CN106432416B - 五甲氧色胺基羰丙酰-rgdv,其制备,活性和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了下式的五甲氧色胺基羰丙酰‑Lys‑Arg‑Gly‑Asp‑Val，公开了它的制备方法，公开了它的抗血栓活性，公开了它治疗中风大鼠的作用，因而本发明公开了它在制备抗血栓药物以及治疗缺血性中风药物中的应用。

Description

五甲氧色胺基羰丙酰-RGDV,其制备,活性和应用

技术领域

本发明涉及五甲氧色胺基羰丙酰-Lys-Arg-Gly-Asp-Val，涉及它的制备方法，涉及它的抗血栓活性以及涉及它治疗缺血性中风的作用，因而本发明涉及它在制备抗血栓药物以及缺血性中风药物中的应用。本发明属于生物医药领域。

背景技术

缺血性中风是一类较常见且危害严重的脑血管疾病，特点是发病率高、病死率高、致残率高和复发率高。目前临床治疗缺血性中风面临没有有效药物的现实，尤其中风面4h以上的患者非死即残。发明对中风面4h以上的患者有效的药物是临床的重要需求。发明人曾经公开式I的咪唑啉化合物在中风面24h的大鼠缺血性中风模型上，显示优秀疗效。即连续静脉注射6天式II的咪唑啉化合物，每天1次，首次剂量为5μmol/kg，后5次的剂量为2μmol/kg具有优秀疗效。式中aa₁和aa₂可为同时存在，aa₁存在但aa₂不存在，或同时不存在；当aa₁和aa₂同时存在时，aa₁为R(Arg)，且aa₂为G(Gly)，A(Ala)或Q(Gln)；当aa₁存在但aa₂不存在时，aa₁为R(Arg)；aa₃可为S(Ser)，V(Val)或F(Phe)。由于式II的咪唑啉化合物的2-位是4-氧乙酰-Lys。而该Lys的侧链氨基和主链羧基分别与RGD抗血栓四肽及ARPAK溶栓肽相连接，所以结构比较复杂需要简化。

发明人经过3年实验研究，发现用五甲氧色胺基羰丙酰基代替式I的2-(4-氧乙酰基)苯基-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧咪唑啉咪唑啉基取代可以获得结构简单和疗效好的意想不到的技术效果。按照这个发现，发明人提出了本发明。

发明内容

本发明的内容之一是提供下式的五甲氧色胺基羰内酰-Lys-Arg-Gly-Asp-Val

本发明的内容之二是提供五甲氧色胺基羰丙酰-Lys-Arg-Gly-Asp-Val的制备方法，该方法包括以下步骤：

1)制备五甲氧色胺基羰丙酸；

2)制备Boc-N^G-NO₂-Arg-Gly-OBzl；

3)制备Boc-N^G-NO₂-Arg-Gly；

4)制备Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

5)制备HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl；

6)制备Boc-N^G-NO₂-Arg-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

7)制备HCl·N^G-NO₂-Arg-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

8)制备Fmoc-Lys(Boc)-N^G-NO₂-Arg-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

9)制备HCl·Lys(Boc)-N^G-NO₂-Arg-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

10)将五甲氧色胺基羰丙酸与HCl·Lys(Boc)-N^G-NO₂-Arg-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl反应得五甲氧色胺基羰丙酰-N^ω-Boc-Lys-N^G-NO₂-Arg-Gly-β-羧酸-OBzl-Asp-Val-OBzl；

11)将五甲氧色胺基羰丙酰-N^ω-Boc-Lys-N^G-NO₂-Arg-Gly-β-羧酸-OBzl-Asp-Val-OBzl脱保护得到五甲氧色胺基羰丙酰-Lys-Arg-Gly-Asp-Val。

本发明的内容之三是评价五甲氧色胺基羰丙酰-Lys-Arg-Gly-Asp-Val的抗血栓活性以及治疗缺血性中风的作用。

附图说明

图1五甲氧色胺基羰丙酰-Lys-Arg-Gly-Asp-Val的合成路线.(a)DCC，HOBt，NMM，THF；(b)2N NaOH，THF；(c)4N氯化氢-乙酸乙酯溶液；(d)哌啶/DMF；(e)丁二酸酐；(f)TFA/TFMSA。

具体实施方式

为了进，一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1接肽通法

将1mmol羧基端化合物溶于干燥THF，冰浴搅拌下依次加入1.2mmol N-羟基苯骈三氮唑(HOBt)和干燥THF溶解的1.2mmol N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)，搅拌0.5h，将1.05mmol氨基端化合物溶于干燥THF，加入上述反应液中，N-甲基吗啉(NMM)调至pH9，室温搅拌6h，TLC(CHCl₃/CH₃OH，10/1)显示羧基端原料完全消失，反应结束。过滤除去DCU，滤液减压浓缩后用乙酸乙酯溶解，得到的溶液依次用饱和NaHCO₃水溶液洗3次，饱和NaCl水溶液洗3次，5％KHSO₄水溶液洗3次，饱和NaCl水溶液洗3次，5％NaHCO₃水溶液洗3次和饱和NaCl水溶液洗3次。合并的乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，柱层(CHCl₃/CH₃OH，10/1)析纯化后得到目标化合物。

实施例2脱除N-叔丁氧羰基保护基通法

将1mmol含有N-叔丁氧羰基保护基的化合物用少量干燥乙酸乙酯溶解，冰浴搅拌下加入10mL 4N氯化氢/乙酸乙酯溶液，冰浴搅拌1-2h，TLC(CHCl₃/CH₃OH，10/1)显示原料完全消失，反应结束。反应液减压浓缩。残留物加5ml无水乙酸乙酯，溶液减压浓缩至干。该操作重复3次。残留物加5ml无水乙醚，，溶液减压浓缩至干。该操作重复3次。得到的目标化合物直接用于下步反应。

实施例3水解脱除苄酯保护基通法

将含有苄酯保护基的化合物溶于甲醇，冰浴和搅拌下缓慢滴加2M NaOH水溶液，调至pH12，反应5h，TLC(CHCl₃/CH₃OH，10/1)显示原料完全消失，反应结束。冰浴搅拌下缓慢滴加饱和KHSO₄水溶液调至pH7，减压浓缩除去甲醇，剩余的水溶液在冰浴搅拌下缓慢滴加饱和KHSO₄水溶液调至pH3，乙酸乙酯萃取3次，合并的乙酸乙酯层用饱和NaCl水溶液洗3次，用无水Na₂SO₄干燥，过滤，滤液减压浓缩，得到目标化合物。

实施例4氢解脱除苄酯保护基通法

将含有苄酯保护基的化合物溶于甲醇，加入Pd/C(反应物量的20％)，减压抽出反应体系内的空气，通入氢气，室温搅拌10h，TLC(CHCl₃/CH₃OH，10/1)显示原料完全消失，反应结束。过滤除去Pd/C，滤液减压浓缩，得到目标化合物。

实施例5制备五甲氧色胺基羰丙酸

由1.9g(10.0mmol)五甲氧色胺溶于干燥THF，冰浴搅拌下加入1.20g(12.0mmol)丁二酸酐，用NMM调至pH9，室温搅拌6h，TLC(CHCl₃/CH₃OH，10/1)显示羧基端原料完全消失，反应结束。滤液减压浓缩后用乙酸乙酯溶解，得到的溶液依次用5％KHSO₄水溶液洗3次，饱和NaCl水溶液洗3次。合并的乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥，过滤，滤液减压浓缩至干后得到2.81g(96.9％)标题化合物，为淡黄色固体。ESI-MS(m/e)：289[M-H]-。

实施例6制备Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl

按照实施例1接肽通法由4.98g(15.5mmol)Boc-Arg(NO₂)和6.49g(15.0mmol)HCl·Gly-OBzl得6g(87％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：467[M+H]⁺。

实施例7制备Boc-Arg(NO₂)-Gly

按照实施例3水解脱除苄酯保护基通法从1g(2.14mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl得0.797g(99％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：376[M-H]^-。

实施例8制备Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl

按照实施例1接肽通法由4.5g(13.85mmol)Boc-Asp(OBzl)和5.0g(13.2mmol)HCl·Val-OBzl得6g(91％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：512[M+H]⁺。

实施例9制备HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl

按照实施例2脱除N-叔丁氧羰基保护基通法从1g(1.95mmol)Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl得到的目标化合物直接用于下步反应。ESI-MS(m/e)：412[M+H]⁺。

实施例10制备Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl

按照实施例1接肽通法由5.03g(15.5mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly和6g(13.37mmol)HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl得7.02g(68.％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：771[M+H]⁺。

实施例11制备HCl·Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl

按照实施例2脱除N-叔丁氧羰基保护基通法从1g(1.30mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl得到的目标化合物直接用于下步反应。ESI-MS(m/e)：671[M+H]⁺。

实施例12制备Fmoc-Lys(Boc)-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl

按照实施例1接肽通法由7.82g(16.68mmol)Fmoc-Lys(Boc)和11.796g(16.68mmol)HCl·Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl得12.7g(68％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：1121[M+H]⁺。

实施例13制备Lys(Boc)-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl

冰浴下将0.5g(0.45mmol)Fmoc-Lys(Boc)-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl溶于1mL 20％哌啶/DMF(N，N-二甲基甲酰胺)，反应30分钟，TLC(CHCl₃/CH₃OH，5/1)显示原料点消失。加入乙醚使固体析出，过滤得标题化合物，为无色固体，直接用于下一步反应。

实施例14制备五甲氧色胺基羰丙酰-Lys(Boc)-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl

按照实施例1接肽通法由207mg(0.069mmol)五甲氧色胺基羰丙酸和100mg(0.11mmol)Lys(Boc)-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl得300mg(34％)标题化合物。ESI-MS(m/e)：1171[M+H]⁺。

实施例15制备五甲氧色胺基羰丙酰-Lys-Arg-Gly-Asp-Val(1)

冰浴下将1g(0.85mmol)五甲氧色胺基羰丙酰-Lys(Boc)-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl与1mL三氟乙酸和0.33mL三氟甲磺酸混合，搅拌40min，倒入50mL无水乙醚，使析出沉淀。固体用无水乙醚反复洗涤并减压浓缩，得到的淡黄色粉末用水溶解，用氨水调pH8，经Sephadex G10除盐，用C18柱纯化(洗脱剂＝甲醇∶水＝5∶95)，收集的馏分冻干，得430mg(60％)标题化合物，为无色固体。Mp140.1-142.2℃；

ESI-MS(m/e)：845[M+H]⁺；¹H-NMR(300MHz，D₂O)：δ/ppm＝7.250(d，J＝8.7Hz，1H)，7.042(s，2H)，6.746(dd，J1＝2.1Hz，J2＝1.8Hz 1H)，4.598(m，2H)，4.057(m，2H)，3.740(m，4H)，3.302(m，2H)，3.000-2.500(m，7H)，2.340(m，3H)，2.000(m，1H)，1.800-1.100(m，10H)，0.9402(m，6H)。

试验例1评价化合物1的抗栓活性试验

将雄性SD大鼠(200±20g)，随机分组，每组10只，饲养1天，停止喂食过夜。灌胃给予化合物1的生理盐水溶液(剂量为100nmol/kg)或阿司匹林的生理盐水溶液(剂量为167μmol/kg)或生理盐水(剂量为10ml/kg)30min之后，大鼠用20％乌来糖的生理盐水溶液麻醉，之后手术。分离大鼠的右颈动脉和左颈静脉，将准确称重的丝线置于旁路插管，管的一端插入左静脉，另一端管插入右侧动脉并注射0.2mL肝素钠抗凝。使得血流从右侧动脉流经旁路插管进入左侧静脉，15min之后取出附有血栓的丝线称量，计算血液循环前后丝线的重量，得到的血栓重以均值±SD mg表示并代表抗血栓活性，作t检验。数据列入表1。结果表明口服100nmol/kg化合物1能有效地抑制血栓形成。说明结构简化之后，技术效果明显。

表1 化合物1的抗栓活性

n＝10；a)与生理盐水比p＜0.01。

实验例2评价化合物1对缺血性中风大鼠的治疗作用

在雄性SD大鼠(体重300±20g)的颈部正中部竖直开约2cm长切口，沿胸锁乳突肌内侧缘分离出右颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉。用无创动脉夹分别夹闭颈内动脉开口处和颈总动脉近心端，结扎颈外动脉的远心端，在颈外动脉剪一小口，松开颈总动脉近心端的动脉夹，取10μl血，之后再用无创动脉夹夹闭颈总动脉的近心端。将取得的10μl血放置在1ml EP管中常温放置30分钟使血液凝固，然后转移至-20℃冰箱中放置1小时，使血液凝块结实。大鼠用10％水合氯醛腹腔注射麻醉，剂量为400mg/kg。取出血液凝块，加入1ml生理盐水，用钢铲把血液凝块捣成大小均一的细小血栓块，制备细小血栓的悬液并转移至1ml注射器内。松开颈总动脉近心端的动脉夹，将1ml血栓混悬液缓慢从大鼠颈外动脉向近心端经过颈内动脉注入大鼠的大脑，然后结扎颈外动脉近心端，打开颈内动脉和颈总动脉处得动脉夹，恢复血流。等待苏醒。大鼠苏醒24小时后按Zealonga方法评定神经功能缺损程度。0分表示无任何神经功能缺失体征、1分表示未损伤侧前肢不能伸展、2分表示向未损伤侧行走、3分表示向未损伤侧转圈成追尾状行走、4分表示意识障碍无自主行走、5分表示死亡。按照得分平均分组。各组大鼠经尾静脉每天注射1次化合物1，剂量为100nmol/kg。连续注射6天，每天评分。结果列入表2。数据表明化合物1连续治疗6天可使13只脑缺血24小时的大鼠神经生物学评分全部为1分。因为不像已经公开的化合物首次剂量需要5μmol/kg，后5次维持剂量需要2μmol/kg，化合物1的6次剂量均为100nmol/kg。这样一来，首次剂量和维持剂量分别降低了50倍和20倍。加上结构简化的好处，本发明获得了意想不到的技术效果。

表2 化合物1连续治疗6天对脑缺血24小时大鼠神经生物学评分的影响

n＝13。

Claims (4)

1.下式的五甲氧色胺基羰丙酰-Lys-Arg-Gly-Asp-Val

2.权利要求1的五甲氧色胺基羰丙酰-Lys-Arg-Gly-Asp-Val的制备方法,该方法包括以下步骤：

1)制备五甲氧色胺基羰丙酸；

2)制备Boc-N^G-NO₂-Arg-Gly-OBzl；

3)制备Boc-N^G-NO₂-Arg-Gly；

4)制备Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

5)制备HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl；

6)制备Boc-N^G-NO₂-Arg-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

7)制备HCl·N^G-NO₂-Arg-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

8)制备Fmoc-Lys(Boc)-N^G-NO₂-Arg-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

9)制备HCl·Lys(Boc)-N^G-NO₂-Arg-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

10)将五甲氧色胺基羰丙酸与HCl·Lys(Boc)-N^G-NO₂-Arg-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl反应得五甲氧色胺基羰丙酰-N^ω-Boc-Lys-N^G-NO₂-Arg-Gly-β-羧酸-OBzl-Asp-Val-OBzl；

11)将五甲氧色胺基羰丙酰-N^ω-Boc-Lys-N^G-NO₂-Arg-Gly-β-羧酸-OBzl-Asp-Val-OBzl脱保护得到五甲氧色胺基羰丙酰-Lys-Arg-Gly-Asp-Val。

3.权利要求1的五甲氧色胺基羰丙酰-Lys-Arg-Gly-Asp-Val在制备抗血栓药物中的应用。

4.权利要求1的五甲氧色胺基羰丙酰-Lys-Arg-Gly-Asp-Val在制备治疗缺血性中风药物中的应用。

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