KR20180134897A - 염증성 장 질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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마크 레이머
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티모시 케안
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리젠티스 코퍼레이션
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Abstract

병든 또는 손상된 조직, 예를 들면, 염증성 장 질환, 예를 들면, 궤양성 대장염을 치료하기 위한 방법 및 조성물은 손상된 조직으로의 줄기 세포 이주를 자극하는 줄기 세포 또는 조직 이식편을 이용한 조직 재생을 포함한다. 이들 조직 이식편은 세포외 기질 (ECM) 물질, 예를 들면, 조직 특이적 세포외 기질 (TS-ECM)일 수 있다. 이들 방법은 또한, 이식편의 배치에 앞서, 손상된 또는 병든 조직의 점막 적출을 포함할 수 있다.

Description

염증성 장 질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물
본 발명은 병든 또는 손상된 조직, 예를 들면, 염증성 장 질환, 예를 들면, 궤양성 대장염을 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관계한다.
배경
염증성 장 질환 (IBD)은 833,000명의 미국인에게 영향을 주는 2가지 독립된 질환: 크론병 (CD) 및 궤양성 대장염 (UC)으로 구성된다.
CD는 소화관 (입에서부터 항문까지)을 따라서 어디든지 현성할 수 있고 종종 소화관 벽의 전체 두께에 영향을 주는 반면, UC는 결장 및 직장에 국한되고 소화관 벽의 점막층 (내부 내층)에만 영향을 준다.
심각한 부작용을 유발할 수 있는 항염증제의 이용을 포함하는 의학적 치료는 UC의 증상을 치료하는데 실패할 수 있고, 그리고 환자가 모든 다른 의학적 치료에 난치성일 때, 결장의 완전한 제거 (결장절제술)가 UC에 대한 유일하게 공지된 "치유법"이다. 결장절제술은 충분히 확립된 것이지만, 노폐물 제거를 용이하게 하기 위한 회장조루술을 종종 필요로 하는 대수술이다.
일선의 치료 (잠재적으로 유해한 부작용을 갖는 약제) 및 이선의 치료 (결장절제술)에 대한 대안이 UC를 비롯한 IBD를 치료하고 치유하는데 필요하다.
최소 침습성 외과 시술을 향한 경향은 조직 재생에 유용한 인공 골격의 발달을 촉진하였다. 정제된 콜라겐, 젤라틴, 자가 지방, 히알루론산 및 합성 물질이 요실금, 역류 질환, 후두 병리 및 신생아 심근세포의 치료를 위한 재생 약제에서 주사가능 골격으로서 임상적으로 이용되었다. 하지만, 지나치게-정제된, 화학적으로 변형된 또는 합성 물질은 호스트에 의한 불리한 면역 반응을 야기하고 기질 내로 세포 이주를 제한할 수 있다.
자연발생 세포외 기질 (ECM)-유래된 골격은 많은 생리활성 성질을 소유하고, 그리고 하부 요도관 구조, 식도, 심장 조직 및 근건 구조를 비롯한 다양한 조직의 수복에 이용되었다. 하지만, 이들 골격 중에서 다수는 비인간 조직으로부터 유래되고, 그리고 소장 조직, 예를 들면, 결장 조직의 치료 또는 재생, 구체적으로 UC의 치료에서 이용에 대해 설명된 바가 없다.
발명의 요약
본 발명은 결장절제술 없이 병든 또는 손상된 점막 조직을 대체함으로써 UC를 치료하기 위한 신규한 조직 이식편 및 방법에 관계한다.
한 구체예에서, 본 발명의 방법은 (1) 결장의 병든 또는 손상된 점막 내층 상에서 점막절제술을 임의선택적으로 수행하고, 그리고 (2) 결장의 점막 내층에 질환 또는 손상의 증상을 앓거나, 또는 이것으로 고통받는 환자에서 결장의 점막 내층을 줄기 또는 선조체 세포로 파종하거나, 또는 병든 또는 손상된 결장 조직으로의 줄기 및 선조체 세포 이주를 자극하는 단계에 의해, 손상된 또는 병든 소장 조직을 치료하는 것을 포함한다. 결장의 점막 내층의 질환은 염증성 장 질환 (IBD)일 수 있고, 그리고 상기 방법은 IBD를 치료하거나, 개선하거나 또는 치유하는데 이용될 수 있다.
따라서 본 발명은 손상된 또는 병든 결장 조직에 직접적으로 줄기 세포 또는 선조체 세포의 전달에 의한 줄기 세포 또는 선조체 세포의 파종을 포함할 수 있는데, 가령 여기서 줄기 세포 또는 선조체 세포는 이들 줄기 세포 또는 선조체 세포가 결장의 점막 내층의 재건 조직 재형성을 개시하거나 또는 자극하기 위해 결장의 내강 벽과 접촉하고 여기에 최소한 일시적으로 체류하도록, 결장의 내강 내로 주사 또는 주입에 의한 결장 조직으로 전달을 위한 유체 조성물, 예를 들면, 용액, 현탁액 또는 겔에서 제조된다. 따라서 본 발명의 방법은 손상된 또는 병든 결장 조직의 새로운, 건강한 결장 조직으로의 대체를 산출할 수 있다.
대안으로, 줄기 세포 또는 선조체 세포는 결장 내강 벽 위에 또는 상기 벽과 접촉하여, 고체 (시트 또는 튜브) 또는 유체 (용액, 현탁액 또는 겔)의 형태에서 세포외 기질 (ECM) 조성물, 예를 들면, ECM 이식편 또는 골격을 도입함으로써, 손상된 또는 병든 결장 조직의 부위로 자극될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 줄기 세포 또는 선조체 세포는 고체 또는 유체 ECM 조성물 내로 통합될 수 있고, 그리고 줄기 세포 또는 선조체 세포를 포함하는 ECM 조성물은 본원에서 설명된 바와 같은 조성물에 대해 적합한 전달 수단에 의해 결장의 점막 내층으로 전달될 수 있다. 가령, 고체 ECM이 결장 내층 위에 내시경적으로 이식될 수 있거나, 또는 유체 ECM이 결장 내로 주입되거나, 주사되거나 또는 분무될 수 있다.
손상된 결장 조직의 부위로 일단 파종되거나 또는 이주되면, 줄기 세포 또는 선조체 세포는 특수화되고, 원지에서 발달하고, 그리고 결장의 점막 내층을 대체한다. 상기 방법은 다음의 추가 단계 중에서 하나 또는 그 이상을 더욱 포함할 수 있다: (3) 회장조루술 창출, 그리고 (4) 새로운 점막층이 형성되고 병든 점막 내층을 대체하는 동안, 환자를 정맥내 영양공급하여 소화관을 우회함으로써 환자에게 완전 비경구 영양 (TPN)을 제공.
본 발명의 방법의 일부로서 이용될 때, 이식편의 주입, 이식 또는 투여에 앞서, 병든 또는 손상된 조직을 제거하는 점막절제술 단계는 조직 적출 또는 제거에 의해 실행될 수 있다.
적출 또는 제거 방법은 내시경 또는 외과적 점막 적출 (절제), 내시경 레이저 요법, 광역학 요법, 아르곤 혈장 응고를 이용한 내시경 열응고, 고주파 제거, 동결절제, 또는 EDTA 또는 다른 제거 작용제의 이용을 포함한다. 이들 점막절제술 시술은 당해 분야에서 충분히 문서화된다. 상기 기술 또는 시술 중에서 한 가지 또는 그 이상이 적출 또는 제거 단계가 이용되는 본 발명의 방법에서 이용될 수 있다.
본 발명은 치료되는 동일한 조직으로부터 유래된 조직 이식편, 예를 들면, 세포외 기질 (ECM) 골격을 이용한, 질환- 또는 외상-손상된 조직의 치료를 위한 방법 및 조성물을 더욱 포함한다. 치료되는 조직과 동일한 조직으로부터 유래된 ECM을 포함하는 조직 이식편은 본원에서 "조직 특이적 세포외 기질" (TS-ECM)로서 지칭된다.
바람직한 TS-ECM은 동일한 조직 유형 (다시 말하면, 결장 조직 치료를 위한 결장-유래된 ECM)으로부터 유래될 뿐만 아니라, 치료되는 종과 동일한 종으로부터 유래된다. 가령, 인간에서 UC의 치료는 인간 결장 점막 조직을 TS-ECM 골격 조성물로서 이용할 것이다. 조직 이식편은 동종이식편 또는 이종이식편일 수 있다. 자극 및 정보의 상호 교환 (당해 분야에서 "동적 의존"으로서 공지되고 지칭됨)이 ECM 및 세포 사이에 존재할 수 있고, ECM 이식편을 이용하는데 대한 이점을 제공한다. 이러한 동적 의존은 TS-ECM 이식편의 이용에 의해 조장되거나 또는 향상될 수 있다.
따라서 본 발명은 병든 또는 손상된 대장 조직의 대체를 위한 대장 조직으로부터 유래된 조직 이식편 조성물을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 대장 조직으로부터 유래된 ECM은 바람직하게는 결장 점막층을 포함할 수 있고, 그리고 치료된 대장 또는 결장 조직은 바람직하게는 결장 점막층일 수 있다.
한 구체예에서, 조직 이식편 조성물은 결장 점막층 위에 배치되거나 또는 고정될 수 있는 고체 시트 또는 튜브로서 형성된 ECM 골격일 수 있다. 고체 시트 또는 튜브 골격은 봉합선, 스테이플, 스텐트 또는 클립을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 기계적 또는 외과적 수단에 의해 환자에서 원하는 부위에서 주입되거나 또는 이식될 수 있고, 또는 당해 분야에서 인식되는 바와 같이, 부착되거나, 적용되거나 또는 부가될 수 있고, 또는 허용되는 접착제, 예를 들면, 생체결합제를 비롯한 제약학적으로 허용되는 또는 치료적으로 허용되는 접착제에 의해 점막층에 부착될 수 있다. ECM 조성물을 결장에 전달하기 위한 한 가지 바람직한 절차는 내시경을 이용할 수 있는데, 이것은 유리하게는, 침습성 외과 시술을 최소화할 수 있다.
대안으로, ECM은 분말화되거나 또는 소화될 수 있고, 그리고 유체, 예를 들면, 겔, 용액 또는 현탁액의 형태에서 제공을 위해 가용화되거나 또는 현탁될 수 있다. 유체 조성물은 유리하게는, 겔, 용액 또는 현탁액을 치료되는 부위에 주사하거나, 주입하거나, 분무하거나 또는 기타 유사한 것에 의해 투여될 수 있다. 가령, 유동화된 ECM은 예로서, 관장 요법으로서 결장의 내강 내로 주사되거나, 주입되거나 또는 분무됨으로써 투여되거나 또는 적용될 수 있는데, 여기서 유체 ECM은 결장의 점막 내층을 코팅하거나, 또는 점막절제된 결장의 경우에, 결장의 노출된 내강 벽을 코팅한다. 이런 투여는 생존가능한 또는 건강한 조직의 허용되는 재성장 또는 대체를 모니터링하는 치료 의사에 의해 결정될 때, 필요에 따라 수 일, 수 주 또는 수 개월에서 약 1 년까지의 기간 동안 하루 1회 또는 그 이상을 비롯하여 수회 반복될 수 있다.
유동화된 ECM의 분무가능한 겔, 용액 또는 현탁액의 한 가지 바람직한 구체예는 분무함으로써 투여용 조성물을 에어로졸화하는 것이다. 에어로졸화된 스프레이는 이런 유동화된 ECM을 원하는 부위 또는 위치로 전달하도록 제조된 또는 변형된 내시경에서 또는 이런 내시경과 함께 제공된 삽관 또는 다른 도관을 통해, 공급원 저장소로부터 펌핑될 수 있다.
유리하게는, 줄기 세포 또는 선조체 세포는 ECM 배치 또는 투여의 부위로 이주하는 것으로 알려져 있고, 그리고 시간의 추이에서, 조직을 이들 세포 또는 조직의 정상적인 성질과 기능을 갖는 건강한 또는 비-증후성 세포와 조직으로 대체할 수 있다. 따라서 본 발명의 조성물의 대안적 구체예는 단독으로, 고체 ECM 튜브 또는 시트 골격; 줄기 또는 선조체 세포로 코팅되거나 또는 임베드된 고체 ECM 골격; 단독으로, 유동화된 ECM (가령, 겔), 또는 고체 또는 유체 ECM으로 코팅된, 임베드된 또는 혼합된 줄기 또는 선조체 세포가 있거나 또는 없이, 유동화된 ECM을 부가적으로 포함하는 고체 ECM 골격을 포함한다.
ECM 조성물은 자연 조직으로부터 부분적으로 유래되고 합성 또는 자연 중합체와 혼합되거나 또는 조합되는 하이브리드일 수 있는 것으로 또한 이해될 것이다. 생물분해성 중합체가 합성 또는 자연 중합체를 포함하는 본 발명의 ECM 조성물에서 이용되는 것이 바람직하지만, 반드시 그러할 필요는 없다.
본 발명의 다른 구체예에서, 예로서, 고체 시트 또는 튜브 ECM 조성물은 3차원 (3-D) 프린터 기술의 이용에 의해 형성되거나 또는 생산될 수 있다.
조성물은 ECM에서 특정한 원하는 성질을 달성하기 위한 첨가제를 더욱 포함할 수 있다. 가령, ECM 조성물은 첨가된 약물 또는 생물제제의 원하는 활성을 제공하는 하나 또는 그 이상의 약물 또는 생물제제, 예를 들면, 항균제, 항염증제, 면역억제제, 단일클론 항체, 성장 인자 또는 기타 유사한 것을 포함할 수 있다. 이들 첨가제는 국부 환경이 우호적인 조직 재형성에 도움이 되도록 만들 수 있다. 조성물에 대한 다른 첨가제는 예로서, 점성 증강제, 또는 겔의 형성을 개시하거나 또는 지연시킬 수 있는 작용제를 포함할 수 있다. 당해 분야에서, 더욱 높은 점성의 겔은 겔의 향상된 부착 및 강인성 성질을 제공할 수 있는 것으로 일반적으로 인정된다. 따라서 점성 증강제가 또한, 표적 조직에 부착을 조장하는데 역할을 할 수 있다. 접착성 촉진자는 당해 분야에서 널리 공지되지만, 혈액 성분, 예를 들면, 혈액 혈액응고제 또는 혈액 응고 인자를 점성 증강제 또는 부착 증강제로서 더욱 포함할 수 있다.
사전 적출 또는 제거 없이, 본원에서 설명된 바와 같은 ECM 이식편 또는 골격을 이용하여 병든 또는 손상된 결장 조직을 치료하기 위한 방법 역시 본 발명의 일부로서 포함된다. 가령, 조직에 대한 질환 또는 손상이 병변 또는 조직 손상, 예를 들면, 조직의 노출된 또는 출혈 표면을 창출하는 사례에서, ECM 골격 또는 이식편 조성물의 주입, 이식, 적용 또는 투여에 앞서, 조직의 적출이 배제될 수 있다. 따라서 본 방법의 한 구체예는 다음의 단계를 포함한다:
a) 장, 생식기, 외피, 췌장, 신장, 순환기 및 호흡기 조직에서 선택되는 조직을 이용한 ECM 골격, 이식편 또는 조성물의 제조 단계, 그리고
b) 하부 장관 조직에 영향을 주는 질환 또는 장애로 고통받는 환자에서, 또는 장관 조직에 영향을 주는 질환, 손상 또는 장애로 고통받는 환자에서 조직 위에 ECM 이식편 또는 골격 조성물을 주입하거나, 이식하거나, 적용하거나 또는 투여하는 단계, 여기서 장관 조직은 ECM 조성물의 주입, 이식, 적용 또는 투여에 앞서, 적출 또는 제거에 종속되지 않는다.
바람직한 구체예에서, 이러한 방법은 IBD, 예를 들면, 궤양성 대장염 또는 크론병; 가족성 샘종 폴립증; 히르쉬스프룽; 협착; 직장염; 결장암; 직장 점막염 또는 누공을 전시하는 손상된 또는 병든 결장 조직을 치료하고, 그리고 더욱 바람직하게는, 결장 점막층 조직에 대한 질환 또는 손상을 치료하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 구체예는 사전 적출 또는 제거가 있거나 또는 없이, 본원에서 설명된 바와 같은 조직 특이적 ECM (TS-ECM) 골격을 이용하여 병든 또는 손상된 조직을 치료하기 위한 방법이다. 따라서 본 방법의 한 구체예는 다음의 단계를 포함한다:
a. 손상된 또는 병든 조직 상에서 점막절제술을 임의선택적으로 수행하는 단계;
b. 장, 생식기 (질 이외에), 외피, 췌장, 신장, 순환기 및 호흡기 조직에서 선택되는 조직을 이용하여 TS-ECM 이식편 또는 골격 조성물을 제조하는 단계, 그리고
c. 동일한 장관, 생식기 (질 이외에), 외피, 췌장, 신장, 순환기 및 호흡기 조직에 영향을 주는 질환 또는 장애로 고통받는 환자에서 조직 위에 TS-ECM 골격 또는 조성물을 주입하거나, 이식하거나 또는 투여하는 단계.
본 발명의 ECM 또는 TS-ECM 이식편, 골격 또는 조성물은 줄기 세포, 또는 ECM 겔, 용액 또는 현탁액이 분산될 수 있는 생체적합성 다공성, 거대다공성 또는 미소다공성 기질일 수 있는 것으로 이해될 것이다. 이에 더하여, 본 발명의 ECM 또는 TS-ECM은 겔화될 수 있다.
이식편으로서 이용되는 세포 성장 기질 또는 골격으로서 유용한 튜브, 시트 및 겔화된, 가용화된 ECM 조성물을 제조하기 위한 방법은 당해 분야에서 설명된다. 겔 ECM 조성물은 주입에 앞서 성형될 수 있거나, 또는 겔화에 앞서 비-겔화된 형태로 환자에게 투여될 수 있는데, 여기서 상기 조성물은 원지에서 겔화된다. ECM 이식편을 형성하는 이런 저런 방법은 예로서, US 특허 번호 8,361,503에서 설명되는데, 이것은 전체적으로 참조로서 편입된다.
바람직한 구체예에서, 겔 ECM 조성물은 설명된 바와 같은 하나 또는 그 이상의 과정에 따라서 제조된다. 가령, 겔 ECM은 다음의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다:
i) 고체 형태에서 ECM을 분쇄하는 단계,
ii) 산성 용액에서 산 프로테아제로 소화에 의해 무손상, 비-투석된 또는 비교차-연결된 ECM을 가용화시켜 소화 용액을 생산하는 단계,
iii) 소화 용액의 pH를 7.2 및 7.8 사이의 pH로 조정하여 중화된 소화 용액을 생산하는 단계, 그리고
iv) 상기 용액을 25 ℃보다 큰 온도에서 겔화하는 단계.
한 구체예에서, ECM 조성물의 제조는 단계 (ii)에 의해 생산된 가용화된 ECM의 추가 처리를 포함할 수 있는데, 여기서 상기 가용화된 ECM은 건조되거나 또는 동결건조되어, 액체 형태에서 가용화된 ECM보다 더욱 긴 기간 동안 보관될 수 있는 건성 분말을 형성한다. 건성 분말 ECM은 이후, 수성 용액 또는 완충액에서 재구성되고 상기 단계 (iii)에서처럼 중성 pH가 될 수 있다.
다른 구체예에서, ECM 이식편 또는 골격 조성물을 제조하는 방법은 골격을 초음파처리하는 것을 더욱 포함한다. 본 발명의 추가 방법은 TS-ECM 골격을 환자의 조직에 부착하는 것을 포함하는데, 여기서 골격의 표면은 환자의 세포, 예를 들면, 줄기 세포로 임베드된 또는 코팅된 겔화된 가용화된 ECM을 포함하고, 여기서 임베드된 또는 코팅된 세포는 조직에 골격을 주입하거나, 이식하거나 또는 투여하기에 앞서, 골격 내로 환자의 세포의 내성장을 위한 충분한 시간이 허용된다.
본 발명의 방법을 실행할 때, 골격 또는 이식편은 본원에서 설명된 바와 같이, 또는 ECM을 제조하는 다른 공지된 방법에 의해 제조되고, 이후 병든 또는 손상된 조직의 최소한 일부에 주입되거나, 이식되거나 또는 투여되고, 그리고 대체 세포가 성장하고 병든 또는 손상된 세포를 대체할 만큼 충분한 기간 동안 병든 또는 손상된 조직과 접촉한 상태로 남아있도록 허용된다. 충분한 기간은 1 일 내지 약 6 개월일 수 있다.
유리하게는, ECM 이식편의 주입, 이식 또는 투여는 ECM 이식편의 주입, 이식 또는 투여의 부위로 줄기 세포의 이주를 위한 자극을 제공한다. 가령, UC를 치료할 때, ECM 이식편은 결장의 최소한 일부와 접촉한 상태로 주입되거나, 이식되거나 또는 투여되고, 여기서 병든 또는 손상된 결장 점막층은 결장 점막 세포의 성장 및 대체를 허용하고 병든 또는 손상된 세포의 건강한 세포로의 대체를 유발하는 기간 동안 점막층과 접촉한 상태로 유지되었거나 (점막절제술후의 경우에) 또는 유지된다 (점막절제술이 미리 실행되지 않은 경우에). ECM 이식편은 대략 1-10 센티미터의 상대적으로 짧은 고체 분절로서 제공되고, 결장의 내벽에 부수적으로 또는 순차적으로 주입되거나, 이식되거나 또는 투여될 수 있다. 대안으로, 전체 결장에 상응하는 복수의 섹션 또는 길이를 갖는 ECM 이식편이 제조될 수 있다.
세포외 기질 (ECM), 또는 세포외 기질 하이드로겔 (ECMH, 다시 말하면, 액체 또는 유체, 겔화가능한 형태에서 ECM)은 또한, 방사선 또는 화학요법을 겪는 환자에서 나타날 수 있는, 자가면역 관련되지 않은 질환 또는 장애, 예를 들면, 직장 점막염의 치료 또는 예방에서 유용할 수 있다. 가령, ECMH 요법, 예를 들면, 방사선 또는 화학요법 치료 이전에 관장에 의해 ECMH를 투여하는 것이 시작되고, 그리고 이런 방사선 또는 화학요법의 코스 전역에서 ECMH 투여를 계속하는 것은 환자에서 직장 점막염의 발병을 예방할 수 있다.
ECMH 투여는 환자의 요구 및 의사 또는 다른 간병인에 의한 결정에 의존하는 상이한 투여 섭생을 이용하여 실행될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 가령, ECMH 투여는 방사선 또는 화학요법이 시작된 이후에 시작될 수 있는데, 여기서 의사 또는 간병인은 ECMH 투여에 대한 요구를 모니터링하고, 그리고 이런 ECMH 요법이 필요한 직장 점막층의 상태를 평가할 수 있다.
ECMH를 투여하기 위한 투약 섭생은 또한, 환자의 요구 및 상태에 의존할 수 있다. 가령, 환자는 하루 1회 또는 그 이상, 예를 들면, 하루 4회까지 ECMH 투여를 제공받을 수 있거나, 또는 ECMH를 이용한 일일 관장을 제공받을 수 있다. 대안으로, 환자는 주 1회 내지 5회, 바람직하게는 주 3회 내지 5회, 2 일마다 또는 3 일마다 ECMH 투여를 제공받을 수 있다. 상기 요법 또는 투약 섭생은 주치의 또는 전문가에 의해 결정될 때, 약 8-12 주까지, 또는 그 이상 동안 환자에게 제공될 수 있다.
도면의 간단한 설명
도면 1은 본원에서 설명된 바와 같은 소장 점막하층 세포외 기질 (SIS-ECM)로 치료된 개로부터 제거된 결장 섹션 (아래쪽 사진)의 결과를 보여준다; 현미경사진 (위쪽 사진 A-D)은 원위 → 근위 구배를 따라서 증가된 점막 피복을 도해하는, 결장 섹션의 상기 구배를 따라서 현미경적 세포 검사 결과를 보여준다, 다시 말하면, 불완전 점막 피복이 원위 문합술 (A)에서 목격되고, 그리고 증가하는 점막 피복이 근위 단부 (B), (C) 및 (D) 방향으로 존재한다.
도면 2는 실시예 3에서 설명된 바와 같은 쥐 연구 설계 및 계측의 계통도를 보여준다.
도면 3은 실시예 3에서 설명된 쥐 연구에 대한 기준 결정의 표를 보여준다: 표 1은 임상적 증상 채점을 위한 기준을 보여준다; 표 2는 결장 검체의 육안 해부학적 채점을 위한 기준을 보여준다; 그리고 표 3은 결장 검체의 조직학적 채점을 위한 기준을 보여준다.
도면 4는 이용된 DSS 모형, 다시 말하면, 식수에서 5% DSS를 이용한 질환 상태의 유도의 검증을 뒷받침하는 데이터를 보여준다. 도면 4A는 체중 감소/하루의 그래프이다; 도면 4B는 하루에 혈변 점수의 그래프이다; 도면 3C는 하루에 대변 굳기의 그래프이다; 도면 4D는 비-DSS 처리된 쥐와 대비하여 DSS-처리된 쥐의 결장 길이의 그래프이다; 그리고 도면 4E는 비-DSS-처리된 쥐와 대비하여 DSS-처리된 쥐에 대한 TRITC 농도의 그래프이다.
도면 5는 실시예 3에서 설명된 바와 같은 쥐 결장에 대한 조직학 결과를 보여주고, ECMH 치료가 조직학 점수를 낮춘다는 것을 도해한다: 도면 5A - 5D는 운반제-처리된 허위 대조 쥐 또는 건강한 쥐와 대비하여 ECMH-처리된 쥐에서 원위와 근위 결장 섹션에 대한 염증 점수를 보여준다; 도면 5E - 5H는 운반제-처리된 허위 대조 쥐 또는 건강한 쥐와 대비하여 ECMH-처리된 쥐에서 원위와 근위 결장 섹션에 대한 궤양화 점수를 보여준다.
도면 6은 결장 점막층의 조직 재생을 보여주고, 운반제 허위 대조 또는 건강한 쥐와 대비하여 ECMH-처리된 쥐로부터 결장에서 궤양화 및 염증을 도해한다.
도면 7은 질환 결과의 임상적 증상을 보여주고, ECMH 치료가 질환 활동성을 감소시킨다는 것을 도해한다: 도면 7A는 하루에 체중 점수를 보여준다; 도면 7B는 하루에 혈변 점수를 보여준다; 도면 7C는 하루에 대변 굳기 점수를 보여준다; 도면 7D는 운반제-처리된 허위 쥐 및 건강한 쥐의 결장과 대비하여 ECMH-처리된 쥐에서 결장 길이를 보여준다; 그리고 도면 7E는 운반제-처리된 허위 쥐 결장과 대비하여 ECMH-처리된 쥐 결장에서 질환 상태의 육안적 점수의 그래프를 보여준다.
도면 8은 ECMH 치료가 운반제-처리된 허위 쥐 및 건강한 (처리되지 않은) 쥐와 대비하여 ECMH-처리된 쥐에서 TNFα+ 대식세포를 감소시킨다는 것을 도해하는 그래픽 표현이다.
도면 9는 운반제-처리된 쥐 및 건강한 (처리되지 않은) 쥐와 대비하여 ECMH-처리된 쥐에서 대식세포의 총수의 그래프를 보여준다.
도면 10은 ECMH-처리된 쥐 대(vs.) 운반제-처리된 허위 쥐 대(vs.) 건강한 쥐로부터 대식세포 표현형 마커에 대해 면역표지화된 조직 섹션으로부터 대표적인 이미지를 보여준다.
도면 11은 염증 척도의 그래픽 표현을 보여주고, ECMH가 염증을 매개한다는 것을 도해한다. 도면 11A는 운반제-처리된 및 NT (처리되지 않음)와 대비하여 ECMH-처리된 고유판 단핵 세포 (LPMC) 분비된 TNFα 농도를 보여준다; 도면 11B는 운반제-처리된 및 NT와 대비하여 ECMH-처리된 LPMC 분비된 PGE2 농도를 보여준다; 그리고 도면 11C는 운반제-처리된 쥐 및 건강한 쥐와 대비하여 ECMH-처리된 쥐의 결장으로부터 기관형적 배양액으로부터 분비된 PGE2 수준을 보여준다.
도면 12는 ECMH의 점막부착성을 그래픽 및 사진으로 보여주는데, 여기서: 도면 12A는 4 mg/ml, 8 mg/ml 및 12 mg/ml 농도의 ECMH와 대비하여 펩신-처리된 쥐 결장에서 인장 부착 강도의 그래프이다; 도면 12B는 병든 쥐 결장과 대비하여 건강한 쥐 결장에서 인장 강도의 그래프를 보여준다; 도면 12C는 14C-표지화된 ECMH의 투여 이후에 2 시간, 12 시간 및 24 시간에서 남아있는 ECMH 퍼센트를 보여준다; 도면 12D는 ECMH의 투여 이후에 1 시간, 2 시간, 12 시간 및 24 시간에서 결장 내에 존재하는 FITC-표지화된 ECMH의 사진 표현이다.
도면 13은 장벽 기능이 ECMH 투여에 의해 복원된다는 것을 보여준다: 도면 13A는 운반제-처리된 허위 쥐 및 건강한 쥐와 대비하여 ECMH-처리된 쥐에서 TRITC 농도의 그래픽 표현이다; 도면 13B는 LPS+ECMH-처리된 세포 배양액, LPS-단독 처리된 세포 배양액 및 NT 세포 배양액과 대비하여 ECMH-처리된 세포 배양액에서 TEER에서 상대적 변화의 그래픽 표현이다; 도면 13C는 LPS-단독 처리된 쥐 및 NT 쥐와 대비하여 LPS+ECMH-처리된 쥐에서 E-cad 세포 퍼센트의 그래픽 표현이다; 그리고 도면 13D는 건강한 세포 배양액 대(vs.) LPS-손상된 세포 배양액 대(vs.) LPS+ECMH 처리된 세포 배양액에서 세포의 사진 표현을 보여준다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 결장절제술 없이 병든 또는 손상된 점막 세포와 조직을 대체하거나 또는 이들의 대체를 자극함으로써, 염증성 장 질환 (IBD), 예를 들면, 궤양성 대장염 (UC) 또는 크론병 (CD) 또는 기타 유사한 것을 치료하는 것에 관계한다.
한 구체예에서, 본 발명의 방법은 (1) 결장의 병든 또는 손상된 점막 내층 상에서 점막절제술을 임의선택적으로 수행하고, 그리고 (2) 결장의 점막 내층에 질환 또는 손상의 증상을 앓거나, 또는 이것으로 고통받는 환자에서 결장의 점막 내층을 줄기 또는 선조체 세포로 파종하거나, 또는 병든 또는 손상된 결장 조직으로의 줄기 및 선조체 세포 이주를 자극하는 단계에 의해, 손상된 또는 병든 소장 조직을 치료하는 것을 포함한다. 결장의 점막 내층의 질환은 염증성 장 질환 (IBD)일 수 있고, 그리고 상기 방법은 IBD를 치료하거나, 개선하거나 또는 치유하는데 이용될 수 있다.
따라서 본 발명은 손상된 또는 병든 결장 조직에 직접적으로 줄기 세포 또는 선조체 세포의 전달에 의한 줄기 세포 또는 선조체 세포의 파종을 포함할 수 있는데, 가령 여기서 줄기 세포 또는 선조체 세포는 이들 줄기 세포 또는 선조체 세포가 결장의 점막 내층의 재건 조직 재형성을 개시하거나 또는 자극하기 위해 결장의 내강 벽과 접촉하고 여기에 최소한 일시적으로 체류하도록, 결장의 내강 내로 주사 또는 주입에 의한 결장 조직으로 전달을 위한 유체 조성물, 예를 들면, 용액, 현탁액 또는 겔에서 제조된다. 따라서 본 발명의 방법은 손상된 또는 병든 결장 조직의 새로운, 건강한 결장 조직으로의 대체를 산출할 수 있다.
대안으로, 줄기 세포 또는 선조체 세포는 결장 내강 벽 위에 또는 상기 벽과 접촉하여, 고체 (시트 또는 튜브) 또는 유체 (용액, 현탁액 또는 겔)의 형태에서 세포외 기질 (ECM) 조성물, 예를 들면, ECM 이식편 또는 골격을 도입함으로써, 손상된 또는 병든 결장 조직의 부위로 자극될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 줄기 세포 또는 선조체 세포는 고체 또는 유체 ECM 조성물 내로 통합될 수 있고, 그리고 줄기 세포 또는 선조체 세포를 포함하는 ECM 조성물은 본원에서 설명된 바와 같은 조성물에 대해 적합한 전달 수단에 의해 결장의 점막 내층으로 전달될 수 있다. 가령, 고체 ECM이 결장 내층 위에 내시경적으로 이식될 수 있거나, 또는 유체 ECM이 결장 내로 주입되거나, 주사되거나 또는 분무될 수 있다.
설계에 의해, ECM은 원지에서 신속하게 부서지고, 그리고 염증 부위로 대식세포의 이주를 비롯한 염증 반응을 고무할 수 있다. ECM의 한 가지 독특한 특징은 유형 M1 (친염증성, 예를 들면, UC로 고통받는 환자에서 목격될 것이다)로부터 유형 M2 (친조직 재형성, 예를 들면, 근원적인 친염증성 질환이 없는 개체에서 목격될 것이다)로, 이들 대식세포의 표현형에서 스위치를 고무하는 것이다. 이러한 M1에서 M2 표현형 스위치의 중요한 영향은 만약 그렇지 않으면, 염증의 성향이 있는 조직이 건강한 상태로 남아있도록 허용하는 것이다.
이식편의 주입, 이식 또는 투여에 앞서, 병든 또는 손상된 조직, 예를 들면, 결장 점막 조직을 제거하기 위해 실행되는 임의선택적 점막절제술 단계는 임의의 통상적으로 인정되는 방법, 예를 들면, 조직 적출 또는 제거를 이용하여 수행될 수 있다. 공지된 적출 또는 제거 방법은 내시경 또는 외과적 점막 적출 (절제), 내시경 레이저 요법, 광역학 요법, 아르곤 혈장 응고를 이용한 내시경 열응고, 냉동요법, 고주파 제거, 또는 EDTA 또는 다른 제거 작용제를 이용한 제거를 포함한다.
점막절제된 조직을 줄기 또는 선조체 세포로 파종하는 것은 의학적 문헌에서 설명된 바와 같이, 공지된 방법, 예를 들면, 부위에서 줄기 세포의 주사에 의해 실행될 수 있다. 가령, Lanzoni, G., Inflammatory bowel disease: Moving toward a stem cell-based therapy, World J Gastroenterol. 14(29): 4616-4626 (August 7, 2008)을 참조하는데, 이것은 IBD를 치료하는데 있어서 조혈 및 중간엽 줄기 세포의 이용을 요약하지만, 사전 점막절제술을 교시하거나 또는 암시하지 않는다.
바람직하게는, 줄기 세포는 부위에서 ECM 골격 또는 이식편으로서 세포외 기질 (ECM) 물질 또는 조성물을 배치하고 및/또는 확보함으로써, 예를 들면, 주입하거나, 이식하거나 또는 투여함으로써, 점막절제된 조직에 도입될 수 있다. 점막절제된 부위에 ECM 조성물의 도입은 고체 시트 또는 튜브의 형태일 수 있거나, 또는 유체, 예를 들면, 용액, 현탁액 또는 겔의 형태일 수 있다. 고체 ECM 물질의 배치 또는 확보는 봉합선, 클립, 스테이플, 접착제, 또는 널리 공지된 바와 같은 다른 확보 수단에 의할 수 있다.
대안으로, 유동화된 ECM은 통상적으로 이용되는 유체 투여 또는 전달 과정, 예를 들면, 주사, 주입 또는 드렌치 (부위 위에 "분출")에 의해, 또는 유체를 부위 위에 분무함으로써 투여될 수 있다. 바람직한 분무 기술은 예로서, 내시경적으로 전달된 에어로졸화된 ECM 유체를 이용하여 실행된다.
본원에서 이용된 바와 같이, ECM을 지칭할 때, 용어 "조성물," "물질," "골격" 및 "이식편"은 교체가능하게 이용될 수 있고, 그리고 특정 형상, 예를 들면, 고체, 액체, 유체 또는 다른 형태를 함축하지 않는다. 가령, "ECM 골격"은 고체 또는 유체일 수 있다.
바람직하게는, 유동화된 ECM 조성물은 이것이 점성 성질을 갖도록 겔로서 형성되고, 그리고 유체가 신체 내에서 원하는 위치에 자가-부착할 만큼 충분한 점성을 갖는다. 바람직한 구체예에서, 유동화된 ECM은 적용되거나 또는 투여될 때 상대적으로 비-점성 액체 성질을 갖는 하이드로겔인데, 이것은 유리하게는 농화되거나 또는 더욱 점성이 되어, 투여 또는 적용 부위에서 신체와의 접촉 시에 또는 직후에 접착성 겔을 형성한다. 겔화는 투여 이후에, 증가된 온도, 예를 들면, 신체 열에 의해 시작될 수 있다. 유체 ECM은 또한, 충분한 점성을 제공하기 위해 별개의 점성 작용제, 예를 들면, 하이드로겔 또는 다른 통상적으로 공지된 겔화제와 혼합될 수 있다. 대안으로, 2개의 유체가 투여될 수 있는데, 여기서 이들 유체 중에서 최소한 하나는 ECM 물질을 내포하고, 그리고 여기서 이들 2개의 유체는 서로 접촉될 때 또는 혼합될 때 겔화된다.
ECM 조성물은 줄기 세포가 조직의 충분한 혈관화가 존재하는 부위로 이주하도록 유발할 수 있고, 그리고 혈관은 이들 세포가 상기 부위로 이주하기 위한 적합한 도관을 제공하는 것으로 충분히 확립되어 있다. 이에 더하여, ECM은 화학적 신호전달을 통해 인접한 또는 기초 조직과 통신하고, 그리고 인접한 또는 기초 조직은 "동적 의존"으로 명명된 현상에 의해 ECM과 통신하는데, 이것은 ECM이 이용되는 세포와 조직 대체 또는 재생을 최적화한다. 따라서 ECM 조성물은 배치, 투여 또는 적용의 부위에서 새로운 세포와 조직 성장을 위한 고체, 액체 또는 겔 골격으로서 역할을 할 수 있다.
추가 구체예에서, ECM-유래된 조성물은 조직 이식편일 수 있는데, 여기서 ECM 조성물은 이식물의 부위에서 조직의 새로운 성장을 증진하기 위한 골격으로서 역할을 한다. 골격은 원하는 부위에서 배치된 ECM 튜브 또는 시트일 수 있다. 골격은 생체적합성 다공성, 거대다공성 또는 미소다공성 기질일 수 있는데, 여기서 줄기 세포, 또는 ECM 겔, 용액 또는 현탁액이 분산될 수 있다. ECM은 또한, 줄기 세포, 또는 ECM 용액 또는 현탁액의 분산 이후에, 차후 겔화될 수 있다.
한 구체예에서, ECM은 당해 분야에서 통상적으로 이용되는 조직으로부터 유래될 수 있다. 가령, ECM은 소장 점막하층 (SIS) 또는 방광 기질 (UBM) 조직으로부터 유래되었다. UBM을 이용한 한 가지 바람직한 구체예는 상피 기저막 층이 없는 UBM 조직이다.
더욱 바람직한 구체예에서, "조직 특이적 세포외 기질" 또는 "TS-ECM"으로서 지칭되는, 치료되는 조직과 동일한 조직 유형으로부터 유래된 ECM은 동적 의존을 통해 일어날 수 있는 유리한 결과, 예를 들면, 더욱 효율적인 또는 더욱 반응성 재건 조직 재형성을 제공할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
따라서 본 발명은 TS-ECM 이식편을 이용하여, 질환- 또는 외상-손상된 하부 장관, 생식기 (질 이외에), 외피, 췌장, 신장, 순환기 또는 호흡기 조직의 치료를 위한 방법 및 조성물을 더욱 포함한다. 한 구체예에서, TS-ECM은 치료되는 종과 동일한 종으로부터 유래된다. 가령, 인간에서 UC의 치료는 인간 결장 점막 조직을 TS-ECM 골격 조성물로서 이용할 것이다. 조직 이식편은 자가이식편, 앞서 설명된 바와 같은 동종이식편, 또는 이종이식편일 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 병든 또는 손상된 대장 조직의 대체를 위한 대장 조직으로부터 유래된 조직 이식편 조성물을 포함하는 이용 방법 및 조성물을 포함한다. 유래된 대장 조직 또는 처리된 대장 조직은 결장 조직일 수 있고, 그리고 바람직하게는 결장 점막층일 수 있다.
유리하게는, 예로서 IBD, 예를 들면, CD 또는 UC로 고통받는 환자에서 결장 조직에 의해 전시되는 아물지 않는 병변 또는 출혈 병변을 유발하는 조직 질환, 손상 또는 장애에서 치료 또는 치유는 점막 적출 또는 제거의 사전 단계 없이 TS-ECM의 주입, 이식 또는 투여를 포함하는 방법에 의해 달성될 수 있는 것으로 예기된다. 따라서 조직에 대한 질환 또는 손상이 조직의 병변, 예를 들면, 노출된 또는 출혈 표면을 창출하는 경우에, 치료에 앞서 조직의 적출이 배제될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 주입하는 또는 주입, 이식하는 또는 이식, 적용하는 또는 적용, 투여하는 또는 투여, 주입하는 또는 주입, 주사하는 또는 주사, 전달하는 또는 전달은 모두, ECM을 치료 부위에 제공하는 과정을 지칭하고, 그리고 조성물 성질 및 상기 부위에 ECM의 전달을 실행하는데 이용된 절차에 따라, 동일한 의미를 갖는 것으로 당업자에 의해 이해될 것이다. 이들 용어는 교체가능하게 이용될 수 있고 본 발명의 방법을 결코 한정하지 않는다.
따라서 본 방법의 한 구체예는 다음의 단계를 포함한다:
하부 장관, 생식기 (질 이외에), 외피, 췌장, 신장, 순환기 및 호흡기 조직에서 선택되는 조직을 이용한 TS-ECM 골격의 제조 단계, 그리고
동일한 하부 장관, 생식기 (질 이외에), 외피, 췌장, 신장, 하부 장관, 순환기 및 호흡기 조직에 영향을 주는 질환 또는 장애로 고통받는 환자에서 조직 위에 TS-ECM 골격을 주입하거나, 이식하거나 또는 투여하는 단계.
임의선택적으로, 결장을 치료할 때, 상기 방법은 다음의 추가 단계 중에서 하나 또는 그 이상을 더욱 포함할 수 있다: (3) 회장조루술 창출, 그리고 (4) 새로운 점막층이 형성되는 동안, 환자를 정맥내 영양공급함으로써 환자에게 완전 비경구 영양 (TPN)을 제공.
바람직한 구체예에서, 이러한 방법은 손상된 또는 병든 결장 조직을 치료하는 것을 포함한다. 상기 방법은 예로서, 크론병, 궤양성 대장염, 가족성 샘종 폴립증, 히르쉬스프룽, 협착, 직장염, 직장 점막염 또는 누공으로부터 발생하는 결장 조직의 손상 또는 질환을 치료하고, 그리고 더욱 바람직하게는, 결장 점막층 조직에 대한 질환 또는 손상을 치료하는데 이용될 수 있다.
세포 성장 골격으로서 유용한 튜브, 시트 및 겔화된, 가용화된 ECM 조성물을 제조하기 위한 방법은 당해 분야에서 설명된다. 겔 ECM 조성물은 주입에 앞서 성형될 수 있거나, 또는 겔화에 앞서 비-겔화된 형태로 환자에게 투여될 수 있는데, 여기서 상기 조성물은 원지에서 겔화된다.
ECM 이식편을 형성하는 이런 저런 방법은 예로서, US 특허 번호 8,361,503에서 설명되는데, 이것은 전체적으로 참조로서 편입된다. 바람직한 구체예에서, 겔 ECM 조성물은 설명된 바와 같은 하나 또는 그 이상의 과정에 따라서 제조된다. 가령, 겔 ECM은 다음의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다:
i) ECM을 분쇄하는 단계,
ii) 산성 용액에서 산 프로테아제로 소화에 의해 무손상, 비-투석된 또는 비교차-연결된 ECM을 가용화시켜 소화 용액을 생산하는 단계,
iii) 소화 용액의 pH를 7.2 및 7.8 사이의 pH로 조정하여 중화된 소화 용액을 생산하는 단계, 그리고
iv) 상기 용액을 25 ℃보다 큰 온도에서 겔화하는 단계.
다른 구체예에서, ECM 골격을 제조하는 방법은 골격을 초음파처리하는 것을 더욱 포함한다. 또 다른 구체예에서, 단계 (ii)에서 분쇄된 ECM의 가용화 이후에, 가용화된 ECM은 분말 형태로 건조될 수 있다. 건조는 동결건조 또는 당해 분야에서 공지된 다른 건조 과정에 의해 달성될 수 있다. 이러한 건조 단계는 유리하게는, 액체, 가용화된 형태에서 보관과 비교하여 조성물에 대한 더욱 긴 보관 시간을 제공할 수 있다. 즉석으로 이용될 때, 건조된 분말 형태는 수성 용액 또는 완충액으로 재구성될 수 있고, 그리고 pH 조정 (가령, pH의 중화)의 과정이 단계 (iii)에서 실행될 수 있고, 그리고 상기 과정이 지속될 수 있다. 대안으로, 단계 (iii)의 pH 조정은 건조 과정 이전에 실행될 수 있다.
본 발명의 추가 방법은 TS-ECM 골격을 환자의 조직에 부착하는 것을 포함하는데, 여기서 골격의 표면은 환자의 세포, 예를 들면, 줄기 세포로 임베드되거나 또는 코팅된 겔화된 가용화된 ECM을 포함하고, 여기서 임베드된 또는 코팅된 세포는 조직에 골격을 주입하거나, 이식하거나 또는 투여하기에 앞서, 골격 내로 환자의 세포의 내성장을 위한 충분한 시간이 허용된다.
본 발명의 방법을 실행할 때, 골격 이식편은 본원에서 설명된 바에 따라서 제조되고, 이후 병든 또는 손상된 조직의 최소한 일부에 주입되거나, 이식되거나 또는 투여되고, 그리고 대체 세포가 성장하고 병든 또는 손상된 세포를 대체할 만큼 충분한 기간 동안 병든 또는 손상된 조직과 접촉한 상태로 남아있도록 허용된다.
충분한 기간은 이런 치료 방법에 대한 환자의 반응성에 따라, 1 일 내지 수 주 또는 수 개월일 수 있다. 성공적인 조직 재건이 없는 1-년 치료 기간은 이런 치료를 계속하는데 대한 상한선일 수 있다. ECM 물질은 체내에서 자연적으로 생분해되고 제거될 필요가 없다. 그럼에도 불구하고, ECMH는 예상치 않게 및 유리하게는, 치료되는 병변 위에서 장벽 층을 제공한다. 이러한 성질은 액체 형태 및 결과의 겔의 점성 또는 강인성 또는 부착 특징 중에서 하나 또는 그 이상이 치료되는 환자의 장 내에서 연동 운동 또는 운동성, 또는 섭취된 액체가 장을 거쳐 이동함에도 불구하고 장으로부터 제거에 내성인 것으로 밝혀졌기 때문에, 예상치 못한 것이다.
따라서 ECMH는 체류 동안 장 내에서 장벽 층 또는 보호 층을 형성한다. ECMH에 대한 체류 시간은 유효한 조직 치유와 수복을 제공할 만큼 길고, 그리고 대략 최소한 2 시간에서 48 시간까지이다. 바람직하게는, 투여 이후에 ECMH의 체류 시간은 약 4 내지 약 24 시간, 그리고 더욱 바람직하게는 약 6 시간 내지 약 12 시간이다.
UC를 치료하는 본 방법을 실행하기 위해, ECM 이식편은 병든 또는 손상된 결장의 최소한 일부와 접촉한 상태로 주입되거나, 이식되거나 또는 투여되고, 결장 점막 세포의 성장 및 대체를 허용하는 기간 동안 점막층과 접촉한 상태로 유지되고, UC-병든 세포의 염증 또는 다른 현성을 전시하지 않는 건강한 점막 세포로 병든 또는 손상된 세포의 대체를 유발한다.
ECM 이식편은 대략 1-10 센티미터 길이의 상대적으로 짧은 튜브 또는 시트 분절로서 제공되고, 결장의 내벽에 주입되거나, 이식되거나 또는 투여될 수 있다. 대안으로, ECM 이식편은 결장의 전체 길이에 상응하는 하나 또는 그 이상의 길이를 포함할 수 있다. 고체 튜브 또는 시트 ECM은 봉합선, 클립, 스테이플, 접착제 또는 기타 유사한 것에 의해, 치료되는 조직에 고정될 수 있다. 대안으로, 결장 조직은 액체 용액, 현탁액 또는 겔 조성물을 치료되는 부위 위에 투여함으로써, 예를 들면, 분무함으로써 치료될 수 있다.
점막절제술 단계를 포함하는 UC를 치료하는 방법에서, UC의 증상을 전시하는 조직이 제거되는데, 그 이유는 UC가 점막층 내에 국한되기 때문이다. 점막절제술 단계는 내시경적으로 수행될 수 있고, 개복술 또는 복강경 수술에 대한 필요를 배제한다. 줄기 세포 자극 단계 (TS-ECM 이식편의 도입을 통한)는 새로운, 건강한 점막층이 결장 내강 내에 형성되도록 허용한다. 점막절제술은 결장의 부분적인 또는 짧은 분절, 또는 결장의 더욱 긴 길이에서 행위될 수 있다.
결장의 분절 또는 결장의 전체 길이에서 실행되는 지에 상관없이, 본 발명은 아래의 기능적 유익성과 함께, 유지된 직장에서 증식성 (악성) 병리, 예를 들면, UC 또는 가족성 폴립증으로부터 악성 잠재력을 제거하고; 그리고 건강 관리 전문가가 더욱 긴 직장구불결장 분절을 제자리에 남겨두도록 허용하는 유익성을 비롯하여, 결장절제술에 대한 필요성을 제거하고 선천적 직장 조직 커프를 원지에 남겨두는 유익성을 제공할 수 있다:
- 하부 절개를 동행하는 괄약근 붕괴 (실금) 또는 천골신경 손상 (발기 불능)의 감소된 위험, 그리고
- 증가된 수분 흡착 및 향상된 저장 능력으로 인해 더욱 정상적인 배변 습관을 허용하는 향상된 저장소 기능;
- 결장절제술 또는 유사한 시술, 예를 들면, IPAA (회장 문합술을 동반한 전체 대장절제술)보다 상대적으로 단순함 및 더욱 적은 침습성을 제공한다; 점막절제술은 회복/회장조루술과 동일한 시점에서 또는 임의의 추후 시점에서 아래로부터 행위될 수 있는 상당히 단순한 시술이다. 줄기 세포는 전환 회장조루술이 여전히 잔존하는 동안, "심어지고" 점막층을 재생할 수 있었다.
- 결장을 남겨두는 것은 결장 없이 평생을 살아가야 하는 우려 (가령, 낭염, 장관 폐쇄, 탈수, 감소된 직장 저장소 능력으로부터 발생하는 빈번한 장 운동의 필요에 기인한 수면 박탈 등)를 배제한다;
- 단지 일시적인 회장조루술만을 창출한다 (다시 말하면, 새로운 점막층이 생존가능할 때까지); 그리고
- 이것은 만약 그렇지 않으면, IBD를 치료하기 위해 독립적으로 작동할지도 모르는 다양한 규율 (외과적, 의학적, 내시경 및 조직 가공)을 합친다.
다양한 방법 및 절차가 줄기 세포를 예로서, 골격 상에서, 관장을 통해 전달된 액체배지에서, 카테터-기초된 전달 시스템에 의해 또는 기타 유사한 것에 의해 결장에 전달하는데 이용될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 유리하게는, ECM 물질은 회장조루술이 창출될 때와 동일한 외과 시술 동안 적용될 수 있고, 그리고 점막층은 내부 파우치가 치유하는 동안 증식하거나 또는 재생하도록 허용될 수 있다.
실시예 1 - 결장 조직의 대체를 위한 고체 ECM의 외과적 배치
소장 점막하층 세포외 기질 (SIS-ECM) 이식편은 4마리 (4) 살아있는 개의 결장 조직 내로 합체되었다. 거의 3-4 센티미터 길이의 SIS-ECM 이식편은 공지된 기술에 따라서 제조되었다. 상이한 숫자의 층 - 2-층, 4-층, 6-층 및 8-층 시트 또는 튜브를 갖는 이식편이 제조되고, 그리고 항문경유 원주 점막 적출 이후에 시험되었다.
4마리 (4) 건강한 성체 잡종견 암컷 개 (대략, 체중에서 20 kg)는 원주 결장 점막 EMR에 종속되었다. 개가 전신 마취 하에 있는 동안, 외과적 점막절제술이 수행되었다. 대안으로, 점막 조직 제거, 예를 들면, EMR은 예로서, 치료적 내시경 (EG-3430, Pentax Medical, Montvale, NJ) 및 상업적으로 가용한 키트 (EMR Kit, Olympus America, Center Valley, Pa)로 수행될 수 있다. 단편적인 점막 적출은 4-cm 원주 적출이 완결될 때까지 순차적으로 수행되었다.
돼지 소장 점막하층 (SIS)으로부터 유래된 세뇨관 ECM 이식편 또는 골격이 이후, 이들 4마리 개에서 내시경적으로 외과적으로 배치되었다. SIS-ECM 생물학적 골격 물질은 앞서 설명된 바와 같이 제조되고 세뇨관 모양으로 설정되었다. 간단히 말하면, 돼지 SIS는 사망 직후에, 시판-체중 돼지 (거의 110-130 kg)로부터 수확되었다. 지방 조직을 비롯한 잔여 외부 결합 조직은 손질되었고, 그리고 모든 잔여 폐기물은 수돗물로 반복된 세척에 의해 제거되었다. 점막하층은 소장 조직으로부터 기계적으로 엽렬되었다. 점막하층은 이후, 무세포화되고, 그리고 0.1% (vol/vol) 과아세트산 (s), 4% (vol/vol) 에탄올 및 96% (vol/vol) 탈이온수에서 2 시간 동안 담금에 의해 소독되었다.
SIS-ECM 물질은 이후, 인산염 완충된 식염수 용액 (pH 7.4)으로 15 분 동안 2회 및 탈이온수로 15 분 동안 2회 세척되었다. 세뇨관 골격은 개 결장의 해부구조와 정합하도록 가공되었다. 간단히 말하면, 총 여러 번의 완전한 회전을 위해 배꼽 테이프로 덮인 22-mm 천공된 튜브/만드렐 (다시 말하면, 다중층 튜브) 주변에 SIS의 수화된 시트를 둘러쌈으로써 다중층 튜브가 창출되었다. 이들 구조체는 이후, 플라스틱 파우치 내로 배치되고, 그리고 응축 트랩이 일렬로 늘어선 진공 펌프 (모형 D4B, Leybold, Export, PA)에 부착되었다.
이들 구조체는 물을 제거하고 밀착 연계된 멀티-라미네이트 구조체를 형성하기 위해 10 내지 12 시간 동안 710 내지 740 mm Hg의 진공에 종속되었다. 각 ECM 장치가 만드렐로부터 제거된 후, 이들은 에틸렌 산화물로 종말 살균되었다.
SIS-ECM 이식편의 내시경 배치를 위해, 세뇨관 골격은 식염수 용액조에서 5 분 동안 수화되고, 그리고 이후, 30-mm 무이완 풍선 (Cook Endoscopy Achalasia balloon, Wilson-Cook Medical, Winston-Salem, NC) 위에 배치된다. SIS-ECM 장치는 풍선이 부풀려질 때 풀어지는 외과의사의 매듭이 있는 2개의 4-0 견사 봉합사로 제약되었다. 0.035-인치 와이어 (Jagwire, Boston Scientific, Natick, MA)가 개의 결장 내로 내시경적으로 배치되었다. 풍선은 이후, 와이어 위에 통과되고, 그리고 SIS-ECM이 점막 적출의 길이를 가교하도록 내시경 보도 하에 배치되었다.
1 ml의 분해성, 리신-유래된 우레탄 (LDU) 외과적 접착제 (TissuGlu, Cohera Medical, Pittsburgh, Pa)가 이후, 저하를 예방하기 위해 장치의 맞은편에 2개의 별개의 스트립에서 결장 벽 및 SIS-ECM 사이에 6F 내시경 인도 카테터 (Oasis stent introduction system, Wilson-Cook Medical)를 통해 주입되었다. 풍선은 이후, 최대한으로 수동으로 부풀려지고, 결장 벽에 대항하여 골격을 확대시켰다. 풍선 팽창은 수축 및 제거 전 15 분 동안 유지되고, SIS-ECM 골격을 결장 내에서 제자리에 남겨 놓았다.
수술후, 이들 개는 마취로부터 회복되고, 발관되고, 그리고 이들이 흉골 위치에서 편안하게 휴식할 때까지 회복실에서 모니터링되었다. 이들 개는 케이지에서 하룻밤 동안 유지되고, 그리고 수술후 1 일자에 그들의 더욱 큰 런 하우징으로 복귀되었다. 모든 개는 7 내지 9 일 동안 하루 2회 세팔로틴/세팔렉신 (35 mg/kg)으로 구성되는 경구 방지적 항생제가 제공되었다.
정맥내 아세프로마진 (0.1 mg/kg) 및 부토르파놀 (0.05 mg/kg)이 2 일 동안 투여되었고, 그 이후에 진통을 위해 필요에 따라 12 시간마다 피하 또는 근육내 부프레노르핀 (0.01 내지 0.02 mg/kg)이 투여되었다.
모든 개는 또한, 하루 오메프라졸 20 mg이 제공되었다. 경구 섭취는 수술 후 36 시간에 시작되었다. 개는 상승된/융기된 플랫폼으로부터 사양되었다. 일일 영양 요구량이 계산되고 3회 별개의 사양으로 나눠졌다. 죽/부드러운 사료가 수술후 1 주 동안 제공되었고, 그 이후에 뒤이은 2-주 기간에 걸쳐 딱딱한 사료로의 점진적인 변화가 뒤따랐다. 이들 개는 주 1회 칭량되고, 그리고 자유롭게 걷도록 허용하기 위해 거의 10-14 피트 치수의 런 (run)에서 수용되었다.
내시경 검사는 결장 점막 모습 및 협착을 평가하기 위해 수술후 1 개월 및 12 주에서 안락사 직전에 수행되었다. 시간적 재형성 반응은 대장내시경검사 및 생검 수집을 이용하여 모니터링되었다. 동물은 2, 8, 10 또는 12 주에서 희생되었다. 체외이식편은 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 및 알시안 블루로 염색되고, 그리고 증식 세포 핵 항원 (PCNA)에 대해 면역표지화되었다. 체외이식편의 육안적 분석은 협착 형성이 점막절제술 단독 개에서는 일어나지만, ECM 치료된 개에서는 협착이 전혀 발달하지 않는다는 것을 보여주었다. 조직학은 ECM이 부위 적절한 술잔 세포 및 적절하게 위치된 PCNA+ 증식 세포의 재형성을 증진한다는 것을 보여주었다. ECM 치료된 개의 점막층은 선천적 조직과 거의 구별하기 어려웠지만, 점막절제술 단독 개는 새로운 점막 피복의 어떤 징후도 보여주지 않았다.
안락사 직후에, 골격 배치 부위 및 골격 배치 부위의 근위와 원위에 선천적 결장 조직이 수확되었다. 절제된 분절은 종적으로 분할되었고, 그리고 노출된 점막 표면은 조사되고 치수 계측을 위해 촬영되었다. 결장의 내강 둘레는 협착증의 정도를 결정하기 위해, 재형성된 부위의 우수한 가장자리의 3 cm 근위에 및 이식편의 중간에서 계측되었다. 결과는 재형성된 부위 및 근위 정상적인 조직 사이에 둘레의 감소 퍼센트 (평균 +/- SD)로서 표현되었다.
절제된 조직은 납작해진 자세에서 코르크판에 핀으로 고정되고 10% 중성 완충된 포르말린에 집어넣어졌다. 검체는 정상적인 조직 및 재형성된 조직 둘 모두를 포함하도록 종적으로 손질되고, 절개되고, 그리고 헤마톡실린-에오신 및 Masson의 트리크롬 염색 둘 모두로 염색되었다. 조사된 구역은 선천적 조직, 재형성된 구역 및 선천적 조직 사이에 근위와 원위 인터페이스, 그리고 재형성된 구역의 중간 영역을 포함하였다. 데이터의 분포의 검사에 기초하여, 상기 데이터는 정상적으로 분포된 것처럼 보인다. 따라서 결과를 비교하는데 이용된 통계학적 접근법은 파라미터 t 검증이었다 (n = 4).
시험된 가설은 SIS-ECM으로 EMR 결함의 치료가 치료 없음과 비교하여 둘레에서 더욱 적은 감소를 야기할 것이라는 것이었다. 개별 시험 동물로부터 데이터는 복수 통계학적 분석 (다시 말하면, 둘레 감소 및 체중)에 종속되었던 것으로 인식된다. 개에서 내강 둘레에서 감소의 비교는 복수 시험을 필요로 하지 않는 일차 통계학적 분석으로서 간주되었다. 모든 다른 통계학적 검증은 진술된 그들의 P 값이 반복 측정에 대해 교정되지 않는 이차적인 것으로 고려되고 단지 서술로서 간주되어야 한다.
결과 및 결론.
치료의 부재에서, 흉터형성 및 협착 형성이 예상된 결과이다. 하지만, ECM 치료는 육안으로 및 현미경적으로 정상적인 것으로 나타나는, 절제된 조직의 점막 피복을 유발하였다. 결과는 세뇨관 장치 내에 ECM 층의 숫자에 따라 약간 변하였다 - 더욱 높은 숫자의 ECM 층은 일반적으로, 증가된 점막 피복과 연관되었다. ECM 골격으로 치료된 개에서 협착의 어떤 징후도 나타나지 않았다.
개 모형에서 본 연구는 원주 EMR 후 내시경적으로 배치된 SIS-ECM 골격이 협착 형성 없이 결장 점막 재형성을 조장한다는 것을 보여주었다 (도면 1). 재형성된 조직은 조밀한, 조직화된 콜라겐성 점막하층 및 정상적인 것처럼 보이는 외근육층을 갖는 완전하게 상피화된 내강으로 구성되었다.
따라서 개 모형을 이용하고, 그리고 결장 점막 내층 조직의 재생을 위해 SIS-ECM 이식편을 이용하는 이들 연구는 ECM이 IBD, 예를 들면, UC 또는 CD를 치료하는데 이용될 수 있다는 것을 증명한다.
본 발명을 이렇게 설명하긴 했지만, 상이한 구체예인 것처럼 보일 수 있는 것이 발명의 사상과 범위로부터 벗어나지 않으면서 제공될 수 있다는 것은 명확하다. 따라서 전술한 명세서는 제한하는 의미보다는 예시적인 것으로서 해석되는 것으로 의도된다.
실시예 2 - 결장 조직의 대체를 위한 겔 ECM의 적용
본 발명에 따라서 염증성 장 질환 (IBD)의 치료를 위해 ECM 겔 조성물을 이용하는 실행가능성이 쥐에서 생체내에서 시험될 수 있다. 쥐는 인간 IBD, 예를 들면, 궤양성 대장염 (UC)에 대한 모형으로서 확립될 수 있는데, 여기서 UC-유사 염증은 여러 일 동안 무제한으로 식수에 담긴 덱스트란 황산염 나트륨 (DSS)을 투여함으로써 쥐 결장 조직에서 유도될 수 있다.
급성 UC-유사 염증은 무제한으로 제공된 식수에서 5% DSS를 7 일 동안 투여하고, 그 이후에 일반 물을 투여함으로써 쥐에서 유도될 수 있다. 만성 UC-유사 염증은 무제한으로 제공된 식수에서 5% DSS를 1회 또는 그 이상의 연속 7-일 기간 동안 투여하고, 그 이후에 일반 물을 투여함으로써 쥐에서 유도될 수 있다.
UC의 치료는 소장 점막하층 (SIS)으로부터 유래되고 관장을 통해 결장 내로 도입된 겔 세포외 기질 (ECM)을 이용하여 실행될 수 있다. 겔 SIS-ECM은 최소한 1 주, 그리고 바람직하게는 약 1 개월까지의 기간 동안 하루 1회 또는 그 이상 투여될 수 있다. SIS ECM에 대한 바람직한 투약 섭생은 1-30 일 동안 하루 1 회이다.
ECM으로부터 겔의 제조 방법
소장의 분절로부터 SIS의 제조는 U.S. 특허 번호 4,902,508, US 특허 번호 5,275,826 및 US 특허 번호 5,514,533에서 상술되는데, 이들의 개시는 명시적으로 본원에서 참조로서 편입된다. 장의 분절은 먼저, 외부 층 (특히, 장막 및 근육층) 및 내부 층 (소장 점막의 내강 부분) 둘 모두를 제거하기 위해 종적 와이핑 움직임을 이용한 마멸에 종속된다. 전형적으로, SIS는 식염수로 헹굼되고, 그리고 임의선택적으로, 아래에 설명된 바와 같이 이용 때까지 수화된 또는 탈수된 상태에서 보관된다.
본 발명의 유동화된 조성물은 상기 조직을 가용화시키고 실제적으로 균질한 용액을 형성하는데 충분한 기간 동안 점막하층을 프로테아제, 예를 들면, 트립신 또는 펩신으로 분쇄하고 및/또는 소화함으로써, 장관 점막하층의 용액 또는 현탁액으로서 제조된다. 장관 점막하층 시작 물질은 찢음, 절단, 분쇄, 전단 등에 의해 분쇄된다. 비록 점막하층의 조각의 현탁액을 고속 (고전단) 블렌더에서 처리에 종속시키고, 그리고 필요하면, 원심분리하고 과잉 물을 옮겨 부어 탈수시킴으로써 우수한 결과가 또한 획득될 수 있긴 하지만, 동결된 또는 동결건조된 상태에서 점막하층을 분쇄하는 것이 선호된다. 분쇄된 장관 점막하층은 점막하층 분말을 형성하기 위해 건조될 수 있다. 그 후에, 이것은 수화되어, 다시 말하면, 물 또는 완충된 식염수 및 임의선택적으로 다른 제약학적으로 허용되는 부형제와 조합되어 25℃에서 약 2 내지 약 300,000 cps의 점성을 갖는 유체로서 조직 이식편 조성물을 형성할 수 있다. 더욱 높은 점성 이식편 조성물은 겔 또는 페이스트 경도를 가질 수 있다. 본 발명 조성물은 당해 분야에서 인정된 살균 기술, 예를 들면, 전리 방사선에 노출을 이용하여 살균될 수 있다.
본 발명의 유동화된 점막하층은 또한, 가장 전형적으로 외상 또는 질환-유도된 조직 결함을 교정하기 위한 수복 또는 증강이 필요한 조직, 예를 들면, 연조직에 대한 주사가능 이종이식편으로서 용도를 발견한다.
SIS 현탁액
앞서 설명된 바와 같이 제조된 SIS 검체는 조직 가위, 외날 면도칼, 또는 다른 적절한 절단 수단을 이용하여 임의적으로 작은 조각으로 다져지거나 또는 잘게 썰어진다. 검체는 편평 바닥 스테인리스강 용기에서 배치되고, 그리고 검체를 동결하여 이들의 분쇄를 준비하기 위해 액체 질소가 상기 용기 내로 도입된다.
동결된 SIS 검체는 이후, 분쇄되어 거친 SIS 분말을 형성한다. 이런 처리는 예로서, 원통형 황동 주괴가 동결된 검체 위에 배치된 Wiley 제분기 또는 수동 아버 프레스로 실행될 수 있다. 주괴는 검체 및 아버 프레스 사이에 인터페이스로서 역할을 한다. SIS 검체를 동결 상태로 유지하기 위해, 액체 질소가 이들에 주기적으로 첨가될 수 있다.
SIS 검체를 분쇄하기 위한 다른 방법은 본 발명에 따라서 이용가능한 SIS 분말을 생산하는데 활용될 수 있다. 가령, SIS 검체는 동결건조되고, 그리고 이후, 아버 프레스 또는 다른 분쇄 수단을 이용하여 분쇄될 수 있다. 대안으로, SIS는 고전단 블렌더에서 처리되어, 탈수 및 건조 시에 SIS 분말을 생산할 수 있다.
미리 냉각된 모르타르 및 막자를 이용한 SIS 분말의 추가 분쇄는 일정하고, 더욱 미세하게 갈라진 산물을 생산하는데 이용될 수 있다. 다시 한 번, 최종 분쇄 동안 고형 동결된 입자를 유지하기 위해, 액체 질소가 필요에 따라 이용된다. 분말은 원하는 점성에서 본 발명의 유동화된 조직 이식편 물질을 생산하기 위해, 예로서 완충된 식염수를 이용하여 쉽게 수화될 수 있다.
SIS 용액
SIS 분말은 와이어 그물망을 통해 임의의 편의한 용기 내로 체로 걸러진다. 분말은 이후, 실제적으로 균질한 용액을 형성하기 위해 단백질분해 소화에 종속된다. 한 구체예에서, 분말은 0.1 M 아세트산에서 1 mg/ml의 펩신 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)으로 소화되고, 실온에서 48-시간 기간에 걸쳐 HCl로 pH 2.5까지 조정된다. 반응 매체는 펩신 활성을 비활성화시키기 위해 수산화나트륨으로 중화된다. 가용화된 점막하층은 이후, 용액의 염 침전에 의해 농축되고 추가 정제 및/또는 동결건조를 위해 분리되어, 분말 형태에서 프로테아제 가용화된 장관 점막하층을 형성할 수 있다.
본 발명에 따른 유동화된 점막하층 조성물의 점성은 점막하층 성분의 농도 및 수화의 정도를 제어함으로써 조작될 수 있다. 점성은 25℃에서 약 2 내지 약 300,000 cps의 범위로 조정될 수 있다. 낮은 점성 점막하층 조성물은 관절내 적용 또는 체강 내에 적용에 더욱 우수하게 적합된다. 더욱 높은 점성 제제, 예를 들면, 겔은 SIS 소화 용액의 pH를 약 6.0으로부터 약 7.0로 조정함으로써, 이런 용액으로부터 제조될 수 있다. 점막하층 현탁액 또는 점막하층 소화 용액으로서 본 발명 조성물의 겔 형태는 전형적으로, 주입기 또는 카테터를 이용한 피하 또는 근육내 적용에 바람직하다.
SIS 겔은 또한, 0.1 N NaOH (소화 용액의 용적의 1/10) 및 10X PBS pH 7.4 (소화 용액의 용적의 1/9)를 적절한 양으로 4℃에서 혼합함으로써, 겔로 형성되는 것으로 설명되었다. 용액은 차가운 (4℃) 1X PBS pH 7.4를 이용하여 원하는 용적과 농도로 되고, 그리고 겔화가 발생하도록 37℃ 인큐베이터 내에 배치되었다.
ECM은 용해 상태에서 40 분 후 기질을 형성할 수 있었다. ECM-유래된 겔은 20℃ 미만의 온도에서 액체이지만, 온도가 37℃로 상승될 때 겔로 변한다.
ECM으로부터 겔을 제조할 때, 모든 용액은 얼음 위에서 유지되어야 하고, 그리고 다음의 변수가 US 특허 번호 8,361,503에 따라서 결정되어야 하는데, 이것은 본원에서 전체적으로 참조로서 편입된다:
Cf = mg/ml에서 최종 겔의 농도
Cs = mg/ml에서 ECM 소화 용액의 농도
Vf = 실험을 위해 필요한 최종 겔 용액의 용적
Vd = ml에서 ECM 소화 용액으로부터 필요한 용적
V10X = ml에서 필요한 10X PBS의 용적
V1X = ml에서 필요한 1X PBS의 용적
VNaOH = ml에서 필요한 0.1 N NaOH의 용적
먼저, 필요한 ECM 겔의 최종 농도 (Cf) 및 용적 (Vf)을 결정한다. 이후, Cf (mg/ml)* Vf (ml)를 곱함으로써, 필요한 ECM의 질량을 계산한다. 이러한 값은 ECM 소화 용액 (Vd)으로부터 필요한 용적을 제공할 것인데, 여기서 Vd =[Cf (mg/ml)* Vf (ml)]/Cs이다.
계산된 용적 Vd를 9로 나눔으로써, 필요한 10X PBS의 용적을 계산한다 (V10X= Vd /9). 계산된 용적 Vd를 10으로 나눔으로써, 필요한 0.1 N NaOH의 용적을 계산한다 (VNaOH = Vd /10). 아래와 같이, 용액을 적절한 농도/용적으로 가져가는데 필요한 1X PBS의 양을 계산한다: V1X=Vf - Vd -V10X-VNaOH. 모든 시약 (V1X + Vd + V10X + VNaOH)을 ECM 소화 용액 (Vd)이 없는 적절한 용기 (통상적으로 15 또는 50 ml 원심분리기 튜브)에 첨가한다. 용액을 얼음 위에 배치하고 얼음 위에서 항상 유지한다.
ECM 소화 용액 (Vd)으로부터 적절한 용적을 상기 제조된 PBS/NaOH 혼합물에 첨가하고, 그리고 용액에서 기포의 발생을 세심하게 방지하면서, 1 ml 미량피펫으로 충분히 혼합한다. ECM 소화 용액의 점성에 따라, 전달 동안 일부 유의미한 용적 상실이 있을 지도 모른다. 총 용적을 모니터링하고, 그리고 최종 용적이 달성될 때까지 적절한 양을 추가한다. 프리겔 용액의 pH를 계측하는데, 여기서 pH는 대략 7.4이어야 한다.
프리겔 용액을 주형에 또는 적절한 웰에 첨가한다. 주형 또는 웰을 37℃ 인큐베이터 내에 최소한 40 분 동안 배치한다. CO2 제어가 있는 인큐베이터를 이용하는 것을 피한다. 물 증발이 우려되면, 주형을 인큐베이터 내에 배치하기 전, 플라스틱 지퍼락 가방 내부에 배치한다. 겔화 후, 겔은 주형으로부터 제거되고 1X PBS 상에 배치될 수 있다. 겔이 조직 배양 평판에서 만들어졌다면, 겔을 수화된 상태로 유지하기 위해 이용 때까지 1X PBS가 겔 위에 배치될 수 있다.
SIS-ECM 투여 절차
SIS-ECM 용액 또는 현탁액은 UC-유도된 쥐의 결장 내로 관장에 의해 투여될 수 있다. 이식편의 투여 이후에, 호스트 동물의 어떤 거부 반응, 감염 반응 또는 비정상적인 생리학적 반응도 예상되지 않는다. 용액 또는 현탁액은 또한, 내시경검사를 통해 및 복강경검사를 통해 결장 내로 투여될 수 있다. 본 발명의 예상치 못한 결과는 결장 점막층의 증강이 SIS 용액 또는 현탁액 물질로 달성될 수 있도록 하는 적절한 조직 재형성의 자극일 것으로 생각된다.
본 발명의 유동화된 조성물은 조직 대체 및 수복을 유발하고, 그리고 더 나아가, UC를 비롯한 IBD의 치료 또는 치유를 유발할 수 있다. 이들 유동화된 점막하층 조성물은 자연 결장 점막 조직의 재성장을 유도하기 위해 본 발명 방법에 따라서 이용된다. 유동화된 ECM 조성물의 효과량을 결손성 조직의 현장 내로 주사함으로써, 기생 영양 성질이 더욱 침습성 수술 기법에 대한 필요 없이 실현될 수 있다.
실시예 3 - 쥐에서 결장 조직의 재형성을 위한 ECM 하이드로겔 (ECMH)을 이용한 생체내 연구
UC 요법에 대한 비외과적 및 비약물적 접근법은 국부 선천성 면역 세포 개체군의 대안적 활성화를 증진함으로써 염증성 발적을 약화시킬 수 있고, 그리고 점막 상피 구조를 복원함으로써 결장 점막 장벽 기능의 신속한 대체를 유도할 수 있다. 본 연구는 UC를 치료하기 위한 포유류 세포외 기질 (ECMH)의 하이드로겔 형태의 국부 전달의 효력을 증명한다. 임상적 증상, 염증 및 상피 장벽 기능에 대한 ECMH의 효과는 복수 생체내 및 시험관내 결과 척도에 의해 평가되었다.
본 실시예에서 제시된 연구는 ECM으로 구성된 관장 하이드로겔이 UC의 설치류 모형을 효과적으로 치료한다는 것을 보여준다. 효과적인 요법은 ECMH 치료에 의해 양성으로 주도된 2가지 필수적인 생리학적 과정에 따라서 결정되었다: 1) 호스트를 친염증성 내강 내용물의 끈질긴 생장억제공간으로부터 보호하는 결장 상피 장벽 기능의 수복; 및 2) 염증성 사이토킨을 방출함으로써 염증을 증식시키는 조직 대식세포의 친염증성 상태의 분해능. 이러한 전략은 사전적 치료적 접근법을 대표하고, 그리고 UC를 치료하는데 현재 이용되는 면역억제성 방법 (방어적) 및 외과적 방법 (구조적)과는 출발점이 상이하다.
일부 이전 보고와 달리, 본 연구의 결과는 ECMH가 M2-유사 대식세포 표현형을 직접적으로 증진함으로써가 아닌 M1-유사 친염증성 대식세포의 숫자를 감소시킴으로써 선천성 면역 염증 반응을 매개할 수 있다는 것을 증명한다. ECMH 치료된 동물의 결장은 대식세포 (이들은 조직 수복의 필수적인 매개체이다)에서는 감소를 갖지 않고 염증성 대식세포에서 감소를 갖는다. ECMH의 이런 면역조정성 성질은 심지어 단독으로 이용될 때에도, 연관된 부정적인 부작용 없이 현재 약리학적 요법만큼 효과적일 수 있다. 추가적으로, ECMH 요법은 결장 점막층의 상피 세포에 대한 보호 효과를 가질 수 있다. 본 연구는 상피 장벽 기능을 복원하고, 친염증성 대식세포를 경감하고, 점막 조직 재생을 위한 환경을 확립함으로써, ECMH로 결장 염증의 효과적인 치료를 증명한다.
방법
실험 설계
검증된 UC 설치류 모형에서 ECMH의 효력 및 안전성을 결정하기 위해, 질환이 수컷 Sprague Dawley 쥐에서 유도되고, 그리고 ECMH, 또는 처리 잔류물을 포함하는 ECMH 희석제를 모의하는 대조 용액으로 7 연속일 동안 일일 관장 주입으로 치료되었다. 동물은 시간 반응을 평가하기 위해, 덱스트란 황산염 나트륨 (DSS) 후 7 일 및 14 일에 희생되었다 (n = 처리마다 시점마다 14). DSS 또는 관장 주입을 제공받지 않았던 건강한 쥐는 7 일 및 14 일 둘 모두에서 비교를 위해 포함되었다 (n = 시점마다 6). 일차 연구 종결점은 임상적 반응, 조직학 점수, 염증 반응 및 장벽 기능을 포함하였다. 염증 및 상피 장벽 기능에 대한 ECMH의 효과는 각각, 고유판 단핵 세포 (LPMC) 및 장관 상피 세포 (IEC)에서 시험관내 계측되었다.
ECM 하이드로겔 제조 및 제제
소장 점막하층 (SIS) ECM이 돼지 소장으로부터 제조되었다. 장은 안락사 직후에 수확되고, 탈이온수에서 내용물이 헹굼되고, 동결되었다. 조직은 해동되었고, 그리고 소장 점막의 표재성 층이 기계적으로 제거되었다. 유사하게, 장막 및 외근육층이 기계적으로 제거되고, 소장 점막의 소장 점막하층 및 기저 부분이 남겨졌다. 나머지 SIS 물질은 0.1% 과아세트산/4% 에탄올로 처리 및 차후 식염수와 물 헹굼에 앞서, 탈이온수에서 24-72h 동안 헹굼되었다. SIS-ECM은 동결되고, 동결건조되고, #60-그물망 스크린을 이용한 Wiley 제분기로 분말화되고, 그리고 21-23℃에서 20-26 시간 동안 교반하면서 0.01N HCl에서 1 mg/mL 펩신 (Sigma, St. Louis, MO)으로 10 mg/mL 건조 중량에서 소화되었다. 소화액은 -20℃에서 분취량으로 보관되고 이용에 앞서 중화되었다. 모든 생체내 연구는 8 mg/mL의 ECMH 농도를 이용하였고, 그리고 모든 시험관내 연구는 500 μg/mL의 ECMH 농도를 이용하였다.
14C-표지화된 ECMH는 앞서 설명된 바와 같이, 14C-태깅된 프롤린이 주사된 돼지의 장으로 전술한 바와 같이 제조되었다. FITC-표지화된 ECMH는 제조업체의 사용설명서 (Thermo PierceNet; #53027)에 따라서 단백질 표지화 키트로 제조되었다.
ECM 하이드로겔의 특징화
무세포화 효율은 H&E 및 DAPI 염색에서 핵의 부재에 의해 결정되었다. 잔존 DNA는 PicoGreen 검정 (Invitrogen)을 통해 계측되었고, 그리고 DNA 단편화는 겔 전기이동을 이용하여 가시화되었다. ECM에서 황산화된 글리코사미노글리칸 함량은 제조업체의 지침에 따라서 Blyscan 황산화된 글리코사미노글리칸 검정 (Biocolor Ltd.)을 이용하여 계측되었다. ECMH의 유동학적 특징은 40 mm 병렬 평판 기하구조로 작동하는 검류계 (AR2000, TA 기기, New Castle, DE)로 결정되었고, 그리고 변동 없는 전단 점성은 앞서 설명된 바와 같이 (참조), 0.159 Hz의 주파수에서 1 Pa의 스트레스를 적용함으로써 계측되었다. 모든 특징화 검정은 ECM의 4가지 독립된 제조물에서 완결되었다 (n = 4).
ECMH 부착 시험
ECMH의 점막부착성은 변형된 탈립력 계측을 이용하여 계측되었다. 10N 로드 셀이 구비된 일축 인장 시험 기계 (MTS Insight; MTS Systems Corp., Eden Prairie, MN)가 모든 인장 강도 계측에 이용되었다. 2개의 결장 섹션이 점막층이 외부를 향하도록 강철 세정기 (직경 12.7 mm)에 접착되었고, 그리고 하나의 세정기가 24-웰 평판 (직경 15.6 mm)의 아래쪽에 접착되었다. ECMH는 10분의 1 용적의 0.1M NaOH 및 9분의 1 용적의 10x PBS로 중화시킴으로써 제조되었고, 이후 0.5 mL가 아래쪽 세정기 위에 첨가되었고, 그리고 위쪽 세정기가 추가되고 37℃에서 1 시간 동안 배양하기 전, 미리 결정된 깊이까지 겔을 뚫고 들어가도록 허용되었다. 배양 후, 점막층은 표면 사이에 파괴가 발생할 때까지 5 mm/분의 일정한 속도에서 위쪽으로 천천히 움츠려졌다. Chickering & Mathiowitz (1995) (Kammer 1983).
동물 및 농작
모든 절차 및 동물 연구는 University of Pittsburgh Radiation Safety Committee and the Institutional Animal Care and Use Committee에 따라서 승인되고 수행되었다. 8-12 주령의 수컷 Sprague Dawley 쥐는 Harlan으로부터 획득되고, 개별적으로 수용되고, 7-10 일 동안 환경적으로 순화되었다. 동물은 21-23 ℃의 온도 및 12 시간 명/암 주기를 갖는 표준 조건 하에 수용되었다. 쥐는 연구 내내 사료 및 물에 무제한 접근이 허용되었다.
질환 유도 및 모니터링
5 퍼센트 덱스트란 황산염 나트륨 (DSS) 염 (36,000-50,000 MW; MP Biomedical)이 탈이온수에서 매일 제조되고 7 일 동안 무제한 흡음에 의해 쥐에게 투여되었고, 그리고 동물은 매일 모니터링되었다. 동물 체중 및 사료와 물의 소비가 각 동물에 대해 추적되었다. 질환 활동성 (다시 말하면, 대변 굳기, 대변에서 혈액의 존재 및 체중 감소)이 2 일마다 (다시 말하면, 1 일자, 3 일자, 5 일자, 7 일자 등) 계측되고 표 1에 따라 0 내지 4의 범위에서 채점되었다. 대변은 굳기 (0 = 정상적인, 2 = 느슨한, 4 = 설사) 및 혈액의 존재 (0 = 없음, 2 = 잠재적, 4 = 육안적 출혈)에 의해 채점되었다. 대변은 ColoScreen ES Lab Pack 대변 잠재성 시험을 이용하여 혈액의 존재에 대해 시험되었다. 기준선과 비교하여 체중 감소는 아래와 같이 채점되었다: 0 = 없음, 1 = 1-5%, 2 = 5-10%, 3 = 10-20% 및 4 = >20%.
관장 주입 투여
쥐는 2-4% 흡입된 이소플루란으로 마취되었고, 그리고 관장 주입은 유연한 Surflo 날개 달린 주입 카테터 (Terumo, OD= 2mm)를 이용하여 전달되었다. 관장 (5mL)은 60 초의 근사 전체 주입 시간 (다시 말하면, 부위마다 20 초)에서 카테터를 점진적으로 이전하면서 항문의 8cm 근위에서 시작하여 5 cm 및 3 cm에서, 카테터에 부착된 주입기를 활용하여 결장을 따라서 3 부위에서 투여되었다 (부위마다 거의 1.6 mL).
FITC- 및 14 C-ECMH로 ECMH 체류 연구
하이드로겔 체류 시간을 결정하기 위해, 쥐는 DSS로 질환 유도 이후에, FITC-표지화된 또는 14C-표지화된 ECMH가 투여되었다. 18마리 쥐는 ECMH 제제 (FITC- 및 14C-ECMH)에 근거하여 2 군으로 나누어지고, 그리고 관장후 2 시간, 12 시간 및 24 시간에 희생되었다 (n = ECMH 제제마다 시점마다 3). FITC-ECMH 치료된 쥐로부터 외식된 결장은 내강 내용물이 형광 영상화에 의해 가시적이도록, 광학적으로 투명하게 처리되었다. 희생 직후에, 모든 표본은 FITC 접합체의 광퇴색을 예방하기 위해 광으로부터 보호되었다. 결장의 광학적 투명화는 Dent의 고정제 (1:4 디메틸술폭시드 (DMSO): 아세톤)에서 2 시간 동안 배양함으로써 시작되었다. 결장은 이후, 투과화되고 Dent의 표백제 (1:4:1 DMSO: 아세톤: H2O2)에서 1 시간 동안 표백되었다. 광학적으로 투명해진 결장은 이후, (Gel 영상장치)에서 영상화되었다. 노출 시간은 FITC-ECMH의 대조 표본에 세팅되고 모든 차후 이미지에 대해 일정하게 유지되었다.
14C 계측을 위해, 각 쥐의 전체 결장은 개별적으로, 액체 질소에서 급속 동결되고 균질화되었다. 조직은 모르타르와 막자로 분쇄되고 균질할 때까지 혼합되었다. 거의 40 mg의 조직 표본이 가속된 질량 분광분석법 (AMS)에 의해 분석되었다. 비처리된 대조는 선천적 조직에서 배경 14C 수준을 감산하는데 이용되었다.
결장 조직의 외식 및 채점
동물은 앞서 설명된 바와 같이 결정된 시점에서 희생되었다. 안락사는 American Veterinary Medical Association (AVMA)에 따라서 CO2 흡입 및 차후 경부 탈구에 의해 달성되었다. 안락사 이후에, 결장은 중간선 절개를 통해 절제되었다. 직장으로부터 맹장까지 걸쳐 있는 연속적 결장 분절이 수집되고 촬영되었다. 결장 길이는 질환 활동성의 지표로서 계측되었다. 결장은 종적으로 개방되고 손상에 대해 육안적으로 사정되었다. 점수는 처리군에 맹검인 조사관에 의해 결정되었다.
길이에서 9 cm인 결장의 원위 영역이 3부분으로 절단되고 종적으로 개방되었다. 검체는 이후, 조직학, 탈체 장기 배양 및 골수세포형과산화효소 계측을 위해 수집되었다. 섹션은 파라핀 포매되었고, 그리고 원위 결장으로부터 근위 결장까지 2 내지 8 cm로부터 획득된 섹션 (5 μm)은 대표적인 조직학적 채점을 위해 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색되었다. 원위와 근위 부분은 2개 슬라이드 위에 분리되었고, 그리고 조직학적 채점이 6명의 맹검 조사관에 의해 수행되었다.
TRITC-덱스트란 투과성 검정
장관 투과성은 TRITC-덱스트란 (분자 질량 4.4 kDa; Sigma)의 경장 투여에 의해 사정되었다. 쥐는 희생 전 4 시간에 TRITC-덱스트란 (1mL, 10 mg/mL)이 투여되었다. 심장 연접으로부터 전혈이 희생의 시점에서 획득되고 혈청 튜브에서 수집되었다. TRITC-덱스트란 계측은 SpectraMax 평판 판독기 (Molecular Devices)에서 삼중으로 수행되었는데, TRITC-덱스트란의 연속 희석액이 표준 곡선으로서 이용되었다.
장기 배양
전층 생검이 앞서 설명된 바와 같이, 3 mm 진피 펀치를 이용하여 7 일자 및 14 일자에 각 실험 동물 및 대조 동물의 결장으로부터 획득되었다. 조직 검체는 37℃ 5% CO2, 95% O2에서 48 시간 동안 배양되었다. 상층액은 수확되고, 그리고 TNF-α 및 PGE2 ELISA 검정을 위해 -80℃에서 보관되었다.
LPMC 단리 및 배양
LPMC가 앞서 설명된 바와 같이, 7 일 동안 식수에서 5% DSS로 대장염 유도 이후에, 쥐로부터 단리되었다. 결장은 외식되고, 장간막 지방 조직이 청소되고, 그리고 페이에르판의 영역이 절제되었다. 결장은 이후, 종적으로 절반으로 분할되고, 조각으로 절단되고, 그리고 제조업체의 사용설명서에 따라서 고유판 해리 키트 (Miltenyi)를 이용하여 단일 세포 현탁액 내로 해리되었다. 현탁액은 이후, 40/70% Percoll 구배를 따라서 분리되었다. 이들 세포는 10% FBS 및 100 U/mL 페니실린과 스트렙토마이신을 내포하는 RPMI 1640에서 현탁되고, 그리고 500 μg/mL ECMH 및 대조 완충액의 첨가와 함께 또는 첨가 없이 웰마다 2x105 세포에서 96-웰 평판에 첨가되었다. 48 시간 동안 배양 후, 상층액이 수집되고, 그리고 TNF-α 및 PGE2에 대한 ELISA 검정이 수행될 때까지 -80℃에서 보관되었다.
장관 상피 세포 (IEC) 배양
시험관내 장벽 기능 검정을 위해, IEC (Caco-2, 계대 24-28, ATCC)가 비필수 아미노산, 1mM 피루브산나트륨 및 20% FBS를 내포하는 MEM에서 약 80% 합류점까지 배양되었다. ECMH에 대한 IEC의 기능적 반응은 제조업체의 사용설명서에 따라서 신속한 분화 시스템 (Corning Biocoat HTS Caco-2 검정)을 이용하여 평가되었다. 합류성 및 분화된 세포 단층은 100 ng/mL LPS로 2 시간 동안 공격되고, 그리고 이후, ECMH로 48 시간 동안 처리되었다. IEC의 기능적 반응은 경상피 전기 저항 (TEER) 및 상피 카드헤린 (E-카드헤린) 세포 부착 단백질의 존재에 의해 계측되었다.
경상피 전기 저항 (TEER) 계측
Caco-2 단층의 TEER은 상피 볼트옴미터 (EVOM2, World Precision Instruments)로 일과적으로 계측되었다. Caco-2 세포를 파종하기 전, 지지 필터 및 완충액 매체의 전기 저항이 계측되고, 그리고 단층의 TEER을 계산하기 위해 단층으로 측정된 전체 전기 저항으로부터 감산되었다. 300 Ωxcm2보다 큰 TEER 값을 갖는 분화된 단층만 연구에서 이용되었다.
면역표지화
ECMH 치료 이후에 대식세포 반응을 결정하기 위해, 파라핀 포매된 조직학 섹션은 M1-유사 및 M2-유사 대식세포 표현형의 지표, TNFα 및 CD206에 대해 면역표지화되었다. 조직 섹션은 자일렌을 이용하여 탈파라피화되고 등급 분류된 에탄올 계열을 이용하여 재수화되었다. 열-매개된 항원 회수는 95℃에서 20 분 동안 0.001 M 구연산염 완충액 (pH= 6)을 이용하여 수행되었다. 조직 섹션은 15 분 동안 Tris-완충된 식염수 Tween-20 (TBST), 그 이후에 1 시간 동안 차단 완충액 (2% 말 혈청 / 1% 소 혈청 알부민/ 0.05% tween-20/ 0.05% triton-x-100)에서 배양에 종속되었다. 차단 완충액에서 희석된 일차 항체가 4 ℃에서 가습된 챔버에서 16 h 동안 슬라이드에 첨가되었다. 슬라이드는 이후, 실온에서 가습된 챔버에서 1h 동안 이차 항체의 첨가에 앞서 TBS에서 3회 세척되었다. 슬라이드는 핵을 가시화하기 위해 4'6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)로 대비염색되었다. 이용된 일차 항체는 범 대식세포 마커로서 1:150 희석도에서 생쥐 항-쥐 CD68 (AbD Serotec, Raleigh, NC), M1-유사 마커로서 1:200 희석도에서 TNFα에 대한 토끼 다중클론 (Abcam), 그리고 1:100 희석도에서 염소 다중클론 CD206 (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA)이었다. 이용된 이차 항체는 Alexa Fluor 당나귀 항생쥐 594 (1:200, Invitrogen), Alexa Fluor 당나귀 항염소 488 (1:200, Invitrogen), 그리고 Alexa Fluor 당나귀 항토끼 546 (1:200, Invitrogen)이었다. 모든 일차 항체는 쥐 에피토프와 교차반응하는 것으로 확증되었다. 조직 섹션은 조직 섹션마다 5개 랜덤 필드에서 영상화되었다. 마커의 정량은 CellProfiler 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 개발된 맞춤 이미지 분석 알고리즘을 이용하여 달성되었다.
통계학적 분석
표본 크기는 이전에 공개된 유관한 연구와 조합으로 예비 연구 데이터를 이용한 전력 분석에 근거하여 결정되었다. 모든 동물은 넘버링되고 군에 무작위로 배정되었다. 채점을 책임지는 모든 조사관은 실험 군화에 맹검이었다. 정량적 결과는 군 사이에 차이를 결정하기 위해, 1-원 또는 2-원 분산 분석 (ANOVA) 및 사후 Tukey 검증과 비교되었다. 모든 통계학적 분석은 SPSS 통계학적 분석 소프트웨어 (SPSS, IBM)를 이용하여 수행되었다. 데이터는 달리 명시되지 않으면, 평균 ± 표준 오차로서 보고된다.
결과
ECMH는 결장 조직에 점착성이다
ECMH는 역열 겔화의 독특한 성질을 갖고, 그리고 하이드로겔 성질은 재료 특징에 의존한다. 관장은 염증이 생긴 결장에 표적화된 전달을 위한 기본형으로서 경등도 내지 중등도 대장염에서 일과적으로 이용된다. ECMH의 치료 효력은 결장 벽에 부착되고 염증이 생긴 세포와 접속하는 이의 능력에 의존한다. 부착 시험의 결과는 ECMH이 건강한 결장에서 시험될 때 부착 강도에서 용량 의존성 증가로, 점막점착성이라는 것을 증명한다 (도면 12A). 연구에서 이용된 8 mg/mL ECMH 용량은 건강한 조직과 비교할 때 대장염 쥐 결장에서 동등한 부착 강도를 유지시킨다 (도면 12B). 점막 접착은 모든 열가역적 겔의 성질이 아닌데, 그 이유는 Pluronic F-127 (20%; Sigma)이 음성 대조보다 큰 부착 강도를 보여주지 않았기 때문이다 (데이터 제시되지 않음). 대장염 쥐에 관장을 통해 전달될 때, ECMH의 체류 시간은 24 시간보다 크다. 관장을 투여한 후 2 시간에, 14C-ECMH의 ~50%가 남아있고, 그리고 초기 ECMH 관장의 대략 10%가 24 시간 후 남아있다 (도면 12C). 이들 결과는 FITC-ECMH의 가시화에 의해 확증되었다 (도면 12D). 종합하면, 이들 조사 결과는 ECMH 재료 물성은 액체로서 주입을 허용하고, 그리고 차후 겔화는 치료가 최소한 24 시간 동안 국부화된 상태로 유지되도록 담보한다는 것을 증명한다. 상기 조사 결과에 따라서 일일 관장 치료가 ECMH의 치료 효력을 계측하는데 이용되었다.
ECMH 치료는 질환 상태를 경감한다
DSS 실험적 모형은 상피 장벽 결함을 갖는 널리 인정된 UC-유사 자기 한정 대장염 표현형이다. 대장염의 임상적 징후 (가령, 체중 감소, 혈변 및 대변 굳기)는 식수에서 5% DSS에 3 일간 노출 이후에 현성하고 6 일 이후에 그들의 피크에 도달한다 (도면 4). ECMH 치료는 UC의 임상적 증상을 축소시킨다. 동물은 대조와 비교하여 더욱 적은 체중을 상실하고 (1 및 3 일자에), 그리고 대변에서 더욱 적은 혈액을 보였다 (3 및 5 일자에). 결장의 단축은 0 일자에는 존재하지만 (도면 4D), 7 및 14 일자까지는 모든 군을 교차하여 더 이상 눈에 띄지 않는다 (도면 8D). ECMH 치료는 7 일자에서 대조와 비교하여 결장 육안 해부학적 점수에서 감소를 야기하지 않는다 (도면 8E). 조직형태학적 분석 역시 ECMH이 대표적인 이미지에서 명백하게 나타난 바와 같이 현재의 모형에서 치료적이라는 것을 보여주었다 (도면 6). ECMH 치료는 염증의 축소된 징후를 유발하고, 그리고 7 및 14 일에 원위와 근위 조직 섹션 둘 모두에서 궤양화의 정도를 낮추었다 (도면 5). 이들 데이터는 ECMH 관장 주입 섭생이 UC의 모형에서 질환의 임상적 징후 및 조직학적 징후를 효과적으로 감소시킨다는 것을 증명한다.
ECMH는 상피 장벽 기능을 복원한다
결장에서 상피 장벽은 질환 진행에서 중요한 역할을 할 수 있다. 소화관 장벽 기능에서 결함 및 증가된 투과성은 심지어 무손상 면역계의 존재에서도, 염증성 장 질환을 야기할 수 있다. TRITC-덱스트란 투과성 검정의 결과는 ECMH 치료된 동물의 장벽 기능은 7 일에 건강한 동물과 유사한 반면, 대조에서 결장 상피 장벽은 건강한 대조와 비교하여 손상된 상태로 남아있다는 것을 보여주었다 (도면 13A). IEC의 분화된 및 LPS-손상된 단층은 TEER 판독에 의해 보여 지는 바와 같이, 기능적 회복으로 ECMH 치료에 반응한다 (도면 13B). 증가된 장벽 기능은 소화관에서 가장 중요한 세포-세포 부착 단백질 중에서 한 가지인 E-카드헤린의 증가된 존재에 상응한다. ECMH 치료는 음성 대조와 비교하여 E-카드헤린 양성 세포에서 거의 50% 증가를 야기한다 (도면 13C-D). 이들 데이터는 ECMH가 상피 장벽 기능의 기능적 향상을 조장하고, 그리고 ECMH가 상피 세포 손상을 제한함으로써 또는 점막 완전성을 능동적으로 구조함으로써 치료적으로 작용할 수 있다는 것을 증명한다.
염증에서 ECMH 역할
염증이 UC의 병인의 일부일 수 있기 때문에, 효과적인 요법은 염증 반응을 매개한다. IBD의 염증성 매개인자 (다시 말하면, TNF-α 및 PGE2)가 염증에 대한 ECMH의 효과를 평가하는데 이용되었다. 대장염 쥐로부터 단리된 LPMC는 도말되고 ECMH에 노출되었다. ECMH 치료는 LPMC에 의한 TNF-α의 생산에서 실제적인 감소를 유발하지만 (도면 11A), PGE2 생산에 대해서는 어떤 효과도 없었다 (도면 11B). 하지만, ECMH 또는 대조의 1-주 관장 섭생 이후에 쥐로부터 수집된 장기 배양액은 ECMH 치료된 동물에서 분비된 PGE2는 건강한 대조와 유사한 반면, 운반제 대조는 유의미하게 상승된 수준의 점막 PGE2를 갖는다는 것을 보여주었다 (도면 11C). TNF-α의 분비된 수준은 연구된 시점에서 실험 조건과 상관없이 장기 배양액에서 검출 미만이었다.
대식세포 표현형에 대한 ECMH의 효과는 TNF-α 또는 CD206을 공동발현하는 결장에서 CD68+ 대식세포의 숫자를 정량함으로써 평가되었다 (도면 10에서 대표적인 이미지를 참조한다). 흥미롭게도, CD68+, CD206+ 및 TNF-α+ 세포의 숫자는 모든 치료 군을 교차하여 동일하지만 (도면 9), ECMH 치료는 7 일자에 CD68+/TNF-α+ 염증성 대식세포의 숫자에서 감소를 유발하였다 (도면 8). ECMH가 전역 TNF-α+ 세포의 양에는 영향을 주지 않았지만 CD68+/TNF-α+ 세포의 숫자를 감소시켰기 때문에, ECMH는 결장 조직 내에 존재하는 염증성 대식세포의 숫자를 감소시킴으로써 대식세포 반응을 조정하는데 직접적인 역할을 할 수 있다.
비록 본 발명이 일정한 바람직한 구체예에 관하여 상세하게 설명되긴 했지만, 다음 청구항에서 설명되고 규정된 바와 같은 발명의 범위 및 사상 내에 변이 및 변형이 존재한다.

Claims (33)

  1. 척추동물의 하부 장관 조직의 장애 또는 질환, 또는 상기 조직에 대한 손상을 치료하거나, 개선하거나 또는 치유하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은 결장절제술 없이 병든 또는 손상된 조직의 치료, 개선 또는 치유를 달성하기 위해 병든 또는 손상된 조직의 재건 조직 재형성을 제공하는 세포외 기질 (ECM) 이식편 또는 골격 조성물을 병든 또는 손상된 조직의 부위에 적용하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, ECM은 소장, 대장 및 방광에서 선택되는 조직으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, ECM은 소장 점막하층 (SIS) 조직으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 청구항 2에 있어서, ECM은 방광 기질 (UBM) 조직으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, UBM은 상피 기저막 층이 없는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, ECM은 고체 시트 또는 튜브로서 전달을 위해 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, ECM은 용액, 현탁액 및 겔에서 선택되는 유체로서 전달을 위해 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, ECM은 약물 또는 생물제제를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 청구항 7에 있어서, 유체 ECM은 내시경적으로 전달되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 소장 조직은 크론병, 궤양성 대장염, 가족성 샘종 폴립증, 히르쉬스프룽, 협착, 직장염, 직장 점막염, 결장 또는 직장암, 또는 누공의 결과로서 병들거나 또는 손상된 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 척추동물의 하부 장관 조직의 장애 또는 질환, 또는 상기 조직에 대한 손상을 치료하거나, 개선하거나 또는 치유하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은 아래의 단계에 의해 상기 손상된 또는 병든 조직을 대체하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a. 소장 조직, 대장 조직 및 방광 조직에서 선택되는 조직으로부터 유래된 세포외 기질 (ECM) 이식편을 제조하는 단계; 및
    b. 병든 또는 손상된 하부 장관 조직 위에 ECM 이식편을 주입하거나, 이식하거나, 투여하거나, 적용하거나, 밀착시키거나 또는 부착하는 단계,
    여기서 상기 장애, 질환, 또는 하부 장관 조직에 대한 손상은 결장절제술 없이 재건 조직 재형성에 의해 치료되거나, 개선되거나 또는 치유됨.
  12. 청구항 11에 있어서, 장애, 질환 또는 손상을 전시하는 조직은 결장 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 청구항 11에 있어서, 조직 장애, 질환 또는 손상은 크론병, 궤양성 대장염, 가족성 샘종 폴립증, 히르쉬스프룽, 협착, 결장 또는 직장암, 직장염, 직장 점막염, 또는 누공으로부터 발생하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 청구항 11에 있어서, ECM 이식편 조성물은 시트 또는 튜브의 형태에서 고체 이식편 또는 골격으로서 제조되고 전달되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 청구항 11에 있어서, ECM 이식편 조성물은 유동화된 겔, 용액 또는 현탁액으로서 제조되고 전달되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, ECM은 관장에 의해 전달되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 청구항 15에 있어서, ECM은 내시경적으로 전달되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 청구항 8에 있어서, ECM 이식편은 소장 점막하층 (SIS)으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 청구항 11에 있어서, 병든 또는 손상된 하부 장관 조직 위에 ECM 이식편을 주입하거나, 이식하거나, 투여하거나, 적용하거나, 밀착시키거나 또는 부착하기에 앞서, 장애, 질환 또는 손상을 전시하는 조직을 절제하거나 또는 제거하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 절제하거나 또는 제거하는 단계는 내시경 점막 적출을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 청구항 19에 있어서, 절제하거나 또는 제거하는 단계는 EDTA 세척을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 환자에서 염증성 장 질환 (IBD)을 치료하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은 아래 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 장관 조직으로부터 유래된 세포외 기질 조성물을 제공하는 단계; 및
    b) 병든 또는 손상된 조직의 건강한 소장 조직으로의 원지 대체를 유도하기 위해, IBD를 전시하는 환자의 장관 조직에 상기 조성물을 적용하거나 또는 투여하는 단계.
  23. 청구항 22에 있어서, IBD는 궤양성 대장염 및 크론병에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 청구항 23에 있어서, 세포외 기질 조성물의 적용 또는 투여는 줄기 세포의 결장 조직으로의 이주를 자극하고, 여기서 이들 줄기 세포는 원지에서 발달하여, 궤양성 대장염 또는 크론병을 전시하는 결장 점막 조직의 재건 조직 재형성을 달성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 청구항 22에 있어서, ECM 이식편 조성물은 유동화된 겔, 용액 또는 현탁액으로서 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 청구항 22에 있어서, ECM은 시판되는 시트 또는 튜브인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 청구항 22에 있어서, ECM은 관장에 의해 투여된 용액 또는 현탁액인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 청구항 22에 있어서, ECM은 내시경적으로 투여된 용액 또는 현탁액인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 청구항 22에 있어서, 적용 또는 투여 단계 b)에 앞서, 상기 방법은 병든 또는 손상된 결장 점막 조직을 절제하거나 또는 제거하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 청구항 29에 있어서, 절제하는 단계는 내시경 점막 적출 (EMR) 또는 EDTA를 이용한 제거를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 청구항 22에 있어서, 상기 방법은 아래와 같이 구성된 군에서 선택되는 임의선택적 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 환자에서 회장조루술을 창출하는 단계, 그리고
    b) 새로운 결장 점막층이 형성되거나 또는 발달하는 동안, 완전 비경구 영양을 이용하여 환자를 정맥내 영양공급하는 단계.
  32. 대장 점막층을 대체하기 위한 이식편으로서 이용을 위한 조직 특이적 세포외 기질 조성물에 있어서, 상기 조성물은 소장 조직으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 조직 특이적 세포외 기질 조성물.
  33. 청구항 29에 있어서, 소장 점막층은 결장인 것을 특징으로 하는 조직 특이적 세포외 기질 조성물.
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