KR102270386B1 - 재조합 지방줄기세포를 포함하는 골 재생용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 지방줄기세포를 포함하는 골 재생용 조성물에 관한 것으로, 효과적으로 신생혈관 생성 및 골 분화를 유도할 수 있어 손상된 골에 대한 골형성 유도 및 골재생 효과가 우수하므로, 골절 질환의 치료에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

재조합 지방줄기세포를 포함하는 골 재생용 조성물{Composition for Bone Begeneration comprising Recombinant Adipose-Derived Stem Cell}

본 발명은 재조합 지방줄기세포를 포함하는 골 재생용 조성물, 이를 포함하는 골절 질환 치료용 약학적 조성물 및 세포치료제에 관한 것이다.

골의 큰 결손이나 대퇴골두 무혈성괴사와 같이 외상, 종양, 질병으로 인해 발생되는 자연 재생이 힘든 광범위한 골 결손은 1년에 수십만 건의 재건수술이 행하여지고 있으나, 완치가 쉽지 않은 실정이다. 특히, 대퇴골두의 혈액공급이 차단되어 발생하며 결국 골두가 붕괴되는 질환인 대퇴골두 무혈성괴사는 우리나라에서 고관절 인공관절치환술의 가장 많은 원인이 되고 있는 질환으로, 심한 통증과 보행 장애를 유발하므로, 이환된 환자는 결국 수술적 치료를 받게 된다. 다만, 환자들 중에서 20-40대의 젊은 환자들이 대다수를 차지하는데, 인공관절은 사용 기한에 한계가 있으므로, 인공관철 치환술을 받은 환자는 1-2회의 재수술이 필요하다, 다만, 재수술시에는 1차 수술의 경우보다 좋은 결과를 얻기 어렵다.

따라서, 대퇴골두를 보존하려는 시도들이 지난 50년간 개발되어 왔으나 인공관절치환술을 대치할 수 있는 결과를 보이지는 못하였다. 골수에 내재된 줄기세포에 의한 골형성이 대퇴골두 무혈성괴사를 치유할 수 있다는 가정 하에 최근 15년간 자가농축골수세포(bone marrow aspirate concentrate) 이식술이 젊은 대퇴골두 무혈성괴사 환자들에게 시행되어 왔으나, 기대했던 효과는 나타나지 않는 실정이다. 이는 이식된 세포에 혈액공급이 충분하지 않아 이식된 세포의 대부분이 이식 초기에 괴사하며, 이식주위부의 혈액 공급이 부족하여 골 형성이 좋지 않기 때문이다.

현재까지 자가 골 이식술이 골 유도성이 좋고, 질병전파 위험성이 없는 표준적인 방법이나 사용할 수 있는 양이 제한이 되고, 조직 공여부 손상과 통증을 유발 할 수 있는 문제가 있어, 제한적으로 사용되고 있다. 조직 공학과 재생의학 발달에 따른 성체줄기세포 이식에 의한 치료가 각광 받고 있고, 골수는 대표적인 성체 줄기세포의 원천이나, 그 양이 제한되어 있다는 단점이 있다.

성체 줄기세포의 출처로 가장 유망하다고 생각되는 조직은 생체에 막대한 양이 존재하고 있는 지방 조직이며, 비교적 간단한 지방흡입시술에 의해 공여부의 기능 장애 없이 손쉽게, 다량을 얻을 수 있다. 하지만 언급된 장점에도 불구하고 지방줄기세포의 낮은 분화능은 지방 줄기세포의 세포원으로써의 사용을 어렵게 한다. 따라서 지방 줄기세포를 유용한 세포원으로 사용하기 위해서는 지방 줄기세포의 분화에 영향을 주는 효율적인 인자들에 대한 발굴과 연구가 매우 필요하다. 또한, 유전자 조작에 일반적으로 사용되는 바이러스 벡터는 안전성 문제로 인해 아직 임상에서 사용될 수 없다는 문제점이 존재한다.

이에, 본 발명자들은 비바이러스벡터를 사용하여 골 재생을 유도할 수 있는 지방줄기세포를 개발하기 위한 연구를 수행하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 특허공개 제10-2018-0085698호

본 발명의 하나의 목적은 BMP2 유전자가 형질전환된 지방줄기세포 및 VEGF 유전자가 형질전환된 지방줄기세포 중 하나 이상의 지방줄기세포를 포함하는 골 재생용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 BMP2 유전자가 형질전환된 지방줄기세포 및 VEGF 유전자가 형질전환된 지방줄기세포 중 하나 이상의 지방줄기세포를 포함하는 골 재생용 조성물을 포함하는 골절 질환 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 BMP2 유전자가 형질전환된 지방줄기세포 및 VEGF 유전자가 형질전환된 지방줄기세포 중 하나 이상의 지방줄기세포를 포함하는 골 재생용 조성물을 포함하는 세포치료제를 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양상은 BMP2 유전자가 형질전환된 지방줄기세포 및 VEGF 유전자가 형질전환된 지방줄기세포 중 하나 이상의 지방줄기세포를 포함하는 골 재생용 조성물을 제공한다.

본 발명에서는 BMP2 유전자가 형질전환된 지방줄기세포 및 VEGF 유전자가 형질전환된 지방줄기세포를 비바이러스성 벡터를 사용하여 개발하였다. 따라서, 기존에 사용되어 오던 바이러스성 벡터 시스템이 가지는 면역원성 등의 생물학적 안정성의 문제, 및 비바이러스성 벡터 시스템이 가지는 전달 효율의 문제가 없으므로, 본 발명의 재조합 지방줄기세포는 골 재생 용도로 유용하게 활용될 수 있다.

또한, 본 발명의 BMP2 유전자가 형질전환된 지방줄기세포 및 VEGF 유전자가 형질전환된 지방줄기세포는 일반적인 지방줄기세포와는 달리 우수한 골 분화능을 나타내므로, 골 재생 용도로 유용하게 활용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "골 재생"은 손상된 골 및 골 주변부가 손상 전의 기능을 나타낼 수 있도록 전부 또는 일부 회복되는 것을 말하며, 이는 골의 분화 및 형성과 골 주변부의 신생혈관의 생성에 의한 것일 수 있다.

본 발명의 형질전환 지방줄기세포를 제조하기 위하여, 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 당 분야에서 공지된 방법을 사용할 수 있으며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온성 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 BMP2 유전자가 형질전환된 지방줄기세포 및 VEGF 유전자가 형질전환된 지방줄기세포를 포함하는 것일 수 있다.

BMP2 유전자가 형질전환된 지방줄기세포 및 VEGF 유전자가 형질전환된 지방줄기세포를 공배양하여 사용하는 것이, 신생혈관 생성 및 골 분화 촉진에 의하여 효과적으로 골 재생을 유도할 수 있으므로 바람직하다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 BMP2 유전자가 형질전환된 지방줄기세포 및 VEGF 유전자가 형질전환된 지방줄기세포를 95:5 내지 80:20의 개수비로 포함하는 것일 수 있다.

BMP2 유전자가 형질전환된 지방줄기세포 및 VEGF 유전자가 형질전환된 지방줄기세포의 비율이 100:0 내지 95:5일 경우, 골 결손 부위의 혈관 생성이 충분하지 못하여, 골 재생 효율이 낮아진다. 반면, BMP2 유전자가 형질전환된 지방줄기세포 및 VEGF 유전자가 형질전환된 지방줄기세포의 비율이 80:20 내지 0:100일 경우, 골 분화가 충분히 유도되지 않으므로, 골 재생 효율이 낮아진다. 따라서, BMP2 유전자가 형질전환된 지방줄기세포 및 VEGF 유전자가 형질전환된 지방줄기세포를 95:5 내지 80:20의 개수비로 사용하는 것이 골 재생에 가장 효과적이다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 형질전환은 비바이러스 벡터에 의한 것일 수 있다.

본 발명의 BMP2 유전자가 형질전환된 지방줄기세포 및 VEGF 유전자가 형질전환된 지방줄기세포는 비바이러스 벡터에 의하여 형질전환되므로, 바이러스성 벡터 시스템이 가지는 면역원성 등의 생물학적 안정성의 문제, 및 비바이러스성 벡터 시스템이 가지는 전달 효율의 문제 없이 임상적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 비바이러스 벡터는 미니써클 벡터인 것일 수 있다.

본 발명에서 재조합 지방줄기세포의 제조에 사용되는 비바이러스성 벡터는 미니써클 벡터, 구체적으로, pMCCMVMCS(MN501A-1)/pMCCMVMCS-EF1-RFP(MN512A-1) 벡터일 수 있다. 복제 개시점은 주로 박테리아 유래의 서열로서 인체 내에서 불필요한 면역 반응을 일으킬 수 있으며, 항생제 내성 유전자와 같은 선별마커 유전자는 체내 존재하는 세균들에까지 전달될 수 있어 다른 질환으로 인해 동일 군의 치료 항생제를 투여하는 경우 불필요한 항생제 내성을 일으킬 수 있는 문제가 있다. 반면, 본 발명에서 사용한 벡터의 경우, 복제 개시점 및 항생제 내성 유전자와 같은 선별마커 유전자가 포함된 박테리아 골격은 증식과정에서 자연적으로 분해되어 없어지기 때문에, 최종산물로써 외래유전자만을 포함하는 벡터에 의한 형질전환이 가능하다.

본 발명의 다른 양상은 BMP2 유전자가 형질전환된 지방줄기세포 및 VEGF 유전자가 형질전환된 지방줄기세포 중 하나 이상의 지방줄기세포를 포함하는 골 재생용 조성물을 포함하는 골절 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 약제의 제조에 통상적으로 이용되는 것으로써, 락토오스, 덱스트로스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(22th ed., 2013)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 골 재생에 활성을 나타내는 물질과 함께 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 골 재생을 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물치료 및/또는 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종 기제 및/또는 첨가물을 포함할 수 있으며, 그 효과를 떨어트리지 않는 범위 내에서 비이온 계면활성제, 실리콘 폴리머, 체질안료, 향료, 방부제, 살균제, 산화 안정화제, 유기 용매, 이온성 또는 비이온성 증점제, 유연화제, 산화방지제, 자유 라디칼 파괴제, 불투명화제, 안정화제, 에몰리언트(emollient), 실리콘, α-히드록시산, 소포제, 보습제, 비타민, 곤충 기피제, 향료, 보존제, 계면활성제, 소염제, 물질 P 길항제, 충전제, 중합체, 추진제, 염기성화 또는 산성화제, 또는 착색제 등 공지의 화합물을 더 포함하여 제조될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001~1000㎎/kg일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 비경구, 구체적으로 골 결손 부위에 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여시 다양한 제형으로 투여될 수 있는데, 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드, 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 구체적으로, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제 및 동결건조제제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 또한, 치료제의 효능 증진을 위해 칼슘이나 비타민 D3를 첨가할 수 있다.

이러한 조성물은 단위-용량(1회분) 또는 다중-용량(수 회분) 용기, 예를 들면, 밀봉된 앰풀 및 바이알에 제시될 수 있고, 사용 직전에 멸균성 액상 담체, 예를 들면, 주사용 수의 부가만을 요구하는 동결-건조 조건하에 저장할 수 있다. 즉석의 사용제 및 현탁제는 멸균성 산제, 과립제 및 정제로부터 제조할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 골절 질환은 대퇴골두 무혈성괴사일 수 있다.

본 발명의 골절 질환 치료용 조성물에 포함되는 골 재생용 조성물은 골 분화와 신생혈관 생성을 동시에 유도할 수 있으므로, 특히, 대퇴골두의 혈액공급이 차단되어 발생하며 결국 골두가 붕괴되는 질환인 대퇴골두 무혈성괴사의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상은 BMP2 유전자가 형질전환된 지방줄기세포 및 VEGF 유전자가 형질전환된 지방줄기세포 중 하나 이상의 지방줄기세포를 포함하는 골 재생용 조성물을 포함하는 세포치료제를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "세포치료제"란 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 이종(xenogenic) 세포를 체외에서 증식ㆍ선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 말한다. 미국은 1993년부터, 우리나라는 2002년부터 세포치료제를 의약품으로 관리하고 있다.

본 발명의 세포치료제는 조직재생 혹은 장기기능 회복을 위한 줄기세포 치료제로써, 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 세포치료제는 세포 치료에 일반적으로 사용되는 약학적 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다.

또한, 본 발명의 세포치료제는 세포치료제가 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 세포치료제는 질환의 치료를 위하여 치료학적으로 유효한 양의 세포치료제를 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, "치료학적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 세포치료제는 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 포함하는 것이 중요하다. 예를 들어, 본 발명의 공배양한 BMP2 유전자 발현 재조합 지방줄기세포 및 VEGF 유전자 발현 재조합 지방줄기세포는 체중 kg당 1×10⁵ 내지 5×10⁹ 세포수로 투여되는 것일 수 있다.

본 발명의 재조합 지방줄기세포를 포함하는 골 재생용 조성물에 따르면, 효과적으로 신생혈관 생성 및 골 분화를 유도할 수 있어 손상된 골에 대한 골형성 유도 및 골재생 효과가 우수하므로, 골절 질환의 치료에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명에서 사용한 미니써클 벡터 중 박테리아 골격에 해당하는 부분의 분해 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 BMP2 또는 VEGF 유전자 발현 비바이러스성 미니써클 벡터를 나타낸 그림이다.
도 3은 BMP2 유전자가 형질전환된 지방줄기세포(A) 및 VEGF 유전자가 형질전환된 지방줄기세포(B)의 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 4는 BMP2 유전자가 형질전환된 지방줄기세포(A) 및 VEGF 유전자가 형질전환된 지방줄기세포(B)의 각 유전자의 mRNA 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 5는 BMP2 유전자가 형질전환된 지방줄기세포(A 및 C) 및 VEGF 유전자가 형질전환된 지방줄기세포(B 및 D)의 각 유전자에 대한 mRNA 및 단백질의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 6은 BMP2 유전자가 형질전환된 지방줄기세포 및 VEGF 유전자가 형질전환된 지방줄기세포의 처리에 따른 신생혈관 생성 효과를 나타낸 사진이다.
도 7은 BMP2 유전자가 형질전환된 지방줄기세포 및 VEGF 유전자가 형질전환된 지방줄기세포의 처리에 따른 분지점 증가 효과를 나타낸 사진이다.
도 8은 BMP2 유전자가 형질전환된 지방줄기세포 및 VEGF 유전자가 형질전환된 지방줄기세포의 처리에 따른 골 분화 효과를 나타낸 사진이다.
도 9는 두개골 결손 모델(calvarial defect model)에서, BMP2 유전자가 형질전환된 지방줄기세포 및 VEGF 유전자가 형질전환된 지방줄기세포의 처리에 따른 골형성 유도 및 골재생 효과를 나타낸 사진이다.
도 10은 분절 결손 모델(segmental defect model)에서, BMP2 유전자가 형질전환된 지방줄기세포 및 VEGF 유전자가 형질전환된 지방줄기세포의 처리에 따른 골형성 유도 및 골재생 효과를 나타낸 사진이다.
도 11은 골재생 유효성을 평가하기 위하여 8주 동안 이식한 세포가 잔존함을 확인한 이미징 결과를 나타낸 사진이다.

이하 본 발명을 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 재조합 미니써클 벡터 제조 및 재조합 지방줄기세포의 혈관형성 및 골형성 효과 분석 방법

1-1. 지방줄기세포 배양

지방 흡입술을 통해 얻어진 인체의 지방조직으로부터 지방줄기세포(adipose-derived stem cell: ADSC)를 얻었다. 상기 지방줄기세포는 10% FBS(Gibco, Cat. 16000-044, USA) 및 1% Penicillin-Streptomycin, 100x(Welgene, Cat. LS 202-02, Republic of Korea)이 보충된 37℃ 및 5% CO₂의 Alpha MEM(Gibco, Cat. 12571-063, USA) 배지에서 100mm 디쉬(dish) 당 백만개씩 배양하였다.

1-2. BMP2 또는 VEGF 유전자 발현 비바이러스성 미니써클 벡터의 제조 및 형질전환

미니써클 제조용 벡터는 도 1의 그림으로 도시한 바와 같이, ΦC31 인테그라아제(integrase)와 I-SceI 엔도뉴클레아제(endonuclease)가 동시 발현되는 박테리아 내에서 증식시킬 경우, arabinose induction에 의해 발현시키고자 하는 외래유전자만을 포함하는 MC 부위와 항생제 저항성 유전자와 박테리아 오리진을 포함하는 박테리아 골격의 두 가지 벡터로 상동 재조합(homologous recombination)된다. 상기 박테리아 골격에 해당되는 벡터는 증식과정에서 자연적으로 분해되어 없어지기 때문에 최종산물로써 외래유전자만을 포함하는 MC를 획득할 수 있다. 이러한 MC에는 박테리아 골격에 해당되는 부위가 없기 때문에 생산된 재조합 벡터의 산물을 곧바로 임상연구에 적용할 수 있다는 장점이 있다.

본 발명의 비바이러스성 미니써클 벡터를 제조하기 위하여, SBI사로부터 미니써클(MC) 제조용 벡터인 pMCCMVMCS(MN501A-1)를 구입하여 이를 기본 골격으로 이용하였으며, 유전자 클로닝을 위한 모플라스미드(pMC)의 단일 제한효소 부위들을 이용하여 BMP2 또는 VEGF 유전자가 발현될 수 있는 pMC 벡터를 제작하였다. BMP2 및 VEGF 유전자는 Invitrogen 사에서 제공하는 MGC 클론을 구입하여 DNA PCR을 위한 주형(template)으로 사용하였고, 각 유전자들의 PCR 반응을 위한 프라이머들은 하기 표 1에 나타내었다. PCR 반응 후 확보된 유전자들은 pGEM-T-Easy 벡터에 연결하여 전체 유전자 서열분석(full gene sequencing)을 통해 유전자 서열의 이상 여부를 확인하였고, 유전자 서열이 정확히 일치하는 BMP2 또는 VEGF 유전자를 각각 pMC에 연결하여, BMP2 또는 VEGF 유전자 발현 비바이러스성 미니써클 벡터를 제조하였다(도 2).

프라이머		프라이머 염기서열(5'→3')	서열번호
BMP2	forward	acgcggccgcggatccatggtggccgggacccgctgtcttc	서열번호 1
	reverse	tgattgtcgagctagcctagcgacacccacaacc	서열번호 2
VEGF	forward	acgcggccgcggatccatgaactttctgctgtcttg	서열번호 3
	reverse	tgattgtcgagctagctcaccgcctcggcttgtc	서열번호 4

1-3. 전기천공법에 따른 BMP2 또는 VEGF 유전자 발현 재조합 지방줄기세포의 제조

실시예 1-1에서 배양한 지방줄기세포를 실온에서 3분 동안 1,000rpm으로 원심분리하여 PBS를 사용하여 한 개의 디쉬 당 1×10⁵으로 세포를 얻었고 다시 실온에서 3분동안 1,000rpm으로 원심분리 후, 상층액을 제거한 다음, 디쉬의 수만큼 10㎕의 R buffer를 첨가하였다. 전기천공법 기기(Neon^TM Transfection System, MPK5000, CA)를 준비하여, Neon^TM Transfection System에 사용가능한 키트(Neon^TM Transfection System, MPK10096, CA)내에 동봉되어있는 E buffer를 네온 tube에 4㎖을 넣고 네온 Pipette system에 장착하였다. R buffer와 세포가 있는 튜브에 제조한 BMP2 또는 VEGF 유전자 발현 비바이러스성 미니써클 벡터 1㎍과 부드럽게 혼합한 다음, 혼합물을 Neon Pipette tip에 주입하였다. 1150v, 30ms, 2 pulse로 Electroporatin을 하여, BMP2 또는 VEGF 유전자가 재조합된 지방줄기세포를 제조하였다.

1-4. 세포 생존율 분석(WST assay)

실시예 1-3에서 제조한 재조합 지방줄기세포를 각 세포의 배양배지를 사용하여 10⁴cells/웰이 되도록 현탁시킨 후, 96-웰 플레이트에 100㎕씩 분주하고, 37℃ 및 5% CO₂의 조건에서 24시간 배양하였다. 그 후, EZ-Cytox(DoGEN, Cat. EZ-1000, Republic of Korea)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 WST 분석을 수행하였다. 즉, 수용성의 테트라졸륨염(tetrazolium salt)이 세포 내의 미토콘드리아 NADH-디하이드로지네이즈에 의해 환원되어 유색의 포르마잔(formazan)으로 전환되는 정도를 측정하였으며, 상기 키트에 포함된 시약을 배지 100㎕당 10㎕씩 넣어주고, 60분 후 VersaMax Microplate Reader(Molecular Devices, USA)로 450nm 파장에서의 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 분석하였다.

1-5. RT-qPCR에 의한 BMP2 및 VEGF 유전자의 발현 평가

Direct-zol™ RNA MiniPrep Plus(200 preps.)(ZYMO RESEARCH, Cat. R2072, USA)를 사용하여 실시예 1-3에서 제조한 재조합 지방줄기세포로부터 총 RNA를 분리하였고, 분리된 RNA로부터 Maxime RT PreMix(Oligo dT primer)(iNtRON, Cat. 25081, Republic of Korea)를　사용하여 SimpliAmp Thermal Cycler(Applied Biosystems, USA) 기기로 역전사 qPCR(RT-qPCR)에 의해 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA에 표 2의 프라이머를 사용하여 결과는 StepOnePlus Real-Time PCR System(Applied Biosystems, USA)기기로 분석하였다.

프라이머		프라이머 염기서열(5'→3')	서열번호
BMP2	forward	AACAATGGCATGATTAGTGG	서열번호 5
	reverse	TTGGAGGAGAAACAAGGTG	서열번호 6
VEGF	forward	TCTTCAAGCCATCCTGTGTG	서열번호 7
	reverse	GCGAGTCTGTGTTTTGCAG	서열번호 8

1-6. 알리자린 레드 염색에 따른 골 분화 평가

골 분화된 세포에 의한 석회화 침착의 존재를 Alizarin Red S(SIGMA-ALDRICH, Cat. A5533-25G, USA)로 염색하여 정량적으로 평가하였다. 금속 이온과 결합하는 성질이 있기 때문에 칼슘염 심착부를 염색하므로, 골 분화가 많이 진행될수록 붉은 색이 나타난다.

실시예 1-3에서 제조한, BMP2 유전자가 재조합된 지방줄기세포 및 VEGF 유전자가 재조합된 지방줄기세포를 각각 0:0, 100:0, 95:5, 90:10, 80:20, 75:25, 50:50, 25:75 및 0:100의 비율로 혼합하고, 6-웰 디쉬의 한 웰 기준으로 전체 세포의 수가 25만개가 되도록 플레이팅 하였다. 그 후, 2 내지 3일 간격으로 분화배양액을 교체하면서 14일간 골형성 배지(osteogenic medium: OM)에서 골 분화를 유도한 다음, Alizarin Red S(SIGMA-ALDRICH, Cat. A5533-25G, USA)로 염색하여 골 분화 정도를 평가하였다.

1-7. 웨스턴 블롯 분석에 따른 BMP2 및 VEGF 단백질의 발현 평가

실시예 1-6에서 골 분화된 세포를 PBS로 씻어낸 후, protease inhibitor cocktail(GenDEPOT, Barker, TX, USA)과 phosphatase inhibitor cocktail(GenDEPOT, Barker, TX, USA)을 함유한 RIPA 버퍼(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)에 용해하였다. 용해물을 샘플 버퍼[50mM Tris-HCl, pH6.8, 2% SDS(sodium dodecyl sulfate), 0.14M 2-mercaptoethanol, 10% glycerol, 및 0.001% bromophenol blue]에서 끓인 후, 전기영동으로 분리하였다. 샘플을 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)으로 분석하고, PVDF 멤브레인으로 옮긴 후, 5% 탈지분유 중 Tween-20을 함유하는 인산염 완충 식염수(phosphate-buffered saline)로 블로킹하였다. 그 후, BMP2 및 VEGF(Cell Signaling, Danvers, MA, USA)에 대한 일차 항체와 4℃에서 밤새 반응시킨 다음, 실온에서 2시간 동안 2차 항체와 반응시켰다(표 3). 항체-항원 복합체는 향상된 화학발광(chemiluminescent) 키트(Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하여 검출하였고, 신호 강도는 Fusion Solo 2 화상이미지 분석기(ChemiDoc^TM XRS+ Imaging System, BIO-RAD, USA)를 사용하여 측정하였다.

항체		이름	구입처	제품번호
BMP2	1차	Anti-BMP2 Anbody	Abcam	Ab14933
	2차	Anti-rabbit lgG HRP-linked Antibody	Cell Signaling	#7074
VEGF	1차	Anti-VEGF Receptor 1 Antibody[Y103]	Abcam	Ab32152
	2차	Anti-mouse lgG HRP-linked Antibody	Cell Signaling	#7076

1-8. ELISA에 따른 BMP2 및 VEGF 단백질의 발현 평가

R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)에서 BMP2 및 VEGF Duo-set ELISA 키트를 구입하여 사용하였다. 실시예 1-3에서 제조한 재조합 지방줄기세포를 4℃에서 10분 동안 2000 내지 3000rpm(1000×g)으로 원심분리 하여 상등액을 수득하였다. 수득한 샘플은 즉시 또는 -80℃에 보관하였다가 제조사의 지시에 따라 분석하였으며, VersaMax Microplate Reader(Molecular Devices, USA)를 사용하여 OD450을 측정하였다.

1-9. 관 형성 분석(Tube formation assay)에 따른 혈관신생 평가

FEBS letters 581.14 (2007): 2663-2669에 기술된 방법으로 Matrigel의 관 형성 분석을 수행하였다. 구체적으로, 냉장된 Matrigel(BD Bioscience) 50㎕를 96-웰 플레이트에 첨가하고 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 그 후, HUVEC(Human umbilical vein endothelial cell)이 1×10⁵cell/㎖로 현탁된 내피성장배지(endothelial growth medium: EGM)(LONZA Inc., Basel, Switzerland)에 배양하고, SPL Insert Hanging dish upper에 BMP2와 VEGF가 공배양되어 있는 배지를 넣고 HUVEC 세포와 함께 공배양하였다. 그 후, 16시간 동안 37℃ 및 5% CO₂ 조건으로 공배양한 다음, Calcein AM으로 형광염색된 튜브를 형광 현미경(Leica, Germany)을 통해 시각적으로 관찰하였다. 또한, Image J 소프트웨어(NIH, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 형광 이미지를 분석하여 관의 평균 분지점(branch point) 수를 확인하였다.

1-10. 두개골 결손 모델 및 분절 결손 모델을 이용한 골 재생 평가

11주령 수컷 Sprague Dawley(SD) 래트의 머리뼈에 직경 4mm의 구멍을 뚫어 두개골 결손 모델(Calvarial defect model)을 만들고, 11주령 수컷 SD 래트의 앞다리 뼈에 골 결손을 주어 분절 결손 모델(Segmental defect model)을 만들었다. 그 후, 실시예 1-3에서 제조하여 90:10의 비율로 공배양한, BMP2 유전자가 재조합된 지방줄기세포 및 VEGF 유전자가 재조합된 지방줄기세포 백만개를 피브린(fibrin) 및 트롬빈(thrombin)(Green Cross, Republic of Korea)과 함께 각 모델의 결손 부위에 도입하였다. 도입 후, 8주간 래트를 사육하고 육안적 관찰, X-ray 촬영 및 Micro CT 촬영하여 골재생 정도를 평가하였다.

1-11. In vivo 형광 이미징에 따른 지방줄기세포의 잔존성 평가

DiD는 생존 세포에서 미토콘드리아를 염색하는 형광 염료로써, Clevue 기기를 통하여 신호의 검출이 가능하다. 따라서, 실시예 1-10에서 제작한 두개골 결손 모델(Calvarial defects model)에 실시예 1-3에서 제조하여 90:10의 비율로 공배양한, BMP2 유전자가 재조합된 지방줄기세포 및 VEGF 유전자가 재조합된 지방줄기세포와, DiD(Abs:644/Em:665)(Invitrogen)를 결손 부위에 이식한 후, VISQUE®Elite(Vieworks, Republic of Korea)기기로 in vivo 형광 신호를 이미징하여 지방줄기세포의 잔존성을 평가하였다.

실시예 2. BMP2 또는 VEGF 유전자 발현 재조합 지방줄기세포의 높은 생존률 확인

실시예 1-3에서 제조한 BMP2 또는 VEGF 유전자를 발현하는 지방줄기세포의 생존율(cell viability)을 확인하기 위하여, 실시예 1-4에 따라 WST 분석을 수행하였다.

그 결과, BMP2 유전자를 발현하는 지방줄기세포(도 3A) 및 VEGF 유전자를 발현하는 지방줄기세포(도 3B) 모두, 실시예 1-2에서 제조한 BMP2 또는 VEGF 유전자 발현 비바이러스성 미니써클 벡터 1㎍과 형질전환할 경우, 세포 생존률이 가장 우수함을 확인하였다.

실시예 3. BMP2 또는 VEGF 유전자 발현 재조합 지방줄기세포의 높은 유전자 발현율 확인

실시예 1-3에서 제조한 BMP2 또는 VEGF 유전자를 발현하는 지방줄기세포의 BMP2 또는 VEGF 유전자의 발현율을 확인하기 위하여, 실시예 1-5에 따라 RT-qPCR 분석 및 실시예 1-8에 따라 ELISA 분석을 수행하였다.

그 결과, BMP2 유전자를 발현하는 지방줄기세포 및 VEGF 유전자를 발현하는 지방줄기세포 모두 BMP2 및 VEGF의 mRNA 발현(도 4A 및 4B) 및 단백질(도 4C 및 4D)의 발현이 증가하여, BMP2 및 VEGF 유전자가 지방줄기세포에 각각 정상적으로 도입 및 발현됨을 확인하였다.

실시예 4. 골 분화 유도를 위한 BMP2 유전자 발현 재조합 지방줄기세포 및 VEGF 유전자 발현 재조합 지방줄기세포의 최적 비율 확인

골 분화 유도 최적 비율을 확인하기 위하여, BMP2:VEGF 100:0, 75:25, 50:50, 25:75 및 0:100의 비율로 공배양된 BMP2 유전자 발현 재조합 지방줄기세포 및 VEGF 유전자 발현 재조합 지방줄기세포에 대해 실시예 1-6에 따라, 알리자린 레드 염색을 수행하여 각 비율에 대한 골 분화의 효율을 확인하였다.

그 결과, BMP2:VEGF가 75:25의 비율에서도 골 분화가 정상적으로 이루어지지 않음을 확인하였다. 따라서, 이후의 실험에서는 각 지방줄기세포의 최적비율을 BMP2:VEGF 100:0, 95:5, 90:10, 80:20 및 0:100에서 확인하였다.

골 분화 유도에 있어서, 신생혈관 생성을 위한 각 지방줄기세포의 최적 비율을 확인하기 위하여, BMP2:VEGF 100:0, 95:5, 90:10, 80:20 및 0:100의 비율로 공배양된 BMP2 유전자 발현 재조합 지방줄기세포 및 VEGF 유전자 발현 재조합 지방줄기세포에 대해 실시예 1-9에 따라, 관 형성 분석을 수행하여 각 비율에 대한 혈관신생 효율을 확인하였다.

그 결과, 95:5, 90:10, 80:20 및 0:100의 BMP2:VEGF 비율에서 관의 신생(도 6) 및 관의 평균 분지수(도 7)가 유의적으로 증가함을 확인하였다.

한편, 골 분화 유도를 위한 각 지방줄기세포의 최적 비율을 확인하기 위하여, BMP2:VEGF 100:0, 95:5, 90:10, 80:20 및 0:100의 비율로 공배양된 BMP2 유전자 발현 재조합 지방줄기세포 및 VEGF 유전자 발현 재조합 지방줄기세포에 대해 실시예 1-6에 따라, 알리자린 레드 염색을 수행하여 각 비율에 대한 골 분화의 효율을 확인하였다.

그 결과, 100:0, 95:5, 90:10 및 80:20의 BMP2:VEGF 비율에서 골 분화가 증가함을 확인하였다(도 8).

상기 결과를 통하여, 두 유전자의 최적의 비율이 골 분화 및 신생혈관 생성에 매우 중요한 요소며, 95:5, 90:10 및 80:20의 BMP2:VEGF 비율에서 골 분화와 신생혈관의 증가가 동시에 증가하므로, 골 재생이 효과적으로 이루어질 수 있음을 확인하였다.

실시예 5. BMP2 유전자 발현 재조합 지방줄기세포 및 VEGF 유전자 발현 재조합 지방줄기세포의 골형성 유도 및 골재생 효과 확인

실시예 4에서, 90:10의 BMP2:VEGF 비율이 골 재생에 특히 우수한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서, 이와 같은 비율로 공배양한 BMP2 유전자 발현 재조합 지방줄기세포 및 VEGF 유전자 발현 재조합 지방줄기세포의 골형성 유도 및 골재생 효과를 확인하기 위하여, 실시예 1-10을 수행하여, 두개골 결손 모델(calvarial defect model)(도 9A)에서 골형성 유도 및 골재생 효과를 확인하였다.

그 결과, 세포 이식 없이 수술만 진행한 실험군이나, BMP2 또는 VEGF 유전자가 도입되지 않은 지방줄기세포를 처리한 군 대비, BMP2:VEGF 90:10으로 공배양한 BMP2 유전자 발현 재조합 지방줄기세포 및 VEGF 유전자 발현 재조합 지방줄기세포를 처리한 군에서 현저한 골재생이 이루어지는 것으로 확인되었다(도 9).

또한, 실시예 1-10을 수행하여, 분절 결손 모델(segmental defect model)(도 10A)에서 골형성 유도 및 골재생 효과를 확인하였다.

그 결과, 세포 이식 없이 수술만 진행한 실험군이나, BMP2 또는 VEGF 유전자가 도입되지 않은 지방줄기세포를 처리한 군 대비, BMP2:VEGF 90:10으로 공배양한 BMP2 유전자 발현 재조합 지방줄기세포 및 VEGF 유전자 발현 재조합 지방줄기세포를 처리한 군에서 결손 부위가 뼈로 대부분 재생되었음을 확인하였다.

상기 결과를 통하여, 소동물(SD 래트)에서, BMP2:VEGF 90:10으로 공배양한 BMP2 유전자 발현 재조합 지방줄기세포 및 VEGF 유전자 발현 재조합 지방줄기세포의 골재생 유효성을 확인하였다.

실시예 6. 지방줄기세포의 우수한 잔존성 확인

BMP2 유전자 발현 재조합 지방줄기세포 및 VEGF 유전자 발현 재조합 지방줄기세포가 결손부위에서 손실되지 않고, 지속적으로 골재생을 유도할 수 있는지 확인하기 위하여, 실시예 1-11을 수행하여 지방줄기세포의 잔존성을 평가하였다.

그 결과, 골재생 유효성을 평가하기 위하여 8주 동안 이식한 세포가 잔존함을 이미징을 통해 확인하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Dongguk University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Composition for Bone Begeneration comprising Recombinant Adipose-Derived Stem Cell <130> PN180389 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP2_pMC_forward <400> 1 acgcggccgc ggatccatgg tggccgggac ccgctgtctt c 41 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP2_pMC_reverse <400> 2 tgattgtcga gctagcctag cgacacccac aacc 34 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF_pMC_forward <400> 3 acgcggccgc ggatccatga actttctgct gtcttg 36 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF_pMC_reverse <400> 4 tgattgtcga gctagctcac cgcctcggct tgtc 34 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP2_forward <400> 5 aacaatggca tgattagtgg 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP2_reverse <400> 6 ttggaggaga aacaaggtg 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF_forward <400> 7 tcttcaagcc atcctgtgtg 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF_reverse <400> 8 gcgagtctgt gttttgcag 19

Claims (8)

1. BMP2(bone morphiogenetic protein 2) 유전자가 형질전환된 지방줄기세포 및 VEGF(vasculoendothelial growth factor) 유전자가 형질전환된 지방줄기세포를 90:10의 개수비로 포함하는 골 재생용 조성물로서,
   상기 형질전환은 미니써클 벡터에 의한 것인 골 재생용 조성물.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 제 1 항의 골 재생용 조성물을 포함하는 골절 질환 치료용 약학적 조성물.
   
7. 제 6 항에 있어서, 상기 골절 질환은 대퇴골두 무혈성괴사인 것인 골절 질환 치료용 약학적 조성물.
   
8. 제 1 항의 골 재생용 조성물을 포함하는 세포치료제.

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