CN115403653A - D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys,其合成及应用 - Google Patents

D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys,其合成及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了下式结构的D(+)‑β‑(3,4‑二羟基苯基)‑乳酰‑Pro‑Ala‑Lys,公开了它的制备方法,进一步公开了它的抗栓活性,溶栓活性以及治疗缺血性中风作用。因而本发明公开了它在制备抗栓剂,溶栓剂以及治疗缺血性中风药物中的应用。
Figure DDA0003828120150000011

Description

D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys,其合成及 应用
技术领域
本发明涉及一种D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys及其制备方法,进一步涉及它的抗栓活性,溶栓活性以及治疗缺血性中风作用。此外，本发明还涉及它在制备抗栓剂,溶栓剂以及治疗缺血性中风药物中的应用。本发明属于生物医药领域。
背景技术
重组人组织纤溶酶原激活剂是目前临床上唯一被美国FDA批准的治疗缺血性中风的溶栓药物,但其治疗时间窗狭窄,仅在发病后4.5小时内能有效溶解血栓,因此只有极少数患者能从中受益。发明人意外发现D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酸有抑制大鼠血清丙二醛含量及超氧化物歧化酶含量的趋势。根据二者和血栓生成及神经损伤的关联性,发明人认识到用Pro-Ala-Lys修饰D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酸的羧基得到的D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys可能具有抗栓活性,溶栓活性以及治疗缺血性中风作用。于是,发明人制备了D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys。之后,评价了D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys抗栓活性,溶栓活性以及治疗缺血性中风作用。此后,还评价了D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys抑制缺血性中风大鼠血清丙二醛含量及超氧化物歧化酶水平的作用。评价发现,D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys确实具有所述活性。根据这些发现,发明人提出了本发明。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种具有下式结构的D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys，
Figure BDA0003828120130000011
本发明的第二个目的是提供具有上述结构的D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys的制备方法,该方法包括:
1)合成Boc-Pro-Ala-OBzl；
2)合成Boc-Pro-Ala；
3)合成Boc-Pro-Ala-Lys(Cbz)-OBzl；
4)合成HCl·Pro-Ala-Lys(Cbz)-OBzl；
5)采用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺为缩合剂,1-羟基苯并三唑为催化剂的液相法将D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)乳酸与HCl·Pro-Ala-Lys(Cbz)-OBzl缩合,制备D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys(Cbz)-OBzl；
6)用H2,Pb/C将D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys(Cbz)-OBzl脱保护基制备D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys。
本发明所述的D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys的合成路线图如附图1所示。
本发明的第三个目的是评价D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys的抗动脉血栓活性，以及其在制备抗动脉血栓药物中的应用。
本发明的第四个目的是评价D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys的溶血栓活性，以及其在制备溶血栓药物中的应用。
本发明的第五个目的是评价D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys的治疗缺血性中风活性，以及其在制备治疗缺血性中风药物中的应用。
本发明的第六个目的是评价D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys对缺血性中风大鼠血清中丙二醛含量的影响。
本发明的第七个目的是评价D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys对缺血性中风大鼠血清中超氧化物歧化酶含量的影响，以及其在制备清除自由基药物中的应用。
附图说明
图1为D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys的合成路线。i)二环己基碳二亚胺,1-羟基苯并三唑,N-甲基吗啉,无水四氢呋喃；ii)H2,Pd/C；iii)氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M)；iv)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺,1-羟基苯并三唑,N,N-二异丙基乙胺,N,N-二甲基甲酰胺,HCl·Pro-Ala-Lys(Cbz)-OBzl。
图2为大鼠脑切片TTC染色图，其中，A为生理盐水组大鼠脑切片TTC染色图，B为D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酸组大鼠脑切片TTC染色图，C为D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys组大鼠脑切片TTC染色图。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
实施例1制备Boc-Pro-Ala-OBzl
取2.88g(13.38mmol)Boc-Pro,20mL无水四氢呋喃,2.99g(14.50mmol)N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)和0.90g(6.66mmol)1-羟基苯并三唑(HOBt)于0℃搅拌0.5小时得到反应液A。往反应液A中加入2.00g(9.27mmol)HCl·Ala-OBzl,并用N-甲基吗啉将反应液的pH调至8。室温反应12h,TLC(二氯甲烷:甲醇＝30:1)监测到HCl·Ala-OBzl消失,终止搅拌。过滤除去反应液中的无色固体,将滤液减压浓缩除去溶剂,并用100mL乙酸乙酯溶液将其分散。之后分别用饱和碳酸氢钠溶液(30mL)、饱和氯化钠溶液(30mL)、5％硫酸氢钾溶液(30mL)、饱和氯化钠溶液(30mL)、饱和碳酸氢钠溶液(30mL)、饱和氯化钠溶液(30mL)各洗涤三次,将洗涤后的有机层用无水硫酸钠干燥12小时。滤去硫酸钠,将滤液减压浓缩除去溶剂,在中压柱上纯化(从二氯甲烷:甲醇＝100:1到15:1梯度洗脱),得3.60g(86％)Boc-Pro-Ala-OBzl,为无色固体。ESI-MS(m/e):377[M+H]+。
实施例2制备Boc-Pro-Ala
称取250mg(0.66mmol)Boc-Pro-Ala-OBzl用10mL甲醇溶解,加入30mg Pd/C,得到的悬浮液充氢气,氢解12小时,TLC(二氯甲烷:甲醇＝30:1)监测到原料点消失,终止氢解,过滤除去Pd/C,减压浓缩除去溶剂,得到167mg(92％)Boc-Pro-Ala,为无色固体。ESI-MS(m/e):285[M-H]-。
实施例3制备Boc-Pro-Ala-Lys(Cbz)-OBzl
采用实施例1的方法从167mg(0.61mmol)Boc-Pro-Ala和277mg(0.51mmol)Tos·Lys(Cbz)-OBzl得到260mg(82％)Boc-Pro-Ala-Lys(Cbz)-OBzl,为无色固体。ESI-MS(m/e):639[M+H]+。
实施例4制备HCl·Pro-Ala-Lys(Cbz)-OBzl
将1.00g(1.61mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Cbz)-OBzl于0℃加入10mL氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M)。之后,0℃搅拌4小时。TLC(二氯甲烷:甲醇＝30:1)显示Boc-Pro-Ala-Lys(Cbz)-OBzl消失,终止搅拌。反应液减压浓缩,残留物加50mL无水乙酸乙酯,溶解后,再减压浓缩。该操作重复三次,得到无色固体,再用50mL无水乙醚浸润固体,减压浓缩,反复三次,得到0.8g(98％)HCl·Pro-Ala-Lys(Cbz)-OBzl,为无色固体。ESI-MS(m/e):539[M+H]+。
实施例5制备D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys(Cbz)-OBzl
取343mg(1.73mmol)D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酸,4mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF),324mg(1.69mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和192mg(1.42mmol)HOBt,冰浴条件下搅拌0.5h得到反应液A。往反应液A中加入700mg(1.21mmol)HCl·Pro-Ala-Lys(Cbz)-OBzl,并用N,N-二异丙基乙胺(DIEA)调节pH至9,室温反应12小时。TLC(二氯甲烷:甲醇＝20:1)显示HCl·Pro-Ala-Lys(Cbz)-OBzl点消失。0℃将反应液缓慢滴加至200mL超纯水中,用乙酸乙酯反复萃取得到的溶液(总共500mL乙酸乙酯),乙酸乙酯溶液减压浓缩。之后,残留物用100mL乙酸乙酯溶解。得到的溶液用饱和碳酸氢钠溶液(30mL)洗三次、饱和氯化钠溶液(30mL)洗三次、5％硫酸氢钾溶液(30mL)洗三次、饱和氯化钠溶液(30mL)洗三次。之后,用无水硫酸钠干燥12小时h。滤除硫酸钠,滤液减压浓缩,中压柱纯化(从二氯甲烷:甲醇＝100:1到10:1梯度洗脱),最终得340mg(36％)D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys(Cbz)-OBzl,为淡黄色固体。ESI-MS(m/e):741[M+Na]+.1HNMR(500MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝8.50(d,J＝7.5Hz,1H),8.33(d,J＝7.5Hz,1H),7.38-7.24(m,10H),7.20(t,J＝5.5Hz,1H),5.08(d,J＝3.0Hz,2H),4.97(s,2H),4.37(t,J＝8.0Hz,1H),4.30(t,J＝7.5Hz,1H),4.25-4.18(m,1H),3.52-3.47(m,1H),3.27(m,2H),2.96-2.89(m,5H),2.80(s,1H),1.88-1.76(m,2H),1.74-1.65(m,2H),1.59(m,1H),1.40-1.30(m,2H),1.30-1.20(m,4H),1.16(d,J＝7.0Hz,4H)。
实施例6制备D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys
用实施例2的方法从340mg(0.47mmol)D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys-(Cbz)-OBzl得到142mg(61％)D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys,为无色粉末。ESI-MS(m/e):495[M+H]+.M.p:188～189℃.
Figure BDA0003828120130000041
＝–146.42(c＝0.03,MeOH)；IR/cm–1:3263.95,3070.07,2932.39,1621.83,1518.00,1445.65,1385.97,1344.05,1244.10,1202.71,1155.46,1116.65,1079.09,1047.00,996.42,875.60,698.11。1H-NMR(500MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝8.19(d,J＝7.5Hz,1H),7.37(dd,J1＝25.5Hz,J2＝7.0Hz,1H),6.59(d,J＝10.5Hz,1H),6.56(d,J＝7.5Hz,1H),6.39(dd,J1＝10.5Hz,J2＝7.5Hz,1H),5.44(s,1H),4.21(dt,J1＝24.0Hz,J2＝6.5Hz,2H),4.09(m,1H),3.81(m,1H),3.01(q,J＝8.5Hz,1H),2.74-2.51(m,4H),1.99-1.45(m,8H),1.19-1.15(m,6H)。13C-NMR(125MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝174.60,172.40,172.10,171.59,145.34,144.18,128.84,120.52,117.36,115.83,71.68,71.06,59.70,54.17,49.15,40.40,40.35,32.13,32.05,29.44,24.68,22.24,18.07。
实施例7评价D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys的溶血栓活性
生理盐水购自山东齐都药业有限公司,尿激酶购自阿拉丁,D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酸购自上海源叶生物科技有限公司,乌拉坦购自国药集团化学试剂有限公司,肝素钠购自百灵威科技有限公司。SPF级SD大鼠(200±20g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验采用大鼠颈总动脉-颈外静脉旁路模型(螺栓法)。
化合物D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys的剂量为100nmol/kg和50nmol/kg,阳性对照尿激酶的剂量为20000IU/kg,阴性对照为生理盐水。
将内径为3.5mm的橡胶管切割至长度为6.0cm作为中段管；将内径为2.0mm的聚乙烯管切成2.0mm长的小段,作为中段管与两端管之间的连接管；将内径1.0mm,外径2.0mm的聚乙烯管的一端加热,在保持内径不被压缩的情况下拉长,按照聚乙烯管弯曲的弧度剪切为斜口细管,便于插入大鼠右颈总动脉和左颈外静脉,将此管定长为10.0cm,其中静脉插管要略粗于动脉插管,以便于血液可以顺畅地经过旁路管道进入静脉,进行循环。
将内径1.0mm,外径2.0mm的聚乙烯管的一端加热,按照动脉插管的粗细拉长并剪切为斜口细管,长度应大于2.0cm,做取血管,以便取动脉血进行造栓。
剪取0.5mL离心管的管帽,作为栓托底座；将内径为3.5mm的橡胶管切割至长度为1.6cm作为栓托管壁,切口应平整,与栓托底座尽量贴合,以防止血液渗漏；将橡胶管用Para膜固定于离心管帽上,形成一个栓托。
将不锈钢螺栓定长为1.8cm,螺环分布应均匀,且不扭曲,保证形成血栓的质量。将准备好的中段管、静脉端插管及动脉端插管,用1％的硅醚溶液(按照硅油:乙醚＝1:99的体积比配制)浸泡2min,取出晾干。将动静脉两端的插管都先与小接头连接,用Para膜封好防止脱落及血液渗漏。将静脉端插管装入中段管的一端,用Para膜将接口固定并密封,防止在手术循环过程中循环管脱落或造成血液渗漏。
用20％的乌拉坦溶液(每100mL生理盐水中溶解20g乌拉坦)以7mL/kg体重对大鼠进行麻醉。将麻醉后的大鼠仰卧位固定于大鼠固定板上,剪开其颈部皮肤,钝性分离大鼠右颈总动脉,将其远心端用手术线结扎,近心端用动脉夹夹闭,在动脉夹及结扎处之间用眼科剪剪一v字型小口,将取血管插入小口,松开动脉夹,用1.5mL的离心管接1.0mL血液,夹闭动脉,通过1mL注射器将取出的血液注入制好的栓托中,注意不要有气泡,尽快将螺栓放入其中,静置40min,使血液充分凝固,形成血栓。
使用针灸针将血栓与栓托的管壁剥离,用镊子将栓夹出,蘸净表面浮血,得到饱满有弹性的圆柱状血栓,且无螺栓裸露,称重并记录,为初始栓重。
将血栓置于旁路中段管的另一端,用动脉端插管将其压好固定,Para膜封口,得到组装好的旁路管。利用1mL注射器及头皮针,使组装好的管内充满肝素,排除气泡,以防止影响血液循环。
分离大鼠左颈外静脉,远心端用手术线结扎,在近心端用眼科剪剪一个v字型小口,将准备好的旁路插管的静脉端朝向近心端插入小口中,用手术线将血管与聚乙烯管的重合处结扎固定,防止脱落。用1mL注射器以3mL/kg体重,通过旁路插管的动脉端,向大鼠体内注入抗凝的肝素钠溶液(浓度为0.42mg/mL)。将旁路插管的动脉端朝向近心端插入动脉上剪开的小口中,用手术线将血管与聚乙烯管的重合处结扎固定,防止脱落。松开动脉夹,可观察到血液从动脉端流经盛有血栓的中段管,进入静脉端,并最后回到大鼠体内,完成大鼠右颈总动脉-左颈外静脉旁路循环。将装有受试化合物溶液,阴性对照或者阳性对照的1mL注射器扎入硅橡胶管的静脉一侧,将内容物注入循环,可明显看到内容物随着血流进入大鼠体内,但不经过血栓。
过程中保持大鼠体温,维持旁路中血流通畅,1小时后,将旁路的静脉端管剪断,观察血流效果,判断循环过程是否足够通畅,再剪断动脉端,将管内余血倾出,从动脉端取出血栓,蘸去浮血,精确称量并记录,为循环后栓重。用初始栓重减去循环后栓重即得到血栓减重。血栓减重以Mean±SD mg表示,采用SPSS软件进行方单因素方差分析。
D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys在100nmol/kg和50nmol/kg的剂量下表现出溶栓活性,且与20000IU/kg的阳性药UK活性相当；在剂量为50nmol/kg时，化合物D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)乳酰-Pro-Ala-Lys与母核丹参素表现出极显著性差异，证明此种改造优化了母核丹参素的溶血栓活性，降低了其最小有效溶栓剂量。这是本发明的意想不到的技术效果。具体结果见表1,
表1化合物D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)乳酰-Pro-Ala-Lys的溶栓活性
Figure BDA0003828120130000061
经单因素方差分析,a)与生理盐水比P<0.01，与尿激酶比P>0.05；b)与生理盐水组比较P>0.05；n＝10
实施例8评价D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys的抗血栓活性
生理盐水购自山东齐都药业有限公司,阿司匹林购自百灵威科技有限公司,羧甲基纤维素钠购自国药集团化学试剂有限公司,乌拉坦购自国药集团化学试剂有限公司,肝素钠购自百灵威科技有限公司。SPF级SD大鼠(200±20g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验采用大鼠颈总动脉-颈外静脉旁路模型(丝线法)。
D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys的剂量为100nmol/kg,阳性对照阿司匹林的剂量为167μmol/kg,阴性对照为羧甲基纤维素钠。
剪取8.0cm长的内径为2.0mm的聚乙烯管作为中段管；将内径1.0mm,外径2.0mm的聚乙烯管的一端加热,拉长并剪切为斜口细管,便于插入大鼠右颈总动脉和左颈外静脉,定长为10.0cm,其中静脉插管要略粗于动脉插管,以便于血液可以很好地经过旁路管道,进行循环。
将丝线在砂纸上摩擦至出现均匀的绒毛,所有丝线摩擦次数一致,绒毛密集程度均匀,定长至6.0cm,精确称重,确保丝线重量在4.0±0.1mg。将丝线用无水乙醇浸泡2min,取出晾干,备用。
将准备好的中段管、静脉端插管及动脉端插管,用1％的硅醚溶液浸泡2min,取出晾干。将准备好的丝线置于中段管的一端,并用动脉端插管将其压好固定,静脉端插管装入中段管的另一端,用Para膜将接口固定并密封,防止在手术循环过程中循环管脱落或渗血。利用1mL注射器及头皮针,将组装好的管内充满肝素,排除气泡,以防止影响血液循环。
将配制好的D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys,阿司匹林及羧甲基纤维素钠以3mL/kg体积及上面规定的剂量体重对大鼠灌胃给药。30min后,用20％乌拉坦溶液以7mL/kg体重对大鼠进行麻醉。
将麻醉后的大鼠仰卧位固定于大鼠固定板上,剪开其颈部皮肤,钝性分离大鼠右颈总动脉,将其远心端用手术线结扎。再分离大鼠左颈外静脉,远心端用手术线结扎,在近心端用眼科剪剪一个v字型小口,将之前准备好的旁路插管的静脉端朝向近心端插入小口中,用手术线将血管与聚乙烯管的重合处结扎固定,防止脱落。用1mL注射器以1mL/kg体重通过旁路插管的动脉端,注入抗凝的肝素钠溶液(浓度为0.42mg/mL)。将右颈总动脉的近心端用动脉夹夹闭,在动脉夹及结扎处之间用眼科剪剪一v字型小口,将旁路插管的动脉端朝向近心端插入小口中,用手术线将血管与聚乙烯管的重合处结扎固定,防止脱落。松开动脉夹,可观察到血液从动脉端流经盛有丝线的中段管,进入静脉端,并最后回到大鼠体内,完成大鼠右颈总动脉-左颈外静脉旁路循环。
过程中保持大鼠体温,维持旁路中血流通畅,15min后,将旁路的静脉端管剪断,观察血流效果,判断循环过程是否足够通畅,再剪断动脉端,将管内余血倾出,从动脉端取出丝线,蘸净浮血,精确称量并记录,减去丝线的本身重量,即为血栓湿重。血栓湿重以均值±标准差mg表示,采用SPSS软件进行方单因素差分析。
D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys在100nmol/kg的剂量下表现的抗栓活性与剂量为167μmol/kg的阿司匹林相当。这是本案的意想不到的技术效果。具体结果见表2,
表2化合物D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)乳酰-Pro-Ala-Lys的抗栓活性
Figure BDA0003828120130000081
经单因素方差分析,a)与羧甲基纤维素钠比P<0.01；b)与阿司匹林比P>0.05；n＝12实施例9评价D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys治疗缺血性中风活性
生理盐水购自山东齐都药业有限公司,D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)乳酸购自上海源叶生物科技有限公司,异氟烷购自深圳瑞沃德生命科技有限公司,乌拉坦购自国药集团化学试剂有限公司,青霉素购自北京索莱宝科技有限公司,氯化三苯基四氮唑(TTC)购自Sigma-Aldrich。SPF级SD大鼠(280±20g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验采用大鼠缺血性中风(24h)模型。D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酸为母体化合物对照口服剂量是100nmol/kg,D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys为治疗剂口服剂量是100nmol/kg,生理盐为水阴性对照。
将内径1.0mm,外径2.0mm的聚乙烯管的一端加热,拉长并剪切为斜口细管,定长为1.5cm,将其粗端插入1mL注射器,并用Para膜固定好,作为打栓用注射器。将内径1.0mm,外径2.0mm的聚乙烯管的一端加热,按照动脉插管的粗细拉长并剪切为斜口细管,长度应大于2.0cm,做取血管,以便取动脉血进行造栓。
用20％的乌拉坦溶液以7mL/kg体重对一只大鼠进行麻醉。将麻醉后的大鼠仰卧位固定于大鼠固定板上,剪开其颈部皮肤,钝性分离大鼠右颈总动脉,将其远心端用手术线结扎,近心端用动脉夹夹闭,在动脉夹及结扎处之间用眼科剪剪一v字型小口,将取血管插入小口中,松开动脉夹,用1.5mL离心管接1.0mL血,使用20μL移液器吸取15μL血液,注入新的1.5mL离心管管壁上,形成一个小血滴,常温静置30min使血液凝固,然后转移至-20℃冰箱中放置24h,使血液凝块结实。
向盛有血液凝块的离心管中加入1mL生理盐水,用圆头钢铲将血块捣碎,形成均一的细小血栓块,将制备得到的细小血栓的悬液转移至准备好的1mL注射器中,排除气泡,使血栓块落于注射器尖端,便于将其全部注入大鼠体内。
利用小动物麻醉机,采用异氟烷为麻醉剂对大鼠进行麻醉,诱导麻醉后将大鼠转移至手术台面,戴上麻醉面罩保持麻醉状态。将麻醉后的大鼠仰卧位固定于大鼠固定板上,将其颈部皮肤备好,竖直减开约2cm长的切口,钝性分离大鼠右颈总动脉,用动脉夹夹闭颈总动脉近心端,沿着其往头部方向分离颈外动脉及颈内动脉。用动脉夹夹闭颈内动脉开口处,用手术线结扎颈外动脉的远心端,在颈外动脉上剪一v字型小口。将装有血栓块悬液的1mL注射器插入小口中,松开颈内动脉上的动脉夹,将栓块注入血管中,重新夹闭颈内动脉,将小口结扎,松开颈总动脉及颈内动脉的动脉夹,恢复血流。将大鼠颈部缝合,滴2滴青霉素溶液防止伤口感染。保持大鼠体温,大约3h后,大鼠苏醒。
手术24小时后,按照Zealonga方法对大鼠进行神经生物学评分,进行神经功能缺损程度的评定。0分表示没有任何神经功能缺损的体征,1分表示未损伤侧的前肢不能伸展,2分表示只能向未损伤侧行走,3分表示向未损伤侧转圈成追尾状行走,4分表示意识障碍无自主行走,5分表示死亡。
根据评定结果平均分组。分组后口服D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酸或者D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys或者生理盐水。第二天同一时间进行神经生物学评分,评分后口服D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酸或者D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys或者生理盐水。第三天同一时间进行神经生物学评分,评分后口服D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酸或者D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys或者生理盐水。第四天评分后将大鼠用20％乌拉坦溶液以7mL/kg体重进行麻醉。动脉取血,留作后续实验。处死大鼠后,分离其心脏,在右心室剪一小口,使用注射器向左心室中注入15mL生理盐水,进行心脏灌流。取脑,置于低温冰箱中冷冻2h。之后取出进行切片,切成厚薄均匀的6个切片,将切片置于配置好的2％TTC溶液中,避光38℃染色10min,未梗死部分被染成红色,梗死部分未着色,呈白色。将脑切片按顺序摆在透明玻片上,用滤纸吸干水分,拍照。通过计算脑梗死的体积比来评价药物对缺血性中风的治疗作用。
利用Photoshop软件处理脑切片的照片,计算梗死体积和正常组织的体积,统计各组的梗死体积百分比值。计算死亡率＝(大鼠死亡数/总数)×100％；显效率＝(最后一天评分低于给药前评分的大鼠/总数)；治愈率＝(最后一天评分为0的大鼠数量/总数)。脑梗死体积比以均值±标准差％表示,采用SPSS软件进行方单因素差分析。结果如表3所示。
D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys在100nmol/kg的剂量下表现出治疗缺血性中风活性,显著降低了大鼠脑梗死体积比,且改善了其神经功能缺损程度；而D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酸在此剂量下未表现出治疗缺血性中风活性。这是本案的意想不到的技术效果。具体结果见表3-7。
表3 D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys的治疗缺血性中风活性
Figure BDA0003828120130000101
经单因素方差分析,a)与生理盐水比较P<0.05；b)与生理盐水组比P>0.05；n＝9表4生理盐水组大鼠神经生物学评分
Figure BDA0003828120130000102
表5 D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)乳酸组大鼠神经生物学评分
Figure BDA0003828120130000103
表6 D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys组大鼠神经生物学评分
Figure BDA0003828120130000104
Figure BDA0003828120130000111
表7 D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys的疗效
Figure BDA0003828120130000112
实施例10评价D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)乳酰-Pro-Ala-Lys治疗缺血性中风大鼠血清中MDA含量的影响
丙二醛检测试剂盒购自碧云天。在大鼠缺血性中风(24h)模型中,将大鼠麻醉后处死前,取动脉血,将全血在室温下放置30分钟至2小时,不要剧烈摇晃以免溶血,待全血自然沉降并析出血清后,4℃约1000-2000g离心10分钟,取黄色上清即得血清。
A.TBA储存液的配制：称取适量TBA,用TBA配制液配制成浓度为0.37％的TBA储存液。例如18.5mg TBA用5ml TBA配制液配制,或者25mg TBA用6.76ml TBA配制液配制,最终浓度即为0.37％。TBA配制液需完全溶解后再使用,可以加热到70℃以促进溶解。
B.丙二醛检测工作液的配制:取3000μL TBA稀释液、1000μL TBA储存液和60μL抗氧化剂混合,加热到70℃以完全溶解。
C.标准品的稀释：取适量标准品用蒸馏水稀释至1、2、5、10、20、50μM,用于后续制作标准曲线。如果样品中丙二醛的浓度很高,可以增加100、150和200μM的标准品浓度。
A.设置标准品和样品组；标准品组：在1.5mL离心管中加入不同浓度的标准品0.1mL,并向各管中加入0.2mL MDA检测工作液；样品组：在1.5mL离心管中加入不同样品各0.1mL,并向各管中加入0.2mL MDA检测工作液。
B.混匀后,100℃或沸水浴加热15分钟。加热时务必注意避免液体暴沸溅出。采用制冷加热型金属浴进行加热。
C.水浴冷却至室温,1000g室温离心10分钟。取200微升上清加入到96孔板中,随后用酶标仪在532nm测定吸光度。如果不方便测定532nm的吸光度,也可以测定530-540nm之间的吸光度。可以设定450nm为参考波长进行双波长测定。
用标准品的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式,将样本的OD值代入方程式,计算出样本浓度,采用SPSS软件进行方单因素差分析。
D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys组大鼠血清中的丙二醛含量与生理盐水组相比显著降低,说明D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys可以改善大鼠体内脂质氧化程度,降低细胞损伤或坏死程度,从而减小了缺血再灌注损伤；而D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酸未表现出改善脂质氧化的活性。这是本案的意想不到的技术效果。具体结果见表8，
表8 D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys对大鼠血清中丙二醛浓度的影响
Figure BDA0003828120130000121
；造模组n＝3,正常组n＝1。经单因素方差分析,a)与生理盐水比P<0.01,与健康大鼠比P>0.05；b)与生理盐水比P>0.05；n＝3。
实施例11评价D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys对缺血性中风大鼠血清中超氧化物歧化酶含量的影响
大鼠超氧化物歧化酶酶联免疫分析试剂盒购自凡科维。在大鼠缺血性中风(24h)模型中,将大鼠麻醉后处死前,取动脉血,将全血在室温下放置30分钟至2小时,不要剧烈摇晃以免溶血,待全血自然沉降并析出血清后,4℃约1000-2000g离心10分钟,取黄色上清即得血清。
将试剂盒在室温下平衡30min；将洗涤缓冲液用超纯水稀释20倍,10mL 20×洗涤缓冲液加190mL超纯水,待用。
A.将酶标板设置标准品孔、空白孔及样本孔。
B.向标准孔加入不同浓度标准品50μL；在酶标包被板上待测样品孔先加样品稀释液40μL,然后再加待测样品10μL(样品最终稀释浓度为5倍)。
C.每孔加入酶标试剂100μL,空白孔除外。
D.用封板膜封板后置37℃温育60min。
E.小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30s弃去,重复5次,拍干。
F.每孔先加显色剂A50μL,再加显色剂B50μL,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15min。
G.每孔加终止液50μL,终止反应(此时蓝色立转黄色)。
H.加终止液后15min内,测量450nm处各孔的吸光度值(OD值)。
用标准品的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式,将样本的OD值代入方程式,计算出样本浓度,利用SPSS软件进行单因素方差分析。
D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys组大鼠血清中的SOD含量与生理盐水组相比选择提高,说明D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)乳酰-Pro-Ala-Lys可以清除自由基,改善大鼠体内脂质氧化程度,从而减小缺血再灌注损伤；而D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酸组未表现出降低脂质氧化程度的活性。这是本案意想不到的技术效果。具体结果见表9，
表9化合物D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)乳酰-Pro-Ala-Lys对大鼠血清中SOD浓度的影响
Figure BDA0003828120130000131
经单因素方差分析,a)与生理盐水组比P<0.05,与健康大鼠比P>0.05；b)与生理盐水组比P>0.05；n＝3。

Claims (6)

1.一种具有下式结构的D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys，
Figure FDA0003828120120000011
2.权利要求1所述结构的D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys的制备方法,其特征在于，所述方法包括:
1)合成Boc-Pro-Ala-OBzl；
2)合成Boc-Pro-Ala；
3)合成Boc-Pro-Ala-Lys(Cbz)-OBzl；
4)合成HCl·Pro-Ala-Lys(Cbz)-OBzl；
5)采用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺为缩合剂,1-羟基苯并三唑为催化剂的液相法将D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酸与HCl·Pro-Ala-Lys(Cbz)-OBzl缩合,制备D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys(Cbz)-OBzl；
6)利用H2,Pd/C将D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys(Cbz)-OBzl脱保护基制备D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys。
3.权利要求1所述结构的D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys在制备抗动脉血栓剂中的应用。
4.权利要求1所述结构的D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys在制备溶血栓剂中的应用。
5.权利要求1所述结构的D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys在制备治疗缺血性中风药物中的应用。
6.权利要求1所述结构的D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys在制备清除自由基药物中的应用。
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