CN112294950A - 包含非瘤组织的半流体的应用、及包含该半流体的疫苗和制备方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种包含非瘤组织的半流体的应用、包含它的疫苗、该疫苗的制备方法、抗实体肿瘤方法以及用于治疗实体肿瘤的疫苗试剂盒。

Description

包含非瘤组织的半流体的应用、及包含该半流体的疫苗和制 备方法

技术领域

本申请涉及一种包含非瘤组织的半流体的应用、包含它的疫苗、该疫苗的制备方法、抗实体肿瘤方法以及用于治疗实体肿瘤的疫苗试剂盒。

背景技术

多种类的物质曾经被用以制作肿瘤疫苗。微生物类物质最早被应用于开发实体肿瘤疫苗。化脓性链球菌、黏质沙雷菌(William B.Coley，1891年)、卡介苗等先后被发现对某些肿瘤有疗效。活的、减毒或基因修饰的专性或兼性厌氧细菌可以选择性地在肿瘤内繁殖(可用作定植载体)，也可以释放某些抗原激活机体免疫系统。感染流感病毒或注射狂犬病疫苗后也出现肿瘤病情明显缓解的案例。此外，活的、减毒或基因修饰的溶瘤病毒可以通过两种方式(选择性肿瘤细胞杀伤和抗肿瘤免疫)抑瘤。另一方面，疟原虫、弓形虫等也被发现可抗肿瘤生长。某些寄生虫和肿瘤具有相似的抗原表位(例如某些寄生虫细胞表面的黏蛋白型O-聚糖)。某些寄生虫亚单位(例如寄生虫肽段GK1)可启动有益的免疫应答。可是，微生物类疫苗要么显示出一定的有效性却有较高安全性风险，要么显示出较高安全性却有效性不高。

包含特异性肿瘤抗原的疫苗更引入关注。首先出现的是全肿瘤细胞疫苗。肿瘤细胞经过消除致瘤性的处理后，其免疫原性仍然能显示出一定的抗肿瘤疗效。通过添加佐剂或通过引入新的基因还可以使其更具抗原性。全细胞疫苗表达较全面，但成分复杂、特异性仍然不强。研究人员于是寄望于在肿瘤细胞中筛选出个别有用无害的抗原部位(例如某些胞外体、表面蛋白质、核酸、多肽、等)制成亚单位疫苗。所谓的肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的发现，曾经让人们欢欣鼓舞。然而，尽管其成分较单一、特异性较强、安全性较高，其免疫原性却较低下。随着当代基因技术的发展，肿瘤新抗原(Neoantigen)再次让人们为之一振。肿瘤新抗原是指由癌细胞基因突变所导致的、正常细胞所没有的、且能被免疫细胞所识别的一类蛋白/表位多肽。然而，多肽序列一般由几个或数十个氨基酸组成，分子量较小，化学结构简单，安全性虽高免疫原性却较弱，仍然难以诱发足够强度的免疫反应，仅有不多的成功案例被报道。

肿瘤抗原的靶向性和微生物减毒活抗原(例如病毒和细菌)强有力的免疫原性的结合，衍生出载体疫苗，例如荷载肿瘤抗原的重组病毒。而在体外将树突状细胞(DC)负载肿瘤抗原，有可能针对患者DC功能缺陷加强抗肿瘤免疫反应，衍生出DC疫苗，例如DC与肿瘤细胞融合疫苗、肿瘤抗原肽或蛋白提取物致敏的DC疫苗、TAA或TSA基因修饰的DC疫苗、肿瘤细胞胞外体致敏的DC疫苗，等等。然而，这些肿瘤抗原衍生疫苗仍然未显示出针对大多数实体肿瘤的有效性。

此外，人们发现，在异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后，异体淋巴细胞在受者体内迁移、增殖，进而以受者靶细胞为目标发动细胞毒攻击，介导移植物抗宿主病(GVHD)，同时还介导移植物抗白血病反应(CVL)。在其他非血液系统恶性肿瘤中，也有GVHD和类CVL反应(延伸称之为移植物抗肿瘤反应(GVT))。然而，进一步的研究发现，包含异基因淋巴细胞的流体中的异基因淋巴细胞抗原的优势抗原性为GVHD，仅显示出较低的GVT反应。实体肿瘤往往需要强大很多的GVT反应，但GVT反应的增加也会增加患者GVHD的发病率和死亡率。这类异基因淋巴细胞疫苗于是将其优势适应症局限于尽可能接近血液系统肿瘤的实体肿瘤，例如应用于尽可能小的瘤体、或在小鼠接种移植瘤后3-5天内即尽快给药。

尽管微生物(抗原)疫苗、肿瘤细胞(抗原)疫苗、肿瘤细胞亚单位(抗原)疫苗、肿瘤新(抗原)疫苗、异基因淋巴细胞(抗原)疫苗繁花似锦，但从临床角度看实体肿瘤疫苗的开发似乎进步不大。问题仍在于如何才能开发出这样一种实体肿瘤疫苗抗原，其具有临床有效所需的(抗肿瘤)抗原性、同时不需抗原性(例如GVHD)又在临床安全的允许范围内？因而，仍然需要开发新的免疫策略，以满足现有技术尚不能满足的急需临床需求。

发明内容

本申请的目的在于提供一种在组成、性质和形态上类似于瘤体组织，却更容易被免疫识别和响应，从而介导针对瘤体组织的有效免疫效应、而不需抗原性(例如GVHD)又最小化的实体肿瘤疫苗抗原，以及包含该抗原的疫苗。

本申请的一个方面提供包含非瘤组织的半流体作为抗原在制备实体肿瘤疫苗中的应用。

本申请的另一个方面提供一种用于抗实体肿瘤的疫苗，其包含作为抗原的包含非瘤组织的半流体。

本申请的又一个方面提供一种治疗或者抑制实体肿瘤的方法，其包括向有此需要的个体局部施用、优选为通过局部注射施用包含作为抗原的包含非瘤组织的半流体的疫苗。

本申请的再一个方面提供一种制备抗实体肿瘤的疫苗的方法，其包括以下步骤：

a.提供非瘤组织；

b.对所述非瘤组织进行半流体化处理得到包含所述非瘤组织的半流体，其中所述半流体化选自以下之一种或多种：液体组织的粘稠化、液体组织的凝固化、非液组织的机械破碎、液体组织凝固物的机械破碎、非液组织的软化。

本申请的再一个方面提供一种根据上述方法制备的疫苗。

根据本发明包含非瘤组织的半流体作为抗原具有以下优点：与现有技术的微生物抗原相比，更高的针对实体肿瘤瘤体的免疫原性，更低的生物安全性风险；与现有技术的肿瘤细胞及其亚单位抗原相比，更高的针对实体肿瘤瘤体的免疫原性，免疫原性的更宽的实体肿瘤适应症谱；与现有技术的肿瘤新抗原相比，更高的针对实体肿瘤瘤体的免疫原性，更高的易获得性；以及与现有技术的异基因淋巴细胞抗原相比，更高的针对实体肿瘤瘤体(尤其是较大瘤体)的免疫原性，更低的应用量，更低的不需要的免疫活性(例如GVHD)。

根据本发明的包含非瘤组织的半流体作为抗原的疫苗具有以下优点：与现有技术的微生物疫苗相比，更高的实体肿瘤抑瘤有效性，更高的生物安全性，更宽的实体肿瘤适应症谱；与现有技术的肿瘤细胞亚单位疫苗相比，更高的实体肿瘤抑瘤有效性，更宽的实体肿瘤适应症谱；与现有技术的肿瘤新抗原疫苗相比，更高的实体肿瘤抑瘤有效性，更快捷方便的获得性；以及与现有技术的异基因淋巴细胞疫苗相比，更高的实体肿瘤抑瘤(尤其是较大瘤体)有效性，更低的移植物风险(例如GVHD)，更宽的实体肿瘤适应症谱。另外，在根据本发明的疫苗包含抗实体肿瘤的活性成分时，能够表现出更好的协同作用。

根据本发明的抗实体肿瘤方案更容易和其它相关治疗方案联合进行。此外，该应用和该疫苗制备可控、成本便宜，而该治疗方案简便易行，特别有助于使难以承受高额费用的广大人群也享受到安全、有效治疗。

具体实施方式

在一个抗实体肿瘤的动物试验中，本发明的发明人将一种包含非瘤组织的半流体用作一种实体肿瘤全细胞疫苗的阴性对照物时，发现了前者有不低于后者的免疫抑瘤性。

根据本申请公开的一个方面，其提供包含非瘤组织或由非瘤组织形成的半流体作为抗原在制备用于治疗或抑制实体肿瘤的疫苗中的应用。

根据本申请公开的另一个方面，其提供一种用于治疗或抑制实体肿瘤的疫苗，其包含作为抗原的包含非瘤组织或由非瘤组织形成的半流体。

根据本申请公开的再一个方面，其提供一种抗实体肿瘤方法，其包括向有此需要的受试者局部给药、优选为局部注射包含作为抗原的包含非瘤组织的半流体的疫苗。

在本申请公开中，术语“疫苗”是指能够诱发机体针对目标疾病(例如实体肿瘤)的安全和有效免疫应答、从而安全和有效地预防或/和治疗该疾病的生物制品。术语“疫苗抗原”(在本申请公开中有时简写为抗原)是指包含在疫苗中、且其优势免疫反应为针对目标疾病(例如实体肿瘤)的所需免疫反应的生物物质。

在本申请公开中，术语“组织”是指包含形态功能类似的动物细胞和细胞间质组成的多细胞结构，其包括天然组织、源自天然组织的天然组织组分和工程化组织。术语“非瘤组织”是指瘤体组织之外的组织。

在本申请公开中，术语“半流体”是指在限时内(例如20秒)无外压则无肉眼可见的流动、而在临床(施用时)可接受的外压(例如可施加在注射器推进装置上的外压)下可以流动并导致不可逆形变的物体，其区别于流体(流体无外压时亦有流动性)、固体(固体在临床可接受的外压下亦不可流动)、半固体(半固体在临床可接受的外压下仅发生可逆形变)。例如，某些动物器官(例如肌肉块、肝、胃、肠、心、肺、胰腺、软骨、关节等)的组织、以及某些压力下不流动的凝胶(例如纤维蛋白胶)是半固体，而不是半流体。

在一个实施方案中，所述半流体所包含的非瘤组织选自源自结缔组织和/或半固体组织的以下组之一种或多种：自动物提取的天然组织、包含细胞和细胞间质的天然组织组分、包含细胞和细胞间质的工程组织。天然组织例如天然血液，天然组织组分例如天然血液组分(细胞富集组分)，工程组织例如包含血浆和一种或多种血细胞的人造血液。

在一个实施方案中，所述包含非瘤组织或由非瘤组织形成的半流体可以是作为类侵入组织抗原。在本发明的范围内，所述半流体作为抗原的必要条件(或者基本技术方案)为：例如通过应用条件，它在体内形成在组成(例如包含细胞和细胞间质)、性质(例如柔软性)、形态/结构上类似侵入组织、且在侵入程度上足够严重的类组织结节，以能够引起对它足够的免疫识别，以及激发出针对它也针对与它类似的病变体(例如瘤体)的足够的免疫响应。

在一个实施方案中，所述包含非瘤组织或由非瘤组织形成的半流体可以是作为类瘤侵入组织抗原。在本发明的范围内，所述半流体作为类瘤侵入组织抗原的必要条件(或者基本技术方案)为：例如通过应用条件，它在体内形成在组成(例如包含细胞的量)、性质(例如柔软性)、形态/结构上类似瘤体组织、且在侵入程度上足够严重的类瘤体结节，以能够引起对它足够的免疫识别，以及激发出针对它也针对与它类似的瘤体的足够的免疫响应。

在本申请公开中，术语“类瘤入侵组织抗原”是指与肿瘤组织(而不一定是肿瘤细胞)具有在免疫识别上的类似性、且其所诱导的免疫响应可以攻击肿瘤组织的类侵入组织抗原。

在一个实施方案中，包含所述包含非瘤组织或由非瘤组织形成的半流体的疫苗是通过瘤区给药和/或瘤外局部给药的方式施用的，且其中所述半流体的组成和形态使得其在施用处形成半流体结节。

在一个实施方案中，包含所述半流体的疫苗是通过瘤区给药的方式施用的。在一个实施方案中，包含所述半流体的疫苗是通过瘤外局部给药的方式施用的。在一个实施方案中，包含所述半流体的疫苗的施用包括在瘤区用药和瘤外局部用药。在一个实施方案中，所述瘤区用药包括瘤内给药。在一个实施方案中，所述瘤外局部用药包括以下之一种或多种：皮下给药、肌肉给药、粘膜给药。

在一个实施方案中，作为抗原，所述非瘤组织为远离天然状态，优选为处于易被免疫系统辨识为严重损伤状态的类侵入组织抗原。

在一个实施方案中，所述包含非瘤组织或由非瘤组织形成的半流体作为抗原的形态/结构条件包括：所述半流体所包含的非瘤组织为高度偏离天然状态的、优选为严重损伤的组织，其中所述远离天然状态包括粘稠化；所述严重损伤选自包括以下之一种或多种损伤：机械破碎、凝固化、超声损伤、热损伤、冻融损伤、照射损伤、化学损伤。

在本发明的范围中，所述粘稠化是指液体非瘤组织或/和加入添加剂的量达到如此之高，以至于体系不再是流体而成为非流体粘稠物。组织从流体变为半流体，明显远离天然状态。

在本申请公开中，术语“严重损伤”是指不仅丧失生理功能且能被机体免疫系统识别和应对作重大创伤加以消除的损伤状态。

在本发明的范围内，所述机械破碎、凝固化损伤、超声损伤、热损伤、冻融损伤、照射损伤、化学损伤可分别通过以下处理来获得：机械破碎、凝固化处理、超声处理、热处理、冻融处理、照射处理、化学处理。众所周知，这些处理可以改变组织结构、形态，从而使得组织严重损伤。这些处理不仅导致组织损伤，往往也可以改变细胞结构、形态，从而使得细胞损伤(例如细胞的机械损伤、超声波损伤、热损伤、冻融损伤、照射损伤、化学损伤)。经这些损伤后，动物组织均丧失生理功能(例如不能再被用于器官移植或组织移植，以及细胞增殖弱化)，而且更易被机体免疫系统作为重大创伤(例如其优势抗原性不再是异基因抗原性)识别和应对。

在本发明的范围中，所述机械破碎包括机械分割(例如组织取样)和剪切破碎。所述剪切破碎是指将待处理物体施以转速为≥10转/分、优选10-50000转/分的剪切，其中所述剪切破碎可以通过搅拌机、研磨机或匀漿机来进行。固体或半固体经机械破碎后可以变为颗粒。此外，半固体半流体(例如脊髄)在进入注射器或注射时，亦受到机械破碎从而严重损伤。

在本发明的范围中，所述凝固化是使液体转化为固体或半固体的处理，其包括选自本领域公知的任何液体组织的凝固化处理，例如：自凝固化(例如自凝固血液)、热凝固化(例如热凝固血液)、凝固剂凝固化(例如凝固剂凝固血液)。其中，热凝固化可以通过热处理来进行，凝固剂凝固化是通过在液体中加入凝固剂(例如血液中加入凝血酶和氯化钙)来进行。

在本发明的范围中，所述超声处理是指将待处理物体(例如血液、组织颗粒)放入超声装置中进行超声(例如工作频率为2-60kHZ)以使其结构受到破坏。

在本发明范围内，所述热处理选自包括以下之一种或多种：直接热处理、蒸汽热处理、冻干热处理、微波热处理、射频热处理、激光热处理。热处理温度为≥40℃、优选为60℃-115℃。例如，可对血液进行如上所述的热处理。

在本发明范围内，所述冻融处理包括冷冻处理和冷冻物的融化处理，其中所述冷冻处理选自机械制冷或/和液氮制冷，制冷温度为≤-60℃、优选为-60℃-160℃。例如，可对血液、组织颗粒进行如上所述的冻融处理。

在本发明范围内，所述照射处理(例如照射強度为20-100Gy)选自包括以下之一种或多种：X射线照射处理、γ射线照射处理、光敏性药物+紫外线照射处理。例如，可对血液、组织颗粒进行如上所述的照射处理。

在本发明范围内，所述化学处理是指将待处理物体加入化学破坏剂(例如酸、碱、乙醇等硬化剂)以使其结构受到破坏。例如，可对血液、组织颗粒进行如上所述的化学处理。

在一个实施方案中，所述半流体包括或由所述非瘤组织的半流体化产物组成，其中所述半流体化选自包括以下组之一种或多种：液体的半流体粘稠化、液体的半流体凝固化、非液体或凝固物的破碎化。

在本申请公开中，术语“半流体粘稠化”是指非流体粘稠物为半流体粘稠物的粘稠化。例如，工程组织白细胞和血浆的混合物、或红细胞和血浆的混合物中的细胞比容达70％以上时，组织从流体转变为半流体。术语“半流体凝固化”是指将液体转化为半流体的凝固化，例如血液的自凝固化(例如不加热、不加凝固剂的凝固)、热凝固化(例如中低温加热凝固)等。术语“破碎化”是指将非液体组织或组织凝固物进行机械分割或剪切破碎在内的碎块化处理以致于形成半流体、优选可注射半流体，其中所述剪切破碎可以通过搅拌机、研磨机或匀漿机(例如转速为≥10转/分、优选10-50000转/分的剪切)来进行。

在一个实施方案中，所述包含非瘤组织的半流体作为抗原的形态/结构条件包括：所述半流体选自以下组之一种或多种：包含液体组织的半流体粘稠物、包含液体组织的半流体凝固物、包含非液组织的破碎物、包含液体组织凝固物的破碎物、包含非液组织的软化物。在该技术方案下，所述包含非瘤组织的半流体优选为作为非正常组织、尤其是严重损伤组织诱导免疫应答的抗原。

在一个实施方案中，所述包非瘤组织含或由非瘤组织形成的半流体作为抗原的形态/结构条件包括：所述半流体优选为选自以下组之一种或多种：包含液体组织的半流体凝固物、包含非液组织的破碎物、包含液体组织凝固物的破碎物、包含非液组织的软化物。

在一个实施方案中，所述凝固物包括液体组织的自凝固物、凝固剂致凝固物、热凝固物。

在一个实施方案中，所述软化包括半固体组织组织的热处理致软。

在一个实施方案中，所述破碎物包括颗粒群。在一个实施方案中，所述颗粒优选为肉眼可辨的宏观颗粒。在一个实施方案中，所述颗粒的最长端的横切面的平均直径为≥100nm，优选为500nm-1mm或1μm-1mm。

在一个实施方案中，所述半流体所包含的组织的细胞比容为>22％(或细胞浓度为>5.6×10⁹个细胞/ml)、优选为33％-86％(或细胞浓度为8.4×10⁹个/ml-22×10⁹个细胞/ml)。

在一个实施方案中，所述半流体所包含的组织的细胞比容为≥45％(或细胞浓度为>11.5×10⁹个细胞/ml)、优选为45％-86％(或细胞浓度为11.5×10⁹个/ml-22×10⁹个细胞/ml)。

在一个实施方案中，所述半流体所包含的组织的细胞比容为≥55％(或细胞浓度为>14.0×10⁹个细胞/ml)、优选为55％-86％(或细胞浓度为14.0×10⁹个细胞/ml-22×10⁹个细胞/ml)。例如，肌肉组织的细胞比容通常大于50％；正常血液的细胞比容通常大于30％(例如人血液的血细胞比容正常范围为37-50％)，去掉部分血清后的浓缩血液的血细胞比容则可达45-85％；血细胞/血浆中的细胞比容可达45-85％。该细胞比容从组成上保证所述半流体能在体内形成半流体结节、尤其是类癌半流体结节。在该技术方案中，所述半流体优选为作为类瘤组织诱导免疫应答的抗原。

在一个实施方案中，所述半流体中的组织的细胞比容为55％-86％(或细胞浓度为14.0×10⁹个细胞/ml-22×10⁹个细胞/ml)。

在一个实施方案中，所述半流体作为抗原优选为包括作为尺寸较大的半流体结节抗原或较大瘤体的严重损伤瘤体仿生抗原。

在一个实施方案中，所述半流体的组成、性质、形态/结构和应用条件使得其在施用处形成体积>100mm³，优选为≥200mm³的半流体结节。

在本申请公开中，术语“尺寸较大的半流体结节抗原”是指由尺寸较大的半流体结节本身的结构(形态)特点致其特异性免疫原的抗原，其区别于分子形态的抗原(例如微生物抗原、肿瘤抗原、异基因免疫细胞抗原等)、以及半固体形态的抗原(例如半固体移植物抗原等)。术语“微生物抗原”、“肿瘤抗原”、“异基因免疫细胞抗原”、“半固体移植物抗原”则是指分别以微生物的种属特异分子、肿瘤细胞的病原特异分子、异基因免疫细胞的异基因特异分子、半固体移植物的种属或异基因特异分子为其特异性免疫原的抗原。当这些抗原被用作疫苗抗原时，相应的疫苗分别被称作“半流体结节抗原疫苗”、“微生物疫苗”、“肿瘤抗原疫苗”、“异基因免疫细胞疫苗”等等。结构越复杂的物质，其携带的抗原决定要素(例如抗原决定基)通常也越多。例如，尽管微生物亚单位抗原更安全、更易制备，临床上应用的很多疫苗仍然主要还是活微生物疫苗。

在一个实施方案中，所述半流体优选为可挤流半流体。在本发明的范围内，所述可挤流半流体是指可在临床接受的压力下流过针管的半流体。

在一个实施方案中，所述半流体为植入剂、优选为注射剂，且其单个动物给药量为>0.1ml，优选为≥0.2ml或0.2-25ml。所述半流体作为抗原的必要条件提供了多重仿瘤体特征，而较大的注射量则使所形成的半流体结节更易被免疫识别作半流体结节抗原。

在本发明的范围内，所述半流体注射剂为可以通过常规注射系统直接用药的半流体。而半固体移植物则往往通过手术植入、或以流体(液体)方式通过常规注射系统用药后在用药处形成半固体(例如原位凝胶化)结节。

在一个实施方案中，所述半流体的皮下半消失期为≥0.1日，优选为0.1-30日。

在一个实施方案中，所述半流体的皮下半消失期为≥1日，优选为1-30日。

在本发明的范围内，所述半流体中包含的非瘤组织为来自哺乳动物的组织。所述哺乳动物选自以下之一种或多种：人、猪、马、羊、牛、兔、鼠。这些动物可以是完全自然进化的动物，也可以是经过生物技术(例如基因编辑技术)改造的动物(例如GAL抗原敲除猪)。

在一个实施方案中，所述包含非瘤组织的半流体作为抗原优选为包括作为其优势抗原性为抗所述实体肿瘤抗原性而非抗宿主抗原性的抗原。

根据本发明的半流体，其作为抗原在上述条件下应用时，优选为其优势抗原性为抗所述实体肿瘤抗原性而非抗宿主抗原性的半流体。

在一个实施方案中，所述半流体优选为抑瘤率为≥抗宿主率、优选为抑瘤率/抗宿主率≥150％的半流体。

物质作为抗原所导致的免疫识别和免疫响应的复杂性，远远超过其作为化疗药物所导致的后果。在免疫系统的多层次、多元化的网络格局中，一个物质有可能导致多种免疫反应，显示多种抗原性。在本申请公开中，术语“优势免疫反应”是指所激活的主要免疫反应。术语“优势抗原性”是指在优势免疫反应中显示的抗原性。例如，异基因淋巴细胞可攻击受者正常细胞(移植物抗宿主反应)和癌细胞(移植物抗肿瘤反应)，也可激活受者淋巴细胞攻击癌细胞(宿主抗肿瘤反应)和异基因细胞(宿主抗移植物反应)。由于其优势免疫反应为移植物抗宿主反应，其次为移植物抗肿瘤反应，宿主抗肿瘤反应则较弱，故异基因淋巴细胞本身是一种抗宿主抗原，可以用作抗肿瘤细胞(例如白血病)抗原，却很难被用作实体肿瘤疫苗抗原。

在一个实施方案中，所述半流体中的非瘤组织可以是异种或异基因抗原性最小化的组织。

在本申请公开中，术语“异种抗原”是指源自受试者的不同物种且代表其种属特异性的抗原；术语“同种异基因抗原”是指源自受试者的同种异体等位基因差异的抗原，例如主要组织相容性抗原(MHC抗原，例如人类白细胞抗原(HLA))、次要组织相容性抗原(mH抗原)和其它组织相容性抗原(例如人类血型抗原、组织特异性抗原等)。

在一个实施方案中，所述半流体中的非瘤组织可以为选自以下组之一种或多种：源自受试者的异种动物且并不富含异种糖蛋白抗原的组织、源自受试者的同种异体且并不富含异基因抗原的组织、源自受试者自体的严重损伤组织，更优选为选自以下之一种或多种：低血管密度的异种组织、ABO血型相符或HLA相近的同种异体异基因组织、严重损伤同种异体同基因组织、严重损伤自体组织。

在本申请公开中，术语“异种组织”是指含有异种细胞的组织。术语“同种异体组织”是指含有同种异体细胞的组织。术语“自体组织”是指所含细胞均为自体细胞的组织。

在一个实施方案中，所述半流体中包含的非瘤组织可以为选自以下组之一种或多种：源自受试者的ABO血型相符或HLA相近的同种异体异基因组织、源自受试者的严重损伤同种异体同基因组织、源自受试者的严重损伤自体组织。

在一个实施方案中，所述半流体包含并不富含自身隐蔽抗原的自体组织。

在一个实施方案中，所述组织优选为选自肌肉组织和/或结缔组织。

在一个实施方案中，所述半流体包含选自以下之一种或多种器官所包含的组织：肠、胃、肉、胰腺、脾脏、肝脏、肺、软骨、关节、皮、胎盘、脐带，优选为选自以下之一种或多种器官所包含的组织：肉、脾脏、肝脏、胎盘、脐带，更优选为选自以下之一种或多种器官所包含的组织：肉、胎盘、脐带。

在一个实施方案中，所述半流体包含选自结缔组织的组织，优选为选自以下之一种或多种：血液、骨髓、脊髓，更优选为血液。

在一个实施方案中，所述半流体包含选自血液以及以下之一种或多种器官所包含的组织：肉、胎盘、脐带。

在一个实施方案中，所述血液为ABO血型相符或HLA相近的同种异体血液。在一个实施方案中，所述血液为自体血液。

在一个实施方案中，所述血液选自以下组之一种或多种：自动物提取的天然血液、包含血细胞和血漿的天然血液组分、包含血细胞和血漿的工程血液。

在一个实施方案中，所述血液为血细胞比容为≥45％、优选为55％-86％的血细胞浓缩血液，其中所述血细胞浓缩血液选自以下之一种或多种；自天然血液脱除20～60％血清的脱血清血液、往天然血液加入血细胞的加血细胞血液、包含血细胞和血漿蛋白的人造血液。

在本发明的范围内，所述血细胞选自包括以下一种或多种：红细胞、白细胞、血小板。所述白细胞选自包括以下一种或多种：粒细胞、单核细胞、淋巴细胞。所述淋巴细胞选自包括以下一种或多种：T细胞、B细胞、裸细胞。

在一个实施方案中，所述液体组织的半流体凝固物包括血液凝固物，其中所述血液凝固物包括血液自凝固物、血液热凝固物、血液/凝固剂凝固物。在本申请公开中，术语“血液自凝固物”是指血液自然凝固形成的凝固物。术语“血液热凝固物”是指血液经热处理形成的凝固物。术语“血液/凝固剂凝固物”是指血液加入凝固剂所形成的凝固物。

在一个实施方案中，所述半流体包括血液自凝固物。

在一个实施方案中，所述半流体包括血液/凝固剂凝固物。在一个实施方案中，所述凝固剂包括血液凝固剂，其中所述血液凝固剂选自包括以下之一种或多种：凝血酶例如牛凝血酶、猪凝血酶、重组人凝血酶、自体凝血酶，其它凝血蛋白例如凝血因子、凝血酶原复合物、及它们的活化形式，钙离子提供剂例如氯化钙、氢氧化钙、碳酸钙。

在一个实施方案中，所述包含半流体的疫苗还包含抗实体肿瘤的活性成分，且其中所述活性成分与所述半流体的量比(w/w或v/v)为(0.1-30)/100。在所述疫苗包含抗实体肿瘤的活性成分的情况下，该半流体可以作为免疫增强抗原，其中所述免疫增强是指所述半流体与活性成分的组合物产生出高于组合物之任一单药单用的免疫疗效。所述免疫增强包括所述半流体与活性成分的组合物的协同作用。

在本发明的范围内，所述协同作用包括选自以下抗所述实体肿瘤的协同作用的一个或多个方面：免疫协同作用和/或化疗协同作用。例如，本发明的半流体瘤内用药可作为组织破坏成分参与释放瘤内原位抗原，而与化疗药物的协同作用加强组织破坏以及释放瘤内原位抗原，有利于免疫加强。

在本发明的范围中，术语“原位抗原”是指活体内病变体中包含的有可能诱发机体的特异性免疫应答的物质(例如含有实体肿瘤抗原信息的瘤内实体肿瘤细胞材料、胞外体、多肽及核酸序列等)，其实际上包含大量的有别于正常机体的抗原信息，只是这些信息被某些病理因素(例如肿瘤微环境)所屏蔽，从而不能被常规免疫系统识别并反应。

在本发明的范围内，所述半流体可以作为抗实体肿瘤活性成分的缓释载体，这是由于所述半流体在给药区形成在组成(例如包含细胞和细胞基质)、性质(例如柔软性)、形态/结构上类似于凝胶半固体、但可分散性更高的半流体结节，以能够可控地释放出活性成分，从而产生超过载体和所述活性成分的加和作用的治疗效应。

在一个实施方案中，所述活性成分选自抗肿瘤化疗药物或/和生物制品之一种或多种。通过包含非瘤组织的半流体与所述活性成分的组合，该疫苗可以在给药区形成有效抗原、激活实体肿瘤原位抗原，以产生超过半流体抗原和所述免疫成分的加和作用的免疫治疗效应；或者形成瘤体组织的破坏效应，以产生超过半流体抗原和所述化疗药物的加和作用的治疗效应。

在一个实施方案中，所述活性成分与所述半流体的量比(w/w或v/v)为(0.1-30)/100。在一个实施方案中，所述化疗药物与所述半流体的量比(w/w或v/v)为(0.1-30)/100。在一个实施方案中，所述生物制品与所述半流体的量比(w/w或v/v)为(0.1-30)/100。

在一个实施方案中，所述生物制品选自包括以下组之一种或多种：细胞制品、免疫调节类抗体、细胞因子、病原体或病原体亚单位。在一个实施方案中，所述细胞制品中细胞的含量为大于10⁵个细胞/ml、优选为10⁵-10⁹个细胞/ml。

在本申请公开中，术语“细胞制品”是指经工程制备方法(例如细胞纯化、细胞培养、等等)所获得的细胞，其包括经工程制备的天然细胞(例如由脾之细胞混合物经溶解红细胞后纯化所获得的淋巴细胞)或工程化细胞；术语“工程组织”是指所包含的细胞均为细胞制品的组织。

在一个实施方案中，所述半流体包含自体血液和细胞制品。

在一个实施方案中，所述细胞制品与血细胞的量比(v/v)为10-90％。

在一个实施方案中，所述细胞制品优选为选自同种异基因细胞、同基因细胞和自体细胞，更优选为自体细胞。

在一个实施方案中，所述细胞制品为选自包含以下之一种或多种天然细胞或工程化细胞的制品：所述组织富含的细胞例如肌细胞、血细胞；免疫细胞例如外周血单核细胞、T细胞、B细胞、NK细胞、淋巴细胞；干细胞例如间充质干细胞、造血干细胞。

在本发明的范围中，所述免疫调节类抗体药物选自以下组之一种或多种：针对抑制性受体的抗体阻断剂(例如针对CTLA-4分子和PD-1分子的阻断性抗体)、针对抑制性受体的配体的抗体阻断剂、针对免疫反应细胞表面刺激分子(例如OX40、CD137、4-1BB等)的激活性抗体、针对实体肿瘤微环境中免疫抑制性分子如TGF-p1的中和抗体。在一个实施方案中，所述免疫调节类抗体药物在所述疫苗中的含量为>0.1％、优选为0.25-10％。

在一个实施方案中，所述细胞因子选自以下之一种或多种：肿瘤坏死因子、干扰素、白介素。在一个实施方案中，所述细胞因子在所述疫苗中的含量为>0.1％、优选为0.25-3％。

在一个实施方案中，所述病原体或病原体亚单位中的所述病原体选自以下组之一种或多种：肿瘤细胞、细菌、病毒。

在本申请公开中，术语“病原体”是指可致病生物体或其他生物媒介，可致病生物体包括例如寄生虫(例如原虫、蠕虫等等)、细菌、真菌、病毒、立克次氐体、衣原体、支原体、螺旋体，其他生物媒介包括例如微生物重组体、病变细胞(例如实体肿瘤细胞)；术语“病原体亚单位”是指病原体的免疫活性成分及其人造类似物，例如寄生物、细菌、病毒、肿瘤细胞、它们的免疫活性成分成分(DNA、蛋白质、多肽片断、等等)(例如肿瘤亚单位抗原、非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸-脱氧寡核苷酸(CpG ODN)等)。

在一个实施方案中，所述病毒选自以下之一种或多种：腺病毒、单纯疤疹病毒、牛痘病毒、腮腺炎病毒、新城鸡瘟病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、西尼卡谷病毒、柯萨奇病毒、呼肠孤病毒。

在一个实施方案中，所述化疗药物选自细胞毒药物和/或常规无效但局部有效化合物之一种或多种。

在一个实施方案中，所述细胞毒药物和半流体的量比(w/w或v/v)为(0.1-15)/100。

在一个实施方案中，所述常规无效但局部有效化合物和半流体的量比(w/w或v/v)为(0.5-30)/100。

在本申请公开中，术语“细胞毒药物”是指在安全剂量下可以通过吸收作用有效的药物(例如抗肿瘤化疗药物)，其选自药学上可接受的任何细胞毒药物，优选为选自本领域公知的细胞毒药物，更优选为选自中国、美国或欧洲官方主管行政部门(例如FDA或中国药监局)己批准或将批准、或经中国、美国或欧洲官方药典己载入或将载入的抗肿瘤化疗药物。

在一个实施方案中，所述细胞毒药物可以为选自以下组之一种或多种：尿嘧啶衍生物类、环磷酰胺类、吉西他滨类、表柔比星类、抗肿瘤抗生素类、替尼泊苷、金属铂络合物、紫杉烷类；优选为选自以下药物及其类似衍生物一种或多种：5-氟尿嘧啶、吉西他滨、表柔比星、抗实体肿瘤抗生素、替尼泊苷、金属铂络合物、紫杉醇。

在一个实施方案中，所述抗肿瘤化疗药物在所述半固体中的浓度大于其饱和浓度的50％、优选为其饱和浓度的50-500％，其中所述饱和浓度是指所述抗实体肿瘤化疗药物在其药用溶媒中的饱和浓度。

在一个实施方案中，所述常规无效但局部有效化合物选自以下组之一种或多种：氨基酸类营养素、无效芳香化合物、非动物生物活性成分。

在本申请公开中，术语“常规无效但局部有效化合物”是指在安全剂量下通过吸收作用临床无效的药物(例如抗肿瘤化疗药物)，其选自例如中国、美国或欧洲官方药典己载入的抗肿瘤化疗药物之外的药物。

在本发明的范围内，作为所述氨基酸类营养素的氨基酸、氨基酸盐、寡肽优选为选自以下组中的氨基酸或其盐或者包含或由以下氨基酸构成的寡肽：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、β-丙氨酸、牛磺酸、γ氨基丁酸(GABA)、茶氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸；更优选为选自以下组中的氨基酸或其盐或者包含或由以下氨基酸构成的寡肽：精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸。在一个实施方案中，所述氨基酸类营养素在所述疫苗中的浓度(w/w)为大于≥5％、优选为10-35％或18-35％，更优选为15％-35％或20％-35％。

在本申请公开中，术语“无效芳香化合物”是指在安全剂量下通过吸收作用不能有效抑制肿瘤的芳香化合物。所述无效芳香化合物包括药学上可接受的任何无效芳香化合物。在本发明的范围内，所述无效芳香化合物为选自以下组之一种或多种：色素芳香化合物、水杨酸类化合物、喹啉类化合物。在一个实施方案中，所述无效芳香化合物在所述疫苗中的浓度(w/v)≥0.35％、优选为0.35-20％。

在本申请公开中，术语“色素芳香化合物”是指药学上可以接受的能够使靶区有选择性的将特定波长的光吸收或反射的芳香化合物，其可以例如包括活体染料、光敏剂和有色化疗药物。

在一个实施方案中，所述色素芳香化合物可以为选自以下化合物及其衍生物之一种或多种：亚甲蓝(包括其水合物)、专利蓝、异硫蓝、孟加拉红、混合卟啉类光敏剂、卟啉类化合物(例如卟啉、卟吩、红紫素、内源性卟啉)、硝基酚化合物。在一个实施方案中，所述色素芳香化合物在所述疫苗中的浓度(w/v)≥0.35％、优选为0.5-10％。

在一个实施方案中，所述水杨酸类化合物为选自水杨酸和以下化合物及其衍生物之一种或多种：乙酰水杨酸、二氟苯水杨酸、双水杨酸酯、双香豆素、赖氨匹林。在一个实施方案中，所述水杨酸类化合物在所述疫苗中的浓度(w/v)≥0.5％、优选为0.5-2.0％。

在一个实施方案中，所述喹啉类化合物选自水溶性喹啉类化合物，优选为选自以下之一种或多种：奎宁、盐酸奎宁、二盐酸奎宁、氯喹。在一个实施方案中，所述喹啉类化合物在所述疫苗中的浓度(w/v)≥3％、优选为3-6％。

在本申请公开中，术语“非动物生物活性成分”是指具有药学活性的生物提取物及其类似物。术语“生物提取物”是指以植物、微生物等生物材料为原料、通过分离过程及其它加工过程获取的特定组分(例如基于特定结构的纯化物)。术语“类似物”是指虽不相同、但结构或/和性质上相似的天然产物、衍生物、半合成物、或合成物。

在本发明的范围内，所述非动物生物活性成分选自具有以下之一种或多种结构的生物提取物及其类似物：苷、多酚、多糖、萜类、黄酮。

在一个实施方案中，所述组织破坏剂选自以下组之一种或多种：抗实体肿瘤化疗药物例如5-氟尿嘧啶、吉西他滨、表柔比星、抗肿瘤抗生素、替尼泊苷、金属铂络合物、紫杉醇，氨基酸类营养素例如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、或它们的盐、或包含它们的寡肽，无效芳香化合物例如亚甲蓝、乙酰水扬酸、奎宁、一盐酸奎宁、二盐酸奎宁，非动物生物活性成分例如藻类多糖、药用植物多糖、真菌多糖、青蒿素。

在一个实施方案中，所述疫苗还任选地包含选自常规佐剂的佐剂。在本申请公开中，术语“佐剂”是指与疫苗抗原混合后能增强机体针对疫苗抗原的免疫应答能力、或改变免疫反应类型的本发明公开的添加剂。根据这一定义，疫苗佐剂与通常意义上的免疫增强剂有所不同，后者起作用往往不必与疫苗抗原混合。

在本申请公开中，术语“常规佐剂”是指本领域技术人员已知的任意合适佐剂，例如可以是油/乳佐剂。在本申请公开中，术语“油/乳佐剂”是指基于油或/和乳化物的佐剂(例如弗式佐剂、MF59)。

在本申请公开中，所用术语“实体肿瘤”是指有瘤体的任何恶性肿瘤。例如白血病、恶性淋巴瘤等则是非实体肿瘤。在一个实施方案中，所述实体肿瘤为选自瘤体体积>85mm³、优选为≥200mm³、更优选为≥300mm³的实体肿瘤。

在本发明的范围中，所述实体肿瘤包括：乳腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、肠癌、口腔癌、胃癌、结直肠癌、支气管癌、喉癌、睾丸癌、阴道癌、子宫癌、卵巢癌、恶性黑色素瘤、脑瘤、肾细胞癌、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤。

在使用所述疫苗治疗或抑制实体肿瘤时，还可与其它疗法组合施用，例如介入疗法、全身化疗、其它免疫疗法(例如去免疫耐受的免疫疗法)、光动力疗法、声动力疗法、手术干预或此类疗法的组合，以进一步提高疗效。

根据本申请公开的又一个方面，其提供一种用于治疗或抑制实体肿瘤的疫苗的制备方法，其包括以下步骤：

a.提供非瘤组织；

b.对所述非瘤组织进行半流体化处理和/或严重损伤处理，以得到包含所述非瘤组织或由该非瘤组织形成的半流体。

如有涉及，本申请公开之前述方面中各相关术语的定义和描述也适用于此方面。

在一个实施方案中，所述半流体化处理包括以下之一种或多种：液体组织的粘稠化、液体组织的凝固化、非液组织的机械破碎、液体组织凝固物的机械破碎、非液组织的软化。在一个实施方案中，所述严重损伤处理包括以下之一种或多种：机械破碎、凝固化、超声损伤、热损伤、冻融损伤、照射损伤、化学损伤。

在制备根据本申请公开的疫苗的方法中，在提供非瘤组织时，可将相应组织来源进行分离。在本发明的范围中，所述分离包括液体组织分离和非液体(固体或半固体)组织分离。液体组织分离是指获得液体组织的分离处理，例如抽取并获得正常血液，以及对抽取的正常血液进行浓缩获得浓缩血液。非液体组织分离包括例如从器官中抽取所需组织，或从包含所需组织的部分中剥离出不需要成分，其中所述不需要成分包括例如下述之一种或多种：脂肪、筋、膜、血管。

当所述非瘤组织为固体或半固体时，根据本申请公开的半流体化可以例如如下进行：将所述组织进行本申请公开的机械破碎，制备为包含非瘤组织的颗粒化组织。

当所述非瘤组织为液体时，根据本申请公开的半流体化可以例如如下进行：将所述组织进行本申请公开的凝固化处理，制备为包含非瘤组织的凝固化组织，或再进行本申请公开的机械破碎制备为包含非瘤组织的颗粒化组织。在本发明的范围内，术语“液体组织”是指无容器限制时具有流动性的组织，其包括例如血液、精液、唾液、液体工程组织等。

在根据本申请公开的方法中，所述非瘤组织可进行严重损伤处理以获得半流体，或将所述非瘤组织制备为半流体后再进行严重损伤处理，其中所述严重损伤处理选自本申请公开的以下处理之一种或多种：机械破碎、凝固化处理、热处理、冻融处理、照射处理、化学处理。

在一个实施方案中，在对非瘤组织进行流体化处理和严重损伤处理前或/和处理中加入本申请公开的活性成分。

在一个实施方案中，所述严重损伤处理包括机械破碎。例如，骨髄、肌肉块、肝、肺、心、固体工程组织等经机械破碎严重损伤。

在一个实施方案中，所述严重损伤处理包括热处理。例如，骨髄、肌肉块、肝、肺、心、固体工程组织等经加热灭活，或血液或血液/细胞制品组合物经加热凝固且严重损伤。

在一个实施方案中，所述严重损伤处理包括冻融处理。例如，骨髄、肌肉块、肝、肺、心、血液、细胞制品等经冻融严重损伤。

在一个实施方案中，所述严重损伤处理包括照射处理。例如，骨髄、肌肉块、肝、肺、心、血液、细胞制品等经照射严重损伤。

在一个实施方案中，所述严重损伤处理包括化学处理。例如，在骨髄、肌肉块、肝、肺、心等的机械破碎物，或血液等液体组织中，加入适量酸、碱或乙醇，以使相应的组织严重损伤。

在一个实施方案中，所述严重损伤处理包括凝固化处理。例如，血液或血液/细胞制品组合物经自凝固、热凝固或加入凝固剂凝固严重损伤。

在根据本申请公开的制备疫苗的方法中，经过以上步骤得到的半流体可进行分装，该分装物可作为制剂(优选为植入剂、更优选为注射剂)备临床使用，或进一步制备为冻干制剂(例如注射用粉针剂)备临床使用。

在本申请公开中，术语“注射剂”是指合乎药政当局注射剂标准的可通过针管给药的药物。注射剂包括全身用药注射剂(例如静脉注射剂)和局部用药注射剂(例如皮下给药注射剂、肌内给药注射剂、组织内给药注射剂等)。

在本发明的范围中，所述针管包括例如：常规注射器针管、常规穿刺针、常规植入针、常规灌注针。

在一个实施方案中，所述冻干制剂的制备工艺例如包括以下步骤：预冻干，在预冻温度约-45℃下保持4小时；升华干燥，其中升温速率为0.1℃/分钟、且升至-15℃时至少保持10小时；解吸附干燥，其是在30℃下保持6小时。该冻干制备物可与液体介质(例如水或含增粘剂的水溶液)混合后直接局部给药。

在根据本申请公开的制备疫苗的方法中，在提供所述非瘤组织的步骤之前，如果所述非瘤组织为带膜的半流体组织，例如骨髄、脊髄，则可任选地对该带膜组织进行去膜处理以提取所需要的组织。

如果所述非瘤组织为可加热软化的非液组织，例如皮、肠、管等，则任选地对这些组织进行脂肪等剥离去除处理。

基于在下文中更详细描述的研究，尽管具体机理尚待进一步研究，本发明的疫苗显示出快速治疗和后续治疗、短效与长效的有机统一，且对患者正常组织几无损害，从而达到安全、有效治疗疾病的药学效果。

实施例

通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为对本发明的限制。在以下实施例中，所有的试验动物均依照相关法规及行业自律进行。如无特殊说明，所有试验均按常规方法进行。

以下具体实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中所用的部分添加剂列于表1中。

表1

在本发明中，L-氨基酸均简写为氨基酸(例如L-精氨酸均简写为精氨酸)。以下实施例中所用的实验动物均为通过专业实验动物公司购入，均为SPF(Specific PathogenFree，无特定病原体)级动物。以小鼠为例，共有5种：BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠、CB6F1小鼠、CC3HF1小鼠、裸小鼠，其中：CB6F1小鼠为BALB/c×C57BL/6杂交F1代雌性小鼠(表型为H-2^{b /d})，CC3HF1小鼠为BALB/c×C3H杂交F1代雌性小鼠(表型为H-2^d/k)、裸小鼠为裸基因(nu)导入BALB/c小鼠获得的突变系(BALB/c–nu)小鼠。小鼠均为6-8周龄健康雌性、体重17.5-20.5g。除非另有说明，在以下实施例中，BALB/c小鼠被简写为B鼠，C57BL/6小鼠被简写为C鼠。

实验动物器官和组织均为通过实验动物公司购入或用实验动物依规作常规制备，包括：血液、骨髓、脊髓、皮、肠、胃、肉、胰腺、脾、肝、肺、软骨。人胎盘、人脐带从法规规定的处置机构合法获得。

在以下实施例中，除非另有说明，皮下移植瘤动物试验均依据药管当局颁发的试验指南、按常规的实体瘤细胞皮下接种方法进行。除非另有说明，实体瘤长至所需体积(例如小鼠荷瘤30-500mm³)则为建模成功，然后采用PEMS 3.2软件(四川大学华西公共卫生学院编制)随机分为若干个实验组，每组6只动物。试验观察、测量和分析的项目，包括一般状态、体重、摄食量、动物移植物抗宿主病、实体瘤体积、瘤重、生存时间等。

实体瘤体积计算公式如下：

实体瘤体积(V)＝l/2×a×b²，其中a表示实体瘤长，b表示实体瘤宽。

实体瘤生长抑制率(本发明中简记为抑瘤率)计算公式如下：

抑瘤率Y(％)＝(CW-TW)/CW×100％，其中TW为研究组的平均瘤重；CW为阴性对照组的平均瘤重。

动物移植物抗宿主病的观察项目及评分如下表2所示。

表2移植物抗宿主病评分

观察指标	0分	1分	2分
				体质量减轻	<10％	10％～25％	>25％
活动能力	正常	减弱	静止不动
				皮毛	正常	轻度混乱	色度差，混乱
皮肤完整度	正常	脚趾、尾部轻度蜕皮	严重脱毛
				姿势	正常	轻度弓背	严重弓背向上

每只动物评分为5项得分之和，最高10分，最低0分。

移植物抗宿主率计算公式如下：

抗宿主率Z(％)＝(TP-CP)/10×100％，其中TP为研究组移植物抗宿主病评分的平均值；CP为阴性对照组移植物抗宿主病评分的平均值；10为每只动物移植物抗宿主病评分的可能最高值。

在以下实施例中，实验结果(例如瘤重)采用均数±标准差(x±s)表示，两个实验动物组与组均数之间的差别采用统计学软件SPSS 19.0软件进行显著性检验来比较，检验选用统计量t来进行，检验水准α＝0.05，P<0.05表示差异有统计学意义，否则无统计学意义。

在本发明的范围內，A药和B药的组合物记为B/A。以下实施例中，除非另有说明，A药和B药分别为包含非瘤组织的半流体和活性组分。除非另有说明，A、B、A/B的药效均为抑瘤率。改善抗肿瘤药物的药效一直是世界最大的医药难题。哪怕百分之几的药效提高也难之又难，以致于联合用药的理论预期通常不高，而一旦实现就意义重大。药物联合使用产生的药效，理论上可依据于q判断进行：

q＝实际合用效应/理论单纯相加预期效应。

当q＝1时，实际合用效应符合理论预期，显示为相加作用；当q<1时，实际合用效应弱于理论预期，显示为拮抗作用；当q>1时，实际合用效应超理论预期，显示为协同作用。

本申请公开中使用的q计算基于Burgi法(Burgi Y.Pharmacology；Drug actionsand reactions.Cancer res.1978，38(2)，284-285)的金正均改进法(金正均，合并用药中的相加，中国药理学报1980；1(2)，70-76)：

q＝E_A+B/(E_A+E_B-E_A·E_B)，

其中E_A+B为A药和B药实际合用效应，E_A为A药单用效应，E_B为B药单用效应，(E_A+E_B-E_A·E_B)为A药和B药理论单纯相加预期效应。为了更符合动物实验中的实际误差范围，他进一步用q＝1±15％代替q＝1作为相加作用的判定式。

文献中常见的另一种抗肿瘤联合用药药效判断方法，基于显著性检验(例如p判断)。在以下抗肿瘤动物实验中，将既合乎q判断又合乎p判断的组合物的药学效应(抑瘤率)判断为实际合用效应与理论预期之间的明显关系：

1)当0.85≤q≤1.15、以及E_A+B与E_A之间或E_A+B与E_B之间的差异无统计学意义(p≥0.05)，则判断为相加作用或未超预期的作用；

2)当q<0.85、以及E_A+B与E_A之间和E_A+B与E_B之间的差异有统计学意义(p<0.05)，则判断为明显拮抗作用；

3)当q>1.15、以及E_A+B与E_A之间和E_A+B与E_B之间的差异有统计学意义(p<0.05)，则判断为明显协同作用。

实施例1：疫苗的制备

以下实施例中，所用非瘤组织选自以下组之一种或多种：

1).自动物提取的天然组织。例如肌肉、血液、脊髄；

2).包含细胞和细胞间质的动物天然组织组分。例如，动物天然组织(例如血液)的细胞富含组分(例如血细胞比容≥45％、优选为55％-86％的血细胞浓缩血液)；

3).包含细胞和细胞间质的工程组织(例如血细胞和血漿构成的工程血液)。

1、包含非瘤组织的半流体以及疫苗的制备

通过本发明公开的方法，可以制备本发明的半流体以及包含该半流体的疫苗。下表列举了本实施例制备的部分包含非瘤组织的半流体(制备物编号)、用以制备它的优选组织、主要制备步骤、以及制备所达到的作用和其结节性。

表3

细胞比容：半固体组织的细胞比容由相关动物实验公司的兽医提供，各种血液的细胞比容按血常规测定方法测定(例如使用全自动血液细胞分析仪BC 5000)。例如，43％细胞比容的小鼠血液中的细胞浓度为11×10⁹个细胞/ml。

作用：A表示半流体化的有无(+为有)，B表示严重损伤的有无(+为有)。

结节：表示能否在注射处形成半流体结节(+为能)，具体如下：将100μl上表中的制备物注射至BALB/c小鼠左腋皮下形成结节，且该结节在食指和拇指掐压下可产生不可逆形变。除半流体粘稠物(X25)为0.1-0.5日外，其它半流体结节的皮下半消失期为1-30日。当细胞悬浮液的细胞比容≥70％时，其转化为半流体粘稠物。

小鼠：表中的小鼠均为BALB/c小鼠。

以下列出本发明的半流体的制备试验的几个实施例。

实施例1a：从含膜猪脊髄经组织提取(穿刺提取或从解剖剥离除去外膜)所获猪脊髄组织20g，即为上表中可注射半流体制备物X1。

将X1置于杯中并加可透气盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸30分钟，便获得上表中制备物X2。

实施例1b：将20g取自小鼠的瘦肉块经组织提取(剥离除去脂肪、膜、筋、血管)，所获小鼠肌肉组织为半固体组织，然后将其置于搅拌机中破碎(转速3000-10000转/分、总时间1-3分钟)，便获得横截面平均尺寸小于1mm×1mm的、肉眼可辨的肌肉组织颗粒(上表中制备物X5)。剪切破碎转速和时间可如此没置，以致于所获颗粒的横截面平均尺寸为≥100nm，优选为500nm-0.8mm或1μm-0.8mm。制备物X5可在压力下产生不可逆变形，是为半流体。

进一步将X5置于杯中并加可透气盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸10分钟，便获得上表中制备物X6。

进一步将X5置于塑料袋中密封好，放入液氮(低于-80℃)中30分钟冷冻，然后在37℃解冻融化，此冷冻-融化可进行一次或多次，便获得上表中制备物X7。

进一步将X5置于塑料袋中密封好，放入超声仪(温度5-25℃、工作频率10-30kHZ、)中处理5-10分钟，便获得上表中制备物X8。

使用与X5制备相同的方法，可分别进行上表中制备物X3、X9、X10、X11、X20和X21的制备。

使用与X6制备相同的方法，可进行上表中制备物X4的制备。

实施例1c：将20g取自猪背的皮块经组织提取(剥离除去脂肪)，所获皮组织为半固体组织，然后置于杯中并加可透气盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸120分钟，再趁热置于搅拌机中剪切破碎(转速3000-10000转/分、总时间1-3分钟)，便获得上表中制备物X12。X12加热(例如60-100℃)为半流体，可分装至注射器，在加热(例如60℃)时即可作为可注射疫苗使用。

实施例1d：处死一只新西兰免并取15ml免血，在室温下静置30分钟，便获得自凝固血液(上表中X13)。

实施例1e：处死一只新西兰免并取15ml免血于预置抗凝剂枸橼酸钠的杯中，慢搅拌均匀后将杯加可透气盖，再放在蒸汽(约100℃)中蒸20-50分钟，便获得热凝固血液(上表中X14)。

使用与X14制备相同的方法，可分别进行上表中制备物X15和X16的制备。

实施例1f：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)，混合在杯中获得约6ml血液，将杯放入超声仪(温度5-25℃、工作频率10-30kHZ、)中处理1-30分钟，再将杯加可透气盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸20分钟，便获得上表中制备物X17。

实施例1g：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)，加入预置凝血剂(例如终浓度10-100U/1ml的凝血酶和5-25mmol/L的氯化钙)的杯中混合均匀，静置30分钟后获得半固体凝固物，再经搅拌破碎(转速3000-10000转/分、总时间1-3分钟)便获得上表中制备物X18。

实施例1h：从多只小鼠眼眶分别取血，离心去除40％血清后加入杯中，再将杯加可透气盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸20分钟，便获得上表中制备物X19。

使用人血液通过相同制备便获得上表中制备物X20。

实施例1i：利用穿刺针在猪后腿上进行肌肉组织取样，然后将高度破坏的肌肉组织抽入注射器针筒，便获得上表中制备物X23。

实施例1j：利用抽血针在马耳上抽出约10ml血液，然后取小针头将盛有血液的针筒竖立在微波炉中加热1分钟，便获得上表中制备物X24。

实施例1k：从多只小鼠眼眶分别取血，离心去除45％血清后便获得上表中制备物X25。

实施例1l：将4g人血浆与6g取自脱白细胞滤器中的人白细胞沉淀混合，再将杯加可透气盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸10分钟，便获得上表中制备物X26。

这些制备物均为可注射半流体，分装至注射器后即可作为疫苗使用。

2、包含非瘤组织的半流体和活性成分的组合物以及疫苗的制备

本发明的抗实体肿瘤疫苗可包含非瘤组织的半流体作为抗原和抗肿瘤活性成分，两者可具有协同作用，其中所述活性成分包括生物制品和/或抗肿瘤化疗药物。

化疗药物和绝大多数生物制品通过商业途径获得(例如表1)。细胞制品在实验室制备。例如，按照现有技术抽取并获得正常血液，再通过离心分离获得白细胞、红细胞、血小板。又例如，按照现有技术从动物脾经红细胞裂解去除处理后获得淋巴细胞：将动物处死后取脾并温和破碎，再分别加入无血清DMEM培养液、红细胞裂解液(0.0075％氯化铵/0.0026％Tris除菌水溶液解并稀释至500mL)，温和搅拌后静止5钟，进行离心洗涤3次(离心条件为1 000rpm/min，沉淀重悬液为无血清DMEM)，最后获得淋巴细胞沉淀。

本实施例所用肿瘤抗原按如下方法制备：将肿瘤细胞液(10⁸-10⁹个细胞/ml)进行常规的冻融灭活处理(放入低于-80℃液氮中30分钟，然后在37℃解冻融化，此冷冻-融化进行3次)后，经常规的肿瘤细胞移植瘤实验验证为不致瘤，即可用作肿瘤抗原，包括自各自肿瘤细胞液获得的以下肿瘤抗原包括：肉瘤抗原(S180细胞)、肝癌抗原(H22细胞)、结肠癌抗原(CT26细胞)、乳腺癌抗原(4T1细胞)、黑色素瘤抗原(B16细胞)、肺癌抗原(LLC细胞)。

通过本发明公开的制备方法，在非瘤组织半流体化或/和严重损伤处理前、中、后加入活性成分并适当混合，便制备出本发明的包含非瘤组织的半流体和活性成分的疫苗。下表列举了本实施例制备的部分组合物半流体(制备物编号)、用以制备它的非瘤组织和活性成分、主要制备步骤、以及制备所达到的作用和其结节性。

表4

作用：A表示半流体化的有无(+为有)，B表示严重损伤的有无(+为有)。

结节：表示能否在注射处形成半流体结节(+为能)，具体如下：将100μl上表中的制备物注射至BALB/c小鼠左腋皮下形成结节，且该结节在食指和拇指掐压下可产生不可逆形变。此外，上述半流体结节的皮下半消失期为1-30日。

小鼠：表中的小鼠均为BALB/c小鼠。

混合搅拌：在本实施例中，除非另有说明，混合搅拌为机械搅拌(转速10-10000转/分、总时间1-3分钟)，其可造成组织的机械破碎和机械损伤。

以下列出本发明的包含组织和活性成分的半流体的制备试验的几个实施例。

实施例1m：将4.9g从含膜猪脊髄经组织提取(穿刺提取或从解剖剥离除去外膜)所获猪脊髄组织与0.1g多西紫杉置于搅拌机中搅拌(转速1000-2000转/分、总时间1-3分钟)，便获得上表中Y1(2％多西紫杉/98％猪脊髄半流体组合物)。

进一步将该Y1置于杯中并加可透气盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸20-50分钟，便获得上表中的Y2。

使用与Y1制备相同的方法，可进行上表中制备物Y3的制备。

使用与Y2制备相同的方法，可分别进行上表中制备物Y4、Y5的制备。

实施例1n：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合，将4.9g该血液与0.1g5-Fu在杯中搅拌均匀，再对杯加可透气盖，放入蒸汽(约100℃)中蒸5-50分钟，便获得上表中制备物Y6。

使用与Y6制备相同的方法，可分别进行上表中制备物Y7、Y8、Y9的制备。

实施例1o：将4.95g从含膜猪脊髄经组织提取(穿刺提取或从解剖剥离除去外膜)所获猪脊髄组织与0.05g CpG ODN置于搅拌机中搅拌(转速1000-2000转/分、总时间1-3分钟)，便获得1％CpG ODN/99％猪脊髄半流体组合物(制备物Y10)。

进一步将该Y10置于杯中并加可透气盖，放在水浴(约60℃)中加热5-50分钟，便获得热处理1％CpG ODN/99％猪脊髄半流体组合物(制备物Y11)。

使用小鼠肌肉组织和与Y10制备相同的方法，可制备1％CpG ODN/99％小鼠肌肉半流体组合物(制备物Y12)。

使用小鼠肌肉组织组织和与Y11制备相同的方法，可制备热处理1％CpG ODN/99％小鼠肌肉半流体组合物(制备物Y13)。

实施例1p：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合，将5g该血液与500万单位α干扰素在杯中搅拌均匀，再对杯加可透气盖，放入蒸汽(约100℃)中蒸20-15分钟，便获得500万单位α干扰素/5g小鼠血液半流体组合物(制备物Y14)。

当使用其它动物的血液、或使用其它细胞因子时使用相同的方法，可分别制备细胞因子/血液半流体组合物(例如Y15)。

实施例1q：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合，将4.95g该血液与0.05g抗PD-1抗体在杯中搅拌均匀，再对杯加可透气盖，放入蒸汽(约100℃)中蒸20-15分钟，便获得1％抗PD-1抗体/99％小鼠血液半流体组合物(制备物Y16)。

当使用其它动物的血液、或使用其它免疫调节类抗体时使用相同的方法，可分别制备免疫调节类抗体/血液半流体组合物。

实施例1r：将0.6g小鼠淋巴细胞沉淀和0.4ml小鼠血液加入杯中温和混合，再将杯加可透气盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸20分钟，便获得上表中制备物Y17。

实施例1s：将6g人血液与4g取自脱白细胞滤器中的人白细胞沉淀混合，再将杯加可透气盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸10分钟，便获得上表中制备物Y18。

实施例1t：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合，将1.5ml该血液与1ml肝癌细胞冻融灭活液(10⁹个细胞/ml)在杯中搅拌均匀，再对杯加可透气盖，放入蒸汽(约100℃)中蒸5-50分钟，便获得上表中制备物Y19。

实施例1u：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合，将1.5ml该血液与1ml肺癌细胞液(10⁹个细胞/ml)在杯中搅拌均匀，再置于塑料袋中密封好，放入液氮(低于-80℃)中30分钟冷冻，然后在37℃解冻融化，此冷冻-融化可进行一次或多次，便获得上表中制备物Y20。

这些制备物均为可注射半流体，分装至注射器后即可作为疫苗使用。

实施例2：包含非瘤组织的半流体作为实体肿瘤抗原应用的必要条件研究

免疫系统是一个多层次网络系统。细胞内生化网络、细胞间传输网络和器官内细胞传输网络相互作用、关系复杂。外源性物质在什么样的条件下才能足够地激活至少某一个层次并诱发整个免疫系统反应，使得肿瘤特异性免疫活性成分增殖，并通过全身循环足量迁移到肿瘤局部并能发挥其效应功能，可能是其能否被应用为疫苗抗原的关健问题。为此，以下实验研究了本发明的技术方案之中的必要条件。

在一个试验中，试验动物为BALB/c小鼠，建模细胞为肉瘤S180细胞，以1×10⁶个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物(瘤体平均体积为342mm³)随机分为13个试验组(如下表所示)。试验组分为2个系列，尾静脉注射系列有1个阴性对照组(01组)和2个研究组，皮下注射系列有1个阴性对照组(02组)和10个研究组。阴性对照物均为生理盐水，研究药物如下表所示。研究药物的制备如下：

C小鼠为C57BL/6小鼠，B小鼠为BALB/c小鼠。小鼠肌肉半流体为以小鼠肉为原料按实施例1中的制备物X5的制备方法制备的半流体。4种小鼠血液制备如下：天然血液(血细胞比容42％、431％)为取自小鼠的加有抗凝剂(枸橼酸钠)的新鲜血液。分出6ml天然血液离心，取出3ml血清，把离心管中剩下部分混匀为小鼠浓缩血液(血细胞比容68％)。将2ml血清与2ml天然血液混匀为小鼠稀释血液(1)(血细胞比容22％)。再将剩下的1ml血清与2ml天然小鼠血液混匀为小鼠稀释血液(2)(血细胞比容33％)。各血液的血细胞比容按常规方法测定。各小鼠血液半流体为相应的小鼠血液经加热凝固形成的半流体(分别按实施例1中的制备物X16、X19的制备方法制备)。小鼠血液半固体为小鼠血液中加入猪凝血酶(终浓度100U/1ml)和氯化钙(终浓度20mmol/L)形成的凝胶(半固体)，将其切割为体积约400mm³的小块使用。

各实验组均如下表所示用药方式(皮下注射为在左腋皮下注射)用药1次，每次用药400μl/只。研究组10通过手术将半固体移植入小鼠左肋皮下。其它各实验组的药物均通过注射器注射。在该实验中，对研究组1、3、5和7-11的给药可被视作同种异基因给药模型(可以代表99％以上的同种异体给药)，对其它研究组的给药可被视作全相合给药模型和自体给药模型。给药后第14日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表5。

表5

注：+为形成结节，-为不形成结节；x为瘤重平均值(g，以下表皆相同)。

在上表中，研究组1、2、3、4的抑率率均低，它们与各自的阴性对照组之间的瘤重差异均无统计学意义(分别为P＝0.9332>0.05、P＝0.5340>0.05、P＝0.3788>0.05、P＝0.5458>0.05)。该结果说明，无论是同基因血液还是异基因血液、是静脉给药还是皮下给药，液态血液均未显示出明显的肿瘤负荷减小效应。更一般地，液体组织可能难以优选作为能够明显减小瘤体的实体瘤疫苗抗原。

实际上，通常认为对肿瘤患者行同种异基因输血会引起白细胞介素-2、白细胞介素-10和白细胞介素-24分泌增加，抑制辅助T淋巴细胞分泌白细胞介素-2，使B淋巴细胞的刺激应答和抗体生成减少，产生细胞免疫的负向调节。于是，异基因血液被看作是免疫效应细胞的潜在抑制剂，也是免疫抑制细胞的刺激剂，这些免疫抑制作用可使有益的抑瘤免疫功能下调。可是，在上表中，研究组5和6均显示出较高的抑瘤率。它们各自与阴性对照组之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.0004<0.05、P＝0.0002<0.05)。更进一步，研究组5和3之间(P＝0.0005)、5和1之间(P＝0.0004)、6和4之间(P＝0.0001)、6和2之间(P＝0.0002)的瘤重差异也都有统计学意义(P<0.05)。而研究组5和6之间的瘤重差异无统计学意义(P＝0.1375>0.05)。以上结果说明，血液(更一般地，液体组织)能否作为明显减小瘤体的实体瘤疫苗抗原与其状态(是液体还是半流体)的相关性明显高于其基因异同。

此外，研究组10的抑瘤率小于研究组9，而研究组10和9之间的瘤重差异有统计学意义(P＝0.0147<0.05)。该结果说明，作为明显减小瘤体的实体瘤疫苗抗原的组织的优选状态为半流体，而非半固体。此外，半流体相较半固体还具有临床应用的较高操作便利性和较高患者顺应性。

在C小鼠血液半流体研究组中，抑瘤率自大而小的排列次序为：研究组5、研究组9、研究组8、研究组7。其中，研究组7和3之间(P＝0.2139)的瘤重差异无统计学意义(P>0.05)，而研究组8、9、5分别和7的瘤重差异有统计学意义(分别为P＝0.0107<0.05、P＝0.0227<0.05、P＝0.0008<0.05)。此外，研究组11(小鼠肌肉组织比容高于60％)的抑瘤率分别与研究组和6相当，它们之间的瘤重差异无统计学意义(P＝0.5241>0.05)。该结果说明，血液半流体(更一般地，包含组织的半流体)能否作为明显减小瘤体的实体瘤疫苗抗原与其所含细胞的浓度(>22％、优选为≥33％)的相关性高于其组织异同。

除了以上实验中研究的自动物提取的天然组织、包含细胞和细胞间质的动物天然组织组分外，以下实验研究了包含细胞和细胞间质的工程组织作为实体瘤抗原的必要条件。

在一个试验中，试验动物为BALB/c小鼠，建模细胞为乳腺癌4T1细胞，以1×10⁶个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物(瘤体平均体积206mm³)随机分为6个试验组(如下表所示)。试验组分为1个阴性对照组(0组)和5个研究组。阴性对照物均为生理盐水，研究药物如下表所示。研究药物的制备如下：

人白细胞沉淀、人血浆为按照现有技术抽取并获得正常血液后通过离心分离获得。人白细胞液为人白细胞沉淀(血细胞比容70.5％)加入等体积生理盐水获得的血细胞比容为35％的稀释液体。50％人血浆为人血浆和等体积生理盐水的混合物。人白细胞/人血漿为人白细胞沉淀加入等体积血浆的混合物(血细胞比容为35％)。血细胞比容按常规方法测定。人白细胞/人血漿半流体为以人白细胞/人血漿经加热凝固形成的半流体(按实施例1中的制备物Y9的制备方法制备)。人白细胞/人血漿半固体为上述人白细胞/人血漿中加入猪凝血酶(终浓度100U/1ml)和氯化钙(终浓度20mmol/L)形成的凝胶(半固体)，将其切割为体积约400mm³的小块使用。

各实验组均在左腋皮下用药一次，每次用药200μl/只。研究组5通过手术将半固体移植入小鼠左肋皮下。其它各实验组的药物均通过注射器注射。给药后第14日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表6。

表6

组号	研究药物	形态	结节	瘤重(x±s)	抑瘤率
						0	生理盐水	液体	-	0.92±0.18g	-
1	50％人血漿	液体	-	0.89±0.11g	3％
						2	人白细胞液/人血漿	液体	-	0.84±0.19g	8％
3	人白细胞液	液体	-	0.87±0.10g	5％
						4	人白细胞/人血漿半流体	半流体	+	0.61±0.10g	43％
5	人白细胞/人血漿半固体	半固体	+	0.75±0.26g	19％

注：+为形成结节，-为不形成结节；x为瘤重平均值。

在上表中，研究组1、2、3的抑瘤率均低。在研究组1、2、3之间，研究组2的q判断(q＝1.13)显示出相加作用，然而研究组2与1之间、和2与3之间的瘤重差异均无统计学意义(分别为P＝0.0931>0.05、P＝0.3762>0.05)，于是组2显示的相加作用并不明显。该结果说明，白细胞(甚至超高浓度异种白细胞)液体、人血浆液体、以及白细胞/人血浆组合物液体均未显示出明显的肿瘤负荷减小效应。

然而，研究组2、4、5的抑瘤率相差较大。研究组4的药效不仅超过研究组2和研究组5的药效，甚于显示出超过这两组加和作用的药效(q＝1.69>1.15)，且研究组4与2之间、4与5之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.0271<0.05、P＝0.0472<0.05)。该结果说明，既使组成相同、浓度相同、用药方式相同，只须形态结构不同(液体、半流体、半固体)，包含细胞(例如血细胞)和细胞间质(例如血浆)的组织便有可能显示出明显不同的肿瘤负荷减小效应。半流体显示出明显超过同组成液体、半固体、甚至液体和半固体效应之和的理论预期药效。这显示出半流体可能与液体和半固体具有完全不同的免疫作用机理。

根据上述研究及更多的类似研究，本发明的实体瘤疫苗抗原的必要条件为：其组成和形态使得其在用药处形成激活有效免疫应答的半流体结节。该必要条件似乎就是要在体内局部形成类似于瘤体组织、又更容易被机体有效识别(例如高度偏离天然状态或高度损伤)并激发针对它以及与它类似瘤体的有效特异性免疫响应。于是，本发明的基本技术方案为：

包含非瘤组织的半流体作为实体瘤疫苗抗原应用；

上述半流体中所含非瘤组织远离其天然状态、优选为经过严重损伤的组织。严重损伤的组织通常包含严重损伤的细胞(例如失去增殖活性的细胞)、以及严重损伤细胞的释放物(例如细胞膜破坏释放出的细胞内容物)；

上述包含非瘤组织的半流体优选为选自以下组之一种或多种：包含液体组织的半流体粘稠物、包含液体组织的半流体凝固物、包含非液组织的破碎物、包含液体组织凝固物的破碎物、包含非液组织的软化物，更优选为选自以下组之一种或多种：包含液体组织的半流体凝固物、包含非液组织的破碎物、包含液体组织凝固物的破碎物。这些半流体所包含的组织高度偏离天然状态或高度损伤；

上述包含非瘤组织的半流体包含在所述疫苗的瘤区用药和/或瘤外局部用药中；

上述包含非瘤组织的半流体为半流体植入剂、优选为半流体注射剂。其中所述半流体注射剂为可以以半流体方式通过常规注射系统直接用药的注射剂，而半固体移植物则往往通过手术植入、或以流体(液体)方式通过常规注射系统用药后在用药处形成半固体(例如凝胶化)结节。

此外，所述半流体所包含的非瘤组织的细胞比容为>22％(或细胞浓度为>5.6×10⁹个细胞/ml)、优选为33％-86％(或细胞浓度为8.4×10⁹-22×10⁹个细胞/ml)、45％-86％(或细胞浓度为11.5×10⁹-22×10⁹个细胞/ml)、或55％-86％(或细胞浓度为14.0×10⁹-22×10⁹个细胞/ml)。在其中所述半流体粘稠物组合物中，所述细胞和组合物的量比(v/v)为≥70％(或细胞浓度为≥17.9×10⁹个细胞/ml)、优选为70％-86％(或细胞浓度为17.9×10⁹-22×10⁹个细胞/ml)。

以下实验在基本技术方案基础上对技术方案进一步优选。

在一个试验中，试验动物为BALB/c小鼠，建模细胞为肉瘤S180细胞，以1×10⁶个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物(瘤体平均体积313mm³)随机分为5个试验组(如下表所示，包括包括1个阴性对照组(0组)和4个研究组)。阴性对照物为生理盐水，研究药物为实施例1的制备物X16。各实验组均在左腋皮下用药1次，用药量如下表所示。用药后24小时测定用药处形成的凸出结节大小，并按上述瘤体计算方式计算结节体积。用药后10天对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表7。

表7

注：x为瘤重平均值。

在类似试验中，常规疫苗的量效关系敏感区通常≤100μl。然而在上表中，研究组1和0之间的瘤重差异无统计学意义(P＝0.2262>0.05)。研究组2和1之间用药量的成倍提高也未出现抑瘤率明显提高，它们之间的瘤重差异无统计学意义(P＝0.8565>0.05)。在这种情况下，通常就可能因为缺少量效关系而放弃进一步的研究了。出人意料的是，当用药量达到200μl后，抑瘤率突然升高。研究组3和2的瘤重差异有统计学意义(P＝0.0140<0.05)，研究组4和2的瘤重差异也有统计学意义(P＝0.0048<0.05)，显示出200μl是一个阈值、而非偶然值。根据该结果及一些其它结果，本发明的疫苗显示出与常规疫苗大不相同的量效关系敏感区，很可能具有大不相同的免疫作用机理。

使用实施例1中的其它制备物(例如X7-X13等)，也可获得类似结果。

根据上述研究及更多的类似研究，本发明的所述包含组织的半流体的组成和形态使得其在用药处形成的半流体结节的总体积为>100mm³，优选为≥200mm³、更优选为≥400mm³。为满足该条件，本发明的半流体的单次施用总量为>0.1ml，优选为≥0.2ml或、优选为0.20-25ml，更优选为≥0.40ml或0.4-25ml。

在以上条件下，以下实施例对技术方案进行了进一步优选。

实施例3：本发明半流体抗原的特异性免疫原研究及组织优选

在一个试验中，试验动物为CB6F1小鼠，建模细胞为肝肿瘤H22细胞，以2×10⁶个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物中，一部分用于制备瘤体颗粒半流体，另一部分(瘤体平均体积213mm³)随机分为10个试验组(如下表所示，包括1个阴性对照组(0组)和9个研究组)。阴性对照物为生理盐水，8个研究药物如下表所示。研究药物的制备如下：

CB6F1小鼠浓缩血液和CB6F1小鼠浓缩血液半流体的制备与实施例2中的制备相同。CB6F1小鼠肌肉块为一体积约400mm³的块状小鼠肉。4种小鼠肌肉颗粒半流体和CB6F1小鼠瘤组织颗粒半流体的制备如下：分别剥取4种小鼠的肉块和荷肝癌CB6F1小鼠的瘤体，再分别将它们置于搅拌机中破碎(转速1000-10000转/分、总时间1-3分钟)，各自获得横截面平均尺寸小于1mm×1mm的、肉眼可辨的组织颗粒(按实施例1中的制备物X5的制备方法制备)。猪肌肉颗粒半流体为实施例1中的制备物X4。马血液半流体为实施例1中的制备物X24。

各实验组均在左腋皮下用药1次，用药400μl/只。研究组3通过手术将小鼠肌肉块移植入小鼠左肋皮下。其它各实验组的药物均通过注射器注射至CB6F1小鼠左肋皮下。在该实验中，对研究组1-4和8的给药可被视作全相合给药移植模型或自体给药模型，对研究组5的给药可被视作同种半相合给药模型，对研究组6的给药可被视作同种异基因给药模型，对研究组7的给药可被视作异种给药模型。给药后第14日对动物进行移植物抗宿主病评分测量，然后处以安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表8。

表8

注：x为瘤重平均值。

通常认为，分子形态的抗原(例如全肿瘤细胞抗原、异源糖蛋白抗原、异基因细胞抗原、亚单位抗原)有着与正常机体明显不同的独特结构成分(例如病原体相关分子模式，Pathogen-associated molecμlar patterns，PAMPs)，而机体内的天然免疫系统细胞上存在可识别这些结构成分(例如PAMP)的模式识别受体(Pattern-recognition receptors，PRRs)，PRRs被刺激并启动适应性免疫应答去攻击相同或类似的结构成分(例如肿瘤细胞中的交叉抗原成分)。于是，异源或异基因移植物通过其抗原分子(例如异源糖蛋白、异基因细胞、等等)介导的较高的移植物抗宿主反应可以导致较高的移植物抗肿瘤反应性。

在上表中，研究组2和1之间比较，其抗宿主病评分无统计学意义(P＝0.3016>0.05)，说明其移植排斥免疫原性(针对宿主正常细胞和肿瘤细胞)相当，然而其瘤重差异(针对宿主瘤体)却有统计学意义(P＝0.0023<0.05)。研究组4和3之间比较，其抗宿主病评分有统计学意义(P＝0.0034<0.05)，说明其移植排斥的免疫原性(针对宿主细胞)明显不同，然而瘤重差异(针对宿主瘤体)却无统计学意义(P＝0.8408>0.05)。根椐这些结果，包含组织的半流体作为实体瘤疫苗抗原的表现与其抗宿主反应没有明显的正相关性。于是，在本发明公开的必要条件下，本发明的组织半流体的抗原性显示出明显不同于现有技术中的移植物，后者的抗肿瘤免疫原性往往与其移植排斥免疫原性正相关。

在上表中，小鼠肌肉颗粒半流体的移植物抗宿主病评分(抗宿主率)由大至小依次为研究组7、研究组6、研究组5和研究组4，大致反应了移植物抗宿主病与异分子抗原(异源抗原和异基因抗原)的相关性。例如，研究组7和4之间的抗宿主病评分有统计学意义(P＝0.0040<0.05)。然而，研究组7和4之间的瘤重差异却无统计学意义(P＝0.6085>0.05)。通常认为，在常规移植物的免疫反应中，异种抗原性远高于同基因抗原性。在上表中，在本发明公开的必要条件下，尽管研究组9(含马血液)和2(含鼠血液)之间的移植物抗宿主病评分的差异确有统计学意义(P＝0.0005<0.05)，但它们之间的瘤重差异却无统计学意义(P＝0.7295>0.05)。

此外，本实验的一个初衷，是将CB6F1小鼠肌肉颗粒半流体作为CB6F1小鼠瘤体颗粒半流体的阴性对照物来研究的。然而在上表中，研究组8(药物组织富含瘤细胞)和研究组4(药物组织不含瘤细胞)的瘤重差异无统计学意义(P＝0.8375>0.05)。

使用实施例1中的其它制备物，也可获得类似结果。例如，在一个试验中，试验动物为BALB/c小鼠，建模细胞为乳腺癌4T1细胞，以1×10⁶个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。建模后14日，成功建模的荷乳腺瘤小鼠(瘤体平均体积为306mm³)随机分为8个试验组(如下表所示，包括1个阴性对照组和7个研究组)。阴性对照物为生理盐水，研究药物如下表所示，均选自实施例1的制备物。各实验组均在左腋皮下用药1次，用药400μl/只，用药后10天对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表9。

表9

组号	研究药物	所包含的组织	抑瘤率
				0	生理盐水	-	0
1	X10	猪肺	23％
				2	X11	猪肝	25％
3	X12	猪皮	21％
				4	X20	人胎盘	36％
5	X21	人脐带	37％
				6	X22	猪肌肉组织	33％
7	X23	猪血液	38％

本实施例的以上结果，进一步证实了本发明的包含组织的半流体具有不同于常规移植物(通常为流体、半固体或固体)的抗实体肿瘤免疫原性，后者的抗原性通常与其异分子(例如异基因抗原分子、异源抗原分子、等等)的抗宿主抗原性相关。而本发明的包含组织的半流体似乎具有与高度损伤的肿瘤组织相当的抗实体肿瘤免疫原性。

根据上述研究及更多的类似研究，对本发明的半流体抗原的技术方案进一步优选如下：本发明的半流体优选为其优势抗原性为抗所述实体肿瘤抗原性而非抗宿主抗原性的半流体，例如抑瘤率为≥抗宿主率、优选为≥150％抗宿主率的半流体。于是：

本发明的半流体的必要组成不包含瘤体组织，优选为选自非瘤体组织；

本发明的半流体的必要组成可以包含天然组织和/或严重损伤组织，优选为选自严重损伤组织。

本发明的半流体的必要组成不包含移植物抗宿主反应强烈的组织(例如富含异种糖蛋白抗原)，优选为选自移植物抗宿主反应不大的组织，例如以下组之一种或多种：并不富含异种糖蛋白抗原的异种组织、并不富含异基因抗原的同种组织，更优选为选自以下之一种或多种：低血管密度的异种组织、ABO血型相符或HLA相近的同种异体异基因组织、同种异体同基因组织、并不富含自身隐蔽抗原的自体组织。

在本发明公开的必要条件和优选条件下，本发明的半流体所包含的组织优选为：胎盘、脐带、肌肉、血液，更优选为：胎盘、脐带、血液。

根据以上结果以及对导致这些结果的免疫策略的初步分析，在本发明公开的基本技术方案(必要条件)下，本发明的优选技术方案中的半流体(形态的)抗原可以有别于现有技术中的分子形态的抗原(例如病原体抗原、常规移植物抗原、和异基因单一细胞抗原)，显示出具有与高度损伤的肿瘤组织相似的针对瘤体组织的特异性免疫原。众所周知，化疗药物的主要特征在其组成，而疫苗抗原的主要特征在其特异性免疫原。该免疫原很可能是因为其形成了一种类瘤体组织结节，但其半流体性和高损伤性(半流体中的组织远离其在天然器官中的状态)却又比瘤体组织更易被免疫系统识别，从而激发出针对其所仿生的瘤体的有效免疫应答。以下实验将对此进行进一步的研究。

实施例4：本发明半流体抗原的靶向研究及适应症优选

在一个试验中，试验动物为BALB/c小鼠，建模细胞为乳腺癌4T1细胞，以1×10⁶个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。建模后4日，成功建模的荷乳腺瘤小鼠(瘤体平均体积为43mm³)随机分组，并随机选出1个阴性对照组(01组)和2个研究组(1、2组)，其它组重新混合后分笼饲养。然后在建模后7日将荷乳腺瘤小鼠(瘤体平均体积为85mm³)随机组，并随机选出1个阴性对照组(02组)和1个研究组(3组)，其它组重新混合后分笼饲养。然后分别在建模后14、17日分别进行类似分组(如下表所示，分别为03组、4组和04组、5组)。

阴性对照物均为生理盐水，2个研究药物分别为BALB/c小鼠浓缩血液和实施例1的制备物X19。小鼠浓缩血液按实施例2中小鼠浓缩血液的制备方法制备。各实验组均在左腋皮下用药一次，用药400μl/只。用药后第14日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从各自的阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表10。

表10

注：x为瘤重平均值。

以异基因造血干细胞移植物(allo-HSCT，通常为液体)为例，其作为抗原介导的免疫响应的靶向无特异性，针对宿主健康细胞(移植物抗宿主病(GVHD))的同时亦可针对肿瘤细胞(例如抗白血病反应(CVL))。实际上，现有技术中的肿瘤疫苗抗原几乎都靶向肿瘤细胞及其中的结构成分(例如移植物的交叉抗原)，而非瘤体、尤其是较大瘤体。因而，它们尽管可以显示出对非实体肿瘤(例如白血病)的最好疗效，以及对较小实体肿瘤的较好疗效，对于较大瘤体的实体瘤则往往无能为力。在文献中，几乎所有的实体肿瘤疫苗研究均在建模后7日内(瘤体平均体积<100mm³)用药。在上表中，研究组1(液体药物)和2(半流体药物)均未显示有意义的抑瘤率，它们各自与阴性对照组之间的瘤重差异也无统计学意义(分别为P＝0.9068>0.05、P＝0.7146>0.05)。这样看上去，本发明的半流体会同绝大多数肿瘤疫苗抗原一样，或许会带来一些免疫学分子参数的有利变化，但不大可能显示出更直接更明显的肿瘤负荷减小效应。

出人意料的是，本发明的半流体抗原的效应与现有技术中的肿瘤疫苗抗原相反，居然在以上实验中随着所治疗瘤体的增长而升高。研究组4(初始瘤体平均体积301mm³)与03之间的瘤重差异有了统计学意义(P＝0.0005<0.05)，且其与研究组3(初始瘤体平均体积85mm³)之间的瘤重差异也有统计学意义(P＝0.0023<0.05)。而研究组5(初始瘤体平均体积407mm³)的抑瘤率甚至于比研究组4还高，且其与04之间的瘤重差异有统计学意义(P＝0.0001<0.05)，以及其与研究组3(瘤体平均体积85mm³)之间的瘤重差异仍有统计学意义(P＝0.0050<0.05)，说明该瘤体体积(>85mm³)并非一个偶然数据。

使用实施例1中的其它制备物，也可获得类似结果。

在一个试验中，试验动物为新西兰白兔(体重2.0～2.5kg，雌雄不限)，建模组织为经2次传代接种的兔ⅤX2瘤体组织。通过手术向动物右肺部植入瘤体组织细块(约1mm³/块、总量约500mm³/只)。建模成功的荷肺癌兔(接种后14天行CT检查，肿瘤直径6～13mm者)随机分为2个试验组(1个阴性对照组和1个研究组)，每组6只。阴性对照物为生理盐水，研究药物为取自加利福尼亚兔的血液按实施例1中的制备物X19方法制备的同种异基因浓缩血液半流体。各实验组均在左腋皮下用药3次，每7天1次，用药2ml/只。用药后第7日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，从阴性对照组计算出研究组的抑瘤率为27％。此外，研究组5只兔子在治疗后出现皮下可触硬结节。众所周知，这种结节通常是机体内局部急性炎症的并发症状。该结果进一步显示，本发明的半流体抗原似乎是作为类瘤体半流体结节抗原通过诱发瘤体急性炎症而靶向瘤体。

根据上述研究及更多类似研究的结果，本发明的半流体抗原不同于现有技术的其它抗原(尤其是能在血液中自由分布的分子形态的抗原)，还在于其靶向性、从而适应症不同。肿瘤抗原靶向肿瘤细胞，从而其应用的适应症与具体肿瘤种类相关。常规移植物(通常为半固体)或allo-HSCT(通常为液体)靶向细胞(正常细胞和肿瘤细胞)，从而其应用的适应症与肿瘤细胞的暴露难易(液体癌易，实体瘤难，瘤体越大越难)相关。

这些结果进一步加强了上述关于本发明半流体的特异性免疫原的分析抗原是一种瘤体仿生抗原的分析。一个可能的解释为：本发明的免疫策略，其必要条件模拟出瘤体而非肿瘤细胞的成分、形状、电荷、尺寸等三维特性，以及瘤体的四维动态重构现象(粘弹性的软物质)。于是，本发明的半流体抗原在本质上是一种类瘤体侵入组织，却又比瘤体更易被免疫系统识别从而激发出靶向其也靶向其所仿生的瘤体的有效免疫应答的新式抗原。当然，瘤体的有效破坏又可能次生地释放出肿瘤抗原并导致自体肿瘤疫苗。因而，本发明的半流体抗原的适应症，与瘤体体积相关，尤其是优选为较大而不是较小的瘤体体积，而对于瘤内具体是什么肿瘤细胞、其是否以分子形态与免疫系统作用(暴露性)的依赖性不强而对于瘤内具体是什么肿瘤细胞、、其是否以分子形态与免疫系统作用(暴露性)的依赖性不强。

按照这些结果，本发明的组合物中的包含组织的半流体作为抗原应用，其适用症优选为瘤体体积>85mm³、优选为≥200mm³、更优选为瘤体总体积≥400mm³的实体瘤。根据其适应症，本发明的半流体抗原的单动物给药量为≥0.2ml、优选为0.2-25ml或0.40-25ml。

本发明的半流体抗原的应用范围，于是具有较大的瘤细胞种类广谱性。除了上述实验中的肝癌、乳腺癌、肉瘤以外，以下实验进行了进一步证实。

在以下一个包括3个实验的实验系列中，试验动物和建模细胞分别如下所示。建模细胞分别在动物右侧腋部皮下进行常规的移植瘤建模。每个系列实验中成功建模的试验动物随机分为4个试验组，其中1个阴性对照组和3个研究组(A、B、C组)。阴性对照物为生理盐水，A、B、C组研究药物分别为实施例1中的制备物X20、X19和X25。各实验组均在左腋皮下注射用药1次，每次用药250μl/只。用药后第14日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从各系列的阴性对照组计算抑瘤率，实验结果示于以下。

1)、在结肠癌治疗中的应用

在一个试验中，试验动物为BALB/c小鼠，建模细胞为结肠癌CT26细胞(1×10⁶个细胞/只)，在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的荷瘤动物(瘤体平均体积203mm³)随机分为4个试验组(1个阴性对照组和3个研究组)。A、B、C组的抑瘤率均值分别为36％、31％、29％。

2)、在黑色素瘤治疗中的应用

在一个试验中，试验动物为C57BL/6小鼠，建模细胞为黑色素瘤B16细胞(1×10⁶个细胞/只)，在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的荷瘤动物(瘤体平均体积403mm³)随机分为4个试验组(1个阴性对照组和3个研究组)。A、B、C组的抑瘤率均值分别为41％、35％、33％。

3)、在肺癌治疗中的应用

在一个试验中，试验动物为C57BL/6小鼠，建模细胞为路易斯肺癌(LLC)(1×10⁶个细胞/只)，在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的荷瘤动物(瘤体平均体积532mm³)随机分为4个试验组(1个阴性对照组和3个研究组)。A、B、C组的抑瘤率均值分别为32％、31％、28％。

使用实施例1中的其它制备物，也可获得以上类似结果。

根据上述研究及更多的类似研究，本发明的半流体作为抗原、优选为作为半流体结节抗原或瘤体仿生抗原可以应用于广谱的实体瘤的治疗或/和预防疫苗制备。所述实体瘤包括例如乳腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、肠癌、口腔癌、胃癌、结直肠癌、支气管癌、喉癌、睾丸癌、阴道癌、子宫癌、卵巢癌、恶性黑色素瘤、脑瘤、肾细胞癌、等等。

实施例5：包含非瘤组织的半流体组合物的协同作用研究

本发明的半流体还可以是包含非瘤组织和抗实体肿瘤的活性成分的半流体组合物。本发明的包含非瘤组织的半流体作为抗原还包括作为抗实体肿瘤的活性成分的免疫增强抗原，其中所述免疫增强是指所述半流体与活性成分的组合物产生出高于组合物之任一单药单用的免疫疗效。该免疫疗效可以通过单一的免疫效应进行观察，也可以通过免疫-化疗综合的免疫效应进行观察(尤其是考虑到原位抗原的释放)。免疫协同效应以荷瘤小鼠为试验动物模型进行研究，化疗协同效应以荷瘤裸鼠为试验动物模型进行研究。

1、包含非瘤组织和生物制品的半流体组合物协同作用方案

在一个试验中，试验动物为BALB/c小鼠，建模细胞为乳腺癌4T1细胞，以1×10⁶个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物(瘤体平均体积236mm³)随机分为16个试验组(如下表所示)。试验组分为2个系列，尾静脉注射系列有1个阴性对照组(01组)和3个研究组，皮下注射系列有1个阴性对照组(02组)和11个研究组。阴性对照物均为生理盐水，研究药物如下表所示。研究药物的制备如下：

所用乳腺癌抗原为从按上述相同建模方法获得的荷乳腺癌小鼠的瘤体再经实施例1所述方法制备获得的乳腺癌细胞冻融灭活液(10⁹个细胞/ml)。4种小鼠血液制备如下：天然血液(血细胞比容41％)为取自小鼠的加有抗凝剂(枸橼酸钠)的新鲜血液。分出6ml天然血液离心，取出3ml血清，把离心管中剩下部分混匀为小鼠浓缩血液(血细胞比容68％)。将2ml血清与2ml天然血液混匀为小鼠稀释血液(1)(血细胞比容22％)。再将剩下的1ml血清与2ml天然小鼠血液混匀为小鼠稀释血液(2)(血细胞比容33％)。各血液的血细胞比容按常规方法测定。各乳腺癌抗原/小鼠血液为40％乳腺癌细胞冻融灭活液(10⁹个细胞/ml)和60％各小鼠血液的混合物。各乳腺癌抗原/小鼠血浆半流体为各乳腺癌抗原/小鼠血液经加热凝固形成的半流体(按实施例1中的制备物Y19的制备方法制备)。小鼠天然血液半流体为小鼠血液经加热凝固形成的半流体(按实施例1中的制备物X16的制备方法制备)。

在该实验中，对研究组的给药可被视作同种异基因给药模型(可以代表99％以上的同种异体给药)。各实验组均如下表所示用药方式(皮下注射均在左腋皮下注射)用药一次，每次用药400μl/只。给药后第14日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表11。

表11

结节：+为形成结节，-为不形成结节

*：x为瘤重平均值；小鼠血液半流体抑瘤率：根据相关实验，稀释小鼠血液的半流体的抑瘤效应小于100％小鼠血液的半流体

在上表中，在行静脉注射的研究组3、2、1之间，组合物组的q判断(q＝0.83<0.85)显示出拮抗作用，然而研究组3与1之间、3与2之间的瘤重差异均无统计学意义(分别为P＝0.7662>0.05、P＝0.9317>0.05)，于是组合物组未显示出明显拮抗作用。在行皮下注射的研究组6、5、4之间，组合物组的q判断(q＝0.79<0.85)显示出拮抗作用，然而研究组6与4之间、6与5之间的瘤重差异均无统计学意义(分别为P＝0.3274>0.05、P＝0.7771>0.05)，于是组合物组未显示出明显拮抗作用。该结果说明，液体组合物无论行静脉注射还是皮下注射，均未显示出协同作用、甚至未显示出明显加和作用。

然而，在行皮下注射的研究组8、7、5之间，组合物组的q判断(q>1.77>1.15)显示出协同作用，且研究组8与5之间、8与7之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.0006<0.05、P＝0.0327<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。该结果说明，包含动物组织的液体和半流体与活性组分之间具有完全不同的相互作用。

在上表中，行皮下注射的组合物研究组中，抑瘤率自大而小的排列次序为：研究组14、研究组8、研究组12、研究组10。在研究组10、9、5之间，组合物组的q判断(q＝0.95)显示出相加作用，但研究组10与5之间的瘤重差异有统计学意义(P＝0.0288<0.05)、10与9之间的瘤重差异却无统计学意义(P＝0.2850>0.05)，于是组合物组未显示出明显相加作用、更无协同作用。随着血细胞比容增加，在研究组12、11、5之间，组合物组的q判断(q＝1.29>1.15)显示出协同作用，且研究组12与5之间、12与11之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.0012<0.05、P＝0.0274<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。更进一步，在研究组14、13、5之间，组合物组的q判断(q＝1.25>1.15)显示出协同作用，且研究组14与5之间、14与13之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.0001<0.05、P＝0.0283<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。该结果说明，包含组织的半流体对生物制品的协同作用依赖于组织之细胞比容。细胞比容也许参与决定了半流体在体内形成的结节的诸多性质(例如柔软度)，从而参与决定了其协同效应。

使用实施例1中的其它制备物(例如Y14-Y18等)，也可获得类似结果。

在一个试验中，试验动物为BALB/c小鼠，建模细胞为乳腺癌4T1细胞，以1×10⁶个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物(瘤体平均体积215mm³)随机分为8个试验组，包括1个阴性对照组和7个研究组。阴性对照物均为生理盐水，研究药物如下表所示。研究药物的制备如下：

所用PD-(L)1抗体为商业渠道获得。PD-(L)1抗体药物均为所示浓度的水溶液，小鼠血液均取自BALB/c小鼠的加有抗凝剂(枸橼酸钠)的新鲜血液，小鼠血液半流体为实施例1中的制备物X16，不同重量比的PD-(L)1抗体/小鼠血液半流体按实施例1中的制备物Y16的制备方法制备。

在该实验中，对研究组的给药可被视作同基因给药模型(可以代表异体同基因给药和自体给药)。各实验组均如下表所示用药方式(皮下注射为均在左腋皮下注射)用药一次，每次用药250μl/只。给药后第14日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表12。

表12

注：x为瘤重平均值。

在上表中，在PD-(L)1抗体/血液半流体组合物研究组中，抑瘤率自大而小的排列次序为：研究组7、研究组6、研究组5。在研究组5、2、1之间，组合物组的q判断(q＝1.11)显示出相加作用，但研究组5与2之间的瘤重差异有统计学意义(P＝0.0019<0.05)而研究组5与1之间的瘤重差异无统计学意义(P＝0.2980>0.05)，于是组合物组显示出不明显的相加作用。然而，在研究组6、3、1之间，组合物组的q判断(q＝1.30>1.15)显示出协同作用，且研究组6与3之间、6与1之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.0003<0.05、P＝0.0060<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。进一步，在研究组7、4、1之间，组合物组的q判断(q＝1.54>1.15)显示出协同作用，且研究组7与4之间、7与1之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.0003<0.05、P＝0.0038<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。根据该结果及更多结果，PD-(L)1抗体与半流体组合物(更一般地，与它们同类的免疫调节类抗体与半流体组合物)的协同量比(w：w)为>0.05/100，优选为≥0.1/100。

以下更多的实验证实了上述协同量比的范围。

在一个试验中，试验动物为BALB/c小鼠，建模细胞为肉瘤S180，以1×10⁶个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物(荷肉瘤小鼠，瘤体平均体积251mm³)随机分为8个试验组(1个阴性对照组和7个研究组)，并在动物瘤内给药。阴性对照物为生理盐水，研究药物如下表所示。研究药物的制备如下：

0.1％卡介苗、人重组干扰素50万IU/ml分别为以注射用水配制的液体。小鼠血液半流体为实施例1的X16，0.1％卡介苗/99.9小鼠血液半流体、人重组干扰素/小鼠血液(50万IU/ml)半流体分别为所示量的生物制品与小鼠血液的混合物的热凝固物(按实施例1的Y14或Y18的制备方法制备。

各实验组均瘤内用药一次，每次用药250μl/只。用药后第14日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表13。

表13

组号	研究药物	量比	瘤重(x±s)	抑瘤率
					0	生理盐水	-	1.73±0.26g	-
1	小鼠血液半流体	-	1.28±0.33g	26％
					2	0.1％卡介苗	-	1.45±0.31g	16％
3	0.1％卡介苗/99.9％小鼠血液半流体	0.1/100	0.81±0.22g	53％
					4	人重组干扰素50万IU/ml	-	1.51±0.35g	13％
5	人重组干扰素/小鼠血液(50万IU/ml)半流体	1/100	0.90±0.20g	48％

注：x为瘤重平均值。

在上表中，在研究组3、2、1之间，组合物组的q判断(q＝1.20>1.15)显示出协同作用，且研究组3与2之间、3与1之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.0022<0.05、P＝0.0166<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。在研究组5、4、1之间，组合物组的q判断(q＝1.33>1.15)显示出协同作用，且研究组5与4之间、5与1之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.004<0.05、P＝0.0379<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。

上述结果及更多类似研究说明，包含本发明的动物组织和抗瘤生物制品的半流体组合物对瘤体组织有协同破坏作用。该协同作用的形成，有可能是因为本发明的包含动物组织的半流体作为免疫成分(抗原)协同、或/和作为缓释载体协同。瘤体组织的加大破坏有利于內源肿瘤疫苗的生成。

2、包含非瘤组织和化疗药物的半流体组合物协同作用方案研究

包含非瘤组织的半流体的组织破坏性或/和缓释性是其作为组织破坏或/和缓释协同组分的基础。以下实验对此进行了研究。

在一个试验中，试验动物为裸小鼠，建模细胞为肉瘤S180，以1×10⁶个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物(荷肉瘤小鼠，瘤体平均体积218mm³)随机分为7个试验组(如下表所示)。试验组分为2个系列，瘤内注射系列有1个阴性对照组(01组)和4个研究组，皮下注射系列有1个阴性对照组(02组)和1个研究组。阴性对照物均为生理盐水，研究药物如下表所示，分别为：BALB/c小鼠新鲜血液、无水乙醇(消融剂阳性对照物)、小鼠血液半流体(实施例1的X16)、人胎盘半流体(实施例1的X21)。各实验组均用药一次，用药200μl/只，用药方式(皮下注射为在左腋皮下注射)如下表所示。

裸小鼠为先天性无胸腺的nude小鼠的位于第11对染色体上的隐性突变基因“nu”导入BALB/c小鼠所获小鼠。裸小鼠胸腺仅有残迹或异常上皮，不能使T细胞正常分化，缺乏成熟T细胞的辅助、抑制和杀伤功能，细胞免疫力低下。荷肉瘤裸小鼠用药后第7日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表14。

表14

注：x为瘤重平均值。

在上表中，研究组5与02之间的瘤重差异无统计学意义(P＝0.437>0.05)。该结果及更多类似研究说明，本发明组合物中的包含组织的半流体主要是作为胸腺依赖抗原在先前的荷瘤小鼠皮下注射中显示出免疫抑瘤效应。

然而在上表中，研究组2与3之间、研究组2与01之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.0043<0.05和P＝0.0014<0.05)。而研究组2与4之间、研究组1与4之间的瘤重差异均无统计学意义(分别为P＝0.2096>0.05、P＝0.2783>0.05)。该结果及更多类似研究说明，本发明的半流体除了可以作为抗原应用于免疫协同，还可以作为组织破坏成分应用于化疗协同。众所周知，瘤体组织的破坏可能次生地释放出肿瘤抗原(原位)并产生疫苗效应。于是，本发明组合物中的包含组织的半流体在给药瘤内时除了作为胸腺依赖抗原、还可作为非胸腺依赖的组织破坏成分应用于药物制备。

在一个试验中，试验动物为裸小鼠，建模细胞为肉瘤S180，以1×10⁶个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物(荷肉瘤小鼠，瘤体平均体积209mm³)随机分为10个试验组(1个阴性对照组和9个研究组)，并在动物瘤内给药。阴性对照物为生理盐水，研究药物如下表所示。研究药物的制备如下：

血液半流体为取自其它裸小鼠的血液按实施例1中X16的制备方法制备，0.5％5-Fu、0.5％亚甲蓝、10％精氨酸/10％甘氨酸分别为抗肿瘤化疗药物的水溶液，其它药物为取自其它裸小鼠的血液分别按实施例1中Y6、Y8、Y9的制备方法制备的抗肿瘤化疗药物/自体血液半流体组合物。各实验组均瘤内用药一次，每次用药200μl/只。用药后第14日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表15。

表15

注：x为瘤重平均值；小鼠血液半流体抑瘤率：根据相关实验，稀释小鼠血液的半流体的抑瘤效应小于100％小鼠血液的半流体

在上表中，研究组4的抑瘤率高于研究组3，研究组7的抑瘤率高于研究组6。在研究组3、2、1之间，组合物组的q判断(q＝1.22>1.15)显示出协同作用，且研究组3与2之间、3与1之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.0012<0.05、P＝0.0007<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。在研究组6、5、1之间，组合物组的q判断(q＝1.38>1.15)显示出协同作用，且研究组6与5之间、6与1之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.0006<0.05、P＝0.0054<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。在研究组9、8、1之间，组合物组的q判断(q>1.17>1.15)显示出协同作用，且研究组9与8之间、9与1之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.0041<0.05、P＝0.0015<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。

该结果及更多类似研究说明，包含本发明的动物组织和抗肿瘤化疗药物的半流体组合物对瘤体组织有协同破坏作用。该协同作用的形成，有可能是因为本发明的包含动物组织的半流体作为组织破坏成分协同、或/和所述抗肿瘤化疗药物的缓释载体协同。瘤体组织的加大破坏有利于內源肿瘤疫苗的生成。

根据上述研究及更多的类似研究，包含非瘤组织的半流体可以作为抗原与其它抗实体肿瘤的免疫药物(例如免疫生物制品)形成组合物以提高免疫效应，也可以在作为抗原的同时作为组织破坏成分或/和载体与化疗药物形成组合物以提高免疫-化疗复合效应。

本发明的组合物的必要条件为：其组成和形态使得其可激发比半流体抗原单用更有效的免疫应答和/或更有效的化疗效果，并最终增强疗效、尤其是免疫疗效。于是，本发明的组合物的基本技术方案为：

包含非瘤组织的半流体作为抗原和抗病原体疾病活性成分的协同组分应用；

上述包含非瘤组织和活性成分的半流体优选为选自以下组之一种或多种：包含所述活性成分和非瘤组织的半流体粘稠物、包含所述活性成分和液体非瘤组织的凝固物、包含所述活性成分和非液非瘤组织的破碎物、包含所述活性成分和液体非瘤组织的凝固物的破碎物，更优选为选自以下组之一种或多种：包含所述活性成分和液体非瘤组织的凝固物、包含所述活性成分和非液非瘤组织的破碎物、包含所述活性成分和液体非瘤组织的凝固物的破碎物；

上述包含非瘤组织和活性成分的半流体包含在所述疫苗的瘤区用药和/或瘤外局部用药中；

上述包含非瘤组织和活性成分的半流体为半流体植入剂、优选为半流体注射剂。

在更优选的条件下，本发明的包含非瘤组织和抗实体肿瘤活性成分的半流体组合物显示出免疫协同作用、化疗协同作用和/或载体协同作用。该半流体组合物的协同条件为：所述活性成分和组合物的量比(w/w或v/v)为(0.1-30)/100，所述细胞和组合物的量比(v/v)为>22％(或细胞浓度为>5.6×10⁹个/ml)、优选为33％-86％(或细胞浓度为8.4×10⁹个/ml-22×10⁹个/ml)、45％-86％(或细胞浓度为11.5×10⁹个/ml-22×10⁹个/ml)或55％-86％(或细胞浓度为14.0×10⁹个/ml-22×10⁹个/ml)。在其中所述半流体粘稠物组合物中，所述细胞和组合物的量比(v/v)为≥70％(或细胞浓度为≥17.9×10⁹个/ml)、优选为70％-86％(或细胞浓度为17.9×10⁹个/ml-22×10⁹个/ml)。

更优选地，所述活性成分的浓度为大于或等于其在单独局部给药时产生作用的浓度，其中：

所述生物制品的浓度为大于或等于其在单独局部给药时产生作用的浓度，例如：所述肿瘤抗原的含量为大于10⁵个/mm³ml、优选为10⁵～10⁹个/mm³ml个肿瘤细胞所包含的肿瘤抗原，所述微生物抗原的浓度为>0.1％，所述免疫调节类抗体药物的含量为≥0.1％、优选为0.25-5％，等等；或/和

所述化疗药物的浓度为大于或等于其在单独局部给药时产生作用的浓度，例如：所述细胞毒药物的浓度大于其饱和浓度的50％、优选为其饱和浓度的50％-500％；所述常规无效化合物的浓度为>0.25％、优选为0.35-30％(例如：所述氨基酸营养素的局部给药浓度为大于5％，优选为5％-30％；所述无效芳香化合物的局部给药浓度为大于0.25％、优选为0.35％-10％；所述植物或菌类活性成分的局部给药浓度为大于0.25％、优选为0.75％-15％)。

本申请公开包括以下项目：

项目1、包含非瘤组织或由非瘤组织形成的半流体作为抗原在制备用于治疗或抑制实体肿瘤的疫苗中的应用。

项目2、一种用于治疗或抑制实体肿瘤的疫苗，其包含作为抗原的包含非瘤组织或由非瘤组织形成的半流体。

项目3、一种用于治疗或抑制实体肿瘤的方法，其包括向有此需要的个体局部施用、优选为通过局部注射施用包含作为抗原的包含非瘤组织或由非瘤组织形成的半流体的疫苗。

项目4、根据项目1-3之一的应用、疫苗和方法，其中所述非瘤组织为选自源自结缔组织和/或结缔组织之外的半固体组织的以下组之一种或多种：天然组织、天然组织组分、工程组织，且其中所述半流体的组成和形态使得其在用药处形成半流体结节。

项目5、根据项目1-3之一的应用、疫苗和方法，其中所述非瘤组织为选自远离天然状态的、优选为经过严重损伤的组织，其中所述远离天然状态包括粘稠化；所述严重损伤包括以下之一种或多种损伤：机械破碎、凝固化、超声损伤、热损伤、冻融损伤、照射损伤、化学损伤。

项目6、根据项目1-3之一的应用、疫苗和方法，其中所述半流体选自以下组之一种或多种：包含液体组织的半流体粘稠物、包含液体组织的半流体凝固物、包含非液组织的破碎物、包含液体组织凝固物的破碎物、包含非液组织的软化物。

项目7、根据项目1-3之一的应用、疫苗和方法，其中所述非瘤组织的细胞比容为>22％(或细胞浓度为>5.6×10⁹个细胞/ml)、优选为33％-86％(或细胞浓度为8.4×10⁹-22×10⁹个细胞/ml)或55％-86％(或细胞浓度为14.0×10⁹-22×10⁹个细胞/ml)。

项目8、根据项目1-3之一的应用、疫苗和方法，其中所述半流体为植入剂、优选为注射剂，且其单次施用量为>0.1ml，优选为≥0.2ml或0.2-25ml。

项目9、根据项目1-8之一的应用、疫苗和方法，其中所述半流体所包含的非瘤组织选自以下组之一种或多种：自动物提取的天然组织、包含细胞和细胞间质的天然组织组分、包含细胞和细胞间质的工程组织。

项目10、根据项目1-3之一的应用、疫苗和方法，其中所述非瘤组织为选自以下组之一种或多种：源自受试者的异种动物且并不富含异种糖蛋白抗原的组织、源自受试者的同种异体且并不富含异基因抗原的组织、源自受试者自体的严重损伤组织，优选为选自以下之一种或多种：低血管密度的异种组织、ABO血型相符或HLA相近的同种异体异基因组织、严重损伤的同种异体同基因组织、严重损伤的自体组织。

项目11、根据项目1-3之一的应用、疫苗和方法，其中所述非瘤组织为选自以下组之一种或多种：源自受试者的ABO血型相符或HLA相近的同种异体异基因组织、源自受试者的严重损伤同种异体同基因组织、源自受试者的严重损伤自体组织。

项目12、根据项目1-3之一的应用、疫苗和方法，其中所述非瘤组织为自体组织。

项目13、根据项目10-12之一的应用、疫苗和方法，其中所述非瘤组织包括选自以下之一种或多种器官所包含的组织：肠、胃、肉、胰腺、脾脏、肝脏、肺、软骨、关节、皮、胎盘、脐带，优选包括选自以下之一种或多种器官所包含的组织：肉、脾脏、肝脏、胎盘、脐带。

项目14、根据项目10-12之一的应用、疫苗和方法，其中所述非瘤组织包括选自结缔组织的组织，优选包括选自以下之一种或多种：血液、骨髓、脊髓，更优选为血液。

项目15、根据项目10-12之一的应用、疫苗和方法，其中所述非瘤组织包括ABO血型相符或HLA相近的同种异体血液。

项目16、根据项目10-12之一的应用、疫苗和方法，其中所述非瘤组织包括自体血液。

项目17、根据项目14-16之一的应用、疫苗和方法，其中所述血液选自以下组之一种或多种：自动物提取的天然血液、包含血细胞和血漿的天然血液组分、包含血细胞和血漿的工程血液，其中所述血细胞选自以下细胞及其衍生物之一种或多种：红细胞、白细胞、血小板，其中所述白细胞选自细胞及其衍生物之一种或多种：粒细胞、单核细胞、淋巴细胞，其中所述淋巴细胞选自以下细胞及其衍生物之一种或多种：T细胞、B细胞、裸细胞。

项目18、根据项目1-17之一的应用、疫苗或方法，其中所述半流体还包含抗实体肿瘤的活性成分，且其中所述活性成分与所述半流体的量比(w/w或v/v)为(0.1-30)/100，以及其中所述活性成分选自抗肿瘤化疗药物或/和生物制品之一种或多种。

项目19、根据项目18的应用、疫苗和方法，其中所述生物制品为选自以下组中的一种或多种：细胞制品、免疫调节类抗体、细胞因子、病原体或病原体亚单位，且所述生物制品与所述半流体的量比(w/w)为(0.1-30)/100。

项目20、根据项目19的应用、疫苗和方法，其中所述细胞制品为选自以下之一种或多种的天然细胞或工程化细胞：组织富含的细胞，例如肌细胞、血细胞；免疫细胞，例如外周血单核细胞、T细胞、B细胞、NK细胞、淋巴细胞；干细胞，例如间充质干细胞、造血干细胞，以及所述细胞制品选自同种异基因细胞、同基因细胞和自体细胞，优选为自体细胞。

项目21、根据项目19的应用、疫苗和方法，其中所述免疫调节类抗体为选自以下组之一种或多种：针对抑制性受体的抗体阻断剂，例如针对CTLA-4分子和PD-1分子的阻断性抗；针对抑制性受体的配体的抗体阻断剂、针对免疫反应细胞表面刺激分子的激活性抗体，例如抗OX40抗体、抗CD137抗体、抗4-1BB抗体；针对实体肿瘤微环境中免疫抑制性分子的中和抗体，例如抗TGF-p1抗体。

项目22、根据项目19的应用、疫苗和方法，其中所述细胞因子为选自以下之一种或多种：肿瘤坏死因子、干扰素、白介素。

项目23、根据项目19的应用、疫苗和方法，其中所述病原体或病原体亚单位中的所述病原体选自以下组之一种或多种：肿瘤细胞、细菌、病毒。

项目24、根据项目19-23之一的应用、疫苗和方法，其中所述组织破坏剂为选自以下组之一种或多种：细胞毒药物、常规无效但局部有效化合物，且所述组织破坏剂与所述半流体的量比(w/w)为(0.1-30)/100。

项目25、根据项目24的应用、疫苗和方法，其中所述细胞毒药物选自以下之一种或多种：5-氟尿嘧啶、吉西他滨、表柔比星、抗局部病变疾病抗生素、替尼泊苷、金属铂络合物、紫杉醇。

项目26、根据项目24的应用、疫苗和方法，其中所述常规无效但局部有效化合物包括以下组之一种或多种：氨基酸类营养素、无效芳香化合物、非动物生物活性成分。

项目27、根据项目26的应用、疫苗和方法，其中所述常规无效但局部有效化合物包括选自以下组之一种或多种：氨基酸类营养素例，如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、或它们的盐、或包含它们的寡肽；无效芳香化合物，例如亚甲蓝、乙酰水扬酸、奎宁、一盐酸奎宁、二盐酸奎宁；非动物生物活性成分，例如藻类多糖、药用植物多糖、真菌多糖、青蒿素。

项目28、根据项目1-3之一的应用、疫苗、方法或试剂盒，其中所述实体肿瘤优选为选自瘤体体积>85mm³、优选为≥200mm³、更优选为≥300mm³的实体肿瘤。

项目29、根据项目1-3之一或28的应用、疫苗和方法，其中所述实体肿瘤包括乳腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、肠癌、口腔癌、胃癌、结直肠癌、支气管癌、喉癌、睾丸癌、阴道癌、子宫癌、卵巢癌、恶性黑色素瘤、脑瘤、肾细胞癌、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤。

项目30、根据项目3-29之一的方法，其中所述方法还包括与以下之一种或多种治疗合用：介入疗法、化疗、其它免疫疗法、光动力疗法、声动力疗法、手术干预。

项目31、一种制备实体肿瘤疫苗的方法，其包括以下步骤：

a.提供非瘤组织；

b.对所述非瘤组织进行半流体化处理和/或严重损伤处理，以得到包含所述非瘤组织或由该非瘤组织形成的半流体，其中所述半流体化处理包括以下之一种或多种：液体组织的粘稠化、液体组织的凝固化、非液组织的机械破碎、液体组织凝固物的机械破碎、非液组织的软化；以及其中所述严重损伤处理包括以下之一种或多种：机械破碎、凝固化、超声损伤、热损伤、冻融损伤、照射损伤、化学损伤。

项目32、根据项目31的方法，其中所述非瘤组织的半流体化处理之前或之后还加入活性成分进行混合，得到包含所述非瘤组织和活性成分的半流体。

项目33、根据项目31或32的方法，其中所述非瘤组织包括选自以下之一种或多种器官所包含的组织：肠、胃、肉、胰腺、脾脏、肝脏、肺、软骨、关节、皮、胎盘、脐带，优选包括选自以下之一种或多种器官所包含的组织：肉、脾脏、肝脏、胎盘、脐带。

项目34、根据项目31或32的方法，其中所述非瘤组织包括选自结缔组织的组织，优选包括选自以下之一种或多种：血液、骨髓、脊髓，更优选为血液，其中所述血液优选为选自ABO血型相符或HLA相近的同种异体血液和自体血液。

项目35、根据项目34的方法，其中所述非瘤组织包括自体血液。

项目36、根据项目34或35之一的方法，其中所述血液为比容(Ⅴ_细胞：Ⅴ_组织)≥45％、优选为55％-86％的血细胞浓缩血液，其中所述血细胞浓缩血液选自以下之一种或多种；自天然血液脱除20～60％血清的脱血清血液、往天然血液加入血细胞的加血细胞血液、包含血细胞和血漿蛋白的人造血液。

项目37、根据项目31-36之一的方法得到的疫苗。

除本文中描述的那些外，根据前述描述，本发明的多种修改对本领域技术人员而言会是显而易见的。这样的修改也意图落入所附权利要求书的范围内。本申请中所引用的各参考文献(包括所有专利、专利申请、期刊文章、书籍及任何其它公开)均以其整体援引加入本文。

Claims (10)

1.包含非瘤组织或由非瘤组织形成的半流体作为抗原在制备用于治疗或抑制实体肿瘤的疫苗中的应用。

2.一种用于治疗或抑制实体肿瘤的疫苗，其包含作为抗原的包含非瘤组织或由非瘤组织形成的半流体。

3.根据权利要求1或2的应用和疫苗，其中所述非瘤组织为选自源自结缔组织和/或结缔组织之外的半固体组织的以下组之一种或多种：天然组织、天然组织组分、工程组织，且其中所述半流体的组成和形态使得其在用药处形成半流体结节。

4.根据权利要求1-3之一的应用和疫苗，其中所述非瘤组织为选自远离天然状态的、优选为经过严重损伤的组织，其中所述远离天然状态包括粘稠化；所述严重损伤包括以下之一种或多种损伤：机械破碎、凝固化、超声损伤、热损伤、冻融损伤、照射损伤、化学损伤。

5.根据权利要求1-3之一的应用和疫苗，其中所述半流体选自以下组之一种或多种：包含液体组织的半流体粘稠物、包含液体组织的半流体凝固物、包含非液组织的破碎物、包含液体组织凝固物的破碎物、包含非液组织的软化物。

6.根据权利要求1-3之一的应用和疫苗，其中所述非瘤组织的细胞比容为>22％(或细胞浓度为>5.6×10⁹个细胞/ml)、优选为33％-86％(或细胞浓度为8.4×10⁹-22×10⁹个细胞/ml)或55％-86％(或细胞浓度为14.0×10⁹-22×10⁹个细胞/ml)。

7.根据权利要求1-3之一的应用和疫苗，其中所述半流体所包含的非瘤组织选自以下组之一种或多种：自动物提取的天然组织、包含细胞和细胞间质的天然组织组分、包含细胞和细胞间质的工程组织。

8.一种制备实体肿瘤疫苗的方法，其包括以下步骤：

a.提供非瘤组织；

b.对所述非瘤组织进行半流体化处理和/或严重损伤处理，以得到包含所述非瘤组织或由该非瘤组织形成的半流体，其中所述半流体化处理包括以下之一种或多种：液体组织的粘稠化、液体组织的凝固化、非液组织的机械破碎、液体组织凝固物的机械破碎、非液组织的软化；以及其中所述严重损伤处理包括以下之一种或多种：机械破碎、凝固化、超声损伤、热损伤、冻融损伤、照射损伤、化学损伤。

9.根据权利要求8的方法，其中所述非瘤组织的半流体化处理之前或之后还加入活性成分进行混合，得到包含所述非瘤组织和活性成分的半流体。

10.根据权利要求8或9的方法得到的疫苗。