CN107759804B - 可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于化学生物领域，具体涉及可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生材料及其制备方法。本发明提供了一种可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生材料，其结构的示意式如式Ⅰ。本发明还提供了上述可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生物材料的制备方法和用途。本发明提供的可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生物材料是一种可以增加明胶生物功能性、生物活性和定点修饰明胶的衍生材料，可用于构建三维细胞培养体系，组织修复工程，药物传递系统等。

Description

可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生材料及其制备方法
技术领域
本发明属于化学生物领域，具体涉及可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生材料及其制备方法。
背景技术
明胶是一种常用的生物材料，可用于构建水凝胶、生物支架、微纳米药物导入系统等，在医学研究和临床医疗中有重要应用。将具有生物活性的蛋白质或多肽与明胶复合可以进一步赋予明胶的生物功能，获得具有生物活性的明胶衍生物，提高明胶的生物医用价值。
目前，人们主要通过化学或物理交联将蛋白质或多肽复合到明胶系统中。通过化学交联的过程中经常会使用有毒的催化剂；并且由于交联的位置不能精确的控制，使蛋白的空间结构发生变化，影响蛋白的生物活性。另一方面，通过物理交联的蛋白，很容易受到周围环境的变化而从明胶系统中脱落下来，使蛋白的作用周期变短。因此，研制一种可定点结合蛋白或多肽的明胶衍生物对新型明胶制品有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生材料。
上述可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生材料，是通过将可吸附含组氨酸标签的蛋白质的金属螯合物连接到明胶或者明胶衍生物上得到的。
所述的金属螯合物为焦脱镁叶绿酸a与乙酸钴的共轭物。
上述可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生材料的其结构的示意式如式Ⅰ：
其中，上述材料中所诉的明胶衍生物为：甲基丙烯化明胶(GelMA)，酪胺化明胶(gelatin-Ph)或硫醇化明胶中的至少一种。
进一步的，上述明胶衍生材料可由以下方法制得，该方法包括以下步骤：
a)PPa-Co共轭物的合成：将PPa(焦脱镁叶绿酸a)与乙酸钴共溶于有机溶剂中，在暗光条件常温条件下反应12～36h，得到含PPa-Co的溶液；
b)NHS-PPa-Co物质的合成；在步骤a)所述的含PPa-Co的溶液中加入EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，常温反应12～36h，除去溶剂后，经萃取、干燥，得到NHS-PPa-Co；
c)将NHS-PPa-Co溶于二甲基亚砜，再与明胶水溶液40～60℃反应2～12h，得到明胶衍生物；
d)将明胶衍生物在12～14KDa的透析袋中透析3天，然后在-60℃下冻干，得到可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生材料。
其中，上述明胶衍生材料采用的制备方法的步骤a)中所述PPa与乙酸钴的摩尔比为1︰1～1︰20。
其中，上述明胶衍生材料采用的制备方法的步骤a)中所述的有机溶剂为甲醇、二氯甲烷或丙酮中的任意一种。
其中，上述明胶衍生材料采用的制备方法的步骤b)中所述EDC、NHS与PPa的用量关系为，按摩尔比：EDC︰NHS＝1︰1～5；NHS︰PPa＝1︰1～5。
其中，上述明胶衍生材料采用的制备方法的步骤b)中所述的萃取是用正丁醇和去离子水进行的，所述正丁醇和去离子水的体积比为1︰1～10。
其中，上述明胶衍生材料采用的制备方法的步骤c)中所述NHS-PPa-Co与明胶的质量比为1︰10～1︰2000。
上述制备方法，步骤c)所述明胶水溶液的质量浓度为1～20％；所述明胶水溶液是在40～60℃下将明胶溶于水中得到的。
相应的，本发明也提供了制备上述明胶衍生材料的方法。
本发明还提供了上述可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生材料在构建三维细胞培养体系中的用途。
本发明还提供了上述可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生材料在组织修复中的用途。
本发明还提供了上述可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生材料在构建药物传递系统中的用途。
本发明提供的可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生材料，通过将可吸附标签蛋白质的金属螯合物连接到明胶上，不仅可以稳定的结合蛋白而且不会破坏蛋白的活性，使蛋白可以在明胶系统中长效的保持生物活性。本发明提供的明胶衍生材料是一种可以增加明胶生物功能性、生物活性和定点修饰明胶的衍生物材料，可用于构建三维细胞培养体系，组织修复工程，药物传递系统等。
附图说明
图1本发明提供的可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生材料的质谱图。
图2本发明提供的可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生材料的氢谱图。氢谱说明该明胶衍生物中含有Co-PPa这种共轭物。
图3纯his(组氨酸)标签蛋白的高效液相色谱图。
图4本发明提供的可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生材料和his标签蛋白孵育后的高效液相色谱图。
具体实施方式
本发明提供的是一种新型的可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生材料。是通过将可吸附含组氨酸标签的蛋白的金属螯合物连接到明胶或者明胶衍生物上得到的。所述的金属螯合物为焦脱镁叶绿酸a与乙酸钴的共轭物。
上述可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生材料的其结构的示意式如式Ⅰ：
上述可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍材料可由以下制备路线制备得到：
上述可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生材料的制备方法，包括以下步骤：
a)PPa-Co共轭物的合成：将PPa与乙酸钴共溶于有机溶剂中，在暗光条件常温条件下反应12～36h，得到含PPa-Co的溶液；有时该含PPa-Co的溶液中还含有有未反应的乙酸钴，为混合溶液。
b)NHS-PPa-Co物质的合成；在步骤a)所述的含PPa-Co的溶液中加入EDC和NHS，常温反应12～36h，除去溶剂后，经萃取、干燥，得到NHS-PPa-Co；
c)将NHS-PPa-Co溶于二甲基亚砜，再与明胶水溶液40～60℃反应2～12h，得到明胶衍生物；
d)将明胶衍生物在12～14KDa的透析袋中透析3天，然后在-60℃下冻干，得到定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生材料。
其中，上述方法步骤a)所述PPa与乙酸钴的摩尔比为1︰1～1︰20。
其中，上述方法步骤a)所述的有机溶剂为甲醇、二氯甲烷或丙酮中的任意一种。
其中，上述方法步骤b)所述EDC、NHS与PPa的用量关系为，按摩尔比：EDC︰NHS＝1︰1～5；NHS︰PPa＝1︰1～5。
其中，上述方法步骤b)所述的萃取是用正丁醇和去离子水进行的，所述正丁醇和去离子水的体积比为1︰1～10。
其中，上述方法步骤c)所述NHS-PPa-Co与明胶的质量比为1︰10～1︰2000。
其中，上述方法步骤c)所述明胶水溶液的质量浓度为1～20％；所述明胶水溶液是在40～60℃下将明胶溶于水中得到的。
实施例1
将1mg的PPa与4.67mg的乙酸钴共溶于4mL的甲醇中，在暗光条件常温条件下反应24h，得到PPa-Co的混合溶液。
然后在上述PPa-Co的混合溶液中加入2.8mg的EDC和4mg的NHS，反应24h，反应结束后，除去其中的甲醇，再加入10mL的正丁醇和20mL的去离子水进行萃取，以去除其中多余的离子和有毒物质。再将正丁醇除去，得到NHS-PPa-Co。
在60℃下将400mg的明胶溶于10mL的水中，得到明胶水溶液。将上述得到的NHS-PPa-Co溶于2mL的二甲基亚砜中，再加入到明胶水溶液中反应3小时，得到明胶衍生材料。
将上述得到的明胶衍生物在12～14KDa的透析袋中透析3天，然后在-60℃下冻干，即得到定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生材料。
实施例2 吸附带有his标签蛋白的测试
本实施例使用的带his标签的蛋白为RAN-GTP蛋白(其氨基酸序列为SEQ ID No.1所示，编码核苷酸序列为SEQ ID No.2所示)。Ran蛋白是小G蛋白的一个亚族，与GTP结合时活化，与不同的下游效应分子相互作用进而执行不同的生理功能，该蛋白带有his标签。
将实施例1冻干制备得到的定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生物20mg，在50℃溶于200uL水中，然后加入300uL(147ug/mL)his标签蛋白在37℃下孵育1h，然后进行高效液相的测定(检测波长250nm，检测温度25℃，使用的是赛分科技的Zenix SEC-100柱子)，从而判断明胶衍生物能否吸附蛋白。其中，高效液相的流动相为1XPBS(1倍浓度的PBS缓冲液，配方：8gNaCl,0.2gKCl,1.44g Na2HPO4,0.24gKH2PO4)，流速为0.5mL/min。
从图3对照可以看出，RAN-GTP蛋白的出峰时间为16.198min左右。而在图4中，16.198min左右几乎看不到该蛋白的出峰。充分说明his标签蛋白被本发明提供的明胶衍生物材料吸附了。
从以上数据可以看出，该明胶衍生物可以稳定的定点结合含有his标签的蛋白或多肽。由于明胶衍生物可以稳定的定点结合标签蛋白，可用于构建三维细胞培养体系，如通过构建水凝胶体系用于细胞培养；更进一步可以在此基础上结合具有his标签的神经生长因子，构建水凝胶三维培养体系用于PC12细胞在3D环境中分化。
此外，该明胶衍生物结合神经生长因子制成的水凝胶还可以在组织修复中用于长截断的神经修复，会比单纯使用明胶制备水凝胶会具有更好的修复效果。
而正因为该明胶衍生物可以稳定的定点结合具有his标签的蛋白或多肽，故可以使用在药物传递系统的制备中，可将具有被用于释放的蛋白或者多肽通过his标签稳定地连接在明胶衍生物中，随着明胶的降解而释放，从而延长释放时间，制成新型的药物传递系统。

Claims (13)

1.可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生材料，是通过将可吸附含组氨酸标签的蛋白质的金属螯合物连接到明胶或明胶衍生物而得；所述的金属螯合物为焦脱镁叶绿酸a与乙酸钴的共轭物。
2.根据权利要求1所述的可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生材料，其特征在于：所述的明胶衍生物为甲基丙烯化明胶、酪胺化明胶或硫醇化明胶中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生材料，其特征在于由以下方法制备：
a)PPa-Co共轭物的合成：将焦脱镁叶绿酸a与乙酸钴共溶于有机溶剂中，在暗光条件常温条件下反应12～36h，得到含PPa-Co的溶液；
b)NHS-PPa-Co物质的合成；在步骤a)所述的含PPa-Co的溶液中加入EDC和NHS，常温反应12～36h，除去溶剂后，经萃取、干燥，得到NHS-PPa-Co；
c)将NHS-PPa-Co溶于二甲基亚砜，再与明胶或明胶衍生物的水溶液40～60℃反应2～12h，得到PPa-Co共轭物修饰的明胶衍生材料；
d)将明胶衍生物在12～14KDa的透析袋中透析3天，然后在-60℃下冻干，得到共轭物修饰的明胶衍生材料。
4.根据权利要求3所述的可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生材料，其特征在于：步骤a)所述PPa与乙酸钴的摩尔比为1︰1～1︰20。
5.根据权利要求3所述的可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生材料，其特征在于：步骤a)所述的有机溶剂为甲醇、二氯甲烷或丙酮中的任意一种。
6.根据权利要求3所述的可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生材料，其特征在于：步骤b)所述EDC、NHS与PPa的用量关系为，按摩尔比：EDC︰NHS＝1︰1～5；NHS︰PPa＝1︰1～5。
7.根据权利要求3所述的可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生材料，其特征在于：步骤b)所述的萃取是用正丁醇和去离子水进行的，所述正丁醇和去离子水的体积比为1︰1～10。
8.根据权利要求3所述的可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生材料，其特征在于：步骤c)所述NHS-PPa-Co与明胶的质量比为1︰10～1︰2000。
9.根据权利要求3所述的可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生材料，其特征在于：步骤c)所述明胶水溶液的质量浓度为1～20％；所述明胶水溶液是在40～60℃下将明胶溶于水中得到的。
10.制备权利要求1～9任一项所述的可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生材料的方法，其特征在于包括以下步骤：
a)PPa-Co共轭物的合成：将焦脱镁叶绿酸a与乙酸钴共溶于有机溶剂中，在暗光条件常温条件下反应12～36h，得到含PPa-Co的溶液；
b)NHS-PPa-Co物质的合成；在步骤a)所述的含PPa-Co溶液中加入EDC和NHS，常温反应12～36h，除去溶剂后，经萃取、干燥，得到NHS-PPa-Co；
c)将NHS-PPa-Co溶于二甲基亚砜，再与明胶或明胶衍生物的水溶液40～60℃反应2～12h，得到PPa-Co共轭物修饰的明胶衍生材料；
d)将明胶衍生物在12～14KDa的透析袋中透析3天，然后在-60℃下冻干，得到共轭物修饰的明胶衍生材料。
11.权利要求1～9任一项所述可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生材料在构建三维细胞培养体系中的用途。
12.权利要求1～9任一项所述可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生材料在组织修复中的用途。
13.权利要求1～9任一项所述可定点结合含组氨酸标签蛋白的明胶衍生材料在构建药物传递系统中的用途。
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