CN101591376A - 具有溶栓活性的寡肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了4，4，5，5－四甲基－1，3－二氧基咪唑啉－2－基苯－4’－基氧乙酰基修饰的溶栓寡肽及其制备方法，本发明还公开了它们在治疗脑血栓中的应用。将Ala－Arg－Pro－Ala－Lys、Pro－Ala－Lys、Arg－Pro－Ala－Lys、Gly－Arg－Pro－Ala－Lys或Gln－Arg－Pro－Ala－Lys分别与4，4，5，5－四甲基－1，3－二氧基咪唑啉－2－基苯－4’－基氧乙酰基偶联，即得本发明化合物。在大鼠颈动静脉旁路插管血栓模型上，本发明化合物显示出优秀的溶栓活性。在大鼠脑血栓模型上，本发明化合物显示优秀的脑梗死治疗作用。
Description
技术领域
本发明涉及寡肽，尤其涉及具有溶栓活性的4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基修饰的溶栓寡肽及其制备方法，本发明还进一步涉及它们治疗脑血栓的活性以及在临床作为脑血栓治疗剂的用途，属于生物医药领域。
背景技术
脑血栓以高发病、高致残和高死亡为特征。药物治疗，是临床治疗脑血栓的主要手段。针对脑血栓开发安全有效的药物，是新药研究与开发的热点之一。在脑血栓治疗药物中，溶血栓药物占有最重要的地位。在脑血栓治疗中，溶血栓药物降解血栓中的纤维蛋白成分，使血栓溶解实现血管再通。普遍认为，发病3h内应用组织型纤溶酶原激活剂可获得确切疗效。不过，目前治疗栓塞性疾病使用的链激酶、尿激酶和组织型纤溶酶原激活剂等药物普遍存在出血倾向和免疫原性反应，一直存在安全性问题。寻找安全有效的脑血栓溶栓药物是溶血栓新药研究的热点之一。
Ala-Arg-Pro-Ala-Lys是纤维蛋白β链的一个降解产物具有良好的溶栓活性，不存在出血倾向和免疫原性反应。对P6A的结构进行修饰，得到Gly-Arg-Pro-Ala-Lys和Gln-Arg-Pro-Ala-Lys两种类似物。它们也具有良好的溶栓活性，也不存在出血倾向和免疫原性反应。代谢研究显示P6A的水解片段RPAK和PAK也具有与P6A相当的溶栓活性。
P6A类似物作为脑血栓的溶栓药，打通血栓的过程类似于脑缺血再灌注的过程，脑内大量释放谷氨酸(Glu)，使NMDA受体激活。这时不仅导致eNOS和nNOS的表达上调，而且导致eNOS和nNOS的活性升高。于是，20分钟内缺血脑区NO的浓度迅速上升，以致达到微摩尔水平。6-12小时之后，iNOS的表达也大幅度上调。脑内生成的过量NO最终导致神经元死亡。从临床实践看，大部分脑缺血病人最后并不是死于脑缺血，而是死于缺血再灌注NO性神经元死亡。
发明人针对目前临床治疗脑血拴的局限性，利用4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧甲酰基修饰溶栓寡肽，发挥4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基清除NO的作用，使恢复血流时细胞能够不受NO自由基损伤，从而保护脑组织，为脑血栓的临床治疗提供新策略。
发明内容
本发明目的之一是提供一类具有溶栓活性的4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基修饰的寡肽。
本发明目的之二是提供一种制备上述具有溶栓活性的寡肽的方法。
本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：
具有溶栓活性的4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基修饰的寡肽，其结构式为式I、式II或式III所示：
式I
其中，R1选自Pro、Arg-Pro、Ala-Arg-Pro、Gly-Arg-Pro或Gln-Arg-Pro；R2为4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基；
式II
其中，R1为4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基；R2选自Pro、Arg-Pro、Ala-Arg-Pro、Gly-Arg-Pro或Gln-Arg-Pro；
其中，4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基的结构式为式III。
式III
将Ala-Arg-Pro-Ala-Lys、Pro-Ala-Lys、Arg-Pro-Ala-Lys、Gly-Arg-Pro-Ala-Lys或Gln-Arg-Pro-Ala-Lys分别与4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基偶联，即可分别得到上述式I、式II化合物。
具体的，一种制备上述式I化合物的方法，包括：
(1)制备C-端和侧链保护的Pro-Ala-Lys、Arg-Pro-Ala-Lys、Ala-Arg-Pro-Ala-Lys、Gly-Arg-Pro-Ala-Lys或Gln-Arg-Pro-Ala-Lys；
(2)制备4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酸；
(3)将C-端和侧链保护的Pro-Ala-Lys、Arg-Pro-Ala-Lys、Ala-Arg-Pro-Ala-Lys、Gly-Arg-Pro-Ala-Lys或Gln-Arg-Pro-Ala-Lys的N端分别与4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酸偶联、脱去所有保护基，即得；
一种制备上述式II化合物的方法，包括：
(1)制备N-端、C-端和除Lys外侧链保护的Pro-Ala-Lys、Arg-Pro-Ala-Lys、Ala-Arg-Pro-Ala-Lys、Gly-Arg-Pro-Ala-Lys或Gln-Arg-Pro-Ala-Lys；
(2)制备4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酸；
(3)分别将N-端、C-端和除Lys外侧链保护的Pro-Ala-Lys、Arg-Pro-Ala-Lys、Ala-Arg-Pro-Ala-Lys、Gly-Arg-Pro-Ala-Lys或Gln-Arg-Pro-Ala-Lys的Lys的侧链氨基与4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酸偶联、脱去所有保护基，即得。
本发明的又一目的是提供一种治疗脑血栓的药用组合物，该药用组合物由治疗上有效剂量的本发明式I或式II化合物与药学上可接受的载体组成，即将有效量的本发明式I或式II化合物与药学上可接受的载体或稀释剂配合后，按本领域常规的制剂方法将其制备成任意一种适宜的药物组合物。通常该组合物适合于口服给药和注射给药，也适合其他的给药方法。该组合物可以是片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、锭剂、栓剂，或口服液等液体制剂形式。根据不同的给药方法，本发明药物组合物可以含有0.1％-99％重量，优选10-60％重量的本发明化合物。
本发明采用大鼠颈动静脉旁路插管血栓模型先确定本发明化合物溶静脉血栓活性，本发明再进一步采用大鼠脑血栓模型确定本发明化合物溶脑血栓活性。在大鼠颈动静脉旁路插管血栓模型上，本发明化合物显示优秀的溶栓活性。在大鼠脑血栓模型上，本发明化合物显示优秀的脑梗死治疗作用。
附图说明
图1本发明化合物的合成路线图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。应当指出，这些实施例仅仅是本发明的例证，不应理解为对本发明的限制。
实施例14，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酸的制备
1)2，3-二甲基-2，3-二硝基丁烷的制备
69g(0.78mol，70ml)2-硝基丙烷加到130ml NaOH(6mol/l)水溶液中。在冰盐浴搅拌条件下，滴加20ml(0.38mol)Br2，1hr内滴加完。然后加入240ml乙醇。反应混合物于90℃回流搅拌3hr，出现片状不溶物。将反应混合物乘热倒入800ml冰水中。抽滤，得白色片状结晶55g(81％)，mp 110-112℃。
2)2，3-二甲基-2，3-二羟胺基丁烷的制备
将7.0g(40mmol)2，3-二甲基-2，3-二硝基丁烷和4.0g NH4Cl混悬于80ml乙醇(50％)溶液中。冰浴下搅拌。在3hr内加入16.0g锌粉。锌粉加完后，撤去冰浴，继续室温搅拌反应3hr，然后将反应液抽滤。滤饼用50％的乙醇水溶液反复洗涤。合并的滤液及洗涤液用浓盐酸调节pH＝2，减压浓缩至泥浆状。往泥浆状物中加入适量碳酸钾，拌匀后，使用索氏提取器，氯仿为提取剂，抽提6hr。提取液减压浓缩至少量，加入石油醚后析出白色结晶2.60g(44％)，mp 157-159℃。
3)1，3-二羟基-2-(4’-羟基苯基)-4，4，5，5-四甲基二氢咪唑啉的制备
1.22g(10mmol)对羟基苯甲醛与1.48g(10mmol)2，3-二甲基-2，3-二羟胺基丁烷溶于10ml甲醇中，室温搅拌16hr后，TLC显示原料点消失。滤出白色固体2g(85％)直接用于下一步反应。样品经TLC纯化后，EI-MS：236.3[M]+；mp：168-169。
4)4’-(4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基)苯酚的制备
475mg(2mmol)1，3-二羟基-2-(4’-羟基苯基)-4，4，5，5-四甲基二氢咪唑啉溶解于50ml甲醇中。往得到的溶液中加入2.5g PbO2，室温搅拌0.5hr后，TLC显示原料点消失。抽滤，除去固体。滤液室温下减压浓缩至干。残留物柱层析分离(氯仿为洗脱剂)，得370mg(80％)标题化合物，为蓝黑色晶体。mp 84-85℃；EI-MS 233[M]+、201[M-32]+，145[M-88]+。
5)4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酸乙酯的制备
250mg(1mmol)4’-(4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基)苯酚、0.32ml溴代乙酸乙酯及100mg乙醇钠溶于5ml无水THF中，60℃搅拌5hrs后，TLC显示原料点消失。室温下减压蒸干反应液，柱层析(氯仿为洗脱剂)，得目标物300mg(90％)，mp：107-109℃。
6)4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酸的制备
33mg(0.1mmol)4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酸乙酯溶于3ml甲醇中，加入7滴2N NaOH，室温搅拌30min后，TLC显示原料点消失。将反应液在室温下减压蒸至少量，加入2ml饱和食盐水溶液，用2N HCl调pH＝5-6，用氯仿(3ml×3)反复萃取溶液，合并氯仿层，无水硫酸钠干燥，室温下减压蒸干得蓝色针状结晶30mg(100％)；mp：155-157℃，EI-MS(m/z)：307[M]+，276[M-31]+。
实施例2Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl的制备
1)制备Boc-Ala-Lys(Z)-OBzl
将473mg(2.5mmol)Boc-Ala-OH溶于10ml无水四氢呋喃(THF)，冰浴下往里加10ml338mg(2.5mmol)N-羟基苯并三唑(HOBt)和619mg(3.0mmol)二环己基羰二亚胺(DCC)的无水THF溶液。反应混合物冰浴搅拌20分钟，得对应的活泼酯溶液，待用。
将936mg(2.3mmol)HCl·Lys(Z)-OBzl和232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉先与6ml无水THF混溶，然后与上面待用的活泼酯溶液混溶。得到的反应混合物室温反应24小时。TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝20∶1)显示HCl·Lys(Z)-OBzl消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。滤液依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗。分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液37℃减压浓缩，得1.204g(97％)标题化合物。为无色油状物。mp 88-90℃；[α]D 20＝-29.2°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)565[M+Na]+。
2)制备HCl·Ala-Lys(Z)-OBzl
将1.354g(2.5mmol)Boc-Ala-Lys(Z)-OBzl与15ml氯化氢-乙酸乙酯液(4N)的混合物室温搅拌3小时，TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示Boc-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。用水泵将反应液抽干，加入无水乙醚，再次用水泵将反应液抽干，重复5次。残留物用无水乙醚泡洗，塑料铲磨洗，将无水乙醚倾出，反复5次。得到的标题化合物直接用于下步反应。
3)制备Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将538mg(2.5mmol)Boc-Pro-OH溶于10ml无水THF，冰浴下往里加10ml 338mg(2.5mmol)HOBt和619mg(3mmol)DCC的无水THF溶液。反应混合物冰浴搅拌20分钟，得对应的活泼酯溶液，待用。
将1.099g(2.3mmol)HCl·Ala-Lys(Z)-OBzl和232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉先与6ml无水THF混溶，然后与上面待用的活泼酯溶液混溶。得到的反应混合物室温反应24小时。TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝20∶1)显示HCl·Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。滤液依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗。分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液37℃减压浓缩，得2.847g(98％)标题化合物。为无色固体。mp 82-83.4℃；[α]D 20＝-46.36°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)661.7[M+Na]+。
4)制备HCl·Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将1.596g(2.5mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl与15ml氯化氢-乙酸乙酯液(4N)的混合物室温搅拌3小时，TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。用水泵将反应液抽干，加入无水乙酸乙酯，用水泵将反应液抽干，重复5次。残留物用无水乙醚泡洗，再次用水泵将反应液抽干，反复5次。得到的标题化合物直接用于下步反应。
实施例3Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl的制备
1)制备HCl·Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将1.596g(2.5mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl与15ml氯化氢-乙酸乙酯液(4N)的混合物室温搅拌3小时，TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。用水泵将反应液抽干，加入乙酸乙酯，用水泵将反应液抽干，重复5次。残留物用无水乙醚泡洗，再次用水泵将反应液抽干，反复5次。得到的标题化合物直接用于下步反应。
2)制备Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将1.073g(2.5mmol)Boc-Arg(Tos)-OH溶于10ml无水THF，冰浴下往里加10ml 338mg(2.5mmol)HOBt和619mg(3mmol)DCC的无水THF溶液。反应混合物冰浴搅拌20分钟，得对应的活泼酯溶液，待用。
将1.322g(2.3mmol)HCl·Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl和232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉先与6ml无水THF混溶，然后与上面待用的活泼酯溶液混溶。得到的反应混合物室温反应24小时。TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示HCl·Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。滤液依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗。分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液37℃减压浓缩，得1.856g(85％)标题化合物。为无色固体。mp 83.1-84.5℃；[α]D 20＝-58.8°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)951.2[M+H]+
3)制备HCl·Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将2.372g(2.5mmol)Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl与15ml氯化氢-乙酸乙酯液(4N)的混合物室温搅拌3小时，TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。用水泵将反应液抽干，加入无水乙醚，再次用水泵将反应液抽干，重复5次。残留物用无水乙醚泡洗，塑料铲磨洗，将无水乙醚倾出，反复5次。得到的标题化合物直接用于下步反应。
实施例4Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl的制备
1)制备HCl·Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将2.372g(2.5mmol)Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl与15ml氯化氢-乙酸乙酯液(4N)的混合物室温搅拌3小时，TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。用水泵将反应液抽干，加入无水乙醚，再次用水泵将反应液抽干，重复5次。残留物用无水乙醚泡洗，塑料铲磨洗，将无水乙醚倾出，反复5次。得到的标题化合物直接用于下步反应。
2)制备Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将473mg(2.5mmol)Boc-Ala-OH溶于10ml无水THF，冰浴下往里加10ml 338mg(2.5mmol)HOBt和619mg(3mmol)DCC的无水THF溶液。反应混合物冰浴搅拌20分钟，得对应的活泼酯溶液，待用。
将2.037g(2.3mmol)HCl·Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl和232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉先与6ml无水THF混溶，然后与上面待用的活泼酯溶液混溶。得到的反应混合物室温反应24小时。TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示HCl·Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。滤液依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗。分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液37℃减压浓缩，得2.088g(89％)标题化合物。为无色固体。mp 85.6-86.7℃；[α]D 20＝-81.3°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)1022.3[M+H]+。
3)制备HCl·Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将2.550g(2.5mmol)Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl与15ml氯化氢-乙酸乙酯液(4N)的混合物室温搅拌3小时，TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。用水泵将反应液抽干，加入无水乙醚，再次用水泵将反应液抽干，重复5次。残留物用无水乙醚泡洗，塑料铲磨洗，将无水乙醚倾出，反复5次。得到的标题化合物直接用于下步反应。
实施例5Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl的制备
1)制备Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将438mg(2.5mmol)Boc-Gly-OH溶于10ml无水THF，冰浴下往里加10ml 338mg(2.5mmol)HOBt和619mg(3mmol)DCC的无水THF溶液。反应混合物冰浴搅拌20分钟，得对应的活泼酯溶液，待用。
将2.037g(2.3mmol)HCl·Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl和232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉先与6ml无水THF混溶，然后与上面待用的活泼酯溶液混溶。得到的反应混合物室温反应24小时。TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示HCl·Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。滤液依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗。分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液37℃减压浓缩，得2.129g(92％)标题化合物。为无色固体。mp 84.6-85.4℃；[α]D 20＝-51.3°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)1008.6[M+H]+。
2)制备HCl·Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将2.515g(2.5mmol)Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl与15ml氯化氢-乙酸乙酯液(4N)的混合物室温搅拌3小时，TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。用水泵将反应液抽干，加入无水乙醚，再次用水泵将反应液抽干，重复5次。残留物用无水乙醚泡洗，塑料铲磨洗，将无水乙醚倾出，反复5次。得到的标题化合物直接用于下步反应。
实施例6Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl的制备
1)制备Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将615mg(2.5mmol)Boc-Gln-OH溶于10ml无水THF，冰浴下往里加10ml 338mg(2.5mmol)HOBt和619mg(3mmol)DCC的无水THF溶液。反应混合物冰浴搅拌20分钟，得对应的活泼酯溶液，待用。
将2.037g(2.3mmol)HCl·Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl和232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉先与6ml无水THF混溶，然后与上面待用的活泼酯溶液混溶。得到的反应混合物室温反应24小时。TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示HCl·Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。滤液依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗。分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液37℃减压浓缩，得2.205g(89％)标题化合物。为无色固体。mp 90.6-91.4℃；[α]D 20＝-91.3°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)1079.3[M+H]+。
2)制备HCl·Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将2.693g(2.5mmol)Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl与15ml氯化氢-乙酸乙酯液(4N)的混合物室温搅拌3小时，TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。用水泵将反应液抽干，加入无水乙醚，再次用水泵将反应液抽干，重复5次。残留物用无水乙醚泡洗，塑料铲磨洗，将无水乙醚倾出，反复5次。得到的标题化合物直接用于下步反应。
实施例7Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OMe的制备
1)制备Boc-Ala-Lys(Z)-OMe
将473mg(2.5mmol)Boc-Ala-OH溶于10ml无水四氢呋喃(THF)，冰浴下往里加10ml338mg(2.5mmol)N-羟基苯并三唑(HOBt)和619mg(3.0mmol)二环己基羰二亚胺(DCC)的无水THF溶液。反应混合物冰浴搅拌20分钟，得对应的活泼酯溶液，待用。
将762mg(2.3mmol)HCl·Lys(Z)-OMe和232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉先与6ml无水THF混溶，然后与上面待用的活泼酯溶液混溶。得到的反应混合物室温反应24小时。TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝20∶1)显示HCl·Lys(Z)-OMe消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。滤液依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗。分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液37℃减压浓缩，得1.018g(95％)标题化合物。为无色油状物。mp 87.6-88.5℃；[α]D 20＝-35.3°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)467.3[M+H]+。
2)制备HCl·Ala-Lys(Z)-OMe
将1.165g(2.5mmol)Boc-Ala-Lys(Z)-OMe与15ml氯化氢-乙酸乙酯液(4N)的混合物室温搅拌3小时，TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示Boc-Ala-Lys(Z)-OMe消失。用水泵将反应液抽干，加入无水乙醚，再次用水泵将反应液抽干，重复5次。残留物用无水乙醚泡洗，塑料铲磨洗，将无水乙醚倾出，反复5次。得到的标题化合物直接用于下步反应。
3)制备Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OMe
将538mg(2.5mmol)Boc-Pro-OH溶于10ml无水THF，冰浴下往里加10ml 338mg(2.5mmol)HOBt和619mg(3mmol)DCC的无水THF溶液。反应混合物冰浴搅拌20分钟，得对应的活泼酯溶液，待用。
将926mg(2.3mmol)HCl·Ala-Lys(Z)-OMe和232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉先与6ml无水THF混溶，然后与上面待用的活泼酯溶液混溶。得到的反应混合物室温反应24小时。TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝20∶1)显示HCl·Ala-Lys(Z)-OMe消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。滤液依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗。分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液37℃减压浓缩，得1.243g(96％)标题化合物。为无色固体。mp 81.6-82.5℃；[α]D 20＝-45.8°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)564.5[M+H]+。
4)制备HCl·Pro-Ala-Lys(Z)-OMe
将1.408g(2.5mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OMe与15ml氯化氢-乙酸乙酯液(4N)的混合物室温搅拌3小时，TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OMe消失。用水泵将反应液抽干，加入无水乙酸乙酯，用水泵将反应液抽干，重复5次。残留物用无水乙醚泡洗，再次用水泵将反应液抽干，反复5次。得到的标题化合物直接用于下步反应。
实施例8Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OMe的制备
1)制备HCl·Pro-Ala-Lys(Z)-OMe
将1.408g(2.5mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OMe与15ml氯化氢-乙酸乙酯液(4N)的混合物室温搅拌3小时，TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OMe消失。用水泵将反应液抽干，加入乙酸乙酯，用水泵将反应液抽干，重复5次。残留物用无水乙醚泡洗，再次用水泵将反应液抽干，反复5次。得到的标题化合物直接用于下步反应。
2)制备Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OMe
将1.073g(2.5mmol)Boc-Arg(Tos)-OH溶于10ml无水THF，冰浴下往里加10ml 338mg(2.5mmol)HOBt和619mg(3mmol)DCC的无水THF溶液。反应混合物冰浴搅拌20分钟，得对应的活泼酯溶液，待用。
将1.149g(2.3mmol)HCl·Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl和232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉先与6ml无水DMF混溶，然后与上面待用的活泼酯溶液混溶。得到的反应混合物室温反应24小时。TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示HCl·Pro-Ala-Lys(Z)-OMe消失。反应混合物减压浓缩至干，DMF吹干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。滤液依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗。分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液37℃减压浓缩，得1.749g(87％)标题化合物。为无色固体。mp 84.6-85.8℃；[α]D 20＝-67.8°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)875.2[M+H]+。
2)制备HCl·Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OMe
将2.185g(2.5mmol)Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OMe与15ml氯化氢-乙酸乙酯液(4N)的混合物室温搅拌3小时，TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OMe消失。用水泵将反应液抽干，加入无水乙醚，再次用水泵将反应液抽干，重复5次。残留物用无水乙醚泡洗，塑料铲磨洗，将无水乙醚倾出，反复5次。得到的标题化合物直接用于下步反应。
实施例9Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OMe的制备
1)制备HCl·Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OMe
将2.185g(2.5mmol)Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OMe与15ml氯化氢-乙酸乙酯液(4N)的混合物室温搅拌3小时，TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OMe消失。用水泵将反应液抽干，加入无水乙醚，再次用水泵将反应液抽干，重复5次。残留物用无水乙醚泡洗，塑料铲磨洗，将无水乙醚倾出，反复5次。得到的标题化合物直接用于下步反应。
2)制备Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OMe
将473mg(2.5mmol)Boc-Ala-OH溶于10ml无水THF，冰浴下往里加10ml 338mg(2.5mmol)HOBt和619mg(3mmol)DCC的无水THF溶液。反应混合物冰浴搅拌20分钟，得对应的活泼酯溶液，待用。
将1.864g(2.3mmol)HCl·Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OMe和232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉先与6ml无水THF混溶，然后与上面待用的活泼酯溶液混溶。得到的反应混合物室温反应24小时。TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示HCl·Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OMe消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。滤液依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗。分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液37℃减压浓缩，得1.891g(87％)标题化合物。为无色固体。mp 87.6-88.9℃；[α]D 20＝-69.1°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)946.8[M+H]+。
实施例10Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OMe的制备
1)制备Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OMe
将438mg(2.5mmol)Boc-Gly-OH溶于10ml无水THF，冰浴下往里加10ml 338mg(2.5mmol)HOBt和619mg(3mmol)DCC的无水THF溶液。反应混合物冰浴搅拌20分钟，得对应的活泼酯溶液，待用。
将1.864g(2.3mmol)HCl·Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OMe和232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉先与6ml无水THF混溶，然后与上面待用的活泼酯溶液混溶。得到的反应混合物室温反应24小时。TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示HCl·Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OMe消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。滤液依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗。分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液37℃减压浓缩，得1.927g(90％)标题化合物。为无色固体。mp 85.6-87.5℃；[α]D 20＝-40.8°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)932.0[M+H]+。
实施例11Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OMe的制备
1)制备Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OMe
将615mg(2.5mmol)Boc-Gln-OH溶于10ml无水THF，冰浴下往里加10ml 338mg(2.5mmol)HOBt和619mg(3mmol)DCC的无水THF溶液。反应混合物冰浴搅拌20分钟，得对应的活泼酯溶液，待用。
将1.864g(2.3mmol)HCl·Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OMe和232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉先与6ml无水THF混溶，然后与上面待用的活泼酯溶液混溶。得到的反应混合物室温反应24小时。TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示HCl·Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。滤液依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗。分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液37℃减压浓缩，得2.028g(88％)标题化合物。为无色固体。mp 89.6-91.2℃；[α]D 20＝-61.8°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)1003.5[M+H]+。
实施例12Pro-Ala-(Nω-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基)Lys(Ia)的制备
1)制备Boc-Pro-Ala-Lys-OMe
将141mg(0.25mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OMe溶于适量甲醇中，加入20mg Pd/C，减压排出反应瓶中的空气。通入氢气置换，反复置换5次后，通氢气室温搅拌48小时，TLC(氯仿∶甲醇＝10∶1)显示原料点消失。停止反应，滤除Pd/C，滤液减压除去溶剂，得105mg(98％)标题化合物。为无色固体。mp 85.6-97.2℃；[α]D 20＝-41.8°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)429.3[M+H]+。
2)制备Boc-Pro-Ala-(Nω-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基)Lys-OMe
将70.6mg(0.23mmol)4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酸溶于10ml无水THF，冰浴下往里加10ml 33.8mg(0.25mmol)HOBt和61.9mg(0.33mmol)DCC的无水THF溶液。反应混合物冰浴搅拌20分钟，得对应的活泼酯溶液，待用。
将107mg(0.25mmol)Boc-Pro-Ala-Lys-OMe和6ml无水THF混溶，然后与上面待用的活泼酯溶液混溶。得到的反应混合物室温反应24小时。TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酸消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。滤液依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗。分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液37℃减压浓缩，柱层析分纯，得115mg(70％)标题化合物。为蓝色固体。mp 95.6-96.8℃；[α]D 20＝-39.0°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)718.4[M+H]+，740.4[M+Na]+；ESR g＝2.00787。
3)制备Boc-Pro-Ala-(Nω-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基)Lys
将179mg(0.25mmol)Boc-Pro-Ala-(Nω-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基)Lys-OMe溶于2ml甲醇中，冰浴条件下往里面加2ml 2N NaOH，2hr后TLC(氯仿∶甲醇＝10∶1)显示原料点消失。停止反应，37℃减压蒸去甲醇，饱和KHSO4调PH＝2，用乙酸乙酯萃取3次，再用饱和氯化钠水溶液洗。分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液37℃减压浓缩，得167mg(95％)标题化合物。为蓝色固体。mp 151.2-152.5℃；[α]D 20＝-37.2°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)704.5[M+H]+；ESR g＝2.00788。
4)制备Pro-Ala-(Nω-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基)Lys
176mg(0.25mmol)Boc-Pro-Ala-(Nω-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基)Lys加入茄瓶中，冰浴下加入6ml TFA和1.5ml TFMSA，1hr后TLC(氯仿∶甲醇＝1∶1)显示原料点消失。停止反应，用无水乙醚反复洗涤至PH＝7，减压抽干，C18柱纯化，冻干，得98.1mg(65％)标题化合物。为蓝色固体。mp 160.6-161.8℃；[α]D 20＝-35.3°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)605.3[M+H]+；ESR g＝2.00785。
实施例13Arg-Pro-Ala-(Nω-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基)Lys(Ib)的制备
1)制备Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys-OMe
将219mg(0.25mmol)Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OMe溶于适量甲醇中，加入30mgPd/C，减压排出反应瓶中的空气。通入氢气置换，反复置换5次后，通氢气室温搅拌48小时，TLC(氯仿∶甲醇＝10∶1)显示原料点消失。停止反应，滤除Pd/C，滤液减压除去溶剂，得181mg(98％)标题化合物。为无色固体。mp 91.5-92.8℃；[α]D 20＝-68.0°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)740.5[M+H]+。
2)制备Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-(Nω-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基)Lys-OMe
将70.6mg(0.23mmol)4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酸溶于10ml无水THF，冰浴下往里加10ml 33.8mg(0.25mmol)HOBt和61.9mg(0.33mmol)DCC的无水THF溶液。反应混合物冰浴搅拌20分钟，得对应的活泼酯溶液，待用。
将185mg(0.25mmol)Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys-OMe和6ml无水THF混溶，然后与上面待用的活泼酯溶液混溶。得到的反应混合物室温反应24小时。TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酸消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。滤液依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗。分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液37℃减压浓缩，硅胶柱纯化，得170mg(72％)标题化合物。为蓝色固体。mp 142.3-143.8℃；[α]D 20＝-42.5°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)1028.2[M+H]+，1050.7[M+Na]+；ESR g＝2.00784。
3)制备Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-(Nω-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基)Lys
将257mg(0.25mmol)Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-(Nω-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基)Lys-OMe溶于3ml甲醇中，冰浴条件下往里面加3ml 2N NaOH，2hr后TLC(氯仿∶甲醇＝10∶1)显示原料点消失。停止反应，37℃减压蒸去甲醇，饱和KHSO4调PH＝2，用乙酸乙酯萃取3次，再用饱和氯化钠水溶液洗。分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液37℃减压浓缩，得241mg(95％)标题化合物。为蓝色固体。mp150.2-151.8℃；[α]D 20＝62.8°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)1015.2[M+H]+，1027.7[M+Na]+；ESR g＝2.00788。
4)制备Arg-Pro-Ala-(Nω-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基)Lys
254mg(0.25mmol)Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-(Nω-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基)Lys加入茄瓶中，冰浴下加入8ml TFA和2ml TFMSA，1hr后TLC(氯仿∶甲醇＝1∶1)显示原料点消失。停止反应，用无水乙醚反复洗涤至PH＝7，减压抽干，C18柱纯化，冻干，得120mg(63％)标题化合物。为蓝色固体。mp 147.2-148.4℃；[α]D 20＝-37.5°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)761.5[M+H]+，783.4[M+Na]+；ESR g＝2.00782。
实施例14Ala-Arg-Pro-Ala-(Nω-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基)Lys(Ic)的制备
1)制备Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys-OMe
将236mg(0.25mmol)Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OMe溶于适量甲醇中，加入30mg Pd/C，减压排出反应瓶中的空气。通入氢气置换，反复置换5次后，通氢气室温搅拌48小时，TLC(氯仿∶甲醇＝10∶1)显示原料点消失。停止反应，滤除Pd/C，滤液减压除去溶剂，得196mg(97％)标题化合物。为无色固体。mp 85.6-86.8℃；[α]D 20＝-88.4°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)809.5[M+H]+。
2)制备Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-(Nω-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基)Lys-OMe
将70.6mg(0.23mmol)4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酸溶于10ml无水THF，冰浴下往里加10ml 33.8mg(0.25mmol)HOBt和61.9mg(0.33mmol)DCC的无水THF溶液。反应混合物冰浴搅拌20分钟，得对应的活泼酯溶液，待用。
将202mg(0.25mmol)Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys-OMe和6ml无水THF混溶，然后与上面待用的活泼酯溶液混溶。得到的反应混合物室温反应24小时。TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酸消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。滤液依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗。分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液37℃减压浓缩，硅胶柱纯化，得179mg(71％)标题化合物。为蓝色固体。mp 125.4-126.7℃；[α]D 20＝-51.6°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)1100.0[M+H]+，1022.0[M+Na]+；ESR g＝2.00783。
3)制备Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-(Nω-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基)Lys
将275mg(0.25mmol)Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-(Nω-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基)Lys-OMe溶于3ml甲醇中，冰浴条件下往里面加3ml 2N NaOH，2hr后TLC(氯仿∶甲醇＝10∶1)显示原料点消失。停止反应，37℃减压蒸去甲醇，饱和KHSO4调PH＝2，用乙酸乙酯萃取3次，再用饱和氯化钠水溶液洗。分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液37℃减压浓缩，得260mg(96％)标题化合物。为蓝色固体。mp148.3-149.5℃；[α]D 20＝-48.5°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)1085.4[M+H]+；ESRg＝2.00788。
4)制备H-Ala-Arg-Pro-Ala-(Nω-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基)Lys
271mg(0.25mmol)Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-(Nω-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基)Lys加入茄瓶中，冰浴下加入8ml TFA和2ml TFMSA，1hr后TLC(氯仿∶甲醇＝1∶1)显示原料点消失。停止反应，用无水乙醚反复洗涤至PH＝7，减压抽干，C18柱纯化，冻干，得133mg(64％)标题化合物。为蓝色固体。mp 160.8-161.9℃；[α]D 20＝-46.2°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)832.7[M+H]+；ESR g＝2.00781。
实施例15Gly-Arg-Pro-Ala-(Nω-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基)Lys(Id)的制备
1)制备Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys-OMe
将233mg(0.25mmol)Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OMe溶于适量甲醇中，加入30mg Pd/C，减压排出反应瓶中的空气。通入氢气置换，反复置换5次后，通氢气室温搅拌48小时，TLC(氯仿∶甲醇＝10∶1)显示原料点消失。停止反应，滤除Pd/C，滤液减压除去溶剂，得194mg(98％)标题化合物。为无色固体。mp 84.1-85.4℃；[α]D 20＝-66.9°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)795.4[M+H]+。
2)制备Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-(Nω-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基)Lys-OMe
将70.6mg(0.23mmol)4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酸溶于10ml无水THF，冰浴下往里加10ml 33.8mg(0.25mmol)HOBt和61.9mg(0.33mmol)DCC的无水THF溶液。反应混合物冰浴搅拌20分钟，得对应的活泼酯溶液，待用。
将199mg(0.25mmol)Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys-OMe和6ml无水THF混溶，然后与上面待用的活泼酯溶液混溶。得到的反应混合物室温反应24小时。TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酸消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。滤液依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗。分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液37℃减压浓缩，硅胶柱纯化，得180mg(72％)标题化合物。为蓝色固体。mp 155.6-156.8℃；[α]D 20＝46.3°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)1085.8[M+H]+，1107.3[M+Na]+；ESR g＝2.00784。
3)制备Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-(Nω-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基)Lys
将271mg(0.25mmol)Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-(Nω-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基)Lys-OMe溶于3ml甲醇中，冰浴条件下往里面加3ml 2N NaOH，2hr后TLC(氯仿∶甲醇＝10∶1)显示原料点消失。停止反应，37℃减压蒸去甲醇，饱和KHSO4调PH＝2，用乙酸乙酯萃取3次，再用饱和氯化钠水溶液洗。分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液37℃减压浓缩，得257mg(96％)标题化合物。为蓝色固体。mp145.5-146.7℃；[α]D 20＝-44.7°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)1072.3[M+H]+；ESRg＝2.007892；ESR g＝2.00783。
4)制备Gly-Arg-Pro-Ala-Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-(Nω-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基)Lys
268mg(0.25mmol)Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-(Nω-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基)Lys加入茄瓶中，冰浴下加入8ml TFA和2ml TFMSA，1hr后TLC(氯仿∶甲醇＝1∶1)显示原料点消失。停止反应，用无水乙醚反复洗涤至PH＝7，减压抽干，Sephadex G-10柱除盐，C18柱纯化，冻干，得135mg(66％)标题化合物。为蓝色固体。mp 162.8-164.2℃；[α]D 20＝-41.2°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)818.7[M+H]+；ESRg＝2.00783。
实施例16Gln-Arg-Pro-Ala-Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-(Nω-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基)Lys(Id)的制备
1)制备Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys-OMe
将251mg(0.25mmol)Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OMe溶于适量甲醇中，加入30mg Pd/C，减压排出反应瓶中的空气。通入氢气置换，反复置换5次后，通氢气室温搅拌48小时，TLC(氯仿∶甲醇＝10∶1)显示原料点消失。停止反应，滤除Pd/C，滤液减压除去溶剂，得212mg(98％)标题化合物。为无色固体。mp 90.6-91.8℃；[α]D 20＝-91.5°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)868.5[M+H]+。
2)制备Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Nω-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基)-OMe
将71.6mg(0.23mmol)4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酸溶于10ml无水THF，冰浴下往里加10ml 33.8mg(0.25mmol)HOBt和61.9mg(0.33mmol)DCC的无水THF溶液。反应混合物冰浴搅拌20分钟，得对应的活泼酯溶液，待用。
将217mg(0.25mmol)Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys-OMe与6ml无水THF混溶，然后与上面待用的活泼酯溶液混溶。得到的反应混合物室温反应24小时。TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酸消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。滤液依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗。分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液37℃减压浓缩，硅胶柱纯化，得186mg(70％)标题化合物。为蓝色固体。mp 91.0-92.2℃；[α]D 20＝56.4°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)1178.1[M+Na]+；ESR g＝2.00785。
3)制备Boc-Gln-Arg-Pro-Ala-Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-(Nω-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基)Lys
将289mg(0.25mmol)Boc-Gln-Arg-Pro-Ala-Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-(Nω-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基)Lys-OMe溶于3ml甲醇中，冰浴条件下往里面加3ml 2N NaOH，2hr后TLC(氯仿∶甲醇＝10∶1)显示原料点消失。停止反应，37℃减压蒸去甲醇，饱和KHSO4调PH＝2，用乙酸乙酯萃取3次，再用饱和氯化钠水溶液洗。分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液37℃减压浓缩，得268mg(94％)标题化合物。为蓝色固体。mp 146.8-148.1℃；[α]D 20＝-50.3°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)1143.5[M+H]+；ESR g＝2.00784。
4)制备Gln-Arg-Pro-Ala-Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-(Nω-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基)Lys
285mg(0.25mmol)Boc-Gln-Arg-Pro-Ala-Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-(Nω-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基)Lys加入茄瓶中，冰浴下加入8ml TFA和2mlTFMSA，1hr后TLC(氯仿∶甲醇＝1∶1)显示原料点消失。停止反应，用无水乙醚反复洗涤至PH＝7，减压抽干，C18柱纯化，冻干，得144mg(65％)标题化合物。为蓝色固体。mp 171.2-172.5℃；[α]D 20＝-20.5°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)889.5[M+H]+；ESRg＝2.00786。
实例施174，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基-Pro-Ala-Lys(If)的制备
1)制备HCl·Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将1.596g(2.5mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl与15ml氯化氢-乙酸乙酯液(4N)的混合物室温搅拌3小时，TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。用水泵将反应液抽干，加入无水乙酸乙酯，用水泵将反应液抽干，重复5次。残留物用无水乙醚泡洗，再次用水泵将反应液抽干，反复5次。得到的标题化合物直接用于下步反应。
2)制备4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将768mg(2.5mmol)4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酸溶于10ml无水THF，冰浴下往里加10ml 338mg(2.5mmol)HOBt和619mg(3mmol)DCC的无水THF溶液。反应混合物冰浴搅拌20分钟，得对应的活泼酯溶液，待用。
将1.322g(2.3mmol)HCl·Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl和232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉先与6ml无水THF混溶，然后与上面待用的活泼酯溶液混溶。得到的反应混合物室温反应24小时。TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示HCl·Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。滤液依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗。分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液37℃减压浓缩，得1.856g(85％)标题化合物。为蓝色固体。mp 155.4-156.7℃；[α]D 20＝-20.6°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)828.3[M+H]+，850.2[M+Na]+ ESR；g＝2.00789。
3)制备4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基-Pro-Ala-Lys
285mg(0.25mmol)4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl加入茄瓶中，冰浴下加入6ml TFA和1.5ml TFMSA，1hr后TLC(氯仿∶甲醇＝1∶1)显示原料点消失。停止反应，用无水乙醚反复洗涤至PH＝7，减压抽干，C18柱纯化，冻干，得144mg(65％)标题化合物。为蓝色固体。mp 152.6-163.8℃；[α]D 20＝-18.4°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)605.2[M+H]+；ESR g＝2.00789。
实施例184，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基-Arg-Pro-Ala-Lys(Ig)的制备
1)制备HCl·Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将2.372g(2.5mmol)Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl与15ml氯化氢-乙酸乙酯液(4N)的混合物室温搅拌3小时，TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。用水泵将反应液抽干，加入无水乙醚，再次用水泵将反应液抽干，重复5次。残留物用无水乙醚泡洗，塑料铲磨洗，将无水乙醚倾出，反复5次。得到的标题化合物直接用于下步反应。
2)制备4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基-Arg-Pro-Ala-Lys-OBzl
将1.073g(2.5mmol)4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酸溶于10ml无水THF，冰浴下往里加10ml 338mg(2.5mmol)HOBt和619mg(3mmol)DCC的无水THF溶液。反应混合物冰浴搅拌20分钟，得对应的活泼酯溶液，待用。
将1.322g(2.3mmol)HCl·Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl和232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉先与6ml无水THF混溶，然后与上面待用的活泼酯溶液混溶。得到的反应混合物室温反应24小时。TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示HCl·Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。滤液依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗。分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液37℃减压浓缩，得1.856g(85％)标题化合物。为蓝色固体。mp 93.1-94.3℃；[α]D 20＝40.5°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)1162.4[M+Na]+；ESR g＝2.00791。
3)制备4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基-Arg-Pro-Ala-Lys
285mg(0.25mmol)4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基-Arg-Pro-Ala-Lys-OBzl加入茄瓶中，冰浴下加入6ml TFA和1.5ml TFMSA，1hr后TLC(氯仿∶甲醇＝1∶1)显示原料点消失。停止反应，用无水乙醚反复洗涤至PH＝7，减压抽干，C18柱纯化，冻干，得144mg(65％)标题化合物。为蓝色固体。mp 147.1-148.3℃；[α]D 20＝-26.9°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)760.3[M+H]+；ESR g＝2.00785。
实施例194，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基-Ala-Arg-Pro-Ala-Lys(Ih)的制备
1)制备HCl·Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将2.550g(2.5mmol)Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl与15ml氯化氢-乙酸乙酯液(4N)的混合物室温搅拌3小时，TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。用水泵将反应液抽干，加入无水乙醚，再次用水泵将反应液抽干，重复5次。残留物用无水乙醚泡洗，塑料铲磨洗，将无水乙醚倾出，反复5次。得到的标题化合物直接用于下步反应。
2)制备4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将1.073g(2.5mmol)4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酸溶于10ml无水THF，冰浴下往里加10ml 338mg(2.5mmol)HOBt和619mg(3mmol)DCC的无水THF溶液。反应混合物冰浴搅拌20分钟，得对应的活泼酯溶液，待用。
将1.322g(2.3mmol)HCl·Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl和232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉先与6ml无水THF混溶，然后与上面待用的活泼酯溶液混溶。得到的反应混合物室温反应24小时。TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示HCl·Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。滤液依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗。分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液37℃减压浓缩，得1.856g(85％)标题化合物。为蓝色固体。mp 146.7-147.9℃；[α]D 20＝-44.9°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)1211.0[M+H]+；ESR g＝2.00789。
3)制备4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基-Ala-Arg-Pro-Ala-Lys
285mg(0.25mmol)4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl加入茄瓶中，冰浴下加入6ml TFA和1.5ml TFMSA，1hr后TLC(氯仿∶甲醇＝1∶1)显示原料点消失。停止反应，用无水乙醚反复洗涤至PH＝7，减压抽干，C18柱纯化，冻干，得144mg(65％)标题化合物。为蓝色固体。mp 162.1-163.5℃；[α]D 20＝-32.1°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)832.1[M+H]+；ESR g＝2.00788。
实施例204，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys(Ii)的制备
1)制备HCl·Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将2.515g(2.5mmol)Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl与15ml氯化氢-乙酸乙酯液(4N)的混合物室温搅拌3小时，TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。用水泵将反应液抽干，加入无水乙醚，再次用水泵将反应液抽干，重复5次。残留物用无水乙醚泡洗，塑料铲磨洗，将无水乙醚倾出，反复5次。得到的标题化合物直接用于下步反应。
2)制备4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将1.073g(2.5mmol)4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酸溶于10ml无水THF，冰浴下往里加10ml 338mg(2.5mmol)HOBt和619mg(3mmol)DCC的无水THF溶液。反应混合物冰浴搅拌20分钟，得对应的活泼酯溶液，待用。
将1.322g(2.3mmol)HCl·Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl和232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉先与6ml无水THF混溶，然后与上面待用的活泼酯溶液混溶。得到的反应混合物室温反应24小时。TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示HCl·Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。滤液依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗。分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液37℃减压浓缩，得1.856g(85％)标题化合物。为蓝色固体。mp 139.2-140.4℃；[α]D 20＝-35.1°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)1197.9[M+H]+；ESR g＝2.00786。
3)制备4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys
285mg(0.25mmol)4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl加入茄瓶中，冰浴下加入6ml TFA和1.5ml TFMSA，1hr后TLC(氯仿∶甲醇＝1∶1)显示原料点消失。停止反应，用无水乙醚反复洗涤至PH＝7，减压抽干，C18柱纯化，冻干，得144mg(65％)标题化合物。为蓝色固体。mp 152.3-153.6℃；[α]D 20＝-31.9°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)818.0[M+H]+；ESR g＝2.00786。
实施例214，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基-Gln-Arg-Pro-Ala-Lys(Ij)的制备
1)制备HCl·Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将2.693g(2.5mmol)Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl与15ml氯化氢-乙酸乙酯液(4N)的混合物室温搅拌3小时，TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。用水泵将反应液抽干，加入无水乙醚，再次用水泵将反应液抽干，重复5次。残留物用无水乙醚泡洗，塑料铲磨洗，将无水乙醚倾出，反复5次。得到的标题化合物直接用于下步反应。
2)制备4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
将1.073g(2.5mmol)4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酸溶于10ml无水THF，冰浴下往里加10ml 338mg(2.5mmol)HOBt和619mg(3mmol)DCC的无水THF溶液。反应混合物冰浴搅拌20分钟，得对应的活泼酯溶液，待用。
将1.322g(2.3mmol)HCl·Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl和232mg(2.3mmol)N-甲基吗啉先与6ml无水THF混溶，然后与上面待用的活泼酯溶液混溶。得到的反应混合物室温反应24小时。TLC(展开剂氯仿∶甲醇＝10∶1)显示HCl·Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。滤液依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗。分出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液37℃减压浓缩，得1.856g(85％)标题化合物。为蓝色固体。mp 96.7-97.9℃；[α]D 20＝-52.7°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)1268.2[M+H]+；ESR g＝2.00789。
3)制备4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基-Gln-Arg-Pro-Ala-Lys
285mg(0.25mmol)4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl加入茄瓶中，冰浴下加入6ml TFA和1.5ml TFMSA，1hr后TLC(氯仿∶甲醇＝1∶1)显示原料点消失。停止反应，用无水乙醚反复洗涤至PH＝7，减压抽干，C18柱纯化，冻干，得144mg(65％)标题化合物。为蓝色固体。mp 163.5-164.8℃；[α]D 20＝-35.8°(c＝0.01，甲醇)；ESI-MS(m/e)888.9[M+H]+；ESR g＝2.00785。
实验例1本发明化合物(Ia-j)的溶静脉血栓活性测定
大鼠溶血栓模型上的溶血栓活性
1)受试化合物：本发明实施例12-21所制备的化合物Ia-j；
2)大鼠手术与器械
SD大鼠(雄性，220～230g)按1200mg/kg剂量腹腔注射乌拉坦溶液进行麻醉。麻醉大鼠仰卧位固定，分离右颈总动脉，于近心端夹动脉夹，近心端和远心端分别穿入手术线，将远心端的手术线于皮毛用止血钳夹紧，在远心端插管，松开动脉夹，放出约1ml动脉血，装在1ml子弹头中。往垂直固定的玻璃管(长15mm，内径2.5mm，外径5.0mm，管底用胶塞密封)中注入0.1ml大鼠动脉血液，往管内迅速插入一支不锈钢质料的血栓固定螺栓。该血栓固定螺旋用直径为0.2mm的不锈钢丝绕成，螺旋部分长12mm，含15个螺圈，螺圈的直径为1.0mm，托柄与螺旋相连，长7.0mm，呈问号型。血液凝固15min后，打开玻璃管底部的胶塞，用镊子固定血栓固定螺旋的托柄，从玻璃管中小心地取出被血栓包裹的血栓固定螺旋。精确称重。
3)大鼠颈动静脉旁路插管
旁路插管由3段构成，中段为聚乙烯胶管，长60.0mm，内径3.5mm；两端为相同的聚乙烯管，管长100.0mm，内径1.0mm，外径2.0mm该管的一端拉成尖管(用于插入大鼠颈动脉或静脉)，外径为1.0mm，另一端的外部套一段长7.0mm，外径为3.5mm的聚乙烯管(加粗，用于插入中段的聚乙烯胶管内)3段管的内壁均硅烷化。将血栓包裹的血栓固定螺旋放入中段聚乙烯胶管内，胶管的两端分别与两根聚乙烯的加粗端相套。用注射器通过尖管端将管中注满肝素生理盐水溶液(50IU·kg-1)，备用。
继续分离麻醉大鼠的气管，并做气管插管。分离大鼠的左颈外静脉，近心端和远心端分别穿入手术线，在暴露的左颈外静脉上小心地剪一斜口，将上面制备好的旁路管道的尖管由斜口插入左颈外静脉开口的近心端，同时远离旁路管中段(含精确称重的血栓固定螺旋)内血栓固定螺旋的托柄。用注射器通过另一端的尖管推入准确量的肝素生理盐水(50IU·kg-1)，此时注射器不要撤离聚乙烯管，用止血钳夹住注射器与聚乙烯管之间的软管。在右颈总动脉的近心端用动脉夹止血，在离动脉夹不远处将右颈总动脉小心地剪一斜口。从聚乙烯管的尖部拔出注射器，将聚乙烯管的尖部插入动脉斜口的近心端。旁路管道的两端都用4号手术缝线与动静脉固定。
4)给药
用头皮针将生理盐水(3ml·kg-1)，尿激酶的生理盐水溶液(20000IU/kg)或本发明化合物的生理盐水溶液(10nmol/kg)通过旁路管的中段(含精确称重的血栓固定螺旋)，刺入远离血栓固定螺旋的近静脉处，打开动脉夹，使血流通过旁路管道从动脉流向静脉，此即大鼠动静脉旁路溶栓模型，缓慢将注射器中的液体注入到血液中，使生理盐水(空白对照)，尿激酶(阳性对照)或线性肽(治疗剂)通过血液循环，按静脉-心脏-动脉的顺序作用到血栓上。从开始注射时计时，1h后从旁路管道中取出血栓固定螺旋，精确称重。求每只大鼠旁路管道中血栓固定螺旋给药前后的质量差，统计各组的血栓质量差值(X±SD)，并做t检验。
5)实验结果
血栓质量差值列入表1。
表1本发明化合物(Ia-j)治疗引起的血栓减重实验结果
| 组别 | 血栓减重(X±SD mg) | 组别 | 血栓减重(X SDmg) |
| NS | 10.562±3.921 | UK | 20.303±3.711 |
| Ia | 15.013±2.901b | If | 16.696±1.914c |
| Ib | 16.845±2.961a | Ig | 14.916±3.417d |
| Ic | 16.644±3.986e | Ih | 14.297±2.264b |
| Id | 14.609±3.926g | Ii | 12.178±4.496h |
| Ie | 16.882±3.648b | Ij | 16.783±3.598f |
n＝10，NS空白对照，Dose＝3ml/kg；UK的剂量：20000IU/kg，化合物Ia-j的剂量：10nmol/kg；a)与NS比较P＜0.001，与UK和Id比较P＜0.01，与Ia比较P＜0.05；b)与NS比较P＜0.001，与UK、Id和Ia比较P＜0.05；c)与NS和UK比较P＜0.001，与Id比较P＜0.01，与Ia比较P＜0.05；d)与NS比较P＜0.01，与UK比较P＜0.001；e)与NS比较P＜0.01，与UK和Id比较P＜0.005；f)与NS比较P＜0.01，与UK和Ia及Id比较P＜0.005；g)与NS比较P＜0.05，与UK比较P＜0.001；h)与UK比较P＜0.001.
实验结果显示NS组血栓减重10.56mg，UK组血栓减重稳定在20.30mg，10种目标化合物血栓减重12.178至16.88mg，所有目标化合物在浓度为10nmol/kg时与NS比P＜0.05。其中Ib，Ie和If活性最好，Id和Ii活性最差，其余的目标化合物活性居中。
实验例2本发明化合物(Ia-j)的溶脑血栓活性测定实验
1)受试化合物：本发明实施例12-21所制备的化合物Ia-j；
2)实验方法：SD雄性大鼠(220～230g)用10％水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉，从颈部正中略偏右侧竖直开约2cm长切口，沿胸锁乳突肌内侧缘分离出右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)。用无创动脉夹分别夹闭颈内动脉开口处和颈总动脉近心端，在颈外动脉剪一小口，结扎颈外动脉远心端，松开颈总动脉处的动脉夹，取10微升血。取血之后再用无创动脉夹夹闭颈总动脉近心端。将取得的10微升血装入1ml EP管中并置-20度冰箱放1小时使血凝固，取出EP管加0.5毫升NS用钢铲捣成均匀细小血栓。松开颈内动脉夹的同时用1ml注射器将血栓混合液缓慢从大鼠颈外动脉向近心端注入颈内动脉，结扎颈外动脉近心端，松开颈内动脉和颈总动脉，恢复血流。
将手术大鼠随机分为假手术组、阳性对照组、生理盐水组和本发明的化合物组。分离静脉，假手术组直接结扎，伤口处滴加3滴青霉素注射液，缝合。阳性对照组注入UK或tPA，，生理盐水组注入生理盐水，本发明的化合物组注入本发明的化合物，结扎静脉，伤口处滴加3滴青霉素注射液，缝合。大鼠苏醒后3h，24h按ZeaLonga方法评定神经功能缺损程度。0分表示无任何神经功能缺失体征、1分表示未损伤侧前肢不能伸展、2分表示向未损伤侧行走、3分表示向未损伤侧转圈成追尾状行走、4分表示意识障碍无自主行走、5分表示死亡。将以上各组评分结果进行统计学比较。大鼠苏醒后24h每组取6只大鼠用乌拉坦麻醉后迅速断头取脑，将脑组织置于-20度冰箱20min后，从前额极开始行约2mm冠状切片并置2％TTC溶液中37℃避光孵育30min，然后用眼科镊取出冠状切片照相，经SPSS统计软件处理，计算冠状切片中梗死组织(白色)和正常组织(红色)的面积。统计各组的梗塞体积百分比值(X±SD)，并做t检验。
3)实验结果
Ia-j的化合物的溶脑血栓活性用脑血栓梗塞体积百分比表示并列入表2。
表2Ia-j的化合物的溶脑血栓活性
| 组别 | 梗塞体积(X±SD％) | 组别 | 梗塞体积(X±SD％) |
| NS | 19.6284±3.4843 | UK) | 12.0842±5.1215c |
| Ia | 14.5363±4.5160b | If | 7.1444±3.4504a |
| Ib | 7.4571±3.5798a | Ig | 10.8154±3.6916c |
| Ic | 12.3878±5.3854b | Ih | 11.0495±5.2931b |
| Id | 15.7867±4.9794 | Ii | 15.5881±5.0733 |
| Ie | 7.6118±5.2317a | Ij | 12.3820±4.1952b |
| PAK | 14.8390±5.6844 |
n＝10，NS空白对照3ml/kg；UK剂量：20000IU/kg，化合物Ia-j的剂量：10nmol/kg；a)与NS比较P＜0.001，与UK比较P＜0.01；b)与NS比较P＜0.01；c)与NS比较P＜0.05.
实验结果显示NS组梗塞体积百分比为19.6，UK组梗塞体积百分比为12.08。其中Ib，Ie和If活性最好，Id和Ii活性最差，其余的目标化合物活性居中。
Claims (6)
1、具有溶栓活性的化合物，其结构式为式I或式II所示：
其中，R1选自Pro、Arg-Pro、Ala-Arg-Pro、Gly-Arg-Pro或Gln-Arg-Pro；R2为4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基；
其中，R1为4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基；R2选自Pro、Arg-Pro、Ala-Arg-Pro、Gly-Arg-Pro或Gln-Arg-Pro。
2、一种制备权利要求1所述化合物的方法，包括：将Ala-Arg-Pro-Ala-Lys、Pro-Ala-Lys、Arg-Pro-Ala-Lys、Gly-Arg-Pro-Ala-Lys或Gln-Arg-Pro-Ala-Lys分别与4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酰基偶联，即得。
3、一种制备权利要求1所述式I化合物的方法，包括：
(1)、制备C-端和侧链保护的Pro-Ala-Lys、Arg-Pro-Ala-Lys、Ala-Arg-Pro-Ala-Lys、Gly-Arg-Pro-Ala-Lys或Gln-Arg-Pro-Ala-Lys；
(2)、制备4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酸；
(3)、将C-端和侧链保护的Pro-Ala-Lys、Arg-Pro-Ala-Lys、Ala-Arg-Pro-Ala-Lys、Gly-Arg-Pro-Ala-Lys或Gln-Arg-Pro-Ala-Lys的N端分别与4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酸偶联、脱去所有保护基，即得。
4、一种制备权利要求1所述式II化合物的方法，包括：
(1)、制备N-端、C-端和除Lys外侧链保护的Pro-Ala-Lys、Arg-Pro-Ala-Lys、Ala-Arg-Pro-Ala-Lys、Gly-Arg-Pro-Ala-Lys或Gln-Arg-Pro-Ala-Lys；
(2)、制备4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酸；
(3)、分别将N-端、C-端和除Lys外侧链保护的Pro-Ala-Lys、Arg-Pro-Ala-Lys、Ala-Arg-Pro-Ala-Lys、Gly-Arg-Pro-Ala-Lys或Gln-Arg-Pro-Ala-Lys的Lys的侧链氨基与4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉-2-基苯-4’-基氧乙酸偶联、脱去所有保护基，即得。
5、一种治疗脑血栓的药物组合物，由治疗上有效量的权利要求1所述的化合物和药学上可接受的载体或辅料组成。
6、权利要求1所述的化合物在制备治疗脑血栓药物中的用途。
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