CN1774255A - 无菌免疫原性非－致瘤性肿瘤细胞组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及除去细胞聚集物中的生物负荷从而得到用于生产疫苗的、仍是活的及免疫原性的细胞的方法。本发明还涉及一种引发免疫应答从而防止转移瘤复发的方法，包括制备并给予一种来源于实体肿瘤的无菌疫苗。所述疫苗是通过切除癌症患者的实体肿瘤、用酶消化肿瘤细胞从而得到解离细胞、辐射解离细胞使细胞不会致瘤、并将细胞灭菌而制备的。

Description

无菌免疫原性非-致瘤性肿瘤细胞组合物和方法
本申请要求2002年2月22日提交的美国临时申请系列60/358,431的权益，其全部内容均引入此处作为参考。
发明领域
本发明一般涉及生物学细胞灭菌方法及所得的无菌细胞产物；更具体而言，但不作为限制，还涉及癌症疫苗及用于制备无菌免疫原性且活的、但不会致瘤的肿瘤细胞组合物的方法。
发明背景
很难使用于预防和治疗目的的生物细胞组合物灭菌是因为细胞的化学、物理、或生理性质可能由于细胞周围环境的改变而被明显改变。例如，已知使用环氧乙烷进行的气体灭菌有毒而且致癌。用约1-3MRads(兆拉德)辐射虽然足以杀死微生物，但会改变蛋白、DNA、RNA等的结构，且或者生物学改变细胞预期的免疫原性或其它生物学功能或者使细胞完全灭活。当重要的是所运用的任何化学或物理方法不仅要获得高水平的无菌，而且细胞的代谢和免疫原性基本不会降低时，这些困难加剧。
美国专利US 5,484,596(“’596专利”)，名称为“有效的特异性免疫疗法”，涉及一种治疗患有可切除实体肿瘤的人结肠癌患者，从而抑制转移瘤复发和形成的方法。所述方法包括手术除去人类癌症患者的结肠肿瘤组织，处理肿瘤组织以得到肿瘤细胞，(用20,000拉德)辐射肿瘤细胞至活的但不会致瘤，制备含有活的非-致瘤性肿瘤细胞的疫苗，并在癌症患者的免疫系统已经从手术恢复后，真皮内注射该疫苗。
依靠大肠内结肠肿瘤的来源，通过’596专利方法生产的癌症疫苗不是无菌的。虽然按照该专利制备的疫苗产品(OncoVAX)已经给予过几百名人类患者，但是管理机构现在要求这种疫苗产品必需是无菌的。为了获得免疫原性细胞制剂，肿瘤细胞必须是活的及代谢活性的。因此，使细胞无菌的任何处理都必须不会过度危害功效所需的细胞的重要生物学性质。我们所需要的是一种使细胞制剂无菌，同时维持存活力及免疫原性的方法。优选，这种灭菌方法可很容易被结合到现有的产品制造方法中。
本发明的目的是获得安全、无菌的肿瘤细胞组合物，而不会对肿瘤细胞的免疫原性造成重大改变。这些目的并非必需兼容。例如，灭菌可灭活微生物感染但也会大量灭活哺乳动物细胞；消毒剂可杀死微生物但也会杀死哺乳动物细胞；辐射可使微生物感染灭活但也会大大改变哺乳动物细胞的免疫原性和其它性质。因此，希望提供一种获得无菌非-致瘤性肿瘤细胞组合物的方法，其基本上不会干扰细胞的重要代谢和免疫原性。
发明概述
本发明提供一种用于除去和灭活肿瘤细胞中生物负荷的十分有效的化学和物理方法的联合，从而获得用于生产治疗和预防性产品的、仍是活的和免疫原性的无菌细胞组合物。这种灭菌处理方法被认为可用于各种细胞类型；然而，它被认为特别适用于将实体肿瘤组织灭菌，用于制备癌症疫苗，包括，例如，’596专利的自体结肠癌疫苗。
本发明还涉及通过给予一种源于实体肿瘤的无菌疫苗而治疗癌症和防止转移瘤复发的方法，所述实体肿瘤包括，但不限制于，结肠癌、肾癌、乳腺癌、肺癌、和肉瘤，包括骨肉瘤。在其中一个实施方案中，本发明提供一种完整的多步方法，它以原位肿瘤开始，并产生无菌的肿瘤细胞疫苗，该疫苗被证实没有微生物生长。
根据本发明另一实施方案，用含有生理盐水和洗涤剂的洗涤溶液有力洗涤原位结肠肿瘤。有力洗涤可通过将无菌端口无菌装在含有洗涤溶液的袋上，并将这种溶液“喷”在肿瘤和周围组织上而获得。适宜的洗涤剂包括，例如，Triton X-100、NP40和Tween 80。然后切除该肿瘤，并在可控条件下运送到用于制备疫苗的设备上。
然后解剖切除的肿瘤，用化学消毒剂处理，并在消化前破碎，释放单个肿瘤细胞。对消毒剂的浓度和处理的持续时间进行选择可提高抗微生物的活性，同时使细胞毒性减到最小。适宜的消毒剂包括，但不限制于，Clorpactin(氧氯苯磺酸钠)(United-Guardian，Inc.)、次氯酸钠、和Oxygene(稳定的二氧化氯)(Oxyfresh Worldwide，Inc.)。消毒后，使肿瘤破碎并利用解离酶消化，优选在有抗生素和一种或多种抗-霉菌剂存在的条件下进行。适宜解离酶的例子包括胶原酶和胰蛋白酶。解离过程中所用的抗生素和抗-霉菌剂包括氨基苷类抗生素(如庆大霉素)、β-内酰胺沙纳霉素类抗生素(如Primaxin(伊米配能)(Merck & Co.，Inc.))、喹诺酮类抗生素(如Levaquin(左氟沙星)(Ortho-McNeil))、和抗-霉菌剂(如两性霉素B)。
解离后，可以约-1℃/分钟的受控速率冷冻至约-80℃而冷冻保存混悬的肿瘤细胞。然后对肿瘤细胞，优选仍然冷冻的肿瘤细胞进行辐射，辐射的剂量足以灭活微生物和致瘤性，而不会不利地影响细胞的存活力、代谢活性、和免疫原性。辐射剂量是约100,000-200,000拉德γ射线；优选约150,000-200,000拉德；且更优选约190,000-200,000拉德。辐射细胞在冷冻状态下维持，直到在给予患者前融化。
通过真皮内注射，优选以约107个活的肿瘤细胞/剂给予患者癌症疫苗形式的融化无菌细胞，从而引发免疫应答并防止转移瘤复发。通过台盼蓝排斥法测量，所述剂量所含的肿瘤细胞通常具有至少80％的存活力。疫苗可以多个剂量给予患者，包括每周一次最少3周。剂量可与佐剂或免疫刺激剂在生理盐水中结合，以便进一步加强免疫应答。适宜佐剂和免疫刺激剂的例子包括BCG(卡介苗(Organon，Inc.))、小棒杆菌(GlaxoSmithKline)、“辅助”抗原，如KLH(匙孔血蓝蛋白(Intracel Corp.))、和淋巴因子-细胞因子，如GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落-刺激因子(Leukine))(Schering-Plough))和干扰素(Avonex(Biogen，Inc.))。
按照特别优选的实施方案，本发明的灭菌方法包括：(1)每次用500mL量的无菌生理盐水有力洗涤原位结肠肿瘤和周围组织4次，其中至少一次生理盐水洗涤含有1％Triton X-100；(2)在0-6℃的温度下运送肿瘤，其中手术切除与解离过程开始之间间隔至少48小时；(3)在破碎前，用0.4％ Clorpactin处理肿瘤碎片2分钟；(4)在有庆大霉素、Primaxin、Levaquin、和两性霉素B存在的条件下解离肿瘤；并(5)用200,000拉德辐射解离的细胞，同时冷冻。生物等价研究是使用所得的无菌肿瘤细胞开始的。阳性免疫原性的标准是第三次注射的延迟皮肤过敏(“DCH”)反应≥5mm。迄今为止，已经治疗过12名患者。所有患者都具有超过阳性免疫原性反应标准的DCH反应(平均14.6×13.4mm)。根据癌症的诊断分期，患者在第一次注射后5-9个月接受第4次治疗。接受第4次治疗的6名患者中的5名具有15.1×15.1mm的平均DCH反应。这些反应是对无菌肿瘤细胞的长期免疫性以及因此对结肠直肠癌复发的免疫性的发展的指示。
根据连同附图一起提供的下列详细描述可更容易地理解本发明的这些和其它优点及特征。当在下面的实施例中讨论结肠肿瘤和自体结肠癌疫苗制剂时，本发明的教导可应用于将要经历灭菌并仍然保持存活力、代谢活性、非-致瘤性和免疫原性的任何实体肿瘤细胞。
附图简述
图1证实在用于研究OncoVAX的实验模型中试验的、按照本发明制备的疫苗细胞的免疫原性功效，并与通过原始非-无菌OncoVAX方法制备的疫苗细胞的功效进行了比较。正如所见到的那样，改进的灭菌方法对功效没有消极影响。如实施例6证实的那样，这些数据被证实并通过对使用按照本发明制备的OncoVAX治疗人类患者进行的研究而扩展。
图2证实洗涤条件对生物学物质的生物负荷的作用。通过将HBSS/G倾注在肿瘤上(P)，或将单独的生理盐水(S)或生理盐水结合TritonX-100(T)喷在肿瘤上而原位洗涤15个肿瘤。然后解剖肿瘤组织。使用膜过滤法测定细胞混悬液中的生物负荷，并接种在TSA-SB和SAB平板上。生物负荷是以集落形成单位(CFU)/107个肿瘤细胞，约一个剂量的OncoVAX表示的。
图3证实仅仅使用生理盐水进行的肿瘤洗涤循环次数对生物负荷的作用。在解剖前，使用生理盐水洗涤5个肿瘤5次。单独收集每次洗涤后的液体，并通过直接在TSA-SB平板上接种而测定生物负荷。对于每个肿瘤而言，用每次洗涤得到的原始集落数除以第一次洗涤液中的CFU，从而使数据标准化。绘制标准化数据的平均值和标准差。
图4证实使用生理盐水和Triton X-100进行的肿瘤洗涤循环次数对生物负荷的作用。在解剖前，洗涤5个肿瘤5次。第1、2、3、4和5次洗涤都含有生理盐水。第2次洗涤是1％ Triton X-100的生理盐水溶液。单独收集每次洗涤后的液体，并通过直接在TSA-SB平板上接种而测定生物负荷。对于每个肿瘤而言，用每次洗涤得到的原始集落数除以第一次洗涤液中的集落数，从而使数据标准化。绘制标准化数据的平均值和标准差。
发明详述
用于本发明目的的词语“无菌”或“灭菌”用于表示组织或细胞已经完全没有可检测到的细菌、酵母和真菌。这一点与所有适合的管理要求相一致。
手术室无菌过程可减少切除肿瘤细胞的外部污染的可能性。就结肠肿瘤而言，在手术前对患者进行抗生素治疗和灌肠以及结肠切除术可进一步减少内源性生物负荷和粪便污染。然而，由于解剖学位置和肠微生物的存在，这种措施虽然有效，但仅仅是疫苗研制所需的使肿瘤无菌的第一步。
进行肿瘤细胞最初的病理学处理的优选地点是无菌手术室或其它可控环境。这里，在切除结肠肿瘤前，通过除去残留的粪便、粘蛋白状、或其它外来物质而洗涤包含肿瘤的结肠或其它器官以及原位肿瘤可减少生物负荷。优选有力洗涤，并且可通过使用喷射瓶将无菌洗涤溶液喷在肿瘤和周围组织表面洗涤结肠而实现。洗涤溶液可以是，例如，无菌生理盐水和洗涤剂。洗涤剂必须不会过度干扰随后的组织学技术，包括免疫组织化学。适宜的洗涤剂包括Triton X-100、NP40、和Tween 80，虽然也可使用各种其它洗涤剂。
有力洗涤原位肿瘤时，可用无菌端口将静脉内用生理盐水无菌装到500mL软袋中，然后将袋转换到喷射瓶中。例如，可垂直或水平持有结肠(将包含肿瘤的结肠区域略微升高)，多次将500mL洗涤液有力喷在肿瘤上，除去可能在随后的解剖过程中进一步污染肿瘤的粪便。根据这里的教导，可使用不同量的洗涤溶液和洗涤剂和/或抗生素，包括不同的洗涤条件(倾注洗涤溶液，有力洗涤)、不同的洗涤循环次数、和不同的洗涤溶液和用量。我们已经发现通过有力喷射4次、每次500mL生理盐水洗涤原位肿瘤和有力喷射1次500mL 1％TritonX-100的生理盐水溶液可充分除去生物负荷，以进行随后的肿瘤处理。
洗涤原位肿瘤后，病理学家可在手术室(或其它可控环境)中除去并解剖肿瘤，随后运送给疫苗制造商或运送到进一步处理的其它设备中。解剖的肿瘤可通过在运送过程中维持适宜温度条件的任何适当方法运送。优选，在肿瘤运送或贮藏前，将抗生素，如庆大霉素加入到运送培养基(例如，含有50μg庆大霉素/ml的Hank′s平衡盐水溶液(HBSS)(HBSS/G))中。我们已经发现，如果在培养基中加入适宜的抗生素并将解剖的肿瘤维持在约0-6℃的温度下，则可在约48小时或更长的时间内，将解剖的肿瘤从手术医院运送到较远的设备。
解剖肿瘤表面污染的进一步减少是通过在进一步破碎和解离之前，将肿瘤碎片消毒而获得的。然而，化学消毒剂广泛发挥作用，因此不能区分哺乳动物和细菌(或真菌)细胞。所以，与使用抗生素处理不同，以杀微生物的浓度对解离的肿瘤细胞使用化学消毒剂可导致不可接受水平的肿瘤细胞毒性。
切除的肿瘤通常包含若干碎片，这是因为病理学家频繁切割肿瘤以确定侵入的最深边缘。在进行消毒步骤之前，优选在有HBSS/G存在的条件下进一步解剖这些碎片，从而除去任何外来的非-肿瘤和坏死组织。结肠肿瘤的腔表面通常包含最大量的生物负荷。化学消毒剂可杀死任何暴露的微生物连同暴露的肿瘤细胞。以这种方式，使用消毒剂可化学“烧灼”解剖肿瘤碎片的外部，表面生物负荷即位于此处。在破碎之前这样处理解剖组织可将肿瘤碎片的表面消毒，同时使最小的表面积与消毒剂接触。肿瘤的更深方面因此而未受影响，并由此保留了活的肿瘤细胞的来源。由于结肠肿瘤的息肉样性质及其多处内陷，这些区域会捕获细菌并免受消毒剂作用。因此，通过用适宜的消毒剂处理，固有的生物负荷可显著降低，但不能完全消除。
可使用各种消毒剂和用量，包括各种浓度的Carrel-Dakin溶液(缓冲的0.5％次氯酸钠)和Clorpactin以及接触时间。在其中一个实施方案中，使解剖的肿瘤碎片与0.4％ Clorpactin接触2分钟。消毒可很方便地通过任何适宜的方法进行，包括将解剖的肿瘤碎片放在含有消毒溶液(例如，约125mL 0.4％ Clorpactin)的烧瓶中，然后在旋转平台摇动器上以约200rpm摇动约2分钟。就结肠肿瘤碎片而言，我们已经发现在肿瘤破碎和解离之前，用约0.4％Clorpactin进行单一的2分钟处理可提供有益的结果。通常，在化学处理之后，化学消毒剂可通过用生理盐水洗涤而除去。
肿瘤消毒过程之后，再次污染的可能性可通过适宜的无菌技术而降低，如线清除和生物安全柜(BSC)的卫生处理。可导致产品与环境接触的所有步骤都应当在BSC中进行，在将物质放在BSC中之前，所有物质都应当用70％异丙醇或其它适宜的消毒剂喷洒或擦拭。
然后通过任何适宜的方法使消毒的肿瘤碎片破碎，得到较小的碎片(如，约2-4mm2)用于解离过程。破碎可通过使更多肿瘤表面与解离酶接触而促进解离过程。碎片可用，例如，HBSS/G清洗，并在Kryorack中，在约0-+6℃下维持，直到肿瘤已经完全破碎，并获得适宜量，例如，约3.0克的肿瘤碎片，随后通过解离酶消化成游离的单个肿瘤细胞。
解离前，可用含有抗生素(例如，庆大霉素)的生理溶液(例如，HBSS)(HBSS/G)洗涤肿瘤碎片。为了进行解离过程，将已经修剪过并切碎成碎片的肿瘤碎片转移到烧瓶或其它适宜溶液中，与酶解离培养基培养一段时间，这段时间足以形成肿瘤细胞的混悬液。持续时间取决于酶的浓度和选择，以及解离循环的次数。所述酶通常是溶于HBSS中的胶原酶-DNA酶溶液(例如，30-40ml 0.14％(200个单位/mL)1型胶原酶(Advance Biofacture)和0.1％(500Kunitz单位/ml)1型脱氧核糖核酸酶(Sigma D-0876))，但任何适宜的解离酶溶液都可使用。可使用无菌的HBSS连同庆大霉素或其它抗生素洗涤通过酶解离得到的细胞混悬液。在其中一个实施方案中，酶解离培养基(30mL)是0.14％胶原酶、0.1％DNA酶溶于含有庆大霉素的HBSS溶液(HBSS/G)。就约2-4mm2的肿瘤碎片而言，我们已经发现在36-38℃下进行3次解离循环，每次35-45分钟，可产生约7.2×107个肿瘤细胞或更多。每次解离循环之后，可将细胞离心、清洗、重悬浮在无菌的HBSS/G中。
如果需要，还可使用尼龙筛将所得的细胞混悬液过滤，从而除去任何细胞凝块。封闭系统，如儿科输液试剂盒，可用于进一步减少污染的任何可能性。然后将所得的解离细胞装入小瓶，并保留随机的质量控制样品用于试验和释放用于质量控制目的的试验产品。
肿瘤内陷内捕获的微生物通常在破碎和酶解离过程中释放。酶解离还可在有利于肠微生物生长的条件下进行。我们已经发现解离过程中抗生素的存在可减少解离过程中释放的生物负荷，并抑制解离过程中微生物的进一步生长。抗生素通常可在较长时间内发挥作用。因为解离过程的持续时间相对较短，然而，某些抗生素/抗-霉菌鸡尾酒优选在与解离酶培养的过程中使用。在解离过程中与酶培养的优选抗生素和抗-霉菌剂包括有效抗厌氧菌的抗生素(如，Primaxin)、有效抗革兰氏阳性需氧菌的抗生素(如，喹诺酮类抗生素，例如左氟沙星)、和作用于不受抗生素影响的酵母菌的抗-霉菌剂。优选的抗-霉菌剂是两性霉素B。在其中一个实施方案中，酶解离培养基含有25μgLevaquin、100μg Primaxin、和1μg两性霉素B/mL酶解离培养基。
在冷冻保存前，将解离细胞的混悬液离心用于进一步洗涤。离心后，可将颗粒状物重悬浮在生物物质小瓶中的适宜体积的HBSS/G连同冷冻培养基(含有15％二甲基亚砜(DMSO)和1％人血清白蛋白(HSA)的2X冷冻培养基)中。将细胞放在冷冻小瓶中，并通过以约-1℃/分钟的受控速率冷冻至约-80℃的温度而冷冻保存。冷冻保存循环直到小瓶和冷冻室已经平衡到+4℃的温度才开始。所得的冷冻混悬液可在，例如，液氮中贮存。细胞通常在冷冻保存状态下维持，直到融化用于给予患者。它们应被转移到干冰上，尽快从受控速率的冰箱到液氮贮存系统。然后，冷冻的生物学物质释放用于冷冻小瓶的辐射。
选择辐射剂量，从而不仅使肿瘤细胞不会致瘤(通常约200,000拉德)，而且灭活解离细胞混悬液中的任何残留生物负荷。然而兆拉德的辐射剂量与活的、代谢活性的哺乳动物细胞不相容。本发明的优选剂量是约100,000-200,000、更优选约150,000-200,000、最优选190,000-200,000拉德的γ射线。如此提供了冷冻肿瘤细胞小瓶辐射的适宜杀微生物剂量，连同方法中其它减少生物负荷的步骤，使细胞无菌。辐射肿瘤细胞同时冷冻还具有在试验并释放细胞用于患者治疗前允许辐射的优点。这与’596专利的方法相反，其在给予患者制剂前，将20,000拉德应用于液体细胞混悬液。
在本发明其中一个实施方案中，除去液氮贮存系统中的解离肿瘤细胞的冷冻小瓶，并放在辐射器的辐射容器内的2-5cm干冰床上。然后用干冰完全覆盖小瓶，填满辐射容器。如果需要，辐射循环开始并每隔2小时暂停1次，以便用干冰再次填满容器。应用200,000拉德后，将小瓶放回到液氮中。
辐射优选在一个或多个中央制造中心进行。这样可消除每个门诊地点对辐射器的需要，并由疫苗或其它无菌细胞产品的制造商控制过程。进行各种质量控制试验，以确保无菌、安全且有效的疫苗产品。这种在产品释放前对随机选择的质量控制样品进行的试验通常包括无菌、细胞计数、身份、和效能试验。
最终的疫苗制剂可由药剂师用有限的设备要求进行，因为在已经进行了完全的质量控制过程之后，可将冷冻的辐射细胞运送给药剂师-照料患者的人，或疫苗的其它最终使用者，从而给予需要治疗的患者所述产品。
疫苗配制的第一步通常是融化无菌的免疫原性非-致瘤性肿瘤细胞。冷冻的肿瘤细胞可在辐射后，通过任何适宜的方法，包括水浴融化。优选用热阻使水中污染物污染肿瘤细胞小瓶的可能性减到最小。在该点，可通过连续的循环离心和在新鲜的HBSS中重悬浮而用HBSS进一步洗涤融化的细胞。各种技术均可选择，只要其中教导了制备制剂，按照各种给药方式给予患者，如’596专利公开的那些。在特别优选的实施方案中，将通过上述方法制备的107个活的无菌结肠肿瘤细胞真皮内注射到已经从中得到肿瘤的癌症患者中。这种自体疫苗的3次给药是以每周一次的间隔注射的。前2次注射还包含大约107个BCG生物；第3次注射不包含任何BCG。在’596专利中没有教导增加第4次加强注射，第4次加强注射包含自体肿瘤细胞而没有任何BCG，其在第一次治疗后5个月或更多个月给药。
所述无菌细胞混悬液可很容易被运送到冷的包装上给门诊病人，并按照由制造商和照料患者的人提出的特殊的给药和治疗方式给药。
                     实施例1
             解剖前洗涤结肠和原位肿瘤
静脉内用的生理盐水(不同于HBSS)是在500mL软袋中获得的。通过将无菌端口(例如，Combi-端口)无菌装在袋中，可基本上将袋子转换到喷射瓶中。通过挤压袋子，可用力将生理盐水流直接喷在肿瘤和周围的结肠粘膜上。
第一次洗涤时，可垂直持有结肠，并用500mL生理盐水从上面开始向下洗涤。在初步实验中，第二次500mL洗涤包括生理盐水或1％Triton X-100(溶于生理盐水中)，并直接针对肿瘤及其接近的相邻区域。当垂直持有结肠时，同样进行这种洗涤。然后水平持有结肠，并将含有肿瘤的结肠区域略微升高。然后针对肿瘤进行进一步的洗涤(2-3次)，每次含有500mL生理盐水。将每次洗涤后的液体收集在单独的无菌盆中并测定，提供生物负荷除去的间接测量值。当可得到时，使肿瘤解离，并测定(冷冻保存前)细胞混悬液的生物负荷，提供该过程功效的直接证据。
为了评估洗涤方法，进行生物负荷的直接测定，即，测定解离后细胞混悬液中的微生物数量。如图2所示，与使用单独的生理盐水或使用生理盐水结合Triton X-100喷射的肿瘤相比，在从通过将HBSS/G倾注在结肠和结肠肿瘤的肿瘤解离的细胞混悬液中观察到更高的生物负荷(以集落形成单位CFU/107个肿瘤细胞表示)。显然，因为有力洗涤过程所用的体积(2000或2500mL)要大于倾注生理盐水方法所用的体积(1000mL)，因此不能认为降低的多少是由于所用的体积或方法。然而，很明显新的有力洗涤方法被证实更好。
洗涤过程在解剖之前进行。因为洗涤步骤包括在用于除去解剖过程中可进一步污染肿瘤的粪便的过程中，因此它不适合在洗涤前通过解剖将肿瘤细分从而在解离的细胞中进行生物负荷的比较研究。此外，不能以更少或更多次原位洗涤用单独的生理盐水洗涤肿瘤的一半或用Triton X-100结合生理盐水洗涤肿瘤的一半。所以，不能在同一患者的材料上进行比较研究。每次洗涤后的液体中的生物负荷测定可提供不同洗涤溶液功效的证据。每次实验中的绝对生物负荷水平广泛变化，这是因为患者与患者之间的粪便菌丛量不同。为了评估每次洗涤的相对有效性，用每次洗涤液的生物负荷值除以#1洗涤液中的生物负荷从而使数据标准化。当使用单独的生理盐水(5个肿瘤)时，洗涤液中生物负荷的量存在一致的降低(图3)。
【为了评估洗涤方法，进行生物负荷的直接测定，即，测定解离后细胞混悬液中的微生物数量。如图2所示，与使用单独的生理盐水或使用生理盐水结合Triton X-100喷射的肿瘤相比，在从通过将HBSS/G倾注在结肠和结肠肿瘤的肿瘤解离的细胞混悬液中观察到更高的生物负荷(以集落形成单位CFU/107个肿瘤细胞表示)。显然，因为有力洗涤过程所用的体积(2000或2500mL)要大于倾注生理盐水方法所用的体积(1000mL)，因此不能认为降低的多少是由于所用的体积或方法。然而，很明显新的有力洗涤方法被证实更好。
洗涤过程在解剖之前进行。因为洗涤步骤包括在用于除去解剖过程中可进一步污染肿瘤的粪便的过程中，因此它不适合在洗涤前通过解剖将肿瘤细分从而在解离的细胞中进行生物负荷的比较研究。此外，不能以更少或更多次原位洗涤用单独的生理盐水洗涤肿瘤的一半或用Triton X-100结合生理盐水洗涤肿瘤的一半。所以，不能在同一患者的材料上进行比较研究。每次洗涤后的液体中的生物负荷测定可提供不同洗涤溶液功效的证据。每次实验中的绝对生物负荷水平广泛变化，这是因为患者与患者之间的粪便菌丛量不同。为了评估每次洗涤的相对有效性，用每次洗涤液的生物负荷值除以#1洗涤液中的生物负荷从而使数据标准化。当使用单独的生理盐水(5个肿瘤)时，洗涤液中生物负荷的量存在一致的降低(图3)。#2洗涤液中的平均值是#1洗涤液中存在的生物负荷的25％(3.6％-74％)。#3洗涤液中的平均生物负荷是#1洗涤液的7％(0.6-13％)。与之相比，在用Triton X-100处理的5个肿瘤的2个中，与第一次的洗涤液相比，含有Triton X-100的第二次洗涤液中存在更多生物负荷(241％和513％)(图4)。第三次洗涤液中的生物负荷再次降低。这些数据暗示利用Trinton X-100除去更多生物负荷。我们建议在第二次洗涤步骤中使用Triton X-100。可通过洗涤除去的绝大多数生物负荷是通过前三次洗涤除去的；只有少量是通过第4次或第5次洗涤除去的。
以上述研究为基础，我们采用将洗涤溶液有力喷在结肠和肿瘤上，而不是倾注在结肠和肿瘤上的洗涤过程。充分支持向其中一次的洗涤溶液中加入表面活性剂Triton X-100。因此，优选的解剖前处理包括开始用500mL生理盐水洗涤，接着用500mL Triton X-100洗涤，并用单独的生理盐水进行两次额外洗涤(500mL)结束。
                     实施例2
            酶解离前的结肠肿瘤的化学消毒
就病理学阶段目的而言，病理学家切割肿瘤以确定侵入的最深边缘。因此，切除的肿瘤包含若干肿瘤组织碎片。解剖该组织以除去外来的非肿瘤和坏死组织。将修剪过的肿瘤碎片进一步细分以实现均匀性，并分成2-4个组，用于按照实验设计处理。将组织尽可能平衡地分配在样品中，尽可能使实验组中的肿瘤碎片看起来相同。将修剪过的碎片加入到含有40mL消毒剂的试管中，然后通过在旋转平台摇动器上以200rpm摇动2分钟而处理。然后用HBSS洗涤修剪过的肿瘤碎片3次，之后解离。解离肿瘤的量是通过在解离前和解离循环完成后，将肿瘤碎片称重而测定的。解离后，测定肿瘤细胞混悬液中的肿瘤细胞存活力百分比、活的肿瘤细胞数、肿瘤细胞的效能和生物负荷。产率被定义为每克确实解离肿瘤获得的活的肿瘤细胞数。使生物负荷标准化至CFU/107个活的肿瘤细胞，约1剂的产品。
在初始实验中，相对于对照组，有效减少生物负荷的次氯酸钠浓度还可显著减少肿瘤细胞产率。在试验浓度下，相对于对照组，Clorpactin可减少样品中的生物负荷，更适度降低肿瘤细胞产率。用消毒剂处理修剪过的肿瘤碎片可减少生物负荷，但不能使肿瘤细胞混悬液无菌。
作为单一的步骤，消毒实验的最初目的是使解离的肿瘤细胞无菌。对该方法进行改变，将消毒看作是完整的、多步过程的一部分，而使产品无菌。因此在解离前，再次对肿瘤进行消毒，且使用Clorpactin获得的初步结果被证实并通过进一步的实验研究被扩展。此外，还评估了通过不同生物学机理发挥作用的其它抗菌剂(对氯间二甲酚)。对氯间二甲酚，或PCMX，也是手术消毒的活性成分，Techni-CareX(Care-Tech Labs.，Inc.)。
该研究的结果在表1中提出。用生理盐水洗涤肿瘤样品500-0051-KNO，第二次用Triton X-100洗涤，接着再用生理盐水洗涤3次(见实施例1)。最终的生物负荷低于测定法的检测限度。为了评估消毒剂除去生物负荷的能力，在对照样品中必须检测到1-2个对数的生物负荷。为了使肿瘤中可能的生物负荷达到最大并对消毒剂提出更大挑战，对该过程进行了下列改进：在进行病理学解剖前对肿瘤进行最小限度的洗涤(1个500mL量)；解离是在没有庆大霉素存在的条件下进行的。
相对于对照组，用Clorpactin处理修剪过的肿瘤碎片导致生物负荷降低至几乎3个数量级，细胞产率仅适度损失。肿瘤500-052-EVA的对照样品具有相对于对照组而言异常低的细胞产率，和因此相对于实验样品而言异常高的产率百分比(相对于该对照)。制造商建议的Clorpactin剂量是0.2％-0.4％。当在这些研究中使用0.8％时，观察到生物负荷没有进一步降低；然而，活的肿瘤细胞产率进一步降低。由于这个原因，选择0.4％Clorpactin作为工作浓度进行进一步研究。0.8％Clorpactin处理样品中偶然更高水平的生物负荷大概是由于将肿瘤碎片分成具有相等水平生物负荷的相等部分的固有困难。尽管很少或没有杀微生物作用，PCMX的细胞毒性高于Clorpactin，导致产率显著降低。
Clorpactin的临床用途包括用新鲜的消毒剂冲洗受影响的区域。因此，作为活性成分，氯消散，然后将新鲜的消毒剂应用于该区域。最后的研究比较了两个连续的两分钟处理，每个使用新鲜的0.4％Clorpactin，以及通常进行的单一的两分钟处理。观察到两次处理没有益处。
以这些研究为基础，在破碎和解离前，用0.4％Clorpactin对肿瘤碎片进行单一的、2分钟处理作为优选的完整多步过程的一部分被执行，从而使肿瘤细胞无菌。
表1.解离前的肿瘤消毒
  患者样品   处理 存活力(％) 产率(％) 效能(％)   生物负荷(CFU/10′个细胞)&(减少％) 无菌
TSA-SB4需氧 TSA-SB厌氧 SAB-CM5需氧 TSB2  FTG3
  500-0051-KNO   对照(HBSS)   94   100   97   ＜44   --  ＜44   --   ＜44 --   F   P
  0.4％Clorpactin   91   132   94   ＜49   (*)  ＜49   (*)   ＜49 (*)   P   P
  0.33％PCMX   94   201   97   ＜34   (*)  136   (*)   ＜34 (*)   F   F
  500-0052-EVA6   对照(PBS)   90   100   98   105,000   --  117,000   --   89,000 --   F   F
  0.4％Clorpactin   90   346   99   3910   (96％)  3890   (97％)   207 (＞99％)   F   F
  0.8％Clorpactin   93   272   96   7100   (93％)  8870   (92％)   4452 (95％)   F   F
  500-0053-VBO6   对照(HBSS)   91   100   N/D   10   --  1100    --   10 --   F   P
  0.4％Clorpactin   94   90   N/D   ＜11   (0％)  343   (69％)   ≤11 (0％)   F   F
  0.8％Clorpactin   96   67   N/D   ＜13   (0％)  1364   (*)   ≤13 (0％)   F   F
  1.S％PCMX   89   35   N/D   ＜27   (0％)  1490   (*)   ≤27 (*)   F   P
  500-0054-ETA6   对照(HBSS)   93   100   99   33   --  68   --   ≤17 --   F   F
  0.4％Clorpactin   95   100   98   ＜23   (30％)  ＜23   (66％)   ≤3 (*)   F   F
  Roc-00-00016   对照(HBSS)   95   100   97   160   --  ＞300   ≤2 --   F   P
  0.4％Clorpactin1次处理   96   158   97   2   (99％)  294   (*)   ≤2 (*)   F   P
  0.4％Clorpactin2次处理   90   67   98   ≤2   (99％)  3800   (*)   ≤2 (*)   F   F
  Roc-00-0002   对照(HBSS)   91   100   99   ≤2   --  ≤2    --   ≤2 --   P   F
  0.4％ClorPactin1次处理   92   164   100   ≤2   (*)  ≤2   (*)   ≤2 (*)   P   P
  0.4％Clorpactin2次处理   90   99   97   ≤2   (*)  ≤2   (*)   ≤2 (*)   F   P
1.将无菌评价为通过(P)(没有微生物生长的证据)和失败(F)(微生物生长)
2.TSB，胰蛋白酶大豆培养液
3.FTG，液体巯基乙酸盐培养液
4.TSB-SB，含有绵羊血的胰蛋白酶大豆琼脂
5.SAB-CM，含有氯霉素的Saboraud′s葡萄糖琼脂
6.这些肿瘤被最低程度地原位洗涤，而且在解离过程中不含庆大霉素，从而使可能的生物负荷达到最大。
*不能计算降低的百分比，这是因为或者在未处理的对照组中没有检测到生物负荷，或者因为处理过的样品中的生物负荷水平高于对照组
                    实施例3
      结肠肿瘤解离过程中抗生素存在的作用
结肠肿瘤中的内陷内捕获的肠微生物在酶解离过程中释放。此外，酶解离过程在有利于肠微生物生长的条件下(37℃)发生。由于这些原因，而研究了向解离酶溶液和其它处理溶液中加入抗生素的作用。
抗生素通常可在较长时间内使用。第一组实验被设计用来评估各种抗生素在较短接触时间内的功效。下一组实验则检验当包含在解离酶溶液中时，所述抗生素的有效性。
在4℃或37℃下，将适宜的试验微生物与抗生素培养不同的时间。“未处理的”对照组与HBSS一起培养。处理完成后，利用膜过滤法在含有5％绵羊血的胰蛋白酶大豆琼脂(TSA-SB)和Sabouraud′s葡萄糖培养基(SAB)上测定样品的生物负荷。这些实验中所用的检测真菌的SAB培养基不含氯霉素，且因此还可支持细菌的生长。
在与(等体积)没有庆大霉素的冷冻保护培养基混合之前，庆大霉素(50μg/mL)存在于所有溶液中，包含用于使细胞混悬的HBSS。将3种其它抗生素-抗霉菌溶液仅仅加入到用于解离肿瘤的胶原酶-DNA酶溶液中。用于洗涤通过酶解离获得的细胞混悬液的HBSS仅含庆大霉素。这些实验中所用的其它抗生素是伊米配能(Primaxin)(100μg/mL)、左氟沙星(Levaquin)(25μg/mL)和两性霉素B(1μg/mL)。这些浓度是在培养细胞上测定的，用试验微生物测试，寻找细胞毒性和抗微生物活性。
将结肠肿瘤碎片在含有庆大霉素的HBSS中洗涤，修剪至没有非-肿瘤或坏死物质，并切碎成碎片。将碎片相等分配在3个烧瓶中。一份平行测定的碎片在没有全部抗生素存在的条件下解离，从而再次产生用于生产早期研究中所用疫苗的条件。随后，用没有任何庆大霉素的HBSS洗涤细胞。第二组碎片在有庆大霉素存在的条件下解离。用于洗涤解离细胞的HBSS含有庆大霉素。第三份平行测定的碎片在有庆大霉素和其它试验抗生素存在的条件下解离。每个解离循环完成之后，将细胞重悬浮并用仅含庆大霉素的HBSS洗涤。
对于前4个处理过的肿瘤而言，将在有庆大霉素或庆大霉素连同其它抗生素存在的条件下解离的细胞混悬液的一部分与相同的抗生素再培养1小时(解离完成后)。评估这种额外培养是否进一步减少了生物负荷。
庆大霉素由于其热稳定性和广谱抗菌性而优选在肿瘤运送过程中和洗涤溶液中使用。庆大霉素还可包含在酶解离溶液中。因此根据与庆大霉素互补而选择其它抗生素。
厌氧菌是结肠中的主要微生物。经试验，甲硝唑(2.5和5μg/mL)可抗普通拟杆菌，并发现在这些实验中所用的需氧培养条件下无效。然后又试验出林可霉素(林可霉素盐酸盐)(Sigma-Aldrich Co.)和Primaxin可抗这种厌氧菌。当过夜(4℃)培养或额外培养时(即，37℃ 40分钟、4℃ 60分钟、接着又是37℃ 60分钟)，Primaxin都显示出与林可霉素相比更高的有效性。4℃下，Primaxin(100μg/mL)诱导1个对数的减少，而林可霉素(直到150μg/mL)没有作用。当在扩展条件下培养时，Primaxin诱导2个对数的减少，而林可霉素诱导1个对数的减少。
还评估了喹诺酮类抗生素的两个成员诺氟沙星(Noroxin(Merck& Co.，Inc.))和左氟沙星(Levaquin(Ortho-McNeil))。在初步实验中，经试验，诺氟沙星可抗粪肠球菌和绿脓假单胞菌。在37℃下培养1小时，诺氟沙星(12.5-50μg/mL)对绿脓假单胞菌十分有效，但对粪肠球菌无效。当对粪肠球菌进行试验时，左氟沙星显示出微小但可再现的抑制。
选择两性霉素B作用于酵母菌和霉菌。用两性霉素B(0.5-1.0μg/mL)处理后1天，观察到白色念珠菌菌落明显减少。然而，这种作用是制霉菌而不是杀霉菌；当在培养8天后观察时，在较高浓度下仅有轻微抑制。
因此，除了庆大霉素外，根据它们不同的敏感微生物菌谱，选择了3种抗生素/抗-霉菌剂，并开始对实验室菌株进行试验。伊米配能(Primaxin(Merck))是一种β内酰胺类沙纳霉素抗生素。它与庆大霉素互补，特别用于厌氧菌。左氟沙星(Levaquin(Ortho-McNeil))是喹诺酮类抗生素的成员。它与庆大霉素和伊米配能互补，用于革兰氏阳性需氧菌。最后，还包含抗霉菌的两性霉素B，其作用于酵母菌而不受抗生素的影响。
利用上述方式解离7个肿瘤。如表2所示，当在有庆大霉素存在的条件下解离肿瘤时，在所有情况下，微生物的生物负荷均降低，正如通过至少一个试验培养基所检测到的那样。
在有庆大霉素存在的条件下解离的肿瘤中的4个具有残留的生物负荷。在有全部抗生素存在的条件下，从这4个肿瘤产生的细胞混悬液中的3份(ROC-99-0035、ROC-99-0038、ROC-99-0039)具有生物负荷的进一步降低，尽管这种降低比较小。第4份肿瘤细胞混悬液(ROC-99-0036[SAB])中的生物负荷没有改变。无法说清的是，在第5个肿瘤(ROC-99-0041[TSAJ中，在有全部抗生素存在的条件下产生的细胞混悬液中的生物负荷比在仅有庆大霉素存在的条件下产生的细胞混悬液中的生物负荷更高。
如表3所示，与庆大霉素额外培养导致两份肿瘤制剂中的生物负荷进一步微小降低。虽然在SAB上检测到CFU降低了80％(ROC-99-0035)，但当接种在TSA平板上时，该肿瘤细胞混悬液中的CFU增加了3倍。TSA平板上CFU的大大增加还可用肿瘤细胞混悬液ROC-99-0036观察到。因此，与单独的庆大霉素进一步培养似乎更有害而不是更有益。除在SAN上试验的ROC-99-0036之外，与全部抗生素进一步培养对生物负荷没有作用。使用这种单一样品观察到了生物负荷明显降低。
向解离酶和解离后的处理溶液中加入庆大霉素可导致存在于结肠肿瘤中的内源性生物负荷的一致降低。在有其它抗生素存在的条件下解离的肿瘤的一些，而不是全部，存在生物负荷的进一步降低。
表2.酶解离过程中抗生素的作用
  肿瘤ID   培养基          生物负荷(CFU/107个细胞)和生物负荷减少的％
没有抗生素 只有庆大霉素 所有抗生素
ROC-99-0035   TSA   1.0×103   ≤9≥99％)   ≤9(≥99％)
  SAB   6.0×102   90(85％)   36(94％)
ROC-99-0036   TSA   5.0×103   ≤10(≥99)   ≤10(≥99)
  SAB   1.7×103   2.4×102(86％)   2.0×102(88％)
ROC-99-0037   TSA   30   ≤6(≥80％)   ≤6(≥80％)
  SAB   45   ≤6(≥87％)   ≤6(≥87％)
ROC-99-0038   TSA   5.4×102   1.4×102(74％)   23(8％)
  SAB   61   1.1×102(0％)   56(92％)
ROC-99-0039   TSA   ≥3.5×104   1.2×104(≥66％)   3.0×103(≥91％)
  SAB   ≥3.5×104   1.8×104(≥49％)   4.1×103≥88％)
ROC-99-0040   TSA   1.0×102   ≤12(≥88％)   ≤12(≥88％)
  SAB   ≤9   ≤24   ≤12
ROC-99-0041   TSA   1.6×103   ≤20(≥98％)   5.1×102(68％)
  SAB   1.1×103   ≤20(≥98％)   ≤18(≥98％)
表3.酶解离后用抗生素额外培养的作用
  肿瘤ID   培养基         生物负荷(CFU/107个细胞)和生物负荷减少的％
        用庆大霉素解离    用所有抗生素解离
  没有培养   额外培养   没有培养   额外培养
  Roc-99-0035   TSA   ≤9   34(＞)   ≤9   ≤9
  SAB   90   17(81)   36   36
  Roc-99-0036   TSA   ≤10   139(＞＞)   ≤10   ≤10
  SAB   2.4×102   1.8×102(25)   2.0×102   20(90)
  Roc-99-0037   TSA   ≤6   ≤6   ≤6   ≤6
  SAB   ≤6   ≤6   12   ≤6
  Roc-99-0038   TSA   1.4×102   82(41)   23   23
  SAB   1.1×102   82(25)   56   79(＞)
                  实施例4
            解离肿瘤细胞的辐射
为了评估增加辐射剂量的可行性，在(干冰上)冷冻的同时，对冷冻保存的解离肿瘤细胞小瓶进行辐射至20,000拉德(约1小时)或200,000拉德(约10小时)的剂量。将细胞放回到液氮中贮存直到测定。然后使小瓶迅速融化，并根据先前测试的生物负荷、无菌、生物负荷或两者来测定细胞的存活力；效能。在以不同辐射剂量辐射的细胞之间观察到其存活力或效能没有差异(没有给出数据)。
从表4可以看出，很意外的是，在以200,000拉德辐射后，生物负荷显著降低。所测试的5个肿瘤中有3个通过更高剂量的辐射而无菌。另外两个肿瘤显示出生物负荷显著降低。无法说清的是，接受200,000拉德辐射的其中一个样品(患者ROC-00-0013)(40CFU)较之接受20,000拉德的样品(8CFU)具有更高的生物负荷；与之相比，较之20,000拉德(168CFU)，在200,000拉德下，厌氧菌的菌落数显著降低(≤2CFU)。
虽然体外研究已经证实了在与两个辐射剂量接触并通过多步过程处理的细胞之间，其重要的生物学特性不存在可区别的差异，从而证实了这点，但我们还是评估了对豚鼠肝癌模型中辐射细胞免疫原性的作用，该豚鼠肝癌模型可作为临床研究的基础(实施例5)。生物等价I-II期研究的临时结果在实施例6中提供。
表4.辐射对生物负荷及无菌的作用
  样品   辐射剂量          生物负荷(CFU/mL)            无菌
  TSA(需氧)  TSA(厌氧)   SAB   疏基乙酸盐   胰蛋白酶大豆培养液
  Roc-00-0006   20,000   4   90   ≤2   F   P
  200,000   ≤2   ≤2   ≤2   P   P
  Roc-00-0007   20,000   ND   ND   ND   F   P
  200,000   ND   ND   ND   P   P
  Roc-00-0009   20,000   ND   ND   ND   F   F
  200,000   ND   ND   ND   P   P
  Roc-00-0010   20,000   13,600   14,000   644   ND   ND
  200,000   500   888   148   ND   ND
  Roc-00-0013   20,000   8   168   ND   ND   ND
  200,000   40   ≤2   ND   P   F
                          实施例5
通过本发明的无菌ONCOVAX方法制备的LINE 10细胞保护豚鼠免受
                    肿瘤细胞侵袭的功效
本研究的目的是确定被设计用于使人结肠肿瘤疫苗无菌的优选方法是否可产生有效的产物。该实验提供研究的方法和结果，该研究被设计用于评估本发明的灭菌方法对解离、辐射细胞保护豚鼠免受致死剂量的移植L-10细胞侵袭的能力。与肿瘤细胞制备的历史方法相比，改进的方法包括用1％Triton X-100洗涤肿瘤，用0.4％Clorpactin将它们消毒，在有抗生素/抗霉菌药物(庆大霉素、Primaxin、Levaquin和两性霉素B)存在的条件下进行酶解离，并用200,000拉德辐射。这些方法的改变对疫苗功效的影响是在相同的豚鼠活性-特异性免疫疗法模型中评估的，该模型可用于导致OncoVAXO产品发展的所有临床前研究。
生产两种类型的试验材料进行此项研究：腹水细胞和实体肿瘤。腹水细胞用于产生进行比较免疫研究的实体肿瘤。腹水细胞还可用于侵袭免疫动物。实体肿瘤是通过肌内注射Line 10(L-10)腹水细胞而产生的。将所得实体肿瘤切除、并通过原始或改进的无菌制造方法处理和解离。然后通过受控速率冷冻将细胞冷冻保存。用20,000或200,000拉德辐射细胞。通过真皮内途径，使用下列之一将10只2种豚鼠(5只雄性和5只雌性)免疫2次(每周一次)：
1.通过原始方法产生、用20,000拉德辐射并与BCG混合的细胞，或
2.通过改进的无菌方法产生、用200,000拉德辐射并与BCG混合的细胞，或
3.单独的BCG。
免疫完成后3周，用107个未-辐射的L-10腹水细胞真皮内侵袭动物。选择这种高度致瘤剂量是为了更完全侵袭动物的抗-肿瘤反应，并由此证实两种疫苗制备方法之间的任何差异。测量每个侵袭注射部位的结节直径，随后确定肿瘤的进展。侵袭后第22天，用BCG处理过的动物具有20nm测量直径的结节。对这些动物连同它们的肿瘤已经被确定为进展或退化的所有动物实施无痛致死术。有4只动物的肿瘤进展/退化的意义不明确。直到第28天才观察这些动物。
用单独的BCG免疫的所有动物都进展成进展性不减弱的肿瘤。使用先前按照原始和改进方法生产并辐射的细胞免疫的10只动物中的1只的肿瘤进展。因此，改进的无菌生产方法不会影响疫苗细胞保护免受肿瘤侵袭的能力，并因此不会不利地影响L-10豚鼠肝癌细胞的免疫原性。以这些结果为基础，我们总结出被设计用于使人结肠肿瘤无菌的新灭菌方法将产生与通过原始OncoVAX方法所制造疫苗同样有效的疫苗。
使用两种L-10肿瘤细胞制剂进行本研究：腹水细胞和实体肿瘤。腹水细胞用于生产进行接种的实体肿瘤，并用肿瘤负荷侵袭免疫的动物。实体肿瘤是通过肌内注射L-10腹水细胞而产生的。通过原始或改进的制造方法处理并解离实体肿瘤。用20,000或200,000拉德辐射细胞。
使L-10腹水细胞融化并洗涤。3只豚鼠(4周大)是通过腹膜内途径用5×106个细胞接种的。此外，4只豚鼠(4-9周大)是用L-10细胞(5×106个细胞/部位，4个部位/只动物)皮下注射。动物是通过皮下途径注射产生实体肿瘤进行处理的，据信肿瘤将局部生长，很少具有可能伴有肌内肿瘤的不适。此外，推测很少有动物需要产生这些研究所需的肿瘤量。出乎意料的是，用肿瘤细胞皮下注射的动物发展成胸膜积液和/或腹膜腹水，而不是局部肿瘤。随后对这些动物实施无痛致死术，没有获得任何肿瘤物质。10天后，对已经通过腹膜内途径接种的动物实施无痛致死术，收集腹水液，并通过受控速率冷冻将细胞冷冻保存。贮存这些新鲜冷冻保存的腹水细胞，进一步用于生产实体肿瘤进行疫苗处理和研究的肿瘤侵袭阶段。
因为通过皮下途径注射不能满足于生产实体肿瘤进行疫苗处理，因此使用肌内途径。使L-10细胞融化并洗涤。给13只豚鼠的每个大腿肌内注射5×106个L-10细胞。17天后，对动物实施无痛致死术。切除9只动物的18个肿瘤(总重109.2克)，并通过原始过程解离，切除4只动物的8个肿瘤(63.5克)，并通过新的无菌方法解离。
原始过程如下：
4次，每次用10mL无菌生理盐水原位洗涤每个肿瘤。生理盐水是用25mL吸量管有力喷射的。然后切除肿瘤，称重并运送到肿瘤-处理实验室的含庆大霉素(50μg/mL)的HBSS(HBSS/G)中。然后，通过用于生产III期研究所用疫苗的原始方法处理肿瘤。用HBSS/G洗涤肿瘤3次，并修剪至没有非-肿瘤和坏死物质。将肿瘤碎片破碎并用HBSS/G再次冲洗3次。将肿瘤碎片称重，并在没有全部抗生素存在的条件下，经过3次酶解离循环。解离步骤后所用的处理溶液都不含任何庆大霉素。所得细胞的存活力为96％，以1.2×107个细胞/小瓶获得90个小瓶。然后将解离的肿瘤细胞冷冻保存。
优选的新方法如下：
每次用25-mL吸量管有力分散10mL液体而将每个肿瘤原位洗涤4次。第一、第三和第四次洗涤均由无菌生理盐水组成。第二次洗涤由在生理盐水中制备的无菌1％Triton X-100组成。然后切除肿瘤，称重并运送到肿瘤-处理实验室的HBSS/G中。然后通过改进的无菌方法处理肿瘤。用HBSS/G冲洗肿瘤3次，修剪肿瘤使其没有非-肿瘤和坏死物质。室温下，用0.4％Clorpactin(在生理盐水中制备的)处理(在轨道摇动器上，200RPM)修剪过的肿瘤碎片2分钟，然后用HBSS/G冲洗3次。然后使肿瘤碎片破碎，用HBSS/G冲洗3次，称重，并经过3个酶解离循环。酶解离溶液含有庆大霉素、Primaxin、Levaquin和两性霉素B。所得细胞的存活力为94％，且以1.2×107个细胞/小瓶获得50个小瓶。将细胞冷冻保存。
然后对细胞的冷冻小瓶进行辐射。通过原始解离方法获得的细胞是用20,000拉德辐射的。通过改进解离方法获得的细胞是用200,000拉德辐射的。辐射后，将红色鉴别线插入到用200,000拉德辐射的小瓶的盖子中。将黄色鉴别盖片装在用20,000拉德辐射的小瓶上。
因为Line10肝癌细胞与Sewall-Wright2种豚鼠同源，因此所有试验动物都属于这个种。每只豚鼠接受的第一次免疫(0.2mL)是按照上面所述真皮内给药的，并位于右腋区域的后面。每组由10只动物组成(5只雌性和5只雄性)。给C组动物注射通过原始方法产生、用20,000拉德辐射并与BCG(1×107CFU)混合的细胞。给E组动物注射通过新方法产生、用200,000拉德辐射并与BCG(1×107CFU)混合的细胞。最后，给F组的豚鼠注射单独的BCG(1×107CFU)。6天后，用标准的测径规测量每个接种部位的硬结大小。
豚鼠接受第二次免疫，第二次免疫与第一次免疫相同，区别在于它是按照上面所述在左腋区域后面给予的。6天后，用校准测径规测量第二次接种部位的硬结大小(两个直径)(表5)。
所有动物都是用活的、未-辐射的、从腹水肿瘤获得的L-10细胞侵袭的。侵袭注射是在第二次免疫后21天进行的，包括真皮内给予1×107个未-辐射的细胞(0.2mL)。40个小时后，使用校准测径规测量(2个直径)侵袭注射部位的硬结大小(表6)。
每天观察豚鼠的死亡率和濒死率。注射未-辐射的肿瘤细胞后，用校准测径规每周2次测量注射部位(两个直径)。Bonferroni检验(变量的单向分析[ANOVA])用于评估治疗组任何差异的统计学显著性。
如表5所示，在每次用与BCG混合的各种细胞制剂或单独的BCG免疫后6天测量的硬结大小方面，没有观察到显著差异。与之相比，较之用单独的BCG免疫的动物，已经用混合了BCG的肿瘤细胞接种的动物对未-辐射肿瘤细胞的侵袭注射具有明显更大的反应(48小时后测量的硬结)(表6)。通过用肿瘤细胞侵袭的动物的命运证明了对肿瘤细胞的细胞免疫性的发展(表6，图1)。已经用单独的BCG注射的全部10只动物(F组)在3周的观察期内都进展成进展性不减弱的肿瘤；没有一只动物能够抵御肿瘤细胞的侵袭。当在侵袭注射后22天测量时，F组动物肿瘤的平均直径(18.8mm[±1.05mm])明显大于疫苗治疗组的结节大小。当在第11和18天测量时，这组动物的平均肿瘤大小还明显大于其它三组。用与通过原始方法解离的L-10细胞混合的BCG接种并(20,000拉德)辐射(C组)或用与通过新方法解离的L-10细胞混合的BCG接种并(200,000拉德)辐射(E组)的豚鼠中均有一只具有进展性肿瘤。这两组每组中的其它9只动物能够抵御107个未-辐射肿瘤细胞的侵袭。在第22天，C组和E组侵袭部位的结节平均直径分别为1.3mm(±4.1mm)和3.6mm(±6.1mm)。肿瘤大小的这种差异并不显著；此外，在其它时间点没有观察到C组和E组之间的显著性差异。在第22天，该研究已经满足终止方案标准的其中一条(当肿瘤直径达到2cm)。在该时间点，除了2只以外的所有动物的肿瘤命运可能都是不明确的，对绝大多数动物实施无痛致死术。正在争论的2只豚鼠(E组#684、#689)的肿瘤或者静止，或者正在非常缓慢地退化。观察这些动物到第28天(研究终止的第二条方案标准)。在第25天，已经在非常缓慢退化的肿瘤(#689动物)完全消失；另外一只动物(#684)的肿瘤继续被抑制且没有进展。当在第28天检查时，肿瘤(#684动物)也已被完全抵御。
用高剂量活的、未-辐射的L-10细胞侵袭本研究的动物，从而可能检测疫苗细胞免疫原性的细小差异。虽然剂量反应曲线没有包括在本研究中，历史性地，当把106个L-10细胞真皮内注射到2种天然豚鼠中时，100％动物在60-90天中死亡，这是因为已经转移到重要器官。在本研究中，侵袭剂量为10倍。与所用方法无关，与单独的BCG相比，所有L-10疫苗对随后的肿瘤细胞侵袭都产生统计学上显著的保护。在用通过原始(C组)或改进(E组)过程生产的疫苗处理的动物中都没有观察到肿瘤进展的差异。
总之，对原始制造方法的若干步骤进行改进可降低结肠肿瘤内源性肠微生物的浓度，并因此使自体疫苗无菌。体外研究(如存活力、身份和功效)具有它们的价值，且还没有证实在通过两种制造方法获得的细胞之间存在任何差异，它是疫苗细胞的免疫原性，即功效的决定性标准。正如通过免受高剂量L-10肿瘤细胞侵袭所测定的那样，分离并通过原始或改进灭菌方法处理的L-10细胞的免疫原性没有差异。由于L-10肝癌2种豚鼠模型是OncoVAX临床应用的临床前基础，因此我们总结出通过新方法处理的人结肠肿瘤将同样有效。
表5.注射后6天测量的接种部位的硬结大小(2个直径的平均值[mm])
组 动物#   接种部位#1   接种部位#2 组 动物#   接种部位#1   接种部位#2
  F组单独的BCG   657   12   11.5   E组改进的方法200,000拉德   682   13   15.5
  658   12   12.25   683   14.5   14.5
  659   12   13   684   14.75   14
  660   13.5   14.25   685   13.75   14
  661   13.75   11.5   686   15.25   15.5
  662   11.25   13.5   687   12.75   15.5
  663   10.75   14   688   13.5   16.25
  664   10.5   12.25   689   14.5   15.75
  665   9.75   12.25   690   15.25   14.25
  666   9.25   12.5   691   11.5   13.15
  C组原始方法20,000拉德   626   12   13
  627   11   14
  628   8.75   11.25
  629   10   14
  630   12   16.25
  631   14.25   13.5
  632   13.5   14.5
  633   12.5   13.5
  634   12.5   14.25
  635   12   14.75
表6.通过未-辐射细胞的侵袭注射引发的L-10肿瘤的进展
  组   动物#                           结节大小(2个直径的平均值[mm])   肿瘤进展
                                   侵袭后的天数
  2   7   11   15   18   22   25   28
  F组单独的BCG   657   12.5   12.75   14.75   14.25   16.75   17.5(P)   10/10
  658   10.75   16   14.75   15.5   18.5   19.75(P)
  659   10   14.5   15.25   16.25   16.25   18(P)
  660   12.5   13.25   15.25   16   18   18(P)
  661   11.25   12   13.5   14.5   16.75   19.25(P)
  662   12.25   13.25   14.5   16   17.5   18.25(P)
  663   12   13.5   13.5   14   16.5   17.75(P)
  664   13.25   14.25   15.75   16.75   19   20.5(P)
  665   10.5   13.25   14.25   15   18   20(P)
  666   13   12.5   14   14.5   17.5   18.5(P)
  C组原始方法20,000拉德 626 16.5 12.5 11.5 8.5 0 0   1/10
  627   15.25   12.5   9.75   7.5   0   0
  628   14.5   13   13.75   10.5   11.5   13(P)
  629   14.25   12.75   10.25   7   0   0
  630   16.25   14.25   12.5   7.5   0   0
  631   15.25   11.75   11.25   7.5   0   0
  632   14.25   11.5   10   8.25   7.25   0
  633   14.75   12.5   12   7.5   0   0
  634   15   13   10.75   7   0   0
  635   15.5   13.25   10   7.75   7.5   0
  E组改进的方法200,000拉德   682   18   12   11.75   8.75   9.75   0   1/10
  683   18   13.25   12.5   8.25   8   0
  684   15.5   14.75   13.5   11.5   11.5   11.25   11.25   0
  685   14.25   13.75   11   8.25   8.25   0
  686   17.25   14   11   8.25   0   0
  687   16.25   14.75   12   8.75   7.25   0
  688   19   12.5   10.25   7.75   0   0
  689   18.25   14.25   13   10.75   9.25   9   0
  690   13.25   13.75   13   13.25   14   16(P)
  691   15   11.5   11   9   9.25   0
(P)进展性肿瘤
                      实施例6
         无菌方法对疫苗质量和临床功效的影响
I/II期生物等价研究的临时结果
开始进行生物-等价研究。迄今为止，已经用通过改进无菌方法制造的OncoVAXO治疗了十二(12)名患者。
疫苗功效的决定性因素是活的肿瘤细胞的绝对数量和细胞的情况。在免疫应答发展的重要时期，细胞必须能够在接种部位持续发挥作用。因此，细胞必须是活的及代谢活性的。这些决定性参数可作为接受规定的准则(表7)。此外，确定细胞为腺癌来源的身份测定是QC试验组的一部分。安全性是通过测试内毒素和无菌而保证的。
在引入无菌方法后，这些规定中的一些被制订得更加严格。存活力的规定从≥70％增加至≥80％，功效的规定从≥70％增加至≥90％，无菌的规定从“信息”变成没有生长。
按照上面实施例所述处理32个结肠肿瘤，当通过非常有效的无菌测定法测试无菌时，26个制剂是无菌的(81％)。以先前的数据为基础，可预期在通过’596专利的原始过程处理的这些肿瘤中，26个肿瘤都没有产生无菌的OncoVAxO制剂。
第3和第4次接种包含辐射、活的、无菌的自体肿瘤细胞，给药时没有加入佐剂BCG。因此，任何延迟皮肤过敏(DCH)反应(硬结)都可表示患者对疫苗细胞的细胞免疫应答。从III期研究获得的数据可表明硬结大小和临床结果之间的相互关联。阳性临床结果与在注射后48小时的第3(或第4)次注射部位观察到的直径≥5mm的硬结有关。该标准已经被United States Food and Drug Administration接受用于进行无菌OncoVAX疫苗的生物等价研究。
这些无菌疫苗中的12支已经给予了患者，所有患者都接受了至少3次治疗。一旦已经给予了第一次注射，所有参加的患者都没有退出研究。患者的年龄为38-88，中值年龄65.5。12名患者中的5名被诊断为III期结肠癌；剩余的7名患者是II期。给药剂量的规定范围是0.7-1.3×107个活的肿瘤细胞。给药剂量为0.76×107-1.3×107个活的肿瘤细胞，平均剂量为0.99×107(中值＝0.98×I07)。
接种后2天，测量第3和第4次注射部位(给予解离的肿瘤细胞时没有给予BCG)的硬结(以及红斑)。正如表8所述，已经接受了3次接种的全部12名患者都对第3次接种(没有BCG的肿瘤细胞)显示出延迟皮肤过敏(DCH)反应，其超过≥5mm的标准。92％(11/12)具有等于或大于10mm至少一个次数的反应。平均反应为14.6×13.4mm。值得注意的是，当与先前使用128OncoVAX治疗患者的III期试验相比，产品的无菌性很少达到。在该试验中，绝大多数疫苗具有胃肠道菌丛污染。在第3次接种后48小时测量的DCH反应≥10mm，86.7％具有17.3×18.0mm的平均硬结。因此，本结果表明无菌疫苗是免疫原性的，且免疫原性并不主要与微生物污染有关，而是与肿瘤相关抗原有关。
II期结肠癌患者平均在第一次接种后20周接受第4次治疗。III期结肠癌患者在完成化疗后约1个月接受第4支疫苗。两名III期患者在第一次治疗后32-36周接受第4次免疫。上述12名患者中的7名已经达到第4次治疗的时间点。7名患者中的1名没有接受第4次治疗。已经接受4次治疗的6名患者中的5名显示出显著的DCH反应。这些高度反应性患者中的2名具有III期疾病。他们的反应没有受到化疗干预过程和疫苗给药延迟12-16周的影响。这5名患者对第4次接种的平均反应为15.1×15.1mm。剩余的患者，568-003，对第4支疫苗没有可证实的DCH反应。该II期患者比平均值更年轻(53)，接受其中一个最高的疫苗剂量(1.24×107个活的肿瘤细胞)，并对第3支疫苗显示出最强的DCH反应(14.6mm×16.1mm)。除了给予第4支疫苗的临床医师技术较差外，对于该患者缺少反应性没有似乎合理的原因。
改进的灭菌方法对先前显示对疫苗功效很关键的重要生物学特性没有消极影响，该改进的灭菌方法包括用洗涤剂处理原位结肠肿瘤，在用解离酶消化之前用消毒剂对解剖的肿瘤进行消毒，在解离过程中与抗生素接触，并用约200,000拉德辐射。通过灭菌方法产生的疫苗细胞能够引发免疫应答，超过了与每位患者中的积极临床结果有关的最低规定。
表7.生物学产品的释放试验
  试验类型   试验方法   规定
效能   肿瘤细胞活力/代谢活性   ≥80％
  活的肿瘤细胞数   ≥3.5×106个活的肿瘤细胞/小瓶
  细胞酯酶活性/效能测定   ≥90％的台盼蓝排斥法细胞具有胞内酯酶活性
身份   组织病理学   II期或III期结肠腺癌的病理学证明
  使用88BV59肿瘤标记的免疫荧光   对肿瘤细胞为阳性
  酶素   动力学产色方法   ≤150EU/小瓶
  无菌   21 CFR 610.12   对生长为阴性
表8.第3次和第4次接种后48小时测量的延迟皮肤过敏反应
  患者ID   年龄   性别   人种来源   TNM阶段  剂量(×107)   第3支疫苗的DCH(mm×mm)   第1和第4次处理之间的间隔(周)   第4支疫苗的DCH(mm×mm)
  539-001   83   F   5   III   1.30   15.0×16.0   36.0   16.0×18.0
  535-001   38   M   5   II   0.98   30.0×25.0   20.7   20.0×20.5
  568-001   66   F   2   III   0.82   11.3×13.1   32.1   10.4×9.2
  568-002   60   F   2   III   0.84   10.1×13.1   ND
  539-002   65   F   5   II   0.85   9.0×10.0   19.7   11.0×15.0
  568-003   53   F   5   II   1.24   14.6×16.1   20.0   0.4×0.4
  539-003   63   F   5   II   1.10   12.0×10.0   22.1   18.0×13.0
  539-004   69   M   5   II   0.98   11.0×11.0   -   NA
  539-005   68   M   5   II   0.76   8.0×08.0   -   NA
  539-006   81   F   5   II   1.24   20.0×13.0   -   NA
  539-007   65   F   5   III   1.30   19.0×11.0   -   NA
  539-008   88   F   5   III   0.80   15.0×14.0   -   NA
人种来源：2＝亚洲人或太平洋岛民，5＝非西班牙来源的白种人
ND.没有完成(该患者的第4支疫苗在医院被偶然破坏)
NA.没有得到(第4次处理还没有给出)
这里引证的所有专利和公开出版物都引入此处作为参考。应当很容易理解本发明不限于上面所述和举例说明的具体实施方案。此外，可对本发明进行改进从而引入任何数量的肿瘤细胞类型、细胞解离技术、消毒和洗涤过程、抗生素、和这里没有描述过的其它变化、改变、替换或等价安排，它们与本发明的精神和范围相等同。例如，虽然已经相对于进行本发明的结肠肿瘤细胞疫苗的无菌制造等的某些优选实施方案描述了本发明，但本发明还可用于制造无菌的肾癌、肺癌、和其它实体肿瘤细胞制剂，这些制剂必须是无菌的、活的和非-致瘤性的。因此，上述描述不能限制本发明，本发明的范围只能由权利要求限定。

Claims (50)

1.一种用于引发免疫应答从而防止转移瘤复发的方法，包括：
切除癌症患者的实体肿瘤组织，
处理肿瘤组织以减少内源性生物负荷，
用酶消化肿瘤组织从而得到解离的肿瘤细胞，
将辐射剂量应用于所述解离肿瘤细胞从而使所述肿瘤细胞不会致瘤且无菌，
以足以引发免疫应答从而防止转移瘤复发的剂量和方式给予所述患者所述无菌非致瘤性细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述辐射剂量是足以灭活微生物并仍然保持所述肿瘤细胞的存活力、代谢活性和免疫原性的量。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述剂量含有约107个活的肿瘤细胞，并且包含具有至少80％存活力的肿瘤细胞群。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述治疗方式在除去肿瘤后4-5周开始，并且包含以每周一次的间隔给予至少3剂。
5.根据权利要求4所述方法，其中所述三剂的前两剂与佐剂或免疫刺激剂联合。
6.根据权利要求4所述的方法，其中在第一次注射后5个月或更多个月，给患者注射第4剂。
7.根据权利要求1所述的方法，进一步包括在切除之前，用生理溶液有力洗涤所述肿瘤。
8.根据权利要求7所述的方法，进一步包括在切除之前，用至少更换一次的含有洗涤剂的生理溶液洗涤所述肿瘤以减少生物负荷以减少生物负荷。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述洗涤剂选自TritonX-100、NP40和Tween 80。
10.根据权利要求1所述的方法，进一步包括在0-6℃的温度下，将所述切除的肿瘤运送到含有抗生素的生理溶液中。
11.根据权利要求1所述的方法，进一步包括在解离之前，用可提供抗-微生物活性同时使细胞毒性减到最小的浓度的消毒剂和持续时间处理肿瘤。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述消毒剂选自氧氯苯磺酸钠、次氯酸钠和稳定的二氧化氯。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述解离酶是胶原酶。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述解离是在有抗生素和抗霉菌剂存在的条件下进行的，以减少生物负荷。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤细胞是在消化后，通过以约-1℃/分钟的受控速率冷冻至约-80℃而冷冻保存的，并在冷冻状态下维持，直到在给予患者之前融化。
16.根据权利要求2所述的方法，其中所述肿瘤细胞被辐射同时冷冻。
17.根据权利要求2所述的方法，其中所述辐射剂量是约200,000拉德。
18.根据权利要求5所述的方法，其中所述佐剂或免疫刺激剂包括炎症-诱导剂。
19.根据权利要求18所述方法，其中所述炎症-诱导剂是卡介苗或小棒杆菌。
20.根据权利要求5所述的方法，其中所述佐剂或免疫刺激剂是一种免疫原性辅助抗原。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述免疫原性辅助抗原是匙孔血蓝蛋白。
22.根据权利要求5所述的方法，其中所述佐剂或免疫刺激剂是淋巴因子-细胞因子。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述淋巴因子-细胞因子是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子或干扰素。
24.根据权利要求5所述的方法，其中佐剂、辅助抗原或免疫刺激剂是彼此联合给药的。
25.一种用于在人类结肠癌患者中提供免疫原性反应的可注射疫苗，它含有约107个解离的结肠肿瘤细胞及药学上可接受的载体，其中所述肿瘤细胞是无菌、非致瘤、所述患者自体的，且通过台盼蓝排斥法测量具有至少80％存活力，其中当经由真皮内注射到所述患者中而给药时，所述组合物产生免疫原性反应。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述组合物还含有佐剂或免疫刺激剂。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述佐剂或免疫刺激剂选自卡介苗、小棒杆菌、匙孔血蓝蛋白、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、和干扰素。
28.根据权利要求26所述的组合物，其中所述佐剂或免疫刺激剂是卡介苗。
29.根据权利要求26所述的组合物，其中佐剂或免疫刺激剂与肿瘤细胞的比例是约1∶1。
30.一种用于制备活的肿瘤细胞的无菌非-致瘤性组合物的方法，包括：
得到肿瘤组织；
用洗涤剂处理肿瘤组织以减少组织的微生物污染；
用酶消化组织从而得到解离的肿瘤细胞；
将解离的肿瘤细胞冷冻；
以足以灭活微生物和致瘤性并保持细胞存活力的量将辐射剂量应用于冷冻细胞，从而得到无菌非-致瘤性肿瘤细胞；且
其中通过台盼蓝排斥法测量，该无菌非-致瘤性肿瘤细胞具有至少80％存活力。
31.根据权利要求30所述方法，其中所述无菌非-致瘤性肿瘤细胞是免疫原性的。
32.根据权利要求30所述的方法，其中得到肿瘤组织进一步包括用含有洗涤剂的生理溶液洗涤该组织。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述洗涤剂选自TritonX-100、NP40、和Tween 80。
34.根据权利要求30所述的方法，其中用消毒剂处理肿瘤进一步包括在用选自氧氯苯磺酸钠、次氯酸钠、和稳定的二氧化氯的消毒剂解离之前处理肿瘤组织。
35.根据权利要求30所述的方法，其中所述解离酶是胶原酶。
36.根据权利要求30所述的方法，其中所述解离是在有至少一种抗生素和一种抗-霉菌剂存在的条件下进行的。
37.根据权利要求30所述的方法，其中所述肿瘤细胞是在解离后，通过以约-1℃/分钟的受控速率冷冻至约-80℃而冷冻保存的，并在冷冻状态下维持，直到在给予患者之前融化。
38.根据权利要求30所述的方法，其中所述辐射量是约190,000-200,000拉德。
39.根据权利要求36所述的方法，其中所述抗生素选自庆大霉素、伊米配能、和左氟沙星。
40.根据权利要求30所述的方法，其中所述肿瘤组织是结肠肿瘤。
41.一种通过权利要求30的方法制备的含有无菌非-致瘤性肿瘤细胞的组合物。
42.一种用于制备可注射的免疫原性剂量的无菌非-致瘤性结肠肿瘤细胞的方法，包括：
用含有洗涤剂的洗涤溶液洗涤结肠肿瘤组织；
切除结肠癌患者的洗涤过的肿瘤组织；
用消毒剂处理切除的肿瘤组织以减少组织的微生物污染；
在有至少一种抗生素和抗-霉菌剂存在的条件下，用解离酶消化肿瘤组织，从而得到至少约107个解离的肿瘤细胞；
冷冻解离的肿瘤细胞；
将约150,000-200,000拉德剂量的γ射线应用于冷冻的肿瘤细胞，使肿瘤细胞无菌且不会致瘤；
将所述肿瘤细胞与用于真皮内注射的药学上可接受的载体结合，制备含有至少约107个解离肿瘤细胞的可注射剂量；且
其中通过台盼蓝排斥法测量，所述剂量含有的无菌非-致瘤性肿瘤细胞具有至少80％的存活力，且当注射到患者中时，可引发免疫原性反应。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述洗涤剂是Triton X-100。
44.根据权利要求42所述的方法，其中所述消毒剂是氧氯苯磺酸钠。
45.根据权利要求42所述的方法，其中所述组织是在有至少一种选自庆大霉素、伊米配能、左氟沙星和两性霉素B的抗生素或抗-霉菌剂存在的条件下消化的。
46.根据权利要求42所述的方法，其中所述消化组织是通过以约-1℃/分钟的受控速率冷冻至约-80℃而冷冻保存的。
47.根据权利要求42所述的方法，其中所述辐射剂量是约190,000-200,000拉德。
48.根据权利要求42所述的方法，进一步包括在足以引发免疫应答从而防止转移瘤复发的治疗方式中给予所述患者至少3剂。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述剂量是在除去患者的结肠肿瘤后约4-5周开始以每周一次的间隔给予的。
50.根据权利要求49所述的方法，进一步包括在第一次注射后约5个月或更多个月给予第4剂。
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