KR20180042921A

KR20180042921A - 혈행 개선 팥 껍질 추출물의 추출방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 혈행 개선 조성물

Info

Publication number: KR20180042921A
Application number: KR1020160135500A
Authority: KR
Inventors: 안택원; 박정미; 김승형; 정찬호
Original assignee: 학교법인혜화학원
Priority date: 2016-10-19
Filing date: 2016-10-19
Publication date: 2018-04-27
Also published as: KR101881653B1

Abstract

본 발명은 팥 껍질을 에탄올로 추출한 후에 여과하여 농축하는 것을 특징으로 하는 항혈전성 팥껍질 추출물 및 상기 팥 껍질 추출물을 유효성분으로 함유하는 항혈전성 약학 조성물에 관한 것이다. 팥껍질을 에탄올로 추출하여 퀘르시틴(Quercitin), 루틴(Rutin), 카테킨(Catechin), 단센수(Danshesu)를 함유함으로써 항혈전성이 우수한 추출물을 쉽게 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 이를 유효성분으로 하는 약학 조성물은 항혈전이 우수한 장점이 있다.

Description

혈행 개선 팥 껍질 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 혈행 개선 조성물{Extracts for enhancing blood circulation from red bean shell and Compositions comprising the same as an active ingredient}

본 발명은 팥 껍질 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 혈행 개선 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 팥 껍질을 용제인 에탄올로 추출함으로써 퀘르시틴(Quercitin), 루틴(Rutin), 카테킨(Catechin), 단센수(Danshesu)을 함유하는 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 혈행 개선 조성물에 관한 것이다.

팥은 쌍떡잎식물이며, 장미목 콩과의 한해살이풀로서 중국, 한국, 일본 등 극동아시아의 온대지역에서 주로 재배되고 있어 동양이 원산지인 것으로 추정되며, 우리나라는 중국에서 전파되어 재배된 것으로 알려져 있다.

팥에는 비타민 B1이 풍부하여 쌀에 혼반(混飯)할 경우 쌀밥에 부족하기 쉬운 비타민을 공급하여 주며, 각기병(脚氣病)의 예방 뿐만 아니라 피로 회복에도 효과가 있으며, 단백질의 대부분이 글리신이고 발린을 제외한 필수아미노산이 풍부하며, 특히 쌀의 제한(制限)아미노산인 라이신 함량이 높아 혼식하면 아미노산 보조 효과로 단백질의 질을 향상시켜 준다고 알려져 있다.

한의학적으로는 팥은 성질이 평하고 맛이 달며, 이수소종(利水消腫), 이습퇴황(利濕退黃), 청열(靑熱) 해독 효능이 있어 수종(水腫), 각기(脚氣), 소변불리(小便不利), 창독(瘡毒) 등에 활용된다. 아울러 팥에 함유된 사포닌은 섬유질과 함께 통변(便通)을 돕는 효과가 있어, 독을 풀고 배변을 촉진하여 장을 깨끗이 하며, 신장병(腎臟病), 각기병, 숙취 등에도 이용되고 있다.

또한 팥의 색소는 안토시아닌(anthocyanin)계의 시아니딘(cyanidin)으로 알려져 있으며, 이들 색소의 항산화 및 항종양효과는 이미 실험적으로 증명된 바가 있다. 특히, 팥에 풍부한 프로안토시아닌(proanthocyanidins), 퀘르세틴 글리코사이드(quercetin glycoside)와 같은 폴리페놀 성분은 강력한 항산화 작용 및 항염증 효과를 나타내는 것으로 보고되어 있다.

한편, 소득수준이 높아짐에 따라 식생활문화에 있어서 고칼로리 식품의 섭취가 늘고, 생활이 편의 위주로 치우침에 따라 운동부족으로 비만이 일반화되어 동맥경화증, 심장병, 뇌질환 등의 혈행 저해 질환(혈전증)의 발병률이 점차 늘어나고 있다. 혈전증은 현재 다양한 외부적 요인들(예를 들면, 고혈압, 당뇨, 비만, 스트레스, 흡연, 과음 및 고지방성 식이)에 의해 복합적으로 발생되는 것으로 알려져 있으며, 이들은 혈관 내피의 손상과 함께 동맥벽의 기능 이상을 초래하여 그 증상을 더욱 뚜렷이 하는 것으로 알려져 있다. 혈관 내피의 손상은 혈소판의 접착 및 분비반응을 유도하여 일련의 혈소판 응집반응과 혈액응고반응에 의한 혈전 형성이 수반된다. 즉, 여기에 콜레스테롤을 많이 함유하고 있는 LDL 등의 침착과 마이크로파지에 의해 만들어지는 활성산소에 의한 LDL의 산화는 동맥경화반(plaque)과 같은 혈관질환의 발생을 더욱 촉진하는 것으로 알려져 있다.

혈행 개선과 관련한 종래기술로서, 하기 특허문헌 1에는 “천마를 유효성분으로 포함하는 혈행 개선 조성물”이 개시되어 있으나, 이는 혈소판 응집 억제에 따른 출혈 시간을 연장시켜 우수한 혈행 개선 효과를 갖는 것이다. 또한 하기 특허문헌 2에는 “돌콩 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈행개선 조성물”이 개시되어 있으나, 이는 혈소판 응집으로 인하여 생성되는 혈전을 예방 또는 제거할 수 있어 그에 의하여 유발되는 다양한 질환의 예방 등의 효과를 갖는 것이다. 상기 특허는 혈행 개선 효과가 만족할 만한 수준에 이르지 못하는 단점이 있다. 또한 하기 비특허문헌 1에는 “팥의 혈행개선 효능 검증 및 작용기전 연구”가 개시되어 있으나, 이는 팥으로부터 유래된 것으로 팥껍질과는 차이가 있다.

이에 본 발명자는 종래 기술과 달리 천마나 돌콩 및 팥이 아닌 팥(赤豆) 껍질을 비교적 저온에서 에탄올로 추출하여 얻은 추출물이 혈행 개선 효과가 있음을 알게 되어 본 발명을 완성하게 되었다.

한국 등록특허공보 제10-1625476호(2016. 5. 24.) 한국 등록특허공보 제10-1621506호(2016. 5. 10.)

"팥의 비만 예방, 혈행개선 효능 구명 및 가공기술 개발"연구보고서, 전북대학교, 2016. 02.)

본 발명은 팥 껍질로부터 유래한 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 혈행 개선 조성물의 제공을 그 과제로 한다.

본 발명은 팥 껍질을 에탄올로 추출한 후에 여과하여 농축하되, 퀘르시틴(Quercitin), 루틴(Rutin), 카테킨(Catechin), 단센수(Danshesu)를 함유하는 것을 특징으로 하는 항혈전성 팥껍질 추출물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 에탄올은 농도가 70%인 것을 특징으로 하는 항혈전성 팥껍질 추출물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 추출은 81~83℃에서 3시간 동안 환류 추출하는 것을 특징으로 하는 항혈전성 팥껍질 추출물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 여과는 거름망으로 여과한 후에 솜으로 다시 여과하는 것을 특징으로 하는 항혈전성 팥껍질 추출물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 농축은 동결 건조하여 분말화하는 것을 특징으로 하는 항혈전성 팥껍질 추출물을 제공한다.

마지막으로 본 발명은 상기 팥 껍질 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항혈전성 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 항혈전성 팥껍질 추출물은 팥 껍질을 에탄올로 추출함으로써 퀘르시틴(Quercitin), 루틴(Rutin), 카테킨(Catechin), 단센수(Danshesu)를 함유하여 항혈전성이 우수한 추출물을 쉽게 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 이를 유효성분으로 하는 약학 조성물은 항혈전성이 우수한 장점이 있다.

도 1은 본원 발명에 의한 팥껍질 추출물의 크로마토그램이다.
도 2는 본원 발명에 의한 팥껍질 추출물 중 (a) 퀘르시틴(Quercitin), (b) 루틴(Rutin), (c) 카테킨(Catechin), (d) 단센수(Danshesu)의 자외선스펙트럼이다.
도 3은 생쥐의 (a) 정상군, (b) 대조군, (c) 팥껍질 추출물 투여군에 의한 꼬리 혈전크기를 나타내는 사진이다.

이하에서는 본 발명의 구체적 내용을 바람직한 실시예와 비교예를 포함하고, 도면을 참고하여 상세하게 설명하기로 한다. 이는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 발명을 용이하게 실시할 수 있을 정도로 상세하게 설명하기 위한 것이지, 이로 인해 본 발명의 기술적인 사상 및 범주가 한정되는 것을 의미하지는 않는다.

본 발명에 의한 팥 껍질 추출물은 팥 껍질을 에탄올로 추출한 후에 여과하여 농축하되, 퀘르시틴(Quercitin), 루틴(Rutin), 카테킨(Catechin),단센수(Danshesu)를 함유하는 것을 특징으로 한다.

먼저, 팥 껍질은 잘 익은 국내산 팥으로 충주, 홍언 또는 밀양을 구입한 후에 분쇄기로 두 쪽으로 분쇄하여 20℃의 물을 가한 후에 실온(25℃)에서 5-6시간 동안 방치하면, 팥의 껍질과 속이 분리되어 껍질은 물 위로 떠오르게 된다. 이어서 증류수를 제거한 후에 다시 물을 가하여 상층에 부유된 팥 껍질을 스테인레스체로 건져낸 다음 건조기에서 24시간 동안 건조하여 건조된 팥 껍질을 얻을 수 있다.

상기에서 얻어진 건조 팥 껍질을 환류추출기를 사용하여 81~83℃에서 팥 껍질의 10배의 에탄올로써 3시간 추출한 후에 팥 껍질 추출물을 얻을 수 있다. 구체적으로는 상기 얻은 팥 껍질 100중량부에 70% 에탄올 1000중량부를 가하고 82℃에서 3시간 추출한 결과, 팥 껍질 추출액이 얻어진다.

이어서 상기 팥껍질 추출액을 농축기를 이용하여 에탄올을 제거하고, 농축시킨 후에 동결 건조시켜 팥껍질 추출물을 얻을 수 있다. 구체적으로 설명하면, 상기 추출액을 둥근 플라스크에 넣고 감압농축기에 연결하여 온도를 제어하면서 진공펌프를 이용하여 감압하는 형태이다. 그 내부를 진공상태로 만들어 직접적으로 증류하는 방식으로 회전하면서 냉매를 순환하게 하여 증류되는 물질을 회수하는 방법으로 유기용매인 에탄올을 제거하는 농축과정을 거치고, 상기 추출액을 -70℃ 냉동고에서 24시간 냉동시켜 급속동결 한 후에 동결된 추출물을 동결건조기에 넣고 챔버 온도 40℃, 진공압력 10Torr이하에서 72시간 동안 건조하였다. 이렇게 하여 동결 건조된 추출물을 얻을 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 팥껍질 추출물은 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.

본 발명에서 상기 용어 "혈전성 질환"이란, 혈전 생성에 의해 유발되는 질환을 의미하는데, 바람직하게는 심근경색, 협심증, 혈전성 정맥염, 동맥색전증, 관상 및 뇌동맥혈전증, 말초혈관 또는 심부정맥혈전증, 임의 혈관의 동맥혈전증, 정맥혈전증, 허혈성 뇌경색, 동맥경화, 고혈압, 폐고혈압, 뇌경색, 뇌졸증, 만성동맥폐색증, 폐경색, 뇌색전증, 신장색전증, 혈전색전증 및 지주막하 출혈 후의 병적 증상, 경피적 관상동맥 성형술(PTCA) 및 스텐트(stent) 삽입 시의 혈전 생성, 스텐트 설치 후의 재협착, 카테터 혈전성 폐색 또는 재폐색, 급성 관상동맥증후군, TIA(일과성 뇌허혈 발작 또는 급성 뇌혈관 증후군), 심부전증, 허혈성 병인에 의한 가슴통증, X 증후군 등이 될 수 있다.

한편, 본 발명의 혈전성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 돌콩 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 약학 조성물에 포함된 상기 팥 껍질 추출물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총중량을 기준으로 0.1 내지 90% 중량%, 보다 바람직하게는 10 내지 70 중량%의 함량으로 포함할 수 있다.

상기 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.

본 발명의 약학조성물의 투여량은 예를 들어, 상기 팥껍질 추출물을 포함하는 본 발명의 약학 조성물을 사람을 포함하는 포유동물에 하루 동안 10 내지 2,000㎎/㎏, 보다 바람직하게는 50 내지 600㎎/㎏으로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

하기에서는 팥껍질, 팥(붉은, 검정)을 추출용매인 에탄올을 사용하여 추출물을 제조한다.

<실시예> 팥 껍질 추출물의 제조

상기에서와 같이, 팥(赤豆) 껍질 1㎏을 채취한 다음 70% 에탄올을 추출용매로 하여 환류추출기(경서기계산업 제품 COSMOS-660)를 사용하여 82℃에서 상기 용매 10L 가하여 3시간 동안 추출하였다. 그 후 감압농축기(N-21NS, EYELA. CO. LTD, 일본)를 이용하여 에탄올을 제거하여 농축시킴으로써 추출액을 얻고, 상기 추출액을 -70℃ 냉동고에서 24시간 냉동시켜 급속 동결한 후에 동결된 추출물을 동결건조기(CA-2600, 일본 EYELA)에 넣고 챔버 온도 40℃, 진공압력 10Torr 이하에서 72시간 동안 건조하여 팥껍질 추출물 52g을 수득하였다.

<비교예 1>

실시예와 대비하여 팥껍질 대신에 붉은 팥(홍언)을 사용하는 점만 다를 뿐이고, 나머지는 그것과 동일하게 하여 추출물을 얻었다.

<비교예 2>

실시예와 대비하여 팥껍질 대신에 검은 팥(검구슬)을 사용하는 점만 다를 뿐이고, 나머지는 그것과 동일하게 하여 추출물을 얻었다.

<실험예 1>

(1) HPLC 분석

추출물은 20㎎/㎖로 80% 메탄올에 용해한 후, PVDF 시린지 필터를 사용하여 여과한 후 분석에 사용하였다. Optima pak C18 column(5㎛, 4.6㎜ x 250㎜)을 사용하여 수행되었으며, 칼럼의 온도는 40℃로 유지하였고, 검출은 PDA detector를 사용하였다. 이동상은 아세토니트릴(A) 및 0.1% TFA(B)를 이용한 gradient system으로 [표 1]과 같이 최적화 하였고, 유속은 1.0㎖/min, 주입량은 20㎕로 하였다. 팥껍질 추출물 중 지표성분 퀘세틴, 루틴, 카테킨, 단센수(danshesu)의 분석을 위해 이들 표준품들은 12.5, 25, 50, 100, 200㎍/㎖의 농도로 제조하고, 팥껍질 추출물의 농도는 20㎎/㎖로 하여 HPLC 분석을 시행한 후 표준품의 양과 peak area사이의 상관관계를 도출하여 검량선을 작성하여 계산하였다. 그 결과 확인된 퀘르시틴, 루틴, 단센수의 크로마토그램과 자외선스펙트럼을 [도 1], [도 2]에 각각 나타내었다.

팥껍질 추출물의 HPLC 분석을 위한 용매 조건

시간(분)	아세토니트릴(A)	0.1% TFA(B)
	10	90
10	10	90
50	50	50
62	100	0
72	100	0
75	10	90
85	10	90

<실험예 2>

(1) 혈행 생화학 검사 동물모델

in vitro 혈행개선을 관찰하기 위하여 250~280g의 SD와 in vivo 카라기난 혈전동물을 위해 8주령의 25~28g 수컷 ICR 생쥐를 (주)대한바이오링크로부터 구입하여 사용하였다. 실험동물은 실험 당일까지 고형사료(항생제 무첨가, 삼양사료 Co.)와 물을 충분히 공급하고, 온도(22℃), 습도(55%) 및 12시간 light-dark cycle의 환경을 유지하며 1주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 그리고 동물실험의 윤리적, 과학적 타당성 검토 및 효율적인 관리를 위하여 대전대학교 동물실험윤리위원회의 규칙 및 규정에 따라 수행하였다.

(2) in vitro 혈전억제 효능평가

㈎ 생쥐 혈소판 준비

준비된 SD 쥐를 에틸에테르로 마취하고, 미리 항응고제로서 0.15M의 구연산나트륨 2㎖를 주사기에 넣고 복대동맥으로부터 11㎖를 채혈하였다. 5.5㎖의 혈액에 2㎖의 세척완충액(tyroid washing buffer, 137mM NaCl, 2.9mM KCl, 1mM MgCl₂, 5mM glucose, 12mM NaHCO₃, 0.34mM Na₂HPO4, 1mM EDTA, 20mM HEPES, 0.25% BSA, pH 7.4)로 2회 세척한 후 2회 반복하였다. 모두 모아진 상층액을 500 rpm에서 7분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 침전된 혈소판을 7.7㎖의 현탁완충액 (Hepes-tyroid suspension buffer, 137mM NaCl, 2.9mM KCl, 1mM MgCl₂, 5mM glucose, 12 mM NaHCO₃, 0.34mM Na₂HPO₄, 20mM HEPES, 0.25% BSA, pH 7.4)에 현탁시켜서 세척 혈소판(washed platelet)으로 하였다.

㈏ 혈소판 응집 억제능 측정

생쥐의 혈소판 응집 억제능은 측정계(Aggregometer, Chrono-Log Co., Ltd., Havertown, PA. USA)를 이용한 탁도 측정법으로 측정하였다. 세척 혈소판(Washed platelet, PRP)을 37℃에서 3분간 인큐베이션(incubation)시킨 후, Platelet-poor plasma (PPP) 400㎕과 Platelet Rich Plasma(PRP) 400㎕을 각각 quartz에 분주하고 stirr bar를 넣은 후 프로그램을 실행시킨다. 실시예의 팥껍질 추출물, 비교예 1, 2의 팥(홍언, 검구슬) 추출물을 400, 200, 10㎍/㎖, 그리고 함유성분 퀘르시틴(Quercitin), 루틴(rutin), 단센수(danshesu), 카테킨(catechin)을 각각 50㎍/㎖, 양성대조군으로 아스피린 100㎍/㎖을 넣고 2분간 배양한 후 콜라겐 10㎍/㎖을 첨가하여 혈소판 응집반응을 5분간 측정한 후 억제능(inhibition, %)을 계산하였다. 억제능은 상기 시료를 처리하지 않은 것을 대조군으로 하여, 다음 수학식과 같은 방법으로 구하였다.

억제능(%) = (A-B/A) x 100

A : 대조군의 응집능(%), B : 시료 처리시 응집능(%)

상기 [표 2]로부터 실시예의 팥껍질 추출물은 비교예 1, 2의 팥(붉은, 검정) 추출물보다 혈소판 응집 억제능이 우수하였으며, 농도의존성이 있음을 알 수 있었다.

(3) in vivo 혈전억제 효능평가

㈎ 카라기난 유도 혈전 생쥐모델에서 꼬리혈전 길이 측정

생쥐의 꼬리에 혈전을 유도하는 카라기난(carragenan) 모델은 8주령 ICR 생쥐에 1% 카라기난(type I)을 생리식염수에 녹여 약 40㎕를 생쥐 오른쪽뒷다리 발가락 사이에 주사하고, 72시간 후 꼬리 혈전 형성길이(tail thrombosis)를 디지털 버니아 캘리퍼스(Mitutoyo, Japan)로 측정 및 사진을 기록하였다. 실시예의 팥 껍질 추출물, 비교예 1, 2의 팥(홍언, 검구슬) 추출물을 각각 200, 100㎎/㎏, 그리고 in vitro에서 활성성분으로 밝혀진 퀘르시틴과 카테킨 25㎎/㎏, 그리고 양성대조군으로 아스피린 25㎎/㎏, 그리고 vehicle은 카라기난 주사 7일전부터 매일 오전 11시에 경구투여하였고, 혈전 유도 당일은 카라기난 주사 1시간 전에 경구투여, 그 이후는 카라기난 주사 후 72시간에 경구투여하였다. 그 결과를 다음 [표 3]에 나타내었다.

상기 [표 3]으로부터, 실시예의 팥껍질 추출물은 꼬리혈전의 길이가 14,23㎝, 16.34㎝로서 비교예 1, 2의 팥 추출물의 경우 16.30~17.41㎝보다 짧아 꼬리의 심각한 괴사가 발생하지 않았음을 알 수 있고, 꼬리혈전의 길이는 추출물의 투여량이 많아지면 짧아지는 것을 알 수 있었다.

㈏ 카라기난 유도 혈전 생쥐모델에서 Ex vivo 전혈응집억제 효능평가

1) 혈전동물 모델 유도 및 흰쥐 혈소판 준비

생쥐의 꼬리에 혈전을 유도하는 카라기난 모델은 8주령 ICR 생쥐에 1% 카라기난(type I)을 생리식염수에 녹여 40㎕를 생쥐 오른쪽 뒷다리 발가락 사이에 주사하였다. 실시예 및 비교예 1, 2의 추출물을 각각 200, 100㎎/㎏, 그리고 in vitro에서 활성성분으로 밝혀진 퀘세틴과 카테킨을 각각 25㎎/㎏, 그리고 양성대조군으로 아스피린25㎎/㎏을 경구투여 72시간 후에 준비된 ICR 생쥐를 에틸에테르로 마취하고, 미리 항응고제로서 0.15M의 구연산나트륨 3㎖을 주사기에 넣고 심장천좌법으로부터 1㎖을 채혈하였다. 0.55㎖의 혈액에 0.2㎖의 세척완충액(tyroid washing buffer, 137mM NaCl, 2.9mM KCl, 1mM MgCl₂, 5mM glucose, 12mM NaHCO₃, 0.34 mM Na₂HPO₄, 1 mM EDTA, 20 mM HEPES, 0.25% BSA, pH 7.4)로 2회 세척한 후 2회 반복했다. 모두 모아진 상층액을 500 rpm에서 7분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 침전된 혈소판을 0.77ml의 현탁완충액 (Hepes-tyroid suspension buffer, 137mM NaCl, 2.9mM KCl, 1mM MgCl₂, 5mM glucose, 12 mM NaHCO₃, 0.34mM Na₂HPO₄, 20mM HEPES, 0.25% BSA, pH 7.4)에 현탁시켜서 세척 혈소판으로 하였다.

2) 혈소판 응집억제능 측정

카라기난 유도 혈전 생쥐모델에서의 혈소판 응집억제능은 측정계 (Aggregometer, Chrono-Log Co., Ltd., Havertown, PA. USA)를 이용한 탁도측정법으로 측정하였다. 세척 혈소판을 37℃에서 3분간 인큐베이션시킨 후, Platelet-poor plasma(PPP) 400㎕과 Platelet Rich Plasma(PRP) 400㎕을 각각 quartz에 분주하고 stirr bar를 넣은 후 프로그램을 실행시킨다. 2분간 배양한 후 콜라겐 10㎍/㎖을 첨가하여 혈소판 응집반응을 5분간 측정한 후 억제능(inhibition, %)을 계산하였다. 억제정능은 시료를 처리하지 않은 것을 대조군으로 하여, 다음 수학식과 같은 방법으로 구하였다.

Inhibition (%) = (A-B/A) x 100

A : 대조군의 응집능 (%), B :시료처리시 응집능 (%)

그 결과를 다음 [표 4]에 나타내었다.

추출물보다 혈소판 응집억제능이 우수함을 알 수 있었다.

(4) 통계 처리

각 실험군 결과 값은 unpaired student's T-test 통계프로그램을 사용하여 통계 처리하였으며, p<0.05 이하의 수준에서 유의성 검정을 실시하였다.

(5) 최종 분석

상기 결과를 종합하면, 본 발명의 팥껍질 추출물은 혈소판의 응집억제능 및 카라기난 유발 꼬리혈전 실험에서 혈전용해 활성이 우수하므로 항혈전성이 우수한 약학 조성물로 사용 가능함을 보여주고 있다.

이상과 같이, 본 발명을 비록 한정된 실시예에 의해 설명하였으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.

Claims

팥 껍질을 에탄올로 추출한 후에 여과하여 농축하되, 퀘르시틴(Quercitin), 루틴(Rutin), 카테킨(Catechin), 단센수(Danshesu)를 함유하는 것을 특징으로 하는 항혈전성 팥껍질 추출물.
청구항 1에 있어서,
상기 에탄올은 농도가 70%인 것을 특징으로 하는 항혈전성 팥껍질 추출물.
청구항 1에 있어서,
상기 추출은 81~83℃에서 3시간 동안 환류 추출하는 것을 특징으로 하는 항혈전성 팥껍질물.
청구항 1에 있어서,
상기 여과는 거름망으로 여과한 후에 솜으로 다시 여과하는 것을 특징으로 하는 항혈전성 팥껍질 추출물.
청구항 1에 있어서,
상기 농축은 동결 건조하여 분말화하는 것을 특징으로 하는 항혈전성 팥껍질 추출물.
청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 하나의 항의 팥 껍질 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항혈전성 약학 조성물.