CN102643330A - 一种骨靶向药物天冬氨酸六肽丹参素的合成方法及其医疗用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种骨靶向药物天冬氨酸六肽丹参素的合成方法，以及其医疗用途，特别是在防治骨质疏松的应用，属于药物制造的技术领域，六肽丹参素的合成方法是将丹参素结构中含有的羧基与天冬氨酸六肽的N端以酰胺键结合得化合物天冬氨酸六肽-丹参素；本发明制备的天冬氨酸六肽-丹参素可靶向作用于骨组织，使骨组织微血管扩张，促进骨的微循环，同时，可以使骨髓基质干细胞向成骨分化，促进成骨细胞形成，增加骨的合成，明显地预防骨质疏松，是临床预防和治疗骨质疏松的良药。进一步的研究发现，这种六肽丹参素由于其在体内不易被氧化，在血液中维持时间较久，还有许多医疗用途，这些医疗用途包括预防和治疗心肌梗死，冠心病，动脉粥样硬化，高血脂，肝损伤，抗脑缺血损伤和抗肿瘤。
Description
技术领域 本发明涉及一种骨靶向药物天冬氨酸六肽丹参素的合成方法及防治骨质疏松的应用，属于药物制造的技术领域。
背景技术 骨质疏松症是老年人和绝经妇女的常见病、多发病。其主要的发病机制是机体的骨重建的失衡，骨重建是指去除骨骼局部旧骨代谢形成新骨的过程，是成熟骨组织的一种重要替换机制，是破骨细胞与成骨细胞一个成对的、相偶联的细胞活动过程。骨质疏松症是一种以骨量低下、骨显微结构破坏为特征，导致骨脆性增加、易发生骨折的全身性骨病。骨量低下是指骨组织单位体积内骨质含量减少，骨微结构破坏指骨质中钙逐渐流失，骨小梁变薄、变细、断裂和骨组织内的孔隙增多，最终导致骨脆性增加，骨强度下降，容易发生骨折。骨质疏松症的临床表现主要有全身性的骨痛、驼背、身高缩短和骨折，最常见的骨折部位是胸、腰椎、股骨上端和桡骨远端骨折。骨质疏松性骨折在骨质疏松症患者中的发病率为20％左右，且呈逐年上升的趋势，成为威胁老年人身心健康和影响生活质量的仅次于心血管疾病的严重疾病。特别是髋部骨折后，使患者失去生活自理能力，长期卧床易并发感染、心血管疾病。骨质疏松症国际骨质疏松基金会的统计数据显示，骨质疏松症目前危害着全球大约三分之一50岁以上的女性和五分之一50岁以上的男性。随着世界人口的增加和平均寿命的提高，这种疾病的威胁将越来越大。2008年10月20日在北京发布的《骨质疏松症防治中国白皮书》指出，我国至少有6944万人患有骨质疏松，有2.1亿人患低骨量存在骨质疏松症的风险。预计到2020年我国骨质疏松和低骨量患者将增加至2.8亿。如果这么大的人群得不到早期干预治疗，其后果将是骨折发生率大大增加，不但给患者带来痛苦和经济负担，也会给医疗资源带来不小的压力。骨质疏松症已成为一个日益突出的社会公共健康问题。
目前，治疗骨质疏松症主要有两大类：一类是抑制骨吸收的药物；一类是促进骨形成的药物。前者有双膦酸盐(羟乙膦酸钠和阿仑膦酸钠等)、降钙素(鲑鱼降钙素和鲠鱼降钙素衍生物)、选择性雌激素受体调节剂、雌激素、活性维生素D和钙剂；后者有氟化物、甲状旁腺素、活性维生素D和合成类固醇等。然而骨组织是一种特殊的组织，其血流量低、硬度大、渗透性差和生理生化过程特殊，按一般的给药途径很难使药物转运至有效部位，有些药物常需全身给药或者多次给药，才能在骨组织中达到有效的治疗浓度。这样不仅降低了药物的治疗指数，也会对病人的非骨组织或器官造成不必要的毒副作用。如长期应用雌激素治疗骨质疏松症易出现阴道出血、乳房肿痛、子宫内膜增生和静脉血 栓等严重不良反应；活性维生素D治疗骨质疏松症呈剂量依赖性，然而增加VD用量时则可能引起高钙血症和高尿血症。
为了解决骨质疏松的治疗难题，本课题组对中药进行了长期的研究，已发现丹参素在治疗骨质疏松方面具有较好的作用，丹参素是唇形科植物丹参的主要水溶性成分，化学名为D(+)β-(3，4-二羟基苯基)乳酸，其化学结构有许多文献报道，在预防骨质疏松方面已有文献证明丹参的粗提取物对成骨细胞株MC3T3-El细胞碱性磷酸酶活性有明显的促进作用(丁寅相，华西口腔医学杂，1996)，对人成骨细胞缺血-再灌注损伤有保护作用(王福生，中华现代医学杂志，2000)，对骨折愈合有促进作用(符诗聪，中国中西医结合杂志，1999)。本课题组证明丹参水提物能有效预防糖皮质激素导致的大鼠骨质疏松(崔燎，生物医学工程，2004)，还可阻止去卵巢大鼠牙槽骨的骨丢失(张晓燕，中成药，2007)，丹参水提物和丹参素促进成骨细胞活性和防治泼尼松所致大鼠骨质疏松(崔爎，中国药理学通报，2004)等。关于丹参素的药理学研究，已经证明丹参素能扩张心脑血管，抵抗血小板粘附聚集，清除氧自由基；能抑制细胞内源性胆固醇合成的作用，具有抗脂蛋白氧化的作用，防止氧化蛋白对细胞的损伤；还能改善微循环，加速血液流速，抵抗血小板凝聚和血栓形成的作用，具有提高机体抗凝和纤溶活性的作用(杨春欣，中国药理学通报，1997)。而本课题组经体外细胞实验还发现丹参素对体外大鼠颅盖骨成骨细胞有直促进增殖、分化和矿化作用，上调成骨细胞骨保护素基因的表达；另外，还可诱导或促进体外培养的骨髓基质细胞成骨分化，抑制其成脂分化。因此我们认为丹参素可预防或治疗骨质疏松症，其可能机制通过直接促进成成骨细胞骨基质的形成及矿化从而对抗骨吸收，和间接通过改善微循环促进成骨源细胞-骨髓基质细胞成骨分化，从而提高骨形成。
丹参素属于酚酸类化合物，经研究认为其活性基团是苯乳酸丹参素，其结构较为不稳定，尤其是在碱性环境中，其化学不稳定性可能与其结构中的α-羟基和酚羟基有关，在水溶液中邻二酚羟基的电荷密度增大，易解离形成氧负离子，发生自动氧化生成有色醌类物质，而α-羟基由于羧基的存在变得更活泼，还原性强；丹参素其在人体内代谢较快被代谢，消除半衰期约0.94h(约56min)(刘琦，药学学报，2003)，在代谢的方式可能是通过α-羟基的乙酰化使其失去活性(裴渭静，分析化学研究简报，2005)。丹参素的这些结构特点，影响了其在体内的应用。
天冬氨酸寡肽作为骨靶向药物的载体已应用始于2000年，kasugai等发现几种能与HA结合的非胶原蛋白，在其与羟基磷灰石吸附实验(HA)的可能结合位点处有重复的氨 基酸序列，因此合成了小肽(Asp)6，将其与荧光素异硫氰酸偶联，考察它在小鼠体内分布情况及其体外亲和力。实验结果表明在硬组织(牙、骨)中有明显的荧光标记，而在软组织中未发现(Kasugai S，J Bone Miner Res，2000)。以上结果表明，(Asp)6是一个有效的骨靶向药物载体分子。进一步研究表明其亲骨性只与其氨基酸数目有关，与其旋光性无关。考虑到D型氨基酸在体内可能不易被水解，研究者建议使用L-型氨基酸。(L-Asp)6通过连接桥丁二酸与雌二醇连接得到了抗骨质疏松症化合物E2·3D6(Sekido T，J Drug Target，2001)和E2·17βD6(Yokogawa K，Endocrinology，2001)，对HA的亲和力与原药都增加，体内也显示了较高的骨靶向性，药效显示可防止去卵巢大鼠的骨丢失，而不会引起子宫的不良反应。我们在研究中发现，以天冬六肽与丹参素结合，组成新型的骨靶向药物，可解决丹参素结构的不稳定性及较短半衰期短的问题，同时由于六肽为骨靶向载体，与丹参素结合后可作为丹参素骨靶向载体，增加其在骨组织的分布及沉积，使其更好地发挥抗骨质疏松的作用。
发明内容：合成一种以天冬六肽为骨靶向载体的天冬六肽丹参素，解决丹参素结构的不稳定性及在体内半衰期短，在骨组织中分布少，抗骨质疏松作用不强问题，为骨质疏松临床应用提供新的治疗药物。
本发明的主要实施方案是：
骨靶向丹参素的设计及合成：丹参素化合物的结构中含有羧基(见说明书附图1)，可与氨基形成酰胺键，本设计参考布洛芬与六肽的连接方式(见说明书附图2)，设计将丹参素与天冬氨酸六肽(L-Asp)6的N端以酰胺键结合得化合物天冬氨酸六肽-丹参素(简称DD6)，结构见说明书附图3。我们采用固相合成法对天冬氨酸六肽-丹参素进行合成，方法如下：
天冬氨酸六肽-丹参素(DD6)的合成设计
固相多肽合成采用固定羧基端，即由C向N端合成；先将所要合成肽链的C端氨基酸的羧基以共价键的形式同固相合成树脂相连，然后以结合在树脂上的氨基酸的氨基作为反应活性位点，与下一个氨基酸的羧基反应生成肽键，延长肽链。重复(缩合、洗涤、去保护、中和、洗涤和下一轮缩合)操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上切割下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。
固相多肽合成包括固相合成树脂、氨基酸保护策略以及肽键缩合试剂三个关键部，目前较为常用的树脂是wang氏树脂，属于一种酸敏感羟基树脂，其羟基位点可与氨基酸羧基端形成酯键。氨基酸所需保护基团是α-氨基及侧链基团，如今α-氨基的保护常 用9-芴甲氧羰基(Fmoc)，其对酸稳定，其可用20％哌啶/DCM或哌啶/DMF轻易脱除，具有反应条件温和，副反应少，产率高等特点，采用Fmoc作为保护基的方法也称为Fmoc合成法。天冬氨酸侧链上存在活泼的羧基基团，目前常用的保护剂是叔丁氧基(OtBu)，对酸较敏感，可用TFA(三氟乙酸)去除，TFA还可用作树脂的切割剂，将肽从树脂上切割下来。本合成选用wang氏树脂作为固相载体将其与合成原料Fmoc-Asp(OtBu)-OH成酯结合之后，再以苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)/1-羟基-苯并-三氮唑(HOBT)/N，N-二异丙基乙胺(DIEA)为缩合剂合成连接剩余氨基酸得肽树脂，最后再用适合缩合剂将丹参素(DSU)与肽树脂结合，切割得粗产物。
本研究采用多肽固相合成法先合成(L-Asp)6载体，采用Fmoc保护α-氨基，用20％哌啶/DMF脱除，使用含有侧链保护的Fmoc-Asp(OtBu)-OH为合成原料。氨基酸羧基端先与Wang树脂的羟基位成酯连接后，肽链从C端向N端延伸，得到线型肽树脂后，再脱除氨基保护基，将丹参素的羧基端与肽链的N端缩合后，用含有95％TFA的切割剂割去树脂和侧链保护剂，经冰乙醚沉淀后即得到目标化合物粗品。其合成路线见说明书附图4。
天冬氨酸六肽-丹参素(DD6)的合成步骤
(一)Fmoc-Asp(OtBu)-O-Wang树脂的合成(成酯反应)
(1)树脂的溶胀：称取Wang树脂于预先经DCM处理的反应器中，用DCM溶胀过夜，使树脂充分溶胀，便于反应能够较完全进行，分别用DCM及DMF洗涤树脂，真空泵抽干。
(2)Fmoc保护基团的脱除：配置20％哌啶/DMF脱除剂，为了能充分脱除Fmoc基团，采用两次脱除法。第一次：脱除时间15min，试剂用量15mL/g树脂；第二次，脱除时间15min，试剂用量15mL/g树脂。
(3)洗涤：依次用DMF×1，DCM×5、DMF×1进行洗涤，每次氮气鼓吹搅拌约1min左右。
(4)缩合反应：将准确称取的Fmoc-Asp(-OtBu)-OH(4倍树脂担载量当量)和HOBt(2倍树脂担载量当量)放入烧杯中，加入45％DMF/THF磁力搅拌，溶解后，置于冰浴中，缓慢加入DIC(2倍当量)，搅拌反应活化20min。然后将此活化酯溶液倒入盛有Wang树脂的反应器(加入树脂前用DCM处理反应器)中；再加DMAP(0.3倍树脂担载量当量)，室温下通入氮气反应6h。反应结束后用DMF洗3次，加入二氯甲烷、乙酸酐和二乙胺后，室温反应30min以封闭未被酯化的羟基。抽干，用DMF、DCM、 MeOH分别洗涤三次，真空干燥树脂。备下步合成用。
(二)Fmoc-Asp(OtBu)-[Asp(OtBu)]4-Asp(OtBu)-O-Wang树脂的合成
(1)反应前树脂的溶胀处理：准确称取上所得氨基酸树脂加入反应器中，加入10mLDCM浸泡，封闭过夜，使树脂充分溶胀。真空抽去溶剂，用DMF×2洗涤1min，抽干。
(2)脱除Fmoc氨基保护基：同2.1.1(2)。
(3)洗涤：同2.1.1(3)。
(4)肽键的形成：称取HBTU(3倍过量，以树脂上氨基酸物质的量为基准，下同)、HOBT(3倍过量)，磁力搅拌下加入DMF溶解，再加入Fmoc-Asp(-otBu)-OH(3倍过量)溶解，室温搅拌活化30min加入到脱除Fmoc氨基保护树脂中。量取DIEA(6倍过量)，通入氮气室温下反应直到茚三酮检测显示反应完全为止依次用DCM，DMF洗涤。重复步骤(2)(3)，直至六肽皆连接上。用DMF、DCM、MeOH分别洗涤三次，真空干燥树脂。备下步合成用。若缩合效率不高，有必要用50％醋酸酐/吡啶(V/V)在25℃下反应2h，以封闭未反应氨基。
(三)天冬氨酸六肽丹参素的合成
(1)反应前树脂的溶胀处理：准确称取上所得肽树脂加入到烧瓶中，用10mL DCM浸泡过夜，使树脂充分溶胀。真空抽去溶剂，用3mL DMF×2洗涤，抽干。
(2)脱除Fmoc氨基保护基：同2.1.1(2)。
(3)洗涤：同2.1.1(3)。
(4)肽键的形成：准确称取DSU(等量，与树脂上肽的物质的量为基准，下同)用适当溶剂溶解，再称取HBTU(等量)和HOBT(等量)，经DMF溶解后，一起加入到脱除Fmoc肽保护树脂中，量取加入DIEA(2倍过量)，通入氮气室温下反应。用DMF、DCM、MeOH分别洗涤三次，除去溶剂后，树脂直接于反应器中放置真空干燥箱中干燥。
(5)脱除侧链保护及树脂：取出反应器，氮气鼓吹下，加入冰的切割剂TFA/TIS/H2O(95/2.5/2.5，V/V/V)室温下反应2h。反应结束后，抽滤，收集滤液，用少量TFA洗树脂三次，合并滤液，加入大量无水冰乙醚，离心、洗涤三次，收集沉淀。沉淀经真空干燥，即得合成的天冬氨酸六肽丹参素产品。
(二)天冬氨酸六肽-丹参素(DD6)的质量控制
对所合成的粗品进行高效液相色谱(RP-HPLC)分析，收集主峰，对其进行质谱鉴定。
1)样品溶液制备
称取所合成的天冬氨酸六肽-丹参素，用0.1％TFA-H2O溶解后用0.22μm滤膜过滤，供RP-HPLC分析备用。
2)RP-HPLC分析条件
色谱分析仪器及分析条件如下：
仪器：Angilent HPLC 1200series
色谱柱：ODS C18柱(250mm×4.6mm，5μm，Hypersil)
流动相：A：0.1％TFA/H2O，B：0.1％TFA/乙腈
流速：1mL/min，检测波长：280nm，进样量：20μL
洗脱程序如下：
| T(min) | 流动相A | 流动相B |
| 0 | 96％ | 4％ |
| 20 | 80％ | 20％ |
| 30 | 96％ | 4％ |
3)主峰质谱鉴定分析
质谱分析条件如下：
离子源：ESI；扫描模式：Negative or positive；
GAS Temp：350℃；
GAS and GAS flow：N2，9L/min；
Nebulizer：40psi；
Capillary：-3500V or 4000V。
4)天冬氨酸六肽-丹参素HPLC分析图谱
天冬氨酸六肽-丹参素粗品经HPLC分离后图谱见说明书附图5，主峰出峰时间是10.429min，其它峰为副产物。
天冬氨酸六肽-丹参素粗品经30次纯化最终得冻干粉100mg。冻干粉经HPLC分析见说明书附图6，采用面积归一法计算其纯度约为90％。
本发明制备的天冬氨酸六肽-丹参素经研究证明，本产品可靶向作用于骨组织，使骨组织微血管扩张，促进骨的微循环，同时，可以使骨髓基质干细胞向成骨分化，促进成骨细胞形成，增加骨的合成，明显地预防骨质疏松，是预防和治疗骨质疏松的良药。
研究还证明本发明制备的天冬氨酸六肽-丹参素，具有缩小心肌梗死范围和减轻病程的作用，同时对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用；可明显抑制血小板的聚集，并明 显增加血小板膜的流动性，对预防冠心病也有效。
本发明制备的天冬氨酸六肽-丹参素，还具有抗菌消炎及增强机体免疫作用；抗动脉粥样硬化及降血脂作用，抗血栓形成作用；治疗肝损伤的作用；抗脑缺血损伤作用和抗肿瘤作用。
研究说明，本发明制备的天冬氨酸六肽-丹参素可用于预防和治疗心肌梗死，冠心病，动脉粥样硬化，高血脂，肝损伤，抗脑缺血损伤和抗肿瘤。
本发明的实施例：
(一)天冬氨酸六肽-丹参素的合成：
采用多肽固相合成法先合成天冬氨酸六肽载体，采用9-芴甲氧羰基保护α-氨基，用20％哌啶/N，N-二甲基甲酰胺脱除，使用含有侧链保护的9-芴甲氧羰基-天冬氨酸(叔丁氧基)-OH为合成原料；氨基酸羧基端先与Wang树脂的羟基位成酯连接后，肽链从C端向N端延伸，得到线型肽树脂后，再脱除氨基保护基，将丹参素的羧基端与肽链的N端缩合后，用含有95％三氟乙酸的切割剂割去树脂和侧链保护剂，经冰乙醚沉淀后即得到目标化合物粗品，其合成路线包括下述步骤：
(1)9-芴甲氧羰基-天冬氨酸(-叔丁氧基)-O-Wang树脂的合成(成酯反应)
1)树脂的溶胀：称取Wang树脂于预先经二氯甲烷处理的反应器中，用二氯甲烷溶胀过夜，使树脂充分溶胀，便于反应能够较完全进行，分别用二氯甲烷及N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，真空泵抽干；
2)9-芴甲氧羰基保护基团的脱除：配置20％哌啶/N，N-二甲基甲酰胺脱除剂，为了能充分脱除9-芴甲氧羰基基团，采用两次脱除法。第一次：脱除时间15min，试剂用量15mL/g树脂；第二次，脱除时间15min，试剂用量15mL/g树脂；
3)洗涤：依次用N，N-二甲基甲酰胺×1，二氯甲烷×5、N，N-二甲基甲酰胺×1进行洗涤，每次氮气鼓吹搅拌约1min左右；
4)缩合反应：将准确称取的9-芴甲氧羰基-天冬氨酸(-叔丁氧基)-OH(4倍树脂担载量当量)和HOBt(2倍树脂担载量当量)放入烧杯中，加入45％N，N-二甲基甲酰胺/四氢呋喃磁力搅拌，溶解后，置于冰浴中，缓慢加入N，N′-二异丙基碳二亚胺(2倍当量)，搅拌反应活化20分钟。然后将此活化酯溶液倒入盛有Wang树脂的反应器(加入树脂前用二氯甲烷处理反应器)中；再加4-二甲氨基吡啶(0.3倍树脂担载量当量)，室温下通入氮气反应6小时。反应结束后用N，N-二甲基甲酰胺洗3次，加入二氯甲烷、乙酸酐和二乙胺后，室温反应30分钟以封闭未被酯化的羟基。抽干，用N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、 MeOH分别洗涤三次，真空干燥树脂；
(2)9-芴甲氧羰基-天冬氨酸(叔丁氧基)-[天冬氨酸(叔丁氧基)]4-天冬氨酸(叔丁氧基)-O-Wang树脂的合成
1)反应前树脂的溶胀处理：准确称取上所得氨基酸树脂加入反应器中，加入10mL二氯甲烷浸泡，封闭过夜，使树脂充分溶胀，真空抽去溶剂，用N，N-二甲基甲酰胺×2洗涤1分种，抽干；
2)脱除9-芴甲氧羰基氨基保护基：方法同(1)步骤的2)；
3)洗涤：方法同(1)步骤的3)；
4)肽键的形成：称取苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(3倍过量，以树脂上氨基酸物质的量为基准，下同)、1-羟基-苯并-三氮唑(3倍过量)，磁力搅拌下加入N，N-二甲基甲酰胺溶解，再加入9-芴甲氧羰基-天冬氨酸(叔丁氧基)-OH(3倍过量)溶解，室温搅拌活化30分钟，加入到脱除Fmoc氨基保护树脂中；量取N，N-二异丙基乙胺(6倍过量)，通入氮气室温下反应，直到茚三酮检测显示反应完全为止，依次用二氯甲烷，N，N-二甲基甲酰胺洗涤。重复步骤2)和3)，直至六肽皆连接上；用N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、MeOH分别洗涤三次，真空干燥六肽树脂；
(3)天冬氨酸六肽丹参素的合成
1)反应前树脂的溶胀处理：准确称取上所得六肽树脂加入到烧瓶中，用10mL二氯甲烷浸泡过夜，使树脂充分溶胀，真空抽去溶剂，用3mLN，N-二甲基甲酰胺×2洗涤，抽干；
2)脱除9-芴甲氧羰基氨基保护基：方法同(1)步骤的2)；
3)洗涤：方法同(1)步骤的3)；
4)肽键的形成：准确称取丹参素(等量，与树脂上肽的物质的量为基准，下同)，再称取苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(等量)和1-羟基-苯并-三氮唑(等量)，经N，N-二甲基甲酰胺溶解后，一起加入到脱除9-芴甲氧羰基肽保护树脂中，量取加入N，N-二异丙基乙胺(2倍过量)，通入氮气室温下反应，用N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、MeOH分别洗涤三次，除去溶剂后，树脂直接于反应器中放置真空干燥箱中干燥；
5)脱除侧链保护及树脂：取出反应器，氮气鼓吹下，加入冰的切割剂三氟乙酸/三异丙基硅烷/水(95/2.5/2.5，V/V/V)室温下反应2小时，反应结束后，抽滤，收集滤液，用少量三氟乙酸洗树脂三次，合并滤液，加入大量无水冰乙醚，离心、洗涤三次，收集沉淀；沉淀经真空干燥，即得合成的天冬氨酸六肽丹参素产品。
(二)天冬氨酸六肽丹参素对大鼠颅盖骨成骨细胞增殖的影响及对大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响
1材料与方法
1.1试剂
1.2仪器
1.3试剂配制
(1)丹参素：用PBS配制浓度为1mg/mL的丹参素溶液，过滤灭菌，-20℃避光保存作为贮存液，使用时用DMEM培养液稀释至所需浓度。
(2)天冬氨酸六肽丹参素：用PBS配制浓度为4.48mg/mL的DD6溶液，过滤灭菌，-20℃避光保存作为贮存液，使用时用DMEM培养液稀释至所需浓度。
(3)培养基：DMEM(H)培养基干粉1包加3.7g碳酸氢钠，用三蒸水均匀搅拌，定容至1000mL，过滤灭菌后试培24小时，如仍为澄清液体，即可使用。完全培养基加10％的胎牛血清和双抗(青霉素100U/mL，链霉素100U/mL)制得。配成的培养基pH为7.4。
(4)胰蛋白酶：胰蛋白酶用PBS液配置成浓度为0.25％的溶液，pH7.2-7.4，4℃放置24小时后过滤灭菌，-20℃保存备用。
(5)MTT：MTT粉剂用PBS液配置成浓度为5mg/mL的溶液过滤灭菌，4℃避光保存。
(6)PBS：准确称取NaCl 8.00g，KCl 0.20g，Na2HPO4·12H2O 3.49g，KH2PO40.20g，加三蒸水定容至1000mL。分装后10lbf/in2(115℃)高压灭菌25分钟，4℃保存备用。
(7)双抗生素：青霉素(80万U/支)一支用灭菌的PBS溶解后定容至16mL，链霉素(100万U/支)一支用灭菌的PBS溶解后定容至20ml，取青霉素溶液16mL和链霉素溶液16mL等体积混匀后分装于1.5mL Eppendoff管中，-20℃保存备用。
(8)PNPP：PNPP粉剂溶于三蒸水，配置成浓度为20mmol/L的溶液，-20℃避光保存。
1.4细胞收集及培养
1.4.1大鼠颅盖骨成骨细胞收集及培养
取新生SD大鼠(胎鼠或出生3天内)，清洗后用75％酒精浸泡消毒5分钟，取出置超净工作台内，擦干残余酒精，无菌条件下剪开皮肤后环行剪下颅骨(顶骨及额骨)，用PBS(含500U/mL青霉素、500U/mL链霉素)液冲洗数次，用另一套剪刀和镊子剔除粘附的结缔组织和血管，剪碎约1×1mm3(呈肉糜状)。先用0.25％胰蛋白酶在37℃预 消化30分钟，去掉消化液以清除成纤维细胞，再加含0.2％的I型胶原酶和0.1％的透明质酸酶的消化液消化，共消化5个循环，每次在37℃恒温震荡20分钟，取各次消化的细胞悬液，2000g离心10分钟，弃上清，沉淀的细胞用含10％胎牛血清的DMEM(H)培养液重悬，吹打均匀后以1×105/mL密度接种到培养瓶中，培养瓶置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
原代细胞24小时后可见细胞贴壁生长，胞浆开始伸展，更换新鲜含10％胎牛血清的DMEM(H)培养液，以后每隔48小时换液一次，待细胞70％-80％融合后，用0.25％胰蛋白酶消化使贴壁细胞消化松解、变圆，然后吸出消化液，加入含10％胎牛血清的DMEM(H)培养液终止消化，然后吹打细胞，脱壁后调至所需细胞密度，移入培养瓶和培养板中进行实验。本实验所用细胞为传3-5代细胞。每项实验重复2-3次。
1.4.2大鼠骨髓基质干细胞收集及培养
采用传统的传代贴壁筛选的方法，分离培养大鼠骨髓基质干细胞。具体步骤：取一月龄SPF级SD大鼠脱颈椎处死，75％酒精浸泡10min，在无菌条件下分离大鼠股骨，去除软组织。切除股骨两端，用5ml DMEM(L)培养液从冲洗每根股骨骨髓腔，8-10根股骨冲出的骨髓收集于同一烧杯中，充分混匀吹散细胞，1000g离心10分钟，弃上清，沉淀用含10％胎牛血清DMEM(L)培养液重悬，吹打均匀后以5×106/cm2密度接种到25ml培养瓶中，37℃，5％饱和湿度的CO2孵箱静置培养，24～48h在倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，多数细胞贴壁生长且轻微摇晃瓶身见细胞不易脱落后，在超净台内首次半量换液，以后每3d全量换液一次。原代培养10-12d左右，贴壁细胞已贴满培养瓶，呈成纤维细胞样生长。用37℃预热的0.25％胰酶室温下消化原代细胞，光学显微镜下见贴壁细胞基本挛缩后，加入新鲜完全培养液终止消化，用吸管吹打成单细胞悬液，按1∶2比例传代，以后每隔3天，细胞贴满培养瓶，同前消化。每次换液弃去未贴壁细胞，纯化MSCs。定期观察，换液。
1.5实验方法与给药
1.5.1大鼠颅盖骨成骨细胞的促增殖实验
用MTT法-四唑盐比色法测定增殖作用。细胞以3×104/cm2密度加入96孔板，24小时分别加入100μL溶剂对照和不同浓度的药物：终浓度为5.0×10-7M、2.5×10-6M的丹参素溶液及终浓度为2.5×10-7M、5.0×10-7M、2.5×10-6M、5.0×10-6M的DD6溶液。测定方法：实验结束前4小时每孔加入20μL浓度为5mg/ml的MTT，继续在37℃，5％CO2条件下孵育，4小时后，去掉培养液，每孔加入二甲基亚砜100μL，振摇至结晶完全溶 解后于酶标仪检测其吸光度，测量波长为570nm，参考波长为630nm。分别于药物作用后1、2、3天后按上述方法测其OD值。
1.5.2大鼠骨髓基质干细胞成骨分化实验
用PNPP法-对硝基苯酚法测定碱性磷酸酶活性96孔板中每孔接种1×105/mL骨髓基质干细胞100μL。培养24h后，每孔加入100μL溶剂对照和不同浓度的药物：终浓度为5.0×10-7M、2.5×10-6M的丹参素溶液及终浓度为2.5×10-7M、5.0×10-7M、2.5×10-6M、5.0×10-6M的DD6溶液。给药三天后换液体。至规定时间点后，各孔加入100μL细胞裂解液，置-20℃冰箱反复冻融三次。取新鲜配制的底物液100μL(25mM二乙醇胺，1mM氯化镁和5.0mM对硝基苯磷酸二钠)，37℃温箱内孵育30min，加氢氧化钠100μL终止反应，酶标仪检测，波长为490nm，结果表示为吸光度值(OD)。
2结果
2.1天冬氨酸六肽丹参素对大鼠颅盖骨成骨细胞的增殖影响
实验观察两个浓度DSU和四个浓度的DD6对成骨细胞增殖的影响，结果见表2.1。在实验时间设定时间内，成骨细胞数目最多时是在细胞培养第72h。2.5×10-7～2.5×10-6M浓度范围内的DD6在给药后第48h呈现出促增殖作用(p＜0.05)，5.0×10-6M浓度的DD6作用第24h后呈现出明显促增殖作用(P＜0.01)。5.0×10-7M和2.5×10-6M浓度的DSU在给药第48h有促增殖作用(p＜0.05)。等摩尔浓度的DD6及DSU其促增殖比较见图2.1，DD6的促增殖能力作用有高于DSU的趋势，尤其是给药24h和48h趋势较为明显。
表2.1 DSU及DD6对新生大鼠颅盖骨成骨细胞增殖的影响(MTT法测定OD值)
注：*：P＜0.05，**：P＜0.01VS Cont.组。
2.2天冬氨酸六肽丹参素对大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响
DD6作用骨髓基质干细胞第9、12、15、18、21天碱性磷酸酶活性的影响见表2.2，浓度为5.0×10-7M、2.5×10-6M的DSU在给药第9天时有促进骨髓基质干细胞分泌碱性磷酸酶的作用(P＜0.05)；DD6浓度在2.5×10-7M时作用第9天有明显增加ALP活性的作用(P＜0.01)，第15天、21天有增加作用(P＜0.05)；浓度在5.0×10-7M时作用第9天有明显作用(P＜0.01)，第12、15、21天也有增加作用(P＜0.05)；浓度在2.5×10-6M时作用第9、12、21天有作用(P＜0.05)，第15天有明显作用(P＜0.01)；浓度为5.0×10-6M时第9、21天有明显作用(P＜0.01)，第12、15、18天也都有作用(P＜0.05)。DSU及DD6对骨髓基质干细胞碱性磷酸酶活性影响作用比较(见图2.2)，以ALP增加百分比数作为比较指标。结果，DSU组对ALP的增加作用于第9天最强，而后有逐渐下降的趋势，第18天显示无作用，第21又出现了作用；在第9和第12天，高浓度DD6组作用强度不如DSU组，而第15、18、21天其作用逐渐增强，且有高于DSU组的趋势。等浓度的DD6和DSU对ALP的影响比较见图2.3，DD6的作用有强于等浓度的DSU作用。DD6对骨髓基质细胞ALP活性的影响见图2.4，高浓度组的作用有强于低浓度组的趋势。
表2.2 不同药物作用不同天后碱性磷酸酶活性(OD值)
注：*：P＜0.05，**：P＜0.01VS Cont.组。
3讨论
3.1大鼠颅盖骨成骨细胞增殖实验
成骨细胞(ostoeblast)是骨形成过程中的重要功能细胞，它不仅分泌骨基质参与骨形成，同时也参与破骨细胞骨吸收的调节，是骨重建的多细胞功能单位的重要细胞之一。 成骨细胞的数量增加和功能增强(分泌旺盛)可生成丰富的骨胶原基质，通过基质矿化而形成新的骨组织，成骨细胞继而被埋于骨基质中成为骨细胞。成骨细胞数量减少或功能受损均导致骨代谢异常，通常引起骨形成减少，特别是骨质疏松。体外培养的成骨细胞表型其发育与体内的发育有相似之处，都经历细胞增殖，细胞外基质成熟和基质矿化3个阶段[44-45]。所有动物包括大鼠、小鼠、兔、狗、猪、羊、猴、狒狒，还有人体的活检组织，均可用于获取成骨细胞，其中大鼠是使用最多的模型动物，骨代谢情况与人类接近，大鼠颅骨细胞体外培养时细胞的分化过程与体内相似[46]。本实验室对于大鼠颅盖骨成骨细胞的分离与培养技术已成熟，已用于药物的筛选、药物作用机制的研究等。对丹参水提物可用于治疗骨质疏松症的治疗机制的研究中发现丹参素对成骨细胞的增殖有一定的影响，因此我们将采用成骨细胞增殖实验来对DD6作体外药效评价。
大鼠颅盖骨细胞的取材及细胞的培养的技术已基本成熟，按照1.4方法来取材及培养的细胞已从细胞形态、矿化结节、ALP阳性等成骨细胞表型证实其为成骨细胞，因此本实验直接采用传统方式进行取材，直接通过观察细胞形态进行鉴定，无需再作矿化结节及ALP阳性鉴定。本实验新生大鼠颅骨细胞是胶原酶和透明质酸酶序列消化第2-5遍的细胞，倒置相差显微镜下观察：刚接种的成骨细胞呈球形，悬浮于培养液，然后逐渐沉降贴壁，24小时后存活细胞完全贴壁，48小时后，胞体由圆形伸展为梭形；培养第3天细胞完全伸展开，体积增大，单核，核呈卵圆形，有1-3个核仁，细胞伸出生长突，胞质丰富，细胞呈梭形或鳞片状，生长细胞增殖旺盛。培养到第7天细胞汇合呈铺路石状，并可重叠生长，大多呈立方形，体积较大，多伪足，胞核较大，偏于一侧，胞浆丰富，伸出突起与邻近细胞伸出的突起相连。
按照已成熟的实验技术来收集成骨细胞，经实验室经验进行细胞培养，按经验原代细胞传至3-5代后用于增殖实验。前期实验发现DSU浓度在0.1mg/ml及0.5mg/ml下促细胞增殖作用最强，因此采用这个两个浓度DSU作为对照组，观察等摩尔浓度DD6(摩尔浓度为5.0×10-7M和2.5×10-6M)对成骨细胞增殖作用的影响，以此为中浓度，另外在中浓度的基础上设定了一个低浓度(2.5×10-7M)及一个高浓度(5.0×10-6M)。中低浓度的DD6及DSU在作用48h后呈现出促增殖作用，而高浓度DD6则于作用24h后便呈现促增殖作用，可能是高浓度DD6可释放出的DSU量较多因此较早发挥作用，而低浓度的DD6较缓慢释放丹参素，促增殖作用慢慢积累至48h后才呈现出促进作用。若继续降低药物浓度则可能需要更长时间才能显现促增殖作用，而提高药物浓度则可能会延长其作用时间。等浓度DSU及DD6作用72天内生长曲线如图2.1，5.0×10-7M浓度时DD6 作用24h后的细胞数目有比DSU组高的趋势，增加至2.5×10-6M浓度时DD6作用24h和48h后的细胞数目都有比DSU组高的趋势，这说明DD6其促增殖能力强于DSU，这可能会是由于DD6缓慢释放药物作用积累的结果，但游离型DSU由于其结构较为不稳定，所以在给药后可能会有一部分被氧化，其作用被减弱。从表2.1还可看出低浓度组(2.5×10-7M)的DD6其浓度虽为DSU组(2.5×10-6M)浓度的十分之一，但是促增殖能力却与其相当，再次说明DD6的促增殖能力强于DSU。若需进一步证实，则可通过扩大作用浓度范围或延长给药后作用时间来证实。本实验单从增殖实验观察DD6的作用，除此之外，还可观察DD6对成骨细胞细胞碱性磷酸酶活性的影响、对成骨细胞I型胶原mRNA表达的影响、对成骨细胞骨钙素的影响、对成骨矿化结节的影响、对骨保护素(OPG)mRNA表达的影响等实验全面观察其作用，并探讨其作用机制。
3.2大鼠骨髓基质干细胞成骨分化实验
骨髓基质干细胞(Marrow Stromal Cells，MSCs)存在于骨髓基质，它是由许多细胞群体组成的异质细胞群，其间存在骨髓基质干细胞，来源于中胚层，约占骨髓基质干细胞总数的十万分之一，是一种具有自我更新、复制及多向分化潜能的成体干细胞，属于结缔组织成体干细胞。但骨髓基质干细胞不像胚胎干细胞那样具有全能性，故认为骨髓基质干细胞是多能性细胞(multipotential)。目前，促骨形成途径不仅有直接促进成骨细胞的增殖、分化、矿化等，还有诱导或促进MSCs向成骨分化。碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)是成骨细胞早期分化的标志，ALP是成熟成骨细胞的标志性酶之一，可作为成骨细胞的功能标记物。选用纯化后的基质细胞予以药物之后，可通过测定ALP活性观察药物对MSCs成骨分化的影响。
实验中DSU只在作用第9天时表现出有增加碱性磷酸酶活性的作用，而后第12、15、18碱性磷酸酶活性虽有高于对照组的趋势，但没有统计学意义，这可能是由于每次给药后，培养液中的DSU迅速被氧化导致作用下降，因此第三天测定时其ALP活性表现为增加不明显。若需进一步证实此想法可观察给药后连续三天内ALP活性的变化。DD6作用初期时对ALP活性不及DSU，但随着作用时间的延长其作用逐渐增强，这表明了DD6的一种缓释效应，当给药后DD6逐渐释放出DSU，虽可能仍有一部分DSU被氧化，但被氧化的部分可被不断补充，因此作用就为持久。另外，图2.3中显示DD6较等浓度DSU的作用好，也表现了DD6的缓释效应。高浓度DD6作用较低浓度组作用效果好，可能是高浓度DD6可释放的DSU量较低浓度组多，因此作用较其强。
4结论
天冬氨酸六肽丹参素药效学探究发现其具有促成骨细胞增殖作用，且作用有强于丹参素；天冬氨酸六肽丹参素可增加骨髓基质干细胞的碱性磷酸酶的活性，作用较丹参素持久。可以作为骨靶向药物，用于骨质疏松的防治。
进一步的研究发现，这种六肽丹参素由于其在体内不易被氧化，在血液中维持时间较久，还有许多医疗用途，这些医疗用途包括预防和治疗心肌梗死，冠心病，动脉粥样硬化，高血脂，肝损伤，抗脑缺血损伤和抗肿瘤。
说明书附图说明：
图1是丹参素的结构图；图2是布洛芬与六肽的连接方式图；图3是天冬氨酸六肽-丹参素结构图；图4是天冬氨酸六肽-丹参素的合成路线图，图5是天冬氨酸六肽-丹参素粗品HPLC分析图谱图，图6为天冬氨酸六肽-丹参素粗品经30次纯化分离后冻干粉经HPLC分析图谱图。
Claims (5)
1.一种六肽丹参素的合成方法及其医疗用途。
2.如权利要求1所述的一种六肽丹参素的合成方法是指将丹参素结构中含有的羧基与天冬氨酸六肽的N端以酰胺键结合得化合物天冬氨酸六肽-丹参素，结构见说明书附图3。
3.如权利要求1所述的一种六肽丹参素的合成方法是指以天冬氨酸六肽为载体的合成方法，其特征是采用多肽固相合成法先合成天冬氨酸六肽载体，采用9-芴甲氧羰基保护α-氨基，用20％哌啶/N，N-二甲基甲酰胺脱除，使用含有侧链保护的9-芴甲氧羰基-天冬氨酸(叔丁氧基)-OH为合成原料；氨基酸羧基端先与Wang树脂的羟基位成酯连接后，肽链从C端向N端延伸，得到线型肽树脂后，再脱除氨基保护基，将丹参素的羧基端与肽链的N端缩合后，用含有95％三氟乙酸的切割剂割去树脂和侧链保护剂，经冰乙醚沉淀后即得到目标化合物粗品，其合成路线包括下述步骤：
(1)9-芴甲氧羰基-天冬氨酸(-叔丁氧基)-O-Wang树脂的合成(成酯反应)
1)树脂的溶胀：称取Wang树脂于预先经二氯甲烷处理的反应器中，用二氯甲烷溶胀过夜，使树脂充分溶胀，便于反应能够较完全进行，分别用二氯甲烷及N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，真空泵抽干；
2)9-芴甲氧羰基保护基团的脱除：配置20％哌啶/N，N-二甲基甲酰胺脱除剂，为了能充分脱除9-芴甲氧羰基基团，采用两次脱除法。第一次：脱除时间15min，试剂用量15mL/g树脂；第二次，脱除时间15min，试剂用量15mL/g树脂；
3)洗涤：依次用N，N-二甲基甲酰胺×1，二氯甲烷×5、N，N-二甲基甲酰胺×1进行洗涤，每次氮气鼓吹搅拌约1min左右；
4)缩合反应：将准确称取的9-芴甲氧羰基-天冬氨酸(-叔丁氧基)-OH(4倍树脂担载量当量)和HOBt(2倍树脂担载量当量)放入烧杯中，加入45％N，N-二甲基甲酰胺/四氢呋喃磁力搅拌，溶解后，置于冰浴中，缓慢加入N，N′-二异丙基碳二亚胺(2倍当量)，搅拌反应活化20分钟。然后将此活化酯溶液倒入盛有Wang树脂的反应器(加入树脂前用二氯甲烷处理反应器)中；再加4-二甲氨基吡啶(0.3倍树脂担载量当量)，室温下通入氮气反应6小时。反应结束后用N，N-二甲基甲酰胺洗3次，加入二氯甲烷、乙酸酐和二乙胺后，室温反应30分钟以封闭未被酯化的羟基。抽干，用N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、MeOH分别洗涤三次，真空干燥树脂；
(2)9-芴甲氧羰基-天冬氨酸(叔丁氧基)-[天冬氨酸(叔丁氧基)]4-天冬氨酸(叔丁氧基)-O-Wang树脂的合成
1)反应前树脂的溶胀处理：准确称取上所得氨基酸树脂加入反应器中，加入10mL二氯甲烷浸泡，封闭过夜，使树脂充分溶胀，真空抽去溶剂，用N，N-二甲基甲酰胺×2洗涤1分种，抽干；
2)脱除9-芴甲氧羰基氨基保护基：方法同(1)步骤的2)；
3)洗涤：方法同(1)步骤的3)；
4)肽键的形成：称取苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(3倍过量，以树脂上氨基酸物质的量为基准，下同)、1-羟基-苯并-三氮唑(3倍过量)，磁力搅拌下加入N，N-二甲基甲酰胺溶解，再加入9-芴甲氧羰基-天冬氨酸(叔丁氧基)-OH(3倍过量)溶解，室温搅拌活化30分钟，加入到脱除Fmoc氨基保护树脂中；量取N，N-二异丙基乙胺(6倍过量)，通入氮气室温下反应，直到茚三酮检测显示反应完全为止，依次用二氯甲烷，N，N-二甲基甲酰胺洗涤。重复步骤2)和3)，直至六肽皆连接上；用N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、MeOH分别洗涤三次，真空干燥六肽树脂；
(3)天冬氨酸六肽丹参素的合成
1)反应前树脂的溶胀处理：准确称取上所得六肽树脂加入到烧瓶中，用10mL二氯甲烷浸泡过夜，使树脂充分溶胀，真空抽去溶剂，用3mLN，N-二甲基甲酰胺×2洗涤，抽干；
2)脱除9-芴甲氧羰基氨基保护基：方法同(1)步骤的2)；
3)洗涤：方法同(1)步骤的3)；
4)肽键的形成：准确称取丹参素(等量，与树脂上肽的物质的量为基准，下同)，再称取苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(等量)和1-羟基-苯并-三氮唑(等量)，经N，N-二甲基甲酰胺溶解后，一起加入到脱除9-芴甲氧羰基肽保护树脂中，量取加入N，N-二异丙基乙胺(2倍过量)，通入氮气室温下反应，用N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、MeOH分别洗涤三次，除去溶剂后，树脂直接于反应器中放置真空干燥箱中干燥；
5)脱除侧链保护及树脂：取出反应器，氮气鼓吹下，加入冰的切割剂三氟乙酸/三异丙基硅烷/水(95/2.5/2.5，V/V/V)室温下反应2小时，反应结束后，抽滤，收集滤液，用少量三氟乙酸洗树脂三次，合并滤液，加入大量无水冰乙醚，离心、洗涤三次，收集沉淀；沉淀经真空干燥，即得合成的天冬氨酸六肽丹参素产品。
4.如权利要求1所述的一种六肽丹参素的医疗用途是指该产品可作为骨靶向药物用于预防和治疗骨质疏松症。
5.如权利要求1所述的一种六肽丹参素的医疗用途是指该产品可用于预防和治疗心肌梗死，冠心病，动脉粥样硬化，高血脂，肝损伤，抗脑缺血损伤和抗肿瘤。
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