CN112458095A - 调控ADSCs成骨分化及组织再生LMO3基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明的调控ADSCs成骨分化及组织再生LMO3基因及其应用，具体为LMO3基因，其Gene ID为hsa‑55885，LMO3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。该基因具体应用于相应的控ADSCs成骨分化及组织再生产品、再生调控等方面。本发明通过LMO3调控ADSCs成骨分化和组织再生的体内外实验，证实了LMO3在脂肪干细胞成骨分化和/组织再生过程中均起了重要的调控作用；LMO3可作为组织再生治疗的潜在靶点，推动开发出新的关于LMO3相关药物或因子，并最终将其运用到再生医学领域，达到临床上真正的精准医疗。

Description

调控ADSCs成骨分化及组织再生LMO3基因及其应用
技术领域：
本发明属于骨组织再生技术领域，具体涉及调控ADSCs成骨分化及组织再生LMO3基因及其应用。
背景技术：
创伤修复与重建包括皮肤或软组织损伤所致创伤的修复、慢性难治性伤口的愈合、骨创伤的修复、血管生成、脊髓的修复等内容。传统的自体移植造成供者组织医源性缺损，严重影响患者的愈合和生活质量。同种异体移植的应用也受到免疫排斥和感染的限制。因此，迫切需要一种新的治疗策略，以限制继发性创伤、低免疫原性和理想的功能恢复。脂肪干细胞(adipose Derived Stem Cells，ADSCs)最近几年引起了广泛的关注。脂肪干细胞来源广泛、含量较多、获取方式简单、患者承受的痛苦也较少。在适当的环境下，脂肪干细胞可以分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞以及肌细胞等。ADSCs具有多向分化能力和较明确的成骨潜能，因此成为骨组织工程中重要的种子细胞。
本申请发明人课题组前期已在国际上率先提出利用脂肪干细胞进行骨组织再生的新理念，并进行了系列相关体内、外实验，如在裸鼠异位成骨及兔下颌骨缺损动物模型上成功再生骨组织；将自体异体脂肪干细胞附合生物支架用于组织再生，取得了良好的效果。
LIM-结构域蛋白3(LIM domain only protein 3，LMO3)是一个关键蛋白。LMO3是LMO家族成员之一，其基因位于12号染色体p12.3，含有5个外显子，全长440bp，由146个氨基酸组成。结构上，LMO3与LMO家族其他成员具有高度的相似性,包含两个串联排列的LIM结构域，该家族在基本生命活动如发育、分化调控中有极其重要的作用。
但是，LMO3在脂肪干细胞中的作用以及与脂肪干细胞成骨分化及组织再生相关作用研究，目前未见报道。
发明内容：
针对上述现有技术，发明人通过研究LMO3调控ADSCs成骨分化和组织再生的体内外实验，进行分子水平研究和体内组织再生研究，结果显示，LMO3在脂肪干细胞成骨分化和组织再生过程中起了重要的调控作用，通过反向论证，当LMO3下调，ADSCs成骨向分化和骨组织再生能力受到抑制，通过本发明阐明脂肪干细胞介导组织再生中LMO3的调控功能，为调控脂肪干细胞促进骨组织再生提供重要的依据。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
调控ADSCs成骨分化及组织再生基因，具体为LMO3基因，其Gene ID为hsa-55885。
所述的LMO3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
所述的LMO3基因在调控ADSCs成骨分化及组织再生产品中的应用。
所述的调控ADSCs成骨分化及组织再生产品通过检测LMO3基因及其表达来检测ADSCs成骨分化的程度。
所述的调控ADSCs成骨分化及组织再生产品至少包括一对特异性扩增LMO3基因的引物和标准品，所述的引物由上游和下游引物组成，上游引物具有如5'-C T T T G T G TT G T G T A G C C C T A A C G T C-3'的序列，下游引物具有如5'-ACTCAGCACTCTGTTGGAGTGGA-3'的核苷酸序列。
所述的LMO3基因在ADSCs成骨分化及组织再生调控中的应用，所述的调控包括正调控和负调控，正调控是指促进脂肪干细胞成骨分化和组织再生，负调控是指抑制脂肪干细胞成骨分化和组织再生，具体的，LMO3基因表达提高，促进脂肪干细胞成骨分化和组织再生；LMO3基因表达下降，ADSCs成骨向分化和骨组织再生能力受到抑制。
LMO3基因的促进剂在制备促进脂肪干细胞成骨分化和组织再生药物中的应用，其中，所述的LMO3促进剂包括任何可以提高LMO3的活性、增加LMO3表达量的物质，例如增加LMO3表达量的LMO3的过表达载体。
LMO3基因的抑制剂在制备抑制脂肪干细胞成骨分化和组织再生药物中的用途，其中，所述的LMO3抑制剂包括任何可以降低LMO3的活性、减少LMO3表达量的物质均可用于本发明，具体包括拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等。
所述的LMO3抑制剂为抑制LMO3表达的si RNA1或si RNA2，其中：
所述的LMO3的si RNA1靶点序列为：
正义链：GCUGCAACCGAAAGAUCAATT。
反义链：UUGAUCUUUCGGUUGCAGCTT。
所述的LMO3的si RNA2靶点序列为：
正义链：CCUUUGUCGCAGAGACUAUTT。
反义链：AUAGUCUCUGCGACAAAGGTT。
一种促进脂肪干细胞成骨分化和骨组织再生的方法，所述方法包括提高LMO3基因的活性和/或增加LMO3基因的表达。
所述的促进脂肪干细胞成骨分化和骨组织再生的方法，还包括将提高LMO3活性和/增加LMO3表达后的脂肪干细胞，与人工骨支架材料形成脂肪干细胞复合物制备成骨材料的步骤。
一种抑制脂肪干细胞成骨分化和骨组织再生的方法，所述方法包括降低LMO3基因的活性和/或抑制LMO3基因的表达。
所述的LMO3基因作为非疾病诊断和治疗用途的靶点在调控脂肪干细胞成骨分化和组织再生中的应用。
脂肪干细胞具有多种分化潜能，在体外通过适当的诱导能够形成骨、软骨、神经、脂肪、血管等多种组织，(即便在定向诱导过程中)脂肪干细胞在诱导时也会伴随多种分化细胞的产生(成骨细胞+脂肪细胞、成骨细胞+血管细胞等)，通过部分抑制成骨分化，可以有效的诱导干细胞向其他特定组织方向分化。
一种调控脂肪干细胞的成骨分化和组织再生的药物组合物，所述药物组合物含有有效量的上述LMO3促进剂或LMO3抑制剂。
所述的调控脂肪干细胞的成骨分化和组织再生的药物组合物中还包含：药学上可接受的载体，所述的药学上可接受的载体为常规的给药载体，包括各种赋形剂或稀释剂等。
本发明的有益效果：
本发明通过LMO3调控ADSCs成骨分化和组织再生的体内外实验，证实了LMO3在脂肪干细胞成骨分化和/组织再生过程中均起了重要的调控作用；LMO3可作为组织再生治疗的潜在靶点，推动开发出新的关于LMO3相关药物或因子，并最终将其运用到再生医学领域，达到临床上真正的精准医疗。
附图说明：
图1为实施例1的第三代hADSCs的形态和特征。
图2为实施例2的hADSC成骨分化过程mRNA测序结果的样本相关性分布图；
图3为实施例2的PCA结果图；
图4为实施例2的差异表达基因聚类图；
图5为实施例2的火山图和散点图，图5(a)为火山图，图5(b)为散点图；
图6为实施例3的RT-q PCR检测脂肪干细胞成骨向诱导后0天、7天、14天LMO3的表达变化情况图；
图7为实施例3的RT-PCR检测nc对照组和实验组的LMO3的表达情况图；
图8为实施例3的Western blot检测分别经siRNA-NC组、siRNA1-LMO3组和siRNA2-LMO3组转染的hADSCs成骨向诱导后成骨分化相关蛋白相对表达的检测；
图9为实施例3的分别经siRNA-NC组、siRNA1-LMO3组和siRNA2-LMO3组转染的hADSCs成骨向诱导后的碱性磷酸酶染色及茜素红染色检测成骨分化钙结节的数量和程度图，其中，上为碱性磷酸酶染色，下为茜素红染色。
具体实施方式：
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
调控ADSCs成骨分化及组织再生LMO3，其基因位于12号染色体p12.3，含有5个外显子，全长440bp，由146个氨基酸组成。
所述的LMO3在ADSCs成骨分化及组织再生调控中的应用，所述的调控包括正调控和负调控，正调控是指促进脂肪干细胞成骨分化和组织再生，负调控是指抑制脂肪干细胞成骨分化和组织再生。
所述的LMO3在ADSCs成骨分化及组织再生调控中的应用，LMO3表达提高，促进脂肪干细胞成骨分化和组织再生；LMO3表达下降，ADSCs成骨向分化和骨组织再生能力受到抑制。
LMO3促进剂在制备促进脂肪干细胞成骨分化和组织再生药物中的用途。
所述的LMO3促进剂包括任何可以提高LMO3的活性、增加LMO3表达量的物质，例如增加LMO3表达量的LMO3的过表达载体。
LMO3抑制剂在制备抑制脂肪干细胞成骨分化和组织再生药物中的用途。
所述的LMO3抑制剂包括任何可以降低LMO3的活性、减少LMO3表达量的物质均可用于本发明，具体包括拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等。
所述的LMO3抑制剂为抑制LMO3表达的小干扰RNA序列。
所述的LMO3的si RNA1靶点序列为：
正义链：5'-gcugcaaccgaaagaucaatt-3'
反义链：5'-uugaucuuucgguugcagctt-3'
所述的LMO3的si RNA2靶点序列为：
正义链：5'-ccuuugucgcagagacuautt-3'
反义链：5'-auagucucugcgacaaaggtt-3'
一种促进脂肪干细胞成骨分化和骨组织再生的方法，所述方法包括提高LMO3的活性和/或增加LMO3的表达。
所述的促进脂肪干细胞成骨分化和骨组织再生的方法，还包括将提高LMO3活性和/增加LMO3表达后的脂肪干细胞。
一种抑制脂肪干细胞成骨分化和骨组织再生的方法，所述方法包括抑制LMO3的表达。
所述的LMO3作为非疾病诊断和治疗用途的靶点在调控脂肪干细胞成骨分化和组织再生中的应用。
脂肪干细胞具有多种分化潜能，在体外通过适当的诱导能够形成骨、软骨、神经、脂肪、血管等多种组织，(即便在定向诱导过程中)脂肪干细胞在诱导时也会伴随多种分化细胞的产生(成骨细胞+脂肪细胞、成骨细胞+血管细胞等)，通过部分抑制成骨分化，可以有效的诱导干细胞向其他特定组织方向分化。
一种调控脂肪干细胞的成骨分化和组织再生的药物组合物，所述药物组合物含有有效量的上述LMO3促进剂或LMO3抑制剂。
所述的调控脂肪干细胞的成骨分化和组织再生的药物组合物中还包含：药学上可接受的载体。
所述的调控脂肪干细胞的成骨分化和组织再生的药物组合物中“药学上可接受的载体”为常规的给药载体，包括各种赋形剂或稀释剂等。
本申请的LMO3是LMO家族成员之一，其基因位于12号染色体p12.3，含有5个外显子，全长440bp，由146个氨基酸组成。结构上，LMO3与LMO家族其他成员具有高度的相似性，包含两个串联排列的LIM结构域，该家族在基本生命活动如发育、分化调控中有极其重要的作用。
实施例1人脂肪干细胞的分离和培养
吸脂手术中取腹部脂肪组织储存于20mL无菌注射器中备用，并冰袋保存。脂肪组织以1000rpm/5min在50mL离心管中离心，去除下层液体。脂肪组织以1：1的比例与0.2％的I型胶原酶在37℃环境下摇床消化40分钟，静置后可见其分成三层。移出上层油脂层，进行充分震荡和过滤(200目滤网)。随后1000rmp/5min三次进行离心移出上层液体，可见其中的细胞沉淀。用细胞培养液将细胞吹打均匀。随后将细胞接种于培养皿中，密度为5×105/mL。随后将细胞放入37℃、5％CO2、95％湿度的培养箱中。传代培养至第三代，获得第三代脂肪干细胞hADSCs，第三代hADSCs的形态和特征图如图1所示。(第三代细胞完成后续实验)
实施例2GEO数据库与mRNA测序结果联合分析
GSE63754，GSE89330和GSE72429的系列矩阵文件是从GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载的。他们基于的平台分别是GPL17077(Agilent-039494SurePrint G3人类GE v2 8x60K微阵列039381)，GPL16956(Agilent-045997Arraystar人类lncRNA微阵列V3)和GPL16770(Agilent-031181Unrestricted_Human_miRNA_V16.0_Microarray)。
GSE63754数据集包括3个ADSC成骨分化数据集和3个对照细胞分化数据集。GSE89330数据集包括4个ADSC成骨分化的数据集和4个未分化ADSC的数据集。GSE72429数据集包括4个分化为成骨细胞系的ADSC数据集和4个来自相同供体的未分化细胞的数据集。hADSC成骨分化过程中进行mRNA测序。通过对两两样本进行相关性计算，得到两两之间的相关性系数，从而绘制样本相关性分布图，如图2所示。图2中编号1、2、3、4、5和6分别代表了样本A Non-induced、A Induced、B Non-induced、B Induced、C Non-induced、C Induced。矩阵中颜色的深浅代表样本之间相关性高低的程度，颜色越深，代表两个样本间的相关性越高。
PCA结果如图3所示，展示了样本间表达谱数据的分类情况，每个坐标轴代表一种主成分。
差异表达基因聚类图如图4所示，每行代表一个基因，每列代表一个样本；图中四块区域，左上块与右下块深色区域代表上调显著差异表达基因，左下块与右上块浅色区域代表下调显著差异表达基因。
火山图如图5(a)所示，散点图如图5(b)所示，该两图以显示未诱导组和诱导组样本间表达和差异表达的分布，用于评估两组数据的总体分布趋势。
实施例3LMO3在ADSCs成骨过程中的细胞功能学验证
1、将脂肪干细胞分别成骨向诱导0d、7d、14天，提取RNA，通过RT-q PCR检测LMO3不同时间的表达变化趋势。RT-q PCR检测脂肪干细胞成骨向诱导后0天、7天、14天LMO3的表达变化情况如图6所示，LMO3的表达在成骨分化过程中随着时间上升。
2、小干扰RNA序列的设计及转染
LMO3序列设计引物，引物由上海吉玛生物科技有限公司合成并纯化，设计小干扰RNA序列抑制LMO3的表达。
根据人LMO3序列起止点为其拼接点，于拼接点附近设计基于si RNA的热稳定性，末尾的碱基选择，GC含量设计出该circ RNA的si RNA最佳靶点，挑选最佳的2条si RNA1靶点序列为：
LMO3的si RNA1靶点序列为：
正义链：5'-gcugcaaccgaaagaucaatt-3'
反义链：5'-uugaucuuucgguugcagctt-3'
LMO3的si RNA2靶点序列为：
正义链：5'-ccuuugucgcagagacuautt-3'
反义链：5'-auagucucugcgacaaaggtt-3'
阴性对照NC(Negative Control)序列如下：
正义链：5'-uucuccgaacgugucacguuu-3'
反义链：5'-acgugacacguucggagaauu-3'
将细胞进行分组：siRNA-NC组、siRNA1-LMO3组和siRNA2-LMO3组，利用脂质体转染法将siRNA及阴性对照(Negative control，NC)分别转入hADSCs。本实验设置实验组与阴性对照组。实验组为转染siRNA1和siRNA2的细胞；阴性对照组为NC对照的细胞。12h后换回正常培养基，提取总RNA，完成后续RT-q PCR的相关验证。
转染及沉默效率的检测结果显示，siRNA转染hADSC细胞可明显抑制LMO3的表达，小干扰RNA转染nc对照组和LMO3实验组的沉默效率如图7所示；
3、沉默LMO3检测成骨相关蛋白及成骨相关染色
用无血清培养基清洗细胞，将siRNA-NC组、siRNA1-LMO3组和siRNA2-LMO3组，按照转染步骤说明书加入到细胞中。12h后换用正常的培养基，孵育72h，待转染稳定后给予成骨向诱导培养基培养。完成后续的Circ RNA-FTO对脂肪干细胞成骨分化的功能研究。
Western blot检测分别经siRNA-NC组、siRNA1-LMO3组和siRNA2-LMO3组转染的ADSCs成骨向诱导后成骨分化相关蛋白相对表达的检测实验结果如图8所示，siRNA1-LMO3组和siRNA2-LMO3组成骨能力相关因子(ALP、Runx2、OCN)的表达均较siRNA-NC组的表达降低，证明LMO3具备成骨向细胞分化的能力，分别经siRNA1-LMO3组和siRNA2-LMO3组转染的ADSCs成骨向诱导后的碱性磷酸酶染色及茜素红染色检测成骨分化钙结节的数量和程度图如图9所示，其中，上为碱性磷酸酶染色，下为茜素红染色；结果表明，ALP染色和茜素红染色显示hADSCs成骨向诱导后siRNA-NC组与siRNA-LMO3组有明显差异。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 辽宁省肿瘤医院
<120> 调控ADSCs成骨分化及组织再生LMO3基因及其应用
<141> 2020-11-29
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 498
<212> DNA
<213> LMO3基因的核苷酸序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgctctcag tccagccaga caccaagccg aaaggttgtg ctggctgcaa ccgaaagatc 60
aaggaccggt atcttctaaa ggcactggac aaatactggc atgaagactg cctgaagtgt 120
aaggaccggt atcttctaaa ggcactggac aaatactggc atgaagactg cctgaagtgt 180
gcctgctgtg actgtcgctt gggagaggtg ggctccaccc tgtacactaa agctaatctt 240
atcctttgtc gcagagacta tctgaggctc tttggtgtaa cgggaaactg cgctgcctgt 300
agtaagctca tccctgcctt tgagatggtg atgcgtgcca aggacaatgt ttaccacctg 360
gactgctttg catgtcagct ttgtaatcag agattttgtg ttggagacaa atttttccta 420
aagaataaca tgatcctttg ccagacggac tacgaggaag gtttaatgaa agaaggttat 480
gcaccccagg ttcgctga 498
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> LMO3的si RNA1靶点序列正义链(Artificial Sequence)
<400> 2
gcugcaaccg aaagaucaat t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> LMO3的si RNA1靶点序列反义链(Artificial Sequence)
<400> 3
uugaucuuuc gguugcagct t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> LMO3的si RNA2靶点序列正义链(Artificial Sequence)
<400> 4
ccuuugucgc agagacuaut t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> LMO3的si RNA2靶点序列反义链(Artificial Sequence)
<400> 5
auagucucug cgacaaaggt t 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 阴性对照NC序列正义链(Artificial Sequence)
<400> 6
uucuccgaac gugucacguu u 21
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 阴性对照NC序列反义链(Artificial Sequence)
<400> 7
acgugacacg uucggagaau u 21

Claims (10)

1.调控ADSCs成骨分化及组织再生LMO3基因，其特征在于，其Gene ID为hsa-55885。
2.根据权利要求1所述的调控ADSCs成骨分化及组织再生LMO3基因，其特征在于，所述的LMO3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3.权利要求1所述的调控ADSCs成骨分化及组织再生LMO3基因在调控ADSCs成骨分化及组织再生产品中的应用，其特征在于，所述的调控ADSCs成骨分化及组织再生产品至少包括一对特异性扩增LMO3基因的引物和标准品，所述的引物由上游和下游引物组成，上游引物具有如5'-C T T T G T G T T G T G T A G C C C T A A C G T C-3'的序列，下游引物具有如5'-ACTCAGCAC TCTGTTGGAGTGGA-3'的核苷酸序列。
4.权利要求1所述的调控ADSCs成骨分化及组织再生LMO3基因在ADSCs成骨分化及组织再生调控中的应用，其特征在于，所述的调控包括正调控和负调控，正调控是指促进脂肪干细胞成骨分化和组织再生，负调控是指抑制脂肪干细胞成骨分化和组织再生，具体的，LMO3基因表达提高，促进脂肪干细胞成骨分化和组织再生；LMO3基因表达下降，ADSCs成骨向分化和骨组织再生能力受到抑制。
5.权利要求1所述的调控ADSCs成骨分化及组织再生LMO3基因的促进剂在制备促进脂肪干细胞成骨分化和组织再生药物中的应用，其特征在于，所述的LMO3促进剂包括任何可以提高LMO3的活性、增加LMO3表达量的物质。
6.权利要求1所述的调控ADSCs成骨分化及组织再生LMO3基因的抑制剂在制备抑制脂肪干细胞成骨分化和组织再生药物中的应用，其特征在于，所述的LMO3抑制剂为抑制LMO3表达的si RNA1或si RNA2，其中：
所述的LMO3的si RNA1靶点序列为：
正义链：GCUGCAACCGAAAGAUCAATT；
反义链：UUGAUCUUUCGGUUGCAGCTT；
所述的LMO3的si RNA2靶点序列为：
正义链：CCUUUGUCGCAGAGACUAUTT；
反义链：AUAGUCUCUGCGACAAAGGTT。
7.一种促进脂肪干细胞成骨分化和骨组织再生的方法，其特征在于，所述方法包括提高权利要求1所述的调控ADSCs成骨分化及组织再生LMO3基因的活性和/或增加LMO3基因的表达，还包括将提高LMO3活性和/增加LMO3表达后的脂肪干细胞，与人工骨支架材料形成脂肪干细胞复合物制备成骨材料的步骤。
8.一种抑制脂肪干细胞成骨分化和骨组织再生的方法，其特征在于，所述方法包括降低权利要求1所述的调控ADSCs成骨分化及组织再生LMO3基因的活性和/或抑制LMO3基因的表达。
9.权利要求1所述的调控ADSCs成骨分化及组织再生LMO3基因作为非疾病诊断和治疗用途的靶点在调控脂肪干细胞成骨分化和组织再生中的应用。
10.一种调控脂肪干细胞的成骨分化和组织再生的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有有效量的权利要求5所述的LMO3促进剂或权利要求6所述的LMO3抑制剂，所述的调控脂肪干细胞的成骨分化和组织再生的药物组合物中还包含：药学上可接受的载体，所述的药学上可接受的载体为常规的给药载体。
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KR20200065212A (ko) * 2018-11-29 2020-06-09 동국대학교 산학협력단 재조합 지방줄기세포를 포함하는 골 재생용 조성물
CN111500578A (zh) * 2020-04-22 2020-08-07 辽宁省肿瘤医院 调控ADSCs成骨分化及组织再生Circ RNA-FTO及其应用

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