CN101130091B - 一种治疗类风湿性关节炎的dna疫苗及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组核酸构建体，其含有与真核表达载体pcDNA 3.1(+)有效连接的CCOL2A1基因(SEQ ID NO：1)。本发明还涉及含有与真核表达载体pcDNA 3.1(+)有效连接的CCOL2A1基因组成的重组表达载体。本发明还涉及所述重组核酸构建体用于制备治疗类风湿关节炎的DNA疫苗的用途，以及包含上述重组核酸构建体的治疗类风湿关节炎的DNA疫苗。本发明进一步的还涉及治疗类风湿性关节炎的方法，包括向受试者施用治疗有效量的所述DNA疫苗。

Description

一种治疗类风湿性关节炎的DNA疫苗及其用途

发明领域

本发明涉及一种重组核酸构建体，其含有与真核表达载体pcDNA3.1(+)有效连接的CCOL2A1基因(SEQ ID NO：1)。本发明还涉及含有与真核表达载体pcDNA3.1(+)有效连接的CCOL2A1基因(SEQID NO：1)组成的重组表达载体。本发明还涉及所述重组核酸构建体用于制备治疗类风湿关节炎的DNA疫苗的用途，以及包含上述重组核酸构建体的治疗类风湿关节炎的DNA疫苗。本发明进一步的还涉及治疗类风湿性关节炎的方法，包括向受试者施用治疗有效量的所述DNA疫苗。

发明背景

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以慢性侵蚀关节炎为特征的全身性自身免疫病。近年来国外趋向于将对免疫调节作用的药物作为治疗RA的第一线药，并对RA新的免疫治疗策略进行了广泛的探索。大量动物实验证实，II型胶原(CII)可诱发胶原性关节炎(CIA)，出现与RA类似的病理表现。这些研究提示，CII是诱导RA发病的主要自身抗原之一。通过给予CII抗原诱导免疫耐受，是国际上兴起的治疗自身免疫病RA的特异性免疫疗法之一。这些免疫耐受的机制包括主动抑制、克隆无能、克隆清除以及旁观者抑制等，这还有可能不是其全部的机制。其中有通过口服胶原，静脉、肌肉、皮下注射胶原等方法治疗CIA模型鼠取得很大成功，但在临床实验中治疗效果远不如动物模型中的治疗效果，其中的限制因素主要是抗原的用量、种类来源、性质、抗原呈递处理过程、宿主的遗传背景等。

目前国际上探索免疫耐受治疗RA所采用的CII均是天然提取制备的，很难保证产物的天然结构的完整性和抗原性，也缺乏正确的空间 构象和适当的修饰。因此，这样的免疫原缺少在构象上相关的表位，难以诱导对应于天然抗原的免疫耐受。而且，CII作为蛋白质在体内存在半衰期短，病人需要重复给药的缺点，这也限制了CII的大规模使用。

采用DNA疫苗可以成功克服上述缺陷。DNA疫苗相对于传统的免疫策略具有的优势包括：(1)免疫效果好。DNA疫苗不需要提取CII，也不需要在体外原核或真核表达CII，也不需要对表达产物进行纯化、加工。CII基因直接在宿主体细胞内表达和后加工，能更完整地得到产物的天然结构和抗原性，也就是在宿主内有正确的空间结构和适当的修饰；(2)易操作性和稳定性。DNA序列清楚，纯化技术简便，质量易于控制。(3)外源基因在体内存在时间较长，不断表达外源蛋白，因此它可以持续给免疫系统提供刺激，无需重复施用蛋白质抗原；(4)能用各种投递疫苗的方法。如直接或脂质包裹后肌肉内注射，基因皮下枪接种，气枪肌肉接种，以气溶胶方式吸入或鼻内滴入，利用细胞内细菌传送DNA疫苗，利用病毒鼻内传递DNA疫苗以及经包装后口服等。(5)具有热稳定性，质粒的热稳定性远高于蛋白质，它不需特别的冷藏系统，可以加工成干燥的小颗粒，便于贮藏和运输。(6)规模化生产，成本低廉。由于其易操作性和稳定性，也决定了DNA疫苗生产成本相对低廉，这就为DNA疫苗在发展中国家的大规模使用铺平了道路。

本发明人在大量研究基础上采用鸡的II型胶原(CCII)基因制备所述DNA疫苗，其表达产物CCII与其它物种来源的CII相比在很多方面具有优势：(1)富含大量的硫酸软骨素A和粘蛋白，而粘蛋白中的硫酸葡糖胺含量最高，它们有着强有力的抗炎作用和软骨修复作用；(2)CCII能有效防止蛋白酶对关节软骨的消化破坏，重新编程已被破坏的软骨细胞和细胞因子，从而减少炎症的发生；(3)CII能促进软骨细胞及粘蛋白的合成，增加关节滑液及透明质酸的分泌；(4)CII是强有力的抗炎剂和疼痛缓解剂；(5)CII治疗十分安全无明显毒副作用，这也是目前任何其它治疗RA药物所不能比拟的。

发明内容

本发明人在成功获得鸡全长CII基因cDNA的基础上，选择真核表达载体，例如pcDNA 3.1或者腺病毒作为载体，成功构建治疗性疫苗用于治疗RA。

因此，本发明的一个方面，涉及一种重组核酸构建体，其含有与表达调控序列有效连接的CCOL2A1基因(SEQ ID NO：1)。在本发明中，所述表达调控序列用于在真核宿主细胞中实现CCOL2A1基因的有效表达。

在本发明的一个实施方案中，以鸡II型胶原(CCII)诱导的Wistar大鼠为RA模型即CIA，一次性尾部静脉注射20μg/kg、200μg/kg、400μg/kg三个不同剂量pcDNA-CCOL2A1基因疫苗对CIA关节炎的治疗作用，结果表明在注射后第5天200μg/kg组就可观察到大鼠关节肿胀程度明显减轻，与空载体组比较有显著性差异(p＜0.05)，而20μg/kg、400μg/kg两剂量组与空载体组比较则未观察到治疗效果(p＞0.05)。放射影象学和组织病理学检查显示，上述实施方案中，经过200μg/kg治疗后，使关节软骨及其下面的骨小梁结构与正常组接近，关节软骨及其下面的骨质结构得到保护，可使炎症分数下降为对照组的50％，仅关节滑膜略有增生，与空载体组比较具有显著性差异(P＜0.05)；而20μg/kg和400μg/kg两剂量组与空载体组比较则未观察到任何治疗效果(P＞0.05)。注射后6周CIA大鼠血清中抗CII抗体浓度水平、TNF-α浓度在200μg/kg治疗组较空载体组明显降低(p＜0.05)，而400μg/kg组则显著的升高，20μg/kg组则无明显变化。此外，细胞因子TGF-β、IL-10浓度水平在200μg/kg组较空载体组明显升高(p＜0.05)，而20μg/kg与400μg/kg两组则无显著性差异。脾细胞淋巴细胞增殖实验表明，200μg/kg剂量pcDNA-CCOL2A1基因疫苗治疗组大鼠脾细胞对CII的反应能力较空载体组明显下降(p＜0.05)。此结果表明，200μg/kg剂量pcDNA-CCOL2A1基因疫苗能明显抑制CIA大鼠关节肿胀程度，降低抗CII抗体、TNF-α水平，提高细胞因子TGF-β、IL-10水平，降低脾细胞增殖反应能 力，对CIA大鼠关节炎有显著的治疗作用，有望在RA的基因免疫耐受治疗中具有重要的临床应用价值。

在本发明的另一方面，涉及一种治疗类风湿性关节炎的DNA疫苗，其包含前述本发明所构建的含有与表达调控序列有效连接的CCOL2A1基因(SEQ ID NO：1)的重组核酸构建体。

具体的，在本发明的一个实施方案中，将克隆的CCOL2A1基因4837bp全长cDNA连接于真核表达载体pcDNA 3.1(+)上，获得重组真核表达载体pcDNA-CCOL2A1，即CCOL2A1基因疫苗。

用于本发明的“基因疫苗”指用于治疗或预防人类类风湿关节炎的基因治疗药物，这是基于鸡II型胶原的药理学活性。

宿主细胞是用本发明的重组表达载体进行遗传工程化(转导、转化或转染)的，载体可以是一个克隆载体或表达载体。载体可以是质粒、病毒粒子、噬菌体等等。工程化的宿主细胞能在为适于活化启动子、筛选转化子或表达CCOL2A1基因而改变的传统营养培养基上培养。培养条件诸如温度、pH等与被选择的细胞原来所用的表达条件一致，对于本领域普通技术人员来说是很明显的。

本发明所述CCOL2A1全长cDNA可以存在于一系列表达载体上，这些载体包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列，例如，SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒、衍生于质粒和噬菌体DNA结合的载体、病毒DNA、杆状病毒、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒及伪狂犬病毒。不过，只要能在宿主中复制和表达目标基因，其它载体也可以利用。

通常，为实现表达载体中的目标序列的高效表达，其被有效地与一个合适的表达调控序列(例如，启动子，增强子，终止子等)连在一起，从而指导mRNA的合成。

下面提到的是这种启动子的代表：LTR或SV40启动子、大肠杆菌的Lac或trp启动子、噬菌体的PL启动子以及已知控制真核细胞或其病毒中基因表达的其它启动子。此外，表达载体优选包含能提供表型特征的一个或多个选择标记基因，以便于转化宿主细胞的筛选，例 如真核细胞的培养可用二氢叶酸还原酶或新霉素抗性。

包含上述合适的目标基因序列、合适的启动子或控制序列的载体可以用于转化合适的宿主，让宿主表达该蛋白。

特别值得提及的是，本发明也包括含上面概括性描述的一个或多个序列的重组核酸构建体。该重组核酸构建体包括载体，如质粒或病毒载体，其中正向或反向插入了本发明的一个序列。在此实施方案的一个优选方面，该重组核酸构建体还包含调节序列，例如启动子，它被有效地连接到该序列上。对于本领域技术人员来说，许多载体和启动子都是已知的，并可通过商业途径获得。下面列举几种载体。pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。不过，只要是能在宿主中复制和存活，其它质粒或载体也可应用。

真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、逆转录病毒的LTR和小鼠金属硫蛋白I。合适载体和启动子的选择应在本领域普通的技术水平之内。

在合适的启动子控制下可以在哺乳类细胞、酵母、细菌或其它细胞中表达成熟蛋白。利用由本发明的DNA构建体衍生的RNA，也可以用无细胞翻译体系产生这种蛋白质。适合于原核和真核宿主的克隆和表达载体Sambrook等人已在《分子克隆实验指南》(第二版，冷泉港出版社，纽约，1989)中进行了描述。

在高等真核生物中，编码本发明多肽的DNA的转录可以通过在载体中插入一增强子序列而被提高。增强子是DNA的顺式作用因子，通常有大约10-300bp，作用于启动子，提高它的转录。例如，SV40的位于复制起点后侧100-270bp处的增强子，巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点后侧的多形瘤增强子及腺病毒增强子。

哺乳类表达载体包括复制起点、适当的启动子、增强子及任何必需的核糖体结合位点、多腺苷化位点、拼接供体和受体位点、转录终止序列和5，侧翼非转录序列。衍生于SV40拼接序列的DNA序列和多腺苷化位点可用于提供所需要的非转录遗传元件。

按本发明所述，将鸡II型胶原编码基因导入细胞，所述基因在这些细胞表达后表现出药理学活性。因此，本发明的药物可有效地用于例如类风湿关节炎的治疗。

为了将本发明所述鸡II型胶原编码基因导入细胞，也可以使用病毒载体的方法。具体的，所述方法由例如下列步骤组成，将鸡II型胶原编码基因导入例如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、新培斯病毒或其它RNA病毒。这些病毒中，逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒优选用于本发明鸡II型胶原编码基因的导入。

其他用于导入鸡II型胶原编码基因方法的例子包括脂质体法、脂转染法、微注射法、磷酸钙方法、电穿孔法。这些方法中，优选使用脂质体法。

在鸡II型胶原编码基因作为基因疫苗的实际应用中，将所述鸡II型胶原编码基因直接导入机体(体内方法)是非常有利的方法。另外，也可以从人类中收集某种细胞，将鸡II型胶原编码基因导入体外细胞，再将导入鸡II型胶原编码基因的细胞重新导入人体(离体方法)。这些方法在下列文献中有所描述：NIKKEI Science，1994年4月，20-45页；GEKKAN YAKUJI，36(1)，23-48(1994)和其中所引的参考文献。可依据待治疗的疾病、靶器官等适当地选择这些方法，并应用本发明的基因疫苗。

当本发明所述基因疫苗采用体内方法给药时，药物可根据待治疗的疾病、靶器官等通过任何合适的途径给药。药物可通过静脉、动脉、皮下、肌肉等给药或直接给药至疾病的靶器官，如肾、肝、肺、脑、神经等。通常，直接给药至靶点可以有选择地治疗靶器官。

上面描述的离体方法可用于鸡II型胶原编码基因的导入，例如，人类细胞(如淋巴细胞或造血干细胞)用常规方法收集后再用本发明药物致敏以导入基因。然后将鸡II型胶原编码基因生产细胞返回人体。

当用体内方法施用药物时，该药物可采用多种制剂方式，包括液体制剂形式。一般而言，药物优选制成一含有鸡II型胶原编码基因作为活性组份的注射液。如果必要，常规载体可加入到药物组合物中。可通过常规方法制备注射液，如将鸡II型胶原编码基因溶解在适当的溶剂里(如无菌水，缓冲溶液，生理盐水等)，通过滤器过滤等方法进行灭菌，将溶液装入灭菌容器中。该药物的制备中可用含鸡II型胶原编码基因的病毒载体代替鸡II型胶原编码基因本身。当使用含有包埋鸡II型胶原酶编码基因(或HVJ-脂质体)的脂质体时，药物可以是脂质体制剂的形式，如悬浮液、冷冻制剂、离心浓缩冷冻制剂等。

基因疫苗中鸡II型胶原编码基因的含量可随待治疗疾病、靶器官、病人的年龄和体重等的变化而改变。然而，在以鸡II型胶原编码基因计算时，适宜剂量为0.0001mg到100mg，优选0.001mg到10mg。该剂量可分为几天或几个月服用。

附图说明

图1.pcDNA-CCOL2A1真核表达载体构建示意图。

图2.显示pcDNA-CCOL2A1真核表达载体的酶切分析结果。其中泳道1为DNA标准参照物；泳道2为HindIII+EcoR酶切pcDNA-CCOL2A1；泳道3为DNA标准参照物；泳道4为Hind III酶切pcDNA-CCOL2A1。

图3A.为15％的SDA-PAGE电泳分析CCOL2A1基因表达的结果，其中泳道1为20μg pcDNA3.1；泳道2为20μg pcDNA-CCOL2A1；泳道3为标准蛋白参照；图3B.Western-blot分析CCOL2A1基因表达的结果，其中泳道1为20μg pcDNA3.1；泳道2为20μg pcDNA-CCOL2A1；泳道3为标准蛋白参照。

图4.显示真核表达载体pcDNA-CCOL2A1用作基因疫苗治疗后CIA大鼠关节炎指数的变化。

图5显示pcDNA-CCOL2A1用作基因疫苗治疗后，各组间CIA大鼠后足踝关节的组织病理学改变(HE染色，40X)，箭头所示关节腔破坏、炎性细胞浸润、血管翳形成、软骨破坏情况。

图6显示pcDNA-CCOL2A1用作基因疫苗治疗后，对CIA大鼠后足组织病理学分数的影响，其中6A显示各组后足踝关节炎症的组织分数情况；6B显示各组后足血管翳形成和软骨破坏分数情况。

图7显示pcDNA-CCOL2A1用作基因疫苗治疗后，对CIA大鼠后足X光放射影象学的影响。其中箭头所示为软组织肿胀，骨关节、软骨破坏情况以及关节间隙的清晰度。

图8显示pcDNA-CCOL2A1用作基因疫苗治疗后，对CIA大鼠后足放射学分数的影响。

图9.nCCII对CIA大鼠脾淋巴细胞增殖的影响。

以下结合具体实施方式说明本发明。统计学处理：结果数据以 表示，应用SPSS11.0软件进行分析，数据两两比较采用Student t检验，而多组之间比较则用ANOVA进行检验。

实施例

实施例1重组真核表达载体pcDNA-CCOL2A1的构建

公开于GenBank-accession numbers AY046949的鸡II型胶原全长cDNA，通过PCR方法从质粒pPIC9K-CCOL2A1(本实验室构建保存)获得。将所得编码鸡II型胶原全长cDNA，连接到测序载体pGEM-T-easy，测序正确后再连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)(Invitrogen，USA)即pcDNA-CCOL2A1。为了使CCOL2A1获得高表达，在起始密码ATG前加入了信号肽序列(ATGGATATGCATGGACGTCGTCCACCACGTTCCGCCGCTCTCCTCCTC，SEQ IDNO：4)和Kozak序列(GTTATGG，SEQ ID NO：5)，并在设计引物时加入EcoR I与Hind III两个酶切位点。引物1：5’AAGCTTGTTATGGATATGCATGGA CGTCGTCCACCACGTTCCGCCGC T C-TCCTCCTC 3’(SEQ ID NO：2)；引物2：5’GAATTCTTACAAGAAGCAGACTGGGCC3’(SEQ ID NO：3)。

具体的，所得真核表达载体pcDNA-CCOL2A1由CMV启动子和鸡II型胶原基因CCOL2A1组成，构建流程见图1。将真核表达载体pcDNA-CCOL2A1经EcoR I和Hind III双酶切可见4.3kb的CCOL2A1 及5.4kb的pcDNA3.1两条电泳带，与插入的目的基因片断和载体大小相一致，而用Hind III单酶切，则可见9.7kb一条电泳带(见图2)，由此表明，pcDNA-CCOL2A1真核表达载体构建成功。

实施例2真核表达载体pcDNA-CCOL2A1在COS-7细胞中的表达

重组真核表达载体pcDNA-CCOL2A1的瞬时表达分析方法：按照LipofectAMINETM 2000试剂盒(购于GIBCOBRLR)说明，将30μgDNA转染到COS-7细胞(10⁶)中，在RPMI-1640培养基中培养12h后，换成含G418(500μg/ml)的培养液筛选获得阳性克隆。扩增培养阳性克隆收集其培养液(每天一次，连续两天)。真空干燥后，将其溶解入0.1mol/L的冰醋酸中。取100μg蛋白上样，经15％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，然后转到PVDF膜上，用含10％小牛血清封闭液封闭，加入1∶1000稀释的抗CCII单抗4℃孵育过夜，尔后再用1∶2000稀释的酶标二抗IgG孵育37℃1～2h。洗膜后，将膜浸入10ml碱性磷酸酶底物缓冲液与33μl四唑氮蓝(NBT)和66μl 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)制成的显色液，室温闭光显色20min，蒸馏水终止反应，Cold-Spring凝胶成像系统扫描显像。

根据上述方法，将真核表达载体pcDNA-CCOL2A1转染到COS-7细胞(10⁶)中。经G418筛选后，培养阳性克隆，收获、浓缩、真空干燥培养液，然后再溶解在0.1mol/L的乙酸中。产物经15％SDS-PAGE电泳检测，结果如图3所示，在大约143kD左右处有一电泳条带，与质粒pcDNA-CCOL2A1基因表达的CCII蛋白相对应，而仅转染pcDNA3.1空载体的细胞培养液中则没有特异性条带出现。Western-Blot分析证明，在约143kD左右亦可见到特异性反应条带。由此证明重组真核表达载体pcDNA-CCOL2A1在COS-7细胞中能够有效表达CCII多肽链α亚单位，而且是分泌型表达。

实施例3真核表达载体pcDNA-CCOL2A1用作基因疫苗对CIA大鼠关节指数的影响

选择雌性Wistar大鼠(190+15g)用于动物实验，其购于北京军事医学科学院动物中心，饲养在动物中心清洁级环境中。

1。CIA大鼠的诱发^[17]：雌性Wistar大鼠70只，随机取8只作正常对照，其余大鼠均用于建立CIA模型。具体建模方法是：将鸡II型胶原(SIGMA公司)用0.01mmol/L的冰醋酸溶解后，配成4mg/ml的溶液，加等体积完全福氏佐剂(CFA)，使终浓度为2mg/ml。以0.1ml/只在尾根部和背部多点注射，一周后从腹部注射0.1ml/只加强免疫一次。加强免疫后一周，CIA发病率为73％(45/62)。

2。核酸免疫：随机抽取40只CIA关节炎大鼠分成5组(每组8只)，各组之间的关节指数经统计学处理差异无显著性。5组分别为：①空载体注射组；②20μg/kg基因疫苗治疗组；③200μg/kg基因疫苗治疗组；④400μg/kg基因疫苗治疗组；⑤关节炎组(空白对照)。空载体和治疗载体都分别溶解在200μl PBS缓冲液中，关节炎组也注射同样量的PBS，均采取尾静脉注射方法。

分别从CIA大鼠尾静脉注射20μg/kg、200μg/kg、400μg/kg真核表达载体pcDNA-CCOL2A1作为基因疫苗，同时设200μg/kg的pcDNA3.1空载体组和不给药的关节炎组作对照。

四肢关节肿胀评估^[17]：四肢关节肿胀程度按0～4级评分：0.无肿胀；1.趾关节稍肿；2.小趾关节和足趾肿胀；3.踝关节以下足爪肿胀；4.包括踝关节在内的全部足爪肿胀。每一CIA关节炎大鼠的关节分数为四肢关节炎分数之和，最大可达16分。

给药后连续一个月观察大鼠关节变化并打分即可获得关节炎指数，结果详见图4。由此可见，空载体组和20μg/kg基因疫苗组间治疗效果无区别，而200μg/kg基因疫苗组与空载体组间疗效则有显著性差异(*P＜0.05)，相反400μg/kg的高剂量组中关节炎指数却有升高。

实施例4真核表达载体pcDNA-CCOL2A1用作基因疫苗对CIA大鼠后足组织病理学的作用

组织病理学检查：按规定处死实验大鼠，取后足炎性踝关节作标本，以10％甲醛溶液固定、脱钙、脱水、切片、HE染色，观察炎性关节组织的病理改变。根据炎症程度对滑膜炎症、血管翳和软骨破坏进行评分。评分标准如下：滑膜下炎症，0分：正常、1分：局灶性炎症细胞浸润、2分：弥漫性炎症细胞增生；血管翳和软骨破坏，0分：正常、1分：血管翳覆盖软骨，但无软骨破坏、2分：有血管翳和软骨破坏。

pcDNA-CCOL2A1用作基因疫苗治疗各组间CIA大鼠后足踝关节的组织病理学改变及其评分结果见图5和图6。由图5可见，注射200μg/kg pcDNA 3.1对照组，大鼠后足有明显的血管翳形成，滑膜增生和大量淋巴细胞浸润，关节软骨变薄且失去完整性，几乎观察不到完整的骨小梁，骨髓腔部为分布有大量破骨细胞。20μg/kg、400μg/kg治疗组与关节炎对照组表现类似。而200μg/kg治疗组关节软骨及其下的骨小梁结构与正常组接近，但关节滑膜有一定程度的增生。由此表明在所选择的20μg/kg、200μg/kg、400μg/kg 3种基因疫苗治疗剂量中，200μg/kg剂量组对CIA大鼠后足踝关节的炎症以及软骨和骨的破坏的抑制作用最为明显，可使炎症分数下降为对照组的50％(*P＜0.05)。

实施例5真核表达载体pcDNA-CCOL2A1用作基因疫苗对CIA大鼠后足作用的放射影象学结果

影象学检查：腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后，对大鼠后肢行侧位X线检查，由一位不了解此项目研究具体内容的放射科人员对全部关节炎后足X线进行放射学评分。具体标准：0分：无损害表现、1分：轻度的骨质疏松和骨膨胀表现、2分：关节间隙减小、3分：明显的骨与关节软骨损害并伴随关节间隙减小、4分：关节结构消失、骨赘形成和钙化。

pcDNA-CCOL2A1用作基因疫苗治疗各组间CIA大鼠后足踝关节X光放射学表现及评分结果详见图7和图8。在关节炎组可见，软组织 肿胀，骨关节边缘模糊，软骨破坏。而在所选择的三种治疗剂量组中，只有200μg/kg治疗组治疗效果最明显(*P＜0.05)，可使软组织肿胀减轻，关节间隙清晰。而20μg/kg和400μg/kg治疗组的关节软骨表面和骨密度与关节炎组比较变化不明显。此外，20μg/kg治疗组的放射学分数与空载体组类似，而400μg/kg治疗组的放射学分数却稍有升高。

实施例6真核表达载体pcDNA-CCOL2A1用作基因疫苗对CIA大鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响

制备脾淋巴细胞悬液：按规程处死受试大鼠，无菌条件下取其脾脏，置于RPMI1640培养液中，100目不锈钢网研磨过滤，洗涤2次后配成2×10⁶/ml悬液加入96孔板。用100μg/ml的nCCII刺激72小时后收集培养液，用ELISA试剂盒检测培养液中细胞因子水平浓度的变化。

淋巴细胞增殖试验：常规制备的大鼠脾细胞经0.83％NH4CL处理破坏红细胞，洗涤配成2×106/ml悬液，按每孔100μl加入96孔板。淋巴细胞分成两组：(1)加PHA作试验阳性对照，浓度为0、1、10、50、100、250μg/ml；(2)加nCCII作试验组，浓度为25、50、100、250、500μg/ml，刺激培养72h，采用MTT比色法测定ABS570nm值。

结果：各实验组CIA大鼠脾脏淋巴细胞分别用不同浓度的nCCII和PHA进行刺激，采用上述MTT法测定其各自的增殖反应，结果如图9所示，200μg/kg基因疫苗组的脾淋巴细胞增殖能力明显下降，与空载体组比较有统计学意义(P＜0.05)；400μg/kg基因疫苗组脾淋巴细胞增殖能力较空载体组却有升高现象；其余3组差别不明显(P＞0.05)。而各实验组在仅加入PHA刺激时其淋巴细胞都发生增殖，但各组之间差别无统计学意义(P＞0.05)，结果见图10。

实施例7真核表达载体pcDNA-CCOL2A1用作基因疫苗施用后CIA 大鼠血清中抗CII抗体水平的变化

血清中抗II型胶原抗体的检测：质粒注射两周后，从尾部静脉取血，离心后储藏-20℃备用。本实验采用商用的ELISA试剂盒(RatsIgG Anti-Type II Collagen Antibody Assay Kit，Chondrex，USA)。

结果：CIA大鼠注射pcDNA-CCOL2A1作为基因疫苗后6周，尾部取血分离血清，通过ELISA试剂盒检测血清中抗CII抗体浓度的变化，结果详见表1。由此可见200μg/kg基因疫苗组的抗CII抗体水平明显低于空载体组(P＜0.05)，而20μg/kg基因疫苗组与空载体组相比变化不大(P＞0.05)，但400μg/kg基因疫苗组却显著升高(P＜0.05)。

表1.pcDNA-CCOL2A1作为基因疫苗免疫6周后CIA大鼠血清中抗CII浓度 

基因质粒剂量                D(490nm)吸收光密度

关节炎组                    1.365±0.133

空载体对照组(100ug)         1.367±0.218

20μg/kg pcDNA-CCOL2A1      1.492±0.134

200μg/kg pcDNA-CCOL2A1     0.674±0.046*

400μg/kg pcDNA-CCOL2A1     2.744±0.600

注：血清1∶1000稀释，与空载体组比较，*P＜0.05

实施例8真核表达载体pcDNA-CCOL2A1用作基因疫苗施用后CIA大鼠血清和脾细胞培养液中细胞因子的变化

血清和脾细胞培养液中TGF-β1、TNF-α、IL-10、IL-4的检测：均采用双抗夹心ELISA试剂盒(R&D Systems，Inc)。

为了探讨pcDNA-CCOL2A1作为基因疫苗治疗CIA大鼠的相关机制，我们采用ELISA检测了pcDNA-CCOL2A1基因疫苗治疗前后CIA大鼠血清和脾细胞培养液中几种相关细胞因子水平的变化。结果表明，在注射pcDNA-CCOL2A1基因疫苗后6周，200μg/kg基因疫苗组CIA大鼠血清中的TGF-β水平明显增高(P＜0.05)，TNF-α浓度则显著降低 (P＜0.05)，而20μg/kg和400μg/kg基因疫苗组以及空载体组间则无显著变化(P＞0.05)；此外在各实验组CIA大鼠血清中我们均没能检测到IL-10和IL-4，结果详见表2。

表3显示pcDNA-CCOL2A1基因疫苗治疗6周后CIA大鼠脾脏2×106/ml经100μg/ml的ncCII刺激72小时后培养液中这几种细胞因子浓度的变化。结果表明，200μg/kg基因疫苗组CIA脾细胞培养液中的TOF-β和IL-10水平明显增高(P＜0.05)，TNF-α浓度显著降低(P＜0.05)，而IL-4的浓度在各组之间无明显变化(P＞0.05)；而上述细胞因子在20μg/kg和400μg/kg基因疫苗组以及空载体组间则无显著变化(P＞0.05)。

表2.peDNA-CCOL2A1基因疫苗免疫6周后CIA大鼠血清中细胞因子浓度的变化 

注：血清1∶500稀释，与空载体组比较，*P＜0.05

表3.pcDNA-CCOL2A1基因疫苗免疫6周后CIA大鼠脾细胞培养液中细胞因子浓度的变化 

注：脾细胞通过100μg/ml的nCCII刺激72小时后收集培养液，与空载体组比较，*P＜0.05

               序列表 

Claims (1)

1.一种治疗类风湿性关节炎的DNA疫苗，其包含一种重组表达载体，其含有与pcDNA3.1(+)真核表达载体有效连接的CCOL2A1基因，所述CCOL2A1基因的序列如SEQ ID NO：1所示。

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