CN1824775A - 重组人血管抑素k1－3的制备工艺及其制品在肿瘤治疗药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人血管抑素K1－3的制备方法及其制品在抗肿瘤治疗中的应用。本发明在对天然人血管抑素的生成机制、分子特性和生物学活性进行深入系统研究的基础上，对重组人血管抑素的蛋白氨基酸序列进行了优选，并自行设计构建了重组人血管抑素的原核高效表达系统，使血管抑素K1－3的表达量达到工程菌可溶性蛋白的50％以上，同时建立了最适的纯化及复性工艺，使重组人血管抑素的纯度达99.9％以上并能正确折叠。由此获得的重组人血管抑素K1－3能抑制肿瘤新生血管的生成，并对多种肿瘤具有治疗作用。

Description

重组人血管抑素K1-3的制备工艺及其 制品在肿瘤治疗药物中的应用

技术领域

本发明提供一种重组人血管抑素K1-3的制备工艺，同时还公开了及制品在肿瘤治疗药物中的应用，属于基因工程领域。

背景技术

癌症是当今世界范围内的常见病和多发病，目前临床上常用的抗癌药多为化疗药物，化疗药物在杀伤癌细胞的同时，对人体正常组织细胞有明显的毒副作用，尤其是严重损伤人体的骨髓造血系统。

1971年Folkman提出肿瘤生长和转移依赖新生血管生成，因此，阻断肿瘤新生血管形成就可能阻止肿瘤生长和转移，抗新生血管疗法也成为肿瘤治疗的重要手段之一。

血管抑素是1994年O’Reilly等在Lewis肺癌荷瘤小鼠的血清和尿液中提取得到的内源性血管生成抑制剂。对小鼠血管抑素进行N-端序列分析显示它与小鼠纤溶酶原(Plasminogen)从第98位氨基酸残基(这里以起始氨基酸残基Met为第一位氨基酸残基，传统定位方法是以成熟肽链中第一个氨基酸残基Gly19为N-端第一个氨基酸残基)起始的一段序列相对应(O’Reilly MS，Holmgren L，Shing Y，et al.Angiostatin：a novel angiogenesis inhibitorthat mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma.Cell，1994，79：315~328)。依据对血管抑素的N-末端部分氨基酸序列的测定结果分析，认为它至少包括纤溶酶原5个Kringles结构中的前4个，每个Kringle结构由80个左右氨基酸残基组成(Lerch P G，Riskli E E，LergierW，et al.Localization of individual lysine-binding regions in humanplasminogen and investigations on their complex forming properties.EurJ Biochem，1980，107：7~13)。O’Reilly指出，38kDa血管抑素是纤溶酶原内部的一个片段，这是因为：(i)对小鼠血管抑素23％的序列进行分析，结果表明它与纤溶酶原相应片段完全一致；(ii)对人纤溶酶原进行限制酶解，其产物(称天然人血管抑素)在体外具有抑制牛毛细血管内皮细胞(bovinecapillary endothelial cell，BCE)增殖活性，在体内具抑制鸡胚尿囊膜(chorioallantoic membrane，CAM)血管生成作用。而纤溶酶原则不具备此作用。同时，前者具抑制小鼠Lewis肺癌生长及转移作用；(iii)抗K1-3抗体能使血管抑素的抗小鼠Lewis肺癌生长及转移活性完全消除。血管抑素不仅能抑制转移瘤的生长，还对包括小鼠Lewis肺癌原发瘤及小鼠血管内皮瘤等在内的多种原发瘤的生长也具有抑制作用(O’Reilly MS，Holmgren L，Shing Y，etal.Angiostatin：a novel angiogenesis inhibitor that mediates thesuppression of metastases by a Lewis lung carcinoma.Cell，1994，79：315~328)。

进一步研究发现重组人纤溶酶原的K1、K2、K3、K1-3、K2-3均能有效抑制BCE细胞增生，呈剂量依赖型，而K4几乎无此活性。K1-3抑制细胞增生的活性要强于K1-4[Cao Y，Ji RW，Davidson D，et al.Kringle domains of humanangiostatin：Characterization of the antiproliferative activity ofendothelil cells.J Biol Chem，1996，271(46)：29461-29467.]血管抑素的出现，不仅促进了人们对肿瘤发生、发展过程中血管生成的理解，还提出了一种新的肿瘤治疗策略，即抗血管生成治疗。其作用靶点在肿瘤新生血管，与细胞毒性治疗(如化疗和放疗)或免疫治疗的作用机理和作用靶点不同。血管抑素是内源性纤溶酶原的裂解产物，一般不太可能引起免疫反应。它特异性地作用于增生内皮细胞，因此不会诱发免疫抑制、骨髓抑制和胃肠道反应。长期注射也不出现体重减轻、活动减少、食欲下降及条件致病菌的感染等[Sim BKL，O’Reilly MS，Liang H，et al.A recombinant human angiostatin protein inhibitsexperimental primary and metastatic cancer.Cancer Res，1997，57：1329-1334.]。肝、肾功能等亦不会受到影响[Kirsch M，Strasser J，Allende R，et al.Angiostatin suppress malignant glioma growth invivo.Cancer Res，1998，58：4654-4659.]。肿瘤对化疗药物产生耐药或对放疗不敏感的部分原因是由于肿瘤细胞遗传的不稳定性和高突变率。而内皮细胞具有相对稳定的遗传特性，突变率低，所以用血管抑素针对内皮细胞的治疗一般不会出现耐药性。目前临床应用最大的障碍是不能获得大量的血管抑素蛋白用于长期治疗。

发明内容：

本发明公开了一种重组人血管抑素K1-3的制备方法，提供一种重组人血管抑素的高效原核表达系统、最适纯化工艺及最佳复性系统，目的是在于使重组人血管抑素能够高效表达，纯化后能正确折叠，从而达到了用原核表达系统以包含体形式高效表达和大批量生产高活性的重组人血管抑素，用于各种肿瘤治疗的目的。

本发明的技术解决方案：是由基因克隆、工程菌的诱导培养、重组产物的纯化和复性过程组成，其步骤如下：

(1)通过PCR方法从人肝细胞中克隆了人纤溶酶原cDNA中Kringle1-3的cDNA片段，在克隆时对其N-端和C-端序列进行了优选。

(2)将这一cDNA片段克隆入自行设计构建的原核表达载体pHB中，用重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，经筛选得到高效表达重组人血管抑素的基因工程重组子。

(3)经发酵培养和诱导表达重组人血管抑素的菌体经超声裂解、离心洗涤包含体后将其溶解，之后经过阴离子交换层析、调酸稀释复性、阳离子交换层析、超滤浓缩及凝胶过滤等手段纯化而得到人重组血管抑素蛋白质纯品。

上述的上述工艺制备的重组人血管抑素K1-3具有以下特性：

(1)其表达载体为自行设计的原核表达载体，其启动子为T7。

(2)其表达产物以包含体的形式出现。

(3)其基因工程宿主菌为BL21(DE3)。

(4)其氨基酸序列经过了优化。

(5)有抑制血管生成活性，具体的说能抑制人脐静脉内皮细胞的增殖及尿囊膜新生血管的生成，而且能够抑制荷瘤鼠肿瘤的生长及转移。

药物组合物及用途

重组人血管抑素K1-3制品在肿瘤治疗中的应用，其制品为单制剂制备成生物制品，并根据其可抑制肿瘤新生血管的生成来治疗肿瘤。

通常，本发明的重组人血管抑素K1-3可以纯化的形式单独应用或与药学上适当的载体一起被使用。一般，这些载体包括水或醇/水溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。非肠道载体包括氯化钠溶液、林格(Ringer’s)葡萄糖、葡萄糖和氯化钠以及乳酸林格氏溶液。如有必要保持悬浮液中的复合体，则适当的生理可接受的佐剂可选自如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和藻酸盐的增稠剂。静脉内载体包括液体和营养补充剂以及电解质补充剂。

本发明的重组人血管抑素K1-3可用作单独施用的组合物，或用作与其它药及联合施用的组合物，这些包括多种肿瘤治疗药物，如环孢菌素、氨甲喋呤、阿霉素或顺氯氨铂以及免疫毒素。药物组合物可包括多种细胞毒剂或其它试剂与本发明的人血管抑素相联合的“鸡尾酒剂”。

根据本发明的药物组合物的给药途径可以是本领域普通技术人员普遍知道的任何一种，包括非肠道、静脉内、肌内、腹腔内给药，或者也可以通过用导管直接灌注给药。制剂中还可以包括其它的医药活性物质。其它的添加剂，如保护剂、稳定剂、乳化剂、缓释剂、缓冲剂及类似物。给药的剂量和频率依据年龄、性别、病人状态、同时服用其它药物、不良反应和临床医师考虑到的其它因素而定。

具体制备方法如下：

(1)通过PCR方法从人胎儿肝脏细胞cDNA文库中筛选得到人纤溶酶原Kringle结构的1-3cDNA序列。首先设计两条引物分别为：5’-GGGAATTCCATATGAAA(C)GTNTAT(C)CTNTCNGAG(A)TGC(T)AAG(A)ACTGGNAATGG-3’和5’-CTAGTCTAGATTAGGNGTNACNGGNCGNTATCTTACAGTACT--3’，以人胎儿肝脏细胞cDNA文库为模板，进行PCR扩增，条件为：94℃，5分钟；94℃，45秒；58℃，45秒；72℃，1分钟，进行30个循环，之后再72℃延伸10分钟。得到人血管抑素K1-3的基因片段。

(2)将基因克隆入T-easy质粒中或直接用NdeI和XbaI酶切，电泳回收特异基因片段，再克隆入用同样内切酶酶切的表达载体pHB质粒中，其中pHB质粒的构建过程如下：利用限制性内切酶BglII和AatII双酶消化pET-3a质粒(美国Novagen公司产品)，获得一个719个碱基的DNA片段。这一片段含有T7启动子、终止子、核糖体结合序列及NdeI/BamHI亚克隆位点。将此片段插入pUC19质粒(美国BRL公司产品)，以取代pUC19质粒中的BamHI/AatII酶切片段。由此获得一种新质粒，称之为pHB，该质粒具有可使载入的克隆化基因在大肠杆菌中高效表达的特点，其结构见图1。

(3)将该重组质粒pANGK1-3转化到BL21(DE3)中，经筛选得到高效基因工程菌株，重组质粒pANGK1-3的结构见图3。

(4)经发酵诱导表达的菌液，经超声破碎、离心洗涤包含体、溶解包含体、阴离子交换层析、调酸稀释复性、超滤浓缩、凝胶过滤层析、超滤浓缩、过滤除菌等手段得到人重组血管抑素蛋白质，其具体过程如下：

1)收集菌体，70006离心15分钟，离心弃上清，用菌体洗涤液(Tris-HCl50mM，EDTA 0.01M，NaCl 100mM克，PH8.0)，6000G离心洗涤两次。加入含0.5％Triton X-100的菌体洗涤液，于4℃超声裂解菌体，2500-5000G三次离心洗涤得到的包涵体。

2)在包涵体沉淀中按1g/15ml比例加入包涵体溶解液(Tris-HCl 50mM，EDTA 1mM，NaCl 100mM，40mM DTT，8M尿素，PH8.0)溶解液中充分溶解。

3)加入一倍量的碳酸盐缓冲液(NaHCO₃-NaOH 50mM，EDTA 0.01M，pH11，用NaCl将电导调至5-17ms/cm)，将混合液用1N NaOH缓慢调至pH8.8-11.3，除气后过G-25凝胶过滤柱，去除变性剂，收集第一组分。

4)上述组分过QAE柱，20-45ms/cm清洗，收集52-58ms/cm组分，超滤或稀释降低盐浓度，将电导降至6-18ms/cm。

5)过QAE柱，20-38ms/cm清洗，收集45-58ms/cm组分。超滤或稀释，将溶液电导降至10-25ms/cm，加入终浓度为0.9-1.8mM的GSH。

6)将上述组分加至DEAE阴离子交换介质柱，将柱上口和下口与放入搅拌子的外接瓶连接构成封闭系统，在输液泵的驱动下形成闭路循环，向外接瓶中用另一台输液泵缓慢加入1N HCl，当pH降到10.2-8.2时停止盐酸供给，补加终浓度为0.2-1.2mM GSSG，室温放置1小时。继续缓慢补加盐酸直至pH值降到7.8后(整个pH下降过程不应小于4小时)，收集外接瓶中的复性产物，将复性液稀释至电导6-28ms/cm，过DEAE柱，收集穿出部分，用PBS(5mM)进行缓冲液超滤置换并将蛋白浓缩到所需浓度，置室温4小时。

7)向终产物中加入终浓度为1-5％的甘露醇和1-6％的甘氨酸。0.22μm滤膜过滤除菌，分装、冻干保存。

本发明所制备的重组人血管抑素K1-3具有抑制人脐静脉内皮细胞增殖、抑制鸡胚尿囊膜毛细血管生成及抑制肿瘤生长及转移作用。

(1)纯化的人血管抑素蛋白加入到体外培养的原代人脐静脉内皮细胞中，同时以生理盐水作为阴性对照，以5-FU为阳性对照，72小时后，用MTT法测定细胞活力，从而判断血管抑素对毛细血管内皮细胞增殖活性的影响。结果显示血管抑素对脐静脉内皮细胞具有明显的增殖抑制活性(结果见图5)。

(2)将纯化的人血管抑素蛋白滴于滤纸片上，放于培养三天的鸡胚尿囊膜毛细血管新生区，48小时候观察纯化的人血管抑素蛋白对鸡胚尿囊膜血管生成的影响。结果表明血管抑素组对鸡胚新生血管的生成有明显的抑制作用(结果见图6)。

(3)将纯化得到的人重组人血管抑素蛋白分高(3mg/kg)、中(1mg/kg)、低剂量(0.3mg/kg)注射到Lewis肺癌实体瘤模型小鼠体内，每日一次，同时设生理盐水组作为阴性对照，设CTX组作为阳性对照，21天后处死动物，测量瘤体积变化及转移瘤大小并进行病理学检查，观察重组人血管抑素的抗肿瘤作用及抗转移活性。结果表明大、中、小剂量血管抑素的抑瘤率分别为：86.0％、75.7％、66.1％。血管抑素组与生理盐水组比较瘤体积重量具有显著性差异(P＜0.001)。肺转移结节计数结果表明给予血管抑素的动物肺组织表面转移结节明显减少，与生理盐水组比较具有显著性差异(P＜0.001)。

                  表1：血管抑素的抗肿瘤效果

分组	用药剂量(mg/kg)	动物数	肿瘤重量(g)( X±S)	肿瘤抑制率
					0.9％NaClCTX血管抑素血管抑素血管抑素	0.2ml/10g303.01.00.3	1210121212	6.710±1.744.736±1.3210.945±1.249**ΔΔ1.639±1.544**ΔΔ2.275±1.927**ΔΔ	29.4％86.0％75.7％66.1％

**表示与0.9％NaCl组相比有显著差异，p＜0.001

^ΔΔ表示与CTX组相比有显著差异，p＜0.001

^Δ表示与CTX组相比有明显差异，p＜0.05

本发明与现有技术相比具有如下优点：

(1)重组人血管抑素蛋白用于治疗肿瘤优于现有的抗肿瘤药物，因为现有的药物均有其不可避免的毒副作用，而血管抑素因是人纤溶酶原的一部分，是人体内正常存在的分子，只是含量较少，所以用其治疗人体肿瘤不会产生超敏反应。

(2)本发明在对天然人血管抑素的生成机制、分子特性和生物学活性进行深入系统研究的基础上，对重组人血管抑素的蛋白氨基酸序列进行了优选，从而为保证重组人血管抑素的原核高效表达和高活性奠定了基础条件。同时自行设计构建了重组人血管抑素的原核高效表达系统，利用这一表达系统实现了重组人血管抑素的高效表达，使重组人血管抑素的表达量达到了工程菌可溶性蛋白的50％以上。

(3)本发明在制备工艺技术上的创新主要表现在以下三个方面--其一是发酵工艺的建立和优化。通过调整培养液配方和发酵条件，探索建立了利用此表达系统制备重组人血管抑素的最适发酵工艺，使每升发酵液重组人血管抑素的含量高达5克。其二是纯化工艺的建立和优化。根据重组人血管抑素的分子特性，经过系统研究建立了重组人血管抑素的最适纯化工艺，利用这一纯化工艺条件，在保证重组人血管抑素纯度达到99.9％以上的前提下，使其收率达到了26-30％。其三是复性工艺的建立和优化。血管抑素的分子结构相当复杂，其内部含有多个Kringle结构，要实现复性实现其分子的正确折叠相当困难，这是一个在此之前国际上始终未能解决的技术难题。本发明根据血管抑素分子结构特点，设计了一套独特的复性工艺条件，实现了重组人血管抑素的正确折叠，使其具有了与天然血管抑素相同的生物学活性，从而解决了这一国际性技术难题。

(4)本发明所制备的重组人血管抑素可明显抑制人血管内皮细胞的增殖。

(5)本发明所制备的重组人血管抑素可明显抑制鸡胚尿囊膜新生毛细血管的生成。

(6)本发明所制备的重组人血管抑素可特异抑制肿瘤新生血管的生成，从而抑制肿瘤的生长及转移，而对其它脏器没有影响，我们的实验已证实这种结论。

附图说明

图1：原核表达载体pHB的结构示意图

图2：重组人血管抑素K1-3的优选氨基酸序列

图3：重组质粒pANGK1-3的结构示意图

图4：重组人血管抑素基因K1-3表达产物的SDS-PAGE凝胶电泳图谱。

图5：重组人血管抑素对人脐静脉内皮细胞的增殖抑制作用

图6：重组人血管抑素对鸡胚新生毛细血管生成的抑制作用

A：对照鸡胚尿囊膜毛细血管网

B，C：添加本发明血管抑素的鸡胚尿囊膜毛细血管网

具体实施方式：

为了便于理解本发明，特列举以下实施例。其作用应被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。

实施例1

原核表达载体pHB的构建

利用限制性内切酶BglII和AatII双酶消化pET-3a质粒(美国Novagen公司产品)，获得一个719个碱基的DNA片段。这一片段含有T7启动子、终止子、核糖体结合序列及NdeI/BamHI亚克隆位点。将此片段插入pUC19质粒(美国BRL公司产品)，以取代pUC19质粒中的BamHI/AatII酶切片段。由此获得一种新质粒，称之为pHB，该质粒具有可使载入的克隆化基因在大肠杆菌中高效表达的特点，其结构见图1。

实施例2

人血管抑素基因的克隆及表达

本发明的制备工艺主要是经过基因克隆、细菌发酵培养、提取、纯化等过程而得到的制品，其步骤如下：

1.通过PCR方法从人胎儿肝细胞cDNA文库中筛选而得到人血管抑素基因即纤溶酶原Kringle结构的1-3cDNA。首先制备两条引物分别为：5’-GGGAATTCCATATGAACGTATATCTATCGGAGTGTAAGACTGGGAATGG-3’和5’-CTAGTCTAGATTAGGAGTGACTGGACGCTATCTTACAGTACT--3’，以1μl人胎儿肝脏细胞cDNA为模板，加入上述两种引物各2μl，浓度为每毫升10nM，加入8μl 2.5mMdNTP、5μl 10×PCR缓冲液，1μl Taq DNA聚合酶。PCR条件为：94℃，5分钟；94℃，45秒；58℃，45秒；72℃，1分钟，进行30个循环，之后再72℃延伸10分钟。用15％琼脂糖凝胶电泳分离得到人血管抑素K1-3基因片段。

(2)将该基因片段克隆入T-easy质粒中，方法按promega TA克隆试剂盒方法进行。4℃连接过夜，转化大肠杆菌，在涂有X-gal和IPTG的板上进行蓝白筛选，将白色菌落扩增、提取质粒，并进行测序，将筛选得到的阳性重组质粒用NdeI和XbaI酶切并回收基因片段，同时将pHB用NdeI和XbaI酶切，并回收质粒，将回收的片段和质粒进行连接，然后转化BL21(DE3)，筛选阳性克隆。

(3)将测序正确的阳性克隆菌株扩增培养，并克隆化筛选高效基因工程菌株。将工程菌加入发酵罐中培养，当OD值达到0.4-0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG继续培养4小时。收集菌体，超声破碎后用10％SDS-PAGE电泳鉴定表达情况。结果见图4，图中1，2：纯化的人血管抑素；3：包含体；4：重组质粒转化工程菌用IPTG诱导；5：重组质粒转化工程菌未用IPTG诱导；6：蛋白质分子量标尺。

实施例3

血管抑素的纯化、变性及复性

(1)将表达人血管抑素的基因工程菌菌体超声波破碎后，7000G离心15分钟，弃上清，用菌体洗涤液(Tris-HCl 50mM，EDTA 0.01M，NaCl 100mM，pH8.0)洗涤两次，加入含0.5％Triton X-100的菌体洗涤液，于4℃超声裂解菌体，2500-5000G三次离心洗涤得到的包含体。

(2)在包含体沉淀中加入包含体溶解液(Tris-HCl 50mM，EDTA 1mM，NaCl100mM，40mM DTT，8M尿素，pH8.0)使包含体充分溶解。

(3)加入一倍量的碳酸盐缓冲液(NaHCO₃-NaOH 50mM，EDTA 0.01M，pH11，用NaCl将电导调至6ms/cm)，将混合液用1N NaOH缓慢调至pH9，除气后过G-25凝胶过滤柱，去除变性剂，收集第一组分。

(4)上述组分过QAE柱，26ms/cm清洗，收集58ms/cm组分，超滤或稀释降低盐浓度，将电导降至6ms/cm。

(5)过QAE柱，20ms/cm清洗，收集56ms/cm组分。超滤或稀释，将溶液电导降至10ms/cm，加入终浓度为1.8mM的GSH。

(6)将上述组分加至DEAE阴离子交换介质柱，将柱上口和下口与放入搅拌子的外接瓶连接构成封闭系统，在输液泵的驱动下形成闭路循环，向外接瓶中用另一台输液泵缓慢加入1N HCl，当pH降到10.1时停止盐酸供给，补加终浓度为1.0mMGSSG，室温放置1小时。继续缓慢补加盐酸直至pH值降到7.8后(整个pH下降过程不应小于4小时)，收集外接瓶中的复性产物，将复性液稀释至电导25ms/cm，过DEAE柱，收集穿出部分，用PBS(5mM)进行缓冲液超滤置换并将蛋白浓缩到所需浓度，置室温4小时。

(7)向终产物中加入终浓度为1％的甘露醇和6％的甘氨酸。0.22μm滤膜过滤除菌，分装、冻干保存。

实验例1

人血管抑素对体外培养的人脐静脉内皮细胞的增殖抑制活性

体外培养人脐带内皮细胞，用10％FCS的DMEM培养基培养，待其生长良好时，用0.25％的胰酶消化后接种到96孔培养板，每孔100μl，浓度为2×10⁵，次日加入人血管抑素使其终浓度为10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、160ng/ml 320ng/ml、640ng/ml，同时以5-FU为阳性对照，生理盐水为阴性对照，继续培养56小时后掺入MTT(5mg/ml)，每孔5μl，继续培养4小时，吸出上清，每孔加100μl DMSO，振荡后用酶标仪测定OD570值。

实验例2

人血管抑素对鸡胚尿囊膜毛细血管生成的抑制作用

将种鸡蛋置于38℃孵箱培养，3天后剥开蛋壳，并小心撕开尿囊膜，将纯化的人血管抑素蛋白50μg/ml，10μl滴于滤纸片上，放于培养三天的鸡胚尿囊膜毛细血管新生区，同时用PBS为对照，48小时候观察纯化的人血管抑素蛋白对鸡胚尿囊膜血管生成的影响。

实验例3

重组人血管抑素对荷瘤鼠肿瘤生长的抑制作用

将纯化得到的人重组人血管抑素蛋白分高(3mg/kg)、中(1mg/kg)、低剂量(0.3mg/kg)注射到Lewis肺癌实体瘤模型小鼠体内，同时以CTX为阳性对照，以生理盐水为阴性对照，每日一次，21天后处死动物，测量瘤体积变化及转移瘤大小并进行病理学检查，观察重组人血管抑素的抗肿瘤作用及抗转移活性。

Claims (3)

1.一种制备重组人血管抑素K1-3的制备工艺，该工艺是由基因克隆、工程菌的诱导培养、重组产物的纯化和复性过程组成，其步骤如下：

(1)通过PCR方法从人肝细胞中克隆了人纤溶酶原cDNA中Kringle1-3的cDNA片段，在克隆时对其N-端和C-端序列进行了优选。

(2)将这一cDNA片段克隆入自行设计构建的原核表达载体pHB中，用重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，经筛选得到高效表达重组人血管抑素的基因工程重组子。

(3)经发酵培养和诱导表达重组人血管抑素的菌体经超声裂解、离心洗涤包含体后将其溶解，之后经过阴离子交换层析、调酸稀释复性、阳离子交换层析、超滤浓缩及凝胶过滤等手段纯化而得到人重组血管抑素蛋白质纯品。

2.根据权利要求1所述的重组人血管抑素具有以下特性：

(1)其表达载体为自行设计的原核表达载体，其启动子为T7。

(2)其表达产物以包含体的形式出现。

(3)其基因工程宿主菌为BL21(DE3)。

(4)其氨基酸序列经过了优化

(5)有抑制血管生成活性，具体的说能抑制人脐静脉内皮细胞的增殖及尿

囊膜新生血管的生成，而且能够抑制荷瘤鼠肿瘤的生长及转移。

3.权利要求1所述的重组人血管抑素制品在肿瘤治疗中的应用。

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