ES2945740T3 - Aplicaciones oculares de vesículas unidas a matriz (MBV) - Google Patents

Abstract

En el presente documento se describen métodos para aumentar la supervivencia de las células ganglionares de la retina en un sujeto que lo necesite. Estos métodos incluyen seleccionar un sujeto que necesite una mayor supervivencia de las células ganglionares de la retina y administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de nanovesículas aisladas derivadas de una matriz extracelular (MBV). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Aplicaciones oculares de vesículas unidas a matriz (MBV)

SECTOR

La presente invención se refiere al sector de la oftalmología, específicamente a la utilización de nanovesículas unidas a matriz (MBV, matrix bound nanovesicles) para aumentar la supervivencia de las células del ganglio retiniano (RGC, retina! ganglion cells) y al tratamiento de enfermedades oftálmicas asociadas con una disminución de la supervivencia de las RGC.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Existe una gran necesidad insatisfecha de terapias dirigidas a la reparación de nervios después de lesiones oculares y enfermedades neurodegenerativas que implican la muerte de RGC. Aproximadamente 285 millones de personas en todo el mundo sufren grados variables de pérdida permanente de la visión (OMS, “Visual impairment and blindness” disponible en línea en who.int/mediacentre/factsheets/fs282/en/. agosto de 2014) debido a enfermedades o traumatismos en el ojo. Solo en los Estados Unidos, se producen anualmente 2,5 millones de casos de lesiones oculares, de los cuales 50.000 dan como resultado ceguera permanente (Owens y Mutter, Statistical Brief #112. Healthcare Cost and Utilization Project (HCUP) Statistical Briefs. Rockville (MD) 2006). La regeneración fallida del axón de las RGC sigue siendo una barrera para la reparación ocular debido a la variedad de factores inducidos por lesión que suprimen la regeneración del axón. Estos factores incluyen una deficiente capacidad intrínseca de crecimiento del axón (Goldberg et al., Neuron 33(5): 689-702, 2002), pérdida de soporte neurotrófico (Mansour-Robaey et al., Proc Natl Acad Sci U S A 91(5): 1632-1636, 1994), moléculas inhibidoras expresadas por la glía (McKeon et al., J Neurosci 19(24): 10778-10788, 1999) o liberadas durante la lesión celular (McKeon et al., J Neurosci 11(11): 3398-3411, 1991), y una respuesta inmunitaria inflamatoria (Darlington et al., J Neuropathol Exp Neurol 67(6): 590-599m 2008). En modelos en roedores, los enfoques multifactoriales dirigidos a uno o más de estos factores mediante manipulaciones moleculares o genéticas pueden mejorar la supervivencia y la regeneración de las neuronas. Sin embargo, utilizando las modalidades disponibles actualmente, el número de neuronas que se regeneran con éxito es bajo (Tropea et al., J Neurosci 23(18): 7034-7044, 2003) con una reinervación diana deficiente y una recuperación funcional escasa o nula. Por tanto, sigue existiendo una necesidad de procedimientos para regenerar axones, tales como en el ganglio retiniano.

Las estrategias de medicina regenerativa que utilizan tecnología de matriz extracelular (ECM, extracelular matrix) han tenido éxito, preclínica y clínicamente, en la promoción de la reparación tisular en el músculo y los tejidos conectivos. La ECM es el microentorno único de proteínas y polisacáridos que define las identidades y funciones tanto celulares como tisulares. La tecnología de ECM utiliza bioarmazones de ECM xenogénicos, derivados de la descelularización de tejidos sanos. Aunque se desconocen los mecanismos exactos, los bioarmazones de ECM pueden aumentar la señalización antiinflamatoria, similar a M2, en los macrófagos y dirigir el reclutamiento y la diferenciación celulares apropiados para el sitio para disminuir la cicatrización y aumentar la reparación de tejido apropiado para el sitio en tejidos que el cuerpo no puede reparar por defecto. Recientemente, se han descubierto vesículas unidas a matriz (MBV) en todos los bioarmazones de ECM experimentales y comerciales probados, y los datos preliminares muestran que las MBV pueden recapitular muchos de los efectos positivos de la ECM original. En el presente documento se da a conocer una nueva utilización para las MBV.

Faust et al., (J. Biomaterials Applications, 31, 2017, 1277-1295) da a conocer vesículas unidas a matriz (MBV) obtenidas de matriz extracelular de vejiga urinaria porcina (UBM-ECM, porcine urinary bladder extracelular matrix) y su capacidad para aumentar la viabilidad de las neuronas y estimular la excrecencia de neuritas hipocámpicas primarias en el sistema nervioso central (SNC).

Ren et al., (eNeuro, 2015, XP055553632) revisa la utilización de tecnología de matriz extracelular en el tratamiento de lesiones en la retina o el nervio óptico, pero no da a conocer las MBV.

La Patente WO 2017/151862 A1 da a conocer MBV derivadas de ECM CD63- CD81- para tratar el cáncer y para utilizaciones terapéuticas relacionadas con la activación de macrófagos.

Huleihel et al., (Science Advances, 2, 2016, 1-11) describen el efecto de las MBV sobre la activación de macrófagos y la diferenciación de células de neuroblastoma.

Van der Merwe et al., (Neural Regeneration Research, 12, 2017, 1597-1599) es una revisión de las MBV, sus actividades biológicas y utilizaciones terapéuticas. No se menciona ningún efecto sobre las células de la retina ni ninguna utilización terapéutica en oftalmopatías.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

La presente invención reivindicada da a conocer nanovesículas aisladas derivadas de una matriz extracelular para su utilización en el tratamiento de una serie de trastornos como se establece en la reivindicación 1 adjunta.

La invención reivindicada en el presente documento también da a conocer una composición que comprende una cantidad eficaz terapéuticamente de nanovesículas aisladas derivadas de una matriz extracelular para su utilización en el tratamiento de una serie de trastornos como se establece en la reivindicación 7 adjunta.

Los anteriores y otros objetivos, características y ventajas de la presente invención se harán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, que continúa con referencia a las figuras adjuntas.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS

FIGURAS 1A-1B. Las MBV aumentan el crecimiento de neuritas de las RGC. (A) La viabilidad de las RGC no se modificó ni con UBM-ECM ni con MBV (5-80 |xg/ml). Los datos se normalizaron a ningún control de tratamiento. (B) El crecimiento total de neuritas de las RGC aumentó con el tratamiento con MBV (5-20) |xg/ml y disminuyó con dosis de MBV de 50-80 |xg/ml. Las barras de error indican el SEM, n=3. *p<0,01 en comparación con los medios; **p<0,001 en comparación con los medios.

FIGURAS 2A-2H. Las MBV suprimen la secreción de citocinas proinflamatorias tanto de la microglía como de los astrocitos. (A-C) En microglía no sensibilizada, LPS/IFNy aumentó las citocinas proinflamatorias. En microglía sensibilizada, la secreción de IL-1 p, IL-6 y TNF-a permaneció elevada en los medios, pero la secreción de las tres citocinas se redujo significativamente tanto por UBM-ECM como por MBV. (D-F) Similar a la microglía, LPS/IFNy aumentó la sección de citocinas proinflamatorias de los astrocitos y estos aumentos se redujeron tanto por UBM-ECM como por MBV. (G-H) Las tablas muestran las concentraciones reales de citocinas para microglía (G) y astrocitos (H) sensibilizados y no sensibilizados. Las barras de error representan el SEM, los datos representan muestras por triplicado de tres experimentos independientes. ANOVA unidireccional entre grupos, *p<0,05.

FIGURA 3. Las MBV aumentan la supervivencia de las RGC en medios acondicionados de astrocitos proinflamatorios. Las RGC se trataron con medios de astrocitos cultivados con sobrenadantes acondicionados por microglía sensibilizada o no sensibilizada. Después de 3 días, las RGC tratadas con medios no sensibilizados con LPS/IFNy y medios sensibilizados con medios mostraron un 100 % de muerte de RGC. Las RGC tratadas con medios sensibilizados con MBV o sensibilizados con UBM-ECM mostraron una mayor supervivencia. Datos normalizados a medios no acondicionados. Las barras de error representan el SEM, los experimentos representan n>300 neuronas analizadas a partir de 3 experimentos independientes. #p<0,01 en comparación con medios no acondicionados.

FIGURA 4. Toxicidad por MBV in vivo. Se inyectaron MBV por vía intravítrea a 5, 10 y 20 |xg/ml, en los días 0, 2 y 7 en ojos de rata sanos y sin lesiones. En comparación con los controles no inyectados, la viabilidad de las RGC no se vio afectada por PBS o MBV a 5 |xg/ml, mientras que las MBV redujeron la viabilidad de las RGC a 10 y 20 |xg/ml en la retina central pero no en la periférica. N=5 animales por grupo, 12 ubicaciones analizadas por retina. *p<0,05 en comparación con el control no inyectado. Los datos muestran que se puede utilizar una concentración de MBV de 5 |xg/ml sin afectar a la viabilidad de las RGC en la retina central o periférica in vivo.

FIGURAS 5A-5C. Las MBV promueven una mayor supervivencia de las RGC después de una lesión por IOP.

(A) Imágenes representativas que muestran cuerpos celulares de RGC comarcados con RBPMS y Brn3A en la retina central y periférica en ojos de control no lesionados (Control), después de elevación de la IOP no tratada (IOP), elevación de la IOP tratada con PBS y tratada con ^m B^v (IOP+MBV). (B-C) En comparación con los ojos no tratados y los tratados con PBS, el análisis cuantitativo mostró que las MBV aumentaban la viabilidad de las RGC tanto en la retina central (B) como en la periférica (C). Las barras de error representan el SEM, n=5 animales por grupo, 12 imágenes retinianas por retina, con un total de 60 imágenes por grupo. La significación se determinó mediante ANOVA unidireccional con prueba de Tukey post-hoc entre grupos; #p<0,05, ##p<0,01 en comparación con los medios; *p<0,05 entre grupos

FIGURAS 6A-6C. Las MBV suprimen la degeneración del axón de las RGC. (A) Imágenes representativas que muestran axones de RGC marcados con CtxB en la retina central y periférica en ojos de control no lesionados (Control), ojos con IOP no tratados (IOP), ojos con IOP tratados con PBS y ojos con IOP tratados con MBV. (B) Imágenes representativas que muestran axones de RGC marcados con CtxB en el nervio óptico de ojos de control no lesionados (control), ojos con IOP no tratados (IOP), ojos con IOP tratados con PBS y ojos con IOP tratados con MBV. (C) El análisis cuantitativo de la expresión de CtxB mostró que las MBV redujeron la pérdida de axones de las RGC. Las barras de error representan el SEM, n=5 animales por grupo y 15 imágenes por nervio óptico, totalizando 75 imágenes por grupo. La significación se determinó mediante ANOVA unidireccional con prueba de Tukey post-hoc entre grupos; #p<0,05, ##p<0,01 en comparación con los medios; *p<0,05 entre grupos.

FIGURAS 7A-7B. Las MBV disminuyen la expresión de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP, glial fibrillar acidicprotein) inducida por IOP en el nervio óptico. (A) Imágenes representativas que muestran la expresión de GFAP en el nervio óptico de ojos de control no lesionados (control), ojos con IOP no tratados (IOP), ojos con IOP tratados con PBS y ojos con ⁱO^p tratados con MBV. (B) El análisis cuantitativo de la inmunorreactividad de GFAP mostró que las inyecciones intravítreas de MBV reducen la expresión de GFAP en el nervio óptico. Las barras de error representan SEM, n=5 animales por grupo, 15 imágenes por nervio óptico, totalizando 75 imágenes analizadas por grupo. La significación se determinó mediante ANOVA unidireccional con prueba de Tukey post-hoc entre grupos; #p<0,001, en comparación con los medios; *p<0,001 entre grupos.

FIGURAS 8A-8B. Las MBV aumentan la expresión de GAP-43 en el nervio óptico. (A) Imágenes representativas que muestran la expresión de GAP-43 en el nervio óptico de ojos de control no lesionados (control), ojos con IOP no tratados (IOP), ojos con IOP tratados con PBS y ojos con IOP tratados con MBV. (B) El análisis cuantitativo de la inmunorreactividad de GAP-43 mostró que las inyecciones intravítreas de MBV aumentan la expresión de GAP-43 en el nervio óptico. Las barras de error representan el SEM, los experimentos representan n=5 animales por grupo, 15 imágenes por nervio óptico por animal, totalizando 75 imágenes analizadas por grupo. La significación se determinó mediante ANOVA unidireccional con prueba de Tukey post-hoc entre grupos; #p<0,05, en comparación con los medios; *p<0,05 entre grupos.

FIGURAS 9A-9D. La inyección de MBV después de una lesión isquémica aumenta la amplitud de la respuesta fotópica negativa (PhNR, photopic negative response) y acorta la latencia. (A) Comparación de la respuesta de la electrorretinografía (ERG) en una retina no lesionada (línea azul) o una retina lesionada por IOP (línea roja) 14 días después de la elevación de la IOP. (B) Comparación de la respuesta de ERG en una retina no lesionada (línea azul) o la retina de un ojo tratado con MBV después de una lesión por IOP (línea roja), 14 días después de la elevación de la IOP. (C) Cuantitativamente, la elevación de la IOP con y sin inyección de PBS disminuyó la amplitud de la respuesta fotópica negativa (PhNR) en comparación con el control no lesionado. El tratamiento con MBV aumentó la amplitud de la PhNR en comparación con los grupos no tratados y no hubo diferencia en la amplitud de PhNR entre los grupos no lesionados y los tratados con MBV. (D) La elevación de la IOP disminuyó la latencia de la PhNR y aumentó significativamente en comparación con la elevación de la IOP con el tratamiento con MBV. C, D. Las barras de error representan el SEM, n=5 animales por grupo, 3 registros de ERG por animal. La significación se determinó mediante ANOVA unidireccional con prueba de Tukey post-hoc entre grupos; #p<0,05, en comparación con los medios; *p<0,05 entre grupos.

LISTADO DE SECUENCIAS

Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos enumeradas en la lista de secuencias adjunta se muestran utilizando abreviaturas de letras estándar para las bases de nucleótidos y un código de tres letras para los aminoácidos, tal como se define en 37 C.F.R. 1.822. Solo se muestra una hebra de cada secuencia de ácido nucleico, pero se entiende que la hebra complementaria está incluida por cualquier referencia a la hebra mostrada. La lista de secuencias se envía como un archivo de texto ASCII [4 de mayo de 2018, 1.121 bytes], que se incorpora como referencia en el presente documento.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Los armazones biológicos compuestos por matriz extracelular (ECM) se han desarrollado como materiales de malla quirúrgica y se utilizan en aplicaciones clínicas que incluyen reparación de hernias ventrales (Alicuban et al., Hernia.

2014;18(5):705-712), reconstrucción musculoesquelética (Mase et al., Orthopaedics. 2010;33(7):511), reconstrucción esofágica (Badylak et al., Tissue Eng Part A. 2011; 17(11-12):1643-50), reemplazo de duramadre (Bejjani et al., J Neurosurg. 2007;106(6):1028-1033), reparación de tendones (Longo et al., Stem Cells Int.

2012;2012:517165), reconstrucción mamaria (Salzber, Ann Plast Surg. 2006;57(1):1-5), entre otras (Badylak et al., Acta Biomater. 2009;5(1):1-13).

Las nanovesículas unidas a matriz (MBV) están incrustadas dentro de la red fibrilar de la ECM. Estas nanopartículas protegen su carga contra la degradación y la desnaturalización durante el proceso de fabricación del armazón con ECM. Los exosomas son microvesículas que previamente se han identificado casi exclusivamente en fluidos corporales y sobrenadantes de cultivos celulares. Se ha demostrado que las MBV y los exosomas son distintos. Las MBV se diferencian de otras microvesículas, por ejemplo, en que son resistentes a la digestión con detergente y/o enzimática, contienen un grupo de diferentes microARN y están enriquecidas en miR-145. Las MBV no tienen proteínas de superficie características que se encuentran en otras microvesículas tales como los exosomas. Como se da a conocer en el presente documento, las MBV afectan a la supervivencia celular y modulan una respuesta de cicatrización para preservar o restaurar la función neurológica. Se da a conocer que las MBV regulan de forma diferencial la supervivencia de las RGC, el crecimiento de axones y la remodelación de tejidos.

Términos

Las siguientes explicaciones de términos y procedimientos se proporcionan para describir mejor la presente invención y para guiar a los expertos en la materia en la puesta en práctica de la presente divulgación. Las formas singulares “un”, “una”, y “el” “la” se refieren a uno o más de uno, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la expresión “que comprende una célula” incluye células individuales o múltiples y se considera equivalente a la frase “que comprende, como mínimo, una célula”. El término “o” se refiere a un único elemento de elementos alternativos establecidos o una combinación de dos o más elementos, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Como se utiliza en el presente documento, “comprende” significa “incluye”. Por tanto, “que comprende A o B”, significa “que incluye A, B, o A y B”, sin excluir elementos adicionales. Las fechas de los números de registro de GENBANK® a los que se hace referencia en el presente documento son las secuencias disponibles, como mínimo, desde el 16 de septiembre de 2015. Todas las referencias, solicitudes de patentes y publicaciones, y los números de registro de GENBANK® citados en el presente documento se incorporan como referencia. Para facilitar la revisión de las diversas realizaciones de la presente invención, se dan a conocer las siguientes explicaciones de términos específicos:

Animal: Organismos vivos vertebrados multicelulares, una categoría que incluye, por ejemplo, mamíferos y aves. El término mamífero incluye mamíferos tanto humanos como no humanos. De manera similar, el término “individuo” incluye tanto individuos humanos como veterinarios.

Biocompatible: Cualquier material que, cuando se implanta en un individuo mamífero, no provoca una respuesta adversa en el individuo. Un material biocompatible, cuando se introduce en un individuo, es capaz de realizar su función prevista y no es tóxico ni perjudicial para ese individuo, ni induce el rechazo inmunológico del material en el individuo.

Enriquecido: Un proceso mediante el cual un componente de interés, tal como una nanovesícula, que se encuentra en una mezcla, tiene una relación mayor entre la cantidad de ese componente y la cantidad de otros componentes no deseados en esa mezcla después del proceso de enriquecimiento en comparación con antes del proceso de enriquecimiento.

Matriz extracelular (ECM): Una mezcla compleja de biomoléculas y/o biomacromoléculas estructurales y funcionales que incluyen, pero sin limitación, proteínas estructurales, proteínas especializadas, proteoglucanos, glucosaminoglucanos y factores de crecimiento que rodean y soportan a las células dentro de los tejidos y, a menos que se indique lo contrario , es acelular. Se puede considerar que las preparaciones de ECM están “descelularizadas” o son “acelulares”, lo que significa que las células se han eliminado del tejido de origen a través de procesos descritos en el presente documento y conocidos en la técnica. “Material derivado de ECM”, tal como una “nanovesícula derivada de ECM”, “nanovesícula unida a matriz”, “MBV” o “nanovesícula derivada de una ECM”, es una nanovesícula que se prepara a partir de una ECM natural o de un fuente in vitro en la que la ECM es producida por células cultivadas. Las nanovesículas derivadas de ECM se definen a continuación.

Glaucoma: Un trastorno ocular caracterizado por la muerte de células del ganglio retiniano, la excavación de la cabeza del nervio óptico y la pérdida gradual del campo visual. Se sabe comúnmente que una presión intraocular anormalmente alta es perjudicial para el ojo y es uno de los principales factores de riesgo en el glaucoma. En pacientes con glaucoma, la presión intraocular alta puede dar como resultado cambios degenerativos en la retina. “Hipertensión ocular” se refiere a la situación clínica en individuos con una presión intraocular anormalmente alta sin ninguna manifestación de defectos en el campo visual o la cabeza del nervio óptico. Los individuos con hipertensión ocular corren el riesgo de conversión en glaucoma y el riesgo se correlaciona con mediciones de presión intraocular más altas.

El glaucoma se puede dividir en forma de ángulo abierto y formas de ángulo cerrado y clasificarse además en formas agudas y crónicas. También hay un glaucoma de tensión normal. El glaucoma puede ser un glaucoma primario o secundario. Más del 80 % de todos los casos de glaucoma son glaucoma crónico de ángulo abierto (COAG, chronic open angle glaucoma), también llamado glaucoma primario de ángulo abierto. Cualquiera de estas formas de glaucoma puede tratarse utilizando los procedimientos dados a conocer en el presente documento.

El “glaucoma primario de ángulo cerrado” es causado por el contacto entre el iris, la malla trabecular y la córnea periférica que, a su vez, obstruye el flujo del humor acuoso fuera del ojo. Este contacto entre el iris y la malla trabecular (TM, trabecular meshwork) puede dañar gradualmente la función de la malla hasta que deja de seguir el ritmo de la producción acuosa y la presión aumenta. En más de la mitad de los casos, el contacto prolongado entre el iris y la TM provoca la formación de sinequias (en realidad, “cicatrices”). Estas causan una obstrucción permanente del flujo de salida de acuoso. En algunos casos, la presión puede acumularse rápidamente en el ojo, causando dolor y enrojecimiento (cierre angular sintomático, o llamado “agudo”). En esta situación, la visión puede volverse borrosa y se pueden ver halos alrededor de luces brillantes. Los síntomas que lo acompañan pueden incluir cefalea y vómitos. El diagnóstico se puede hacer a partir de signos y síntomas físicos: pupilas medianamente dilatadas y que no responden a la luz, córnea edematosa (turbia), visión reducida, enrojecimiento y dolor. Sin embargo, la mayoría de los casos son asintomáticos. Antes de la pérdida muy severa de la visión, estos casos solo pueden identificarse mediante un examen, generalmente realizado por un profesional del cuidado de los ojos.

El “glaucoma primario de ángulo abierto” se produce cuando el daño del nervio óptico da como resultado una pérdida progresiva del campo visual. No todas las personas con glaucoma primario de ángulo abierto tienen presión ocular más alta de lo normal. El aumento de la presión es causado por el bloqueo de la vía de flujo de salida del humor acuoso. Debido a que los conductos microscópicos están bloqueados, la presión se acumula en el ojo y causa una pérdida de visión muy gradual e imperceptible. La visión periférica se ve afectada primero, pero finalmente se perderá toda la visión si no se trata. El diagnóstico se puede hacer buscando la excavación del nervio óptico y midiendo el campo visual. Los agonistas de prostaglandina funcionan abriendo los conductos uveoesclerales.

Otras formas de glaucoma son el glaucoma del desarrollo y el glaucoma secundario, que pueden producirse después de uveítis, iridociclitis, hemorragia intraocular, traumatismo o un tumor intraocular. Cualquier forma de glaucoma puede tratarse utilizando los procedimientos dados a conocer en el presente documento.

La muerte de las células del ganglio retiniano se produce en el glaucoma. En el presente documento se dan a conocer procedimientos para aumentar la supervivencia de las células del ganglio retiniano.

Administración intraocular: Administración de agentes directamente en el ojo, por ejemplo, mediante administración en el humor vítreo o la cámara anterior. La administración intraocular indirecta (por ejemplo, por difusión a través de la córnea) no es administración directa en el ojo.

Presión intraocular: La presión del fluido que llena el globo ocular, el humor acuoso, que está determinada por la interacción entre la velocidad de producción de humor acuoso dentro del ojo y la resistencia al flujo de salida de acuoso a medida que sale del ojo a través del ángulo de la cámara anterior hacia el canal de Schlemm. En el ojo humano, la velocidad de formación de acuoso es de 2,54/minuto, mientras que en el ojo de conejo es de aproximadamente 3 a 4 μl/minuto. Las mediciones de IOP normales en el ojo humano, según consenso ampliamente aceptado, oscilan entre 10 y 20 mm de mercurio, con un promedio de 15,5 mm.

Administración intravítrea: Administración de agentes en la cavidad vítrea. La cavidad vítrea es el espacio que ocupa la mayor parte del volumen del núcleo del ojo con el cristalino y su sistema de suspensión (las zónulas) como borde anterior y la retina y su revestimiento como borde periférico. La administración intravítrea puede realizarse mediante inyección, bombeo o implantes.

Aislado: Un componente biológico “aislado” (tal como un ácido nucleico, una célula proteica o una nanovesícula) se ha separado o purificado sustancialmente de otros componentes biológicos en la célula del organismo o la ECM, en la que se encuentra el componente de forma natural. Los ácidos nucleicos y las proteínas que se han “aislado” incluyen ácidos nucleicos y proteínas purificados mediante procedimientos de purificación estándar. Las nanovesículas que se han aislado se retiran de los materiales fibrosos de la ECM. El término también abarca ácidos nucleicos y proteínas preparados mediante expresión recombinante en una célula huésped, así como ácidos nucleicos sintetizados químicamente.

Lisil oxidasa (Lox): Una enzima dependiente de cobre que cataliza la formación de aldehídos a partir de residuos de lisina en precursores de colágeno y elastina. Estos aldehídos son altamente reactivos y experimentan reacciones químicas espontáneas con otros residuos de aldehídos derivados de la lisil oxidasa o con residuos de lisina sin modificar. In vivo, esto da como resultado la reticulación de colágeno y elastina, lo que desempeña un papel en la estabilización de las fibrillas de colágeno y en la integridad y elasticidad de la elastina madura. Se forman reticulaciones complejas en el colágeno (piridinolinas derivadas de tres residuos de lisina) y en la elastina (desmosinas derivadas de cuatro residuos de lisina) que difieren en estructura. Los genes que codifican las enzimas Lox se han clonado a partir de una variedad de organismos (Hamalainen et al., Genomics 11:508, 1991; Trackman et al., Biochemistry 29:4863, 1990; incorporados en el presente documento como referencia). Se ha demostrado que los residuos 153-417 y los residuos 201-417 de la secuencia de lisil oxidasa humana son importantes para la función catalítica. Hay cuatro isoformas similares a Lox, llamadas LoxL1, LoxL2, LoxL3 y LoxL4.

Macrófago: Un tipo de glóbulo blanco que fagocita y degrada desechos celulares, sustancias extrañas, microbios y células cancerosas. Además de su papel en la fagocitosis, estas células desempeñan un papel importante en el desarrollo, el mantenimiento y la reparación de tejidos, y en la inmunidad tanto innata como adaptativa, ya que reclutan e influyen en otras células, incluyendo células inmunitarias tales como los linfocitos. Los macrófagos pueden existir en muchos fenotipos, incluyendo los fenotipos que se han denominado M1 y M2. Los macrófagos que realizan principalmente funciones proinflamatorias se denominan macrófagos M1 (CD86+/CD68+), mientras que los macrófagos que reducen la inflamación y promueven y regulan la reparación de tejidos se denominan macrófagos M2 (CD206+/CD68+). Los marcadores que identifican los diversos fenotipos de macrófagos varían entre especies. Cabe señalar que el fenotipo de macrófagos está representado por un espectro que oscila entre los extremos de M1 y M2. F4/80 (codificado por el gen del receptor E1 acoplado a la proteína G de adhesión (ADGRE1, adhesión G protein coupled receptor E1)) es un marcador de macrófagos, véase el número de registro de GENBANK® NP_001243181.1, 6 de abril de 2018 y NP_001965, 5 de marzo de 2018.

MicroARN: Un pequeño ARN no codificante que tiene una longitud de aproximadamente 17 a aproximadamente 25 bases de nucleótidos, que regula postranscripcionalmente la expresión génica al reprimir típicamente la traducción del ARNm diana. Un miARN puede funcionar como regulador negativo, de modo que mayores cantidades de un miARN específico se correlacionarán con niveles más bajos de expresión del gen diana. Hay tres formas de miARN, miARN primarios (pri-miARN), miARN prematuros (pre-miARN) y miARN maduros. Los miARN primarios (pri-miARN) se expresan como transcritos estructurados en horquilla de aproximadamente unos pocos cientos de bases hasta más de 1 kb. Los transcritos de pri-miARN son escindidos en el núcleo por una endonucleasa de ARNasa II llamada Drosha que escinde ambas hebras del tallo cerca de la base de la horquilla. Drosha escinde el dúplex de ARN con cortes escalonados, dejando un fosfato en 5' y un saliente de 2 nucleótidos en el extremo 3'. El producto de escisión, el miARN prematuro (pre-miARN) tiene una longitud de aproximadamente 60 a aproximadamente 110 nucleótidos con una estructura de horquilla formada de manera plegada hacia atrás. El pre-miARN es transportado desde el núcleo al citoplasma por Ran-GTP y Exportina-5. Los pre-miARN se procesan aún más en el citoplasma por otra endonucleasa RNasa II llamada Dicer. Dicer reconoce el fosfato en 5' y el saliente en 3', y corta el bucle en la unión de la horquilla para formar dúplex de miARN. El dúplex de miARN se une al complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC, RNA-induced silencing complex), donde la hebra antisentido se degrada preferentemente y el miARN maduro de hebra sentido dirige RISC a su sitio diana. El miARN maduro es la forma biológicamente activa del miARN y tiene una longitud de aproximadamente 17 a aproximadamente 25 nucleótidos.

Nanovesícula: Una vesícula extracelular que es una nanopartícula de aproximadamente 10 a aproximadamente 1.000 nm de diámetro. Las nanovesículas son partículas unidas a la membrana lipídica que portan moléculas de señalización biológicamente activas (por ejemplo, microARN, proteínas) entre otras moléculas. En general, la nanovesícula está limitada por una bicapa lipídica y las moléculas biológicas están encerradas y/o pueden estar incrustadas en la bicapa. Por tanto, una nanovesícula incluye una luz rodeada por membrana plasmática. Los diferentes tipos de vesículas se pueden distinguir basándose en el diámetro, el origen subcelular, la densidad, la forma, la tasa de sedimentación, la composición lipídica, los marcadores de proteínas, el contenido y el origen de los ácidos nucleicos, ya sea de la matriz extracelular o secretada. Una nanovesícula se puede identificar por su origen, tal como una nanovesícula unida a la matriz de una ECM (véase anteriormente), el contenido de proteína y/o el contenido de miR.

Un “exosoma” es una vesícula membranosa secretada por una célula y que oscila entre 10 y 150 nm de diámetro. En general, los endosomas tardíos o cuerpos multivesiculares contienen vesículas intraluminales que se forman por la gemación hacia adentro y la escisión de vesículas desde la membrana endosómica limitada a estas vesículas encerradas. Estas vesículas intraluminales se liberan, a continuación, desde la luz del cuerpo multivesicular al entorno extracelular, típicamente a un fluido corporal tal como sangre, líquido cefalorraquídeo o saliva, durante la exocitosis tras la fusión con la membrana plasmática. Un exosoma se crea intracelularmente cuando un segmento de la membrana se invagina y se somete a endocitosis. Los segmentos internalizados que se rompen en vesículas más pequeñas y finalmente son expulsados de la célula contienen proteínas y moléculas de ARN, tales como ARNm y miARN. Los exosomas derivados de plasma carecen en gran medida de ARN ribosómico. Los exosomas derivados de la matriz extracelular incluyen miARN y componentes proteicos específicos, y se ha demostrado que están presentes en prácticamente todos los fluidos corporales, tales como sangre, orina, saliva, semen y líquido cefalorraquídeo. Los exosomas pueden expresar CD11c y CD63 y, por tanto, pueden ser CD11c+ y CD63+. Los exosomas no tienen altos niveles de lisil oxidasa en su superficie.

Una “nanovesícula derivada de una ECM”, “nanovesícula unida a matriz”, “MBV” o una “nanovesícula derivada de ECM” se refieren todas a las mismas partículas unidas a membrana, cuyo tamaño oscila entre 10 nm-1.000 nm, presentes en la matriz extracelular, que contienen moléculas de señalización biológicamente activas tales como proteínas, lípidos, ácidos nucleicos, factores de crecimiento y citocinas que influyen en el comportamiento celular. Las expresiones son intercambiables y se refieren a las mismas vesículas. Estas MBV están incrustadas dentro de la ECM y unidas a la misma y no están simplemente fijadas a la superficie. Estas MBV son resistentes a condiciones de aislamiento severas, tales como congelación, descongelación y digestión con proteasas tales como pepsina, elastasa, hialuronidasa, proteinasa K y colagenasa, y digestión con detergentes. En general, estas MBV están enriquecidas para miR-145 y, opcionalmente, miR-181, miR-143 y miR-125, entre otros. Estas MBV no expresan CD63 o CD81, o expresan niveles apenas detectables de estos marcadores (CD63loCD81b). Las MBV contienen lisil oxidasa (Lox) en su superficie. La ECM puede ser una ECM de un tejido, puede producirse a partir de células en cultivo o puede adquirirse de una fuente comercial. Las MBV son distintas de los exosomas.

Portadores aceptables farmacéuticamente: Los portadores farmacéuticamente aceptables útiles en la presente invención son convencionales. Remington's Pharmaceutical Sciences, de E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15a edición (1975), describe composiciones y formulaciones adecuadas para la administración farmacéutica de las proteínas de fusión dadas a conocer en el presente documento.

En general, la naturaleza del portador dependerá del modo particular de administración que se esté empleando. Por ejemplo, las formulaciones parenterales normalmente comprenden fluidos inyectables que incluyen fluidos farmacéutica y fisiológicamente aceptables tales como agua, solución salina fisiológica, soluciones salinas equilibradas, dextrosa acuosa, glicerol o similares como vehículo. Para composiciones sólidas (por ejemplo, formas de polvo, píldora, comprimido o cápsula), los portadores sólidos no tóxicos convencionales pueden incluir, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón o estearato de magnesio. Además de portadores neutros biológicamente, las composiciones farmacéuticas a administrar pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes y agentes tamponadores del pH y similares, por ejemplo, acetato de sodio o monolaurato de sorbitán.

Agente farmacéutico: Un compuesto o composición química capaz de inducir un efecto terapéutico o profiláctico deseado cuando se administra apropiadamente a un individuo o una célula. “Incubar” incluye una cantidad de tiempo suficiente para que un fármaco interactúe con una célula. “Poner en contacto” incluye incubar un agente, tal como un exosoma, un miARN o un ácido nucleico que codifica un miARN, en forma sólida o líquida con una célula.

Fototoxicidad: Daño a las células inducido por la luz.

Polinucleótido: una secuencia de ácido nucleico (tal como una secuencia lineal) de cualquier longitud. Por lo tanto, un polinucleótido incluye oligonucleótidos y también secuencias de genes que se encuentran en los cromosomas. Un “oligonucleótido” es una pluralidad de nucleótidos unidos, unidos mediante enlaces fosfodiéster nativos. Un oligonucleótido es un polinucleótido de entre 6 y 300 nucleótidos de longitud. Un análogo de oligonucleótido se refiere a restos que funcionan de manera similar a los oligonucleótidos pero que tienen partes no de origen natural. Por ejemplo, los análogos de oligonucleótidos pueden contener partes no de origen natural, tales como restos de azúcar alterados o enlaces entre azúcares, tales como un oligodesoxinucleótido de fosforotioato. Los análogos funcionales de polinucleótidos de origen natural pueden unirse a ARN o ADN e incluyen moléculas de ácido peptidonucleico (PNA).

Purificado: El término “purificado” no requiere pureza absoluta; más bien, se entiende como un término relativo. Por tanto, por ejemplo, una preparación de moléculas de ácido nucleico purificado es aquella en la que el ácido nucleico al que se hace referencia es más puro que el ácido nucleico en su entorno natural dentro de una célula. Por ejemplo, una preparación de un ácido nucleico se purifica de modo que el ácido nucleico represente, como mínimo, el 50 % del contenido total de proteína de la preparación. De manera similar, una preparación de exosoma purificado es aquella en la que el exosoma es más puro que en un entorno que incluye células, en las que hay microvesículas y exosomas. Una población purificada de ácidos nucleicos o exosomas es superior al 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % pura o libre de otros ácidos nucleicos o componentes celulares, respectivamente.

Prevenir o tratar una enfermedad: “Prevenir” una enfermedad se refiere a inhibir el desarrollo de una enfermedad, por ejemplo, en una persona que se sabe que tiene predisposición a una enfermedad tal como glaucoma. Un ejemplo de una persona con una predisposición conocida es alguien con antecedentes de una enfermedad en la familia, o que ha estado expuesto a factores que predisponen al individuo a una afección. “Tratamiento” se refiere a una intervención terapéutica que mejora un signo o síntoma de una enfermedad o afección patológica después de que ha comenzado a desarrollarse.

Retina: La parte del ojo sensible a la luz (fotones), que contiene los fotorreceptores (conos y bastones) para la luz. Los bastones y conos realizan la percepción de la luz mediante la utilización de pigmentos sensibles a la luz. Los pigmentos sensibles a la luz están hechos de una proteína llamada opsina y un cromóforo llamado retineno, que es la variante de la vitamina A. Los bastones contienen rodopsina mientras que los conos contienen yodopsina. Los bastones y conos transmiten señales a través de neuronas sucesivas que desencadenan una descarga neuronal en las células de salida de la retina y las células ganglionares. Las señales visuales son transportadas por el nervio óptico a los cuerpos geniculados laterales desde donde la señal visual pasa a la corteza visual (lóbulo occipital) y se registra como un estímulo visual.

Individuo: Animales humanos y no humanos, incluyendo todos los vertebrados, tales como mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ratones, conejos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios y reptiles. En muchas realizaciones de los procedimientos descritos, el individuo es un ser humano.

Cantidad eficaz terapéuticamente: Una cantidad de una sustancia específica, como una MBV, suficiente para lograr un efecto deseado en un individuo que se está tratando. Cuando se administra a un individuo, generalmente se utilizará una dosificación que logrará concentraciones de tejido diana (por ejemplo, en hueso) que se ha demostrado que logra un efecto in vitro deseado.

Trasplante: La colocación de un sustrato biocompatible, tal como una MBV, en un individuo que lo necesita.

Tratar, tratamiento y terapia: Cualquier éxito o indicio de éxito en la atenuación o mejora de una lesión, patología o afección, incluyendo cualquier parámetro objetivo o subjetivo, tal como reducción, remisión, disminución de los síntomas o hacer que la afección sea más tolerable para el paciente, ralentizar la velocidad de degeneración o declive, hacer que el punto final de la degeneración sea menos debilitante, mejorar el bienestar físico o mental de un individuo, o mejorar la visión. El tratamiento puede ser evaluado mediante parámetros objetivos o subjetivos; incluyendo los resultados de un examen físico, examen neurológico o evaluaciones psiquiátricas.

A menos que se explique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la materia a la que pertenece la presente invención. Los términos singulares “un”, “una” y “el”, “la” incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De manera similar, la palabra “o” pretende incluir “y” a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, “que comprende A o B” significa que incluye A, o B, o A y B. Debe entenderse, además, que todos los tamaños de bases o tamaños de aminoácidos, y todos los valores de peso molecular o masa molecular, dados para ácidos nucleicos o polipéptidos son aproximados, y se proporcionan para la descripción.

Nanovesículas derivadas de una matriz extracelular (ECM)

Las nanovesículas derivadas de ECM (también denominadas nanovesículas unidas a matriz, MBV) se dan a conocer en la Patente WO 2017/151862, que se incorpora en el presente documento como referencia. Se da a conocer que las nanovesículas están incrustadas en la matriz extracelular. Estas MBV se pueden aislar y son activas biológicamente. Por tanto, estas MBV se pueden utilizar para fines terapéuticos, ya sea solas o con otra ECM. Estas MBV se pueden utilizar en armazones biológicos, ya sea solas o con otra ECM.

Una matriz extracelular es una mezcla compleja de biomoléculas y/o biomacromoléculas estructurales y funcionales que incluyen, pero sin limitación, proteínas estructurales, proteínas especializadas, proteoglucanos, glucosaminoglucanos y factores de crecimiento que rodean y soportan a las células dentro de los tejidos de los mamíferos y, a menos que se indique lo contrario, es acelular. En general, las MBV dadas a conocer están incrustadas en cualquier tipo de matriz extracelular (ECM) y pueden aislarse de esta ubicación. Por tanto, las MBV están presentes de forma no separable en la superficie de la ECM y no son exosomas.

Las matrices extracelulares se dan a conocer, por ejemplo y sin limitación, en las Patentes US4,902,508; 4,956,178; 5,281,422; 5,352,463; 5,372,821; 5,554,389; 5,573,784; 5,645,860; 5,771,969; 5,753,267; 5,762,966; 5,866,414; 6,099,567; 6,485,723; 6,576,265; 6,579,538; 6,696,270; 6,783,776; 6,793,939; 6,849,273; 6,852,339; 6,861,074; 6,887,495; 6,890,562; 6,890,563; 6,890,564; y 6,893,666. Sin embargo, una ECM se puede producir a partir de cualquier tejido o de cualquier fuente in vitro en la que la ECM sea producida por células cultivadas y comprenda uno o más componentes (constituyentes) poliméricos de la ECM nativa. Las preparaciones de ECM pueden considerarse “descelularizadas” o “acelulares”, lo que significa que las células se han eliminado del tejido o cultivo de origen. En algunas realizaciones, la ECM se aísla de un animal vertebrado, por ejemplo, de un animal vertebrado mamífero que incluye, pero sin limitación, ser humano, mono, cerdo, vaca, oveja, etc. La ECM puede derivarse de cualquier órgano o tejido, incluyendo, sin limitación, vejiga urinaria, intestino, hígado, corazón, esófago, bazo, estómago y dermis. En ejemplos específicos no limitantes, la matriz extracelular se aísla a partir de tejido esofágico, vejiga urinaria, submucosa del intestino delgado, dermis, cordón umbilical, pericardio, tejido cardíaco o músculo esquelético. La ECM puede comprender cualquier parte o tejido obtenido de un órgano, incluyendo, por ejemplo y sin limitación, submucosa, membrana basal epitelial, túnica propia, etc. En una realización no limitante, la ECM se aísla a partir de vejiga urinaria.

La ECM puede incluir o no la membrana basal. En otra realización no limitante, la ECM incluye, como mínimo, una parte de la membrana basal. El material de la ECM puede retener o no algunos de los elementos celulares que formaban el tejido original, tales como las células endoteliales capilares o los fibrocitos. En algunas realizaciones, la ECM contiene tanto una superficie de membrana basal como una superficie de membrana no basal.

En una realización no limitante, la ECM se recolecta de vejigas urinarias porcinas (también conocida como matriz de vejiga urinaria o UBM, urinary bladder matrix). En resumen, la ECM se prepara extirpando el tejido de vejiga urinaria de un mamífero, tal como un cerdo, y recortando los tejidos conectivos externos residuales, incluyendo el tejido adiposo. Toda la orina residual se elimina mediante lavados repetidos con agua del grifo. El tejido se deslamina sumergiendo primero el tejido en una solución de desepitelización, por ejemplo y sin limitación, solución salina hipertónica (por ejemplo, solución salina 1,0 N), durante períodos de tiempo que oscilan desde diez minutos hasta cuatro horas. La exposición a la solución salina hipertónica elimina las células epiteliales de la membrana basal subyacente. Opcionalmente, se puede añadir un agente quelante de calcio a la solución salina. El tejido que queda después del procedimiento de deslaminación inicial incluye la membrana basal epitelial y las capas de tejido abluminales a la membrana basal epitelial. La membrana basal epitelial relativamente frágil es invariablemente dañada y eliminada mediante cualquier abrasión mecánica en la superficie luminal. A continuación, este tejido se somete a un tratamiento adicional para eliminar la mayor parte de los tejidos abluminales pero manteniendo la membrana basal epitelial y la túnica propia. La serosa exterior, la adventicia, la túnica muscular de la mucosa, la túnica submucosa y la mayor parte de la muscular de la mucosa se eliminan del tejido desepitelizado restante mediante abrasión mecánica o mediante una combinación de tratamiento enzimático (por ejemplo, utilizando tripsina o colagenasa) seguido de hidratación y abrasión. La eliminación mecánica de estos tejidos se logra mediante la eliminación de tejidos mesentéricos con, por ejemplo, y sin limitación, pinzas de Adson-Brown y tijeras de Metzenbaum y limpiando la túnica muscular y la túnica submucosa utilizando un movimiento de limpieza longitudinal con un mango de bisturí u otro objeto rígido envuelto en gasa humedecida. También se contemplan procedimientos robóticos automatizados que implican cuchillas de corte, láseres y otros procedimientos de separación de tejidos. Una vez que se eliminan estos tejidos, la ECM resultante consiste principalmente en una membrana basal epitelial y una túnica propia subyacente.

En otra realización, la ECM se prepara raspando tejido de vejiga porcina para eliminar las capas externas que incluyen tanto la túnica serosa como la túnica muscular utilizando un movimiento de limpieza longitudinal con un mango de bisturí y una gasa humedecida. Después de la eversión del segmento de tejido, la parte luminal de la túnica mucosa se deslamina del tejido subyacente utilizando el mismo movimiento de limpieza. Se tiene cuidado para evitar la perforación de la submucosa. Una vez que se eliminan estos tejidos, la ECM resultante consiste principalmente en la túnica submucosa (véase la figura 2 de la Patente US9,277,999).

La ECM también se puede preparar en forma de polvo. Dicho polvo se puede preparar según el procedimiento de Gilbert et al., Biomaterials 26 (2005) 1431-1435, incorporado en el presente documento como referencia en su totalidad. Por ejemplo, las láminas de UBM se pueden liofilizar y a continuación cortar en láminas pequeñas para inmersión en nitrógeno líquido. El material congelado instantáneamente se puede triturar, a continuación, para que las partículas sean lo suficientemente pequeñas como para colocarlas en un molino de cuchillas rotativas, donde la ECM se pulveriza. De manera similar, al precipitar NaCl dentro del tejido de ECM, el material se fracturará en partículas de tamaño uniforme, que se pueden congelar instantáneamente, liofilizar y pulverizar.

En una realización no limitante, la ECM se deriva de la submucosa del intestino delgado o SIS. Las preparaciones disponibles en el mercado incluyen, pero sin limitación, SURGISIS™, SURGISIS-ES™, St Ra Ta SIS™ y STRATASIS-ES™ (Cook Urological Inc.; Indianápolis, Ind.) y GrAFTPATCH™ (Organogenesis Inc.; Canton Mass.). En otra realización no limitante, la ECM se deriva de la dermis. Las preparaciones disponibles en el mercado incluyen, pero sin limitación, PELVICOL™ (comercializado como PERMAc Ol™ en Europa; Bard, Covington, Ga.), REPLIFORM™ (Microvasive; Boston, Mass.) y ALLODERM™ (LifeCell; Branchburg, N.J.). En otra realización, la ECM se deriva de la vejiga urinaria. Las preparaciones disponibles en el mercado incluyen, pero sin limitación, UBM (ACell Corporation; Jessup, Md.).

Las MBV se pueden derivar (liberar) de una matriz extracelular utilizando los procedimientos dados a conocer a continuación. En algunas realizaciones, la ECM se digiere con una enzima, tal como pepsina, colagenasa, elastasa, hialuronidasa o proteinasa K, y se aíslan las MBV. En otras realizaciones, las MBV se liberan y se separan de la ECM cambiando el pH con soluciones tales como glicina HCl, ácido cítrico, hidróxido de amonio, utilización de agentes quelantes tales como, pero sin limitación, EDTA, EGTA, por fuerza iónica y o efectos caotrópicos con la utilización de sales tales como, pero sin limitación, cloruro de potasio (KCl), cloruro de sodio, cloruro de magnesio, yoduro de sodio, tiocianato de sodio, o exponiendo la ECM a condiciones desnaturalizantes como guanidina HCl o urea.

En ejemplos particulares, las MBV se preparan después de la digestión de una ECM con una enzima, tal como pepsina, elastasa, hialuronidasa, proteinasa K, soluciones salinas o colagenasa. La ECM se puede congelar-descongelar o someter a degradación mecánica.

En algunas realizaciones, la expresión de CD63 y/o CD81 no puede detectarse en las MBV. Por tanto, las MBV no expresan CD63 y/o CD81. En un ejemplo específico, tanto CD63 como CD81 no pueden detectarse en las nanovesículas. En otras realizaciones, las MBV tienen niveles apenas detectables de CD63 y CD81, tales como los detectables por transferencia de Western. Estas MBV son CD63loCD81lD. Un experto en la materia puede identificar fácilmente las MBV que son CD63loCD81lD, utilizando, por ejemplo, anticuerpos que se unen específicamente a CD63 y CD81. Se puede establecer un nivel bajo de estos marcadores utilizando procedimientos tales como la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, fluorescent activated cell sorting) y anticuerpos marcados con fluorescencia para determinar un umbral para cantidades altas y bajas de CD63 y CD81. Las MBV dadas a conocer difieren de las nanovesículas, tales como los exosomas que pueden fijarse transitoriamente a la superficie de la ECM debido a su presencia en fluidos biológicos.

Las MBV incluyen lisil oxidasa (Lox). En general, las nanovesículas derivadas de la ECM tienen un contenido de Lox mayor que los exosomas. Lox se expresa en la superficie de las MBV. El análisis proteómico por Nano-LC MS/MS se puede utilizar para detectar proteínas Lox. La cuantificación de Lox se puede realizar como se ha descrito anteriormente (Hill RC, et al., Mol Cell Proteomics. 2015;14(4):961-73).

En determinadas realizaciones, las MBV comprenden uno o más miARN. En ejemplos específicos no limitantes, las MBV comprenden uno, dos o los tres de miR-143, miR-145 y miR-181. MiR-143, miR-145 y miR-181 son conocidos en la técnica.

La secuencia de ácido nucleico de miR-145 se proporciona en el número de registro de MiRbase MI0000461. Una secuencia de ácido nucleico de miR-145 es CACCUUGUCCUCACGGUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUUAGAUGCUAAGAUGGGGA UUCCUGGAAAUACUGUUCUUGAGGUCAUGGUU (SEQ ID NO: 1). Se proporciona una secuencia de ácido nucleico de miR-181 en el número de registro de miRbase MI0000269. Una secuencia de ácido nucleico de miR-181 es: AGAAGGGCUAUCAGGCCAGCCUUCAGAGGACUCCAAGGAACAUUCAACGCUGUCGG UGAGUUUGGGAUUUGAAAAAACCACUGACCGUUGACUGUACCUUGGGGUCCUUA (SEQ ID NO: 2). La secuencia de ácido nucleico de miR-143 se proporciona en el número de registro de NCBI NR_029684.1, 30 de marzo de 2018. Un ADN que codifica una secuencia de ácido nucleico de miR-143 es:

G C G C A G C G C C C T G T C T C C C A G C C T G A G G T G C A G T G C T G C A T C T C T G G T C A G T T G G G A G T C T G A G A T G A A G C A C T G T A G C T C A G G A A G A G A G A A G T T G T T C T G C A G C

(SEQ ID NO: 3).

Después de la administración, las MBV mantienen la expresión de F4/80 (un marcador de macrófagos) y CD-11b en macrófagos en el individuo. Los macrófagos tratados con nanovesículas son predominantemente F4/80 Fizz1 , lo que indica un fenotipo M2.

Las MBV dadas a conocer en el presente documento se pueden formular en composiciones para administración farmacéutica y se pueden utilizar en bioarmazones y dispositivos. Las MBV se dan a conocer en la Patente WO 2017/151862.

Aislamiento de MBV a partir de la ECM

Para producir MBV, la ECM puede ser producida por cualquier célula de interés o puede utilizarse de una fuente comercial, véase anteriormente. Las MBV se pueden producir a partir de la misma especie, o de una especie diferente, que el individuo que está siendo tratado. En algunas realizaciones, estos procedimientos incluyen digerir la ECM con una enzima para producir ECM digerida. En realizaciones específicas, la ECM se digiere con uno o más de pepsina, elastasa, hialuronidasa, colagenasa, una metaloproteinasa y/o proteinasa K. En un ejemplo específico no limitante, la ECM se digiere solo con elastasa y/o una metaloproteinasa. En otro ejemplo no limitante, la ECM no se digiere con colagenasa y/o tripsina y/o proteinasa K. En otras realizaciones, la ECM se trata con un detergente. En realizaciones adicionales, el procedimiento no incluye la utilización de enzimas. En ejemplos específicos no limitantes, el procedimiento utiliza agentes caotrópicos o fuerza iónica para aislar las MBV, tales como sales, tales como cloruro de potasio. En realizaciones adicionales, la ECM se puede manipular para aumentar el contenido de MBV antes del aislamiento de las MBV.

En algunas realizaciones, la ECM se digiere con una enzima. La ECM se puede digerir con la enzima durante de aproximadamente 12 a aproximadamente 48 horas, tal como de aproximadamente 12 a aproximadamente 36 horas. La ECM se puede digerir con la enzima durante aproximadamente 12, aproximadamente 24, aproximadamente 36 o aproximadamente 48 horas. En un ejemplo específico no limitante, la ECM se digiere con la enzima a temperatura ambiente. Sin embargo, la digestión puede producirse a aproximadamente 4 °C, o a cualquier temperatura entre aproximadamente 4 °C y 25 °C. En general, la ECM se digiere con la enzima durante cualquier período de tiempo y a cualquier temperatura, suficientes para eliminar las fibrillas de colágeno. El proceso de digestión se puede variar dependiendo de la fuente de tejido. Opcionalmente, la ECM se procesa congelando y descongelando, ya sea antes o después de la digestión con la enzima. La ECM se puede tratar con detergentes, incluyendo detergentes iónicos y/o no iónicos.

A continuación, la ECM digerida se procesa, tal como mediante centrifugación, para aislar un sobrenadante libre de fibrillas. En algunas realizaciones, la ECM digerida se centrifuga, por ejemplo, durante una primera etapa, a de aproximadamente 300 a aproximadamente 1.000 g. Por tanto, la ^eC^m digerida se puede centrifugar a de aproximadamente 400 g a aproximadamente 750 g, tal como a aproximadamente 400 g, aproximadamente 450 g, aproximadamente 500 g o aproximadamente 600 g. Esta centrifugación puede producirse durante de aproximadamente 10 a aproximadamente 15 minutos, tal como durante de aproximadamente 10 a aproximadamente 12 minutos, tal como durante aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 14, aproximadamente 14 o aproximadamente 15 minutos. Se recoge el sobrenadante que incluye la ECM digerida. Las MBV incluyen Lox. En algunas realizaciones, los procedimientos para aislar dichas MBV incluyen digerir la matriz extracelular con elastasa y/o metaloproteinasa para producir matriz extracelular digerida, centrifugar la matriz extracelular digerida para eliminar los restos de fibrillas de colágeno y producir así un sobrenadante libre de fibrillas, centrifugar el sobrenadante libre de fibrillas para aislar los materiales sólidos y suspender los materiales sólidos en un portador.

En algunas realizaciones, la ECM digerida también se puede centrifugar, durante una segunda etapa, a de aproximadamente 2.000 g a aproximadamente 3.000 g. Por tanto, la ECM digerida se puede centrifugar a de aproximadamente 2.500 g a aproximadamente 3.000 g, tal como a aproximadamente 2.000 g, 2.500 g, 2.750 g o 3.000 g. Esta centrifugación puede producirse durante de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 minutos, tal como de aproximadamente 20 a aproximadamente 25 minutos, tal como durante aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23, aproximadamente 24, aproximadamente 25, aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28, aproximadamente 29 o aproximadamente 30 minutos. Se recoge el sobrenadante que incluye la ECM digerida.

En realizaciones adicionales, la ECM digerida se puede centrifugar, durante una tercera etapa, a de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 15.000 g. Por tanto, la ECM digerida se puede centrifugar a de aproximadamente 10.000 g a aproximadamente 12.500 g, tal como a aproximadamente 10.000 g, 11.000 g o 12.000 g. Esta centrifugación puede producirse durante de aproximadamente 25 a aproximadamente 40 minutos, tal como durante de aproximadamente 25 a aproximadamente 30 minutos, por ejemplo durante aproximadamente 25, aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28, aproximadamente 29, aproximadamente 30, aproximadamente 31, aproximadamente 32, aproximadamente 33, aproximadamente 34, aproximadamente 35, aproximadamente 36, aproximadamente 37, aproximadamente 38, aproximadamente 39 o aproximadamente 40 minutos. Se recoge el sobrenadante que incluye la ECM digerida.

Una, dos o las tres de estas etapas de centrifugación se pueden utilizar de forma independiente. En algunas realizaciones, se utilizan las tres etapas de centrifugación. Las etapas de centrifugación se pueden repetir, por ejemplo, 2, 3, 4 o 5 veces. En una realización, las tres etapas de centrifugación se repiten tres veces.

En algunas realizaciones, la ECM digerida se centrifuga a aproximadamente 500 g durante aproximadamente 10 minutos, se centrifuga a aproximadamente 2.500 g durante aproximadamente 20 minutos y/o se centrifuga a aproximadamente 10.000 g durante aproximadamente 30 minutos. Estas etapas, tal como las tres etapas, se repiten 2, 3, 4 o 5 veces, tal como tres veces. Por tanto, en un ejemplo no limitante, la ECM digerida se centrifuga a aproximadamente 500 g durante aproximadamente 10 minutos, se centrifuga a aproximadamente 2.500 g durante aproximadamente 20 minutos y se centrifuga a aproximadamente 10.000 g durante aproximadamente 30 minutos. Estas tres etapas se repiten tres veces. Por tanto, se produce un sobrenadante libre de fibrillas.

A continuación, el sobrenadante libre de fibrillas se centrifuga para aislar las MBV. En algunas realizaciones, el sobrenadante libre de fibrillas se centrifuga a de aproximadamente 100.000 g a aproximadamente 150.000 g. Por tanto, el sobrenadante libre de fibrillas se centrifuga a de aproximadamente 100.000 g a aproximadamente 125.000 g, tal como a aproximadamente 100.000 g, aproximadamente 105.000 g, aproximadamente 110.000 g, aproximadamente 115.000 g o aproximadamente 120.000 g. Esta centrifugación puede producirse durante de aproximadamente 60 a aproximadamente 90 minutos, tal como de aproximadamente 70 a aproximadamente 80 minutos, por ejemplo durante aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85 o aproximadamente 90 minutos. En un ejemplo no limitante, el sobrenadante libre de fibras se centrifuga a aproximadamente 100.000 g durante aproximadamente 70 minutos. Se recoge el material sólido, que son las MBV. Estas MBV se pueden resuspender, a continuación, en cualquier portador de interés, tal como, pero sin limitación, un tampón.

En realizaciones adicionales, la ECM no se digiere con una enzima. En estos procedimientos, la ECM se suspende en una solución salina isotónica, tal como una solución salina tamponada con fosfato. A continuación, se añade sal a la suspensión para que la concentración final de la sal sea mayor que aproximadamente 0,1 M. La concentración puede ser, por ejemplo, hasta aproximadamente 3 M, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 M de sal a aproximadamente 3 M, o de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 2 M. La sal puede ser, por ejemplo, aproximadamente 0,1 M, 0,15 M, 0,2 M, 0,3 M, 0,4 M, 0,7 M, 0,6 M, 0,7 M, 0,8 M, 0,9 M, 1,0 M, 1,1 M, 1,2 M, 1,3 M, 1,4 M, 1,5 M, 1,6 M, 1,7 M, 1,8 M, 1,9 M o 2 M. En algunos ejemplos no limitantes, la sal es cloruro de potasio, cloruro de sodio o cloruro de magnesio. En otras realizaciones, la sal es cloruro de sodio, cloruro de magnesio, yoduro de sodio, tiocianato de sodio, una sal de sodio, una sal de litio, una sal de cesio o una sal de calcio.

En algunas realizaciones, la ECM se suspende en la solución salina durante de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 2 horas, tal como de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 1 hora, de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 1 hora o de aproximadamente 45 minutos a aproximadamente 1 hora. La ECM se puede suspender en la solución salina durante aproximadamente 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115 o 120 minutos. La ECM se puede suspender en la solución salina a temperaturas de 4 °C a aproximadamente 50 °C, tales como, pero sin limitación, de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 25 °C o de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 37 °C. En un ejemplo específico no limitante, la ECM se suspende en la solución salina a aproximadamente 4 °C. En otros ejemplos específicos no limitantes, la ECM se suspende en la solución salina a aproximadamente 22 °C o aproximadamente 25 °C (temperatura ambiente). En ejemplos no limitantes adicionales, la ECM se suspende en la solución salina a aproximadamente 37 °C.

En algunas realizaciones, el procedimiento incluye incubar una matriz extracelular a una concentración de sal mayor de aproximadamente 0,4 M; centrifugar la matriz extracelular digerida para eliminar los restos de fibrillas de colágeno y aislar el sobrenadante; centrifugar el sobrenadante para aislar los materiales sólidos; y suspender los materiales sólidos en un portador, aislando así las MBV de la matriz extracelular.

Después de la incubación en la solución salina, la ECM se centrifuga para eliminar las fibrillas de colágeno. En algunas realizaciones, la ECM digerida también se puede centrifugar a de aproximadamente 2.000 g a aproximadamente 5.000 g. Por tanto, la ECM digerida se puede centrifugar a de aproximadamente 2.500 g a aproximadamente 4.500 g, tal como a aproximadamente 2.500 g, aproximadamente 3.000 g, 3.500, aproximadamente 4.000 g o aproximadamente 4.500 g. En un ejemplo específico no limitante, la centrifugación es a aproximadamente 3.500 g. Esta centrifugación puede producirse durante de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 minutos, tal como de aproximadamente 25 a aproximadamente 35 minutos, tal como durante aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23, aproximadamente 24, aproximadamente 25, aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28, aproximadamente 29, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 31, aproximadamente 32, aproximadamente 33, aproximadamente 34 o aproximadamente 35 minutos. A continuación, se recoge el sobrenadante.

En realizaciones adicionales, el sobrenadante se puede centrifugar, a continuación, durante una tercera etapa a de aproximadamente 100.000 a aproximadamente 150.000 g. Por tanto, la ECM digerida se puede centrifugar a de aproximadamente 100.000 g a aproximadamente 125.000 g, tal como a aproximadamente 100.000 g, 110.000 g o 120.000 g. Esta centrifugación puede producirse durante de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 2,5 horas, tal como durante de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 3 horas, por ejemplo durante aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente 60 minutos, aproximadamente 90 minutos o aproximadamente 120 minutos (2 horas). Los materiales sólidos se recogen y se suspenden en una solución, tal como solución salina tamponada, aislando así las MBV.

En aún otras realizaciones, la ECM se suspende en una solución salina tamponada isotónica, tal como, pero sin limitación, solución salina tamponada con fosfato. Se puede utilizar centrifugación u otros procedimientos para eliminar las partículas grandes (véase más adelante). A continuación, se utiliza la ultrafiltración para aislar las m Bv a partir de la ECM, partículas entre aproximadamente 10 nm y aproximadamente 10.000 nm, tal como entre aproximadamente 10 nm y aproximadamente 1.000 nm, tal como entre aproximadamente 10 nm y aproximadamente 300 nm.

En ejemplos específicos no limitantes, la solución salina tamponada isotónica tiene una concentración de sal total de aproximadamente 0,164 mM y un pH de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 7,4. En algunas realizaciones, la solución salina isotónica tamponada incluye KCl 0,002 M a KCl aproximadamente 0,164 M, tal como KCl aproximadamente 0,0027 M (la concentración de KCl en solución salina tamponada con fosfato). Esta suspensión se procesa, a continuación, por ultracentrifugación.

Después de la incubación en la solución salina tamponada isotónica, la ECM se centrifuga para eliminar fibrillas de colágeno. En algunas realizaciones, la ECM digerida también se puede centrifugar a de aproximadamente 2.000 g a aproximadamente 5.000 g. Por tanto, la ECM digerida se puede centrifugar a de aproximadamente 2.500 g a aproximadamente 4.500 g, tal como a aproximadamente 2.500 g, aproximadamente 3.000 g, 3.500, aproximadamente 4.000 g o aproximadamente 4.500 g. En un ejemplo específico no limitante, la centrifugación es a aproximadamente 3.500 g. Esta centrifugación puede producirse durante de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 minutos, tal como de aproximadamente 25 a aproximadamente 35 minutos, tal como durante aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23, aproximadamente 24, aproximadamente 25, aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28, aproximadamente 29, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 31, aproximadamente 32, aproximadamente 33 aproximadamente 34 o aproximadamente 35 minutos.

La microfiltración y la centrifugación se pueden utilizar y combinar para eliminar materiales de gran peso molecular de la suspensión. En una realización, los materiales de moléculas de gran tamaño, tal como más de 200 nm, se eliminan mediante microfiltración. En otra realización, los materiales de gran tamaño se eliminan mediante la utilización de centrifugación. En una tercera realización se utilizan tanto microfiltración como ultracentrifugación para eliminar materiales de gran peso molecular. Los materiales de gran peso molecular se eliminan de la ECM suspendida, tales como materiales superiores a aproximadamente 10.000 nm, superiores a aproximadamente 1.000 nm, superiores a aproximadamente 500 nm o superiores a aproximadamente 300 nm.

El efluente para microfiltración o el sobrenadante se somete, a continuación, a ultrafiltración. Por tanto, el efluente, que incluye partículas de menos de aproximadamente 10.000 nm, menos de aproximadamente 1.000 nm, menos de aproximadamente 500 nm o menos de aproximadamente 300 nm, se recoge y se utiliza. Este efluente se somete a continuación a ultrafiltración con una membrana con un límite de peso molecular (MWCO, molecular weight cutoff) de 3.000 a 100.000. En el ejemplo se utilizó un MWCO de 100.000.

Procedimientos para aumentar la supervivencia de las células del ganglio retiniano

En el presente documento se dan a conocer procedimientos para tratar diversos trastornos (como se definen en las reivindicaciones adjuntas) aumentando la supervivencia de las células del ganglio retiniano en un individuo. El individuo puede ser un individuo veterinario o un ser humano. El individuo puede ser un mamífero. El individuo puede ser un ave o una mascota doméstica, tal como un gato, un perro o un conejo. El individuo puede ser un primate no humano o ganado, incluidos cerdos, rumiantes, caballos y aves de corral. Los procedimientos incluyen seleccionar un individuo que necesite tratamiento para aumentar la supervivencia de las células del ganglio retiniano y administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de MBV. Las MBV se pueden derivar de la misma especie o de una diferente que el individuo que necesita una mayor supervivencia de las células del ganglio retiniano.

En algunas realizaciones, el individuo tiene glaucoma. El individuo puede tener glaucoma de ángulo abierto, glaucoma de ángulo cerrado o glaucoma normotenso. El glaucoma puede ser un glaucoma primario o un glaucoma secundario. Cualquiera de estos individuos puede ser seleccionado para el tratamiento. La presión intraocular (IOP), la presión del fluido dentro del ojo, se puede medir en unidades de milímetros de mercurio (mmHg) o kilopascales (kPa). Típicamente se considera que la presión intraocular normal está entre 10 mmHg y 20 mmHg. El valor promedio de la presión intraocular es de 15,5 mmHg con fluctuaciones de aproximadamente 2,75-3,50 mmHg. La presión intraocular elevada (por encima de 21 mmHg o 2,8 kPa) es el factor de riesgo más importante y el único modificable para el glaucoma. En algunas realizaciones, se selecciona un individuo que tiene una presión intraocular elevada. En otras realizaciones, se selecciona un individuo que tiene una presión intraocular menos que elevada, pero que tiene evidencia de daño glaucomatoso. Por ejemplo, el individuo puede tener un excavación de la papila óptica y una relación de excavación respecto a papila aumentada o en aumento (por ejemplo, superior a 0,3, 0,5 o 0,7). En otras realizaciones, el individuo puede tener una IOP ligeramente elevada en presencia de daño glaucomatoso del nervio óptico (tal como una progresión en la relación excavación-papila).

Las pruebas de glaucoma pueden incluir mediciones de la presión intraocular, tales como la utilización de tonometría, examen del ángulo de la cámara anterior o gonioscopia, y examen del nervio óptico para identificar daños, cambios en la relación excavación-papila, apariencia del borde y detección de cambios vasculares. Se pueden realizar pruebas de campo visual. La capa de fibras nerviosas de la retina se puede evaluar con técnicas de imagenología tales como tomografía de coherencia óptica, polarimetría láser de barrido y/o oftalmoscopia láser de barrido (tomografía retiniana de Heidelberg). Las pruebas adicionales incluyen tonometría, oftalmoscopia, perimetría, gonioscopia, paquimetría y análisis de fibras nerviosas. Estos procedimientos se pueden realizar con el fin de seleccionar un individuo para el tratamiento, según los procedimientos dados a conocer en el presente documento. En otras realizaciones, el individuo tiene degeneración de las células del ganglio retiniano provocada por una lesión. En realizaciones adicionales, el individuo tiene degeneración de las células del ganglio retiniano provocada por un trastorno genético. En algunos ejemplos no limitantes, el individuo tiene neuropatía óptica glaucomatosa independiente de la presión, neuropatía óptica isquémica, neuropatía óptica inflamatoria, neuropatía óptica compresiva, neuropatía óptica traumática. En otros ejemplos no limitantes, el individuo tiene neuropatía óptica isquémica arterítica, neuropatía óptica isquémica arterítica asociada con arteritis de células gigantes, neuropatía óptica isquémica no arterítica, neuropatía óptica infiltrante, neuropatía óptica infiltrante asociada con sarcoidosis, neuropatía óptica infecciosa, neuropatía óptica infecciosa asociada con sífilis, neuropatía óptica infecciosa asociada con la enfermedad de Lyme, neuropatía óptica infecciosa asociada con toxoplasmosis, neuropatía óptica infecciosa asociada con herpes zoster, neuritis óptica por enfermedad desmielinizante, neuropatía óptica posradiación, acrodermatitis enteropática, neuropatía óptica hereditaria, neuropatía óptica hereditaria asociada con neuropatía óptica dominante, neuropatía óptica compresiva, neuropatía óptica compresiva asociada con seudotumor orbitario, neuropatía óptica compresiva asociada con oftalmopatía tiroidea, neuropatía óptica autoinmunitaria o neuropatía óptica autoinmunitaria asociada con lupus.

El individuo puede tener fototoxicidad ocular, específicamente retinopatía fótica, también llamada maculopatía fótica. En algunas realizaciones, la retinopatía fótica está provocada por la exposición al sol. En otras realizaciones, la retinopatía fótica está provocada por la exposición a la luz artificial. El individuo puede estar en riesgo de retinopatía fótica, también conocida como maculopatía fótica. Por ejemplo, el individuo puede estar sometiéndose a procedimientos con láser en el ojo o puede ser soldador.

El individuo puede tener degeneración retiniana como resultado de un traumatismo, tal como la exposición a un artefacto explosivo. El individuo puede haber tenido un procedimiento con láser en la retina. En realizaciones adicionales, el individuo tiene una enfermedad en la que se produce una degeneración neuronal (es decir, no fotorreceptora). Estas incluyen, pero sin limitación, glaucoma, oclusiones de la arteria retiniana y oclusiones de la vena retiniana.

En algunas realizaciones, la administración puede ser sistémica. Ejemplos de vías de administración incluyen, pero sin limitación, administración intravenosa, intraperitoneal o subcutánea.

En algunas realizaciones, la administración puede ser local en el ojo, tal como utilizando administración intravítrea o subretiniana. La administración también puede ser en la cámara anterior del ojo. En otras realizaciones, la administración puede ser en el humor vítreo del ojo. En algunas realizaciones, la administración al humor vítreo del ojo se logra utilizando inyecciones, bombas o implantes intravítreos.

El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiple para finalmente administrar la cantidad especificada anteriormente. Las dosis pueden ser intermitentes. Además, al individuo se le pueden administrar tantas dosis como sea apropiado.

Las dosis individuales típicamente no son inferiores a una cantidad requerida para producir un efecto medible en el individuo, y pueden determinarse basándose en la farmacocinética y la farmacología para la absorción, distribución, metabolismo y excreción (“ADME”, absorption, distribution, metabolism and excretiorí) de la composición en cuestión o sus subproductos, y por tanto basándose en la disposición de la composición dentro del individuo. Esto incluye la consideración de la vía de administración así como la cantidad de la dosis, que puede ajustarse para aplicaciones locales y sistémicas (por ejemplo, intravenosas). Las cantidades eficaces de dosis y/o régimen de dosis pueden determinarse fácilmente de manera empírica a partir de ensayos preclínicos, de ensayos de seguridad y escalamiento e intervalo de dosis, relaciones individuales médico-paciente, así como ensayos in vitro e in vivo. En general, estos ensayos evaluarán las células del ganglio retiniano, o la expresión de un componente biológico (citocina, célula inflamatoria específica, microglía, etc.) que afecta a la degeneración de estas células.

Se puede suspender una cantidad eficaz terapéuticamente de MBV en un portador farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, en una solución tampón isotónica a un pH de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 8,0, preferentemente a un pH de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 7,4, de 3,5 a 6,0 o de 3,5 a aproximadamente 5,0. Los tampones útiles incluyen citrato de sodio-ácido cítrico y fosfato de sodio-ácido fosfórico, y tampones de acetato de sodio/ácido acético. Se pueden añadir otros agentes a las composiciones, tales como conservantes y agentes antibacterianos. Estas composiciones se pueden administrar localmente en el ojo, tal como por vía intravítrea o por vía subretiniana.

Los modos locales de administración incluyen, a modo de ejemplo, vías intraocular, intraorbitaria, subconjuntival, subtenoniana, subretiniana o transescleral. La administración también puede ser en la cámara anterior del ojo. En una realización, cantidades significativamente menores de los componentes (en comparación con enfoques sistémicos) pueden ejercer un efecto cuando se administran localmente (por ejemplo, por vía intravítrea) en comparación con cuando se administran sistémicamente (por ejemplo, por vía intravenosa).

Las inyecciones subretinianas se pueden realizar directamente en la mácula, por ejemplo, inyección submacular. Ejemplos de procedimientos incluyen inyección intraocular (por ejemplo, retrobulbar, subretiniana, submacular, intravítrea e intracoroidea), iontoforesis, colirio e implantación intraocular (por ejemplo, intravítrea, subtenoniana y subconjuntival).

En algunas realizaciones, se administra una cantidad eficaz terapéuticamente de MBV mediante inyección intravítrea. Un procedimiento general para la inyección intravítrea puede ilustrarse mediante el siguiente resumen breve. Este ejemplo pretende simplemente ilustrar ciertas características del procedimiento, y de ninguna manera pretende ser limitante. Los procedimientos para la inyección intravítrea son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Peyman, et al. (2009) Retina 29(7):875-912 y Fagan y Al-Qureshi, (2013) Clin. Experiment. Ophthalmol.

41(5):500-7). En la técnica se conocen otros procedimientos de administración intraocular e incluyen la administración subretiniana.

En resumen, un individuo para inyección intravítrea puede prepararse para el procedimiento mediante dilatación pupilar, esterilización del ojo y administración de un anestésico. Puede utilizarse cualquier agente midriático adecuado conocido en la técnica para la dilatación pupilar. La dilatación pupilar adecuada puede confirmarse antes del tratamiento. La esterilización se puede lograr aplicando un tratamiento ocular esterilizante, por ejemplo, una solución que contenga yoduro, tal como povidona yodada (BETADINE®). También se puede utilizar una solución similar para limpiar el párpado, las pestañas y cualquier otro tejido cercano (por ejemplo, la piel). Se puede utilizar cualquier anestésico adecuado, tal como lidocaína o proparacaína, a cualquier concentración adecuada. El anestésico se puede administrar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluyendo, sin limitación, gotas tópicas, geles o gelatinas, y la aplicación subconjuntival del anestésico.

Antes de la inyección, se puede utilizar un espéculo palpebral esterilizado para despejar las pestañas del área. El sitio de la inyección se puede marcar con una jeringa. El sitio de la inyección puede elegirse en función del cristalino del paciente. Por ejemplo, el sitio de la inyección puede estar a 3-3,5 mm del limbo en pacientes pseudofáquicos o afáquicos, y a 3,5-4 mm del limbo en pacientes fáquicos. El paciente puede mirar en una dirección opuesta al sitio de la inyección. Durante la inyección, la aguja puede insertarse perpendicular a la esclerótica y apuntando al centro del ojo. La aguja se puede insertar de modo que la punta termine en el humor vítreo, en lugar del espacio subretiniano. Puede utilizarse cualquier volumen adecuado conocido en la técnica para inyección. Después de la inyección, el ojo puede tratarse con un agente esterilizante tal como un antibiótico. También se puede enjuagar el ojo para eliminar el exceso de agente esterilizante.

La inyección intravítrea (o la administración mediante cualquier otra vía de administración) de una cantidad eficaz terapéuticamente de MBV se puede realizar una vez o se puede realizar repetidamente, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces. La administración se puede realizar quincenalmente, semanalmente, cada dos semanas, mensualmente o cada 2, 3, 4, 5 o 6 meses.

Las composiciones farmacéuticas que incluyen una cantidad eficaz terapéuticamente de MBV se pueden formular en forma de dosificación unitaria, adecuada para la administración individual de dosis precisas. La cantidad de compuesto o compuestos activos administrados dependerá del individuo que esté siendo tratado, la gravedad de la aflicción y la forma de administración, y es mejor dejarlo a juicio del médico que prescribe. Dentro de estos límites, la formulación a administrar contendrá una cantidad del componente o de los componentes activos en cantidades eficaces para lograr el efecto deseado en el individuo que está siendo tratado. En algunas realizaciones, los procedimientos dados a conocer aumentan la supervivencia de las células del ganglio retiniano cuando se administran en el ojo de un individuo.

Al individuo se le pueden administrar agentes terapéuticos adicionales, en la misma composición o en una composición diferente. Estos agentes terapéuticos incluyen, pero sin limitación, un agente que reduce la presión intraocular. El agente puede ser a) un análogo de prostaglandina, b) un bloqueador beta-adrenérgico, c) un agonista alfa-adrenérgico, o d) un agonista colinérgico. Los ejemplos de agentes incluyen latanoprost, bimatorpost, travoprost, timolol, betaxolol, brimonidina, pilocarpina, dorzolamida, brinzolamida y acetazolamida. En algunos ejemplos específicos no limitantes, el agente es a) latanoprost, b) timolol, c) brimonidina o d) pilocarpina. Al individuo se le puede administrar un inhibidor de Rho-cinasa, tal como, pero sin limitación, ripasudil o netarsudil.

Los agentes adicionales que se pueden administrar al individuo incluyen antibióticos antibacterianos y antifúngicos, así como agentes antiinflamatorios no esteroideos para reducir el riesgo de infección e inflamación. Se pueden administrar agentes adicionales por cualquier vía. Los agentes adicionales se pueden formular por separado o en la misma composición que las MBV.

Los agentes útiles incluyen minoglucósidos (por ejemplo, amikacina, apramicina, arbekacina, bambermicinas, butirosina, dibekacina, dihidroestreptomicina, fortimicina(s), gentamicina, isepamicina, kanamicina, micronomicina, neomicina, undecilenato de neomicina, netilmicina, paromomicina, ribostamicina, sisomicina, espectinomicina, estreptomicina, tobramicina, trospectomicina), anfenicoles (por ejemplo, azidamfenicol, cloranfenicol, florfenicol, tianfenicol), ansamicinas (por ejemplo, rifamida, rifampicina, rifamicina sv, rifapentina, rifaximina), p-lactámicos (por ejemplo, carbacefémicos (por ejemplo, loracarbef), carbapenémicos (por ejemplo, biapenem, imipenem, meropenem, panipenem), cefalosporinas (por ejemplo, cefaclor, cefadroxilo, cefamandol, cefatrizina, cefazedona, cefazolina, cefcapeno pivoxilo, cefclidina, cefdinir, cefditoren, cefepima, cefetamet, cefixima, cefmenoxima, cefodizima, cefonicid, cefoperazona, ceforanida, cefotaxima, cefotiam, cefozopran, cefpimizol, cefpiramida, cefpiroma, cefpodoxima proxetil, cefprozil, cefroxadina, cefsulodina, ceftazidima, cefteram, ceftezol, ceftibuteno, ceftizoxima, ceftriaxona, cefuroxima, cefuzonam, cefacetrilo sódico, cefalexina, cefaloglicina, cefaloridina, cefalosporina, cefalotina, cefapirina sódica, cefradina, pivcefalexina), cefamicinas (por ejemplo, cefbuperazona, cefmetazol, cefininox, cefotetán, cefoxitina), monobactámicos (por ejemplo, aztreonam, carumonam, tigemonam), oxacefemos, flomoxef, moxalactama), penicilinas (por ejemplo, amdinocilina, amdinocilina pivoxilo, amoxicilina, ampicilina, apalcilina, aspoxicilina, azidocilina, azlocilina, bacampicilina, ácido bencilpenicilínico, bencilpenicilina sódica, carbenicilina, carindacilina, clometocilina, cloxacilina, ciclacilina, dicloxacilina, epicilina, fenbenicilina, floxacilina, hetacilina, lenampicilina, metampicilina, meticilina sódica, mezlocilina, nafcillina sódica, oxacilina, penamecilina, hidroyoduro de penetamato, penicilina G benetamina, penicilina g benzatina, penicilina g benzidrilamina, penicilina G calcio, penicilina G hidrabamina, penicilina G potasio, penicilina G procaína, penicilina N, penicilina O, penicilina V, penicilina V benzatina, penicilina V hidrabamina, penimepiciclina, feneticilina potásica, piperacilina, pivampicilina, propicilina, quinacilina, sulbenicilina, sultamicilina, talampicilina, temocilina, ticarcilina), otros (por ejemplo, ritipenem), lincosamidas (por ejemplo, clindamicina, lincomicina), macrólidos (por ejemplo, azitromicina, carbomicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina, acistrato de eritromicina, estolato de eritromicina, glucoheptonato de eritromicina, lactobionato de eritromicina, propionato de eritromicina, estearato de eritromicina, josamicina, leucomicinas, midecamicinas, miokamicina, oleandomicina, primicina, rokitamicina, rosaramicina, roxitromicina, espiramicina, troleandomicina), polipéptidos (por ejemplo, anfomicina, bacitracina, capreomicina, colistina, enduracidina, enviomicina, fusafungina, gramicidina s, gramicidina(s), mikamicina, polimixina, pristinamicina, ristocetina, teicoplanina, tiostrepton, tuberactinomicina, tirocidina, tirotricina, vancomicina, viomicina, virginiamicina, bacitracina de zinc), tetraciclinas (por ejemplo, apiciclina, clortetraciclina, clomociclina, demeclociclina, doxiciclina, guameciclina, limeciclina, meclociclina, metaciclina, minociclina, oxitetraciclina, penimepiciclina, pipaciclina, rolitetraciclina, sanciclina, tetraciclina) y otros (por ejemplo, cicloserina, mupirocina, tuberina). Los agentes útiles también incluyen antibacterianos sintéticos, tales como 2,4-diaminopirimidinas (por ejemplo, brodimoprim, tetroxoprim, trimetoprim), nitrofuranos (por ejemplo, furaltadona, cloruro de furazolio, nifuradeno, nifuratel, nifurfolina, nifurpirinol, nifurprazina, nifurtoinol, nitrofurantαna), quinolonas y análogos (por ejemplo, cinoxacina, ciprofloxacina, clinafloxacina, difloxacina, enoxacina, fleroxacina, flumequina, grepafloxacina, lomefloxacina, miloxacina, nadifloxacina, ácido nalidíxico, norfloxacina, ofloxacina, ácido oxolínico, pazufloxacina, pefloxacina, ácido pipemídico, ácido piromídico, rosoxacina, rufloxacina, esparfloxacina, temafloxacina, tosufloxacina, trovafloxacina), sulfonamidas (por ejemplo, acetil sulfametoxipirazina, bencilsulfamida, cloramina-b, cloramina-t, dicloramina t, mafenida, 4'-(metilsulfamoil)sulfanilanilida, noprilsulfamida, ftalilsulfacetamida, ftalilsulfatiazol, salazosulfadimidina, succinilsulfatiazol, sulfabenzamida, sulfacetamida, sulfaclorpiridazina, sulfacrisoidina, sulfacitina, sulfadiazina, sulfadicramida, sulfadimetoxina, sulfadoxina, sulfaetidol, sulfaguanidina, sulfaguanol, sulfaleno, ácido sulfalóxico, sulfamerazina, sulfameter, sulfametazina, sulfametizol, sulfametomidina, sulfametoxazol, sulfametoxipiridazina, sulfametrol, sulfamidoccrisoidina, sulfamoxol, sulfanilamida, sulfanililurea, n-sulfanilil-3,4-xilamida, sulfanitran, sulfaperina, sulfafenazol, sulfaproxilina, sulfapirazina, sulfapiridina, sulfasomizol, sulfasimazina, sulfatiazol, sulfatiourea, sulfatolamida, sulfisomidina, sulfisoxazol) sulfonas (por ejemplo, acedapsona, acediasulfona, acetosulfona sódica, dapsona, diatimosulfona, glucosulfona sódica, solasulfona, succisulfona, ácido sulfanílico, p-sulfanililbencilamina, sulfoxona sódica, tiazolsulfona) y otros (por ejemplo, clofoctol, hexedina, metenamina, anhidrometileno-citrato de metenamina, hipurato de metenamina, mandelato de metenamina, sulfosalicilato de metenamina, nitroxolina, taurolidina, xibornol).

Los agentes útiles adicionales incluyen antibióticos antimicóticos tales como polienos (por ejemplo, anfotericina B, candicidina, dennostatina, filipina, fungicromina, hachimicina, hamicina, lucensomicina, mepartricina, natamicina, nistatina, pecilocina, perimicina), otros (por ejemplo, azaserina, griseofulvina , oligomicinas, undecilenato de neomicina, pirrolnitrina, sicanina, tubercidina, viridina) alilaminas (por ejemplo, butenafina, naftifina, terbinafina), imidazoles (por ejemplo, bifonazol, butoconazol, clordantαna, clormidazol, cloconazol, clotrimazol, econazol, enilconazol, fenticonazol, flutrimazol , isoconazol, ketoconazol, lanoconazol, miconazol, omoconazol, nitrato de oxiconazol, sertaconazol, sulconazol, tioconazol), tiocarbamatos (por ejemplo, tolciclato, tolindato, tolnaftato), triazoles (por ejemplo, fluconazol, itraconazol, saperconazol, terconazol) otros (por ejemplo , acrisorcina, amorolfina, bifenamina, bromosalicilcloranilida, buclosamida, propionato de calcio, clorfenesina, ciclopirox, cloxiquina, coparafinato, diclorhidrato de diamtazol, exalamida, flucitosina, haletazol, hexetidina, loflucarbán, nifuratel, yoduro de potasio, ácido propiónico, piritiona, salicilanilida, propionato de sodio, sulbentina, tenonitrozol, triacetina, ujotión, ácido undecilénico, propionato de zinc). Los agentes antineoplásicos también pueden ser útiles, incluyendo (1) antibióticos y análogos (por ejemplo, aclacinomicinas, actinomicina, antramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carrubicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, menogarilo, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, pirarrubicina, plicamicina, porfiromicina, puromicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, zinostatina, zorrubicina), (2) antimetabolitos tales como análogos de ácido fólico (por ejemplo, denopterina, edatrexato, metotrexato, piritrexima, pteropterina, trimetrexato), (3) análogos de purina (por ejemplo, cladribina, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina), (4) análogos de pirimidina (por ejemplo, ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, doxifluridina, emitefur, enocitabina, floxuridina, fluorouracilo, gemcitabina, tagafur).

También se pueden utilizar agentes antiinflamatorios esteroideos, tales como 21-acetoxipregnenolona, alclometasona, algestona, amcinonida, beclometasona, betametasona, budesonida, cloroprednisona, clobetasol, clobetasona, clocortolona, cloprednol, corticosterona, cortisona, cortivazol, ciclosporina, deflazacort, desonida, desoximetasona, dexametasona, diflorasona, diflucortolona, difluprednato, enoxolona, fluazacort, flucloronida, flumetasona, flunisolida, acetónido de fluocinolona, fluocinonida, fluocortina butilo, fluocortolona, fluorometolona, acetato de fluperolona, acetato de fluprednideno, fluprednisolona, flurandrenolida, propionato de fluticasona, formocortal, halcinonida, propionato de halobetasol, halometasona, acetato de halopredona, hidrocortamato, hidrocortisona, etabonato de loteprednol, mazipredona, medrisona, meprednisona, metilprednisolona, furoato de mometasona, parametasona, prednicarbato, prednisolona, 25-dietilaminoacetato de prednisolona, fosfato sódico de prednisolona, prednisona, prednival, prednilideno, rimexolona, tixocortol, triamcinolona, acetónido de triamcinolona, benetónido de triamcinolona y hexacetónido de triamcinolona.

Además, se pueden utilizar agentes antiinflamatorios no esteroideos. Estos incluyen derivados del ácido aminoarilcarboxílico (por ejemplo, ácido enfenámico, etofenamato, ácido flufenámico, isonixina, ácido meclofenámico, ácido mefenámico, ácido niflúmico, talniflumato, terofenamato, ácido tolfenámico), derivados del ácido arilacético (por ejemplo, aceclofenaco, acemetacina, alclofenaco, amfenaco, amtolmetina guacilo, bromfenaco, bufexamaco, cinmetacina, clopirac, diclofenaco sódico, etodolaco, felbinaco, ácido fenclózico, fentiazaco, glucametacina, ibufenaco, indometacina, isofezolaco, isoxepaco, lonazolaco, ácido metiazínico, mofezolaco, oxametacina, pirazolaco, proglumetacina, sulindaco, tiaramida, tolmetina, tropesina, zomepiraco), derivados del ácido arilbutírico (por ejemplo, bumadizón, butibufeno, fenbufeno, xenbucina), ácidos arilcarboxílicos (por ejemplo, clidanaco, ketorolaco, tinoridina), derivados del ácido arilpropiónico (por ejemplo, alminoprofeno, benoxaprofeno, bermoprofeno, ácido buclóxico, carprofeno, fenoprofeno, flunoxaprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, ibuproxam, indoprofeno, ketoprofeno, loxoprofeno, naproxeno, oxaprozina, piketoproleno, pirprofeno, pranoprofeno, ácido protizínico, suprofeno, ácido tiaprofénico, ximoprofeno, zaltoprofeno), pirazoles (por ejemplo, difenamizol, epirizol), pirazolonas (por ejemplo, apazona, benzpiperilón, feprazona, mofebutazona, morazona, oxifenbutazona, fenilbutazona, pipebuzona, propifenazona, ramifenazona, suxibuzona, tiazolinobutazona), derivados del ácido salicílico (por ejemplo, acetaminosalol, aspirina, benorilato, bromosaligenina, acetilsalicilato de calcio, diflunisal, etersalato, fendosal, ácido gentísico, salicilato de glicol, salicilato de imidazol, acetilsalicilato de lisina, mesalamina, salicilato de morfolina, salicilato de 1 -naftilo, olsalazina, parsalmida, acetilsalicilato de fenilo, salicilato de fenilo, salacetamida, ácido salicilamida o-acético, ácido salicilsulfúrico, salsalato, sulfasalazina), tiazinacarboxamidas (por ejemplo, ampiroxicam, droxicam, isoxicam, lornoxicam, piroxicam, tenoxicam), ácido épsilon-acetamidocaproico, s-adenosilmetionina, ácido 3-amino-4-hidroxibutírico, amixetrina, bendazaco, bencidamina, alfa-bisabolol, bucoloma, difenpiramida, ditazol, emorfazona, fepradinol, guaiazuleno, nabumetona, nimesulida, oxaceprol, paranilina, perisoxal, proquazona, superóxido dismutasa, tenidap y zileutón.

Los implantes también son útiles en los procedimientos dados a conocer en el presente documento. Los implantes se pueden insertar en el ojo mediante una variedad de procedimientos, incluida la colocación con pinzas o trocar después de hacer una incisión en la esclerótica (por ejemplo, una incisión de 2-3 mm) u otros sitios adecuados. En algunos casos, el implante se puede colocar con un trocar sin hacer una incisión separada, sino formando, en su lugar, un orificio directamente en el ojo con el trocar. El procedimiento de colocación puede influir en la cinética de liberación. Por ejemplo, implantar el dispositivo en el humor vítreo o en la cámara posterior con un trocar puede dar como resultado la colocación del dispositivo más profunda dentro del humor vítreo que la colocación con pinzas, lo que puede dar como resultado que el implante esté más cerca del borde del humor vítreo. La ubicación del dispositivo implantado puede influir en los gradientes de concentración del agente terapéutico que rodea el dispositivo y, por tanto, influir en las velocidades de liberación (por ejemplo, un dispositivo colocado más cerca del borde del humor vítreo puede dar como resultado una velocidad de liberación más lenta, véase la Patente US5,869,079 y la Patente US6,699,493). En una realización, se formula un implante con una matriz polimérica bioerosionable.

En general, cuando se utilizan implantes, las MBV se distribuyen homogéneamente a través de la matriz polimérica, de modo que se distribuyen de manera suficientemente uniforme para que no se produzcan fluctuaciones perjudiciales en la velocidad de liberación debido a la distribución desigual del agente inmunosupresor en la matriz polimérica. La selección de la composición polimérica a emplear varía con la cinética de liberación deseada, la ubicación del implante, la tolerancia del paciente y la naturaleza del procedimiento de implante. El polímero se puede incluir como, como mínimo, aproximadamente el 10 por ciento en peso del implante. En un ejemplo, el polímero se incluye como, como mínimo, aproximadamente el 20 por ciento en peso del implante. En otra realización, el implante comprende más de un polímero. Estos factores se describen en detalle en la Patente US6,699,493. Las características de los polímeros generalmente incluyen biodegradabilidad en el sitio de implantación, compatibilidad con el agente de interés, facilidad de encapsulación e insolubilidad en agua, entre otras. En general, la matriz polimérica no se degrada completamente hasta que se ha liberado la carga de fármaco. La composición química de los polímeros adecuados se conoce en la técnica (por ejemplo, véase la Patente US6,699,493).

La administración se puede proporcionar como una sola administración, un bolo periódico o una infusión continua. En algunas realizaciones, la administración es desde un depósito interno (por ejemplo, desde un implante dispuesto en una ubicación intraocular o extraocular (véanse, las Patentes US5,443,505 y 5,766,242)) o desde un depósito externo (por ejemplo, desde una bolsa intravenosa). Los componentes pueden administrarse mediante liberación continua durante un período específico desde un dispositivo de administración de fármacos de liberación sostenida inmovilizado en una pared interna del ojo o mediante liberación controlada transescleral dirigida en la coroides (véanse, por ejemplo, la Patente PCT/US00/00207, la Patente PCT/US02/14279, Ambati et al., Invest. Opthalmol. Vis. Sci. 41:1181-1185, 2000, y Ambati et al., Invest. Opthalmol. Vis. Sci. 41:1186-1191, 2000). En la técnica se conocen una variedad de dispositivos adecuados para administrar componentes localmente en el interior del ojo. Véase, por ejemplo, la Patente US6,251,090, la Patente US6,299,895, la Patente US6,416,777, la Patente US6,413,540 y la Patente PCT/US00/28187.

En algunas realizaciones, el procedimiento incluye la etapa de detectar que se ha logrado un beneficio terapéutico. Las medidas de eficacia terapéutica serán aplicables a la enfermedad particular que se está modificando, y reconocerán los procedimientos de detección apropiados a utilizar para medir la eficacia terapéutica. Se puede evaluar la respuesta del individuo utilizando cualquier procedimiento conocido en la técnica. Estos incluyen, pero sin limitación, oftalomoscopia, perimetría, gonioscopia, paquimetría o análisis de fibras nerviosas. En algunas realizaciones, se puede evaluar el número y/o la viabilidad de las células del ganglio retiniano. Un experto en la materia puede determinar fácilmente que los procedimientos dados a conocer son eficaces. Por ejemplo, se puede determinar si la relación excavación-papila se ha estabilizado. Se podría utilizar polarimetría láser de barrido o tomografía de coherencia óptica, por ejemplo, para realizar análisis de la capa de fibras nerviosas de la retina. Se podría utilizar una prueba de campo visual para monitorizar la progresión del glaucoma. Para cualquiera de los procedimientos dados a conocer, la eficacia terapéutica en el tratamiento de una deficiencia de la visión puede ser una alteración en la visión del individuo.

La eficacia terapéutica también se puede evaluar midiendo las citocinas producidas por la microglía y/o los astrocitos. En algunas realizaciones, la citocina es IL-1 p, IL-6 o TNF-a. Los procedimientos para medir citocinas son conocidos en la técnica e incluyen, sin limitación, bioensayos, radioinmunoensayos (RIA) y ensayos inmunoadsorbentes ligados a enzimas (ELISA). Los procedimientos de ejemplo se dan a conocer a continuación. EJEMPLOS

La resonancia magnética por tensor de difusión, complementada con optocinética y resonancia magnética mejorada con manganeso, puede detectar pequeños cambios en las velocidades de degeneración del axón longitudinalmente que se correlacionan con cambios en el comportamiento visual. En el presente documento se da a conocer que los armazones de ECM pueden alterar la respuesta de cicatrización predeterminada en el sistema nervioso central (SNC) de rata adulta al disminuir la activación de astrocitos y microglial y aumentar la supervivencia de las células del ganglio retiniano (RGC) y la expresión génica del desarrollo de RGC.

Aunque se ha demostrado que la ECM modula la respuesta de cicatrización predeterminada en tejidos tales como el esófago, los mecanismos y factores bioactivos responsables de los efectos no se han dilucidado por completo. Las MBV desencadenan respuestas celulares in vitro similares a la ECM original, de la que se derivan, lo que sugiere que las MBV son factores bioactivos críticos dentro de la ECM que regulan las respuestas celulares. Adicionalmente, las MBV están enriquecidas en miARN que se sabe que regulan la supervivencia y el crecimiento celulares, y tienen Lox en su superficie.

En el presente documento se dan a conocer terapias que modulan la respuesta de cicatrización predeterminada para preservar o restaurar la función neurológica. Se da a conocer que las ECM específicas de tejido, específicamente las MBV aisladas de las ECM, regulan diferencialmente la supervivencia de las RGC, el crecimiento de los axones y la remodelación de tejidos. Se ha demostrado que las MBV promueven la supervivencia de las RGC y la regeneración de axones y disminuyen la respuesta inmunitaria innata en el nervio óptico después de isquemia aguda del nervio óptico.

Ejemplo 1

Materiales y procedimientos

Animales: Ratas Sprague-Dawley fueron proporcionadas por Charles River Laboratories (Wilmington, MA). El cuidado y los protocolos de los animales cumplieron con las pautas de la Guía para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio publicada por los Institutos Nacionales de Salud.

Descelularización de la matriz extracelular de la vejiga urinaria y formación de hidrogel: Vejigas urinarias porcinas de cerdos adultos con peso de mercado fueron proporcionadas por un matadero local. Las vejigas urinarias se descelularizaron como se describe (Faust et al., J Biomater Appl, 2017. 31(9): págs. 1277-1295). La descelularización se confirmó utilizando procedimientos establecidos para cuantificar el ADN, incluyendo tinción con H&E y visualización mediante electroforesis en gel (Faust et al., J Biomater Appl, 2017. 31(9): págs. 1277-1295); Freytes et al., Biomaterials, 2008. 29(11): págs. 1630-7; Rosario et al., Regen Med, 2008. 3(2): págs. 145-56). La matriz extracelular de vejiga urinaria descelularizada (UBM-ECM) se congeló, se liofilizó y se almacenó a -20 °C hasta su utilización. Los hidrogeles de UBM-ECM a 10 mg/ml se prepararon como se describió anteriormente (Faust et al., J Biomater Appl, 2017. 31(9): págs. 1277-1295; Medberry et al., Biomaterials, 2013. 34(4): págs. 1033-40). En resumen, la UBM-ECM liofilizada se molió hasta obtener un polvo, se digirió a 10 mg/ml con 1 mg/ml de pepsina durante 48 horas (h) y el pH se ajustó a 7,4.

Aislamiento de nanovesículas unidas a matriz (MBV): UBM-ECM liofilizada se digirió con Liberase TL (5401020001, Sigma-Aldrich) en tampón Tris (Tris 50 mM pH 7,5, CaCl25 mM, NaCl 150 mM) durante 24 horas a temperatura ambiente (TA) en un agitador de balanceo orbital. La UBM-ECM digerida se centrifugó a (10.000 g, 30 minutos). Las MBV se sedimentaron mediante ultracentrifugación (100.000 g, ultracentrífuga Beckman Coulter Optima L-90K) a 4 °C durante 2 horas y se purificaron adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño, utilizando una resina Sepharose CL-2B. Las MBV purificadas se almacenaron a -80 °C hasta su utilización. Todos los aislamientos de MBV se analizaron morfológicamente mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM, transmisión electron microscopy) como se describe (Huleihel et al., Adv, 2016. 2(6): p. e1600502). Se observaron MBV en rejillas de TEM a 80 kV con un microscopio electrónico de transmisión ^j E^o L 1210 equipado con una cámara digital AMT de alta resolución.

Aislamiento de células del ganglio retiniano (RGC): Las RGC se aislaron de crías de rata Sprague-Dawley del tercer día postnatal como se describe (Barres et al., Neuron, 1988. 1(9): pág. 791-803). Las RGC purificadas se sembraron en medio neurobasal-SATO (nb-SATO) a 3.000 RGC por pocillo en placas de cultivo de 96 pocillos (087723B, Falcon) recubiertas con poli-D-lisina durante 1 hora a TA (70 kDa, 10 |xg/ml, Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, EE. UU.) y laminina durante la noche (37 °C, 2 |xg/ml, Sigma-Aldrich Corp.). Las MBV se resuspendieron en PBS estéril y se añadieron a cultivos de RGC en pocillos por triplicado a concentraciones que oscilaban entre 5-80 |xg/ml. Como controles se utilizaron medios de hidrogel de Ub M-ECM (250 |xg/ml) y nb-SATO. Las RGC se cultivaron a 37 °C, CO2 al 10 % durante 3 días.

Viabilidad de las RGC: La viabilidad de las RGC se analizó utilizando un kit vivo/muerto de calceína y yoduro de propidio según las instrucciones del fabricante (Life Technologies, R37601). En resumen, la calceína y el yoduro de propidio se mezclaron y se incubaron con las RGC durante 15 minutos a tA. Se tomaron imágenes de cinco campos no superpuestos aleatorios por pocillo a 20X utilizando juegos de filtros de rodamina y fluoresceína de epifluorescencia (Zeiss, Axio Observer). Las RGC vivas y muertas se cuantificaron utilizando ImageJ (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, EE. UU.). Los datos representan triplicados de tres repeticiones experimentales independientes que totalizan, como mínimo, 45 campos de visión.

Cuantificación del crecimiento de neuritas de RGC: El crecimiento de neuritas se analizó como se ha descrito (Steketee, et al., Invest Ophthalmol Vis Sci, 2014. 55(7): págs. 4369-77; Van der Merwe, et al., EBioMedicine, 2017.

26: págs. 47-59). En resumen, las RGC se fijaron con paraformaldehído al 4 % (Alfa Aesar, 30525-89-4) en PBS durante 15 minutos (min) y, a continuación, se lavaron con PBS (3X). Las RGC se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,2 % en PBS durante 15 minutos, se bloquearon con BSA al 1 % (Fisher Scientific) en PBS durante 15 minutos y se incubaron durante la noche a 4 °C con anti-p III tubulina (1:300, TUJ-1, Millipore) en PBS. Después de la incubación, las RGC se lavaron con PBS (3X), se incubaron en FITC-anticuerpo secundario de conejo anti-IgY H+L de pollo (1:150, Thermo Scientific) durante 3 horas a temperatura ambiente, se lavaron con PBS (3X) y se tiñeron con DAPI (1:3000, Invitrogen) durante 15 minutos a TA. Las RGC se lavaron con PBS (3X) y se tomaron imágenes a 20X (Zeiss, Axio Observer). Para cada pocillo, se midió el crecimiento total de neuritas para las primeras diez RGC encontradas al azar que no estaban en contacto con otra RGC utilizando el complemento NeuronJ de ImageJ. Los datos representan el crecimiento total de neuritas de RGC de pocillos por triplicado en tres repeticiones experimentales, totalizando, como mínimo, 90 neuronas por grupo.

Cultivos de microglía: Se sembró microglía primaria de rata (Lonza, R-G-535) en placas a 50.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos según la recomendación del proveedor. Para todos los experimentos, la microglía se incubó inicialmente durante 24 horas a 37 °C, CO2 al 5 % para facilitar la adherencia. Después de 24 h, los sobrenadantes se retiraron y se reemplazaron con medio de microglía fresco.

Para cultivos de microglía no sensibilizada, se añadieron los siguientes reactivos a pocillos por triplicado: medio de microglía únicamente, lipopolisacárido (LPS, 100 ng/ml) e interferón gamma (IFNy, 20 ng/ml), interleucina-4 (IL-4, 20 ng/ml), hidrogel de UBM-ECM (250 |xg/ml), o MBV (5 |xg/ml). Después de 24 horas, se recogieron medios para análisis ELISA o para tratar astrocitos.

Para cultivos de microglía sensibilizada, la microglía se trató con LPS (100 ng/ml) e IFNy (20 ng/ml) durante 6 horas, se retiraron los sobrenadantes, se enjuagó la microglía con medio de microglía y se trató con lo siguiente en pocillos por triplicado durante 24 horas adicionales: medio de microglía, UBM-ECM (250 |xg/ml) o MBV (5 |xg/ml). Después de la incubación adicional de 24 horas, se recogieron los sobrenadantes para ensayos ELISA o para tratar astrocitos.

Cultivos de astrocitos: Se sembraron astrocitos primarios de rata (ScienCell Research Laboratories, R1800) a 5.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos según las instrucciones del proveedor. Se permitió que los astrocitos se adhirieran durante 24 horas a 37 °C, CO2 al 5 %. Para determinar el efecto que la polarización de la microglía tiene sobre los astrocitos, se añadieron medios acondicionados para microglía (grupos y recogida descritos en la sección “Cultivos de microglía”) a pocillos de astrocitos por triplicado y se incubaron durante 24 horas. Después de una incubación inicial de 24 horas con medio acondicionado con microglía, los astrocitos se enjuagaron con medio de astrocitos, se incubaron con medio de astrocitos nuevo durante 24 horas adicionales y se recogieron los sobrenadantes para ensayos ELISA. Para determinar el efecto de los sobrenadantes de astrocitos sobre la viabilidad de las RGC, se utilizó una placa Transwell. Los astrocitos se colocaron en placas en el inserto Transwell a 5.000 células por inserto según las instrucciones del proveedor, y la cámara inferior se llenó con medio de astrocitos. Se permitió que los astrocitos se adhirieran durante 24 horas a 37 °C, CO2 al 5 %. Después de una incubación inicial de 24 horas, se añadió medio acondicionado con microglía por triplicado a los astrocitos en el inserto y se incubó durante 24 h. Después de 24 horas, los astrocitos se enjuagaron y los medios se reemplazaron con medios nb-SATO frescos durante 24 horas adicionales. Después de la incubación, se recogieron los medios nb-SATO de los pocillos inferiores para los cultivos de RGC.

Análisis ELISA: Se analizó la expresión de IL-1 p (R&D Systems, DY501), IL-6 (R&D Systems, DY506) y TNF-a (BioLegend, N.° de Cat. 438204) en sobrenadantes de microglía y astrocitos según las instrucciones del fabricante. Se analizaron muestras por duplicado de tres repeticiones experimentales independientes.

Respuestas de las células del ganglio retiniano a medios acondicionados con astrocitos: Las RGC se aislaron y se sembraron como se ha descrito anteriormente y se dejaron adherir durante 24 horas a 37 °C, CO2 al 10 %. Para determinar los efectos de los medios acondicionados con astrocitos sobre la supervivencia de las RGC, se recogieron sobrenadantes de astrocitos como se ha descrito y se añadieron a pocillos de RGC por triplicado y se incubaron durante 72 horas a 37 °C, CO2 al 10 %. La viabilidad de las RGC de tres experimentos independientes se analizó como se ha descrito anteriormente en la sección Viabilidad de las RGC.

Respuesta a la dosis de MBV in vivo: La supervivencia de las RGC se probó con tres dosis de MBV in vivo: 5, 10 y 20 |xg/ml (n=5 animales por grupo). Los animales se anestesiaron mediante inhalación de isoflurano (3 % de inducción, 1,5 % de mantenimiento). Se aplicaron por vía tópica una gota de solución oftálmica de clorhidrato de proparacaína (Bausch & Lomb, Inc., Rochester, NY) y una gota de solución oftálmica de tropicamida (Akorn, Lake Forest, IL) en ambos ojos de veinte animales para inducir analgesia y dilatación de la pupila, respectivamente. Se utilizó una aguja de 18 g para hacer un pequeño orificio en la esclerótica inmediatamente posterior al limbo. Bajo un microscopio quirúrgico, se insertó una microjeringa Hamilton en el humor vítreo a través de la abertura escleral. La punta de la aguja se colocó lo más cerca posible de la cabeza del nervio óptico y se tuvo cuidado de no tocar la retina o el cristalino. Las MBV se diluyeron en PBS estéril a las concentraciones apropiadas. Todos los volúmenes de inyección fueron de 1 |j.l y se utilizó PBS estéril como control de vehículo (n=5 por grupo). Se inyectó 1 |j.l de MBV o PBS en el humor vítreo y la aguja se mantuvo en su lugar durante 30 segundos para permitir que la MBV o el PBS se difundiera en el humor vítreo. Se retiró la aguja y se aplicó por vía tópica una gota de pomada antibiótica de gentamicina (Akorn, Lake Forest, IL) inmediatamente después de retirar la aguja. Los animales recibieron dos inyecciones adicionales los días 2 y 7 utilizando las mismas técnicas descritas. Los animales se sacrificaron 14 días después de la inyección de MBV y se extirparon las retinas para la cuantificación de RGC.

Elevación de la presión intraocular con tratamiento con MBV: Se indujo la elevación aguda de la presión intraocular (IOP) como se ha descrito anteriormente. Cuarenta y cinco animales recibieron elevación de la IOP solamente en el ojo derecho mediante perfusión de la cámara anterior con solución salina y los ojos izquierdos sirvieron como control no lesionado. Los animales se anestesiaron con una inyección intraperitoneal de un cóctel de ketamina/xilazina de 75:10 mg/kg, y la anestesia se confirmó con un reflejo de pellizco del dedo del pie. Se aplicaron una gota de proparacaína y una de tropicamida en los ojos derechos para inducir la analgesia y la dilatación de la pupila, respectivamente. Se conectó una aguja de 30 g a un depósito de solución salina estéril (cloruro de sodio al 0,9 %; Baxter International Inc., Deerfield, IL) y se insertó la punta de la aguja en la cámara anterior. La aguja se insertó paralela al iris utilizando un microscopio quirúrgico y se aseguró en su lugar. El reservorio de solución salina se elevó para aumentar la IOP de 15 mmHg a 130 mmHg y se aseguró en su lugar durante 60 minutos. La IOP se midió utilizando un transductor de presión (BIOPAC Systems, Goleta, CA, EE. UU.) y un tonómetro de mano. Después de 60 minutos, se bajó el depósito de solución salina y se retiró la aguja de la cámara anterior. Se aplicó una gota de gentamicina en el ojo inmediatamente después de retirar la aguja. Quince animales (n=10 para histología, n=5 para ERG) recibieron tratamiento con 1 |j.l 5 |xg/ml de MBV inmediatamente después de la elevación de la IOP, y en los días 2 y 7 después de la elevación de la IOP, utilizando la técnica de inyección descrita en la sección anterior. Quince animales (n=10 para histología, n=5 para ERG) se utilizaron como controles de vehículo y recibieron 1 |j.l de PBS inyectado por vía intravítrea inmediatamente después de la elevación de la IOP y los días 2 y 7 después de la elevación de la IOP. Quince animales (n=10 para histología, n=5 para ERG) recibieron elevación de la IOP sin inyecciones.

Inyección de la subunidad B de la toxina del cólera: Cinco animales por grupo recibieron inyecciones de la subunidad B de la toxina del cólera (CtxB) el día 11, tres días antes del sacrificio el día 14. La subunidad B de la toxina del cólera (recombinante), conjugada a Alexa Fluor 594 (LifeTech, N.° de Cat. C3477) se resuspendió en PBS estéril para producir una solución al 1 %. Los animales se anestesiaron mediante inhalación de isoflurano (3 % de inducción, 1,5 % de mantenimiento). Se utilizó la técnica de inyección intravítrea como se ha descrito en la sección anterior, y se inyectaron 2 μl de la solución de CtxB al 1 % en el humor vítreo. La aguja de la jeringa Hamilton se mantuvo en su lugar durante 30 segundos antes de retirarla y se aplicó por vía tópica una gota de gentamicina después de retirar la aguja del ojo.

Inmunohistoquímica: Se utilizaron diez animales por grupo para la inmunohistoquímica. Se sacrificaron los animales y se extirparon las retinas y los nervios ópticos y se fijaron en paraformaldehído al 4 % en PBS durante 30 minutos. Las retinas y los nervios ópticos se enjuagaron tres veces en PBS durante 5 minutos cada uno. Las retinas se dividieron en cuartos y se permeabilizaron/bloquearon en tampón de bloqueo IHC (Triton X-100 al 3 %, Tween-20 al 0,5 %, BSA al 1 % y azida sódica al 0,1 % en PBS) durante 2 horas a TA en un agitador a 60 RPM. Las retinas de los animales que recibieron inyecciones de CtxB se marcaron con anti-CtxB 1:250 (anti-CtxB de ratón, Abcam, AB62429) en tampón de bloqueo IHC, y las retinas restantes se comarcaron con proteína de unión a anti-ARN con múltiples cortes y empalmes 1:250 (anti-RBPMS de conejo, Phosphosolutions, 1830-RBPMS) y anti-Brn3A 1:250 (anti-Brn3A de ratón, Santa Cruz, SC-8429) en tampón de bloqueo IHC durante 48 horas a 4 °C en un agitador a 60 RPM. Las retinas se enjuagaron tres veces con Tween-20 al 0,3 % en PBS y se incubaron en Alexa Fluor 488 de burro anti-conejo 1:500 (Abcam, AB150073) y Alexa Fluor 555 de cabra anti-ratón (Abcam, AB150114) en tampón de bloqueo IHC durante 24 horas a 4 °C en un agitador a 60 RPM. Las retinas se enjuagaron tres veces con Tween-20 al 0,3 % en PBS, se montaron en portaobjetos de microscopio de vidrio, se cubrieron con cubreobjetos y con Vectashield (Vector Laboratories, H-1200) y se tomaron imágenes con epifluorescencia (Zeiss, Axio Observer). De manera similar a los procedimientos de cuantificación anteriores (Shaw, et al., Exp Eye Res, 2017. 158: págs.

33-42), las retinas se dividieron en cuartos antes de la tinción y se tomaron tres imágenes en la periferia y el centro de la retina (alrededor de la cabeza del nervio óptico) en cada sección de cuarto, totalizando así 12 imágenes en la periferia y 12 imágenes en el centro por retina. Estudios previos mostraron que la elevación de la IOP causa una mayor muerte de células RGC en la periferia de la retina (Chen et al., Invest Ophthalmol Vis Sci, 2011. 52(1): págs.

36-44), por lo tanto, la supervivencia de las RGC se analizó en dos ubicaciones.

Los nervios ópticos se incluyeron en parafina y se seccionaron en un criostato en secciones de 15 μm. Las secciones se bloquearon/permeabilizaron en tampón de bloqueo IHC durante 2 horas a TA y se enjuagaron dos veces con Tween-20 al 0,3 % en PBS. Las secciones se marcaron con anti-GAP43 1:500 (anti-GAP-43 de conejo, Abcam, AB 16053), anti-GFAP 1:500 (anti-GFAP de conejo, 1:500, Abcam, AB7260) o anti-CtxB 1:250 (anti-CtxB de ratón, Abcam, AB62429) durante 24 horas a 4 °C. Las secciones se enjuagaron tres veces con Tween-20 al 0,3 % en PBS y se incubaron en Alexa Fluor 488 de burro anti-conejo 1:500 (Abcam, AB150073) o Alexa Fluor 555 de cabra anti-ratón (Abcam, AB150114) en tampón de bloqueo IHC durante 24 horas a 4 °C. Las secciones se enjuagaron dos veces con Tween-20 al 0,3 % en PBS y se incubaron con 4 μg/ml de tinción de Hoechst (Sigma-Aldrich, H6024) en tampón de bloqueo IHC durante 15 minutos a TA. Las secciones se enjuagaron tres veces con Tween-20 al 0,3 % en PBS, se montaron en un cubreobjetos con Vectashield y se tomaron imágenes con epifluorescencia (Zeiss, Axio Observer). Las intensidades de la señal se midieron con ImageJ como se ha descrito anteriormente (Van der Merwe, et al., EBioMedicine, 2017. 26: págs. 47-59; McCloy et al., Cell Cycle, 2014. 13(9): págs. 1400-12). Se dibujaron quince regiones de interés (ROI, regions of interest) distribuidas uniformemente a lo largo del nervio óptico y se dibujaron cuatro ROI en el fondo de la imagen. Se midió el área, la fluorescencia media y la densidad integrada para cada imagen y se calculó la intensidad de la señal basándose en la siguiente ecuación: CTCF = densidad integrada -(área x fluorescencia media del fondo).

Electrorretinografía (ERG): El análisis funcional por ERG se realizó de acuerdo con un protocolo establecido (Alarcon-Martinez et al., Mol Vis, 2009. 15: págs. 2373-83). En resumen, los animales se anestesiaron con una inyección intraperitoneal de un cóctel de ketamina/xilazina de 75:10 mg/kg y se confirmó la anestesia con un reflejo de pellizco en el dedo del pie. Se aplicaron una gota de proparacaína y una de tropicamida en cada ojo para inducir la analgesia y la dilatación de la pupila, respectivamente, y los ojos se mantuvieron lubricados con Goniovisc al 2,5 % (Sigma Pharmaceuticals, artículo n.° 9050) durante los registros. Se colocaron dos electrodos de asa de oro en la córnea, el electrodo de referencia se insertó en el interior de la mejilla y el electrodo de conexión a tierra se insertó en el cuádriceps. Se realizaron registros de ERG bilaterales simultáneamente en ambos ojos durante las pruebas utilizando un domo de luz de color. En general, se iluminó una etapa de una luz de intensidad fija durante 1 ms y la respuesta de ERG se registró como un barrido sobre múltiples etapas de iluminación creciente. Se registraron cincuenta respuestas de ERG por prueba y se realizaron un total de tres pruebas por etapa de intensidad de luz. Los datos se analizaron midiendo la Respuesta Fotópica Negativa (PhNR) y el tiempo implícito de las diferentes ondas registradas.

Análisis estadístico: Todos los análisis y mediciones fueron realizados por individuos con enmascaramiento. Se utilizó el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) y la prueba de Tukey post-hoc para determinar las diferencias significativas entre los grupos con p<0,05. Los gráficos representan la media con barras de error que indican el error estándar de la media (S^eM, standard error of the mean), a menos que se indique lo contrario.

Ejemplo 2

Las MBV no son citotóxicas para las RGC y aumentan el crecimiento de neuritas de RGC in vitro

Consecuentes con estudios previos que investigan los efectos de las MBV sobre cultivos neuronales primarios (Faust, et al., J Biomater Appl, 2017. 31(9): págs. 1277-12950), los estudios in vitro sugirieron que las MBV derivadas de UBM-ECM no son citotóxicas y aumentan el crecimiento de neuritas de RGC en comparación con medios e hidrogeles de UBM-ECM (figura 1). Después de 3 días de tratamiento, no hubo diferencia en la supervivencia de RGC entre los grupos tratados con cualquiera de las cinco concentraciones de MBV, UBM-ECM o medios, lo que indica que UBM-^eC^m y MBV no son citotóxicas a las concentraciones probadas (figura 1A). En contraste con los estudios de viabilidad de las RGC, MBV aumentó la longitud de las neuritas de RGC después de 3 días (figura 1B). 5, 10 o 20 |xg/ml de MBV aumentaron significativamente el crecimiento de neuritas de RGC a 621,5 ± 35,2 |o.m, 652,4 ± 23,2 |o.m y 596,0 ± 32,3 μm, respectivamente, en comparación con controles de medios (275,2 ± 11,6 μm) y UBM-ECM (348,3 ± 12,1 μm). 50 y 80 μg/ml de MBV no aumentaron el crecimiento de neuritas de RGC a 191,6 ± 9,9 μm y 76,4 ± 4,3 μm, respectivamente.

Ejemplo 3

Las MBV suprimen la secreción de citocinas proinflamatorias a partir de microglía y astrocitos

Los estudios in vitro mostraron que MBV suprime la secreción de citocinas proinflamatorias a partir de microglía y astrocitos (figura 2). La microglía primaria se preparó con LPS/IFNy para inducir un fenotipo proinflamatorio similar a M1 y, posteriormente, se trató con medios (control), UBM-ECM o MBV aislada de UBM-E^c M para determinar si UBM-ECM y MBV pueden suprimir la secreción de citocinas proinflamatorias (figuras 2A, 2B, 2C, 2G). La microglía tratada con LPS/IFNy durante 24 horas (no sensibilizada) tuvo una mayor liberación de IL-1 p, IL-6 y TNF-a en el secretoma. El análisis del secretoma de la microglía sensibilizada con LPS/IFNy durante 6 horas y a, continuación, tratada con medios dio como resultado un aumento comparable de la liberación de IL-1 p, IL-6 y TNF-a, lo que indica que la microglía continuó liberando citocinas proinflamatorias después de que el sobrenadante se retiró y se reemplazó con medios. Finalmente, la microglía sensibilizada con LPS/IFNy durante 6 horas y tratada con UBM-ECM o MBV mostró niveles de expresión de IL-1 p, IL-6 y TNF-a similares a los de la microglía tratada solo con medios durante 24 horas, lo que indica que el tratamiento con UBM-ECM y MBV durante 24 horas después de la sensibilización con LPS/IFNy suprime la liberación de citocinas proinflamatorias. El análisis del secretoma de astrocitos mostró resultados y tendencias comparables a los resultados de la microglía (figuras 2D, 2E, 2F, 2H). Los astrocitos tratados con sobrenadantes de microglía no sensibilizada tratada con LPS/IFNy mostraron una mayor expresión de IL-1 p, IL-6 y TNF-a, lo que indica que el secretoma de la microglía proinflamatoria regula al alza la liberación de marcadores proinflamatorios de los astrocitos. El secretoma de la microglía sensibilizada con LPS/IFNy tratada con medios indujo una expresión regulada al alza similar de IL-1 p, IL-6 y TNF-a a partir de astrocitos, mientras que el secretoma de la microglía sensibilizada con LPS/IFNy y tratada con UBM-ECM o MBV no aumentó la expresión de marcadores proinflamatorios por parte de los astrocitos. Estos resultados indican que el tratamiento con UBM-ECM y MBV después de la sensibilización de la microglia puede regular a la baja la secreción de citocinas proinflamatorias de microglia y prevenir la secreción de citocinas proinflamatorias por parte de los astrocitos.

Ejemplo 4

Las MBV suprimen la secreción de citocinas proinflamatorias, lo que aumenta la supervivencia de las RGC in vitro

Las RGC se trataron con sobrenadantes de astrocitos y los resultados mostraron que el tratamiento de la microglía con LPS/IFNy, o la sensibilización con LPS/IFNy, y el tratamiento posterior con medios dieron como resultado la muerte celular de las RGC al 100 %, mientras que el tratamiento con UBM-ECM o MBV después de la sensibilización de la microglía aumentó la viabilidad de las RGC y previno la muerte celular de las RGC (figura 3). Estos resultados se corresponden con estudios previos que muestran que la polarización similar a M1 de la microglía afecta a la viabilidad de las RGC por medio de polarización similar a A1 de los astrocitos (Liddelow et al., Nature, 2017. 541(7638): págs. 481-487), y sugieren que la promoción de un fenotipo antiinflamatorio de microglia sobre un fenotipo proinflamatorio aumentará la supervivencia de las RGC después de la lesión.

Ejemplo 5

Las MBV no son citotóxicas a bajas concentraciones in vivo

Se llevaron a cabo estudios in vivo para determinar qué concentraciones de MBV no son citotóxicas después de la inyección intravítrea. La viabilidad de las RGC se cuantificó alrededor de la cabeza del nervio óptico (Central) y alrededor de la periferia de la retina (Periferia) y los resultados se muestran como porcentaje de RGC viables en comparación con el control no inyectado (figura 4). La viabilidad de las RGC alrededor de la periferia no cambió después de las inyecciones de ^m B^v y PBS en comparación con el control no inyectado. La viabilidad de las RGC en la región central se redujo a un 82,8 ± 1,9 % y un 80,7 ± 4,4 % de los ojos de control no inyectados después de la inyección de 10 |xg/ml y 20 |xg/ml, respectivamente, mientras que la inyección de 5 |xg/ml de MBV (104,4 ± 4,1 %) y PBS (97,4 ± 3,0 %) no tuvo ningún efecto sobre la viabilidad de las ^rG^c . Por lo tanto, se eligió la concentración de MBV de 5 |xg/ml para los experimentos in vivo de elevación de la IOP.

Ejemplo 6

Las MBV aumentan la supervivencia de las RGC después de la elevación de la IOP

Después de la elevación de la IOP, se inyectaron 5 |xg/ml de MBV por vía intravítrea inmediatamente después de la elevación de la IOP, y en los días 2 y 7 y dieron como resultado un aumento significativo en la viabilidad de las RGC (figura 5). La viabilidad de las RGC se analizó 14 días después de la elevación de la IOP, y la elevación de la IOP sola y la elevación de la IOP con inyección de PBS dieron como resultado una viabilidad de las RGC significativamente menor en la retina central con una supervivencia de las RGC del 47,4 ± 2,3 % y el 41,8 ± 2,3 % en comparación con el control sin lesiones. El tratamiento con MBV provocó un aumento significativo en la supervivencia de las RGC en la retina central en comparación con los dos grupos no tratados, con una supervivencia del 79,5 ± 3,8 %. De manera similar, en la retina periférica, la elevación de la IOP sola y la elevación de la IOP con PBS provocaron una disminución significativa en la viabilidad de las RGC con una supervivencia de las RGC del 36,3 ± 3,6 % y el 26,4 ± 2,8 %, respectivamente, en comparación con los controles no lesionados. El tratamiento con MBV aumentó significativamente la supervivencia de las RGC al 75,9 ± 4,2 % en comparación con los controles no lesionados.

Ejemplo 7

Las MBV aumentan la supervivencia de axones de RGC después de la elevación de la IOP

El marcado con CtxB en la retina mostró un marcado de axones intactos en la retina central y periférica en el grupo de control sano y un marcado axonal disminuido en los grupos de elevación de la IOP y elevación de la IOP con inyección de PBS (figura 6A). Los animales tratados con MBV mostraron un marcado de axones intactos, similar al de los grupos de control sanos, lo que indica que el tratamiento con MBV conserva los axones de RGC además de los cuerpos celulares de RGC en la retina. En los nervios ópticos (figura 6B), los grupos de elevación de la IOP y de elevación de la IOP con inyección de PBS mostraron una disminución significativa del marcado con CtxB al 32.5 ± 6,3 % y al 26,8 ± 4,4 % del control no lesionado, respectivamente (figura 6C). El marcado con CtxB en los nervios ópticos tratados con MBV disminuyó significativamente en comparación con los controles no lesionados al 78.6 ± 6,1 % de los controles y aumentó significativamente en comparación con los grupos de elevación de la IOP y elevación de la IOP con inyección de PBS.

Ejemplo 8

Las MBV disminuyen la expresión de GFAP después de la elevación de la IOP

Para analizar el efecto de las MBV sobre la activación de astrocitos in vivo, se analizó la expresión de GFAP a lo largo de la longitud del nervio óptico (figura 7A). En comparación con los nervios de control no lesionados, la expresión de GFAP aumentó significativamente en los grupos de elevación de la IOP y elevación de la IOP con inyección de PBS, lo que es consistente con la migración y activación típicas de los astrocitos después de una lesión del nervio óptico. Cuantitativamente, la elevación de la IOP y la elevación de la IOP con PBS aumentaron significativamente la expresión de GFAP al 393 ± 22,7 % y 413,7 ± 26,3 %, respectivamente, en comparación con el control no lesionado (figura 7B). Cualitativa y cuantitativamente, los nervios ópticos de los animales tratados con MBV después de la elevación de la IOP mostraron una disminución de la expresión de GFAP, y no hubo una diferencia significativa (107,7 ± 6,4 % de aumento) en la expresión de GFAP entre los nervios ópticos de control no lesionados y los nervios ópticos tratados con MBV.

Ejemplo 9

Las MBV aumentan la expresión de GAP43 después de la elevación de la IOP

Para determinar si las MBV pueden aumentar el crecimiento de axones de RGC in vivo, se analizó la expresión del marcador de crecimiento de axones GAP-43 (figura 8A). En comparación con los nervios de control no lesionados, la expresión de GAP43 disminuyó significativamente en los grupos de elevación de la IOP y elevación de la IOP con inyección de PBS a un 77,5 ± 7,2 % y 77,8 ± 8,4 % de los controles no lesionados, respectivamente (figura 8B). Los nervios ópticos de los animales tratados con MBV mostraron una mayor expresión de GAP43 y no hubo diferencia (108,6 ± 6,1 %) en la expresión de GAP43 entre los nervios ópticos de control no lesionados y los tratados con MBV.

Ejemplo 10

Las MBV mejoran la función eléctrica de la retina después de la elevación de la IOP

La amplitud y la latericia de la respuesta fotópica negativa (PhNR) se registraron utilizando electrorretinografía (ERG) (figura 9). En comparación con los ojos de control no lesionados, la elevación de la IOP y la elevación de la IOP con la inyección de PBS redujeron significativamente la amplitud de la PhNR en un 32,8 ± 4,4 % y un 42,0 ± 16,8 %, mientras que no hubo diferencia en la amplitud de la PhNR entre los ojos de control no lesionados y los tratados con MBV (figura 9C). El análisis de latencia mostró que la elevación de la IOP aumentó significativamente la latencia en un 16,6 ± 4,0 % en comparación con el grupo de control no lesionado, mientras que la elevación de la IOP con la inyección de PBS y el tratamiento con MBV no tuvieron un efecto significativo sobre la latencia (figura 9D).

Ejemplo 11

Las MBV son distintas de los exosomas

Se ha demostrado que las vesículas extracelulares (EV, extracellular vesicles), que incluyen tanto exosomas como microvesículas, se secretan exclusivamente en el fluido extracelular, donde pueden reubicarse libremente entre las células, así como en sitios distantes utilizando fluidos biológicos como medio líquido móvil (figura 10). De hecho, las EV se han aislado a partir de la mayoría de los tipos de fluidos biológicos, incluyendo la sangre, la orina, la leche materna, el líquido cefalorraquídeo y los derrames pleurales. Además, las EV se secretan en los medios acondicionados de células madre mesenquimáticas (MSC, mesenchymal stem cells) cultivadas in vitro. Las EV aisladas a partir de fluidos corporales o a partir de sobrenadantes de cultivos celulares se identifican fácilmente mediante la expresión de marcadores de superficie exosómicos comunes que incluyen: CD63, CD81, CD9 y Hsp70. A diferencia de los exosomas, las nanovesículas unidas a matriz (MBV) se han notificado recientemente como un componente integral y funcional de la matriz extracelular (ECM). Las MBV son una subpoblación específica de vesículas estrechamente asociadas a las fibras de colágeno dentro de la ECM. Se demostró que las MBV se pueden separar de la matriz solamente después de la digestión enzimática del material del armazón de ECM, lo que sugiere que MBV incrustadas dentro de la ECM solo están disponibles para la captación celular durante eventos de remodelación de la matriz, tales como los que producen durante procesos fisiológicos normales como cicatrización de heridas y estrés mecánico, o durante la degradación iniciada por la respuesta del huésped a armazones biológicos de ECM implantados (figura 10). Como resultado de su compartimentación distinta dentro de la matriz, las MBV contienen un conjunto único de marcadores de superficie celular para permitir la integración en la matriz. Además, las MBV no expresan marcadores de superficie clásicos típicamente asociados con exosomas (figura 11). Dadas las diferencias en su ubicación dentro del cuerpo (es decir, fluido frente a unidas a ECM) y su firma de carga diferencial, las MBV y los exosomas necesariamente tienen funciones diferenciales. Para demostrar esto, se aislaron MBV y exosomas a partir de células madre cultivadas in vitro (figura 12). Las muestras de MBV y exosomas se utilizaron, a continuación, para estimular macrófagos derivados de médula ósea de ratón. Los resultados muestran un perfil fenotípico distintivo de los macrófagos expuestos a MBV en comparación con los estimulados con exosomas (figura 13). Es importante destacar que la expresión de los marcadores panmacrófagos F4/80 y CD-11b se redujo significativamente en los macrófagos tratados con exosomas pero no en los macrófagos tratados con MBV. Los resultados demuestran las actividades biológicas diferenciales de las subpoblaciones de EV, documentan que las MBV son distintas de los exosomas y demuestran que las MBV tienen potencial en la medicina regenerativa. Las MBV también contenían Lox en su superficie.

En vista de las muchas realizaciones posibles a las que se pueden aplicar los principios de la presente invención dada a conocer, debe reconocerse que las realizaciones ilustradas son solo ejemplos preferentes de la presente invención y no deben considerarse como limitantes del alcance de la presente invención. Más bien, el alcance de la presente invención está definido por las siguientes reivindicaciones.

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Nanovesículas aisladas derivadas de una matriz extracelular para su utilización en el tratamiento de:

(1) glaucoma en un individuo;

(2) degeneración de las células del ganglio retiniano provocada por una lesión o un trastorno genético en un individuo;

(3) neuropatía óptica glaucomatosa independiente de la presión, neuropatía óptica isquémica, neuropatía óptica inflamatoria, neuropatía óptica compresiva o neuropatía óptica traumática en un individuo; o

(4) neuropatía óptica isquémica arterítica, neuropatía óptica isquémica arterítica asociada con arteritis de células gigantes, neuropatía óptica isquémica no arterítica, neuropatía óptica infiltrante, neuropatía óptica infiltrante asociada con sarcoidosis, neuropatía óptica infecciosa, neuropatía óptica infecciosa asociada con sífilis, neuropatía óptica infecciosa asociada con la enfermedad de Lyme, neuropatía óptica infecciosa asociada con toxoplasmosis, neuropatía óptica infecciosa asociada con herpes zoster, neuritis óptica por enfermedad desmielinizante, neuropatía óptica posradiación, acrodermatitis enteropática, neuropatía óptica hereditaria, neuropatía óptica hereditaria asociada con neuropatía óptica dominante, neuropatía óptica compresiva, neuropatía óptica compresiva asociada con seudotumor orbitario, neuropatía óptica compresiva asociada con oftalmopatía tiroidea, neuropatía óptica autoinmunitaria o neuropatía óptica autoinmunitaria asociada con lupus en un individuo,

en las que las nanovesículas mantienen la expresión de F4/80 y CD-11b en macrófagos en el individuo, en las que las nanovesículas comprenden lisil oxidasa, y en las que las nanovesículas a) no expresan CD63 o CD81, o b) son CD63loCD81l 234°.

2. Nanovesículas aisladas para su utilización, según la reivindicación 1, en las que:

(1) la matriz extracelular es una matriz extracelular de mamífero;

(2) la matriz extracelular de mamífero es una matriz extracelular humana;

(3) la matriz extracelular es de tejido esofágico, vejiga urinaria, submucosa del intestino delgado, dermis, cordón umbilical, pericardio, tejido cardíaco, tejido tumoral o músculo esquelético; y/o

(4) las nanovesículas comprenden miR-145 y/o miR-181.

3. Nanovesículas aisladas para su utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en las que:

(1) las nanovesículas son para administración localmente al ojo del individuo, en las que opcionalmente las nanovesículas son para administración por vía intravítrea o por vía subretiniana; y/o

(2) las nanovesículas son para administración repetidamente al ojo del individuo, en las que opcionalmente las nanovesículas son para administración semanal, bimensual o mensual al individuo.

4. Nanovesículas aisladas para su utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en las que el individuo tiene glaucoma.

5. Nanovesículas aisladas para su utilización, según la reivindicación 4, en las que al individuo se le administra una cantidad eficaz terapéuticamente de un agente que reduce la presión intraocular, en las que, opcionalmente, el agente o agentes que reducen la presión intraocular son a) un análogo de prostaglandina, b) un bloqueador beta-adrenérgico, c) un agonista alfa-adrenérgico, o d) un agonista colinérgico.

6. Nanovesículas aisladas para su utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en las que el individuo tiene degeneración de las células del ganglio retiniano provocada por una lesión.

7. Composición que comprende una cantidad eficaz terapéuticamente de nanovesículas aisladas derivadas de una matriz extracelular, en la que las nanovesículas mantienen la expresión de F4/80 y CD-11b en macrófagos en un individuo, y en la que las nanovesículas a) no expresan CD63 o CD81, o b ) son CD63loCD81lo, para su utilización en el tratamiento de:

(1) glaucoma en un individuo;

(2 ) degeneración de las células del ganglio retiniano provocada por una lesión o un trastorno genético en un individuo;

(3) neuropatía óptica glaucomatosa independiente de la presión, neuropatía óptica isquémica, neuropatía óptica inflamatoria, neuropatía óptica compresiva o neuropatía óptica traumática en un individuo; o

(4) neuropatía óptica isquémica arterítica, neuropatía óptica isquémica arterítica asociada con arteritis de células gigantes, neuropatía óptica isquémica no arterítica, neuropatía óptica infiltrante, neuropatía óptica infiltrante asociada con sarcoidosis, neuropatía óptica infecciosa, neuropatía óptica infecciosa asociada con sífilis, neuropatía óptica infecciosa asociada con la enfermedad de Lyme, neuropatía óptica infecciosa asociada con toxoplasmosis, neuropatía óptica infecciosa asociada con herpes zoster, neuritis óptica por enfermedad desmielinizante, neuropatía óptica posradiación, acrodermatitis enteropática, neuropatía óptica hereditaria, neuropatía óptica hereditaria asociada con neuropatía óptica dominante, neuropatía óptica compresiva, neuropatía óptica compresiva asociada con seudotumor orbitario, neuropatía óptica compresiva asociada con oftalmopatía tiroidea, neuropatía óptica autoinmunitaria o neuropatía óptica autoinmunitaria asociada con lupus en un individuo,

en la que la composición se formula para administración localmente al ojo del individuo.

8. Composición para su utilización, según la reivindicación 7, en la que:

(1) la matriz extracelular es una matriz extracelular de mamífero;

(2) la matriz extracelular de mamífero es una matriz extracelular humana;

(3 ) la matriz extracelular es de tejido esofágico, vejiga urinaria, submucosa del intestino delgado, dermis, cordón umbilical, pericardio, tejido cardíaco, tejido tumoral o músculo esquelético; y/o

(4) las nanovesículas comprenden miR-145 y/o miR-181.

9. Composición para su utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 7-8, en la que:

(1) las nanovesículas son para administración localmente al ojo del individuo, en las que opcionalmente las nanovesículas son para administración por vía intravítrea o por vía subretiniana; y/o

(2) las nanovesículas son para administración repetidamente al ojo del individuo, en las que opcionalmente las nanovesículas son para administración semanal, bimensual o mensual al individuo.

10. Composición para su utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en la que el individuo tiene glaucoma.

11. Composición para su utilización, según la reivindicación 10, en la que al individuo se le administra una cantidad eficaz terapéuticamente de un agente que reduce la presión intraocular, en la que, opcionalmente, el agente o agentes que reducen la presión intraocular son a) un análogo de prostaglandina, b) un bloqueador beta-adrenérgico, c) un agonista alfa-adrenérgico, o d) un agonista colinérgico.

12. Composición para su utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en la que el individuo tiene degeneración de las células del ganglio retiniano provocada por una lesión.

13. Nanovesículas aisladas para su utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o composición para su utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en las que el individuo tiene degeneración de las células del ganglio retiniano provocada por un trastorno genético.

14. Nanovesículas aisladas para su utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o composición para su utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en las que el individuo tiene neuropatía óptica glaucomatosa independiente de la presión, neuropatía óptica isquémica, neuropatía óptica inflamatoria, neuropatía óptica compresiva o neuropatía óptica traumática.

15. Nanovesículas aisladas para su utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o composición para su utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en las que el individuo tiene neuropatía óptica isquémica arterítica, neuropatía óptica isquémica arterítica asociada con arteritis de células gigantes, neuropatía óptica isquémica no arterítica, neuropatía óptica infiltrante, neuropatía óptica infiltrante asociada con sarcoidosis, neuropatía óptica infecciosa, neuropatía óptica infecciosa asociada con sífilis, neuropatía óptica infecciosa asociada con la enfermedad de Lyme, neuropatía óptica infecciosa asociada con toxoplasmosis, neuropatía óptica infecciosa asociada con herpes zoster, neuritis óptica por enfermedad desmielinizante, neuropatía óptica posradiación, acrodermatitis enteropática, neuropatía óptica hereditaria, neuropatía óptica hereditaria asociada con neuropatía óptica dominante, neuropatía óptica compresiva, neuropatía óptica compresiva asociada con seudotumor orbitario, neuropatía óptica compresiva asociada con oftalmopatía tiroidea, neuropatía óptica autoinmunitaria o neuropatía óptica autoinmunitaria asociada con lupus.

16. Nanovesículas aisladas para su utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y 13-15, o composición para su utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 7-15, en las que las nanovesículas disminuyen la secreción de una citocina de la microglía y/o los astrocitos.

17. Nanovesículas aisladas para su utilización, según la reivindicación 16, o composición para su utilización, según la reivindicación 16, en las que la citocina es IL-1p, IL-6 o TNF-a.