CN109689094A - 免疫刺激剂 - Google Patents
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Abstract
一种复合体，其包含载体、和在该载体上负载的具有过氧化物酶样活性的蛋白质，所述载体包含通过变性凝固而固体化的源自血浆的蛋白质或源自血清的蛋白质，所述复合体具有能够强烈刺激抗原提呈细胞的高有效性，且减轻对生物体的毒性，能够用作安全性高的免疫刺激剂。
Description
技术领域
本发明涉及免疫刺激剂。更具体而言，涉及包含通过变性凝固而固体化的源自血浆的蛋白质或源自血清的蛋白质作为载体的免疫刺激剂。
背景技术
免疫已知大致有自然免疫和获得免疫两种。在生物体中引起炎症反应的物质主要刺激自然免疫，在数分钟至数天之间引发炎症反应。其后诱导获得免疫，对成为抗原的物质引发特异性反应。该反应中，主要有利用B细胞的液体免疫反应(产生抗体)、和利用T细胞的细胞免疫反应(异常细胞的伤害去除)。疫苗对生物体给予抗原，用于刺激免疫从而预防(根据情况还治疗)感染症等疾病。此外，在期待引发免疫反应的抗原的免疫刺激能力弱(抗原性低)的情况下，可以为了补助免疫刺激而添加免疫佐剂，从而增强对抗原的免疫反应。
免疫佐剂被设计为用以吸附、覆盖、封闭抗原、与抗原共价键合等任意形式与抗原一体化，从而使抗原不容易在体内扩散或消失。这些设计相当于无论抗原引发液体免疫反应还是细胞免疫反应，抗原均暂时被抗原提呈细胞(已知为树状细胞、巨噬细胞、单核细胞、B细胞)摄取并在细胞内处理。被处理的抗原被搭载于主要组织相容性基因复合体(major-histocompatibility complex，简称为“MHC”，以下皆同)上从而提呈给抗原提呈细胞表面，其被辅助性T细胞识别，导致诱导液体免疫反应或细胞免疫反应。因此，为了期待诱导对抗原的免疫反应，免疫佐剂一般与抗原一起由体外给予，或向体内的存在抗原的局部给予。不伴随抗原(因此不必然期待引发该抗原特异性免疫反应)而期待常规的免疫反应系统的刺激作用的物质组通常被分类为“生物反应修饰物质(biological response modifier，BRM)”，著名的物质有云芝多糖、香菇多糖、丸山疫苗。
被抗原提呈细胞摄取并处理的抗原，在MHC之中的class II(II类)分子上提呈的物质主要经过Th2型辅助性T细胞的活化而诱导利用成熟B细胞的抗原特异性抗体产生。抗体是液体免疫反应的主要部分。此外，在MHC之中的class I(I类)分子上提呈的物质主要经过Th1型辅助性T细胞的活化而使抗原特异性细胞杀伤性T细胞(CTL)增殖活化。Th1型辅助性T细胞和CTL是细胞免疫反应的主要部分。在液体免疫反应、细胞免疫反应任一情况中，均可以理解疫苗中的免疫佐剂一般是介由自然免疫而增强获得免疫(非专利文献1)。另外，本说明书中引用的专利文献和非专利文献中的记载的全部通过参考的方式而作为本说明书的公开内容而包括在内。
不仅作为因外来生物而导致的感染症对策，还想要通过体内的免疫系统的活化而治疗在同一个体的体内发生的肿瘤(包括癌症肿瘤)的概念(Coley，1891)自提出起已超过100年。但是，在利用与感染症疫苗相同的方式(即抗原与免疫佐剂的组合)的肿瘤疫苗中，至今难以说在肿瘤治疗中取得了充分的成功。
此外，免疫反应系统中存在使淋巴细胞的活化终止的免疫检查点，而开发越过该障碍而强化免疫反应的方法已成为课题。作为肿瘤的免疫疗法，已知于2014年7月领先于世界而被日本批准的抗PD-1抗体—纳武单抗(Nivolumab)。该抗体药物通过阻碍免疫检查点的作用而具有活化免疫反应的作用，被期望在黑素瘤、肺癌、肾癌等中发挥出高有效性。然而，有效的癌症的种类限定于部分癌症，仅在大约30％左右的症例中发挥功效。此外，例如如脑瘤之中的胶质母细胞瘤那样，存在即使将以往类型的手术、放疗、化疗全部组合进行治疗，术后复发预防也非常困难的难治性肿瘤，因此不仅免疫检查点抑制剂，期待开发其他的利用有效免疫反应的增强的肿瘤治疗方法的这种社会需求极大。
作为免疫佐剂的候选，有引发与自然免疫的pattern-recognition receptors(模式识别受体)结合的物质组。这些中，可以举出作为pathogen-associated molecular patterns(病原体相关分子模式)而已知的外源性的Toll样受体激动剂、NOD样受体激动剂、RIG样受体激动剂、内源性的警报素。除此之外，还有与receptor of advanced glycationendproduct(晚期糖基化终产物受体)结合的物质组、或细胞因子、趋化因子等，其种类庞大(非专利文献2)。
这些免疫刺激物质组之中，作为免疫佐剂，较常用源自细菌的脂蛋白、脂肽、脂磷壁酸酸(Lipoteichoic acid)、源自分枝杆菌的脂聚糖、源自支原体的脂蛋白、源自酵母的酵母聚糖、膜孔蛋白、病毒双链RNA、革兰氏阴性杆菌的脂多糖、脂质A、单磷脂质A、脂多糖体、热激蛋白、鞭毛蛋白、病毒单链RNA、咪唑并喹啉、细菌DNA、CpG DNA、疟色素、尿路致病性细菌、前纤维蛋白、原虫的前纤维蛋白样蛋白质等，除此之外还有皂苷、细菌毒素等(非专利文献1)。作用虽然存在强弱，但它们均为炎症诱导因子，引发导致细胞因子的产生的细胞内信号。
作为炎症诱导因子组的递送系统，已知铝盐、油脂-水乳液(作为乳化剂而包含表面活性剂)、脂质体、病毒体、生物学可分解的人造聚合物小球、Immune stimulating complex(免疫刺激复合物，ISCOM)、角鲨烯、α角生育酚、粘膜递送系统(非专利文献1)。除此之外，还已知磷酸钙(专利文献1)、二氧化硅(非专利文献3和4)。此外，作为细胞因子中免疫反应刺激能力高的物质，已知粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(非专利文献5)，除此之外，还有白介素-12等(非专利文献6)。
作为最强力的免疫佐剂而已知的是弗氏完全佐剂(FCA)(液体石蜡、表面活性剂、结核灭活菌的混合物)(非专利文献3)。然而，由于因强烈的炎症诱导而导致的毒性强，因此迄今只为了实验目的而使用。肿瘤治疗领域中，不含结核灭活菌的弗氏不完全佐剂(IFA)(例如Montanide ISA-51)被尝试作为癌症肽疫苗的免疫佐剂而临床使用(非专利文献7和8)，但已知IFA也诱导强炎症反应，在皮下注射的情况中，经过数月以上甚至一年多的长时间内，残留注射局部的发红和肿胀。
当前，作为感染症对策用疫苗的组合物，在临床上最普及的免疫佐剂是铝盐或氢氧化铝。然而，尽管在液体免疫反应增强上优异，但存在细胞免疫反应的诱导能力低的问题(非专利文献4和6)。
广泛已知的是，在肿瘤的治疗、复发预防中，即使不仅能够刺激自然免疫、还能够刺激获得免疫，仅液体免疫反应诱导也是不充分的，利用细胞免疫反应诱导的辅助性T细胞(特别是Th1型辅助性T细胞)和CTL的活化、和利用CTL的杀肿瘤细胞作用是重要的。为此，要求具有与铝盐或氢氧化铝不同的特征、能够特异性地活化细胞免疫反应的免疫佐剂或免疫刺激剂。然而，如前述FCA或IFA那样，各种公知的免疫佐剂之中，细胞免疫反应诱导能高的物质存在因炎症诱导而导致的毒性也强的倾向，难以进行临床应用。细胞免疫反应增强优异、且毒性低、安全性高的有用免疫佐剂尚不能称为得到充分开发。
本发明人等为了诱导细胞免疫反应而将使白蛋白-肝素团聚体的沉淀物与GM-CSF、白介素-2(IL-2)、和/或纯化结核菌素结合而得到的物质作为免疫佐剂，从而制作以术后摘除福尔马林固定自体肝癌组织切片作为抗原的自体癌症疫苗。该疫苗的安全性高，在用于18名肝癌患者中时，仅示出按照National Cancer Institute-Common Toxicity Criteriav2.0，1999(美国国立癌症研究员通用毒性标准2.0版，1999年)的1～2级的自然治愈的水平的不良事件，不存在1例示出3～4级的危重不良事件的病例。进一步，观察肝癌的术后复发预防效果，还确认了有效性(非专利文献9和专利文献2)。
此外，以术后摘除福尔马林固定肝癌组织切片作为抗原，向作为免疫佐剂而吸附BCG菌提取物(BCGext)的物质、和使白蛋白-肝素团聚体沉淀包含纯化结核菌素并通过交联反应而固定的物质，进一步添加溶解的纯化结核菌素，从而能够用作自体肝癌症疫苗，但是在肝癌病例中，观察到因该疫苗而导致CTL对肝癌特异性抗原分子glypican 3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3)的诱导(非专利文献10)。
以福尔马林固定自体胶质母细胞瘤组织切片作为抗原，向作为免疫佐剂而含有BCGext的物质(专利文献3)、和在白蛋白-肝素团聚体沉淀通过而固定了纯化结核菌素的物质(专利文献4)中，进一步也添加混合溶解的纯化结核菌素，从而能够用作自体脑瘤疫苗。通过该疫苗，在胶质母细胞瘤患者中，与由文献中的过往数据提取出的历史对照组相比，观察到术后总生存期间的延长(非专利文献11、12、13)。这些临床试验中，也示出高安全性，也不存在1例示出3～4级的危重不良事件的病例。
上述的自体脑瘤疫苗中，利用福尔马林固定自体脑瘤组织作为免疫刺激物质的载体，但根据肿瘤患者，无法利用充分量的摘除肿瘤组织的情况也多。因此，需要替代福尔马林固定肿瘤组织，进行深入探索。该开发过程中，提出了使白蛋白负载于作为无机固体物的磷酸钙沉淀上的物质(专利文献1)、或制成白蛋白-肝素团聚体沉淀的形态的物质(专利文献4、5)等在成为基质的不溶性物质负载的形态下将溶解性的血清蛋白质固定化的形态。这些形态中，白蛋白分子本身未变性，形成保持了本来的分子形态的状态。前者的情况中，在磷酸钙沉淀中并入白蛋白分子，后者的情况中，在团聚体状态下直接通过蛋白质分子间交联剂而交联。然而，以往尚未知晓在将白蛋白分子本身预先变性凝固的基础上通过蛋白质分子间交联剂而交联并固体化的物质发挥作为抗原或免疫刺激物质的有效载体的作用。
此外，尽管能够利用由选自包含人在内的动物的组织、细胞、和这些成分构成的组的固体化材料制备的不溶性微粒(专利文献6)，但针对利用在组织细胞外分泌且在血浆中溶解的蛋白质作为组织、细胞、和它们的成分，在上述专利文献6中没有公开，针对这样的技术思想也没有暗示或教导。尚未发现在公开出版物中暗示或教导了将使在血浆(或血清)中溶解的蛋白质本身预先以分子水平变性凝固、并通过蛋白质交联剂处理而制成不溶性固体的物质用作免疫刺激物质的主要载体或者组合物(炎症诱导因子组的递送系统)。
如公知的那样，将动物的组织、细胞、和由这些成分组成的材料给予异种动物时，发生排异反应。在将该材料加工并固体化的情况中，也推定发生排异反应，因此即使该材料能够容易地获取，除抗原性极低的胶原蛋白等部分材料之外，在人的临床中尚未广泛应用。源自人且原本溶解的源自血浆的蛋白质能够较大量地获取，但使这些蛋白质分子变性并加工时，针对对同种的人给予时是否引发排异反应，尚无详细研究。从这样的背景出发，没有文献暗示或教导将源自血浆的蛋白质加工成不溶性从而用作抗原或免疫刺激物质的载体的技术思想，完全不存在文献暗示或教导即使将以这样的方式制备的载体对人给予，也几乎不会引发排异反应，能够贡献于对抗原的获得免疫的增强。进一步，以往没有尝试不与抗原同时给予到同一部位，而仅通过将以分子水平变性凝固并制成不溶性的固体的源自血浆(或血清)的蛋白质作为主要载体而负载免疫刺激物质的免疫刺激剂，即以BRM的方式，刺激生物体，试图强化常规的免疫反应。
另一方面，已知诱导IV型过敏反应(也称为延迟型过敏、细胞免疫、结核菌素型)的代表性物质即结核菌素即使对人反复给予也极为安全(非专利文献14)。在IV型过敏反应中，诱导细胞免疫反应，而且作为液体免疫反应的主要部分的抗体、补体不参与(非专利文献15)。但是，纯化的结核菌素是水溶性的，存在即使直接在体内给予也迅速扩散消失的问题。此外，纯化结核菌素并非肿瘤抗原，因此仅单独使用其可以认为无法期待肿瘤的复发预防·治疗效果。
纯化结核菌素容易吸附于玻璃容器，但能够通过血清白蛋白防止该吸附，因此可以理解纯化结核菌素强烈吸附于血清白蛋白(非专利文献16和17)。然而，在通过以分子水平使血清白蛋白变性凝固并进行蛋白质交联剂处理从而将白蛋白制成不溶性固体的情况中，对纯化结核菌素是否还具有充分的吸附能力在以往是未知的。此外，针对因吸附在这样的白蛋白的不溶性固体上的纯化结核菌素所导致的抗原提呈细胞的刺激性的变化，以往也完全没有进行研究，同样地，针对将白蛋白等源自血浆(或血清)的蛋白质制成不溶性固体，在其上负载纯化结核菌素以外的免疫刺激性物质的情况，免疫活性细胞的刺激性方面是否导致变化以往也没有进行研究。
进一步，血红蛋白通常不溶于血浆中，引起溶血反应时离开至红细胞外从而出现在血浆中，但该血红蛋白中广泛已知存在过氧化物酶样活性。然而，利用血红蛋白的过氧化物酶样活性的免疫刺激剂是以往未知的。与血红蛋白类似的血红素蛋白质即肌红蛋白、细胞色素、和过氧化氢酶也具有过氧化物酶样活性，但利用这些血红素蛋白质的过氧化物酶样活性的免疫刺激剂也是以往未知的。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第4569946号
专利文献2：日本专利第4688254号
专利文献3：日本专利第5579586号
专利文献4：日本专利第3492671号
专利文献5：日本专利第4238279号
专利文献6：日本专利第4176021号
非专利文献
非专利文献1：堺春美，临床和病毒，41(5):1-9，2013.
非专利文献2：博客：EARL的医学笔记、http://drmagician.exblog.jp/16073684
非专利文献3：Stills HF,Jr.Adjuvants and antibody production:Dispelling themyths associated with Freund’s complete and other adjuvants.ILAR Journal,46:280-293,2005.
非专利文献4：Kuroda E,Coban C,Ishii KJ.Particulate adjuvant and innateimmunity:Past achievements,present findings,and futureprospects.Intern.Rev.Immunol.,32:209-220,2013.
非专利文献5：Disis ML,et al.Granulocyte-macrophage colony-stimulatingfactor:an effective adjuvant for protein and peptide-based vaccines.Blood,88:202-210,1996.
非专利文献6：石井健，佐剂开发研究的新展望，第9回日本厚生科学审议会预防接种·疫苗分科会研究开发和生产·流通部会资料1，平成27年1月30日。
非专利文献7：Yutani S,et al.Phase II study of personalized peptidevaccination with both a hepatitis C virus-derived peptide and peptides fromtumor-associated antigens for the treatment of HCV-positive advancedhepatocellular carcinoma patients.J.Immunol.Res.,Article ID 473909,2015.http://www.hindawi.com/journals/jir/2015/473909/
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非专利文献9：Kuang M,et al.Phase II randomized trial of autologousformalin-fixed tumor Vaccine for Postsurgical recurrence of HepatocellularCarcinoma.Clin.Cancer Res.,10:1574-1579,2004.
非专利文献10：Kawashima I,et al.Suppression of postsurgical recurrence ofhepatocellular carcinoma treated with autologous formalin-fixed tumorvaccine,with special reference to glypican-3.Clinical Case Reports,3:444-447,2015.
非专利文献11：Ishikawa E,et al.A clinical trial of autologous formalin-fixed tumor vaccine for glioblastoma multiforme patients.Cancer Sci.,98:1226-1233,2007.
非专利文献12：Muragaki Y,et al.Phase I/IIa Trial of Autologous Formalin-fixed Tumor Vaccine Concomitant with Fractionated Radiotherapy for Initially-Diagnosed Glioblastoma.J.Neurosurg.,115:248-255,2011.
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非专利文献25：Najjam S,et al.Further characterization of the binding ofhuman recombinant interleukin 2to heparin and identification of putativebinding sites.Glycobiology,8:509-516,1998.
非专利文献26：DAKO Educational IHC Guidebook,Immunohistochemical StainingMethods,Sixth Edition,Chapter 15,ed.Tayor CR and Rudbeck L,2013.http://www.dako.com
发明内容
发明要解决的问题
本发明的课题在于，提供具有能够强烈刺激抗原提呈细胞的高有效性、且减轻了对生物体的毒性的安全性高的免疫刺激剂。
用于解决问题的手段
本发明人等为了解决上述的课题而进行深入研究的结果发现，确认到即使将使白蛋白等源自血浆的蛋白质等变性凝固并固体化而得到的材料给予生物体，也不会引发排异反应，但另一方面，在包含这样的通过变性凝固而固体化的白蛋白等的载体上负载血红蛋白等具有过氧化物酶样活性的蛋白质而得到的复合体具有高免疫刺激能力。进一步，还发现上述载体维持了对纯化结核菌素等免疫刺激物质的高吸附性，并发现通过在上述的复合体上负载纯化结核菌素等免疫刺激物质，能够进一步实现强力的免疫刺激能力。本发明基于这样的见解而完成。
即，本发明人提供了以下的发明。
[1]一种复合体，其包含载体、和在该载体上负载的具有过氧化物酶样活性的蛋白质，所述载体包含通过变性凝固而固体化的源自血浆的蛋白质或源自血清的蛋白质。
[2]根据上述[1]所述的复合体，其中，具有过氧化物酶样活性的蛋白质在实质上未变性的状态或变性的状态下负载。
[3]根据上述[1]所述的复合体，其中，具有过氧化物酶样活性的蛋白质在与源自血浆的蛋白质或源自血清的蛋白质一起通过变性凝固而固体化的状态下负载。
[4]根据上述[1]至[3]中任一项所述的复合体，其中，具有过氧化物酶样活性的蛋白质为血红蛋白或肌红蛋白。
[5]根据上述[1]至[4]中任一项所述的复合体，其还负载有1种或2种以上的免疫刺激物质。
[6]根据上述[5]所述的复合体，其中，免疫刺激物质是选自纯化结核菌素、BCG菌提取物、细胞因子、Toll样受体配体、NOD样受体激动剂、RIG样受体激动剂、C型凝集素受体激动剂、与环状GMP-AMP合成酶结合的外源性DNA、警报素、抗原、和抗体构成的组中的1种至2种以上的物质。
[7]一种免疫刺激剂，其包含上述[1]至[6]中任一项所述的复合体。
[8]一种免疫刺激性组合物，其包含上述[7]所述的免疫刺激剂和白蛋白-肝素团聚体沉淀。
[9]根据上述[8]所述的免疫刺激性组合物，其中，白蛋白-肝素团聚体沉淀是吸附有细胞因子的肝素-白蛋白团聚体沉淀。
[10]根据上述[9]所述的免疫刺激性组合物，其中，细胞因子是选自粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、白介素-2、和干扰素γ构成的组中的1种或2种以上的物质。
[11]一种用于治疗和/或预防疾病的药物，其包含上述[7]所述的免疫刺激剂或上述[8]所述的免疫刺激性组合物、和免疫反应抑制作用阻碍物质的组合。
[12]根据上述[11]所述的药物，其用于恶性肿瘤的治疗和/或复发或转移的预防。
[13]根据上述[11]或[12]所述的药物，其中，免疫反应抑制作用阻碍物质是免疫检查点抑制剂。
[14]根据上述[13]所述的药物，其中，免疫检查点抑制剂是选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗CD40抗体、抗CD137抗体、抗OX40抗体、抗TGF-β抗体、抗LAG3抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗TIM3抗体、抗CD96抗体、和抗TIGIT抗体构成的组中的1种或2种以上的抗体。
[15]一种用于预防疾病的疫苗，其包含上述[7]所述的免疫刺激剂或上述[8]所述的免疫刺激性组合物、和抗原的组合。
[16]根据上述[15]所述的疫苗，其中，抗原为肿瘤抗原。
[17]根据上述[16]所述的疫苗，其用于预防恶性肿瘤的复发或转移。
[18]在包括人在内的哺乳类动物中活化免疫的方法，其包括将上述[7]所述的免疫刺激剂或上述[8]所述的免疫刺激性组合物的有效量给予包括人在内的哺乳类动物的步骤。
[19]在包括人在内的哺乳类动物中治疗和/或预防疾病、优选恶性肿瘤的方法，其包括将上述[7]所述的免疫刺激剂或上述[8]所述的免疫刺激性组合物、和免疫反应抑制作用阻碍物质的组合的有效量给予包括人在内的哺乳类动物的步骤。
[20]在包括人在内的哺乳类动物中预防恶性肿瘤的复发或转移的方法，其包括将上述[7]所述的免疫刺激剂或上述[8]所述的免疫刺激性组合物、和抗原的组合的有效量给予包括人在内的哺乳类动物的步骤。
发明的效果
本发明的复合体包含含有通过变性凝固而固体化的源自血浆的蛋白质或源自血清的蛋白质的载体、和在该载体上负载的具有过氧化物酶样活性的蛋白质，优选地，具有过氧化物酶样活性的血红蛋白等蛋白质在与白蛋白等源自血浆的蛋白质或源自血清的蛋白质一起通过变性凝固而固体化的状态下负载的上述复合体具有免疫刺激作用，能够有效地刺激抗原提呈细胞，因此除了对肿瘤等疾病的治疗之外，作为用于预防恶性肿瘤的术后复发或转移的免疫刺激剂也是有用。在进一步优选方式中，通过负载纯化结核菌素等免疫刺激物质，能够用作强力的免疫刺激剂。
本发明所提供的免疫刺激剂是安全的，不会引发在人的临床中使用的CommonTerminology Criteria for Adverse Events(CTCAE)version4.0(不良事件常用术语标准第4.0版，由日本临床肿瘤研究组公布日语翻译JCOG版)中所称的3级以上的问题的不良事件，在临床上可以安全使用。
附图说明
图1是示出在例1的样品2(变性凝固固体化血浆载体)、样品3(在变性凝固固体化血浆载体上吸附了未变性血红蛋白的物质)、样品4(在变性凝固固体化血浆载体上吸附了未变性肌红蛋白的物质)中具有抗原提呈细胞刺激作用的图。
图2是示出例2的样品2～5(白蛋白和血红蛋白混合后经变性凝固固体化而得到的载体：变性凝固固体化血红蛋白/白蛋白微粒(HAMP))的抗原提呈细胞的刺激活性的图。
图3是示出例3中HAMP的源自血红蛋白的过氧化物酶样活性参与对抗原提呈细胞的刺激作用的图。
图4是示出HAMP对纯化结核菌素(PPD)的吸附能力的图。
图5是示出吸附了PPD或hGM-CSF等免疫刺激物质的HAMP所产生的抗原提呈细胞的刺激作用的图。
图6是示出吸附了BCG菌提取物(BCGext)的HAM P所产生的抗原提呈细胞的刺激效果的图。
图7是示出从由吸附了BCG菌提取物(BCGext)的HAMP刺激的抗原提呈细胞同时产生TNFα(图中表示为TNF)和GM-CSF的图。
图8是示出HAMP对抗体的吸附能力的图。
图9是示出HAMP对抗体的吸附能力的图。
图10是示出负载了PPD的HAMP的安全性(小鼠体重变化)的图。
图11是示出负载了PPD的HAMP的安全性(脏器重量变化)的图。NS(not significant，不显著)表示没有确认到显著差异。
图12是示出混合有癌症抗原和免疫刺激剂的癌症疫苗所产生的抗肿瘤效果的图。
图13是示出混合有癌症抗原和免疫刺激剂的癌症疫苗所产生的抗肿瘤效果的图。
具体实施方式
本发明的免疫刺激剂具有对将源自血浆的蛋白质或源自血清的蛋白质变性凝固而固体化的载体、期望通过交联剂处理而制成更稳定的固体状态的固体化载体，负载具有过氧化物酶样活性的蛋白质的复合体的形态；进一步，即使在负载了免疫刺激物质的形态下也能够使用。本发明的免疫刺激剂能够直接给予体内作为BRM使用，也能够用于与抗原一起给予生物体作为免疫佐剂使用。
本说明书中，“免疫刺激剂”和其类似词语(例如“免疫刺激作用”等)除了包括对特定抗原的特异性免疫反应具有直接刺激作用的物质之外，还包括无论有无抗原，对抗原非特异性免疫反应也示出间接刺激作用的物质，必须最广义地进行解释。
“免疫刺激剂”包括(a)与抗原一起使用且期待强化对该抗原的特异性免疫反应的“免疫佐剂”、和(b)不伴随抗原而使用的用于一般性地激活免疫能力的BRM等。此外，(b)中包括(b-1)即使部分也直接刺激免疫反应通路的“免疫反应促进剂”、和(b-2)通过相反地阻碍基于阻碍免疫反应通路的免疫反应抑制作用的作用而间接地进行免疫刺激的“免疫反应抑制作用阻碍剂”。本发明的免疫刺激剂除了能够用作(a)和(b-1)之外，还能够以负载了“免疫反应抑制作用抑制剂”的形态而用作(b-2)。
本发明人等发现，使在血浆或血清中溶解的白蛋白等蛋白质(源自血浆的蛋白质或源自血清的蛋白质变性)以分子水平变性凝固并固体化而制备不溶性的载体，在该载体上负载具有过氧化物酶样活性的血红蛋白、肌红蛋白等蛋白质，由此得到的复合体作为免疫刺激剂是有用的，以及，进一步具有通过在该复合体上负载纯化结核菌素等免疫刺激性物质，从而更强地促进通过成为免疫反应起点的抗原提呈细胞而产生细胞因子(tumor necrosisfactor alpha：肿瘤坏死因子α，TNFα)等的效果。
本发明所提供的包含通过变性凝固而固体化的源自血浆的蛋白质或源自血清的蛋白质的载体是通过使白蛋白等源自血浆或源自血清的蛋白质变性凝固而固体化得到的，一般而言，以具有70μm以下的粒径的水不溶性的微粒的形态而提供。
使原本为水溶解性的源自血浆的蛋白质或源自血清的蛋白质分子地变性凝固从而固体化，制作优选为微粒状的形态的载体的方法没有特别限定，只要是本领域技术人员已知的方法，则可以使用任意方法。作为用于变性凝固的手段，本领域技术人员公知的是例如热变性、酸处理、有机溶剂处理、或表面活性剂处理等，可以单独使用这些处理，或组合使用2种以上的处理。例如，采用通过加热而使蛋白质分子变性从而凝固的方法时，例如能够采用100℃以上的加热处理，但不限于该温度范围。此外，制备微粒形态的载体的方法也没有特别限定，只要是本领域技术人员能够利用的方法，则可以使用任意方法。例如，优选将通过变性凝固而得到的固体机械磨碎，通过具有适当孔径的筛网或过滤器等，从而制备具有期望粒径的微粒状的载体，但不限于此。
在将该微粒形态的固体用作免疫刺激剂的载体的形态中，一般而言，将固体化的微粒形态的载体在水性溶剂中可溶化是不期望的，因此可以从所得微粒状的固体中去除可溶性部分，将作为不溶性的固体残留的物质用作载体。出于这样的目的，根据需要，可以用除了水之外还用乙醇或丙酮等亲水性溶剂清洗固体化的载体。
另一方式中，还能够将固体化的载体用蛋白质分子间交联剂处理，将载体制备为更加稳定化的不溶性的固体。蛋白质分子间交联剂的种类没有特别限定，可以通过本领域技术人员公知的方法使用公知的物质。例如，可以使用甲醛、福尔马林、多聚甲醛、戊二醛、或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)等。例如，优选在10％中性福尔马林液中在室温下经过3天以上浸渍的方法等。此外，例如将EDC制成水溶液，在用涡旋混合器混合的同时添加以使得最终浓度达到0.8～1.5mg/mL，其后，在室温下静置15分钟，由此在固体化的载体中的蛋白质分子间形成充分稳定的交联。尤其地，交联形成的手段不限于上述的特定条件或特定蛋白质分子间交联剂。以上述方式得到的免疫刺激剂、优选充分交联处理的免疫刺激剂即使用水清洗也不溶解，能够适合用作本发明的免疫刺激剂中的载体。
本发明所提供的包含通过变性凝固而固体化的源自血浆的蛋白质或源自血清的蛋白质的载体上，能够负载具有过氧化物酶样活性的蛋白质。该蛋白质可以在实质上未变性的状态下负载于载体上，也可以在变性的状态下负载于载体上。作为具有过氧化物酶样活性的蛋白质，可以使用例如血红素蛋白质，更具体而言，除了血红蛋白之外，还可以使用肌红蛋白、细胞色素、过氧化氢酶等。
在该载体上负载具有过氧化物酶样活性的蛋白质的方法没有特别限定，只要是对该载体以充分的强度负载具有过氧化物酶样活性的蛋白质，能够实现将两者一体化的状态的方法，则可以采用任意方法。例如，作为用于负载的手段，可以使用吸附反应。吸附的术语在任何意味上均不作限定性解释，必须最广义地解释。通过对上述的载体吸附具有过氧化物酶样活性的蛋白质，能够制备在实质上未使该蛋白质变性的状态下负载于载体上的状态的复合体。此外，作为用于负载的另一手段，通过使用交联剂等化学手段的处理，还能够将具有过氧化物酶样活性的蛋白质在实质上未变性的状态下维持的同时，对该载体通过共价键而固定化。
此外，即使在变性的状态下，血红蛋白等血红素蛋白质也有时具有过氧化物酶样活性，因此上述载体上可以使具有过氧化物酶样活性的蛋白质在变性的状态下负载。例如，在将白蛋白等源自血浆或源自血清的蛋白质通过变性凝固而固体化时，预先使该蛋白质和具有过氧化物酶样活性的血红蛋白等蛋白质通过混合等手段而共存，还能够制备包含一同变性的状态的源自血浆或源自血清的蛋白质和具有过氧化物酶样活性的蛋白质的固体。本说明书中，“负载”这一术语包括上述那样具有过氧化物酶样活性的蛋白质与形成载体的白蛋白等蛋白质一起变性从而将两者一体化而固体化的状态，在任何意义上均不作限定性解释，必须最广义地解释。
通过使用白蛋白作为源自血浆或源自血清的蛋白质，使用血红蛋白作为具有过氧化物酶样活性的蛋白质，并在混合这些蛋白质的状态下变性而得到的固体状的复合体是本发明的优选的方式；将血红蛋白在血清白蛋白中混和，热变性凝固，进行福尔马林固定处理，在此基础上微粒化而得到的物质(HAMP:hemoglobin-albumin-microparticle，血红蛋白-白蛋白微粒)是本发明的特别优选的方式。该微粒的粒径没有特别限定，例如为200～0.01μm的范围。优选地，通常能够通过70μm的孔径的筛网或过滤器的粒径是优选的，但不限于特定的尺寸。应予说明，在蛋白质分子间交联剂以充分量存在的水性溶剂中，本领域技术人员广泛已知任意生物均无法生存，假使未知的有害生物包含在原料的源自血浆或源自血清的蛋白质中，通过蛋白质分子间交联剂处理(作为代表例，仅浸渍于10％中性福尔马林液中的处理)也能够进行无生物化，因此通过上述的处理，能够提高本发明的免疫刺激剂的安全性。
上述的复合体本身具有免疫刺激作用，因此能够用作免疫刺激剂，但也可以例如在进一步负载纯化结核菌素等免疫刺激物质中的1种或2种以上的状态下用作免疫刺激剂。作为纯化结核菌素，例如，除了可以使用例如纯化结核菌素的全蛋白质之外，还可以使用通过本领域技术人员公知的方法而由结核菌素制备的可溶性蛋白质中的全部或其一部分。对上述的复合体负载的免疫刺激物质的比率没有特别限定，例如可以以在能够对上述复合体吸附的范围内的量，选择适当的比率。作为免疫刺激物质，除了纯化结核菌素之外，还可以使用例如BCG菌提取物、细胞因子、Toll样受体配体、NOD样受体激动剂、RIG样受体激动剂、C型凝集素受体激动剂、与环状GMP-AMP合成酶结合的外源性DNA、警报素、抗原、和抗体等。
作为除了吸附之外的负载方法，例如将白蛋白等源自血浆或源自血清的蛋白质、具有过氧化物酶样活性的血红蛋白等蛋白质、以及作为具有免疫佐剂活性的免疫刺激物质的例如纯化结核菌素等可溶性蛋白质预先混合，由该混合物与上述同样地得到变性凝固而固体化的复合体，由此能够制造具有过氧化物酶样活性的蛋白质和具有佐剂活性的纯化结核菌素可溶性蛋白质等免疫刺激物质负载于源自血浆或源自血清的蛋白质上的免疫刺激剂。
此外，可以制成对包含具有过氧化物酶样活性的蛋白质和具有佐剂活性的纯化结核菌素可溶性蛋白质等免疫刺激物质的上述免疫刺激剂进一步负载不溶性的蛋白质的免疫刺激剂。作为不溶性蛋白质，可以使用例如生物分解性的不溶性蛋白质，更具体而言，可以使用胶原蛋白等，但不必限定于此。该方式中，只要是在生物体内分解的不溶性蛋白质，则还可以使用任意物质。
本发明的免疫刺激剂还能够用作与白蛋白-肝素团聚体沉淀组合的免疫刺激性组合物。作为白蛋白-肝素团聚体沉淀，可以使用例如吸附有细胞因子的肝素-白蛋白团聚体沉淀，作为细胞因子，可以使用选自例如由粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-2(IL-2)和干扰素γ(IFNγ，本说明书中有时表示为“IFNg”)构成的组中的1种或2种以上的物质，但不限于此。
将本发明的免疫刺激剂用于治疗和/或预防疾病时，可以与药理学可允许的载体、赋形剂、添加物等混合而制剂化，作为医药组合物给予包括人在内的哺乳类动物。在本发明的免疫刺激剂未负载纯化结核菌素等免疫刺激物质的情况下，可以在使用另外制剂化的纯化结核菌素等免疫刺激物质时混合而同时给予。或者，可以进行处理以将两者分别对同一部位给予，在生物体内的同一局部共存。此外，在本发明的免疫刺激剂负载1种或2种以上的免疫刺激物质的情况下，可以在使用与负载的免疫刺激物质不同种类的免疫刺激物质时混合而同时给予。或者，可以进行处理以将两者分别对同一部位给予，在生物体内共存。
本发明的免疫刺激剂可以用作常规的免疫佐剂。通过单纯与抗原混合而给予包括人在内的哺乳类动物的体内，能够诱导对该抗原的全身性免疫反应。该抗原为肿瘤组织、肿瘤细胞、肿瘤细胞成分、和/或肿瘤抗原肽时，可以用作肿瘤疫苗。例如，如果将从患者分离的癌细胞溶解物(裂解物)和本发明的免疫刺激剂混合而对患者注射，则在患者的体内，能够诱导对该特定癌细胞的抗肿瘤免疫反应。此外，同样地，在该抗原源自引起感染症的微生物时，可以用作通常的感染症预防疫苗。不过，本发明的免疫刺激剂的使用方法不限于上述方法，可以使用利用免疫佐剂的通常的形态中的任意方法。
进一步，在患者的生物体内通过物理手段而使肿瘤组织变性后，对该变性组织内给予本发明的免疫刺激剂，由此形成位于变性肿瘤组织内的肿瘤抗原与本发明的免疫刺激剂在该局部共存的状态，能够进行诱导对在患者的生物体内存活的肿瘤细胞的抗肿瘤免疫反应的in situ vaccination(原位接种疫苗)。用于肿瘤组织变性的物理手段没有特别限定，可以单独采用例如微波照射、射频凝固法、冻结凝固法、电刀加热、热水注入、酒精注入、塞栓法、放射线照射、激光照射、或超声破坏等手段，或适当组合采用2种以上。不过，不限于此，只要是能够诱导位于肿瘤组织内的肿瘤细胞的细胞死亡的手段，则可以使用任意手段。
例如，如果将肿瘤组织通过微波照射而加热凝固，对该凝固组织内给予本发明的免疫刺激剂，则能够诱导对在该肿瘤组织内部或其周边存活的肿瘤细胞的抗肿瘤免疫反应。在给予本发明的免疫刺激剂时，还优选进一步同时给予纯化结核菌素溶液、或刺激免疫反应的细胞因子、或者细胞因子缓释制剂。不过，本发明的免疫刺激剂的给予方法不限于上述的方式，只要在该变性肿瘤组织中聚集的抗原提呈细胞中本发明的免疫刺激剂与变性肿瘤组织中包含的肿瘤抗原一起被摄入，或者给予本发明的免疫刺激剂能够直接刺激抗原提呈细胞的环境，则可以采用任意方法。
此外，还可以预先将本发明的免疫刺激剂和免疫活性细胞在体外混合后给予患者的体内，刺激生物体内的免疫反应。作为免疫活性细胞，可以优选使用例如树状细胞、巨噬细胞、单核细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、或自然杀伤细胞等，但不限于此。上述手段中，可以组合使用2种以上的免疫活性细胞。
从另一观点出发，提供一种疫苗，其包含本发明的免疫刺激剂作为免疫佐剂。疫苗能够与作为疾病原因物质的抗原、优选病原微生物等源自外来生物的抗原或病毒抗原、或者肿瘤抗原一起给予，也可以进一步同时混合负责免疫的细胞。作为抗原，优选为源自患者本人的抗原，但也可以为源自其他人的同一种类的抗原。例如，还可以混合使用由其他患者采集的肿瘤组织和/或肿瘤细胞，通过将以该方式得到的疫苗给予肿瘤患者，能够治疗恶性肿瘤等肿瘤。此外，通过上述疫苗，能够有效地刺激在肿瘤的治疗所需的细胞免疫反应，因此能够预防例如恶性肿瘤的转移或术后复发。
优选的方式中，还可以在本发明的免疫刺激剂上负载免疫检查点阻碍抗体等免疫反应抑制作用物质，这样的方式中，除了进一步有效地治疗恶性肿瘤之外，还可以以预防恶性肿瘤或预防转移等为目的而用作免疫刺激剂或肿瘤疫苗。作为免疫检查点阻碍抗体，例如可以使用选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗CD40抗体、抗CD137抗体、抗OX40抗体、抗TGF-β抗体、抗LAG3抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗TIM3抗体、抗CD96抗体和抗TIGIT抗体构成的组中的1种或2种以上的抗体，但不限于此。
一般而言，本领域技术人员广泛已知的是，生物体内自然产生的肿瘤细胞中包含的肿瘤抗原的抗原性低，大多无法在生物体内引起抗肿瘤免疫反应，因此肿瘤增殖。通过将本发明的免疫刺激剂用作免疫佐剂，能够诱导上述那样对抗原性低的肿瘤抗原的有效抗肿瘤免疫反应。同样地，即使是源自生物体且抗原性低的其他疾病原因物质，通过将本发明的免疫刺激剂用作免疫佐剂，也能够对这样的抗原性低的疾病原因物质诱导免疫反应。
进一步，如果使用本发明的免疫刺激剂，则刺激抗原提呈细胞，能够由抗原提呈细胞本身释放抗原提呈细胞的生存维持·增殖所需的GM-CSF。因此，能够活化GM-CSF作为自分泌细胞生长因子而发挥作用的该抗原提呈细胞自身、和作为旁分泌细胞生长因子而发挥作用的附近的抗原提呈细胞组，并维持其活化状态。其由于是提高生物体的免疫能力的BRM的性质之一，因此本发明的免疫刺激剂作为BRM是有用的。
实施例
以下，通过实施例进一步具体说明本发明，但本发明的范围不限于下述的实施例。
本发明中的术语或概念基于本领域中惯常使用的术语的含义，为了实施本发明而使用的技术除了特别明示其出处的技术之外，能够基于公知的文献等而由本领域技术人员容易且切实地实施。此外，各种的分析等使用所使用的分析仪器或试剂、试剂盒的操作说明书、产品目录等中记载的方法而进行。
[表1]
缩略词表
例1：包含变性凝固固体化血浆的载体的制备、和利用未变性血红蛋白吸附复合体或未变性肌红蛋白吸附复合体的抗原提呈细胞的刺激效果
已知如果将人巨噬细胞样细胞株THP-1在培养下使Phorbol 12-Myristate 13-Acetate(佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯，PMA)发挥作用而分化诱导，不仅示出吞噬能力(非专利文献18)，还获得抗原提呈能力，成为抗原提呈细胞(非专利文献19)。此外，如果将该细胞用作为细胞因子的人干扰素γ(IFNg)进行前处理，则增强对T细胞的抗原提呈能力(非专利文献20)。分化并吞噬的THP-1细胞产生TNFα(非专利文献21)。已知TNFα的产生示出巨噬细胞(或抗原提呈细胞)活化，体内的巨噬细胞(或抗原提呈细胞)的活化成为后续的炎症反应和免疫反应的起点(非专利文献22、23)。
因此，如果将THP-1细胞分化诱导为抗原提呈细胞后，测定吞噬某种固体物并产生的TNFα量，则能够在体外的细胞培养系统中测定该固体物在体内的炎症反应和免疫反应的刺激作用。
(1)生物测定用样品的制备方法
从成人的志愿者，通过常规方法采血作为添加肝素的血液，通过常规方法的离心法得到血浆。将其2.25mL进行110℃、5分钟热处理并凝固后，用抹刀粗略破碎。向其添加市售的10％中性缓冲福尔马林液20mL，在室温下放置3天，进行福尔马林固定。将固定破碎物用生理食盐液清洗后，通过能够安装微型管的通用的组织破碎机(Tissue Lyser II，Qiagen公司制)，进行10分钟破碎处理。使微粒化的切片通过70μm的孔径的筛网，用充分量的生理食盐液离心清洗，进一步浸渍于乙醇中并杀菌，再次用充分量的生理食盐液离心清洗。适量添加生理食盐液并悬浮，以使得用桌面式离心机以3000rpm(最大加速度1580G)进行15分钟离心沉淀的切片的容量比例达到25v/v％，制成生物测定用样品2“变性凝固固体化血浆载体悬浮液”。
此外，将人血红蛋白(SIGMA公司制，H7379-5G)或马肌红蛋白(SIGMA公司制，M0630)用精制水悬浮以达到4w/v％，在室温下搅拌2小时从而溶解，以3000rpm离心15分钟从而去除不溶成分，进一步将上清液用0.22μ的孔径的膜过滤器过滤灭菌。将该溶液36μL和变性凝固固体化血浆载体悬浮液264μL混合，在室温下搅拌2小时后，用冷却微量高速离心机，进行4℃、12000rpm(最大加速度11000G)、5分钟离心，得到沉淀。将其用充分量的生理食盐液离心清洗后，对沉淀添加198μL的生理食盐液从而悬浮，制成生物测定用样品3“未变性血红蛋白吸附变性凝固固体化血浆载体悬浮液”或生物测定用样品4“未变性肌红蛋白吸附变性凝固固体化血浆载体悬浮液”。
(2)利用抗原提呈细胞的生物测定方法
将按照常规方法维持培养的人巨噬细胞样细胞株THP-1用培养液调整为50万个/mL。培养液是利用常规方法进行了加热处理的包含3％的胎牛血清的RPMI1640培养液(以下称为“3％medium”)。向其添加phorbol 12-myristate 13-acetate(佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯，PMA)溶液(将SIGMA公司制PMA在二甲基亚砜中溶解以达到1.62mM)以使得最终浓度达到0.16μM，在24孔板中，以每1孔0.5mL进行接种，培养4天，将THP-1细胞分化诱导为抗原提呈细胞。以下的实施例中，记作抗原提呈细胞的也是通过该方法而分化诱导的细胞。
分化诱导培养后，交换为测定用培养液(包含PMA 0.016μM、和人干扰素γ(hIFNg)0.5ng/mL的3％medium)，培养过夜。其后，交换为新的测定用培养液，向每1孔0.5mL的测定用培养液中添加以下的生物测定用样品液，培养22小时(以下称为“测定培养”)。
样品1.生理食盐液，32μL(将该样品的TNFα产生量记作空白值)
样品2.变性凝固固体化血浆载体悬浮液，32μL
样品3.未变性血红蛋白吸附变性凝固固体化血浆载体悬浮液，32μL
样品4.未变性肌红蛋白吸附变性凝固固体化血浆载体悬浮液，32μL
将测定培养后的培养液用冷却微量高速离心机进行4℃、12000rpm(最大加速度11000G)、5分钟离心，回收上清液，测定其中的肿瘤坏死因子α(TNFα)浓度。针对1个样品，使用2个或3个孔，将平均值记作数据。
(3)TNFα的测定方法
使用市售的利用ELISA法的TNFα测定用试剂盒(BD Biosciences公司制OptEIA SetHuman TNF，Cat.No.555212)。ELISA的详细方法按照该试剂盒随附的操作说明书。该操作过程中，反复进行将包含表面活性剂Tween 20的大量过剩的清洗液添加至ELISA用的各孔中从而清洗的步骤，但在本ELISA中，向用捕捉用第一抗体涂布的某一ELISA用孔中添加回收培养液离心上清液后重复5次，向检测用第二抗体中添加追加添加的streptavidin-horseradish peroxidase(链霉亲和素-辣根过氧化物酶，该试剂盒中包含，简称为SAv-HRP)或streptavidin-alkalinephosphatase(链霉亲和素-碱性磷酸酶，Promega公司制，Cat.No.V5591，简称为SAv-ALP)重复7次，总计12次清洗步骤。因此，回收培养液离心上清液中，即使混入了变性凝固固体化血浆载体的微粒，也被充分清洗去除。实际上，测定回收培养液离心上清液中的TNFα时，如果反而不添加SAv-HRP而执行利用本TNFα测定用试剂盒的ELISA，则TNFα测定值成为空白水平，因此确认到回收培养液离心上清液被充分清洗去除。
该试剂盒随附的标准TNF的浓度与最终显色反应的直线性非常良好，因此通过读板器(Biotrak II，Amersham Biosciences公司)而得到的最终数据减去样品1.的空白值而得到的吸光度直接示于图中。使用SAv-HRP的情况(应用于样品1、2、3)中，表示为使用通用的市售的TMB底物液和2N H2SO4反应停止液时的A450值。A450＝1.0相当于该试剂盒随附的标准TNF 60pg/mL。此外，使用SAv-ALP的情况(作为另一试验而应用于样品1、2、4)中，表示为使用用于测定碱性磷酸酶的活性的市售的以2mg/mL溶解了磷酸对硝基苯酯的底物液和0.5NNaOH反应停止液时的A405值。该方法也对于本领域技术人员而言是常规方法之一。此时的测定中，设定条件以使得以该试剂盒随附的标准TNF计240pg/mL达到A405＝0.3。TNFα产生量的结果示于图1。减去空白值(样品1)。图1的左侧2根柱表示对样品2和样品3使用SAv-HRP的情况的结果，右侧2根柱表示在另一试验中对样品2和样品4使用SAv-ALP的情况的结果。
由该结果可知，样品2的变性凝固固体化血浆载体具有抗原提呈细胞刺激作用，此外，其上吸附了未变性血红蛋白的样品3具有更强的抗原提呈细胞刺激作用。此外，可知吸附了未变性肌红蛋白的样品4也具有强抗原提呈细胞刺激作用。
例2：利用变性凝固固体化白蛋白/血红蛋白复合体的抗原提呈细胞的刺激效果
例1中，示出使未变性血红蛋白吸附于变性凝固固体化血浆载体上的物质具有抗原提呈细胞的刺激效果，但预先将作为血清蛋白质的代表例的白蛋白、和源自红细胞的血红蛋白混合，研究将该混合物变性凝固固体化时的抗原提呈细胞的刺激活性。
(1)生物测定用样品的制备方法
对市售的生物学的制剂基准 对人血清白蛋白(化学及血清疗法研究所制，献血白蛋白25“化血研”，以下称为“25％HSA”)，制作以下述所示的比例混合人血红蛋白(SIGMA 公司制，H7379-5G，在生理食盐液中溶解·悬浮)而得到的液体，在110℃下进行5分钟热处理并凝固后，用抹刀粗略破碎。向其添加10％中性缓冲福尔马林液20mL，在室温下放置3天，进行福尔马林固定。将固定破碎物用生理食盐液清洗后，通过能够安装微型管的通用的组织破碎机(Tissue Lyser II，Qiagen公司制)，进行10分钟破碎处理。使破碎切片通过70μm的孔径的筛网，用充分量的生理食盐液离心清洗，进一步浸渍于乙醇中并杀菌，再次用充分量的生理食盐液离心清洗。适量添加生理食盐液并悬浮，以使得用桌面式离心机以3000rpm进行15分钟离心沉淀的切片的容量比例达到25v/v％，制成生物测定用样品“变性凝固固体化血红蛋白·白蛋白微粒悬浮液”。该样品存在改变血红蛋白的比例而得到的以下的种类。
样品1.25％HSA 3.0mL
样品2.25％HSA 2.4mL +100mg/mL 血红蛋白0.6mL
样品3.25％HSA 1.84mL +220mg/mL血红蛋白0.909mL+生理食盐液0.251mL
样品4.25％HSA1.04mL+220mg/mL血红蛋白1.818mL+生理食盐液0.141mL
样品5.220mg/mL血红蛋白3.0mL
样品6.生理食盐液3.0mL(将该样品的TNFα产生量记作空白值)
这些样品在测定培养时，向包含0.5mL的3％medium的孔中，每1孔均添加32μL。针对1个样品，使用3个孔，将平均值记作数据。
(2)利用抗原提呈细胞的生物测定方法、和TNFα的测定方法以与例1的使用SAv-HRP的情况同样的方式进行。TNFα产生量的结果示于图2。减去空白值(样品6)。该结果是，在仅变性凝固固体化白蛋白微粒(样品1)的情况中，与原本的空白值相比，示出TNFα的产生量被抑制，在与白蛋白一起使血红蛋白变性凝固从而固体化的微粒样品2～5的情况中，随着血红蛋白的含有比例增加，示出抗原提呈细胞的刺激效果增强。
(3)样品中的内毒素含量的测定和结果
如果向前述的例1、和上述的生物测定用样品中混入内毒素，则有可能对结果造成影响。因此，测定内毒素含量。测定使用Kinect-QCL 192Test Kit(Lonza公司制)、和作为标准内毒素的E.coli O55:B5，测定方法按照该试剂盒的使用说明书。其结果是，前述的例1的生物测定用样品、本次的生物测定用样品中，内毒素含量均为检测限以下(<0.500EU/mL)。由该结果判断图1和图2中没有内毒素的影响。
应予说明，以下的实施例中，变性凝固固体化血红蛋白·白蛋白微粒(简称为HAMP)之中，以包含相当于上述的“样品2”的HSA和血红蛋白的比例的物质作为HAMP的代表例，通过用桌面式离心机以3000rpm(最大加速度1580G)在室温下离心15分钟并沉淀，从而浓缩，调整浓度而使用。浓缩后的HAMP浓度以沉淀重量比例w/v％表示，或以沉淀容量比例v/v％表示。
例3：变性凝固固体化蛋白质微粒中的过氧化物酶样活性的功能
广泛已知的是血红蛋白或肌红蛋白那样的蛋白质具有过氧化物酶样的强活性。该活性即使在进行福尔马林固定并石蜡包埋处理后制作的病理组织切片中也得以发挥，因此病理组织切片中如果含有例如大量的血红蛋白，则在利用过氧化物酶标记抗体的免疫染色中，有时出现不期望的染色图像。能够消除其活性的是过氧化氢水处理(非专利文献26)。上述HAMP的过氧化物酶样活性也被认为非常强。
(1)样品2的过氧化物酶活性：定性的试验
例2(1)的生物测定用样品中，将血红蛋白的比例最少的样品2作为HAMP的代表例。将其离心，测定沉淀的重量后，将沉淀含量用生理食盐液制成相当于40w/v％的悬浮液。将其20μL添加至利用过氧化物酶的显色反应中通用的市售的TMB底物液200μL时，无色的TMB底物液在数秒内变化为深蓝色。由此，确认到HAMP的过氧化物酶样活性也非常强。
替代样品2的血红蛋白而使用马肌红蛋白，将以与样品2完全相同的方式制备的myoglobin-albumin microparticle(肌红蛋白-白蛋白微粒)的悬浮液20μL添加至TMB底物液200μL时，无色的TMB底物液在1分钟以内变化为深蓝色。因此，即使在变性凝固固体化后，只要是具有过氧化物酶样活性的蛋白质，也能够与HAMP同样进行处理。
(2)样品5的利用过氧化氢水的过氧化物酶样活性失活处理后的抗原提呈细胞刺激效果：定量的试验
福尔马林固定·石蜡包埋后制作的病理组织切片中的过氧化物酶样活性广泛已知通过过氧化氢水处理而消除。如果向例2中的生物测定用样品2中添加过剩的过氧化氢水并放置过夜后，用生理食盐液反复离心清洗，则无法观察到利用样品2的市售的TMB底物液的着色反应。另一方面，例2(1)的生物测定用样品中，血红蛋白的比例最多的样品5的过氧化物酶样活性最强，因此对样品5的150μL，添加1)精制水、或2)3％过氧化氢水900μL，在室温下搅拌过夜。用冷却微量高速离心机，在4℃、12000rpm(最大加速度11000G)的条件下离心5分钟而得到沉淀，将其用充分量的生理食盐液离心清洗后，对沉淀添加112.5μL的生理食盐液从而悬浮，将生物测定用样品分别记作1.血红蛋白-MP、2.H2O2-血红蛋白-MP。利用抗原提呈细胞的生物测定方法、和TNFα的测定方法与例1相同。
TNFα产生量的结果示于图3。减去空白值(将生理食盐液作为生物测定用样品)。其结果是，如果通过过氧化氢水处理而消除过氧化物酶样活性，则示出TNFα产生被明显抑制，即变性凝固固体化血红蛋白切片中的过氧化物酶样活性贡献于对抗原提呈细胞的刺激效果。
例4：HAMP上的纯化结核菌素的吸附
纯化结核菌素是诱导IV型过敏反应(即，细胞免疫反应)的代表性的免疫刺激物质。纯化结核菌素主体本身是稳定的物质，但已知在溶解后吸附于玻璃瓶内壁，容易引起表观上的失活，并且可以通过人血清白蛋白而防止其吸附(非专利文献16)。因此，研究HAMP是否吸附纯化结核菌素。
(1)纯化结核菌素的定量法
得到一般诊断用纯化结核菌素(PPD)(1μg/小瓶，日本BCG制造株式会社)中包含的源自Mycobacterium tuberculosis(结核分枝杆菌)的蛋白质之一、对DnaK(非专利文献24)的HuCAL-Fab抗体(GeneFrontier Corporation，千叶县柏市)。将其作为第一抗体，将JacksonImmuno Research公司的抗体#109-035-097作为第二抗体，确定纯化结核菌素的ELISA定量法。除了作为抗原的纯化结核菌素(PPD)、第一抗体、第二抗体之外，为本领域技术人员公知的通常的ELISA定量法。最终显色反应中，使用例1(3)所示的对horseradishperoxidase(辣根过氧化物酶)的通用的TMB底物液和反应停止液，结果表示为A450值。本方法中，将生理食盐液作为空白。减去空白值时，上述PPD的浓度为1.25μg/mL(ELISA反应时的液量为ELISA用96孔微孔板每1孔200μL)时的A450值为0.063，是能够定量的范围。
(2)HAMP上的吸附反应
向塑料制微型管中，添加HAMP(适量添加生理食盐水并悬浮，以使得用桌面式离心机以3000rpm(最大加速度1580G)离心沉淀15分钟而得到的微粒的容量比例达到40v/v％)以使得最终浓度达到20v/v％、使得上述PPD的浓度达到1.25μg/mL，在室温下搅拌。搅拌时间为30分钟～6小时。搅拌后，用微量高速离心机，进行4℃、12000rpm(最大加速度11000G)、5分钟离心，得到上清液。使用该上清液150μL，通过上述的ELISA定量法(以生理食盐液作为空白)，测定上清液中的PPD量。
(3)结果
图4中，表示为上清液中残留的PPD量减去空白值而得到的A450值。该结果表示，通过在室温下进行30分钟的搅拌，92％的PPD吸附于HAMP上。可以认为，2小时以上的搅拌的情况中(最小的A450值存在-0.004这一略微的测定误差)，几乎全部量吸附于HAMP。此外，该结果表示能够成为抗原的源自异种的蛋白质也能够吸附于HAMP上。
例5：HAMP上的吸附PPD、利用吸附细胞因子的抗原提呈细胞的刺激效果
如例4所示那样，HAMP具有对PPD的强吸附力。因此，针对所吸附的PPD的抗原提呈细胞的刺激活性如何，和吸附在生物体内发挥重要作用的细胞因子时细胞因子吸附HAMP是否示出抗原提呈细胞的刺激活性，进行研究。
(1)吸附操作
向50-mL离心管中，添加在生理食盐液中悬浮的HAMP沉淀和PPD的浓度以使得各自达到25v/v％、286ng/mL，在室温下搅拌2小时。将其作为PPD-HAMP悬浮液。
将人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF，Leukine(sargamostim，沙格司亭)、sanofi-aventis U.S.LLC公司制)用水溶解，制成100μg/mL。将其100μL与HAMP(25w/v％，基于变性凝固固体化血红蛋白·白蛋白微粒沉淀的重量而制备)200μL合并，在室温下搅拌2小时。搅拌后，用微量高速离心机在4℃下、12000rpm(最大加速度11000G)的条件下离心5分钟，得到沉淀。总计3次重复进行将该沉淀用750μL的生理食盐液悬浮、同样地离心而得到沉淀的离心清洗，向最终的沉淀中添加150μL的生理食盐液，制成hGM-CSF-HAMP悬浮液。
人白介素2(hIL-2)的情况中，向Imunace注射剂35(1小瓶含有替西白介素(基因重组，实际上为hIL-2)35万单位，日本盐野义(Shionogi)制药)的小瓶中注入625μL的生理食盐液而溶解，从该溶液中取50μL与HAMP 200μL混合，在室温下搅拌2小时。以下，添加与上述的hGM-CSF的情况相同的操作，制成hIL-2-HAMP悬浮液。人干扰素γ(hIFNg，和光纯药工业)的情况中，在生理食盐液中制备设为50ng/mL的溶液，与HAMP 200μL混合，在室温下搅拌2小时。以下，添加与上述的hGM-CSF的情况相同的操作，制成hIFNg-HAMP悬浮液。
(2)利用抗原提呈细胞的生物测定方法、和TNFα的测定方法与例1相同。TNFα的测定中，使用SAv-HRP。在此，作为生物测定用样品，每1孔添加以下的溶液或悬浮液。
样品1.生理食盐液，32μL(将该样品的TNFα产生量记作空白值)
样品2.将一般诊断用纯化结核菌素(PPD)1人用(0.25μg/小瓶，JapanBCG Laboratory)用1.2mL的生理食盐液溶解而得到的PPD溶液，32μL
样品3.HAMP悬浮液，32μL
样品4.PPD-HAMP(在HAMP上吸附PPD)悬浮液，32μL
样品5.hGM-CSF-HAMP(在HAMP上吸附hGM-CSF)悬浮液，32μL
样品6.hIL-2-HAMP(在HAMP上吸附hIL-2)悬浮液，32μL
样品7.hIFNg-HAMP(在HAMP上吸附hIFNg)悬浮液，32μL
针对1个样品，使用3个孔。22小时的测定培养后回收的培养液用新鲜的3％medium稀释至1/2，供于TNFα的利用ELISA的测定。
(3)结果
针对减去空白值而得到的A450值，将3个孔的平均值示于图5。但是，样品4中，与样品2相比包含于添加了2倍量的PPD的32μL中，因此实测A450值为0.374，但图中为测定值一半0.187。
该结果中，溶液状态的PPD(样品2)以与作为空白的生理食盐液(样品1)的情况相同的水平(A450值为0.004，为与例3的情况同样的测定误差的范围)确认到抗原提呈细胞的刺激效果。此外，仅HAMP(样品3)的情况中，与例2的情况同样地，与原本的空白值相比TNFα的产生量被抑制，但在HAMP上吸附了PPD的PPD-HAMP(样品4)的情况中，观察到刺激效果。因此，表明将溶解性的PPD固体化的切片、即HAMP上吸附固定的情况能够更强地活化抗原提呈细胞。
吸附了细胞因子的hGM-CSF-HAMP(样品5，A450值为0.019)和hIFNg-HAMP(样品7，A450值为0.025)的情况中，尽管低，但观察到清楚的TNFα的产生。但是，hIL-2-HAMP(样品6)的情况中，没有观察到超过作为空白的生理食盐液(样品1)的情况的效果。
如前述的例1(2)项中记载那样，将THP-1细胞分化诱导为抗原提呈细胞的情况中，TNFα产生需要预先向培养液中添加作为触发剂的微量的IFNg，但可以认为，在仅HAMP的情况中，由于吸附了该培养液中的微量IFNg，因此例2的样品1、2、和本实施例的样品3、6的情况中，A450值为负。
例6：利用吸附了BCG菌提取物的HAMP的抗原提呈细胞的刺激效果
由例5的结果表明，在HAMP上吸附溶解性的PPD的情况能够更强地活化抗原提呈细胞，但在其他免疫刺激物质的情况中，也研究了能够期待这样的效果。在此，使用混入了各种各样的低分子的BCG菌提取物(BCGext)。
(1)BCGext的制作方法
将干燥BCG疫苗安瓿瓶1个(日本BCG制造株式会社，装有12mg)在110℃下5分钟施加压热釜，添加乙醇1mL，搅拌6小时以上后，采集该悬浮液，添加至另一干燥BCG制剂1瓶，再次充分搅拌，其后用微量高速离心器，以12000rpm(最大加速度11000G)离心5分钟，回收该上清液，制成BCGext。
(2)HAMP上的BCGext的吸附
向HAMP(40w/v％)中，等量添加用乙醇稀释至1/5的BCGext，在室温下搅拌过夜。将其用充分量的生理食盐液离心清洗，悬浮以达到原本的HAMP(40w/v％)。用3％medium稀释至5.65倍，制成样品HAMP-BCGext。
(3)利用抗原提呈细胞的生物测定方法、和TNFα的测定方法与例1相同，TNFα的测定中，使用SAv-HRP。
在此，作为生物测定用样品，每1孔添加以下物质。
样品1.生理食盐液，30μL(将该样品的TNFα产生量记作空白值)
样品2.将HAMP(40w/v％)用生理食盐液稀释至5.65倍，30μL(测定培养时的最终浓度0.4w/v％)
样品3.将BCGext用3％medium稀释至28.3倍，30μL(测定培养时的最终浓度0.2v/v％)
样品4.HAMP-BCGext，30μL(测定培养时的HAMP最终浓度0.4w/v％，如果假定原本的BCGext全部吸附于HAMP，则最终浓度应当达到0.18v/v％)
(4)结果
结果示于图6。该结果示出，与直接添加BCGext相比，在HAMP上吸附BCGext的情况能够更强力地刺激抗原提呈细胞。即，不限于PPD，只要溶解性的免疫刺激物质能够吸附于HAMP上，则形成更强力的免疫刺激剂，因此可知HAMP是免疫刺激物质的有效载体。
(5)以与前项相同的方式制作HAMP-BCGext(其中，未用3％medium稀释至5.65倍，将在3％medium中悬浮以达到原本的HAMP(40w/v％)的物质记作1/1浓度)，制作用测定用培养液稀释至1/50～1/800的悬浮液，供于利用抗原提呈细胞的生物测定。对回收的上清液中的产生TNFα量进行定量时，使用利用ELISA法的测定用试剂盒(BD Biosciences公司制OptEIASet Human TNF，Cat.No.555212)随附的标准TNF，换算为TNF量。此外，对回收上清液中的产生GM-CSF(THP-1细胞源自人，因此为hGM-CSF)量进行定量时，使用利用ELISA法的测定用试剂盒(Thermo Scientific公司制GM-CSF ELISA kits，Cat.No.EHGMCSF)随附的标准GM-CSF，换算为GM-CSF量。
(6)结果
结果示于图7。由该结果表明，与TNFα相比，同时产生1/40量左右的hGM-CSF。
如例5的样品5中所见那样，hGM-CSF直接吸附于HAMP，吸附hGM-CSF能够刺激并活化抗原提呈细胞。因此，表明以利用负载了BCGext的HAMP的刺激为契机，由抗原提呈细胞产生hGM-CSF，其启动了对抗原提呈细胞自身也发挥作用而活化的自分泌机理。本领域技术人员公知的是，所产生的hGM-CSF不仅对所产生的抗原提呈细胞自身发挥作用，而且即使是针对其他种类的抗原分子进行提呈的抗原提呈细胞，只要位于附近，则hGM-CSF还具有对其也能够发挥作用并活化的旁分泌作用。因此，本发明的免疫刺激剂中，由受到刺激的抗原提呈细胞分泌的hGM-CSF通过对附近的抗原提呈细胞的作用而能够强化一般的免疫反应，因此即使未同时给予其他特定抗原，也能够用作BRM。
例7：HAMP上的抗体的吸附-1
抗体已知根据其种类而具有免疫刺激作用。至前项的实施例为止，推定HAMP具有吸附各种分子的能力。因此，研究了是否也吸附抗体。
(1)吸附操作
将市售的羊抗小鼠IgG(H+L)抗体(horseradish peroxidase(辣根过氧化物酶)标记)(Cat.No.W4021，Promega公司制)用Dulbecco的不含Ca+Mg+的磷酸缓冲液(PBS(-))稀释至1/25000，取其20μL，添加至包含HAMP 60μL和生理食盐液920μL的悬浮液中，在室温下搅拌0～60分钟。搅拌后，立刻用冷却微量高速离心机进行4℃、12000rpm(最大加速度11000G)、5分钟离心，测定其上清液100μL中残留的抗体的过氧化物酶活性。过氧化物酶活性利用例1(3)TNFα的测定方法的TNFα测定用试剂盒随附的利用TMB底物液的显色反应，用A450值表示。
(2)结果
如图8所示那样，上清液中的过氧化物酶活性随着搅拌时间而减少。未向羊抗小鼠IgG(H+L)抗体中添加HAMP的情况中，已知抗体的稀释液在1小时左右的时间内活性未发生变化，因此其减少表示抗体随时间地吸附在HAMP沉淀上。此外，该结果表示，在想要将羊抗体用作抗原蛋白质的情况中，可以以在HAMP上吸附了抗体的固体化抗原的形式而非抗体溶液的形式进行利用。
例8：HAMP上的抗体的吸附-2
研究在另一种的抗体的情况中是否也同样引起抗体吸附。
(1)吸附操作
将市售的兔抗羊IgG(全分子)抗体(alkaline phosphatase(碱性磷酸酶)标记)(A4187，Sigma-Aldrich公司制)用PBS(-)稀释至1000倍，制成第一抗体。取其100μL，添加至包含HAMP 60μL和生理食盐液840μL的悬浮液中，在室温下搅拌0min～60min。搅拌后，立刻用冷却微量高速离心机，在4℃下、12000rpm(最大加速度11000G)的条件下离心5分钟，将所得沉淀用充分量的生理食盐液离心清洗。将该清洗后的沉淀悬浮于100μL的生理食盐液中，向其一半的量，按照说明书添加碱性磷酸酶用缓冲液(TRACP&ALP Assay Kit，CodeNo.MK301，TAKARA BIO公司制)和该试剂盒的反应底物液190μL。在室温下搅拌10分钟，添加反应停止液(0.5N NaOH)30μL后，用冷却微量高速离心机，在4℃下、12000rpm(最大加速度11000G)的条件下离心5分钟，取上清液200μL，测定405nm的吸光度。
(2)结果
如图9所示那样，沉淀中的碱性磷酸酶活性随着与第一抗体的搅拌时间的长度而增加。即，示出兔抗羊IgG(全分子)抗体也吸附于HAMP上。因此，由例7和8的结果可知，吸附了抗体的HAMP也能够形成有效的免疫刺激剂的组合物。此外，由该结果表明，将吸附了抗体的HAMP用作免疫刺激剂时，抗体在给予局部未立刻溶解扩散，因此能够进行局限于给予局部的有效抗体施用法。
例9：PPD-HAMP的安全性
例5中，利用在HAMP上吸附的细胞因子的抗原提呈细胞的刺激效果在hGM-CSF和hIFNg被确认到，在hIL-2中未被确认到。已知这些细胞因子均容易与肝素结合，特别是hIL-2在与肝素结合的状态下示出活性(非专利文献25)。因此，制成在与HAMP不同种类的固体化载体、即肝素-白蛋白团聚体沉淀(形成微粒状)(专利文献4，但是，该文献中针对包含PPD的肝素-白蛋白团聚体沉淀进行记载，本实施例中，使用不含PPD的肝素-白蛋白团聚体沉淀(命名为nega-TuMP))上吸附了hIL-2的微粒(hIL-2-MP)，研究是否具有抗原提呈细胞的刺激效果。
专利文献4中的例1、A.材料和方法、1.免疫佐剂的制作的项中记载的微粒化结核菌素(相当于含PPD的nega-TuMP)的制作方法中，将仅未添加PPD而制作的物质记作nega-TuMP。形成微粒状的nega-TuMP的悬浮液1mL中，包含肝素625单位、人血清白蛋白12.5mg。此外，如果将Immunace注射剂35(日本盐野义(Shionogi)制药)溶解于注射用水625μL中，取其50μL(以hIL-2计为28000单位)而与nega-TuMP悬浮液100μL混合，在室温下搅拌过夜，则hIL-2吸附于微粒状的nega-TuMP上。其按照例1，制成利用抗原提呈细胞的生物测定用样品hIL-2-MP。此时的比较对照仅为同量的nega-TuMP。此外，此时的利用抗原提呈细胞的生物测定方法、和TNFα的测定方法与例1中使用SAv-HRP的情况相同。其结果是，与最终回收的抗原提呈细胞培养液中的TNFα量成比例的A450值在仅nega-TuMP的情况中为-0.016，在hIL-2-MP的情况中为-0.006。
即，这些样品两者均不具有抗原提呈细胞的刺激性，甚至使TNFα产生略微减少。nega-TuMP具有吸附IFNg的性质，因此包括hIL-2-MP的情况在内，可以认为是导致培养液中添加的触发剂用的微量IFNg的浓度降低的结果，但至少nega-TuMP本身不会直接活化抗原提呈细胞。
在根据以上的结果的基础上，将在PPD-HAMP中混合了nega-TuMP而得到的物质作为样品，以成为毒性试验的基本的对生长期的小鼠给予时的体重变化·脏器重量变化为指标，研究安全性。
(1)方法
将5周龄的C3H/HeN(雄性)小鼠14只分为2组，分别每周1次，总计3次向对照组尾根部皮内每1只注射50μL的生理食盐液，处理组尾根部皮内每1只注射包含PPD-HAMP(以3000rpm(最大加速度1580G)离心15分钟时的沉淀量计19.1v/v％)和nega-TuMP悬浮液(以容量比例计8.7％)的悬浮液50μL。此外，第二周开始分别每周1次，总计6次在大腿部皮下注射，测定体重。此外，最终注射7天后，测定小鼠的脾脏、肾脏、肝脏的重量。
(2)结果
图10示出小鼠的体重变化，图11示出脏器重量。这些结果示出，在PPD-HAMP中混合了nega-TuMP的悬浮液不具有在生长期的小鼠中导致体重减少那样的强毒性，不存在如给予弗氏完全佐剂(FCA)的情况中所观察到那样本领域技术人员公知的与安全性相关的严重问题。
例10：利用混合了癌症抗原和免疫刺激剂的癌症疫苗的抗肿瘤效果-1
如例4所示那样，HAMP快速吸附PPD，能够使溶解性的PPD制成不溶性，此外如例5所示那样，能够刺激抗原提呈细胞。因此，推定PPD-HAMP是有效的免疫佐剂。此外，HAMP如例5所示那样，能够吸附细胞因子。另一方面，本领域技术人员公知细胞因子良好地吸附肝素，在通过肝素与白蛋白的团聚而产生的nega-TuMP上，细胞因子也良好地吸附。因此，研究了在nega-TuMP上混合吸附细胞因子、并添加至PPD-HAMP时的作为免疫佐剂的效果。
(1)方法
(1-1)细胞因子吸附nega-TuMP的制作
将小鼠GM-CSF(Miltenyi Biotec公司制，premium grade)100μg溶解于1mL的精制水中。将其50μL与100μL的nega-TuMP悬浮液混合，在室温下搅拌过夜从而吸附，将其记作mGM-CSF-MP。此外，将Immunace注射剂35(日本盐野义(Shionogi)制药)溶解于注射用水625μL中，取其50μL而与100μL的nega-TuMP悬浮液混合，在室温下搅拌过夜，将其记作hIL-2-MP。
(1-2)抗原与免疫佐剂的组合液
将卵白蛋白(Calbiochem公司制，产品目录号32467，简称为OVA)1.12mg溶解于1mL的生理食盐液。将其作为抗原原液，按照下表那样的液量的比例，与小鼠的G1～G4组一起，制作添加了吸附(或未吸附)细胞因子的nega-TuMP作为免疫佐剂的组合液。
[表2]
(1-3)对小鼠的给予计划
向6周龄的C57BL/6小鼠(雌性，由日本CLEA公司购入)，将上表的组合液每1只皮内注射50μL。一个小鼠的组为10只。注射开始日记作第0天。该第0天时的50μL中包含OVA原液。以后，将不含OVA的上表的组合液对各个组每1只在第4、11、18、25、32天追加皮内注射50μL(总计5次)。
(1-4)小鼠中的E.G7-OVA肿瘤细胞的挑战
由美国模式培养物集存库获取将OVA蛋白质切片表达为肿瘤抗原的小鼠淋巴瘤细胞株E.G7-OVA，按照常规方法进行培养。将该细胞用无血清的MEM培养液清洗，进一步用无血清MEM培养液培养2小时后，再一次用无血清的MEM培养液清洗。将该细胞50万个悬浮于0.1mL的生理食盐液中，在(1-3)项所述的小鼠的右下肢皮下在第15天注射，作为肿瘤细胞挑战，以后，按照常规方法测定逐渐增殖的肿瘤的容积。即使肿瘤容积达到5000mm3还生存的小鼠终止测定，进行安乐死。
(2)结果
结果示于图12。小鼠的生存期间中央值在E.G7-OVA肿瘤细胞挑战后，在G1(对照)组中为21日(组合液注射开始日起达到第36天)，G2(PPD-HAMP-nega-TuMP)组中为24日，G3(PPD-HAMP-mGM-CSF-MP)组中为26日，G4(PPD-HAMP-mGM-CSF-MP-hIL-2-MP)组中为31日以上。挑战后第31天结束时点生存的小鼠的比例在G1组中为1/10，G4组中为5/10，实施该2组间的母比率之差的检验(卡方检验)时，双侧达到p＝0.051，在G4组中观察到具有延命效果的强烈倾向。另外的G2组、G3组中，没有相对于G1组的统计学显著差异，但各自的生存期间中央值与G1组相比延长，因此分别确认到具有延命效果的倾向。
例11：利用混合癌症抗原和免疫刺激剂的癌症疫苗的抗肿瘤效果-2
例10中使用的抗原为卵白蛋白，免疫学中作为典型的模型抗原而通用，但并非自然产生的肿瘤细胞中包含的肿瘤抗原。因此，在此将小鼠肺癌细胞的裂解物作为肿瘤抗原，挑战活的相同的肺癌细胞时，研究作为添加剂而添加了吸附细胞因子的nega-TuMP的PPD-HAMP悬浮液的免疫佐剂效果。
(1)方法
(1-1)抗原与免疫佐剂的组合液
吸附细胞因子的nega-TuMP悬浮液的制作方法与例10的(1-1)项相同。按照常规方法，将作为小鼠肺癌的LLC细胞(由理化学研究所·理研生物资源中心获取，细胞编号RCB0558)增殖培养后，进行2小时无血清培养，用PBS(-)充分清洗后，通过常规方法的EDTA处理，剥离细胞后，在PBS(-)中制成悬浮液。使细胞数与2x107/mL一致后，重复冻结熔化，制成裂解物。裂解物用3％台盼蓝液染色，确认到没有存活的LLC细胞。将其作为肿瘤抗原，按照下表那样的液量的比例，与小鼠的各组一起，制作添加吸附细胞因子的nega-TuMP(mGM-CSF-MP和hIL-2-MP)作为免疫佐剂的组合液。在此，PPD-HAMP悬浮液中，未添加nega-TuMP本身。
[表3]
(1-2)对小鼠的给予计划
向6周龄的C57BL/6小鼠(雌性，由日本CLEA公司购入)，将上表的组合液每1只背部皮下注射0.1mL。一个小鼠的组为10只，但mGM-CSF-hIL-2-PPD-HAMP组中为8只。注射开始日记作第0天。此时的给予0.1mL中包含LLC细胞裂解物。以后，将不含LLC细胞裂解物的上表的组合液对各个组每1只在第4、10、18、25、32、39、46天追加皮下注射0.1mL。
(1-3)小鼠中的LLC细胞的挑战
将制作上述的裂解物的细胞的原株、即活的LLC细胞悬浮于无血清的MEM培养液0.1mL中，将1x104个在第15天注射至大腿部皮下，作为肿瘤细胞挑战，以下通过触诊记录首次产生肿瘤块之日。挑战后，至该日为无肿瘤的期间。
(2)结果
LLC细胞的挑战后，至第53天进行观察的结果是，两组中在无肿瘤的情况下残留的小鼠如图13所示。对照(saline)组中从肿瘤细胞挑战后第17天观察到肿瘤块的产生，与此相对地，PPD-HAMP组中肿瘤块的产生推迟至第24天起，对肿瘤块的产生确认到抑制效果，而两组在挑战后50天以后在无肿瘤的情况下残留的小鼠均同为6/10(60％)。但是，mGM-CSF-hIL-2-PPD-HAMP给予组中，完全没有观察到肿瘤块的产生(8/8、100％)，与对照组之间实施2组间的母比率之差的检验(卡方检验)时，双侧达到p＝0.0425，存在统计学上显著的差异。
将该结果、和例10的图12的结果合并考虑，确认到PPD-HAMP(尽管未添加nega-TuMP)具有能够抑制肿瘤的增恶的免疫佐剂活性，向其追加在nega-TuMP上吸附的细胞因子mGM-CSF和hIL-2时，发挥出更强且有效的免疫佐剂活性。
此外，本领域技术人员广泛已知，在体内自然产生的肿瘤细胞中，其包含的肿瘤抗原的抗原性一般而言低，无法简单地引起体内的抗肿瘤免疫反应(因此才产生肿瘤)。因此，如果替代在此使用的肿瘤抗原(LLC细胞裂解物)，使用抗原性高的物质(例如病毒等源自外来生物的抗原)，则形成能够对抗该病毒感染症的疫苗，其免疫反应的机理不依赖于抗原而基本相同，因此对本领域技术人员而言是显而易见的。进一步，如果将向PPD-HAMP追加了mGM-CSF-MP或IL-2-MP的免疫刺激剂制成免疫佐剂，则如上述那样即使对抗原性低的肿瘤抗原也能够诱导有效的抗肿瘤免疫反应，因此即使是源自体内且抗原性低的其他疾病原因物质，也能够制作以该物质作为抗原的形成该疾病的治疗用疫苗的组合物，这对本领域技术人员而言也是显而易见的。
工业实用性
本发明的复合体具有免疫刺激作用，能够有效地刺激抗原提呈细胞，因此除了对肿瘤等疾病的治疗之外，作为用于预防恶性肿瘤的术后复发或转移的预防的免疫刺激剂也是有用的。
Claims (17)
1.一种复合体，其包含载体、和在该载体上负载的具有过氧化物酶样活性的蛋白质，所述载体包含通过变性凝固而固体化的源自血浆的蛋白质或源自血清的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的复合体，其中，具有过氧化物酶样活性的蛋白质在实质上未变性的状态或变性的状态下负载。
3.根据权利要求1所述的复合体，其中，具有过氧化物酶样活性的蛋白质在与源自血浆的蛋白质或源自血清的蛋白质一起通过变性凝固而固体化的状态下负载。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的复合体，其中，具有过氧化物酶样活性的蛋白质为血红蛋白或肌红蛋白。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的复合体，其还负载有1种或2种以上的免疫刺激物质。
6.根据权利要求5所述的复合体，其中，免疫刺激物质是选自纯化结核菌素、BCG菌提取物、细胞因子、Toll样受体配体、NOD样受体激动剂、RIG样受体激动剂、C型凝集素受体激动剂、与环状GMP-AMP合成酶结合的外源性DNA、警报素、抗原和抗体构成的组中的1种至2种以上的物质。
7.一种免疫刺激剂，其包含权利要求1至6中任一项所述的复合体。
8.一种免疫刺激性组合物，其包含权利要求7所述的免疫刺激剂和白蛋白-肝素团聚体沉淀。
9.根据权利要求8所述的免疫刺激性组合物，其中，白蛋白-肝素团聚体沉淀是吸附有细胞因子的肝素-白蛋白团聚体沉淀。
10.根据权利要求9所述的免疫刺激性组合物，其中，细胞因子是选自粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、白介素-2、和干扰素γ构成的组中的1种或2种以上的物质。
11.一种用于治疗和/或预防疾病的药物，其包含权利要求7所述的免疫刺激剂或权利要求8所述的免疫刺激性组合物、和免疫反应抑制作用阻碍物质的组合。
12.根据权利要求11所述的药物，其用于恶性肿瘤的治疗和/或复发或转移的预防。
13.根据权利要求11或12所述的药物，其中，免疫反应抑制作用阻碍物质是免疫检查点抑制剂。
14.根据权利要求13所述的药物，其中，免疫检查点抑制剂是选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗CD40抗体、抗CD137抗体、抗OX40抗体、抗TGF-β抗体、抗LAG3抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗TIM3抗体、抗CD96抗体和抗TIGIT抗体构成的组中的1种或2种以上的抗体。
15.一种用于预防疾病的疫苗，其包含权利要求7所述的免疫刺激剂或权利要求8所述的免疫刺激性组合物、和抗原的组合。
16.根据权利要求15所述的疫苗，其中，抗原为肿瘤抗原。
17.根据权利要求16所述的疫苗，其用于恶性肿瘤的治疗和/或复发或转移的预防。
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