CN110022888A - 包含间充质干细胞或培养上清液的滑膜素表达抑制剂 - Google Patents

包含间充质干细胞或培养上清液的滑膜素表达抑制剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于抑制滑膜素基因或滑膜素蛋白质的表达的滑膜素表达抑制剂。滑膜素表达抑制剂包含间充质干细胞或间充质干细胞的培养上清液作为有效成分，抑制滑膜素基因的表达或滑膜素蛋白质的表达。滑膜素表达抑制剂的制造方法包括：使用无血清培养基培养间充质干细胞，从而得到间充质干细胞或间充质干细胞的培养上清液的工序；以及使用在所述工序中所得到的间充质干细胞或间充质干细胞的培养上清液来制备对滑膜素基因的表达或滑膜素蛋白质的表达进行抑制的滑膜素表达抑制剂的工序。

Description

包含间充质干细胞或培养上清液的滑膜素表达抑制剂
技术领域
本发明涉及一种包含间充质干细胞或培养上清液的滑膜素表达抑制剂。
背景技术
国际公开2002-52007号单行本(下述专利文献1)记载了一种滑膜素(Synoviolin；SYVN1：滑膜细胞凋亡抑制物1)和对滑膜素进行编码的遗传基因。
滑膜素是被鉴定为在源自风湿病患者的滑膜细胞中呈过度表达的因子的蛋白质(非专利文献1)。滑膜素具有作为泛素化的E3连接酶发挥的功能。针对滑膜素的E3连接酶活性的抑制剂已经被发现，通过使用该抑制剂来抑制风湿病的症状(非专利文献2)。
除了风湿病以外，还可知在肺、肝脏等中滑膜素促使胶原蛋白过量分泌而结果会引起纤维化(非专利文献3、4)。另外，还启示了由于滑膜素与抗癌基因P53的分解相关，由此，滑膜素可能会引起致癌(非专利文献5)。
在滑膜素的异基因剔除小鼠中，基本上不会引发风湿病(非专利文献1)，在风湿病患者中可发现外周血中的滑膜素表达量的上升(非专利文献6)，由此，可认为对于缓解风湿病的病情而言重要的是不仅抑制滑膜素的活性，而且控制滑膜素的量本身。到现在为止，已知一种通过化合物来控制滑膜素的活性的方法，但是，控制滑膜素的表达量的方法并不为人所知。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1：国际公开2002-52007号单行本
【非专利文献】
非专利文献1：Amano,T.,et al.(2003).Genes&Development,17(19)，2436－49.
非专利文献2：Yagishita，N.,et al.(2012).International Journal of MolecularMedicine，30(6)，1281－6.
非专利文献3：Nakajima，F.,et al.(2015).International Journal of MolecularMedicine，35(1)，110－6.
非专利文献4：Hasegawa，D.,et al.(2010).PloS One，5(10)，e13590.
非专利文献5：Yamasaki，S.,et al.(2007).The EMBO Journal，26(1)，113－22.
非专利文献6：Toh，M.－L.,et al.(2006).Arthritis and Rheumatism，54(7)，2109－18.
非专利文献7：Le Blanc，K.,&Mougiakakos，D.(2012).Nature Reviews Immunology，12(5)，383－396.
发明内容
【发明所要解决的技术问题】
因此，本发明的目的在于，提供一种用于抑制滑膜素基因或滑膜素蛋白质的表达的滑膜素表达抑制剂。
【用于解决问题的方案】
本发明是基于间充质干细胞或培养上清液有效地抑制滑膜素基因或滑膜素蛋白质的表达这一由实施例得到的见解的发明。
本发明的第一方面涉及一种滑膜素表达抑制剂。滑膜素表达抑制剂是用于抑制滑膜素基因或滑膜素蛋白质的表达的药品。本发明的滑膜素表达抑制剂含有有效量的作为有效成分的间充质干细胞或间充质干细胞的培养上清液。
【发明效果】
根据本发明，能够提供一种用于抑制滑膜素基因或滑膜素蛋白质的表达的滑膜素表达抑制剂。
附图说明
图1是表示细胞数的测定结果的替代图的图表。
图2是表示滑膜素基因的表达量的替代图的图表。
图3是以胶原蛋白致敏前的后肢的厚度为0而标绘各测定时的厚度而成的替代图的曲线图。
图4是表示各种细胞系的滑膜素基因的表达量的替代图的图表。
具体实施方式
下面，使用附图对用于实施本发明的方式进行说明。本发明并不限于下面所要说明的方式，还包括在本领域技术人员显而易见的范围内由下面的方式进行适宜地修改而得到的方式。
本发明是基于间充质干细胞或培养上清液有效地抑制滑膜素基因或滑膜素蛋白质的表达这一由实施例得到的见解的发明。
本发明的第一方面涉及一种滑膜素表达抑制剂。滑膜素表达抑制剂是用于抑制滑膜素基因或滑膜素蛋白质的表达的药品。本发明的滑膜素表达抑制剂含有有效量的作为有效成分的间充质干细胞或间充质干细胞的培养上清液。培养上清液意思是指用培养基培养间充质干细胞时所得到的培养上清液，其优选为包含间充质干细胞的培养上清液。
间充质干细胞是生物体内的脂肪、骨髓、脐带、羊膜、胎盘和齿髓等中存在的具有多分化能的成体干细胞(Somatic stem cells)(非专利文献7)。间充质干细胞能够分化为各种中胚层细胞，例如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞。间充质干细胞由于其多分化能而被期待应用于骨、关节、肌肉、肝脏、肾脏、心脏、中枢神经系统和胰腺等的再生医疗。除了填补、替代受损组织以外，间充质干细胞通过产生各种细胞因子或细胞外基质而在生物体内进行各种有用的活动。其中，对间充质干细胞所具有的免疫抑制能力的研究也在发展，在加拿大和新西兰，从骨髓中分离的同种间充质干细胞被承认是对移植物抗宿主病(GvHD)的治疗药物。
间充质干细胞例如可以通过使用无血清培养基的无血清培养方法来进行培养。例如，日本特开2012-157263号公报中公开了一种间充质干细胞的无血清培养方法。
如上面说明所示，通过抑制滑膜素蛋白质的表达或功能而有助于治疗风湿病。因此，本发明的滑膜素表达抑制剂能够有效地用作风湿病的治疗剂或预防剂。并且，本发明由于能够抑制滑膜素的表达，因此，还能够提供可抑制滑膜素的表达的功能性食品等。这种食品例如为抗肥胖食物。该食品例如可以为补充剂或食品添加剂。
日本发明专利公开公报特开2009-155204号中公开了如下一种技术，即，通过抑制对滑膜素进行编码的基因的表达，能够调节IL-4的产生和IgE的产生，以及有效地预防和治疗过敏性疾病、传染病、自身免疫性疾病或白血病。另外，在该文献中，作为对滑膜素进行编码的基因的例子，公开了一种包含该文献中的序列号1(SEQ ID NO：1)所示的碱基序列的基因。因此，本发明的滑膜素表达抑制剂也能够用作IL-4的产生或IgE的产生的产生抑制剂、或者过敏性疾病、传染病、自身免疫性疾病或白血病的预防剂或治疗剂。
WO2006/137514号单行本中公开了一种以抑制滑膜素的表达或功能的物质为有效成分的癌症治疗剂。因此，本发明的滑膜素表达抑制剂能够有效地用作癌症的治疗剂。
在本发明中所使用的培养基可以使用将DMEM、MCDB201、α-MEM、F12中的任一种或者这些的混合品作为基本培养基，并混合1～20％的牛或人体等的血清而得到的培养基。或者，也可以使用公知的无血清培养基。本发明的培养基可以适宜地含有公知的培养基中的成分。另外，例如，日本发明专利授权公报第4385076号(专利文献1)和日本发明专利公开公报特开2012-157263号(专利文献2)中公开了一种用于无血清培养动物细胞的培养基。如此，可以将公知的文献所记载的要素适宜地添加到本发明的培养基中。
培养基的调整方法为公知的方法，例如，除了上面所说明的专利文献以外，适宜地使用公知的培养学的书籍所记载的方法为好。
培养基的具体例子为将DMEM、MCDB201、α-MEM、F12中的任一种或者将这些混合，作为基本培养基的无血清培养基。
细胞的培养方法适宜地采用公知的方法为好。下面，根据得到间充质干细胞的例子来说明细胞的培养方法。首先，通过以外科方式从被试验者切除或抽吸来得到皮下脂肪组织。从如此而得到的皮下脂肪组织来提取间质细胞组分(SVF)。对间质细胞组分使用组织分散酶溶液而得到间充质干细胞。参考下面所说明的实施例来适宜地调整间质细胞组分(SVF)和组织分散酶溶液的量为好。反应温度在25℃～40℃，反应时间在15分钟～5小时之间进行适宜地调整为好。在可目视确认到组织发生分散这一情况之后，例如，通过离心分离来回收沉淀。将回收的沉淀悬浮于生理盐水等，进行过滤，并对滤液再次进行离心分离而作为二次沉淀，从而得到间充质干细胞。
使用上述那样得到的沉淀来进行培养。可以使用与原代培养及此后代的培养相同的培养基，也可以使用不同的培养基。例如，使用上述本发明的培养基，并使用烧瓶或培养皿这样的容器来进行贴壁培养。例如，在达到90～95％的汇合(Confluent)的时间点反复进行传代(Passage，传代培养)，根据需要，即使在传代的中途，也可用流式细胞仪或细胞免疫染色法来确认CD73、CD90、CD105等干细胞标记和C10的表达。在回收培养上清液之后，使用剥离剂剥离细胞，通过离心分离回收细胞的沉淀，然后，将沉淀悬浮于培养基，并接种到烧瓶中，由此来进行传代。在该过程中，能够得到培养上清液。从原代培养开始起大约三周以内，能够得到包含1×108个数量级(order)的源自脂肪组织的间充质干细胞的细胞集团(cell assemhly)。然后，可以适宜针对细胞制剂的内毒素浓度、无菌试验、特异性病毒感染阴性试验、支原体阴性试验、生存率等所需的质量管理标准项目进行试验。
本发明的制剂通过本领域技术人员公知的方法来制造为好。本发明的制剂能够制造为口服制剂和肠外制剂，但是优选为肠外制剂。这种肠外制剂可以为液体制剂(水性液体制剂、非水性液体制剂、悬浮性液体制剂、乳化性液体制剂等)，也可以为固体制剂(粉末填充制剂、冷冻干燥制剂等)。另外，本发明也可以为缓释制剂。
制造液体制剂的方法能够用公知的方法来制造。例如，能够通过将间充质干细胞混合到药学上可接受的溶剂中，并填充到已灭菌的液体制剂用容器中，来制造液体制剂。药学上可接受的溶剂例如为注射用水、蒸馏水、生理盐水、电解质溶液制剂，优选使用已灭菌的溶剂。已灭菌的液体制剂用容器例如为安瓿瓶(Ampoule)、小试剂瓶(Vial)和试剂袋。这些容器能够使用玻璃制或塑料制等的公知的容器。具体而言，塑料制容器例如为使用聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、乙烯乙酸乙烯酯共聚物等材质的容器。这些容器或溶剂的灭菌法例如为加热法(火焰法、干燥法、高温蒸汽法、循环蒸汽法、沸腾法等)、过滤法、照射法(辐射法、紫外线法、高频法等)、气体法和药液法。只要是本领域技术人员，就能够根据容器的材质、溶剂的性质适宜地选择使用这种灭菌法。
作为制造固体制剂的方法，例如能够使用冷冻干燥法、喷雾干燥(Spray dry)法和无菌重结晶法。
另外，本发明也可以提供为将包含本发明的间充质干细胞或培养上清液的制剂和医疗用具组合而成的试剂盒制品。例如列举出了如下制品等：预先将包含本发明的间充质干细胞的制剂填充到注射筒等医疗用具中而得到的制品；在一个软袋中隔着分隔壁于一方填充固体制剂，而于另一方填充溶剂，在使用时开通分隔壁，以可进行混合的方式得到的制品。如此一来，不仅能够减轻在使用时医疗从业人员制备的负担，还能够防止细菌污染、异物混入等，从而能够适合使用。由于这种注射筒或软袋为公知的注射筒或软袋，因此，只要是医疗从业人员，就能够适宜地使用。
包含本发明的间充质干细胞或培养上清液的制剂能够使用静脉内给药、动脉内给药、肌内给药、皮下给药、腹膜内给药、鼻内给药等公知的给药方法来进行给药。给药方式的优选例为由注射实现的给药，也可以通过点滴来注入本发明的制剂。另外，本发明的制剂可以直接注射到患部或对象部位，另外也可以通过外科手术在患部开口来将本发明的制剂进行给药。
本发明的制剂中的作为有效成分的间充质干细胞或培养上清液可以与药学上可接受的载体或介质一起进行制备。药学上可接受的载体或介质例如列举出如下药学上可接受的物质：赋形剂、稳定剂、增溶剂、乳化剂、悬浮剂、缓冲剂、等渗剂、抗氧化剂或防腐剂等。另外，也可以使用聚乙二醇(PEG)等高分子材料、环糊精等包合物。赋形剂例如为淀粉、乳糖等其自身不具有药理作用的物质。稳定剂例如为白蛋白、明胶、山梨糖醇、甘露醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖和葡萄糖。其中，优选为蔗糖或海藻糖。增溶剂例如为乙醇、甘油、丙二醇和聚乙二醇。乳化剂例如为卵磷脂、硬脂酸铝或失水山梨醇倍半油酸酯。悬浮剂例如为聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或羧甲基纤维素(CMC)。等渗剂例如为氯化钠和葡萄糖。缓冲剂例如为柠檬酸盐、醋酸盐、硼酸和磷酸盐。抗氧化剂例如为抗坏血酸、亚硫酸氢钠和偏亚硫酸氢钠。防腐剂例如为苯酚、硫柳汞和苯扎氯铵。
作为本发明的制剂的主要成分的间充质干细胞在本发明的制剂中含有有效量为好。给药量根据给药的对象、年龄、症状等而发生变化。一般而言，一天的给药量例如为以间充质干细胞的数量计，个体的每1kg为1×104～5×107的细胞，也可以为1×105～5×106的细胞。优选将本发明的制剂的一天的给药量分为2～5次来进行给药。另外，也可以将本发明的制剂作为缓释制剂，而减少每一天的给药次数。为了制成这种缓释制剂，使用公知的方法为好。通过或是分开给药或是制成缓释制剂，而易于使生物体内的药剂浓度保持恒定，因此，易于获得持续的药效，并且进一步能够减轻副作用，因此，能够减少对患者的负担。
本发明还提供用于制造各种疾病的预防剂或治疗剂的上述本发明的间充质干细胞的用途。即，能够如上面说明所示那样得到间充质干细胞，并使用所得到的间充质干细胞来制造上述各种疾病的预防剂或治疗剂。
本发明还提供各种疾病的治疗方法和预防方法。各种疾病的治疗方法包括如下工序，即，将上述那样制造的包含本发明的间充质干细胞作为有效成分的制剂对患各种疾病的患者给药有效量。各种疾病的预防方法包括如下工序，即，将上述那样制造的包含本发明的间充质干细胞作为有效成分的制剂对存在患各种疾病的风险的患者给药有效量。
本发明的培养上清液可以包含间充质干细胞。在培养上清液包含间充质干细胞的情况下，间充质干细胞的含量例如为包含上面说明的间充质干细胞的治疗剂的1/100以上1/1以下。培养上清液例如为通过离心分离将培养上清液固液分离而得到的处理物、通过冷冻干燥从培养上清液除去水分而得到的处理物、使用蒸发器等对培养上清液进行减压浓缩而得到的处理物、使用超滤膜等对培养上清液进行浓缩而得到的处理物、或使用过滤器将培养上清液固液分离而得到的处理物。另外，例如可以在将培养上清液离心分离(例如，3000rpm，10分钟)之后，用针头式过滤器(Syringe filter)(例如，0.45微米)对培养上清液进行过滤，并用硫酸铵(例如，65％饱和硫酸铵)对过滤液进行分级，用生理盐水对沉淀物进行渗析，从而得到培养上清液。所采集的培养上清液可以直接使用，另外也可以预先冷冻保存，在使用时解冻使用。另外，除了药学上可接受的载体外，还可以以成为易处理的液体量的方式例如0.2ml或0.5ml等进行稀释。
该方面的优选使用方式为含有有效量以培养上清液为有效成分的制剂。更详细的该方面的优选使用方式涉及一种含有有效量的以培养上清液为有效成分的制剂，其为下面的疾病的治疗剂或预防剂。包含培养上清液作为有效成分的制剂例如如日本专利第5139294号和日本专利第5526320号公报中所公开的那样的公知制剂。因此，包含本发明的培养上清液的制剂能够使用公知的方法来制造。
本发明还提供用于制造各种疾病的预防剂或治疗剂的上述本发明的培养上清液的用途。即，得到间充质干细胞培养上清液，并使用所得到的间充质干细胞培养上清液，能够制造上述各种疾病的预防剂或治疗剂。
本发明还提供各种疾病的治疗方法和预防方法。各种疾病的治疗方法包括如下工序，即，将上述那样制造的包含本发明的培养上清液作为有效成分的制剂对患各种疾病的患者给药有效量。各种疾病的预防方法包括如下工序，即，将上述那样制造的包含本发明的培养上清液作为有效成分的制剂对存在患各种疾病的风险的患者给药有效量。
实施例一
对于间充质干细胞上清液对滑膜细胞的增殖带来的影响的研究
首先，利用BioMimetics Sympathies公司制的间充质干细胞用无血清培养基(sf-DOT培养基)对源自脂肪的间充质干细胞培养三天，从而得到了培养上清液。
将从风湿病患者采集到的滑膜细胞以3×103/well接种到96孔培养板上。次日，将培养基更换为间充质干细胞的培养上清液。另外，作为阴性对照，还利用未培养间充质干细胞的sf-DOT培养基进行了培养。在更换培养基之后，在第三天使用Cell Counting Kit-8(同仁科学研究所)对细胞数进行了测定。
其结果在图1示出。图1是表示细胞数的测定结果的图表。图1中示出了源自脂肪的间充质干细胞培养上清液抑制源自风湿病患者的滑膜细胞增殖的情况。
实施例二
对于间充质干细胞上清液对滑膜细胞的滑膜素表达带来的影响的研究
在本实施例中，测定了源自脂肪、源自脐带和源自羊膜的间充质干细胞培养上清液抑制源自风湿病患者的滑膜细胞的滑膜素表达的活性。首先，利用sf-DOT培养基对源自脂肪的间充质干细胞培养三天，从而得到了培养上清液。将从风湿病患者采集到的滑膜细胞以1×105/well接种到6孔培养板上。
次日，将培养基更换为间充质干细胞的培养上清液。作为阴性对照，利用未培养间充质干细胞的sf-DOT培养基进行了培养。在培养的第三天回收细胞，并提取了RNA。由RNA合成cDNA，通过定量PCR法对滑膜素的基因表达进行了测定。作为内部标准，对RPLP0的表达进行定量，并用所得到的值对滑膜素基因的表达量进行了补正。
其结果在图2示出。图2是表示滑膜素基因的表达量的图表。如图2所示，示出了源自脂肪的间充质干细胞培养上清液抑制源自风湿病患者的滑膜细胞中滑膜素的基因表达的情况。
实施例三
对于间充质干细胞对关节炎模型带来的影响的研究
调查了源自人体脂肪的间充质干细胞对使用了DBA/1小鼠(体重约25克)的胶原蛋白诱发关节炎模型带来的影响。在DBA/1小鼠的尾根部皮内给药与佐剂(Adjuvant)混合的牛II型胶原蛋白，并进行了致敏(Sensitization)。在初次胶原蛋白致敏两周后，再次进行胶原蛋白致敏，从而得到了关节炎。对于间充质干细胞而言，从进行初次胶原蛋白致敏的两周前开始，以一周两次的频率且经持续九周，将1×106细胞给药到背部的皮内。在观察期间，用游标卡尺对后肢的厚度进行了测定。
间充质干细胞使用实施例一中所培养的细胞。
图3是以胶原蛋白致敏前的后肢的厚度为0而标绘各测定时的厚度而成的曲线图。如图3所示，在间充质干细胞给药组中，抑制了由胶原蛋白诱导的关节炎。
实施例四
对于间充质干细胞上清液对各种细胞系的滑膜素表达带来的影响的研究
在本实施例中，测定了源自脂肪、源自脐带和源自羊膜的间充质干细胞培养上清液抑制一般研究所使用的细胞系的滑膜素表达的活性。首先，利用sf-DOT培养基对源自脂肪的间充质干细胞培养三天，从而得到了培养上清液。将A549、HEK239和Hela细胞以1×105/well接种到6孔培养板上。
次日，将培养基更换为间充质干细胞的培养上清液。作为阴性对照，利用未培养间充质干细胞的sf-DOT培养基进行了培养。在培养的第三天回收细胞，并提取了RNA。由RNA合成cDNA，通过定量PCR法对滑膜素的基因表达进行了测定。作为内部标准，对RPLP0的表达进行定量，并用所得到的值对滑膜素基因的表达量进行了补正。
其结果在图4示出，图4是表示滑膜素基因的表达量的图表。如图4所示，示出了源自脂肪的间充质干细胞培养上清液抑制A549、HEK239和Hela细胞中的滑膜素的基因表达的情况。
【工业上可利用性】
由于对将滑膜素应用于各种药品进行了研究，因此，本发明可以利用于医药产业中。尤其是，本发明能够抑制滑膜素的表达。因此，能够提供与滑膜素有关的各种疾病的治疗剂或各种食品。

Claims (2)

1.一种滑膜素表达抑制剂，其特征在于，
所述滑膜素表达抑制剂包含间充质干细胞或间充质干细胞的培养上清液作为有效成分，抑制滑膜素基因的表达或滑膜素蛋白质的表达。
2.一种滑膜素表达抑制剂的制造方法，其特征在于，
包括：
培养间充质干细胞，从而得到间充质干细胞或间充质干细胞的培养上清液的工序；以及
使用在所述工序中所得到的间充质干细胞或间充质干细胞的培养上清液来制备对滑膜素基因的表达或滑膜素蛋白质的表达进行抑制的滑膜素表达抑制剂的工序。
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