CN112316148A - 包含血浆的半流体的应用、包含该半流体和活性成分的药物组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本项发明涉及一种包含血浆或由血浆形成的半流体应用，包含该血浆和活性成分的药物组合物，以及该药物组合物的制备方法。

Description

包含血浆的半流体的应用、包含该半流体和活性成分的药物 组合物及其制备方法
技术领域
本项发明涉及一种包含血浆或由血浆形成的半流体应用，包含该血浆和活性成分的药物组合物，以及该药物组合物的制备方法。
背景技术
局部病变、尤其是顽固性局部病变疾病(例如实体肿瘤、顽固性微生物感染、顽固性皮肤病等)的治疗，一直是一个艰难的科学问题。由于有大量研究工作支持，实体肿瘤常被用作局部病变疾病、尤其是难治性局部病变疾病的研究模型。
多种类的物质曾经被用以制作肿瘤疫苗。微生物类物质最早被应用于开发实体肿瘤疫苗。化脓性链球菌、黏质沙雷菌、卡介苗等先后被发现对某些肿瘤有疗效。活的、减毒或基因修饰的专性或兼性厌氧细菌可以选择性地在肿瘤内繁殖(可用作定植载体)，也可以释放某些抗原激活机体免疫系统。感染流感病毒或注射狂犬病疫苗后也出现肿瘤病情明显缓解的案例。此外，活的、减毒或基因修饰的溶瘤病毒可以通过两种方式(选择性肿瘤细胞杀伤和抗肿瘤免疫)抑瘤。另一方面，疟原虫、弓形虫等也被发现可抗肿瘤生长。可是，微生物类疫苗要么显示出一定的有效性却有较高安全性风险，要么显示出较高安全性却有效性不高。
为了提高特异性，包含肿瘤抗原的疫苗更引入关注。首先出现的是全肿瘤细胞疫苗。全细胞疫苗表达较全面，但成分复杂、特异性仍然不强。研究人员于是寄望于在肿瘤细胞中筛选出个别有用无害的抗原部位(例如某些胞外体、表面蛋白质、核酸、多肽等)制成亚单位疫苗。所谓的肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的发现，曾经让人们欢欣鼓舞。然而，尽管其成分较单一、特异性较强、安全性较高，其免疫原性却较低下。随着当代基因技术的发展，肿瘤新抗原(Neoantigen)再次让人们为之一振。肿瘤新抗原是指由癌细胞基因突变所导致的、正常细胞所没有的、且能被免疫细胞所识别的一类蛋白/表位多肽。然而，多肽序列一般由几个或数十个氨基酸组成，分子量较小，化学结构简单，安全性虽高免疫原性却较弱，仍然难以诱发足够强度的免疫反应。
尽管微生物(抗原)药物、肿瘤细胞(抗原)药物、肿瘤细胞亚单位(抗原)药物、肿瘤新(抗原)药物、异基因淋巴细胞(抗原)药物繁花似锦，而从临床角度看实体肿瘤药物的开发，似乎进步不大。大问题还在老地方：要如何才能开发出这样一种实体肿瘤药物抗原，其具有临床有效的所需(抗肿瘤)抗原性、同时不需抗原性(例如GVHD)又在临床安全的允许范围内？若干其它严重局部病变疾病、尤其是顽固性局部病变疾病(例如乙肝)也有类似问题。因而，仍然需要开发新的药物，以满足现有技术尚不能满足的急需临床需求。
发明内容
本申请的目的在于提供一种针对局部病变疾病的作用更全面更持久因而更有效、而不需抗原性(例如GVHD)又最小化的药物，以及该药物的制备方法。
本申请公开的一个方面提供包含血浆或由血浆形成的半流体作为活性成分在制备用于治疗或抑制局部病变疾病的药物组合物中的应用。
本申请公开的另一个方面提供一种用于抗局部病变疾病的药物组合物，其包含抗局部病变疾病的活性成分以及包含血浆或由血浆形成的半流体。
本申请公开的又一个方面提供一种抗局部病变疾病的方法，其包括向有此需要的个体的局部病变区内和/或局部病变区外通过植入、优选通过注射施用包含抗局部病变疾病的活性成分以及包含血浆或由血浆形成的半流体的药物组合物。
本申请公开的再一个方面提供一种用于抗局部病变疾病的药物组合物的制备方法，该药物组合物包含抗局部病变疾病的活性成分以及包含血浆或由血浆形成的半流体，所述方法包括以下步骤：
a.提供血浆和抗局部病变疾病的活性成分；
b.将所述抗局部病变疾病的活性成分加入所述血浆中进行混合，以及对该混合物进行半流体化处理，其中所述半流体化包括以下之一种或多种：粘稠化、液体的凝固化、凝固物的破碎化。
本申请公开的再一个方面提供根据本申请公开的方法制备的药物组合物。
根据本发明的半流体与现有技术的药物相比具有以下优点：更全面的药理、更高的有效性，更高的安全性，更宽的适应症谱，更多更好的协同作用选择性。
根据本发明的抗局部病变疾病的方案更容易和其它相关治疗方案联合进行。此外，该应用和该药物制备可控、成本便宜，而该治疗方案简便易行，特别有助于使难以承受高额费用的广大人群也享受到安全、有效治疗。
具体实施方式
根据本申请公开的一个方面，其提供包含血浆或由血浆形成的半流体作为抗局部病变疾病活性成分的协同成分在制备用于治疗或抑制局部病变疾病的药物组合物中的应用。
根据本申请公开的另一个方面，其提供一种用于治疗或抑制局部病变疾病的药物组合物，其包含抗局部病变疾病的活性成分以及包含血浆或由血浆形成的半流体。
根据本申请公开的另一个方面，其提供一种治疗或抑制局部病变疾病的方法，其包括向有此需要的个体的局部病变区内和/或局部病变区外通过植入、优选通过注射施用包含抗局部病变疾病的活性成分以及包含血浆或由血浆形成的半流体的药物组合物。
在本申请公开中，术语“活性成分”是指在相同条件下单独使用能够产生治疗效果的物质；术语“血浆”是指由血液中除去血细胞后获得的蛋白质混合物组分。
在本申请公开中，术语“半流体”是指在限时内(例如10秒)无外压则无肉眼可见的流动、而在(施用时)可接受的外压(例如可施加在注射器推进装置上的外压)下可以流动并导致不可逆形变的物体，其区别于流体(流体无外压时亦有流动性)、固体(固体在临床可接受的外压下亦不可流动)、半固体(半固体在临床可接受的外压下仅发生可逆形变)。例如，某些动物器官(例如肌肉块、肝、胃、肠、心、肺、胰腺、软骨、关节等)的组织、以及某些压力下不流动的凝胶(例如纤维蛋白胶)是半固体，而不是半流体。
在本发明的范围内，所述血浆为选自以下组之一种或多种：天然血浆、病毒灭活血浆、包含天然血浆主要蛋白质(例如白蛋白、球蛋白和主要凝血蛋白)的血浆组分。
在一个实施方案中，所述组合物的组成和形态使得其在用药处形成半流体结节，且所述包含血浆的半流体为所述活性成分提供缓释载体，并能够与之产生以下协同作用：免疫协同和/或组织破坏协同。
在一个实施方案中，所述活性成分为选自抗局部病变疾病的生物制品或/和化疗药物之一种或多种，且所述活性成分在所述组合物中的量比(w/w或v/v)为(0.1-30)/100。
在本发明的范围内，所述包含血浆的半流体可以作为所述抗局部病变疾病的活性成分的载体，这是因为它能够在给药区形成在组成(例如包含细胞)、性质(例如柔软性)、形态/结构上类似于凝胶半固体、但可分散性更高的半流体结节，以能够可控地释放出活性成分。
在本发明的范围内，所述包含血浆的半流体可以起到抗局部病变疾病的免疫成分的作用，因为它能够在给药区形成有效抗原或/和激活病原体原位抗原，由此与所述活性成分产生协同作用，超过该半流体和所述活性成分的加和作用的免疫治疗效应和/或化学治疗效应。例如，本发明的半流体形式的药物组合物在瘤内用药可作为组织破坏成分参与释放瘤内原位抗原。
在本申请公开中，术语“原位抗原”是指活体内病原体所致病变体中包含的有可能诱发机体的特异性免疫应答的物质(例如含有实体肿瘤抗原信息的瘤内实体肿瘤细胞材料、胞外体、多肽及核酸序列等)，其实际上包含大量的有别于正常机体的抗原信息，只是这些信息被某些病理因素(例如肿瘤微环境)所屏蔽，从而不能被常规免疫系统识别并反应。
在一个实施方案中，所述活性成分选自抗病原体疾病的生物制品或/和化疗药物之一种或多种，且所述活性成分在所述药物组合物中的量比(w/w或v/v)为(0.1-30)/100。
在一个实施方案中，所述化疗药物与所述组合物的量比(w/w或v/v)为(0.1-30)/100。在一个实施方案中，所述生物制品与所述组合物的量比(w/w或v/v)为(0.1-30)/100。
在一个实施方案中，所述组合物是在病变区内施用和/或病变区外局部施用。在一个实施方案中，所述组合物是在病变区内(例如瘤内)施用。在一个实施方案中，所述组合物是在病变区外局部(例如瘤外局部)施用。在一个实施方案中，所述组合物是在病变区内和病变区外局部同时施用。在一个实施方案中，所述病变区外局部用药包括以下之一种或多种：皮下给药、肌肉给药、粘膜给药。
在一个实施方案中，所述组合物是以下形式：包含所述活性成分和血浆或由血浆的混合物的原位凝固物、或/和包含所述活性成分和血浆的半流体凝固物制备物，其中所述半流体凝固物制备物选自以下组之一种或多种：包含所述活性成分和血浆的半流体粘稠物、包含所述活性成分和血浆的半流体凝固物、包含所述活性成分和血浆的凝固物的破碎物。
在一个实施方案中，所述原位凝固物选自以下组之一种或多种：原位热凝固物(例如所述混合物在局部病变内受热形成的凝固物)、原位凝固剂凝固物(例如所述混合物加入凝固剂后在局部病变内形成的凝固物)。
在一个实施方案中，所述组合物的皮下半消失期为≥0.1日、优选为0.1～30日。
在一个实施方案中，所述包含血浆的半流体作为免疫协同成分用于局部病变疾病药物制备。
在本发明的范围内，所述包含血浆的半流体作为活性成分的免疫协同成分的优选条件(或者优选技术方案)为：使得(例如通过应用条件)它在体内形成在组成(例如包含细胞基质)、性质(例如柔软性)、形态/结构上类似侵入有机物、且在侵入程度上足够严重的半流体结节，以能够引起对它足够的免疫识别和免疫响应，从而协同活性成分的免疫作用。
在一个实施方案中，所述包含血浆的半流体作为组织破坏协同成分用于局部病变疾病药物制备。
在本发明的范围内，所述包含血浆的半流体作为活性成分的组织破坏协同成分的优选条件(或者优选技术方案)为：例如通过应用条件，它在局部病变区形成在组成(例如包含蛋白质基质)、性质(例如柔软性)、形态/结构上类似侵入组织、且在侵入程度上足够严重的半流体结节，以能够引起对局部病变组织的破坏效应，从而协同活性成分的组织破坏作用。
在一个实施方案中，所述包含血浆的半流体作为免疫协同成分和组织破坏协同成分用于局部病变疾病药物制备。
在一个实施方案中，所述包含血浆的半流体作为载体成分用于局部病变疾病药物制备。
在本发明的范围内，所述包含血浆的半流体作为活性成分的缓释载体的优选条件(或者优选技术方案)为：例如通过应用条件，它在给药区形成在组成(例如包含蛋白质基质)、性质(例如柔软性)、形态/结构上类似于凝胶半固体、但可分散性更高的半流体结节，以能够可控地释放出活性成分。
在一个实施方案中，所述包含血浆的半流体作为免疫协同成分、组织破坏协同成分和载体成分用于局部病变疾病药物制备。
在一个实施方案中，所述包含血浆的半流体还可作为生物制品的保护介质用于局部病变疾病药物制备。
在一个实施方案中，所述半流体的应用条件包括局部给药。在一个实施方案中，所述局部给药包括以下之一种或多种：皮下给药、肌肉给药、粘膜给药、局部病变区(例如瘤体)内给药，优选为皮下或/和局部病变区内给药。在一个实施方案中，所述局部给药为皮下给药。
在一个实施方案中，所述包含血浆的半流体包括所述血浆的半流体化产物，其中所述半流体化选自包括以下组之一种或多种：血浆的半流体粘稠化、血浆的半流体凝固化、血浆凝固物的破碎化。
在本申请公开中，术语“粘稠化”是指血浆被浓缩或/和加入添加剂的量达到如此之高，以至于体系不再是流体而成为非流体粘稠物；术语“半流体粘稠化”是指非流体粘稠物为半流体粘稠物的粘稠化；术语“凝固化”是使将血浆转化为非液体的处理；术语“半流体凝固化”是指非液体为半流体的凝固化，其包括选自本领域公知的任何半流体凝固化处理，例如：自凝固化(例如不加热、不加凝固剂的凝固)、热凝固化(例如中低温加热凝固)、凝固剂凝固化(例如血浆中加入凝血酶和氯化钙凝固为非半固体)；术语“机械破碎”是指包括机械分割和剪切破碎在内的碎块化处理，其中所述剪切破碎可以通过搅拌机、研磨机或匀漿机(例如转速为≥10转/分、优选10-50000转/分的剪切)来进行。其中，所述粘稠化、凝固化都使血浆出现严重异常或严重损伤。
在一个实施方案中，所述血浆凝固物选自以下之一种或多种：血浆自凝固物、血浆热凝固物、血浆/凝固剂凝固物。
在本申请公开中，术语“血浆自凝固物”是指血浆自然凝固形成的凝固物。术语“血浆热凝固物”是指血浆经热处理形成的凝固物。术语“血浆/凝固剂凝固物”是指血浆加入凝固剂所形成的凝固物。
在一个实施方案中，所述半流体包括血浆自凝固物。
在一个实施方案中，所述半流体包括血浆热凝固物。在本发明范围内，所述热处理选自包括以下之一种或多种：直接热处理、蒸汽热处理、冻干热处理、微波热处理、射频热处理、激光热处理，热处理温度的热效为≥40℃、优选为60℃-115℃。
在一个实施方案中，所述半流体包括血浆/凝固剂凝固物。在一个实施方案中，所述凝固剂包括血浆凝固剂，其中所述血浆凝固剂选自包括以下之一种或多种：凝血酶例如牛凝血酶、猪凝血酶、重组人凝血酶、自体凝血酶，其它凝血蛋白例如凝血因子、凝血酶原复合物、及它们的活化形式，钙离子提供剂例如氯化钙、氢氧化钙、碳酸钙。
在一个实施方案中，所述半流体包括血浆凝固物的破碎物。在一个实施方案中，所述血浆凝固物的破碎物包括血浆凝固物颗粒。在一个实施方案中，所述血浆凝固物颗粒优选为肉眼可辨的宏观颗粒。在一个实施方案中，所述血浆凝固物颗粒的最长端的横切面的平均直径为≥100nm，优选为500nm-1mm或1μm-1mm。
在一个实施方案中，所述半流体的组成、性质、形态/结构和应用条件使得其在施用处形成体积>100mm3，优选为≥200mm3的半流体结节。
在一个实施方案中，所述半流体优选为可挤流半流体。在本发明的范围内，所述可挤流半流体是指可在临床接受的压力下流过针管的半流体。
在一个实施方案中，所述半流体为植入剂、优选为注射剂，且其单个动物给药量为>0.1ml，优选为≥0.2ml或0.2-25ml。
在本发明的范围内，所述半流体中包含的血浆源自哺乳动物。所述哺乳动物选自以下之一种或多种：人、猪、马、羊、牛、兔、鼠。这些动物可以是完全自然进化的动物，也可以是经过生物技术(例如基因编辑技术)改造的动物(例如GAL抗原敲除猪)。
在一个实施方案中，所述半流体包含源自同种异体血液和/或自体血液的血浆，其中所述同种异体血液优选为ABO血型相符或HLA相近的同种异体血液。
在一个实施方案中，所述半流体包含源自自体血液的血浆。
在一个实施方案中，所述活性成分选自生物制品或/和化疗药物之一种或多种。
在一个实施方案中，所述生物制品选自以下组之一种或多种：细胞制品、病原体抗原、免疫调节类抗体、细胞因子。在一个实施方案中，所述生物制品和半流体的量比(w/w或v/v)为(0.1-85)/100。
在本申请公开中，术语“细胞制品”是指经工程制备方法(例如细胞纯化、细胞培养、基因工程介入等)所获得的细胞集合，例如由脾之细胞混合物经溶解红细胞后纯化所获得的淋巴细胞集合。
在一个实施方案中，所述细胞制品为选自包含以下之一种或多种天然细胞或工程化细胞的制品：组织富含的细胞，例如肌细胞、血细胞；免疫细胞，例如外周血单核细胞、T细胞、B细胞、NK细胞、淋巴细胞；干细胞，例如间充质干细胞、造血干细胞。
在一个实施方案中，所述细胞优选为选自同种异基因细胞、同基因细胞和自体细胞，更优选为自体细胞。
在一个实施方案中，所述细胞在所述半流体中的细胞比容为>5％(或细胞浓度为>1.1×109个细胞/ml)、优选为5％-86％(或细胞浓度为1.1×109-22×109个细胞/ml)。
在一个实施方案中，所述细胞在所述半流体中的细胞比容为>22％(或细胞浓度为>5.6×109个细胞/ml)、优选为33％-86％(或细胞浓度为8.4×109-22×109个细胞/ml)或45％-86％(或细胞浓度为11.5×109-22×109个细胞/ml)。
在一个实施方案中，所述细胞包括血细胞、且所述血细胞在所述半流体中的细胞比容为>22％(或细胞浓度为>5.6×109个细胞/ml)、优选为33％-86％(或细胞浓度为8.4×109-22×109个细胞/ml)或45％-86％(或细胞浓度为11.5×109-22×109个细胞/ml)。
在一个实施方案中，所述半流体包含自体血液和细胞制品。
在一个实施方案中，所述半流体包含血细胞浓缩血液，其中在所述血细胞浓缩血液中，血细胞比容为≥45％、优选为50％-86％；血浆蛋白浓度为正常血浆中血浆蛋白的基线浓度的15％-70％或20％-60％。
在一个实施方案中，所述血细胞浓缩血液选自以下之一种或多种；自天然血液脱除20～60％血清的脱血清血液、往天然血液加入血细胞的加血细胞血液、包含血细胞和所述血浆蛋白的人造血液。
在本发明的范围内，所述血细胞选自包括以下一种或多种：红细胞、白细胞、血小板。在本发明的范围内，所述白细胞选自包括以下一种或多种：粒细胞、单核细胞、淋巴细胞。在本发明的范围内，所述淋巴细胞选自包括以下一种或多种：T细胞、B细胞、裸细胞。
在本申请公开中，术语“病原体抗原”是指源于病原体的抗原，其包括例如病原体、病原体亚单位等；术语“病原体”是指可致病生物体或其他生物媒介，可致病生物体包括例如寄生虫(例如原虫、蠕虫等)、细菌、真菌、病毒、立克次氐体、衣原体、支原体、螺旋体，其他生物媒介包括例如微生物重组体、病变细胞(例如实体肿瘤细胞)；术语“病原体亚单位”是指病原体的免疫活性成分及其人造类似物，例如寄生物、细菌、病毒、肿瘤细胞、它们的免疫活性成分成分(DNA、蛋白质、多肽片断等)(例如肿瘤亚单位抗原、非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸-脱氧寡核苷酸(CpG ODN)等)。
在一个实施方案中，所述半流体作为病原体抗原的佐剂用于局部病变疾病疫苗的制备，其中所述病原体抗原选自以下组之一种或多种：微生物抗原、肿瘤抗原。
在一个实施方案中，所述微生物抗原选自源于以下微生物组之一种或多种的抗原：细菌，例如以下之一种或多种：化脓性链球菌、豁质沙雷菌、卡介苗、破伤风梭菌、丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌；病毒，例如以下之一种或多种：乙肝病毒、腺病毒、单纯疤疹病毒、牛痘病毒、腮腺炎病毒、新城鸡瘟病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、西尼卡谷病毒、柯萨奇病毒、呼肠孤病毒；寄生虫，例如疟原虫。
在一个实施方案中，所述肿瘤抗原选自包括以下组之一种或多种：乳腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、肠癌、口腔癌、胃癌、结直肠癌、支气管癌、喉癌、睾丸癌、阴道癌、子宫癌、卵巢癌、恶性黑色素瘤、脑瘤、肾细胞癌、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤。
在一个实施方案中，所述病原体抗原与所述半流体的量比(w/w)为(0.1-20)/100或(0.25-10)/100。
在一个实施方案中，所述免疫调节类抗体选自以下组之一种或多种：针对抑制性受体的抗体阻断剂，例如针对CTLA-4分子和PD-1分子的阻断性抗；针对抑制性受体的配体的抗体阻断剂、针对免疫反应细胞表面刺激分子的激活性抗体，例如抗OX40抗体、抗CD137抗体、抗4-1BB抗体；针对实体肿瘤微环境中免疫抑制性分子的中和抗体，例如抗TGF-p1抗体。在一个实施方案中，所述免疫调节类抗体与所述半流体的量比(w/w)为(0.1-20)/100或(0.25-10)/100。
在一个实施方案中，所述细胞因子选自以下之一种或多种：肿瘤坏死因子、干扰素、白介素。在一个实施方案中，所述细胞因子与所述半流体的量比(w/w)为(0.1-10)/100或(0.25-5)/100。
在一个实施方案中，所述化疗药物选自以下组之一种或多种：细胞毒药物、常规无效但局部有效化合物。在一个实施方案中，所述化疗药物和半流体的量比(w/w或v/v)为(0.1-50)/100。
在本申请公开中，术语“细胞毒药物”是指在安全剂量下可以通过吸收作用有效的药物(例如抗肿瘤化疗药物)，其选自药学上可接受的任何细胞毒药物，优选为选自本领域公知的细胞毒药物，更优选为选自中国、美国或欧洲官方主管行政部门(例如FDA或中国药监局)己批准或将批准、或经中国、美国或欧洲官方药典己载入或将载入的抗肿瘤化疗药物。
在一个实施方案中，所述细胞毒药物可以为选自以下组之一种或多种：尿嘧啶衍生物类、环磷酰胺类、吉西他滨类、表柔比星类、抗肿瘤抗生素类、替尼泊苷、金属铂络合物、紫杉烷类；优选为选自以下药物及其类似衍生物一种或多种：5-氟尿嘧啶、吉西他滨、表柔比星、抗实体肿瘤抗生素、替尼泊苷、金属铂络合物、紫杉醇。在一个实施方案中，所述细胞毒药物和半流体的量比(w/w或v/v)为(0.1-15)/100。
在一个实施方案中，所述抗肿瘤化疗药物在所述半流体中的浓度大于其饱和浓度的50％、优选为其饱和浓度的50-500％，其中所述饱和浓度是指所述抗实体肿瘤化疗药物在其药用溶媒中的饱和浓度。
在一个实施方案中，所述常规无效但局部有效化合物选自以下组之一种或多种：氨基酸类营养素、无效芳香化合物、植物或菌类活性成分。在一个实施方案中，所述常规无效但局部有效化合物和半流体的量比(w/w或v/v)为(0.5-50)/100。
在本申请公开中，术语“常规无效化合物”是指在安全剂量下通过吸收作用临床无效的药物(例如抗肿瘤化疗药物)，其选自例如中国、美国或欧洲官方药典己载入的抗肿瘤化疗药物之外的药物。
在本发明的范围内，作为所述氨基酸类营养素的氨基酸、氨基酸盐、寡肽优选为选自以下组中的氨基酸或其盐或者包含或由以下氨基酸构成的寡肽：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、β-丙氨酸、牛磺酸、γ氨基丁酸(GABA)、茶氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸；更优选为选自以下组中的氨基酸或其盐或者包含或由以下氨基酸构成的寡肽：精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸。在一个实施方案中，所述氨基酸类营养素在所述半流体中的浓度(w/w)为大于≥5％、优选为10-35％或18-35％，更优选为15％-35％或20％-35％。
在本申请公开中，术语“无效芳香化合物”是指在安全剂量下通过吸收作用不能有效抑制肿瘤的芳香化合物。所述无效芳香化合物包括药学上可接受的任何无效芳香化合物。在本发明的范围内，所述无效芳香化合物为选自以下组之一种或多种：色素芳香化合物、水杨酸类化合物、喹啉类化合物。在一个实施方案中，所述无效芳香化合物在所述半流体中的浓度(w/v)≥0.35％、优选为0.35-20％。
在本申请公开中，术语“色素芳香化合物”是指药学上可以接受的能够使靶区有选择性的将特定波长的光吸收或反射的芳香化合物，其可以例如包括活体染料、光敏剂和有色化疗药物。在一个实施方案中，所述色素芳香化合物可以为选自以下化合物及其衍生物之一种或多种：亚甲蓝(包括其水合物)、专利蓝、异硫蓝、孟加拉红、混合卟啉类光敏剂、卟啉类化合物(例如卟啉、卟吩、红紫素、内源性卟啉)、硝基酚化合物。在一个实施方案中，所述色素芳香化合物在所述半流体中的浓度(w/v)≥0.35％、优选为0.5-10％。
在一个实施方案中，所述水杨酸类化合物为选自水杨酸和以下化合物及其衍生物之一种或多种：乙酰水杨酸、二氟苯水杨酸、双水杨酸酯、双香豆素、赖氨匹林。在一个实施方案中，所述水杨酸类化合物在所述半流体中的浓度(w/v)≥0.5％、优选为0.5-5.0％。
在一个实施方案中，所述喹啉类化合物选自水溶性喹啉类化合物，优选为选自以下之一种或多种：奎宁、盐酸奎宁、二盐酸奎宁、氯喹。
在一个实施方案中，所述喹啉类化合物在所述半流体中的浓度(w/v)≥1％、优选为3-6％。
在本申请公开中，术语“植物或菌类活性成分”是指具有药学活性的生物提取物及其类似物。术语“生物提取物”是指以植物、微生物等生物材料为原料、通过分离过程及其它加工过程获取的特定组分(例如基于特定结构的纯化物)。术语“类似物”是指虽不相同、但结构或/和性质上相似的天然产物、衍生物、半合成物、或合成物。在本发明的范围内，所述植物或菌类活性成分选自具有以下之一种或多种结构的生物提取物及其类似物：苷、多酚、多糖、萜类、黄酮。
在一个实施方案中，所述化疗药物选自以下组之一种或多种：抗疾病化疗药物，例如5-氟尿嘧啶、吉西他滨、表柔比星、抗肿瘤抗生素、替尼泊苷、金属铂络合物、紫杉醇；氨基酸类营养素，例如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、或它们的盐、或包含它们的寡肽；无效芳香化合物，例如亚甲蓝、乙酰水扬酸、奎宁、一盐酸奎宁、二盐酸奎宁；植物或菌类活性成分，例如藻类多糖、药用植物多糖、真菌多糖、青蒿素。
在一个实施方案中，所述药物还任选地包含选自常规佐剂的佐剂。在本申请公开中，术语“佐剂”是指与药物抗原混合后能增强机体针对药物抗原的免疫应答能力、或改变免疫反应类型的本发明公开的添加剂。根据这一定义，药物佐剂与通常意义上的免疫增强剂有所不同，后者起作用往往不必与药物抗原混合。
在本申请公开中，术语“常规佐剂”是指本领域技术人员已知的任意合适佐剂，例如可以是油/乳佐剂。在本申请公开中，术语“油/乳佐剂”是指基于油或/和乳化物的佐剂(例如弗式佐剂、MF59)。
根据本申请公开的半流体中的所述添加剂还可进一步任选地包括赋形剂。所述赋形剂可以是本领域技术人员已知的任意合适者，其可包括例如以下之一种或多种：分散介质、防腐剂、稳定剂、湿润剂和/或乳化剂、增溶剂、增粘剂等。所述增粘剂例如为羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素、聚乙烯毗咯烷酮或明胶。所述防腐剂例如抗氧化剂例(如抗坏血酸)。
根据本发明的药物组合物是用于治疗或抑制局部病变疾病。在本发明的范围中，术语“局部病变疾病”是指具有局部病变症状的疾病，而术语“局部病变”是指动物(优选人类)身体局部部位原生或继生的结构、形态或功能上的不正常，其例如可以是包括以下一种或多种：瘤体、非瘤肿大、局部炎症、分泌腺分泌功能异常等。所述局部部位可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如可以是包括以下一种或多种器官中的局部：分泌系统所在的分泌器官、血液循环系统所在的心血管器官、皮肤等。
在一个实施方案中，所述局部病变疾病包括选自以下疾病组之一种或多种：实体肿瘤、非瘤肿大、局部炎症、分泌腺分泌功能异常。
在一个实施方案中，所述实体肿瘤选自以下组之一种或多种：乳腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、肠癌、口腔癌、胃癌、结直肠癌、支气管癌、喉癌、睾丸癌、阴道癌、子宫癌、卵巢癌、恶性黑色素瘤、脑瘤、肾细胞癌、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤。
根据本申请公开的药物组合物是用于治疗或抑制局部病变疾病，还可与其它疗法相组合施用，例如介入疗法、全身化疗、其它免疫疗法(例如去免疫耐受的免疫疗法)、光动力疗法、声动力疗法、手术干预或此类疗法的组合，以进一步提高疗效。
根据本申请公开的又一个方面，其提供一种用于抗局部病变疾病的药物组合物的制备方法，该药物组合物包含抗局部病变疾病的活性成分以及包含血浆或由血浆形成的半流体，所述方法包括以下步骤：
a.提供血浆和抗局部病变疾病的活性成分；
b.将所述抗局部病变疾病的活性成分加入所述血浆中进行混合，以及对该混合物进行半流体化处理，其中所述半流体化包括以下之一种或多种：粘稠化、液体的凝固化、凝固物的破碎化。
在根据本申请公开的药物组合物制备方法中，所述半流体化处理包括以下之一种或多种：半流体粘稠化、热凝固化、凝固剂凝固化，且其中所述凝固化选自以下之一种或多种：直接热处理、蒸汽热处理、微波热处理、射频热处理、激光热处理，优选为微波热处理。
在根据本申请公开的药物组合物制备方法中，如上制备的半流体状的药物组合物可进行分装，该分装物可作为制剂(优选为植入剂、更优选为注射剂)备临床使用，或进一步制备为冻干制剂(例如注射用粉针剂)备临床使用。
在本申请公开中，术语“注射剂”是指合乎药政当局注射剂标准的可通过针管给药的药物。注射剂包括全身用药注射剂(例如静脉注射剂)和局部用药注射剂(例如皮下给药注射剂、肌内给药注射剂、血液内给药注射剂等)。
在本发明的范围中，所述针管包括例如：常规注射器针管、常规穿刺针、常规植入针、常规灌注针。
所述冷冻干燥处理的工艺条件例如包括：预冻条件为在预冻温度-45℃保持4小时；升华干燥条件为升温速率为0.1℃/分钟、且升至-15℃时至少保持10小时；解吸附干燥条件为30℃保持6小时。该冻干制备物可与液体介质(例如水或含增粘剂的水溶液)混合后直接局部给药。
基于在下文中更详细描述的研究，尽管具体机理尚待进一步研究，本发明的药物显示出快速治疗和后续治疗、短效与长效的有机统一，且对患者正常组织几无损害，从而达到安全、有效治疗疾病的药学效果。
实施例
通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为对本发明的限制。在以下实施例中，所有的试验动物均依照相关法规及行业自律进行。如无特殊说明，所有试验均按常规方法进行。
以下具体实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中所用的部分添加剂列于表1中。
表1
Figure BDA0002152423380000111
在本发明中，L-氨基酸均简写为氨基酸(例如L-精氨酸均简写为精氨酸)，还原型谷胱甘肽简写为谷胱甘肽。
以下实施例中所用的实验动物均为通过专业实验动物公司购入，均为SPF(Specific Pathogen Free，无特定病原体)级动物。以小鼠为例，共有5种：BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠、CB6F1小鼠、CC3HF1小鼠、裸小鼠，其中：CB6F1小鼠为BALB/c×C57BL/6杂交F1代雌性小鼠(表型为H-2b/d)，CC3HF1小鼠为BALB/c×C3H杂交F1代雌性小鼠(表型为H-2d/k)、裸小鼠为裸基因(nu)导入BALB/c小鼠获得的突变系(BALB/c–nu)小鼠。小鼠均为6-8周龄健康雌性、体重17.5-20.5g。除非另有说明，在以下实施例中，BALB/c小鼠被简写为B鼠，C57BL/6小鼠被简写为C鼠。实验动物器官和组织均为通过实验动物公司购入或用实验动物依规作常规制备，包括血液、血浆等。人血液、人白细胞、人血浆从法规规定的处置机构合法获得。
在以下实施例中，除非另有说明，皮下移植瘤动物试验均依据药管当局颁发的试验指南、按常规的实体瘤细胞皮下接种方法进行。除非另有说明，实体瘤长至所需体积(例如小鼠荷瘤30-500mm3)则为建模成功，然后采用PEMS 3.2软件(四川大学华西公共卫生学院编制)随机分为若干个实验组，每组6只动物。试验观察、测量和分析的项目，包括一般状态、体重、摄食量、动物移植物抗宿主病、实体瘤体积、瘤重、生存时间等。
实体瘤体积计算公式如下：
实体瘤体积(V)＝l/2×a×b2，其中a表示实体瘤长，b表示实体瘤宽。
实体瘤生长抑制率(本发明中简记为抑瘤率)计算公式如下：
抑瘤率Y(％)＝(CW-TW)/CW×100％，其中TW为研究组的平均瘤重；CW为阴性对照组的平均瘤重。
在以下实施例中，实验结果(例如瘤重)采用均数±标准差(x±s)表示，两个实验动物组与组均数之间的差别采用统计学软件SPSS 19.0软件进行显著性检验来比较，检验选用统计量t来进行，检验水准α＝0.05，P<0.05表示差异有统计学意义，否则无统计学意义。
在本发明的范围內，A药和B药的组合物记为B/A。以下实施例中，除非另有说明，A药和B药分别为包含血浆的半流体和活性组分。除非另有说明，A、B、A/B的药效均为抑瘤率。改善抗肿瘤药物的药效一直是世界最大的医药难题。哪怕百分之几的药效提高也难之又难，以致于联合用药的理论预期通常不高，而一旦实现就意义重大。药物联合使用产生的药效，理论上可依据于q判断进行：
q＝实际合用效应/理论单纯相加预期效应。
当q＝1时，实际合用效应符合理论预期，显示为相加作用；当q<1时，实际合用效应弱于理论预期，显示为拮抗作用；当q>1时，实际合用效应超理论预期，显示为协同作用。
本申请公开中使用的q计算基于Burgi法(Burgi Y.Pharmacology；Drug actionsand reactions.Cancer res.1978，38(2)，284-285)的金正均改进法(金正均，合并用药中的相加，中国药理学报1980；1(2)，70-76)：
q＝EA+B/(EA+EB-EA·EB)，
其中EA+B为A药和B药实际合用效应，EA为A药单用效应，EB为B药单用效应，(EA+EB-EA·EB)为A药和B药理论单纯相加预期效应。为了更符合动物实验中的实际误差范围，他进一步用q＝1±15％代替q＝1作为相加作用的判定式。
文献中常见的另一种抗肿瘤联合用药药效判断方法，基于显著性检验(例如p判断)。在以下抗肿瘤动物实验中，将既合乎q判断又合乎p判断的组合物的药学效应(抑瘤率)判断为实际合用效应与理论预期之间的明显关系：
1).当0.85≤q≤1.15、以及EA+B与EA之间或EA+B与EB之间的差异无统计学意义(p≥0.05)，则判断为相加作用或未超预期的作用；
2).当q<0.85、以及EA+B与EA之间和EA+B与EB之间的差异有统计学意义(p<0.05)，则判断为明显拮抗作用；
3).当q>1.15、以及EA+B与EA之间和EA+B与EB之间的差异有统计学意义(p<0.05)，则判断为明显协同作用。
实施例1：药物组合物的制备
以下实施例中，所用血浆选自以下组之一种或多种：
1)自动物血液提取的天然血浆；
2)病毒灭活血浆；
3)包含天然血浆主要蛋白质(例如白蛋白、球蛋白和主要凝血蛋白)的血浆组分。
1、血浆半流体的制备
按照现有技术(例如从血液离心)抽取并获得正常血浆。再通过本发明公开的方法，可将血浆进行半流体化处理，制备包含血浆的半流体。下表列举了本实施例制备的部分包含血浆的半流体(制备物编号)、用以制备它的血浆、主要制备步骤、以及制备所达到的作用和其结节性。
表2
编号 血浆 主要制备步骤 半流体化 结节
X1 免血浆 血浆提取+热处理 + +
X2 小鼠血浆 血浆提取+热处理 + +
X3 小鼠血浆 血浆提取+凝固剂凝固+机械破碎 + +
X4 马血浆 血浆提取+热处理 + +
X5 人血浆 血浆提取+热处理 + +
X6 小鼠血浆 血浆提取+原位热处理 + +
X7 小鼠血浆 血浆提取+原位凝固剂凝固 + +
半流体化：表示半流体化的有无(+为有)。
结节：表示能否在注射处形成半流体结节(+为能)，具体如下：将100μl上表中的制备物注射至BALB/c小鼠左腋皮下形成结节，且该结节在食指和拇指掐压下可产生不可逆形变。上述半流体结节的皮下半消失期为1-30日。
小鼠：表中的小鼠均为BALB/c小鼠。
热处理：除原位热处理在体内进行外，其它热处理均在体外制备中进行。
以下列出本发明的半流体的制备试验的几个例子。
实施例1a：处死一只新西兰免并取15ml免血于预置抗凝剂枸橼酸钠的离心杯中，离心获得血浆，将之置于杯中，将杯加可透气盖，再放在蒸汽(约100℃)中蒸5-50分钟，便获得热凝固血浆(上表中X1)。
使用与X1制备相同的方法，可分别使用不同血浆进行上表中制备物X2、X4和X5的制备。
实施例1b：从多只小鼠眼眶取血提取血浆，加入预置凝血剂(例如终浓度10-100U/1ml的凝血酶和5-25mmol/L的氯化钙)的杯中混合均匀，静置30分钟后再经搅拌破碎(转速3000-10000转/分、总时间1-3分钟)便获得上表中制备物X3。
实施例1c：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并离心分离出血浆，再将0.5ml血浆注射入局部病变内，同时对局部病变内的注入血浆进行热处理(例如65℃、1分钟)便获得上表中制备物X6。
实施例1d：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并离心分离出血浆，再通过双管(一管内装0.5ml血浆、另一管内装0.25ml浓度为500IU/ml的凝血酶)单针注射系统注射入局部病变内，便获得上表中制备物X7。
2、包含血浆半流体和活性成分的组合物以及药物的制备
本发明的包含血浆的半流体作为活性成分的协同成分用于药物制备。其中所述活性成分包括生物制品和/或组织破坏剂。
组织破坏剂和绝大多数生物制品通过商业途径获得(例如表1)。细胞制品在实验室制备。例如，按照现有技术抽取并获得正常血液，再通过离心分离获得白细胞、红细胞、血小板、血浆。又例如，按照现有技术从动物脾经红细胞裂解去除处理后获得淋巴细胞液：将动物处死后取脾并温和破碎，再分别加入无血清DMEM培养液、红细胞裂解液，温和搅拌后静止5钟，进行离心洗涤3次(离心条件为1 000rpm/min，沉淀重悬液为无血清DMEM)。沉淀用PBS重悬为淋巴细胞液(109个细胞/ml)。
本实施例所用肿瘤抗原按如下方法制备：将肿瘤细胞液(108-109个细胞/ml)进行常规的冻融灭活处理(放入低于-80℃液氮中30分钟，然后在37℃解冻融化，此冷冻-融化进行3次)后，经常规的肿瘤细胞移植瘤实验验证为不致瘤，即可用作肿瘤抗原，自各自肿瘤细胞液获得的肿瘤抗原包括自各自肿瘤细胞液获得的肿瘤抗原包括：肉瘤抗原(S180细胞)、肝癌抗原(H22细胞)、结肠癌抗原(CT26细胞)、乳腺癌抗原(4T1细胞)、黑色素瘤抗原(B16细胞)、肺癌抗原(LLC细胞)。
通过本发明公开的方法，可在血浆进行半流体化处理前、中、后加入活性成分并适当混合，制备出本发明的包含血浆和活性成分组合物的半流体。下表列举了本实施例制备的部分半流体组合物(制备物编号)、用以制备它的优选组织和优选活性成分、主要制备步骤、以及制备所达到的作用和其结节性。
表3
Figure BDA0002152423380000141
Figure BDA0002152423380000151
细胞比容：细胞比容按常规测定方法测定(例如使用全自动血液细胞分析仪BC5000)。
例如，43％细胞比容的小鼠血液中的细胞浓度为11×109个/ml。
半流体化：表示半流体化的有无(+为有)。
结节：表示能否在注射处形成半流体结节(+为能)，具体如下：将100μl上表中的制备物注射至BALB/c小鼠左腋皮下形成结节，且该结节在食指和拇指掐压下可产生不可逆形变。上述半流体结节的皮下半消失期为1-30日。
小鼠：表中的小鼠均为BALB/c小鼠。
混合搅拌：在本实施例中，除非另有说明，混合搅拌为机械搅拌(转速10-1000转/分、总时间1-3分钟)。
热处理：除原位热处理在体内进行外，其它热处理均在体外制备中进行。
以下列出本发明的包含血浆和活性成分的半流体的制备试验的几个例子。
实施例1e：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合、离心后获得血浆，将4.9g该血浆与0.1g5-Fu在杯中搅拌均匀，再对杯加盖加盖可透气盖，放入蒸汽(约100℃)中蒸5-50分钟，便获得表3中制备物Y1。
使用与Y1制备相同的方法，可分别进行表4中制备物Y2、Y3、Y4的制备。
实施例1f：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合、离心后获得血浆，将5g该血浆与500万单位α干扰素在杯中搅拌均匀，再对杯加盖加盖可透气盖，放入蒸汽(约100℃)中蒸5-15分钟，便获得500万单位α干扰素/5g小鼠血浆半流体组合物(制备物Y5)。
当使用其它动物的血浆、或使用其它细胞因子时使用相同的方法，可分别制备细胞因子/血浆半流体组合物(例如Y6)。
实施例1g：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合、离心后获得血浆，将4.95g该血浆与0.05g抗PD-1抗体在杯中搅拌均匀，再对杯加盖加盖可透气盖，放入蒸汽(约100℃)中蒸5-15分钟，便获得1％抗PD-1抗体/99％小鼠血浆半流体组合物(制备物Y7)。Y7为可注射半流体，分装至注射器后即可作为疫苗使用。
当使用其它动物的血浆、或使用其它免疫调节类抗体时使用相同的方法，可分别制备免疫调节类抗体/血浆半流体组合物。
实施例1h：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合、离心后获得血浆，将2ml该血浆与3ml淋巴细胞沉淀(细胞比容72％)在杯中搅拌均匀，再加盖可透气盖，放入蒸汽(约100℃)中蒸5-15分钟，便获得制备物Y8。
实施例1i：将2g人血浆与3g人白细胞沉淀在杯中搅拌均匀，再加盖可透气盖，放入蒸汽(约100℃)中蒸5-15分钟，便获得制备物Y9。
实施例1j：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合、离心后获得血浆，将1.5ml该血浆与1ml肝癌细胞冻融灭活液(109个细胞/ml)在杯中搅拌均匀，再对杯加可透气盖，放入蒸汽(约100℃)中蒸5-50分钟，便获得上表中制备物Y10。
实施例1k：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合、离心后获得血浆，将2.5ml该血浆与2.5ml肺癌细胞冻融灭活液(109个细胞/ml)在杯中搅拌均匀，再置于塑料袋中密封好，放入液氮(低于-80℃)中30分钟冷冻，然后在37℃解冻融化，此冷冻-融化可进行一次或多次，便获得上表中制备物Y11。
实施例1l：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合，将1.5ml该血液与1ml小鼠淋巴细胞液(109个淋巴细胞/ml)在杯中搅拌均匀，再加盖可透气盖，放入蒸汽(约100℃)中蒸5-15分钟，便获得制备物Y12。
实施例1m：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合、离心后脱除40％体积血清的脱血清血液加入杯中，再对杯加可透气盖，放入蒸汽(约100℃)中蒸5-50分钟，便获得上表中制备物Y13。
实施例1n：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合，将1.5ml该血液与1ml肝癌细胞冻融灭活液(109个细胞/ml)在杯中搅拌均匀，再对杯加可透气盖，放入蒸汽(约100℃)中蒸5-50分钟，便获得上表中制备物Y14。
实施例1o：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合，将1.5ml该血液与1ml肺癌细胞液(109个细胞/ml)在杯中搅拌均匀，再置于塑料袋中密封好，放入液氮(低于-80℃)中30分钟冷冻，然后在37℃解冻融化，此冷冻-融化可进行一次或多次，便获得上表中制备物Y15。
实施例1p：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合、离心后获得血浆，将1.5ml该血浆与1ml乳腺癌细胞冻融灭活液(109个细胞/ml)和25mg5-Fu在杯中搅拌均匀，再对杯加可透气盖，放入蒸汽(约100℃)中蒸5-50分钟，便获得上表中制备物Y18。如果加入的是25mg亚甲蓝而非5-Fu，便获得上表中制备物Y19。
实施例1q：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合、离心后获得血浆，将0.9ml该血浆与1.5ml淋巴细胞液(109个淋巴细胞/ml)和25mg亚甲蓝在杯中搅拌均匀，再加盖可透气盖，放入蒸汽(约100℃)中蒸5-15分钟，便获得制备物Y20。
上述制备物均为可注射半流体，分装至注射器后即可作为药物使用。
实施例1r：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合、离心后获得血浆，将4.9g该血浆与0.1g5-Fu在杯中搅拌均匀，再将0.5ml混合物注射入局部病变内，同时对局部病变内的注入混合物进行热处理(例如65℃、1分钟)便获得上表中制备物Y16。
实施例1s：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合、离心后获得血浆，将4.9g该血浆与0.1g5-Fu在杯中搅拌均匀，再通过双管(一管内装0.5ml混合物、另一管内装0.25ml浓度为500IU/ml的凝血酶)单针注射系统注射入局部病变内，便获得上表中制备物Y17。
上述制备物可作为药物使用，其半流体化或凝固化在原位进行。
实施例2：包含血浆和生物制品的半流体组合物协同作用方案
在一个试验中，试验动物为BALB/c小鼠，建模细胞为乳腺癌4T1细胞，以1×106个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物(瘤体平均体积206mm3)随机分为16个试验组(如下表所示)。试验组分为2个系列，尾静脉注射系列有1个阴性对照组(01组)和3个研究组，皮下注射系列有1个阴性对照组(02组)和11个研究组。阴性对照物均为生理盐水，研究药物如下表所示。研究药物的制备如下：
小鼠血浆从加有抗凝剂(枸橼酸钠)的BALB/c小鼠新鲜血液离心分离而制备。乳腺癌抗原为从按上述相同建模方法获得的荷乳腺癌小鼠的瘤体再经实施例1所述方法制备获得的乳腺癌细胞冻融灭活液(109个细胞/ml)。50％小鼠血浆为50％小鼠血浆和50％生理盐水的混合物。乳腺癌抗原/小鼠血浆为50％乳腺癌细胞冻融灭活液(109个细胞/ml)和50％小鼠血浆的混合物。乳腺癌抗原/小鼠血浆半流体为乳腺癌抗原/小鼠血浆经加热凝固形成的半流体(按实施例1中的制备物Y11的制备方法制备)。
人白细胞沉淀、人血浆为按照现有技术抽取并获得正常血液后通过离心分离获得。人白细胞液1、人白细胞液2、人白细胞液3分别为人白细胞沉淀加入生理盐水获得的稀释液体，它们的血细胞比容分别为30％、40％、60％。血细胞比容按常规方法测定。50％人血浆为50％人血浆和50％生理盐水的混合物。人白细胞/人血浆半流体1、人白细胞/人血浆半流体2、人白细胞/人血浆半流体3分别为以血浆替代人白细胞液1、人白细胞液2、人白细胞液3中的生理盐水的混合物经加热凝固形成的半流体(按实施例1中的制备物Y9的制备方法制备)。
人白细胞沉淀、人血浆为按照现有技术抽取并获得正常血液后通过离心分离获得。人白细胞液为人白细胞沉淀(血细胞比容70.5％)加入等体积生理盐水获得的血细胞比容为35％的稀释液体。50％人血浆为人血浆和等体积生理盐水的混合物。人白细胞/人血浆为人白细胞沉淀加入等体积血浆的混合物(血细胞比容为35％)。血细胞比容按常规方法测定。人白细胞/人血浆半流体为以人白细胞/人血浆经加热凝固形成的半流体(按实施例1中的制备物Y9的制备方法制备)。人白细胞/人血浆半固体为上述人白细胞/人血浆中加入猪凝血酶(终浓度100U/1ml)和氯化钙(终浓度20mmol/L)形成的凝胶(半固体)，将其切割为体积约400mm3的小块使用。
各实验组均如下表所示用药方式(皮下注射为在左腋皮下注射)用药一次，每次用药200μl/只。研究组12通过手术将半固体移植入小鼠左肋皮下。其它各实验组的药物均通过注射器注射。给药后第14日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表4。
表4
Figure BDA0002152423380000181
Figure BDA0002152423380000191
注：+为形成结节，-为不形成结节；x为瘤重平均值(g，以下表皆相同)
在上表中，在行静脉注射的研究组3、2、1之间，组合物组的q判断(q＝0.88)显示出相加作用，然而研究组3与1之间、和3与2之间的瘤重差异均无统计学意义(分别为P＝0.7691>0.05、P＝0.8943>0.05)，于是组合物组显示的相加作用并不明显。在行皮下注射的研究组6、5、4之间，组合物组的q判断(q＝1.01)显示出相加作用，然而研究组6与5之间的瘤重差异虽有统计学意义(P＝0.0166<0.05)但6与4之间的瘤重差异无统计学意义(P＝0.3980>0.05)，于是组合物组显示的相加作用并不明显。该结果说明，液体组合物无论行静脉注射还是皮下注射，均未显示出协同作用、甚至未显示出明显加和作用。
然而，在研究组7、5、4之间，组合物组的q判断(q＝2.09>1.15)显示出协同作用，且研究组7与5之间、7与4之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.0015<0.05、P＝0.0276<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。研究组7与6的结果说明，液体血浆和血浆半流体与活性组分之间具有完全不同的相互作用。
在上表中，研究组8、9、10的抑瘤率均低。在研究组8、9、10之间，研究组9的q判断(q＝1.13)显示出相加作用，然而研究组9与8之间、和8与10之间的瘤重差异均无统计学意义(分别为P＝0.0931>0.05、P＝0.3762>0.05)，于是组9(人白细胞/人血浆液体组合物)并未显示出明显的肿瘤负荷减小相加作用。然而，在研究组8、10、11之间，组合物组11的q判断(q＝4.71>1.15)显示出协同作用，且研究组11与8之间、11与10之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.0008<0.05、P＝0.0011<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。
此外，研究组9、11、12的抑瘤率相差较大。研究组11的药效不仅超过研究组9和研究组12的药效，甚于显示出超过这两组加和作用的药效(q＝1.69>1.15)，且研究组11与9之间、11与12之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.0271<0.05、P＝0.0472<0.05)。该结果说明，既使组成相同、浓度相同、用药方式相同，只须形态结构不同(液体、半流体、半固体)，包含细胞/血浆的组合物便有可能显示出明显不同的肿瘤负荷减小效应。这显示出半流体可能与液体和半固体具有完全不同的免疫作用机理。
使用实施例1中的其它制备物(例如Y5-Y7等)，也可获得类似的协同效应。
以上结果及更多类似研究说明，本发明的包含血浆和抗原(更一般地，具有免疫作用的生物制品)的半流体组合物对治疗局部病变有协同作用。该协同作用的形成，有可能是因为包含血浆的半流体对所述抗原的免疫协同作用，并对抗原起到缓释载体的作用。
实施例3：包含血浆和化疗药物的半流体组合物协同作用方案研究
在一个试验中，试验动物为裸小鼠，建模细胞为肉瘤S180，以1×106个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物(荷肉瘤小鼠，瘤体平均体积331mm3)随机分为6个试验组(1个阴性对照组和5个研究组)。阴性对照物为生理盐水，研究药物分别为小鼠血浆和无水乙醇(阳性对照物)。小鼠血浆系从加有抗凝剂(枸橼酸钠)的裸小鼠新鲜血液离心分离获得。各实验组均用药一次。根据预先的副反应试验的结果，裸小鼠血浆用药400μl/只，无水乙醇用药150μl/只，用药方式如下表所示。
微波加热所用仪器为FORSEA MTC-微波消融治疗仪(频率2 450MH，功率输出范围0-100W，微波辐射芯线长0.3cm，直径1.2mm)。将电极针插入小鼠肿瘤块，输出功率为30W，作用时间为45秒。
裸小鼠为先天性无胸腺的nude小鼠的位于第11对染色体上的隐性突变基因“nu”导入BALB/c小鼠所获小鼠。裸小鼠胸腺仅有残迹或异常上皮，不能使T细胞正常分化，缺乏成熟T细胞的辅助、抑制和杀伤功能，细胞免疫力低下。荷肉瘤裸小鼠用药后第7日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表5。
表5
组号 研究药物 给药方式 瘤重(x±s) 抑瘤率
0 生理盐水 瘤内注射 2.08±0.30g -
1 无水乙醇 瘤内注射 1.31±0.24g 37％
2 无水乙醇 瘤内注射后微波加热 1.19±0.18g 43％
3 小鼠血浆 瘤内注射 1.93±0.29g 7％
4 小鼠血浆 瘤内注射后微波加热 1.14±0.26g 45％
5 - 微波加热 1.50±0.12g 28％
在上表中，研究组2与研究组1之间的瘤重差异无统计学意义(P＝0.3971>0.05)，而研究组4与研究组3之间之间的瘤重差异有统计学意义(P＝0.0006<0.05)。此外，研究组2与研究组5之间、和研究组4与研究组5之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.0065<0.05、P＝0.0127<0.05)。该结果及更多类似研究说明，血浆凝固物具有液体血浆所没有的组织破坏协同作用。
在一个试验中，试验动物为BALB/c小鼠，建模细胞为乳腺癌4T1细胞，以1×106个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物(瘤体平均体积217mm3)随机分为9个试验组(如下表所示)。试验组分为2个系列，尾静脉注射系列有1个阴性对照组(01组)和3个研究组，皮下注射系列有1个阴性对照组(02组)和4个研究组。阴性对照物均为生理盐水，研究药物如下表所示。研究药物的制备如下：
小鼠血浆从加有抗凝剂(枸橼酸钠)的BALB/c小鼠新鲜血液离心分离而制备。1％5-Fu为浓度为1％的5-Fu水溶液。1％5-Fu/99％小鼠血浆为40mg5-Fu与4.6g小鼠血浆的混溶物。1％5-Fu/99％小鼠血浆半流体为1％5-Fu/99％小鼠血浆经加热凝固形成的半流体。
各实验组如下表所示用药方式用药一次，每次用药200μl/只。给药后第14日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表6。
表6
Figure BDA0002152423380000211
*：+为形成结节，-为不形成结节
在上表中，在行静脉注射的研究组3、2、1之间，组合物组的q判断(q＝1.01)显示出相加作用，而研究组3与1之间的瘤重差异有统计学意义(P＝0.0167<0.05)但研究组3与2之间的瘤重差异无统计学意义(P＝0.7578>0.05)，于是组合物组显示的相加作用并不明显。在行瘤内注射的研究组6、5、4之间，组合物组的q判断(q＝1.05)显示出相加作用，而研究组6与4之间的瘤重差异有统计学意义(P＝0.0043<0.05)但研究组6与5之间的瘤重差异无统计学意义(P＝0.5727>0.05)，于是组合物组显示的相加作用并不明显。该结果说明，液体组合物无论行静脉注射还是瘤内注射，均未显示出协同作用、甚至未显示出明显加和作用。
然而，在行瘤内注射的研究组7、5、4之间，组合物组的q判断(q＝1.49>1.15)显示出协同作用，且研究组7与5之间、7与4之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.0075<0.05、P＝0.0004<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。研究组7与6的结果说明，液体血浆和血浆半流体与活性组分之间具有完全不同的相互作用。
使用实施例1中制备的其它组合物(例如Y1-Y4、Y18-Y20等)，也可获得显示其协同作用的类似结果。
在一个试验中，试验动物为裸小鼠，建模细胞为肉瘤S180，以1×106个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物(荷肉瘤小鼠，瘤体平均体积224mm3)随机分为14个试验组(1个阴性对照组和13个研究组)，并在动物瘤内给药。阴性对照物为生理盐水，研究药物如下表所示。其中：小鼠血浆从加有抗凝剂(枸橼酸钠)的BALB/c小鼠新鲜血液离心分离而制备。化疗药物(5-Fu、亚甲蓝、氨基酸)溶液均为所示浓度的水溶液。化疗药物/小鼠血浆半流体均为所示浓度的化疗药物与小鼠血浆的混溶物经加热凝固形成的半流体(按实施例1中的制备物Y1、Y3、Y4方法的制备)。
各实验组如下表所示用药方式用药一次，每次用药200μl/只。给药后第14日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表7。
表7
Figure BDA0002152423380000221
在上表中，在5-Fu/血浆半流体组合物研究组中，研究组5的抑瘤率大于研究组4。在研究组4、2、1之间，组合物组的q判断(q＝1.01)显示出相加作用，而研究组4与2之间的瘤重差异有统计学意义(P＝0.0430<0.05)但研究组4与1之间的瘤重差异无统计学意义(P＝0.3467>0.05)，于是组合物组未显示出明显的相加作用。然而，在研究组5、3、1之间，组合物组的q判断(q＝1.18>1.15)显示出协同作用，且研究组5与3之间、5与1之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.0018<0.05、P＝0.0281<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。根据该结果及更多结果，5-Fu与血浆半流体的组合物(更一般地，类似的细胞毒药物与血浆半流体的组合物)的协同量比(w：w)为>0.05/100，优选为≥0.1/100。
在上表中，在亚甲蓝/血浆半流体组合物研究组中，研究组9的抑瘤率大于研究组8。在研究组8、6、1之间，组合物组的q判断(q＝1.80>1.15)显示出协同作用，且研究组8与6之间、8与1之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.0160<0.05、P＝0.0405<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。在研究组9、7、1之间，组合物组的q判断(q＝4.22>1.15)显示出协同作用，且研究组9与7之间、9与1之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.0072<0.05、P＝0.0001<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。根据该结果及更多结果，亚甲蓝与血浆半流体的组合物(更一般地，类似的染色剂与血浆半流体的组合物)的协同量比(w：w)包括0.25/100-2.04/100。
在上表中，在氨基酸/血浆半流体组合物研究组中，研究组13的抑瘤率大于研究组12。在研究组12、10、1之间，组合物组的q判断(q＝1.39>1.15)显示出协同作用，且研究组12与10之间、12与1之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.0099<0.05、P＝0.0008<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。在研究组13、11、1之间，组合物组的q判断(q＝1.27>1.15)显示出协同作用，且研究组13与11之间、13与1之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.0369<0.05、P＝0.0001<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。根据该结果及更多结果，氨基酸与血浆半流体的组合物(更一般地，类似的常规无效化合物与血浆半流体的组合物)的协同量比(w：w)包括17.65/100-33.33/100。
本实施例以上结果及更多类似研究说明，包含本发明的血浆和化疗药物的半流体组合物对病变组织有协同破坏作用。该协同作用的形成，有可能是因为包含血浆的半流体的组织破坏协同，并对所述化疗药物起到缓释载体的作用。
根据上述多个实施例的研究及更多的类似研究，包含血浆的半流体可以作为协同组分应用于抗局部病变药物的制备。具体而言，其可以作为疫苗佐剂或/和载体与其它免疫药物(例如免疫生物制品)形成组合物用于抗局部病变疾病免疫药物(例如病原体疾病疫苗)的制备，也可以作为组织破坏成分或/和载体与化疗药物形成组合物用于抗局部病变疾病免疫药物(例如抗局部病变疾病的免疫-化疗复合药物)的制备。
本发明的组合物的必要条件为：其组成和形态使得其可激发比活性成分单用更有效的免疫应答、和/或更有效的化疗效果的半流体结节。于是，本发明的组合物的基本技术方案为：
包含血浆的半流体作为抗病原体疾病活性成分的协同组分应用；
上述包含血浆和活性成分的半流体选自包含所述活性成分和血浆的混合物的原位凝固物、或/和包含所述活性成分和血浆的半流体凝固物制备物，其中所述半流体凝固物制备物选自以下组之一种或多种：包含所述活性成分和血浆的半流体粘稠物、包含所述活性成分和血浆的半流体凝固物、包含所述活性成分和血浆的凝固物的破碎物，更优选为选自以下组之一种或多种：包含所述活性成分和血浆的凝固物、包含所述活性成分和血浆的凝固物的破碎物；
上述半流体中所含血浆远离其天然状态；
上述包含血浆和活性成分的半流体包含在所述药物的病变区用药和/或病变外局部用药中；
上述包含血浆和活性成分的半流体为半流体植入剂、优选为半流体注射剂。其中所述半流体注射剂为可以以半流体方式通过常规注射系统直接用药的注射剂，而半固体移植物则往往通过手术植入、或以流体(液体)方式通过常规注射系统用药后在用药处形成半固体(例如凝胶化)结节。
在更优选的条件下，本发明的包含血浆和抗病原体疾病活性成分的半流体组合物显示出免疫协同作用、化疗协同作用和/或载体协同作用。该半流体组合物的协同条件为：所述活性成分与所述组合物的量比(w/w或v/v)为(0.1-77)/100，所述血浆和组合物的量比(w/w或v/v)为≥23％、优选为23％-99.9％。
更优选地，所述活性成分的浓度为大于或等于其在单独局部给药时产生作用的浓度，其中：
所述生物制品的浓度为大于或等于其在单独局部给药时产生作用的浓度，例如：所述细胞制品在所述组合物中的细胞比容为>22％(或细胞浓度为>5.6×109个/ml)、优选为33％-86％(或细胞浓度为8.4×109个/ml-22×109个/ml)或45％-86％(或细胞浓度为11.5×109个/ml-22×109个/ml)，所述肿瘤抗原的含量为大于105个/ml、优选为105～109个/ml个肿瘤细胞所包含的肿瘤抗原，所述微生物抗原的浓度为>0.1％，所述免疫调节类抗体药物的含量为≥0.1％、优选为0.25-5％，等等；或/和
所述化疗药物的浓度为大于或等于其在单独局部给药时产生作用的浓度，例如：所述细胞毒药物的浓度大于其饱和浓度的50％、优选为其饱和浓度的50％-500％，所述常规无效化合物的浓度为>0.25％、优选为0.35-30％(例如：所述氨基酸营养素的局部给药浓度为大于5％，优选为5％-30％；所述无效芳香化合物的局部给药浓度为大于0.25％、优选为0.35％-10％；所述植物或菌类活性成分的局部给药浓度为大于0.25％、优选为0.75％-15％)，等等。
实施例4：组合物的更多应用
按照上述研究结果，本发明的包含血浆的半流体作为活性成分的协同成分用于抗局部病变疾病药物的更多的应用被研究。
1、荷瘤裸鼠试验
在以下一个包括9个实验的实验系列中，试验动物为裸小鼠，建模细胞分别为如下所示的9个人实体瘤细胞，分别在动物右侧腋部皮下进行常规的移植瘤建模。每个系列实验中成功建模的试验动物随机分为4个试验组，其中1个阴性对照组和3个研究组(A、B、C组)。阴性对照物为生理盐水，A、B、C研究药物分别为实施例1中的制备物Y1、Y3、Y4。各实验组均瘤内用药1次，每次用药200μl/只。用药后第7日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从各系列的阴性对照组计算抑瘤率，9个系列实验的结果示于以下。
1)、在乳腺肿瘤治疗中的应用
成功建模的荷人乳腺癌细胞(MDA-MB231)裸鼠(瘤体平均体积207mm3)随机分为一个阴性对照组和3个研究组(A、B、C组)。A、B、C组的抑瘤率均值分别为81％、73％、67％，均合乎通常认为的有效抗实体瘤标准(抑瘤率≥40％)。
2)、在肺癌治疗中的应用
成功建模的荷人肺癌细胞(A549)裸鼠(瘤体平均体积189mm3)随机分为一个阴性对照组和3个研究组(A、B、C组)。A、B、C组的抑瘤率均值分别为73％、68％、61％，均合乎通常认为的有效抗实体瘤标准(抑瘤率≥40％)。
3)、在甲状腺癌治疗中的应用
成功建模的荷人甲状腺癌细胞(SW579)裸鼠(瘤体平均体积201mm3)随机分为一个阴性对照组和3个研究组(A、B、C组)。A、B、C组的抑瘤率均值分别为74％、68％、63％，均合乎通常认为的有效抗实体瘤标准(抑瘤率≥40％)。
4)、在前列腺癌治疗中的应用
成功建模的荷人前列腺癌细胞(LNCaP/AR)裸鼠(瘤体平均体积209mm3)随机分为一个阴性对照组和3个研究组(A、B、C组)。A、B、C组的抑瘤率均值分别为81％、73％、65％，均合乎通常认为的有效抗实体瘤标准(抑瘤率≥40％)。
5)、在肝癌治疗中的应用
成功建模的荷人肝癌细胞(HepG2)裸鼠(瘤体平均体积187mm3)随机分为一个阴性对照组和3个研究组(A、B、C组)。A、B、C组的抑瘤率均值分别为79％、71％、64％，均合乎通常认为的有效抗实体瘤标准(抑瘤率≥40％)。
6)、在头颈癌治疗中的应用
成功建模的荷人头颈癌细胞(Fμda)裸鼠(瘤体平均体积207mm3)随机分为一个阴性对照组和3个研究组(A、B、C组)。A、B、C组的抑瘤率均值分别为69％、64％、61％，均合乎通常认为的有效抗实体瘤标准(抑瘤率≥40％)。
7)、在鼻咽癌治疗中的应用
成功建模的荷人鼻咽癌细胞(CNE1)裸鼠(瘤体平均体积183mm3)随机分为一个阴性对照组和3个研究组(A、B、C组)。A、B、C组的抑瘤率均值分别为71％、68％、61％，均合乎通常认为的有效抗实体瘤标准(抑瘤率≥40％)。
8)、在胃癌治疗中的应用
成功建模的荷人胃癌细胞(BGC823)裸鼠(瘤体平均体积217mm3)随机分为一个阴性对照组和3个研究组(A、B、C组)。A、B、C组的抑瘤率均值分别为69％、65％、61％，均合乎通常认为的有效抗实体瘤标准(抑瘤率≥40％)。
9)、在卵巢癌治疗中的应用
成功建模的荷人卵巢癌细胞(PA1)裸鼠(瘤体平均体积179mm3)随机分为一个阴性对照组和3个研究组(A、B、C组)。A、B、C组的抑瘤率均值分别为76％、65％、61％，均合乎通常认为的有效抗实体瘤标准(抑瘤率≥40％)。
使用实施例1中的其它包含组织破坏剂的组合物的制备物，也可获得类似结果。
2、荷瘤小鼠试验
在以下一个包括5个实验的实验系列中，试验动物和建模细胞分别如下所示。建模细胞分别在动物右侧腋部皮下进行常规的移植瘤建模。每个系列实验中成功建模的试验动物随机分为4个试验组，其中1个阴性对照组和3个研究组(A、B、C组)。阴性对照物为生理盐水，A、B、C组研究药物分别为实施例1中的制备物Y8、Y9、Y12。各实验组均在左腋皮下注射用药1次，每次用药250μl/只。用药后第14日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从各系列的阴性对照组计算抑瘤率，实验结果示于以下。
1)、在肝癌治疗中的应用
在一个试验中，试验动物为BALB/c小鼠，建模细胞为肝癌H22细胞(2×106个细胞/只)，在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的荷瘤动物(瘤体平均体积185mm3)随机分为4个试验组(1个阴性对照组和3个研究组)。A、B、C组的抑瘤率均值分别为36％、31％、37％。
2)、在肠癌治疗中的应用
在一个试验中，试验动物为BALB/c小鼠，建模细胞为结肠癌CT26细胞(1×106个细胞/只)，在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的荷瘤动物(瘤体平均体积201mm3)随机分为4个试验组(1个阴性对照组和3个研究组)。A、B、C组的抑瘤率均值分别为39％、35％、33％。
3)、在乳腺癌治疗中的应用
在一个试验中，试验动物为BALB/c小鼠，建模细胞为乳腺癌4T1细胞(1×106个细胞/只)，在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的荷瘤动物(瘤体平均体积187mm3)随机分为4个试验组(1个阴性对照组和3个研究组)。A、B、C组的抑瘤率均值分别为41％、32％、37％。
4)、在恶性黑色素瘤治疗中的应用
在一个试验中，试验动物为C57BL/6小鼠，建模细胞为黑色素瘤B16细胞(1×106个细胞/只)，在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的荷瘤动物(瘤体平均体积206mm3)随机分为4个试验组(1个阴性对照组和3个研究组)。A、B、C组的抑瘤率均值分别为36％、33％、29％。
5)、在肺癌治疗中的应用
在一个试验中，试验动物为C57BL/6小鼠，建模细胞为肺癌(LLC细胞)(1×106个细胞/只)，在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的荷瘤动物(瘤体平均体积184mm3)随机分为4个试验组(1个阴性对照组和3个研究组)。A、B、C组的抑瘤率均值分别为32％、37％、32％。
使用实施例1中的其它包含生物制品的组合物的制备物，也可获得以上类似结果。
根据以上结果以及对导致这些结果的免疫协同、组织破坏协同、和/或缓释协同策略的初步分析，在本发明公开的技术方案下，本发明的组合物中的包含血浆的半流体作为协同成分显示出靶向局部病变(例如瘤体)的特性。
根据上述研究及更多的类似研究，本发明的半流体可以应用于广谱的局部病变疾病的治疗，其中所述局部病变疾病包括选自以下疾病组之一种或多种：实体肿瘤、非瘤肿大、局部炎症、分泌腺分泌功能异常。
具体而言，其中所述实体肿瘤为选自以下组之一种或多种：乳腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、肠癌、口腔癌、胃癌、结直肠癌、支气管癌、喉癌、睾丸癌、阴道癌、子宫癌、卵巢癌、恶性黑色素瘤、脑瘤、肾细胞癌、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤。
本申请公开包括以下项目：
项目1、包含血浆或由血浆形成的半流体作为抗局部病变疾病活性成分的协同成分在制备用于治疗或抑制局部病变疾病的药物组合物中的应用。
项目2、一种用于治疗或抑制局部病变疾病的药物组合物，其包含抗局部病变疾病的活性成分以及包含血浆或由血浆形成的半流体。
项目3、一种治疗或抑制局部病变疾病的方法，其包括向有此需要的个体的局部病变区内和/或局部病变区外通过植入、优选通过注射施用包含抗局部病变疾病的活性成分以及包含血浆或由血浆形成的半流体的药物组合物。
项目4、根据项目1或2的应用、药物组合物或方法，其中所述血浆选自以下组之一种或多种：天然血浆、病毒灭活血浆、包含天然血浆主要蛋白质(例如白蛋白、球蛋白和主要凝血蛋白)的血浆组分。
项目5、根据项目1-4之一的应用、药物组合物或方法，其中所述组合物的组成和形态使得其在用药处形成半流体结节。
项目6、根据项目1-5之一的应用、药物组合物或方法，其中所述活性成分为选自抗局部病变疾病的生物制品或/和化疗药物之一种或多种，且所述活性成分在所述组合物中的量比(w/w或v/v)为(0.1-30)/100。
项目7、根据项目1-6之一的应用、药物组合物或方法，其中所述组合物为选自以下的形式：包含所述活性成分和血浆的混合物的原位凝固物、或/和包含所述活性成分和血浆的半流体凝固物制备物，其中所述半流体凝固物制备物选自以下组之一种或多种：包含所述活性成分和血浆的半流体粘稠物、包含所述活性成分和血浆的半流体凝固物、包含所述活性成分和血浆的凝固物的破碎物。
项目8、根据项目1-7之一的应用、药物组合物或方法，其中所述组合物为包含所述活性成分和血浆的半流体粘稠物的形式。
项目9、根据项目8的应用、药物组合物或方法，其中所述凝固物选自以下之一种或多种：血浆自凝固物、血浆热凝固物、血浆/凝固剂凝固物。
项目10、根据项目1-9之一的应用、药物组合物或方法，其中所述组合物的皮下半消失期为≥0.1日、优选为0.1～30日。
项目11、根据项目1-10之一的应用、药物组合物或方法，其中所述血浆源自同种异体血液和/或自体血液的血浆，其中所述同种异体血液优选为ABO血型相符或HLA相近的同种异体血液。
项目12、根据项目1-11之一的应用、药物组合物或方法，其中所述血浆源自自体血液的血浆。
项目13、根据项目5-12之一的应用、药物组合物或方法，其中所述生物制品选自以下组之一种或多种：细胞制品、病原体抗原、免疫调节类抗体、细胞因子。
项目14、根据项目13的应用、药物组合物或方法，其中所述细胞制品所包含的细胞选自以下组之一种或多种：天然组织中的天然细胞、天然组织组分中的天然细胞、天然细胞制备物和/或工程细胞，其中所述细胞优选为选自同种异体细胞和/或自体细胞。
项目15、根据项目13或14的应用、药物组合物或方法，其中所述细胞制品在组合物中的量比(w/w或v/v)使得其中细胞的含量>22％(或细胞浓度为>5.6×109个细胞/ml)、优选为33％-86％(或细胞浓度为8.4×109-22×109个细胞/ml)或45％-86％(或细胞浓度为11.5×109-22×109个细胞/ml)。
项目16、根据项目13-15之一的应用、药物组合物或方法，其中所述细胞为选自以下组之一种或多种或其衍生物：肌细胞、血细胞、免疫细胞、干细胞，例如间充质干细胞、造血干细胞，其中所述免疫细胞为选自以下组之一种或多种或其衍生物：树突状细胞、巨噬细胞、白细胞，其中所述白细胞为选自以下一种或多种：粒细胞、单核细胞、淋巴细胞，其中所述淋巴细胞选自以下一种或多种：T细胞、B细胞、裸细胞。
项目17、根据项目13的应用、药物组合物或方法，其中所述病原体抗原选自以下组之一种或多种：微生物抗原、肿瘤抗原。
项目18、根据项目17的应用、药物组合物或方法，其中所述微生物抗原选自源于以下微生物组之一种或多种的抗原：细菌，例如以下之一种或多种：化脓性链球菌、豁质沙雷菌、卡介苗、破伤风梭菌、丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌；病毒，例如以下之一种或多种：乙肝病毒、腺病毒、单纯疤疹病毒、牛痘病毒、腮腺炎病毒、新城鸡瘟病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、西尼卡谷病毒、柯萨奇病毒、呼肠孤病毒；寄生虫，例如疟原虫。
项目19、根据项目18的应用、药物组合物或方法，其中所述肿瘤抗原选自包括以下组之一种或多种：乳腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、肠癌、口腔癌、胃癌、结直肠癌、支气管癌、喉癌、睾丸癌、阴道癌、子宫癌、卵巢癌、恶性黑色素瘤、脑瘤、肾细胞癌、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤。
项目20、根据项目13的应用、药物组合物或方法，其中所述免疫调节类抗体选自以下组之一种或多种：针对抑制性受体的抗体阻断剂，例如针对CTLA-4分子和PD-1分子的阻断性抗；针对抑制性受体的配体的抗体阻断剂、针对免疫反应细胞表面刺激分子的激活性抗体，例如抗OX40抗体、抗CD137抗体、抗4-1BB抗体；针对实体肿瘤微环境中免疫抑制性分子的中和抗体，例如抗TGF-p1抗体。
项目21、根据项目13的应用、药物组合物或方法，其中所述细胞因子选自以下之一种或多种：肿瘤坏死因子、干扰素、白介素。
项目22、根据项目5-11之一的应用、药物组合物或方法，其中所述抗局部病变疾病的活性成分为选自包括以下组之一种或多种：细胞毒药物、常规无效但局部有效化合物。
项目23、根据项目22的应用、药物组合物或方法，其中所述细胞毒药物为选自以下之一种或多种：5-氟尿嘧啶、吉西他滨、表柔比星、抗疾病抗生素、替尼泊苷、金属铂络合物、紫杉醇。
项目24、根据项目22的应用、药物组合物或方法，其中所述常规无效但局部有效化合物为选自包括以下组之一种或多种：氨基酸类营养素、无效芳香化合物、植物或菌类活性成分。
项目25、根据项目23的应用、药物组合物或方法，其中所述氨基酸类营养素为选自以下之一种或多种：精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、或它们的盐、或包含它们的寡肽；所述芳香化合物为选自以下之一种或多种：亚甲蓝、乙酰水扬酸、奎宁、一盐酸奎宁、二盐酸奎宁；所述或菌类活性成分为选自具有以下之一种或多种结构的生物提取物及其类似物：苷、多酚、多糖、萜类、黄酮。
项目26、根据项目1-25之一的应用、药物组合物或方法，其中所述局部病变疾病包括选自以下疾病组之一种或多种：实体肿瘤、非瘤肿大、局部炎症、分泌腺分泌功能异常。
项目27、根据项目26的应用、药物组合物或方法，其中所述实体肿瘤为选自以下组之一种或多种：乳腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、肠癌、口腔癌、胃癌、结直肠癌、支气管癌、喉癌、睾丸癌、阴道癌、子宫癌、卵巢癌、恶性黑色素瘤、脑瘤、肾细胞癌、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤。
项目28、根据项目3-27之一的方法，其中所述方法还包括与以下之一种或多种治疗合用：介入疗法、化疗、其它免疫疗法、光动力疗法、声动力疗法、手术干预。
项目29、一种用于抗局部病变疾病的药物组合物的制备方法，该药物组合物包含抗局部病变疾病的活性成分以及包含血浆或由血浆形成的半流体，所述方法包括以下步骤：
a.提供血浆和抗局部病变疾病的活性成分；
b.将所述抗局部病变疾病的活性成分加入所述血浆中进行混合，以及对该混合物进行半流体化处理，其中所述半流体化包括以下之一种或多种：粘稠化、液体的凝固化、凝固物的破碎化。
项目30、根据项目29的制备方法，其中所述半流体化处理包括以下之一种或多种：半流体粘稠化、热凝固化、凝固剂凝固化，且其中所述凝固化选自以下之一种或多种：直接热处理、蒸汽热处理、微波热处理、射频热处理、激光热处理，优选为微波热处理。
项目31、一种根据项目29或30的方法制备的药物组合物。
除本文中描述的那些外，根据前述描述，本发明的多种修改对本领域技术人员而言会是显而易见的。这样的修改也意图落入所附权利要求书的范围内。本申请中所引用的各参考文献(包括所有专利、专利申请、期刊文章、书籍及任何其它公开)均以其整体援引加入本文。

Claims (10)

1.包含血浆或由血浆形成的半流体作为抗局部病变疾病活性成分的协同成分在制备用于治疗或抑制局部病变疾病的药物组合物中的应用。
2.一种用于治疗或抑制局部病变疾病的药物组合物，其包含抗局部病变疾病的活性成分以及包含血浆或由血浆形成的半流体。
3.根据权利要求1或2的应用、药物组合物或方法，其中所述血浆选自以下组之一种或多种：天然血浆、病毒灭活血浆、包含天然血浆主要蛋白质(例如白蛋白、球蛋白和主要凝血蛋白)的血浆组分。
4.根据权利要求1-3之一的应用、药物组合物或方法，其中所述组合物的组成和形态使得其在用药处形成半流体结节。
5.根据权利要求1-4之一的应用、药物组合物或方法，其中所述活性成分为选自抗局部病变疾病的生物制品或/和化疗药物之一种或多种，且所述活性成分在所述组合物中的量比(w/w或v/v)为(0.1-30)/100。
6.根据权利要求1-5之一的应用、药物组合物或方法，其中所述组合物为选自以下的形式：包含所述活性成分和血浆的混合物的原位凝固物、或/和包含所述活性成分和血浆的半流体凝固物制备物，其中所述半流体凝固物制备物选自以下组之一种或多种：包含所述活性成分和血浆的半流体粘稠物、包含所述活性成分和血浆的半流体凝固物、包含所述活性成分和血浆的凝固物的破碎物。
7.根据权利要求1-6之一的应用、药物组合物或方法，其中所述局部病变疾病包括选自以下疾病组之一种或多种：实体肿瘤、非瘤肿大、局部炎症、分泌腺分泌功能异常。
8.一种用于抗局部病变疾病的药物组合物的制备方法，该药物组合物包含抗局部病变疾病的活性成分以及包含血浆或由血浆形成的半流体，所述方法包括以下步骤：
a.提供血浆和抗局部病变疾病的活性成分；
b.将所述抗局部病变疾病的活性成分加入所述血浆中进行混合，以及对该混合物进行半流体化处理，其中所述半流体化包括以下之一种或多种：粘稠化、液体的凝固化、凝固物的破碎化。
9.根据权利要求8的制备方法，其中所述半流体化处理包括以下之一种或多种：半流体粘稠化、热凝固化、凝固剂凝固化，且其中所述凝固化选自以下之一种或多种：直接热处理、蒸汽热处理、微波热处理、射频热处理、激光热处理，优选为微波热处理。
10.一种根据权利要求8或9的方法制备的药物组合物。
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