CN108948145B - 1R-甲基-β-四氢咔啉酰-K(PAK)-RGDV,其合成,活性和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了下式的1R‑甲基‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3S‑酰基‑Lys(Pro‑Ala‑Lys)‑Arg‑Gly‑Asp‑Val,公开了它的制备方法,公开了它的抗血栓活性,公开了它的溶血栓活性以及公开了它治疗中风24小时大鼠的作用,因而本发明公开了它在制备抗血栓药物,溶血栓药物以及治疗缺血性中风药物中的应用。

Description

1R-甲基-β-四氢咔啉酰-K(PAK)-RGDV,其合成,活性和应用

技术领域

本发明涉及1R-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3S-酰基-Lys(Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val,涉及它的制备方法,涉及它的抗血栓活性,涉及它的溶血栓活性以及涉及它治疗中风24小时大鼠的作用,因而本发明涉及它在制备抗血栓药物,溶血栓药物以及治疗缺血性中风药物中的应用。本发明属于生物医药领域。

背景技术

缺血性中风是一类较常见且危害严重的脑血管疾病，特点是发病率高、病死率高、致残率高和复发率高。目前临床治疗缺血性中风面临没有有效药物的现实，尤其中风面4h以上的患者非死即残。发明对中风面4h以上的患者有效的药物是临床的重要需求。发明人曾经公开下式的咪唑啉在中风面24h的大鼠缺血性中风模型上，显示优秀疗效。即连续静脉注射6天下式的咪唑啉，每天1次，剂量为100nmol/kg，具有优秀疗效。式中AA为Ser,Val或Phe。由于结构的原因，下式的咪唑啉有两个必然缺点。即1,3-二氧咪唑啉部分的自由基对还原性环境敏感，不仅制备困难，而且保存困难。

发明人在经过3年实验研究,发现咪唑啉部分用1R-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3S-酰基替代可得到稳定结构和容易保存的双重意想不到的技术效果。按照这个发现发明人提出了本发明。

发明内容

本发明的第一个内容是提供下式的1R-甲基-1,2,3,4四氢-β-咔啉-3S-酰基-Lys(Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val。

本发明的第二个内容是提供1R-甲基-1,2,3,4四氢-β-咔啉-3S-酰基-Lys(Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val的制备方法,该方法包括:

(1)制备N-Boc-1R-甲基-1,2,3,4四氢-β-咔啉-3S-羧酸；

(2)制备Lys[(Boc-Pro-Ala-Lys(Cbz)]-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

(3)制备N-Boc-1R-甲基-1,2,3,4四氢-β-咔啉-3S-酰基-Lys[(Boc-Pro-Ala-Lys(Cbz)]-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

(4)制备N-Boc-1R-甲基-1,2,3,4四氢-β-咔啉-3S-酰基-Lys(Boc-Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val；

(5)制备1R-甲基-1,2,3,4四氢-β-咔啉-3S-酰基-Lys(Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val。

本发明的第三个内容是评价1R-甲基-1,2,3,4四氢-β-咔啉-3S-酰基-Lys(Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val的抗血栓活性,溶血栓活性以及治疗缺血性中风的活性。

附图说明

图1.1R-甲基-1,2,3,4四氢-β-咔啉-3S-酰基-Lys(Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val的合成路线.i)N-羟基苯骈三氮唑(HOBt)，N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)，N-甲基吗啉(NMM)；ii)NaOH水溶液(2M)，稀盐酸；iii)氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M)；iv)哌啶的DMF溶液(20％)；v)稀硫酸；vi)Pd/C。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯

于60℃向800mL蒸馏水中逐滴加入1mL浓度为98％的浓硫酸，搅拌均匀后将10.0g(34mmol)L-Trp-OBzl分三次加入其中。搅拌五分钟，使L-Trp-OBzl与硫酸水溶液充分混悬。之后，往浮悬液中滴加入10mL浓度为40％乙醛水溶液。反应化合物先于60℃搅拌12h，然后往里滴加3mL浓氨水调反应溶液pH至8。反应化合物静置1h，待产物充分析出。滤出固体，干燥，得9.84g(90％)淡黄色固体，为1R-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3S-羧酸苄酯和1S-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3S-羧酸苄酯的混合物。ESI-MS(m/e):321[M+H]⁺。

实施例2制备N-Boc-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯(1)

将实施例1得到的9.84g(30.8mmol)1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯用20mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解。于0℃往溶液中加6.98g(32.0mmol)Boc₂O。得到的溶液用三乙胺调节pH 12，室温搅拌48h。反应混合物减压浓缩，除去DMF。残留物用100mL乙酸乙酯溶解。得到的乙酸乙酯溶液依次用5％硫酸氢钾水溶液洗(50mL×3)和饱和氯化钠水溶液洗(50mL×3)。分离的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥12h，过滤，滤液减压浓缩得到的油状物。该油状物用硅胶柱分离(二氯甲烷/甲醇,100/1)，得到5.02g(38％)N-Boc-1R-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3S-羧酸苄酯和6.00g(47％)N-Boc-1S-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3S-羧酸苄酯。均为无色粉末。

N-Boc-1R-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3S-羧酸苄酯:ESI-MS(m/e):421[M+H]⁺。¹HNMR(DMSO-d6,800MHz)δ/ppm＝7.457(d,J＝8.0Hz,1H)；7.314(d,J＝8.0Hz,1H)；7.239(m,5H),7.080(t,J＝7.2Hz,1H)；7.000(t,J＝7.2Hz,1H)；5.377(m,1H)；5.095(m,2H)；0.499(m,1H)；3.421(m,1H)；2.906(m,1H)；1.454(m,12H)。

N-Boc-1S-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3S-羧酸苄酯:ESI-MS(m/e):421[M+H]⁺。¹HNMR(DMSO-d6,800MHz)δ/ppm＝7.434(d,J＝7.2Hz,1H)；7.313(m,1H)；7.214(s,1H)；7.158(m,2H)；7.063(m,3H)；6.990(m,1H)；5.066(m,1H)；5.020(m,2H)；4.890(m,1H)；3.275(m,1H)；3.074(m,1H)；1.495(s,3H),1.438(s,3H)；1.331(m,6H)。

实施例3制备Boc-1R-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3S-羧酸(2)

往1g(2.38mmol)N-Boc-1R-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3S-羧酸苄酯与40mL无水四氢呋喃的溶液中加100mg Pd/C,搅拌使成为均匀的悬浮液。减压抽出反应体系内的空气，通入氢气，室温搅拌10h，TLC(二氯甲烷/甲醇,40/1)显示N-Boc-1R-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3S-羧酸苄酯完全消失。过滤除去Pd/C，滤液减压浓缩，得到的无色粉末的ESI-MS(m/e)为329[M-H]^-。

实施例4制备Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl

将10g Boc-Arg(NO₂)溶于50mL无水四氢呋喃，冰浴与搅拌下依次往得到的溶液中加入5.1g N-羟基苯骈三氮唑(HOBt)和7.5g N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)与30mL无水四氢呋喃的溶液，充分搅拌0.5h。然后往该溶液中加11g HCl·Gly-OBzl与30mL无水四氢呋喃的溶液。得到的反应混合物用N-甲基吗啉(NMM)调至pH 9，室温搅拌6h，TLC(二氯甲烷/甲醇,40/1)HCl Gly-OBzl完全消失。过滤除去析出的二环己基脲(DCU)。滤液减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用饱和NaHCO₃水溶液洗三次、饱和NaCl水溶液洗三次、5％KHSO₄水溶液洗三次、饱和NaCl水溶液洗三次、5％NaHCO₃水溶液洗三次和饱和NaCl水溶液洗三次。收集的乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥12h，过滤，滤液减压浓缩至干。得到油状物用150mL二氯甲烷将其溶解,室温下静置过夜使无色固体充分析出。过滤，得到12g(83％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e):467[M+H]⁺。

实施例5制备Boc-Arg(NO₂)-Gly

将12g(2.58mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl溶于50mL甲醇。冰浴与搅拌下往得到的溶液中缓慢滴加NaOH水溶液(2M)，冰浴搅拌6h。TLC(二氯甲烷/甲醇,40/1)显示Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl完全消失。冰浴与搅拌下缓慢滴加饱和KHSO₄水溶液调pH7，减压浓缩除去甲醇。在冰浴与搅拌下往残留的水溶液缓慢滴加稀盐酸调pH 2。得到的溶液用200mL乙酸乙酯分三次萃取。合并的乙酸乙酯层用200mL饱和NaCl水溶液分三次洗。收集乙酸乙酯层，用无水Na₂SO₄干燥12h。过滤，滤液减压浓缩，得到0.98g(98％)标题化合物。ESI-MS(m/e):359[M-H]^-。

实施例6制备Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl

采用实施例3的方法从10g Boc-Asp(OBzl)和12g Tos·Val-OBzl得到14.5g标题化合物，为淡黄色块状物。ESI-MS(m/e):515[M+H]⁺。

实施例7制备Asp(OBzl)-Val-OBzl

将10g Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl用20mL无水乙酸乙酯溶解。在冰浴与搅拌下往该溶液中加100ml氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M),搅拌2h。TLC(二氯甲烷/甲醇,40/1)显示Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl完全消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物用30mL无水乙酸乙酯稀释，再减压浓缩至干。该操作重复三次。得到的残留物用30mL无水乙醚稀释，再减压浓缩至干。该操作重复三次，得到标题化合物。ESI-MS(m/e):415[M+H]⁺。

实施例8制备Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl

采用实施例3的方法从12g Boc-Asp(NO₂)-Gly和15.9g Asp(OBzl)-Val-OBzl得到15g(61％)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):773[M+H]⁺。¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz)δ/ppm＝8.481(m,1H),8.234(d,J＝7.8Hz,1H),8.137(d,J＝7.8Hz,1H),8.047(m,1H),7.355(m,10H),6.951(m,1H),5.101(m,4H),4.768(m,1H),4.184(m,1H),3.932(s,1H),3.708(m,2H),3.120(m,2H),2.762(m,1H),2.581(m,1H),2.073(m,1H),1.577(m,4H),1.371(s,9H),0.850(d,J＝6.0Hz,6H)。

实施例9制备Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl

采用实施例5的方法从15g Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl得到12.8g(98％)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):673[M+H]⁺。

实施例10制备Boc-Pro-Ala-OBzl

采用实施例3的方法从10g Boc-Pro和10g HCl·Ala-OBzl得到15g(86％)标题化合物，为淡黄色固体。ESI-MS(m/e):377[M+H]⁺。

实施例11制备Boc-Pro-Ala

采用实施例4的方法从15g(39.9mmol)Boc-Pro-Ala-OBzl得到10.63g(99％)目标化合物，为淡黄色固体。ESI-MS(m/e):268[M-H]^-。

实施例12制备Boc-Pro-Ala-Lys(Cbz)-OBzl

采用实施例3的方法从10g Boc-Pro-Ala-OBzl和14.2g HCl·Lys(Cbz)-OBzl得到14.5g(65％)标题化合物，为无色油状产物。ESI-MS(m/e):639[M+H]⁺。

实施例13制备Boc-Pro-Ala-Lys(Cbz)

采用实施例4的方法从14.5g Boc-Pro-Ala-Lys(Cbz)-OBzl得到11.93g(99％)标题化合物，为淡黄色固体。ESI-MS(m/e):529[M-H]_-。

实施例14制备Fmoc-Lys(Boc)-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)Val-OBzl

采用实施例3的方法从10g Fmoc-Lys(Boc)和14.8g HCl·Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl得到16.79g(70％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e):1123[M+H]⁺。

实施例15制备Fmoc-Lys-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)Val-OBzl

采用实施例5的方法从8g Fmoc-Lys(Boc)-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl得到7.14g(98％)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):1023[M+H]⁺。

实施例16制备Fmoc-Lys[Boc-Pro-Ala-Lys(Cbz)]-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl

采用实施例3的方法从1.2g Boc-Pro-Ala-Lys(Cbz)和1.885g Fmoc-Lys-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl得到1.69g(98％)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):1553[M+H]⁺。

实施例17制备Lys[Boc-Pro-Ala-Lys(Cbz)]-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl

在冰浴下将500mg Fmoc-Lys[Boc-Pro-Ala-Lys(Cbz)]-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl与2mL哌啶的DMF溶液(20％)充分搅拌0.5h。TLC(二氯甲烷/甲醇,40/1)显示Fmoc-Lys[Boc-Pro-Ala-Lys(Cbz)]-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl完全消失。往反应混合物加100mL乙醚，静置，使无色固体充分析出。吸出上清液，往里再加100mL乙醚，静置，使无色固体充分析出。该操作重复5次。最后一次吸出的上清液减压浓缩至干，得到453mg(95％)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):1329[M+H]⁺。

实施例18制备N-Boc-1R-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3S-酰基-Lys[Boc-Pro-Ala-Lys(Cbz)]-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl(3)

采用实施例3的方法从117mg N-Boc-1R-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3S-羧酸(2)和428mgLys[Boc-Pro-Ala-Lys(Cbz)]-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl得到70mg(13％)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):1641[M+H]⁺；¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz)δ/ppm＝8.443(m,1H),8.212(m,2H),8.033(m,2H),7.878(m,1H),7.704(m,3H),7.263(m,15H),6.963(m,2H),5.094(m,4H),4.994(s,2H),4.787(m,2H),4.185(m,4H),3.729(m,1H),3.146(m,3H),2.953(m,6H),2.762(m,1H),2.053(m,2H),1.764(m,3H),1.387(m,26H),1.189(m,8H),0.843(d,J＝5.7Hz,6H)。

实施例19制备N-Boc-1R-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3S-酰基-Lys(Boc-Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val(4)

往100mg N-Boc-1R-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3S-酰基-Lys[(Boc-Pro-Ala-Lys(Cbz)]-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl(3)与10mL甲醇的溶液中加40mg Pd/C和2滴甲酸，充分搅拌使成为均匀的悬浮液。减压抽出反应体系内的空气，通入氢气，室温搅拌24h。TLC(二氯甲烷/甲醇,40/1)显示3完全消失。过滤去除Pb/C，滤液减压浓缩，得到40mg(51％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e):1282[M-H]^-。

实施例20制备1R-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3S-酰基-Lys(Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val(5)

采用实施例5的方法从40mg N-Boc-1R-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3S-酰基-Lys(Boc-Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val(4)得到33mg(98％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e):1082[M+H]⁺；Mp:188-189℃；

IR(cm^-1):3254.85,3062.05,2938.74,1647.09,1537.95,1454.68,1375.13,1229.86,1041.95,845.61,658.70；¹H NMR(D₂O-d₂,800MHz)δ/ppm＝7.523(d,J＝8.0Hz,1H),7.440(d,J＝8.0Hz,1H),7.233(t,J＝8.0Hz,1H),7.136(t,J＝8.0Hz,1H),5.020(m,1H),4.552(m,1H),4.290(t,J＝8.0Hz,1H),4.256(m,1H),4.224(m,1H),4.126(m,2H),4.074(m,J₁＝7.2Hz 1H),3.897(m,2H),3.568(m,2H),3.450(m,1H),3.284(m,2H),3.101(m,5H),2.979(m,2H),2.946(m,2H),2.843(m,1H),2.791(m,1H),2.758(m,1H),2.281(m,1H),2.037(m,1H),2.025(m,1H),1.932(m,1H),1.810(m,1H),1.671(m,5H),1.609(m,2H),1.546(m,3H),1.468(m,2H),1.322(m,6H),1.181(m,1H),0.882(m,1H),0.838(t,J＝8.0Hz,4H)。

实验例1评价化合物5的抗血栓活性

将雄性SD大鼠(200±20g)，随机分组，每组7只，饲养1天，停止喂食过夜。灌胃给予化合物5的生理盐水溶液(剂量为10nmol/kg)或阿司匹林的生理盐水溶液(剂量为167或16.7μmol/kg)或生理盐水(剂量为10mL/kg)30min之后，大鼠用20％乌来糖的生理盐水溶液麻醉，之后手术。分离大鼠的右颈动脉和左颈静脉，将准确称重的丝线置于旁路插管，管的一端插入左静脉，另一端管插入右侧动脉并注射0.2mL肝素钠抗凝。使得血流从右侧动脉流经旁路插管进入左侧静脉，15min之后取出附有血栓的丝线称量，计算血液循环前后丝线的重量，得到的血栓重以均值±SD mg表示并代表抗血栓活性，作t检验。数据列入表1。结果表明口服10nmol/kg化合物5能有效地抑制血栓形成。10nmol/kg化合物5抑制血栓形成的活性比16.7μmol/kg阿司匹林强，即化合物5的抗血栓活性比阿司匹林强1670倍。

表1在10nmol/kg剂量下化合物5的抗血栓活性

a)与生理盐水及阿司匹林比p<0.01；b)与生理盐水比p>0.05；n＝7.

实验例2评价化合物5的溶血栓活性

SD大鼠(雄性,200±20g)按1200mg/kg的剂量腹腔注射乌拉坦生理盐水溶液进行麻醉。麻醉大鼠后将其仰卧位固定，分离其右颈总动脉，近心端处夹住动脉夹，将近心端及远心端分别穿入手术线，远心端的手术线结扎，远心端插管，将动脉夹松开，取出约1mL动脉血，置于1mL离心管中。往垂直固定的橡胶管(长15mm，内径2.5mm，外径5.0mm，管底用胶塞密封，para膜封紧)内注入0.1ml大鼠动脉血，随后在管内迅速插入一支不锈钢材质的血栓的固定螺栓(血栓固定螺旋用直径为0.2mm的不锈钢丝绕成,螺旋部分长10mm，内含15个螺圈，螺圈的直径为1.0mm，托柄与螺旋相连，长约7.0mm，呈问号型)。血液凝固45min后，从玻璃管中小心取出被血栓包裹的血栓固定螺旋，精确称其重量。

旁路插管由三部分构成，中间段为长60.0mm，内径3.5mm的聚乙烯胶管；两端均为长100.0mm，内径1.0mm，外径2.0mm的相同的聚乙烯管，该管一端拉成尖管，长约10.0mm(用于插入大鼠颈动脉及静脉)，外径为1.0mm，其另一端的外部套一段长为7.0mm，外径为3.5mm的聚乙烯管(用于插入中段的聚乙烯胶管内)，3段管的内壁均需要硅烷化(1％的硅油乙醚溶液)。将血栓包裹的血栓固定螺旋置于中段聚乙烯胶管内，胶管的另外两端分别与两根聚乙烯的加粗端相套，保证在循环的过程中不会漏血。用注射器通过尖管端将管中注满肝素生理盐水溶液(50IU/kg)，排除气泡，备用。

分离大鼠的左颈外静脉，近心端和远心端分别穿入手术线，结扎远心端的血管，在暴露的左颈外静脉上剪一小口，将上述制备好的旁路管道尖管由小口插入左颈外静脉开口处,同时远离旁路管中段(含精确称量的血栓固定螺旋)内血栓固定螺旋。用注射器通过另一端的尖管注入准确量的肝素钠的生理盐水溶液(50IU/kg)，此时注射器不要撤离聚乙烯管，用动脉夹夹住注射器与聚乙烯管之间的软管。在右颈总动脉的近心端用动脉夹止血，结扎远心端，在离动脉夹不远处将右颈总动脉剪一小口，从聚乙烯管的尖部拔出注射器，将聚乙烯管的尖部插入动脉斜口的近心端。旁路管道的两端均用4号手术缝线将动静脉固定。

用头皮针将生理盐水(3mL/kg)或尿激酶的生理盐水溶液(剂量为20000IU/kg)或化合物5的生理盐水溶液(剂量为10nmol/kg)通过旁路管的中段(含精确称量的血栓固定螺旋)，扎入远离血栓固定螺旋的近静脉端，松开动脉夹,使血流通过旁路管道从动脉流向静脉。将注射器中的溶液缓慢注入血液，通过血液循环，按静脉-心脏-动脉的顺序作用于螺旋的血栓上。血液循环1h之后，从旁路管道中取出固定血栓的螺旋，精确称量。计算每只大鼠旁路管道中固定血栓的螺旋血液循环前后血栓的重量差，即血栓减重。对数据(均值±SDmg)作t检验。血栓减重代表溶血栓活性。表2的结果表明，10nmol/kg化合物5能有效地溶解血栓。活性与20000IU/kg尿激酶无显著差异。说明技术效果明显。

表2在10nmol/kg剂量下化合物5的溶血栓活性

a)与生理盐水比p<0.01,与尿激酶比p>0.05；n＝9.

实验例3评价化合物5对缺血性中风24h大鼠的治疗作用

在雄性SD大鼠(体重300±20g)的颈部正中部竖直开约2cm长切口，沿胸锁乳突肌内侧缘分离出右颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉。用无创动脉夹分别夹闭颈内动脉开口处和颈总动脉近心端，结扎颈外动脉的远心端，在颈外动脉剪一小口，松开颈总动脉近心端的动脉夹，取10μl血，之后再用无创动脉夹夹闭颈总动脉的近心端。将取得的10μl血放置在1ml EP管中常温放置30分钟使血液凝固，然后转移至-20℃冰箱中放置1小时，使血液凝块结实。大鼠用10％水合氯醛腹腔注射麻醉，剂量为400mg/kg。取出血液凝块，加入1ml生理盐水，用钢铲把血液凝块捣成大小均一的细小血栓块，制备细小血栓的悬液并转移至1ml注射器内。松开颈总动脉近心端的动脉夹，将1ml血栓混悬液缓慢从大鼠颈外动脉向近心端经过颈内动脉注入大鼠的大脑，然后结扎颈外动脉近心端，打开颈内动脉和颈总动脉处得动脉夹，恢复血流。等待苏醒。大鼠苏醒24小时后按Zealonga方法评定神经功能缺损程度。0分表示无任何神经功能缺失体征、1分表示未损伤侧前肢不能伸展、2分表示向未损伤侧行走、3分表示向未损伤侧转圈成追尾状行走、4分表示意识障碍无自主行走、5分表示死亡。按照得分平均分组。大鼠每天经尾静脉注射1次生理盐水，剂量为3mL/kg。连续注射6天，每天评分。表3的数据说明，生理盐水治疗前大鼠的神经生物学评分为3只1分，3只2分，2只3分。生理盐水治疗后大鼠的神经生物学评分为3只死亡，4只1分，1只0分。整体显示病情恶化。

表3生理盐水连续治疗6天对脑缺血24小时大鼠神经生物学评分的影响

剂量:3mL/kg；n＝8.

大鼠每天经尾静脉注射1次tPA，剂量为3mg/kg。连续注射6天，每天评分。表4的数据说明，tPA治疗前大鼠的神经生物学评分为3只1分，3只2分，2只3分。tPA治疗后大鼠的神经生物学评分为4只死亡，1只1分，3只0分。此外，存活的4只大鼠眼眶和尾巴都显示严重出血副作用。整体显示病情恶化。

表4 tPA连续治疗6天对脑缺血24小时大鼠神经生物学评分的影响

剂量:3mg/kg；存活的4只大鼠眼眶和尾巴都严重出血；n＝8.

大鼠每天经尾静脉注射1次化合物5，剂量为10nmol/kg。连续注射6天，每天评分。表5的数据说明，化合物5治疗前大鼠的神经生物学评分为4只1分，2只2分，1只3分，1只4分。化合物5治疗后大鼠的神经生物学评分为0只死亡，1只0分，5只1分，1只3分，1只4分。此外，存活的8只大鼠均未见眼眶和尾巴出血。整体显示疗效明显。

表5化合物5连续治疗6天对脑缺血24小时大鼠神经生物学评分的影响

剂量:10nmol/kg；n＝8.

实验例4评价化合物5对缺血性中风24h大鼠脑梗死体积的影响

接受实验例3评价神经功能缺损程度后，用乌拉坦麻醉，迅速断头取脑置于-20℃冰箱冻2小时，从前额极开始连续切片,制得6片2mm厚冠状脑切片。将脑切片置于2％TTC溶液中37℃避光孵育30min，观察脑切片的颜色变化。待正常脑组织被TTC染成红色，缺血脑组织呈白色后，用数码相机照相。照片经SPSS统计软件处理，计算脑冠状切片中梗死体积和正常组织的体积，统计各组的梗死体积百分比值。验数据均采用t检验。表6的数据说明，化合物5治疗的缺血性中风24h大鼠脑梗死体积显著小于生理盐水治疗的缺血性中风24h大鼠脑梗死体积。

表6化合物5连续治疗6天对脑缺血24小时大鼠的脑梗死体积比

a)数据来自5/8只存活的大鼠脑切片；b)数据来自4/8只存活眼眶和尾巴都严重出血的大鼠脑切片；c)数据来自8/8只存活的大鼠脑切片,与生理盐水比p<0.01；n＝8.

总结：与曾经公开的化合物相比，本发明的化合物稳定容易制备和保存。一次性口服10nmol/kg化合物5可有效地抑制血栓形成，一次性口服10nmol/kg化合物5可有效地溶解血栓。连续6天每天一次静脉给予100nmol/kg化合物5可有效地恢复缺血性中风24小时大鼠的神经生物学行为，可有效地减小缺血性中风24小时大鼠的脑梗死体积。也就是说，本发明获得了突出的技术效果。

Claims (5)

1.下式的1R-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3S-酰基-Lys(Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val，

2.权利要求1的1R-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3S-酰基-Lys(Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val的制备方法,该方法包括:

(1)制备N-Boc-1R-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3S-羧酸；

(2)制备Lys[(Boc-Pro-Ala-Lys(Cbz)]-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

(3)制备N-Boc-1R-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3S-酰基-Lys[(Boc-Pro-Ala-Lys(Cbz)]-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

(4)制备N-Boc-1R-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3S-酰基-Lys(Boc-Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val；

(5)制备1R-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3S-酰基-Lys(Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val。

3.权利要求1的1R-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3S-酰基-Lys(Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val在制备抗血栓药物中的应用。

4.权利要求1的1R-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3S-酰基-Lys(Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val在制备溶血栓药物中的应用。

5.权利要求1的1R-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3S-酰基-Lys(Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val在制备治疗缺血性中风药物中的应用。

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