CN106589057B - N-(pak)-2,3-二氧-异喹啉-7-甲酰-rgdv/f,其合成,活性及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开下式的(7S)‑N‑[(Pro‑Ala‑Lys)‑5,6,7,8‑四氢‑2,3‑二氧异喹啉‑7‑甲酰]‑Arg‑Gly‑Asp‑AA,公开了它的制备方法，公开了它的抗血栓活性，公开了它治疗脑缺血大鼠的作用，因而本发明公开了它在制备抗血栓药物和治疗缺血性中风药物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及式的(7S)-N-[(Pro-Ala-Lys)-5,6,7,8-四氢-2,3-二氧异喹啉-7-甲酰]-Arg-Gly-Asp-AA(当AA＝Val时Arg-Gly-Asp-AA为Arg-Gly-Asp-Val；当AA＝Phe时Arg-Gly-Asp-AA为Arg-Gly-Asp-Phe)，涉及它们的制备方法，涉及它们的抗血栓活性，涉及它们治疗脑缺血大鼠的作用，因而本发明涉及它们在制备抗血栓药物和治疗缺血性中风药物中的应用。本发明属于生物医药领域。
背景技术
缺血性中风是一类较常见且危害严重的脑血管疾病，特点是发病率高、病死率高、致残率高和复发率高。目前临床治疗缺血性中风面临没有有效药物的现实，尤其中风面4h以上的患者非死即残。发明对中风面4h以上的患者有效的药物是临床的重要需求。发明人曾经公开式II的咪唑啉化合物在中风面24h的大鼠缺血性中风模型上，显示优秀疗效。即连续静脉注射6天式II的咪唑啉化合物，每天1次，首次剂量为5μmol/kg，后5次的剂量为2μmol/kg具有优秀疗效。式中aa1和aa2可为同时存在,aa1存在但aa2不存在,或同时不存在；当aa1和aa2同时存在时,aa1为Arg,且aa2为Gly,Ala或Gln；当aa1存在但aa2不存在时,aa1为Arg；aa3可为Ser,Val或Phe。由于式II的咪唑啉化合物的2-位是4-氧乙酰-Lys，而该Lys的侧链氨基和主链羧基分别与RGD抗血栓四肽及ARPAK溶栓肽相连接,所以结构比较复杂需要简化。
发明人经过3年实验研究，发现用(7S)-5,6,7,8-四氢-2,3-二氧异喹啉-7-甲酰基代替上式中的1-取代苯基咪唑啉基可以获得结构简单和疗效好的双重意想不到的技术效果。按照这个发现，发明人提出了本发明。
发明内容
本发明的内容之一是提供下式的(7S)-N-[(Pro-Ala-Lys)-5,6,7,8-四氢-2,3-二氧异喹啉-7-甲酰]-Arg-Gly-Asp-AA(当AA＝Val时Arg-Gly-Asp-AA为Arg-Gly-Asp-Val；当AA＝Phe时Arg-Gly-Asp-AA为Arg-Gly-Asp-Phe)
本发明的内容之二是提供(7S)-N-[(Pro-Ala-Lys)-5,6,7,8-四氢-2,3-二氧异喹啉-7-甲酰]-Arg-Gly-Asp-Phe的制备方法,该方法包括以下步骤:
(1)制备(7S)-5,6,7,8-四氢-2,3-二羟基异喹啉-7-羧酸；
(2)制备(7S)-N-叔丁氧羰基-5,6,7,8-四氢-2,3-二羟基异喹啉-7-羧酸苄酯；
(3)制备(7S)-5,6,7,8-四氢-2,3-二氧异喹啉-7-羧酸苄酯；
(4)制备Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl；
(5)制备Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl；
(6)制备(7S)-N-[(Boc-Pro-Ala-Lys)-5,6,7,8-四氢-1,3-二氧异喹啉-7-甲酰]-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl；
(7)制备(7S)-N-[(Pro-Ala-Lys)-5,6,7,8-四氢-2,3-二氧异喹啉-7-甲酰]-Arg-Gly-Asp-Phe。
本发明的内容之三是提供(7S)-N-[(Pro-Ala-Lys)-5,6,7,8-四氢-2,3-二氧异喹啉-7-甲酰]-Arg-Gly-Asp-Val的制备方法,该方法包括以下步骤:
(1)制备(7S)-5,6,7,8-四氢-2,3-二羟基异喹啉-7-羧酸；
(2)制备(7S)-N-叔丁氧羰基-5,6,7,8-四氢-2,3-二羟基异喹啉-7-羧酸苄酯；
(3)制备(7S)-5,6,7,8-四氢-2,3-二氧异喹啉-7-羧酸苄酯；
(4)制备Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；
(5)制备Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；
(6)制备(7S)-N-[(Boc-Pro-Ala-Lys)-5,6,7,8-四氢-2,3-二氧异喹啉-7-甲酰]-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；
(7)制备(7S)-N-[(Pro-Ala-Lys)-5,6,7,8-四氢-2,3-二氧异喹啉-7-甲酰]-Arg-Gly-Asp-Val。
本发明的内容之四是评价(7S)-N-[(Pro-Ala-Lys)-5,6,7,8-四氢-2,3-二氧异喹啉-7-甲酰]-Arg-Gly-Asp-AA(当AA＝Val时Arg-Gly-Asp-AA为Arg-Gly-Asp-Val；当AA＝Phe时Arg-Gly-Asp-AA为Arg-Gly-Asp-Phe)的抗血栓活性。
本发明的内容之五是评价(7S)-N-[(Pro-Ala-Lys)-5,6,7,8-四氢-2,3-二氧异喹啉-7-甲酰]-Arg-Gly-Asp-AA(当AA＝Val时Arg-Gly-Asp-AA为Arg-Gly-Asp-Val；当AA＝Phe时Arg-Gly-Asp-AA为Arg-Gly-Asp-Phe)治疗缺血性中风24h的活性。
附图说明
图1(S)-N-[(Pro-Ala-Lys)-5,6,7,8-四氢-2,3-二氧异喹啉-7-甲酰]-Arg-Gly-Asp-AA(当AA＝Val时Arg-Gly-Asp-AA为Arg-Gly-Asp-Val；当AA＝Phe时Arg-Gly-Asp-AA为Arg-Gly-Asp-Phe)的合成路线.(i)甲醛,稀盐酸；(ii)对甲苯磺酸,苯甲醇,正己烷；(iii)NMM,Boc2O；(iv)二碘甲烷,无水碳酸钾,丙酮；(v)4N氯化氢-乙酸乙酯溶液；(vi)N-羟基丁二酰亚胺,HOBt,THF,NMM；(vii)Pd/C,methanol；(viii)4N氢氧化钠甲醇溶液；(ix)TFA,TFMSA。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明,下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的,它们仅用来对本发明进行具体描述,不应当理解为对本发明的限制。
实施例1 制备(7S)-5,6,7,8-四氢-2,3-二羟基异喹啉-7-羧酸
向988mg(0.005mmol)(S)-3,4-二羟基-Phe依次加入5.9mL H2O,0.7mL 32％盐酸,搅拌均匀,待完全溶解后加入1.2mL 40％甲醛溶液,室温反应6小时。TLC(二氯甲烷:甲醇,10:1)显示(S)-3,4-二羟基-Phe消失,冰浴下滴加饱和碳酸氢钠使pH为5并析出大量无色沉淀。过滤得1.01g(95％)。Mp 281-286℃,ESI-MS(m/z):210[M+H]+。
实施例2 制备(7S)-5,6,7,8-四氢-2,3-二羟基异喹啉-7-羧酸苄酯
将1g(4.08mmol)(7S)-5,6,7,8-四氢-2,3-二羟基异喹啉-7-羧酸,1.02g对甲苯磺酸,8mL苯甲醇和8mL正己烷的混合物在90～95℃加热搅拌36h，使变澄清。待反应混合液冷却至室温，再加入大量乙醚，使析出大量无色固体，过滤，得到的固体用乙醚磨洗，干燥，得1.08g(77％)标题化合物,为无色粉末。ESI-MS(m/z):300[M+H]+。
实施例3 制备(7S)-N-叔丁氧羰基-5,6,7,8-四氢-2,3-二羟基异喹啉-7-羧酸苄酯
冰浴下1g(3.32mmol)(7S)-5,6,7,8-四氢-2,3-二羟基异喹啉-7-羧酸苄酯用50mlTHF溶解,再加入0.93g Boc2O,用NMM调节pH8，室温反应48h，TLC监测反应完成。反应化合物减压浓缩至干，黄色油状物经柱层析(石油醚/丙酮:6/1-1/1)纯化得243mg(35％)标题化合物，为黄色粉末。ESI-MS(m/z)：400[M+H]+。
实施例4 制备(7S)-N-叔丁氧羰基-5,6,7,8-四氢-2,3二氧异喹啉-7-羧酸苄酯
冰浴下将1g(2.5mmol)(7S)-N-叔丁氧羰基-5,6,7,8-四氢-2,3-二羟基异喹啉-7-羧酸苄酯用30mL丙酮溶解，加入4g无水碳酸钾之后，再加入200μL二碘甲烷，60℃加热回流10h,冷却,过滤,滤液减压浓缩至干,得到的绿色油状物经柱层析(石油醚/丙酮体:6/1-1/2)纯化得143mg(13％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/z):412[M+H]+。
实施例5 制备(7S)-5,6,7,8-四氢-2,3-二氧-异喹啉-7-羧酸苄酯
向412mg(1mmol)(7S)-N-叔丁氧羰基-5,6,7,8-四氢-2,3二氧异喹啉-7-羧酸苄酯中加10mL 4M氯化氢-乙酸乙酯溶液，室温搅拌3小时，TLC(CHCl2:MeOH＝30:1)显示原料点消失。反应液减压浓缩至干，残留物加少量干燥乙酸乙酯溶解，得到的溶液减压浓缩至干。该操作重复3次。残留物再加少量无水乙醚，减压浓缩至干。该操作重复上述3次，得278mg(89％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/z)：312[M+H]+。
实施例6 制备Boc-Pro-Ala
将1.075g(5.0mmol)Boc-Pro溶于20mL无水四氢呋喃(THF)，冰浴下向溶液中加入0.637g(5mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)，并使完全溶解。冰浴下，把已溶于少量无水THF的二环己基羰二亚胺(DCC)1.236g(6.0mmol)加入反应液中。室温搅拌7小时，TLC(CHCl2：MeOH＝10:1)监测反应。滤除二环己基脲(DCU)，滤液减压浓缩除去THF。浓缩物用乙酸乙酯(EA)溶解，依次用饱和NaHCO3水溶液洗3次、饱和NaCl水溶液洗3次，然后将EA层减压浓缩至干，加入适量THF溶解。再加入已溶于少量水的Ala 0.489g(5.5mmol)，用NaHCO3固体调pH到8-9，常温反应12小时，减压浓缩除去THF，加入5mL水溶解，用饱和KHSO4水溶液调pH到2，用EA少量多次萃取，合并EA层，用饱和NaCl水溶液洗至中性，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液减压浓缩至干，得1.41g(98％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e):285[M-H]-。
实施例7 制备Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)-OBzl
将314mg(1.1mmol)Boc-Pro-Ala溶于15mL无水THF，冰浴下往里加149mg(1.1mmol)N-羟基苯并三唑(HOBt)和268mg(1.3mmol)DCC的无水THF溶液。反应混合物冰浴搅拌20分钟，得对应的活泼酯溶液。将372mg(1.0mmol)HCl·Lys(Boc)-OBzl用无水THF溶解，然后与刚刚得到的活泼酯溶液混溶，滴加少量N-甲基吗啉(NMM)调节pH 9，得到的反应混合物室温反应24小时。过滤除去二环己基脲(DCU)，滤液减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，然后再滤除DCU，滤液依次用饱和NaHCO3溶液洗3次，饱和NaCl溶液洗3次，饱和KHSO4溶液洗3次、饱和NaCl溶液洗3次、饱和NaHCO3溶液洗3次、饱和NaCl溶液洗3次，所得乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥，过滤、减压浓缩得黄色油状物，经柱层析(石油醚/丙酮体系6:1-1:1)得412mg(65％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/z)：605[M+H]+。
实施例8 制备Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)
向604mg(1.0mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)-OBzl加入20mL甲醇和30mg的Pd/C。往得到的悬浮液中通氢气，室温搅拌24小时，TLC(CH2Cl2:MeOH＝15:1)监控反应原料点消失，反应完成。滤除Pd/C，滤液减压浓缩除去溶剂，得496mg(97％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/z)：513[M-H]-。
实施例9 制备(7S)-N-(Boc-Pro-Ala-Lys)-5,6,7,8-四氢-2,3二氧异喹啉-7-羧酸苄酯
将564mg(1.1mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)溶于15mL无水四氢呋喃(THF)，冰浴下往里加149mg(1.1mmol)HOBt和468mg(1.3mmol)N-羟基丁二酰亚胺的无水THF溶液。反应混合物冰浴搅拌20分钟，得对应的活泼酯溶液。将312mg(1.0mmol)(7S)-5,6,7,8-四氢-2,3二氧异喹啉-7-羧酸苄酯用无水THF溶解，然后与刚刚得到的活泼酯溶液混溶，滴加适量NMM调节pH 8，室温反应24小时。过滤，滤液减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤液依次用饱和KHSO4溶液洗3次,饱和NaCl溶液洗3次,所得乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥,过滤,滤液减压浓缩，得到的黄色油状物经柱层析纯化得190mg(24％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/z)：809[M+H]+。
实施例10 制备(7S)-N-(Boc-Pro-Ala-Lys)-5,6,7,8-四氢-2,3二氧异喹啉-7-羧酸
向808mg(1.0mmol)(7S)-N-(Boc-Pro-Ala-Lys)-5,6,7,8-四氢-2,3二氧异喹啉-7-羧酸苄酯中加入20mL甲醇和30mgPd/C。往得到的悬浮液中通氢气，室温搅拌24小时，TLC(CH2Cl2:MeOH,30:1)监控反应完成。滤除Pd/C,滤液减压浓缩得680mg(94％)标题化合物,为无色粉末。ESI-MS(m/z):717[M-H]-。
实施例11 制备Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl
将350mg(1.1mmol)Boc-Arg(NO2)溶于15mL无水THF，冰浴下往里加149mg(1.1mmol)HOBt和268mg(1.3mmol)二环己基羰二亚胺(DCC)的无水THF溶液,反应混合物冰浴搅拌20分钟。将337mg(1.0mmol)HCl·Gly-OBzl用无水THF溶解，然后与刚刚得到的活泼酯溶液混溶，滴加NMM调节pH 8,得到的反应混合物室温反应24小时。过滤,滤液减压浓缩至干,残留物用乙酸乙酯溶解。乙酸乙酯溶液依次用饱和KHSO4溶液洗3次,饱和NaCl溶液洗3次,无水Na2SO4干燥,过滤,滤液减压浓缩。得到的黄色油状物经柱层析纯化，得312mg(67％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/z)：466[M+H]+。
实施例12 制备Boc-Arg(NO2)-Gly
将466mg(1.0mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl用20mL甲醇溶解，冰浴下加4N NaOH溶液调节pH到12,冰浴反应3h,TLC(CHCl2:MeOH,30:1)显示原料点消失。反应混合物加5％KHSO4水溶液调节pH至中性，减压浓缩除去甲醇，再加入饱和KHSO4水溶液调节pH至2，用乙酸乙酯萃取，无水Na2SO4干燥,过滤,滤液减压浓缩得到310mg(78％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/z):375[M-H]-。
实施例13 制备Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl
按照实施例11的方法从355mg(1.1mmol)Boc-Asp(OBzl)和291mg(1.0mmol)HCl·Phe-OBzl得284mg(50％)标题化合物,为无色粉末。ESI-MS(m/z):561[M+H]+。
实施例14 制备HCl·Asp(OBzl)-Phe-OBzl
向560mg(1mmol)Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl加入10mL 4M氯化氢-乙酸乙酯溶液，室温搅拌3小时，TLC(CHCl2:MeOH,30:1)显示原料点消失。反应液减压浓缩至干,残留物加少量无水乙酸乙酯溶解,再减压浓缩至干。该操作重复3次。残留物加少量无水乙醚溶解,减压浓缩至干,再减压浓缩至干。该操作重复3次，得440mg(96％)标题化合物,为无色粉末。ESI-MS(m/z):461[M+H]+。
实施例15 制备Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl
按照实施例11的方法从413mg(1.1mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly和496mg(1.0mmol)HCl·Asp(OBzl)-Phe-OBzl得368mg(45％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/z)：819[M+H]+。
实施例16 制备HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl
按照实施例14的方法从818mg(1mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl得690mg(93％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/z)：719[M+H]+。
实施例17 制备(7S)-N-[(Boc-Pro-Ala-Lys)-5,6,7,8-四氢-2,3-二氧异喹啉-7-甲酰]-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl
按照实施例9的方法从789mg(1.1mmol)(7S)-N-(Boc-Pro-Ala-Lys)-5,6,7,8-四氢-2,3二氧异喹啉-7-羧酸苄酯和718mg(1.0mmol)HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp-(OBzl)-Phe-OBzl得到635mg(47％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/z)：1418[M+H]+。
实施例18 制备(7S)-N-[(Pro-Ala-Lys)-5,6,7,8-四氢-2,3-二氧异喹啉-7-甲酰]-Arg-Gly-Asp-Phe(Ia)
冰浴下向286mg(0.2mmol)(7S)-N-[(Boc-Pro-Ala-Lys)-5,6,7,8-四氢-2,3-二氧-异喹啉-7-甲酰]-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl依次加3mL TFA和1mL TFMSA，反应30min，TLC(CHCl2:MeOH＝15:1)监测反应完成。冰浴下向反应液中加入大量乙醚，使析出大量固体，静置，倾倒上层乙醚，再加入乙醚。该操作反复3次。减压浓缩至干。残留物用Sephadex G15除盐，用C18柱纯化，冻干，得到4mg(2％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e):993[M+H]+；1H-NMR(D2O,800MHz):δ/ppm＝7.255(m,2H),7.205(m,1H),7.190(d,2H),6.792(s,1H),6.723(s,1H),5.852(m,2H),4.601-4.544(m,3H),4.476(t,1H),4.355(m,1H),4.309(m,1H),3.740(t,2H),3.399(d,2H),3.117(m,2H),3.034-3.008(m,3H),2.956-2.915(m,4H),2.688(m,1H),2.540(m,1H),2.014(m,2H),1.950(m,1H),1.721-1.638(m,4H),1.582(m,1H),1.460(m,1H),1.457(m,1H),1.376(m,1H),1.328(d,J＝7.2Hz,3H),1.303-1.284(m,2H)。
实施例19 制备Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl
按照实施例11的方法从355mg(1.1mmol)Boc-Asp(OBzl)和243mg(1.0mmol)HCl·Val-OBzl，得到338mg(66％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/z)：513[M+H]+。
实施例20 制备HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl
按照实施例14的方法从512mg(1mmol)Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl，得400mg(94％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/z)：413[M+H]+。
实施例21 制备Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl
按照实施例11的方法从413mg(1.1mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly和448mg(1.0mmol)HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl，得533mg(69％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/z)：771[M+H]+。
实施例22 制备HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl
按照实施例14的方法从770mg(1mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl得680mg(96％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/z)：671[M+H]+。
实施例23 制备(S)-N-[(Boc-Pro-Ala-Lys)-5,6,7,8-四氢-2,3-二氧异喹啉-7-甲酰]-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl
按照实施例9的方法从789mg(1.1mmol)(S)-N-(Boc-Pro-Ala-Lys)-5,6,7,8-四氢-1,3-二氧异喹啉-7-羧酸和671mg(1.0mmol)HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl，得到635mg(47％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/z)：1371[M+H]+。
实施例24 制备(7S)-N-[(Pro-Ala-Lys)-5,6,7,8-四氢-2,3-二氧异喹啉-7-甲酰]-Arg-Gly-Asp-Val(Ib)
按照实施例9的方法从274mg(0.2mmol)(7S)-N-[(Boc-Pro-Ala-Lys)-5,6,7,8-四氢-1,3-二氧-异喹啉-7-甲酰]-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl得到4mg(2％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e):946[M+H]+；1H-NMR(D2O，800MHz):δ/ppm＝6.792(s,1H),6.723(s,1H),5.867(m,2H),4.648-4.541(m,4H),4.350(m,1H),4.302(m,1H),4.210(m,1H),3.355(m,2H),3.091(m,1H),3.040(m,1H),3.004(m,1H),2.972-2.936(m,3H),2.668(m,1H),2.549(m,1H),2.410(m,1H),2.024(m,3H),1.958(m,1H),1.821(m,1H),1.704-1.662(m,5H),1.524(m,1H),1.474(m,1H),1.419(m,1H),1.376(m,1H),1.334(d,J＝4.8Hz,3H),1.193-1.157(m,2H),0.807(d,J＝23.6Hz,6H)。
实验例1 评价化合物Ia,b的抗血栓活性
将雄性SD大鼠(200±20g)，随机分组，每组10只，饲养1天，停止喂食过夜。灌胃给予化合物Ia,b的生理盐水溶液(剂量为1nmol/kg)或阿司匹林的生理盐水溶液(剂量为167μmol/kg)或生理盐水(剂量为10mL/kg)30min之后，大鼠用20％乌来糖的生理盐水溶液麻醉，之后手术。分离大鼠的右颈动脉和左颈静脉，将准确称重的丝线置于旁路插管，管的一端插入左静脉，另一端管插入右侧动脉并注射0.2mL肝素钠抗凝。使得血流从右侧动脉流经旁路插管进入左侧静脉，15min之后取出附有血栓的丝线称量，计算血液循环前后丝线的重量，得到的血栓重,以均值±SD mg表示并代表抗血栓活性，作t检验。数据列入表1。结果表明口服1nmol/kg化合物Ia,b能有效地抑制血栓形成。说明本发明获得了意想不到的技术效果。
表1 1nmol/kg化合物Ia,b的抗血栓活性
n＝10；a)与生理盐水相比p<0.01.
实验例2 评价化合物Ia,b对缺血性中风大鼠的治疗作用
在雄性SD大鼠(体重300±20g)的颈部正中部竖直开约2cm长切口，沿胸锁乳突肌内侧缘分离出右颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉。用无创动脉夹分别夹闭颈内动脉开口处和颈总动脉近心端，结扎颈外动脉的远心端，在颈外动脉剪一小口，松开颈总动脉近心端的动脉夹，取10μL血，之后再用无创动脉夹夹闭颈总动脉的近心端。将取得的10μL血放置在1mL EP管中常温放置30分钟使血液凝固，然后转移至-20℃冰箱中放置1小时，使血液凝块结实。大鼠用10％水合氯醛腹腔注射麻醉，剂量为400mg/kg。取出血液凝块，加入1mL生理盐水，用钢铲把血液凝块捣成大小均一的细小血栓块，制备细小血栓的悬液并转移至1mL注射器内。松开颈总动脉近心端的动脉夹，将1mL血栓混悬液缓慢从大鼠颈外动脉向近心端经过颈内动脉注入大鼠的大脑，然后结扎颈外动脉近心端，打开颈内动脉和颈总动脉处得动脉夹，恢复血流。等待苏醒。大鼠苏醒24小时后按Zealonga方法评定神经功能缺损程度。0分表示无任何神经功能缺失体征,1分表示未损伤侧前肢不能伸展,2分表示向未损伤侧行走,3分表示向未损伤侧转圈成追尾状行走,4分表示意识障碍无自主行走,5分表示死亡。按照得分平均分组。各组大鼠经尾静脉每天注射1次化合物Ia,b，剂量为1nmol/kg。连续注射6天，每天评分。结果列入表2,3。表2的数据表明，化合物Ia连续治疗6天可使7只脑缺血24小时的大鼠神经生物学评分为0分，可使3只脑缺血24小时的大鼠神经生物学评分为神经生物学评分为1分，可使1只脑缺血24小时的大鼠神经生物学评分为神经生物学评分为2分。表3的数据表明，化合物Ib连续治疗6天可使2只脑缺血24小时的大鼠神经生物学评分为0分，可使9只脑缺血24小时的大鼠神经生物学评分为神经生物学评分为1分。因为不像已经公开的化合物首次剂量需要5μmol/kg，后5次维持剂量需要2μmol/kg，化合物Ia,b的6次剂量均为1nmol/kg。这样一来，首次剂量和维持剂量分别降低了5000倍和2000倍。
表2 化合物Ia连续治疗6天对脑缺血24小时大鼠神经生物学评分的影响
n＝11，目标化合物剂量＝1nmol/kg，鼠尾静脉注射给药
表3 化合物Ib连续治疗6天对脑缺血24小时大鼠神经生物学评分的影响
n＝11，目标化合物剂量＝1nmol/kg，鼠尾静脉注射给药。
Claims (5)
1.一种(7S)-N-[(Pro-Ala-Lys)-5,6,7,8-四氢-2,3-二氧异喹啉-7-甲酰]-Arg-Gly-Asp-AA化合物，其特征在于，其结构式为:
式中AA＝Val或Phe。
2.一种制备权利要求1的(7S)-N-[(Pro-Ala-Lys)-5,6,7,8-四氢-2,3-二氧异喹啉-7-甲酰]-Arg-Gly-Asp-Phe化合物的方法,该方法包括以下步骤:
(1)制备(7S)-5,6,7,8-四氢-1,3-二羟基异喹啉-7-羧酸；
(2)制备(7S)-N-叔丁氧羰基-5,6,7,8-四氢-2,3-二羟基异喹啉-7-羧酸苄酯；
(3)制备(7S)-5,6,7,8-四氢-2,3-二氧异喹啉-7-羧酸苄酯；
(4)制备Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl；
(5)制备Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl；
(6)制备(7S)-N-[(Boc-Pro-Ala-Lys)-5,6,7,8-四氢-2,3-二氧异喹啉-7-甲酰]-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl；
(7)制备(7S)-N-[(Pro-Ala-Lys)-5,6,7,8-四氢-2,3-二氧异喹啉-7-甲酰]-Arg-Gly-Asp-Phe。
3.一种制备权利要求1的(7S)-N-[(Pro-Ala-Lys)-5,6,7,8-四氢-2,3-二氧异喹啉-7-甲酰]-Arg-Gly-Asp-Val化合物的制备方法,该方法包括以下步骤:
(1)制备(7S)-5,6,7,8-四氢-2,3-二羟基异喹啉-7-羧酸；
(2)制备(7S)-N-叔丁氧羰基-5,6,7,8-四氢-2,3-二羟基异喹啉-7-羧酸苄酯；
(3)制备(7S)-5,6,7,8-四氢-2,3-二氧异喹啉-7-羧酸苄酯；
(4)制备Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；
(5)制备Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；
(6)制备(7S)-N-[(Boc-Pro-Ala-Lys)-5,6,7,8-四氢-2,3-二氧异喹啉-7-甲酰]-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；
(7)制备(7S)-N-[(Pro-Ala-Lys)-5,6,7,8-四氢-2,3-二氧异喹啉-7-甲酰]-Arg-Gly-Asp-Val。
4.权利要求1的一种(7S)-N-[(Pro-Ala-Lys)-5,6,7,8四氢-2,3-二氧异喹啉-7-甲酰]-Arg-Gly-Asp-AA化合物在制备抗血栓药物中的应用，式中AA为Phe或Val。
5.权利要求1的一种(7S)-N-[(Pro-Ala-Lys)-5,6,7,8-四氢-2,3-二氧异喹啉-7-甲酰]-Arg-Gly-Asp-AA化合物在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用，式中AA为Phe或Val。
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