ −ブチルピロカルボネート（８，３１ｇ、３８圃ｏ１）を、６アミノヘキサン酸 ［化合物１１　（５ｇ、３８ｍｍｏｌ）および水酸化ナトリウム（３８ｍｌ、２ Ｎ溶液）のジオキサン（３０ｍｌ）中溶液に加えた。

この溶液を室温において４時間撹拌し、ついで２Ｎ−ＨＣＩて酸性にしてエーテ ル（１００ｍり中に注いだ。相を分離し、エーテル層を乾燥し減圧下に溶媒を除 去すると、化合物［２］が得られ、さらに精製することなく次工程に用いた。

１、　２．　５−アミノペンタン酸メチルエステル［化合物４］の製造５−アミ ノペンタン酸［化合物３］　（５ｇ、４１ｍｎｏｌ）を乾燥メタノール中飽和Ｈ ＣＩ溶液に加えた。この溶液を室温に３時間放置し、メタノールを減圧下に除去 した。残留物を最小量のメタノールに再溶解し、エーテルを加えて沈殿させると 、白色の結晶性化合物［４コが与られ、これを濾過し、エーテルで洗浄し。

真空中で乾燥し、さらに精製することなく次工程に用いた。

１．３．化合物［２］と［４コの活性エステル法によるカップリングＣＨ２Ｃ１ ｔ　／ＴＨＦ　Ｉ　：　Ｉ　（ｖ／ｖ　）溶液（７ｍｌ）中、化合物［２コ　（ ５００ｍｇ、２．　１６＋＋ｎ＋ｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ ２７３ｍｇ、２．　３７ｍｍｏｌ）を含有する溶液に１．３−ジシクロへキシル カルボジイミド（ＤＣＣ）（４９０ｍｇ、２．　３７１ＴＩＴｌｏｌ）を加えて 化合物［２］の活性エステルを生成させ。

−夜室温に放置した。得られた活性エステル溶液を濾過して反応中に生成したジ シクロ△、キシル尿素（ＤＣＵ）を除去し、乾燥ＣＨ２Ｃ１！で洗浄した。ＤＭ Ｆ（５ｍｌ）中トリエチルアミン（アミン塩酸塩を中和するため）を含有する化 合物［４］の溶液をついで化合物［２］の活性エステル溶液に加えた。５時間後 、この溶液を５％炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ｍ１）中に注ぎ、生成物を エーテルで抽出した。エーテルをＮａ　２　ＳＯ４上で乾燥し、減圧下に除去す ると１次工程用に十分な純度を有する粗生成物［５］が得られた。

１．４．Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ保護基の除去 粗生成物［５］をＣＨ，Ｃ１２：ＴＦＡ　（）リフルオロ酢酸）　１　：　Ｉ　 （ｖ／ｖ）にＯ″Ｃで溶解した。３０分後に、溶液を放置して３０分間で温度を 室温まで上昇させた。溶媒を減圧下に除去し、粗生成物を水に溶解し、エーテル で洗浄した。

水を減圧下に除去すると、遊離アミノ基を存する粗生成物が得られ、さらに精製 することな（次工程に使用した。

１．５．化合物ＳＦ−６，５の製造 エタノール（５ｍｌ）中、工程１．４において得られた脱保護アミン（２００ｇ 。

０、　８７ｍｍａｌ）を含有する溶液に３．５−ジメチルピラゾール１−カルボ キシアミジン硝酸塩（１７５ｍｇ、０．　８７ｍｍｏｌ）を加え、ついでＮａ　 ＯＨ（２Ｎ）を溶液に加えてｐＨを９．５とした。溶液を一夜５０℃で撹拌し、 溶媒を減圧下に除去し、粗生成物ＳＦ−６，５を逆相クロマトグラフィー、つい でＲＰ−１８カラムを用いてＨＰ　Ｌ　Ｃによって精製した。純度はＮＭＲでチ ェックした。

ＮＭＲ：　３．　１８　（ｔ、Ｊ＝６．５４Ｈｚ、２Ｈ）；　３．Ｉ　６　（ｔ 、Ｊ＝６゜９０Ｈｚ、２Ｈ）；２．３９　（ｔ、Ｊ＝７．１９．２Ｈ）；２．２ ３　（ｔ、Ｊ＝７．２１Ｈｚ、２Ｈ）；１．６４−１．４９　（Ｍ、８Ｈ）；１ ．３３　（ｔｔ。

２Ｈ）、ＦＡＢ−ＭＳ　（ｍ／ｅ）：２７３．３　（Ｍ＋１）。

例２．７−アザー８−オキソ−１２−グアニジノドデカン酸［ＡＣ−１５］の製 造化合物ＡＣ−１５は、出発原料として５−アミノペンタン酸メチルエステルお よびＮ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−６−アミノへキサン酸を用いた以外は例 １に記載の化合物ＳＦ−６，５と同様にして製造された。純度はＮＭＲでチェッ クした。

ＮＭＲ：２．９８　（ｔ、Ｊ＝６．４５Ｈｚ、２Ｈ）；２．９７　（ｔ、Ｊ＝６ ゜６９Ｈｚ、２Ｈ）：２．０６　（ｔ、Ｊ−６，７９Ｈｚ、２Ｈ）；　１．９７ 　（ｔ。

Ｊ＝７．３８８Ｚ、２Ｈ）；１．４９−１．２４　（ｍ、８Ｈ）；１．１６−１ ゜０５　（ｔｔ、２Ｈ）、ＦＡＢ−ＭＳ　（ｍ／ｅ）＋２７３．３　（Ｍ＋１） 。

例３．化合物ＳＦ−６，６の製造 この化合物はスペーサー鎖に余分のメチレン基を有し３本発明の化合物との比較 に使用した。これは、出発化合物として、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−６−アミノヘキサン 酸および６−アミノヘキサン酸メチルエステルを用いた以外は１例１に記載の化 合物ＳＦ−６，５と同様にして製造された。

ＮＭＲ：３．０３　ｃｔ、Ｊ＝６．７５Ｈｚ、２Ｈ）；３．０２　（ｔ、Ｊ＝６ ゜９６Ｈｚ、２Ｈ）；　２．２３　（ｔ、Ｊ＝７．３８Ｈｚ、２Ｈ）；２．０９ 　（ｔ。

Ｊ＝７．２８Ｈｚ、２Ｈ）；１．４６　（Ｍ、６Ｈ）；１．３７　（Ｑ、２Ｈ） 、１゜１９　（ｔ　ｔ＋　４８）、ＦＡＢ−ＭＳ　（ｍ／ｅ）：　２８７．３　 （Ｍ＋１）。

例４．化合物５ＦＮ−７０の製造 この化合物は化合物ＳＦ−６，５と類似の構造を有するが、末端グアニジノ基に 代えて一級アミノ基を有する。これは例１．　４からの適当なエステルを塩基水 溶液中で加水分解することにより製造さね７本発明の化合物との比較に使用され ｔら Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−β−アラニンは例Ｉに６−アミノヘキサン酸について記載され たようにして製造され、セシウム月決によってクロロメチル化ポリスチレン１％ ジビニルベンゼンにカップリングさせた。すなわち、ｔ−Ｂｏｃ−β−アラニン （１，７３ｇ、０．Ｏｌｍｏｌ）を水（１０ｍｌ）に溶解し、１Ｍ炭酸セシウム 溶液を加えてｐＨを７．０に調整した。溶媒を減圧下に除去し、残留物を真空中 Ｐ、０．上で乾燥した。乾燥した塩をＤＭＦ中に溶解して、ポリマーに加えた。

混合物を２時々振盪しなから５０°Ｃに１２時間保持した。溶媒を濾過し、ポリ マーを順９　ＤＭＦ、ＤＭＦ　：水９：ｌ混合物、およびエタノールで洗浄し、 真空中で乾燥した。ポリマー上でのカップリングは手動で行った。すなわち、メ チレンクロリド中５０％トリフルオロ酢酸で脱保護したのち、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ− β−アラニンへのカップリングは２倍過剰の保護アミノ酸に、試薬として１．　 ３−ジシクロへキシルカルボジイミドおよびｌ−ヒドロキシベンゾトリアゾール の等モル混合物を用いて実施した。同一の条件下に脱保護およびＮ−ｔ−ＢｏＣ −γ−アミノ酪酸へのカップリングを行うと、ポリマーにカップリングした最終 生成物が得られた。脱保護および樹脂からの切断は無水ＨＦによる処理で達成さ れた。

粗生成物を５０％酢酸中に抽出し、凍結乾燥した。アミン基のグアニジノ基への 変換は１例１において化合物ＳＦ−６，５の製造について記載したのと同様にし て実施した。最終生成物は逆相クロマトグラフィ一ついで製造ＨＰＬＣ精製によ って精製した。

ＡＣ−１４，ＮＭＲ：３．５８　（ｔ、Ｊ＝６．４１Ｈｚ、２ｈ）；３．５２（ ｔ、Ｊ＝６．７４Ｈｚ、２Ｈ）；　２．５６　（ｔ、Ｊ＝６．４２，２Ｈ）；２ ．５３　（ｔ、Ｊ＝６．７２Ｈｚ、２Ｈ）；　２．４４　（ｔ、Ｊ＝７．２５Ｈ ｚ。

２Ｈ）　：２．　００　（Ｑ、２Ｈ）、ＦＡＢ−ＭＳ　（ｍ／ｅ）　二２８８． 　３　（Ｍ＋１）　。

ＡＣ−４］の製造 この化合物は式（Ｉｃ）においてＸが４．　ｎがｌ、ｍが２の化合物に相当する 。

これは例５に記載された化合物ＡＣ−１４と同様にして製造された。

ＮＭＲ：３．７０　（Ｓ、２Ｈ）；３．３１　（ｔ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、２Ｈ）； ３．０４　（’ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ）；２．４４　（ｔ、Ｊ＝６．４Ｈｚ 。

２Ｈ）；　２．１９（ｔ、Ｊ＝６．７Ｈｚ、２Ｈ）；１．４６（Ｍ、４Ｈ）。

ＦＡＢ−ＭＳ：　（ｍ／ｅ）：２８８．３　（Ｍ＋１）。

化合物［ＩＩａ］は、メリーフィールド樹脂上２例５におけるようにポリマーに カップリングされたＮ−ｔ−Ｂｏｃ−β−アラニンに出発して製造された。ポリ マー上でのカップリングは例５におけると同様に手動で行い、最初にＮ−ｔ−Ｂ ｏｃ−アスパラギン酸α−ベンジルエステル（二ついでＮ−ｔ−Ｂｏｃ−γ−ア ミノ酪酸にカップリングさせた。脱保護、樹脂からの切断およびアミノ基のグア ニジノ基への変換は例５の場合と同様に実施した。

化合物［ｎｂ］の製造には、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−アスパラギン酸α−ベンジルエス テルを例５に記載したのと同じ方法でメリーフィールド樹脂にカップリングさせ た。Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−β−アラニンの添加ついでＮ−ｔ−Ｂｏｃ−γ−アミノ酪 酸へのカップリングによる段階合庖続いて脱保護、切断、アミノ基のグアニジノ 基への変換、および逆相クロマトグラフィーを行い、化合物［ＩＩｂ］が製造さ れた。

化合物Ｉｎｃは、メリーフィールド法におけるように活性エステル法を用い。

β−アラニンベンジルエステルに出発して溶液中段階合成によって製造した。す なわち、β−アラニンベンジルエステルをＮ−ｔ−Ｂｏｃ−アスパラギン酸α＝ ベンジルエステルにカップリングさせ、生成物をＴＦＡ：ＣＨＩ　ＣＩ　１　１ 　：　１中。

例１．４におけると同様にして脱保護した。これをついで、モノベンジルオキシ カルボニル１．　３−プロパンジアミンにカップリングした。脱保護、それに続 くアミノ基のグアニジノ基への変換を例１．　５に記載したと同様に実施すると 、化合物Ｉ［ｃが得られ、これを逆相クロマトグラフィーにより精製した。

＋０．　１．　ジ保護ジアミンＨ，Ｎ−（ＣＨＩ　）２−　ＮＨ２は、ベンジル オキシカルボニルクロリド（１，２ｍｏｌｅ）を２当量のｌＮ−Ｎａ　ＯＨとと もにジアミン（Ｉｍｏｌｅ）の水（５００ｍｌ）溶液に添加して製造された。生 成物を水およびヘキサンで洗浄し、Ｐ２Ｏ５上て乾燥し、エタノールから再結晶 した。

１０．２．モノ保護ジアミンは氷酢酸（１００ｍ１）中ジ保護ジアミン（０，０ ６ｍｏｌｅ）の溶液と濃塩酸（Ｉ　Ｏｍｌ、０．　１２ｍｏｌｅ）を還流下に１ 時間加熱し、室温に一夜放置して製造した。ジアミンの二塩酸塩が結晶化し、こ れを濾過した。

濾液にエーテルを加えて２モノベンジルオキシカルボニルプロパンジアミンを沈 殿させた。これを濾過し、エーテルで洗浄し、乾燥すると１次工程に用いるのに 十分純粋であることがわかった。

＋０．　３．　１．　３−ジシクロへキシルカルボジイミド（４９０ｍｇ、２． 　３７ｎｍｏ　ｌ　）を、スペリン酸モノメチルエステル（２，１６ｍｍｏｌ） およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２，３７ｎｗｎｏｌ）をＣＨＩ　Ｃ１２ ／ＴＨＦ　Ｉ　：　１　（ｖ／ｖ　）溶液（７ｍｌ）中に含有する溶液に加えた 。反応混合物を室温に一夜放置し、溶液を濾過してＤＣＵを除去し、乾燥ＣＨ， ＣＩ　２で洗浄した。ついで、活性エステル溶液に、　ＤＭＦ　（５ｍｌ）中ト リエチルアミン（アミン塩酸塩を中和するため）を含有する溶液中玉［１０，２ のモノベンジルオキシカルボニルプロパンジアミンを加えた。５時間後、この溶 液を５％炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ｍｌ）中に注ぎ、生成物をエーテル で抽出した。エーテルをＮａｚＳｏ４上で乾燥し、減圧下に除去した。粗カップ リング生成物は次工程に用いるのに十分純粋であった。

！０．４．前例の記載と同様にして、ベンジルオキシカルボニル保護基を除去し 、粗アミンをグアニジンに変換した（この反応条件下にメチルエステル基は除去 された）。逆相クロマトグラフィーで精製すると、標記製品が得られた。

ｄにおいてｘ＝３．ｎ＝ｍ＝２の化合物］の製造１、　３−ジシクロへキシルカ ルボジイミド（４９０■、２．　３７＋ｎ＋η１）を、コハク酸モノメチルエス テル（２，１６ｍｍｏｌ）ならびにＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２，３７血 ｍｌ）をＣＨ，ＣＩ　、　／ＴＨＦ　１　：　ｉ　（ｖ／ｖ　）溶液（７ｍｌ） 中に含有する溶液に加えた。反応混合物を室温に一夜放置した。溶液を濾過して ＤＣＵを除去し、乾燥ＣＨ２Ｃ１２て洗浄し九ついで、活性エステル溶液に。

ＤＭＦ　（５ｍｌ）中β−アラニン溶液を加えた。５時間後、この溶液を水（１ ００ｍｌ）中に注ぎ、生成物をエーテルで抽出した。エーテルをＮａ　ｔ　ＳＯ ａ上で乾燥し、減圧下に除去した。粗カップリング生成物は次工程に用いるのに 十分純粋であった。モノベンジルオキシカルボニルプロパンジアミンとのカップ リング、脱保護、アミンのグアニジンへの変換および精製は前例と同様に実施し た。

例１２．化合物Ｎ５−ＩＩの製造 Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−β−アラニンは上記例１にＮ−ｔ−Ｂｏｃ−６−アミノへキサ ン酸について記載したと同様にして製造し、セシウム月決によってクロロメチル 化ポリスチレン１％ジビニルベンゼンにカップリングさせ總すなわち、ｔ−Ｂｏ ｃ−β−アラニン（１，７３ｇ、０．０１ｍｏりを水（１０ｍｌ）に溶解し、１ Ｍ炭酸セシウム溶液を添加してｐＨを７．０に調整した。溶媒を減圧下に溶媒を 除去し、残留物を真空中Ｐ２０．上で乾燥した。乾燥した塩をＤＭＦ中に溶解し 、ポリマーに加えた。混合物を２時々振盪しまがら５０°Ｃに１２時間保持した 。溶媒を濾過し、ポリマーを順ａ　ＤＭＦ、ＤＭＦ　：水９：１混合物、および エタノールで洗浄し、真空中で乾燥した。ポリマー上でのカップリングは手動で 行い、まず、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−ニベコチン酸（６−アミノへキサン酸について記 載したと同様にして製造）、ついでＮ−ｔ−Ｂｏｃ−α−アミノ酪酸とカップリ ングさせた。

カップリングはすべて、３倍過剰の保護アミノ酸誘導体、および試薬としてＮ。

Ｎ−ジシクロへキシルカルボジイミドと１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの等 モル混合物を用いて実施した。脱保護および樹脂からの切断は無水ＨＦで処理し て達成された。粗生成物を５０％酢酸に抽出し、凍結乾燥した。アミノ基のグア ニジノ基への変換は、上述のように実施した。最終生成物は逆相クロマトグラフ ィ一ついて製造ＨＰＬＣ晴製によって精製した。

例＋３．化合物ＮＳ−８およびＮＳ−１５の製造１３．１．化合物ＮＳ−８は、 メリーフィールド樹脂（Ｓｉｇｍａ　）　ｌ、例５におけるようにポリマーにカ ップリングさせたＮ−ｔ−Ｂｏｃ−β−アラニンに出発して製造された。ポリマ ー上でのカップリングは例５におけるように手動で行い。

最初にＮ−ｔ−ブチルオキシカルボニルピペコリン酸にカップリングさせ、つい でＮ−ｔ−ブチルオキジオカルボニル−５−アミノ吉草酸にカップリングさせた 。

脱保攬樹脂からの切断およびアミノ基のグアニジノ基への変換は例５の場合と同 様に実施した。

＋３．２．化合物Ｎ５−１５は、メリーフィールド樹脂（Ｓｉｇｍａ　）　ｌ、 例５におけるようにポリマーにカップリングさせたＮ−ｔ−Ｂｏｃ−β−アラニ ンに出発して製造された。ポリマー上でのカップリングは例５におけるように手 動で行い。

最初にＮ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−３−アミノ安息香酸にカップリングさ せ、ついでＮ−ｔ−プチルオキソオ力ルボニルーβ−アラニンにカップリングさ せた。脱保護、樹脂からの切断およびアミノ基のグアニジノ基への変換は例５の 場合と同様に実施した。

化合物はすべでＨ−ＮＭＲおよびＦＡＢ−ＭＳスペクトルによって特徴づけられ 　これらは図２に示した割り当てられた構造に一致した。

例Ｉ４．トリプシンによる処理 化合物ＳＦ−６，５およびＣ；　ＲＧ　Ｄ　Ｓペプチド（１００μＩ　ＰＢＳ中 ５０μｇ）を３７°Ｃてインキュベートして、０．２５％トリプシン（Ｇｉｂｃ ｏ　；改良パック緩衝液中５０μｍ）に暴露した。５，３０および６０分後に、 アリコートを採取して、ＨＰＬＣにより２２０ｎｍてモニタリングした。化合物 ＳＦ−６，５は６０分後にも無傷なことか明らかにされたが、ＧＲＧＤＳペプチ ドは５分後には完全に分解された。

例＋５．ＥＣＭ蛋白質へのＴ細胞接着の阻止Ｔ細胞の接着性を調へるために、フ ィブロネクチン（ＦＮ）　（Ｓｉｇｍａ　）　、ＦＮの１２０ｋＤ細胞付着フラ グメント（Ｔｅｌ　ｉｏｓ　ＰｔＩａｒａ　Ｉｎｃ、　、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ 、　ＣＡ）またはラミニン（ＬＮ）（Ｓｉｇ昭）のいずれかの１１１ｇ１５０μ ｌ／ウエルを９６−平底マイクロタイターウェルに１２時間添加した。ついて非 結合蛋白質を洗い流し、残った結合部位はウェルに０．１％ウシ血清アルブミン （ＢＳＡ）を２時間加えて洗浄した。ＣＤ４”Ｔ細胞を、健康ヒトドナーから得 られた末梢血単核白血球より精製した。単核細胞はフィコル勾配を用いて単離し 、洗浄し、ペトリ皿でｌθ％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および抗生物質補充ＲＰＭ Ｉ中、３７°Ｃ加湿℃０．インキュベーターにおいてインキュベートした。２時 間後、非付着細胞を単離し。

ナイロン−ウールカラム上に適用した（１．５時間）。次にＣＤ４”　Ｔ細胞を 抗−ＣＤ８．ＣＤ１９および磁性ビーズ（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓ、　ＭＡ　）に接合したＣＤ１４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のカクテルに 細胞を暴露してネガティブに選択した。非結合細胞を回収して、それらの表現型 を検討しｆ：ｃＤ４”Ｔ細胞の純度は、ＦＡＣ３ｃａｎて測定して、常に９２％ 以上であっ總精製ＣＤ４”Ｔ細胞をＲＰＭＩ＋２０％ＦＣ３中にて、　”［Ｃｒ ｌ　（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　）で放射標識し、洗浄した。細 胞をカウントし、予めコートしたマイクロタイターウェルＬ様々なインヒビター の存在下または不存在下に。

接種した（０．２ＸｌＯ’細胞）。コーティングはＦＮ、ＦＮの１２０ｋＤ細胞 付着フラグメントまたは対照接着蛋白質ラミニン（ＬＮ）のいずれかによって行 った。インヒビターは本発明による様々な代替物、他の試験分子またはｍＡｂと した。３０分インキュベー１−（３７℃、Ｃ０７−加湿インキュベーター中）し たのち、Ｔ細胞をＬｏｎｇ／ｍｌのホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ ）で活性化し、蛋白質基質に付着したＴ細胞の百分率を測定した。非結合細胞を ２０〜３０分後に洗い流し、結合細胞を溶解し、放射能カウンターによってその 放射能を測定した。細胞溶解物の放射能の量はマトリックス−付着細胞を表し、 ウェルに加えた総放射能との比較から結合％が計算された。対照ウェルまたはＢ ＳＡでコートしたウェルへの活性化Ｔ細胞の接着は常に２〜５％で、非活性化Ｔ 細胞の接着レベルは常に５％未満であった。指示したように、１／２００希釈ｍ Ａｂ抗−ＣＤ２９（抗−β１　ｍＡｂ、　５ｅｒｏｔｅｃ、ＣＢ）　、　または １／４００希釈抗−ＶＬＡ５（βＩα５ＦＮ−インテグリン受容体）　ｍＡｂ　 （Ｔｅｌｉｏｓ　Ｐｈａｒａ　Ｉｎｃ、ＳａｎＤｉｅｇｏ　）　＋　または０． ２ｍｌのＲＧＤ、ＧＲＧＤＳＰＫもしくはＧＲＧＥＳＰペプチド（Ｓｉｇｎａ　 ）を使用した。試験した非ペプチド性代替物、ＰＢＳ中０．　２ｍＭは細胞接種 前１５分間Ｔ細胞を前処置するために使用した。′はＰ＜００５、表１Ａ、ＩＢ およびＩｃに示した結果は、はぼ同し結果を生じた数回の実験から得られたデー タである。

ＦＮの＋２０ｋＤフラグメントを用いた表Ｉへに示す第一のシリーズの実験では 、Ｔ細胞の活性化はＦＮおよびＬＮの両者への細胞接着を生じた（ない。特異的 なインテグリン部位に対する様々なｍＡｂを用いた遮断試験によって９両蛋白質 に対するＴ細胞の結合はβｌ　ＶＬＡインテグリンによって仲介されることが明 らかになっ總抗−β１ｍＡｂ　（抗−ＣＤ２９ｍＡｂ）は両蛋白質に対する細胞 接着を阻害し、一方、抗−ＶＬＡ−５ｍＡｂはＦＮに対するＴ細胞接着を阻害し たが、ＬＮに対する接着は阻害しなかった。ＦＮへのＴ細胞の接着は。

０．２ｄＲＧＤまたはＧＲＧＤＳＰＫペプチドによって特異的に阻害されたが。

対照ペプチドのＧＲＧＥＳＰによっては阻害されなかった。４種類のＲＧＤ代替 物、ＡＣ−４，ＡＣ−１４，ＳＦ−６，５およびＡＣ−１５は、ＦＮへのＴ細胞 接着を阻害したが、ＬＮに対する接着は阻害せず、最も顕著な阻害はＳＦ−６゜ ５代替物によって発揮された。ＲＧＥ代替物ＳＦ−６，６およびアミノ化合物は ５ＦＮ−７０はＦＮおよびＬＮ両者へのＴ細胞の接着を阻害しなかった。

ＲＧＤ類縁体のＴ細胞接着にｉｔ−する阻害作用は、これらの化合物がＬＮに対 するＴ細胞接着を阻害せず、またそれらが、ＰＭＡまたはミトゲン（フィトヘマ グルチニン）によって４８〜７２時間にわたり誘導されるＴ細胞の増殖性応答を 妨害しないこと（データは示していない）から、毒性作用によるものではない。

すなわち、非ペプチド性ＲＧＤ代替物は、ＦＮに対するＴ細胞接着を特異的に妨 害するものである。

表ＩＡ ＦＮへのＣＤ４″″Ｔ細胞接着のＲＧＤ代替物による特異的阻害Ｔ細胞接着イン ヒビター　活性化ＣＤ４”Ｔ細胞の接着％（阻害％）ＦＮの１２０ｋＤフラグメ ント　ＬＮ なし　４３±４　５５±５ 抗−ＣＤ２９ｍＡｂ　Ｉ　Ｏ±２°　（８３）　ｔｔ±２”　（８０）抗−ＶＬ Ａ−５ｍＡｂ　Ｂ±２°　（８２）　５２±４（０）ＲＧＤ　３８±３　（１２ ）　５７±３　（０）ＧＲＧＤＳＰＫ　２０±２°　（５４）　５３±４　（０ ）ＧＲＧＥＳＰ　４６±３（０）５２±３　（０）ＡＣ−４１６±３”　（４７ ）　５７±４　（０）ＡＣ−１４２５±４”　（４２）　５５±６　（０）ＳＦ −６，５２２±２”　（４９）　５５±６（０）ＡＣ−１５３５±５°　（１９ ）　５２±４　（０）ＳＦ−６，６４６±２（０）５２±６　（０）ＳＦＮ−７ ０４２±５　（＋２）　４９±６　（０）第二のシリーズの実験では、ＲＣ；Ｄ Ｓペプチドとの比較において、ＲＧＤ代替物、ＮＳ−８，ＮＳ−１１およびＮＳ −１５について行った接着アッセイに、ＦＮを使用した。表ＩＢに示す結果は化 合物Ｎ５−１１はＲＧＤＳペプチドよりも優れた細胞接着のインヒビターである ことを指示している。

表ＩＢ ＦＮへのＣＤ４”　Ｔ細胞接着の環状ＲＧＤ代替物による阻害の評価Ｔ細胞接着 インヒビター　ＦＮへの活性化　接着阻害％ＲＧＤＳ　２２　（６７） 第三のシリーズの実験で＋ｔＦＮを１代替物ＳＦ−６，５およびＮＳ−１１とと もに接着アッセイに使用し、ペプチドＧＲＧＤＳＰと比較しｔも結果は表ＩＣＦ ＮへのＣＤ４”″Ｔ細胞接着のＲＧＤ代替物による阻害Ｔ細胞接着インヒビター 　濃度（Ｍｇ　−ｍｌ）　ＦＮへの活性化ＣＤ４″″Ｔ細胞の接着％（％阻害） ＧＲＧＤＳＰ　２５　４０ 例１６．腫瘍細胞接着の阻止 それらが転移活性を発揮するためには、ａ瘍細胞は血管壁を透過しなければなら ない。ＲＣＤ含有ペブペプチドンビボにおいて転移を阻害することが示されてい たので９本発明のＲＧＤ代替物がＥＣＭのＦＮおよびビトロネクチン（ＶＮ）成 分への腫瘍細胞の接着を阻害するか否かについて検討した。

腫瘍細胞の接着性を調べるために、ＦＮの１８ｇ１５０μｌ／ウエルまたはＶＮ の０．３μｄウエルを９６−平底マイクロタイターウェルに１２時間添加した。

ついて非結合蛋白質を洗い流し、残った結合部位はウェルに０１％ＢＳＡを２時 間加えて遮断し、洗浄し總マウスＢ１６メラノーマＦ−１細胞を、　ｆｔ謝的に ２時＠　ｍ６３−メチオニン（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　）て 標識し、１８時間チェースし。

徹底的に洗浄した。懸濁した細胞を１ｍＭＣａ　Ｃ１ｔおよびＭｇ　Ｃ１！含有 １％ＢＳＡを補充したＲＰＭＩに再懸濁した。対照ウェルまたはＢＳＡでコート したウェルへの腫瘍細胞の接着は常に２〜５％であった。試験した非ペプチド性 代替物＋ＬＰＢＳ中０．　２ｍＭとして、細胞接種前１５分間、腫瘍細胞を前処 置するために使用した。′はＰ＜ＯＯ５，結果は表２Ａおよび２Ｂに示す。

第一のシリーズの実験てはＢＩ６メラノーマ細胞のＦＮまたはＶＮへの接着に対 するＲＧＤ代替物ＳＦ−６，５の阻害作用の可能性を、ＲＧＥ代替物ＳＦ−６゜ ６の場合ならびにＲＧＤ、ＧＲＧＤＳＰＫおよびＧＲＧＥＳＰペプチドの場合と 比較した。結果は表２八に示す。

表２Ａ ＦＮおよびＶＮへの腫瘍細胞接着のＲＧＤ代替物を用いた阻害腫瘍細胞接着イン ヒビター　８１６メラノーマ細胞の接着％（阻害％）ＲＧＤ　７０±３（７）　 ６６±６　（０）ＧＲＧＤＳＰＫ　Ｉ　５±４°　（８０）　１０±２”　（８ ６）ＧＲＧＥＳＰ　７３±５（０）　６６±８　（０）ＳＦ−６，５３４±４° 　（５５）　４０±５″’（４２）ＳＦ−６，６７５±２（０）　７０±７　（ ０）ＦＮに対するＢ１６マウスメラノ一マ細胞接着はＧＲＧＤＳＰＫペプチドに よって阻害されるが、ＲＧＤもしくはＲＧＥペプチド、またはＲＧＥ代替物５Ｆ −６，６によっては阻害されないことか明らかにされた。しかしながら、ＲＧＤ 代替物ＳＦ−６，５はＦＮおよびＶＮ両者への腫瘍細胞の接着を阻害した。

インビボで行った第二のセットの実験では１本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／　６マ ウスにおいて、腫瘍細胞誘導の転移が、転移の誘導後マウスあたり１日２５μｇ の化合物ＳＦ−６，５のｉ、　Ｖ、投与により阻止されることを明瞭に示すこと ができた。ネイティブペプチドＧＲＧＤＳＰおよび化合物ＳＦ−６，６はいずれ も。

転移を阻止できなかった。

さらに他のセットの実験ては、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞のＦＮへの接着に対 するＲＧＤ代替物ＳＦ−６，５およびＭＳ−１１の阻害活性をＧＲＧＤＳＰペプ チドの場合と比較した。結果は表２Ｂに示す。

表２Ｂ ＦＮへの腫瘍細胞接着のＲＧＤ代替物による阻害腫瘍細胞接着インヒビター　濃 度（μｇ−ｍｌ）　ＦＮへの活性化腫瘍細胞の接着％（％阻害） ＧＲＧＤＳＰ　２５　３０ 板凝集を仲介する血６ｉＧＰＭｂ−Ｉ［ａ受容体をモデルとして使用した。

血小板濃縮液は、フェンウオールバッグ（Ｂａｘｔｅｒ　Ｔｒａｖｅｎｏｌ、　 ｌ５ｒａｅｌ）内の１０％アデニン−クエン降デキストロース中ヒト全血から、 標準ＡＡＢＢプロトコールに従い調製した。血小板富血漿は遠心分離（２５０Ｏ ｒｐｍ５分間）によって調製した。血小板サンプルはミノスＡＳＴセルカウンタ ー（Ｌｅｖｏ　ｉ　ｓｅ　ｌ　ｌ　ｅ。

Ｆｒａｎｃｅ）中でカウントシた。細胞凝集は５ｍ１ｉｌＡＤＰで誘導し４−チ ｉネルアグレゴメーター（Ｂｉｏ−Ｄａｔａ、　Ｉ（ａｔｂｏｒｏ、　ＰＡ　） により６９５剛でモニタリングした。様々なＲＧＤペプチドおよびそのペプチド 類縁体の効果の評価には、血小板富血漿を様々なインヒビターと、３７℃、１０ 分間、ｌ０ｍ１溶液でブレインキュベートし。

ついて凝集を誘導しｔも 図３には、化合物ＳＦ−６，５（黒丸）およびＳＦ−６，６（白丸）による血小 板凝集阻害能 を用量依存性様式において０．３ｄのＩＣ，、で阻害することが見出された。５ Ｆ−６，６は阻害作用を示さなかった。

血小板凝集に対するＲＧＤ−類縁体の阻害作用の特異性を調べるため（二様々な ペプチド性（ＲＧＤおよび０ＲＣＤＳＰ）ならびに非ペプチド性（ＳＦ−６゜６ 、ＳＦ−６，５およびＡＣ−１５）ＲＧＤ類縁体を０．５−の固定した飽和上濃 度で用いて細胞を処理した。図４は、１０μｇ１ｍｌａ度のインヒビターを用い た場合の、血漿板凝集の阻害を示す（ここに示す結果は、計４回の実験から得ら れたデータのまとめである）。これら結果は、トリペプチドＲＧＤそれ自体は作 動なインヒビターではないが、大きなペプチドＧＲＧＤＳＰＫは血小板凝集に著 しい阻害効果を発揮することを示している。さらに、ＲＧＤ代替物、　ＳＦ−６ ，５およびＡＣ−１５の阻害作用はＧＲＧＤＳＰＫペプチドの場合よりもさらに 高かった。対照代替物のＳＦ−６，６は血小板凝集には極めて限られた効果しか 示さず、ＲＧＥにおける血小板凝集阻害能の欠如を反映した。

例！８．Ｎ５−１１による血小板凝集の阻止例１７に記載のインビトロアッセイ を化合物ＮＳ−１１について実施し、その血小板凝集阻害能を検討し、ＳＦ−６ ，５代替物の場合と比較した。

図３には、ＡＤＰ誘導血小板凝集に対する両分子の作用の分析に際して得られた 結果をまとめる。

ム且 血小板凝集のＮＳ−１１仲介阻害 化合物　濃度　凝集の阻害％ ＧＲＧＤＳＰ　０．１ｍＭ　７５ ＳＦ−６，５０，１ｍＭ　２５ ０．３ｍＭ　５５ ＮＳ−１１０，１ｍＭ　９０ ０．３ｍＭ　１００　− 要約すれば、試験した３８１の化合物は、血小板凝集の阻害を誘発することが見 出された。代替物ＳＦ−６，５は凝集に対しては緩和な、しかしながら存意な作 用を示した。その作用を、ｍＭベースでＲＧＤ含有ペプチドの場合と比較すると 。

この分子はその細胞機能に対してはわずかながら低い作用をもっことが明らかに された。得られた結果は、ＮＳ−１１が血小板凝集にはＳＦ−６，５より優れた インヒビターであることを指示している。さらに、この分子はＲＧＤ含有ペプチ ドよりも有意に優れたインヒビターである。０．　１−の濃度におけるその効果 は。

同濃度で使用されたＲＧＤペプチドの場合よりも約２０％はど良好である。

例１９．ＮＳ−８，ＮＳ−１１およびＮＳ−１５による血小板凝集の阻止血小板 富血漿（ＰＲ，Ｐ）は、驚りエンＷデキストロース抗−凝固新鮮ヒト血液から分 画遠心分離によって調製した。血小板凝集は５ｍＭＡＤＰで誘導し４−チヤネル アダレゴメーター（Ｂｉｏ−Ｄａｔａ、ＰＡ　）により６９５ａでモニタリング した。

ＲＧＤＳペプチドおよびそのＮＳ−８，ＮＳ−１１およびＮＳ−１５類縁体の効 果の評価には、ＰＲＰをインヒビターと、３７°Ｃ，１０分間ブレインキュベー トし、ついで凝集を誘導した。図５から明らかなように、化合物ＮＳ−１１はＮ Ｓ−８およびＮＳ−１５のいずれよりも、血小板凝集の良好なインヒビターであ った。さらに、化合物Ｎ５−ＩＩはＲＯＤ含有ペプチド（ＲＧＤＳ）よりも良好 に血小板凝集を阻害することが見出された。実際、血小板凝集の５０％阻害はＲ ＧＤＳの場合よりも３０倍低い濃度のＮＳ−１１を用いて達成された。

例２０．血小板への抗−ＧＰＩＩｂ−ＩＩ［ａｍＡｂ　（ＰＡＣ−１）の結合能 の阻害ＲＧＤ代替物が実際にＧＰＴＬｂ−ｍａインテグリンに結合するか否かを 検討するために　ＧＰＩＩｂ−Ｈａに特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）と それらが競合する能力を調べた。このＰＡＣ−１と命名された。活性化受容体に 特異的なｍＡｂ＋；Ｌ　ＲＧＤ依存性様式で、ＧＰＩ［ｂ−Ｈａに結合する［Ｔ ａｕｂ、　Ｒ，ら（１９８９）。

Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６４：２５９　）。

ＡＤＰ−活性化血小板（九以下のような様々のペプチドおよび非ペプチド性化合 物の存在下にＦＩＴＣ−接合ＰＡＣ−１ｍＡｂとインキュベートした。血小板富 血漿は、３５０　μｇ／ｍ１ＢｓＡ含存改良タイロード液（１３７，５ａ＆Ｎａ Ｃ１゜４ｍＮＨｅｐｅｓ、２．　６７ＫＣＩ　、１ｍＭＭｇ　Ｃｌ　ｘ、３．　 ３ｎＭＮａ　ＨＩ　ＰＯ４、５゜６ｒｆＭグルコース、ｐＨ７，４）中にゲル濾 過した（これは以下の工程においてインキュベーション緩衝液として使用された ：タイロード／ＢＳＡ）。細胞アッセイにおける最終カウントは１ｍｌあたり２ Ｘ１０”であった。細胞はついで１０μＭＡＤＰおよびエピネフリンで活性化し た。血小板へのＰＡＣ−１ｍＡｂの結合能に対するコンペティターとしてのＲＧ Ｄペプチドおよび関連類縁体を検討するために、細胞を１ｉＡｌｃａ　Ｃ１２を 補充したタイロード／Ｂ５Ａ３０μｌ中、０〜５００μＭのペプチドまたはペプ チド類縁体の存在下、１０μｇ／ｍｌのＦＩＦＣ標識ＰＡＣ−１とともに２５° Ｃにおいて３０分間インキュベートし總細胞の蛍光像をＦＡＣＳｃａｎ　（Ｂｅ ｃｋｔｏｎＤｉｃｋｅｎｓｏｎ）を用いて４８８ｎｍで測定しｔう図６に。

ＧＲＧＤＳＰＫ　（白丸）、ＧＲＧＥＳＰ　（黒三角）、化合物ＳＦ−６，５（ 白三角）、化合物ＳＦ−６，６（黒丸）の結果を示す（ここに示すデータは、１ 〜３回の実験から得られたほぼ等しい結果である）。

図６に示した結果は、ＲＧＤペプチドおよびＲＧＥ類縁化合物５Ｆ−６，６がい ずれも、血小板インテグリン受容体へのＰＡＣ−１の結合を阻害しないことを指 示している。しかしながら、ＧＲＧＤＳＰＫおよびＲＧＤ代替物、化合物５Ｆ− ６，５は、用量依存性の様式で、細胞のＰＡＣ−１染色を阻害した。したがって 、ＲＧＤ代替化合物の血小板凝集阻害能は、ＧＰＩ［ｂ−ＩＩ［ａ受容体上のＲ ＧＤ結合部位との直接的干渉に帰することができるものと考えられる。

インビボでのＴ細胞免疫性およびリンパ球遊走に対するＳＦ−６，５の調整的役 割を調べるため（二遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応実験を行った。ＢＡＬＢ／　ｃ マウスの！ｌ７（１！！￥６匹）の、刺毛した腹部を皮膚アレルゲン、４−エト キシメチレン−２−フェニルオキサシロン（ＯＸ）（アセトン／オリーブ油中３ ％ＯＸ。

１０μｍ）で感作し、５日後にＯＸを耳に適用して再チャレンジした。耳の腫脹 の増大をＤＴＨの指標として２４時間後に記録し總耳の腫脹の測定者には、マウ スの実験群の種類はブラインドとした。ＧＲＧＤＳ、ＲＧＤ代替化合物５Ｆ−６ ，５およびＲ，ＧＥ代替化合物５Ｆ−６，６は２００μｌのＰＢＳ中、指示され た日に尾静脈に１．Ｖ、投与した。マウスの対照群はＰＢＳて同様に処置した。

表４に示す結果は、化合物ＳＦ−６，５による処置がＤＴＨ応答を阻害し、それ はマウスに６日間投与した場合に最善であることを指示するが、ＳＦ−６，６で は阻害は認められなかった（それぞれ図７および８）。さらに、ＲＧＤ代替物は 、ＧＲＧＤＳペプチドの場合よりもＤＴＨの良好なインヒビターであることが明 らかにされた。これは多分、後者（群３）の短い生理的保持時間によるものと考 えられる。実際１例１４に示されたように、化合物ＳＦ−６，５は、ＧＲＧＤＳ ペプチドとは異なり、トリプシン誘導加水分解に完全に抵抗することが見出され た。これらの群で得られた結果は、陽性対照群で得られた結果（データは示して いない）と有意な差を示さなかった。′はｐ＜ｏｏｓ、ｐ値は群２．陽性対照群 に関してめた。これらの所見は、インビボにおける細胞仲介免疫反応の修飾が比 較的低用量の非ペプチド性ＲＧＤ類縁体によって達成されることを指示し。

これは多分リンパ球の遊走への干渉によるものと考えられる。

ＯＸに対するＤＴＨ応答のＲＧＤ代替物によるマウス処置での阻止マウスの処置 　ＯＸ感作　Δ耳腫脹　阻害％群　化合物　注射日　（ｘｌＯ−２ｍｍ±５Ｄ） １　なし　−　なし　２±２　− ２　なし　−あり　２１±２　− ３　にＲＧＤＳＰＫ　１〜６　あり　１７±３　２０４ＳＦ−６，５１あり　１ ６±３　２０５　１．３　あり　１３±２　３４ ６　１、　３．　５　あり　８±２”　６２７　１〜６　あり　２±１０　９５ ４４７゜ ＡＩｏｎ、　Ｒ，ら（１９９０）　ＢＢＲＣ１７０：ｌ２３６−１２４１゜Ｂａ ｒａｎｙ、Ｎ、＆　１Ｊｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｒ，Ｂ、Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ ｓ、Ａｎａｌｙｓｉｓ、５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　aｉｏｌｏｇｙ （Ｇｒｏｓｓ、Ｅ、　り、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒ ｋ、　１９８０．　ｐ、２゜Ｄ’　５ｏｕｚａ、　Ｓ、巳、、Ｇｉｎｓｂｅｒｇ 、　Ｍ、　Ｈ，、Ｍａｔｓｕｄａ、　Ｇ、　Ｒ，＆　Ｐｌｏｗ、　Ｅ、　Ｆ、　 （１９９Pａ）　Ｎａｔｕｒｅ　３５０： ６６−６８゜ Ｈｙｎｅｓ、Ｒ，０，（１９９０）Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｓ、Ｓｐｅｒｇｅｒ 、Ｖｅｒｌａｇ。

Ｍａｚｅｒｏｌ　Ｉｅｓ、Ｆ、、Ａｍｂｌ、ａｒｄ、Ｆ、、Ｌｕｍｂｒｏｓｏ、 Ｃ，、Ｌｅｃｏｍｔｅ、０．、Ｖａｎ　ｄｅ　Ｍｏｏｒｔｅ撃■AＰ、Ｆ、。

Ｍｏｕｌｄ、　Ａ、　Ｐ、ら（＋９９１）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６６ 　：　３５７９−３５８５゜０ｕａｉｓｓｉ、Ｍ、Ａ、、Ｃｏｒｎｅｔｔｅ、Ｊ 、、Ａｆｃｈａｉｎ、Ｄ、、Ｃａｐｒｏｎ、Ａ、、Ｇｒａｓ−Ｍａｓｓｅ、Ｈ， ＆　Ｔａ窒狽≠秩B Ｓｈｉｍｉｚｕ、Ｙ、、ｖａｎ　５ｅｖｅｎｔｅｒ、Ｇ、Ａ、、ｌ（ｏｒｇａｎ 、に、Ｊ、＆　Ｓｈａｗ、Ｓ、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ　R４５　： ２５０−２５３゜ Ｔａｕｂ、　Ｒ，、Ｇｏｕ　Ｉｄ、　Ｒ，Ｊ、　、　Ｇａｒｓｋｙ、　Ｖ、　Ｍ 、　、　Ｃ１ｃｃａｒｏｎｅ、　Ｔ、　Ｍ、　、　Ｈｏｘｉ■A　Ｊ、　、　Ｆ ｒｉｅｄｍａｎ、　Ｐ、　Ａ、　＆Ｖｏｇｅ１．　Ｂ、　Ｅ、ら（１９９２）　 Ｊ、Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　ＢｉｏｃｈｅｌＩＬ１６Ｆ　：　１５４゜Ｅ１αＪ五　 １ ｌ−１２Ｎ＝ ｒＩ（、ＵＲＥ　Ｚ 血小板凝集インヒビター　（ｍＭ） ＥＴＧに　３ ＫｐＣｆｌＧαＥｌ’　５Ｆ−６，６Ｓｌ”−６，５ＡＣ−１５血小板凝集イン ヒビター　（１，４ｍＭ）ｊＩＧ班如　４ 補正書の写しく翻訳文）提出書（＃ＩｒＦ法組８法条８４条平成６年５月２０日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．天然α−アミノ酸の配列をもたず，少なくとも５個は炭素原子であるＩＩ原 子の配列を挟むグアニジノおよびカルボキシル末端官能基からなり，細胞接着を 阻害する非ペプチド性化合物ならびにその塩２．式 ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）（式中，Ａは９原子の鎖であり，その 少なくとも３個は炭素原子である）で示される「請求項１」に記載の非ペプチド 性化合物３．Ａ鎖は炭素，ならびに窒素，酵素および／または硫黄原子から選択 されるヘテロ原子からなる「請求項２」に記載の非ペプチド性化合物４．Ａ鎖は １個または２個以上の窒素原子からなる「請求項３」に記載の非ペプチド性化合 物 ５．Ａは，ハロゲン，アミノ，オキソ，チオキソ，イミノ，ヒドロカルボイル， ヘテロ環，カルボキシルおよびチオカルボキシルならびにそれらのエステル，ヒ ドロキシおよびメルカプトならびにそれらのエーテルおよびエステル，カルボキ シアミド，チオカルボキシアミド，カルパモイル，チオカルバモイルから選択さ れる基によって置換されていてもよい飽和または不飽和鎖であるか，あるいはＡ 鎮は少なくとも３員の炭素環またはヘテロ環の部分を形成してもよい「請求項１ 〜４」のいずれかに記載の非ペプチド性化合物６．Ａ鎖は１個または２個以上の 窒素原子および１個または２個以上の酸素原子からなる「請求項５」に記載の非 ペプチド性化合物７．式 ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉａ）（式中，ｎは少なくとも１，最高８ である）で示される「請求項６」に記載の化合物 ８．式 ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉｂ）（式中，ｎは少なくとも１，最高８ である）で示される「請求項６」に記載の化合物 ９．式 ▲数式、化学式、表等があります▼（（Ｉｃ）（式中，ｘ，ｎおよびｍはそれぞ れ少なくとも１で，Ｘ＋ｎ＋ｍの合計は７である）で示される「請求項６」に記 載の化合物１０．式 ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉｄ）（式中，Ｘ，ｎおよびｍはそれぞれ 少なくとも１で，Ｘ＋ｎ＋ｍの合計は７である）で示される「請求項６」に記載 の化合物１１．式 ▲数式、化学式、表等があります▼ １２．式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される化合物 １３．式 ▲数式、化学式、表等があります▼ １４．式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される化合物 １５．１個または２個以上のカルボキシル基で置換された「請求項６」に記載の 非ペプチド性化合物 １６．式 （▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉａ）で示される「請求項１５」に記載 の化合物１７．式 ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉｂ）で示される「請求項１５」に記載の 化合物１８．１個または２個以上のアミノ基で置換されていてもよい「請求項６ 」に記載の非ペプチド性化合物 １９．式 ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉｃ）で示される「請求項１８」に記載の 化合物２０．Ａ鎖の１個または２個以上の原子は炭素環またはヘテロ環の部分を 形成する［請求項５」に記載の非ペプチド性化合物２１．式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される「請求項２０」に記載の化合物２２．式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される「請求項２０」に記載の化合物２３．式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される「請求項２０」に記載の化合物２４．活性成分として「請求項１〜２ ３」のいずれかに記載の非ペプチド性化合物および医薬的に許容される担体から なる医薬組成物２５．血栓症，自己免疫疾患，転移，アレルギー，移植片対宿主 および宿主対移植片反応の処置，ならびに瘢痕組織形成の阻害のための「請求項 ２４」に記載の医薬組成物 ２６．「請求項１１」に記載の化合物からなる「請求項２４または２５」に記載 の医薬組成物 ２７．「請求項１２」に記載の化合物からなる「請求項２４または２５」に記載 の医薬組成物 ２８．「請求項１３」に記載の化合物からなる「請求項２４または２５」に記載 の医薬組成物 ２９．「請求項１４」に記載の化合物からなる「請求項２４または２５」に記載 の医薬組成物 ３０．「請求項２１」に記載の化合物からなる「請求項２４または２５」に記載 の医薬組成物 ３１．「請求項２２」に記載の化合物からなる「請求項２４または２５」に記載 の医薬組成物 ３２．「請求項２３」に記載の化合物からなる「請求項２４または２５」に記載 の医薬組成物 ３３．ＲＸＤ（式中，Ｘはアミノ酸残基Ｇ，Ｅ，Ｙ，ＡまたはＦの一つである） の認識に依存する生物学的な細胞および分子相互作用の阻止のための「請求項１ 〜２３」のいずれかに記載の非ペプチド性化合物の使用３４．ＲＧＤの認識に依 存する細胞および分子相互作用の阻止のための「請求項３３」に記載の使用 ３５．インテグリン仲介細胞機能の阻止のための「請求項３３」に記載の使用３ ６．血小板凝集の阻止のための「請求項３３〜３５」のいずれかに記載の使用 ３７．腫瘍細胞接着の阻止のための「請求項３３〜３５」のいずれかに記載の使 用 ３８．瘢痕組織形成の阻止のための「請求項３３〜３５」のいずれかに記載の使 用