CN101684159B - 人颗粒酶b蛋白衍生物及其在靶向治疗腺癌中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程药物领域。运用基因工程技术,本发明提供了一组人颗粒酶B蛋白衍生物GrB-G4S-GnRH(GrBLG)和mGrB-G4S-GnRH(mGrBLG)。二者为人成熟颗粒酶B(GrB)与突变的人成熟颗粒酶B(mGrB)分别经柔性连接短肽GlyGlyGlyGlySer(G4S)与人促性腺激素释放激素(GnRH)连接而成的靶向融合蛋白,均能通过配体人GnRH与细胞表面的人GnRH受体(GnRHR)相结合。mGrB消除了原始GrB通过自身“静电交换-吸附模式”结合并进入靶细胞的功能,同时保留了GrB的酶促活性与杀细胞功能。本发明提供所述融合蛋白特异靶向杀伤GnRHR阳性细胞并毒副作用最小化的实验证据,展示了一组人颗粒酶B蛋白衍生物分别靶向治疗一类促性腺激素释放激素受体阳性的腺癌的用途。
Description
技术领域
本发明属于基因工程药物领域。利用基因工程技术,本发明提供了一组人颗粒酶B蛋白衍生物GrB-G4S-GnRH(GrBLG)和mGrB-G4S-GnRH(mGrBLG)。二者为人成熟颗粒酶B(GrB)与突变的人成熟颗粒酶B(mGrB)分别经柔性连接短肽GlyGlyGlyGlySer(G4S)与人促性腺激素释放激素(GnRH)连接而成的靶向融合蛋白,均能通过配体人GnRH与细胞表面的人GnRH受体(GnRHR)相结合。mGrB消除了原始GrB通过自身“静电交换-吸附模式(即通过GrB蛋白特定阳离子序列中的碱性氨基酸结合细胞表面携带负电荷的粘多糖)”结合并进入靶细胞的功能,同时保留了GrB的酶促活性与杀细胞功能。本发明提供所述融合蛋白特异靶向杀伤GnRHR阳性细胞并毒副作用最小化的实验证据,展示了一组人颗粒酶B蛋白衍生物分别靶向治疗一类促性腺激素释放激素受体阳性的腺癌的用途。
背景技术
恶性肿瘤是严重危害人类生命和健康的常见病和多发病,近年来在全球范围内呈增长趋势。加强恶性肿瘤防治研究已成为全球性的卫生战略问题。恶性肿瘤的治疗长期以来是一项世界性难题,传统的手术、化疗和放疗的疗效总不尽人意。近年来,利用受体与配体、抗体与抗原等分子间特异性相互结合等作用使药物定向作用于特定细胞和组织的靶向治疗(targetedtherapy)研究日益受到关注。癌症的靶向治疗研究是推动恶性肿瘤治疗和生物技术产业发展的前沿领域,肿瘤靶向治疗药物是其中颇具前景的研究热点之一。靶向药物是利用化学方法或基因重组技术将毒素或细胞因子与抗体、抗体可变区或有关配体相偶联而获得的融合分子,具有针对性强、效果显著、较少伤及正常组织等优点。目前,靶向药物主要指利用基因重组技术获得的重组靶向融合蛋白。
靶向药物由靶向结合域和杀伤效应域组成。靶向结合域能够特异识别并结合靶细胞,通常为肿瘤细胞表面特异抗原的抗体或高丰度受体的配体(如多肽激素、细胞因子、小肽等)。杀伤效应域行使高效杀灭靶细胞的功能,多为源于动物、植物、微生物的生物毒素或细胞因子。迄今,已有多种基于抑制肿瘤组织血管生成、激活免疫细胞、以及利用毒素和细胞因子的细胞毒效应等途径设计的靶向融合蛋白药物投入研制,并以其显著的体外抗肿瘤作用受到关注。然而,多种融合了人体外源毒素的靶向蛋白药物均无法成功应用于临床。用药后,机体在短期内就会产生中和抗体,导致重复用药失效;严重时甚至出现免疫反应,以致休克与死亡;同时伴随血管渗出综合征及肝、肾功能损伤等副作用。究其原因,主要是该类药物的靶向准确性低以及严重的免疫原性和毒副作用等问题。这些也正是靶向药物设计目前面临的主要问题。
靶向性是靶向药物设计的核心,它直接决定了药物的特异性。特异性强的药物具有高效、低毒、副作用小等优点。药物的靶向性与其靶向结合域直接相关。理想的靶向结合域应将药物准确定位于癌组织,以高亲和力特异性结合并进入肿瘤细胞,不伤及或极少伤及正常细胞;此外,药物本身应无免疫原性。而杀伤效应域本身与正常细胞的相互作用是决定药物靶向性的另一重要因素,在设计时需全面考虑。免疫原性可能来自靶向药物的各个组分。早期多由人体异源蛋白、异源毒素构成的杀伤效应域是药物免疫原性的主要来源。而毒副作用除了由杀伤效应域决定外,也与药物的非特异性结合及免疫原性直接相关。可见,对靶向药物进行准确靶向的人源化、智能化设计是保证其安全、有效的重要前提。
结合癌症治疗的现状和靶向治疗的特点,本发明确立了一条研制基因工程靶向融合蛋白药物以治疗一类恶性肿瘤的策略。本发明构建并表达包含毒性细胞因子及配体多肽的融合蛋白,利用配体与靶细胞表面高丰度受体的特异性识别与结合,将融合蛋白导入靶细胞,进而利用其中的毒性蛋白杀灭该细胞。该药物的靶向结合域和杀伤效应域均选用源于人体自身的正常蛋白,从根本上消除了异源蛋白带来的免疫原性问题,提高了药物的安全性。另一方面,利用分子生物学技术对杀伤效应分子自身可与靶细胞静电结合的特定氨基酸序列进行改造,以消除其与正常细胞通过该途径进行的非特异性结合,以达到显著降低融合蛋白毒副作用的目的。各功能域间以柔性短肽相连接,保持了各自独立的空间构像,以保证其各自正常的生物学活性;同时避免该融合蛋白被人体免疫系统错误识别,从而防止免疫反应的发生。
发明内容
首先,本发明提供了一组人颗粒酶B蛋白衍生物GrB-G4S-GnRH(GrBLG)和mGrB-G4S-GnRH(mGrBLG)。所述GrBLG是包含具有杀细胞功能的人成熟GrB、柔性连接短肽G4S及具有GnRHR结合功能的人GnRH的靶向融合蛋白。所述mGrBLG则是包含具有杀细胞功能的人突变成熟mGrB、G4S及人GnRH的靶向融合蛋白。其中的mGrB在保留GrB原有酶促活性和杀细胞功能的前提下,消除了其通过自身静电交换-吸附模式结合并进入细胞的功能。两种融合蛋白GrBLG与mGrBLG均可通过GnRH靶向结合域特异性结合细胞表面的GnRHR,并经配体-受体相互作用进入表达GnRHR的细胞,进而利用杀伤效应域GrB和mGrB杀灭该细胞。而mGrBLG消除了GrB基团自身与细胞的静电结合,进而消除了该融合蛋白通过该途径对正常细胞的非特异性杀伤作用。本发明提供所述两种融合蛋白的融合编码基因GrB-G4S-GnRH和mGrB-G4S-GnRH、所述融合蛋白编码基因的表达型重组体、所述表达型重组体的工程菌、及由此二工程菌分别表达和纯化的融合蛋白GrB-G4S-GnRH和mGrB-G4S-GnRH。本发明同时提供所述融合蛋白分别特异靶向杀伤GnRHR阳性细胞并毒副作用最小化的实验证据,展示了一组人颗粒酶B蛋白衍生物靶向治疗一类促性腺激素释放激素受体阳性腺癌的用途。
优选地,所述融合蛋白GrBLG中的细胞杀伤效应基团是人成熟GrB蛋白,其DNA编码序列如SEQ ID NO.1所示,其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
优选地,所述融合蛋白mGrBLG中的细胞杀伤效应基团是经突变改造的人成熟GrB蛋白mGrB。它是利用DNA重组技术对GrB自身原有结合靶细胞位点的阳离子氨基酸编码序列进行替换突变,从而在不影响其酶促活性和细胞杀伤功能的前提下,消除其通过自身静电交换吸附模式结合并进入细胞的功能。mGrB的DNA编码序列如SEQ ID NO.8所示,其氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
优选地,所述GrBLG和mGrBLG中的靶向结合基团均为人GnRH蛋白,其DNA编码序列如SEQ ID NO.2所示,其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
更优选地,上述GrB和GnRH多肽经柔性短肽G4S相连,得到GrB-G4S-GnRH(GrBLG)融合蛋白,其DNA编码序列如SEQ ID NO.4所示,对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
更优选地,上述mGrB和GnRH多肽经柔性短肽G4S相连,得到mGrB-G4S-GnRH(mGrBLG)融合蛋白,其DNA编码序列如SEQ ID NO.9所示,对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。
附图说明
图1.GrB基因RT-PCR扩增及pBSSK-GrB酶切鉴定结果
A:
1.分子量标准DL2000(自上而下分别为2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp;后续图谱中的DL2000均与此相同);
2.GrB基因RT-PCR扩增产物(707bp);
B:
3.pBSSK-GrB/EcoR I+BamH I双酶切鉴定结果,上下两条带分别为载体与插入片段(707bp);
4.分子量标准DL2000。
图2.表达重组体pPIC9K—GrB构建示意图
图3.pPIC9K—GrB系列表达重组体PCR鉴定结果
1.分子量标准DL2000;
2.pPIC9K-GrB PCR扩增产物(985bp);
3.pPIC9K-mGrB PCR扩增产物(985bp);
4.pPIC9K-GrBLG PCR扩增产物(1030bp);
5.pPIC9K-mGrBLG PCR扩增产物(1030bp)。
图4.pPIC9K-GrB系列表达重组体BamHI/EcoR I双酶切鉴定结果
1.分子量标准DL2000;
2.pPIC9K-GrB双酶切鉴定结果,上下两条带分别为载体和插入片段,以下各 泳道同(插入片段为971bp);
3.pPIC9K-mGrB双酶切鉴定结果(插入片段为971bp);
4.pPIC9K-GrBLG双酶切鉴定结果(插入片段为1016bp)。
5.pPIC9K-mGrBLG双酶切鉴定结果(插入片段为1016bp)
图5.表达重组体pPIC9K—mGrB构建示意图
图6.pPIC9K—GrBLG表达重组体构建示意图
图7.pPIC9K—mGrBLG表达重组体构建示意图
图8.pET32a—GrB表达重组体构建示意图
图9.pET32a—GrB系列表达重组体PCR及XbaI/EcoR I双酶切鉴定结果
A:
1.分子量标准DL2000
2.pET32a-GrB PCR扩增产物(1259bp)
3.pET32a-mGrB PCR扩增产物(1259bp)
4.pET32a-GrBLG PCR扩增产物(1305bp)
5.pET32a-mGrBLG PCR扩增产物(1305bp)
B:
6.分子量标准DL2000
7.pET32a-GrB/Xba I+BamHI双酶切,上下两条带分别为载体与插入片段, 以下各泳道同(插入片段为1203bD)
8.pET32a-mGrB/Xba I+BamHI双酶切(插入片段为1203bp)
9.pET32a-GrBLG/Xba I+BamH I双酶切(插入片段为1248bp)
10.pET32a-mGrBLG/Xba I+BamHI双酶切(插入片段为1248bp)
图10.pET32a—mGrB表达重组体构建示意图
图11.pET32a—GrBLG表达重组体构建示意图
图12.pET32a—mGrBLG表达重组体构建示意图
图13.大肠杆菌表达蛋白的鉴定结果
A:
1.pET32a-GrB非诱导表达阴性对照
2~4.IPTG诱导表达目的蛋白GrB
5.低分子量标准蛋白(自上而下:97.4,66.2,42.7,31.0,20.1,14.4kDa)
6.pET32a-mGrB非诱导表达阴性对照
7~9.IPTG诱导表达目的蛋白mGrB
B:
10.pET32a-GrBLG非诱导表达阴性对照
11~13.IPTG诱导表达目的蛋白GrBLG
14.低分子量标准蛋白
15.pET32a-mGrBLG非诱导表达阴性对照
16~18.IPTG诱导表达目的蛋白mGrBLG
图14.Western Blot分析大肠杆菌表达目的蛋白实验结果
1.GrB免疫印迹
2.mGrB免疫印迹
3.GrBLG免疫印迹
4.mGrBLG免疫印迹
图15.外源基因酵母整合及表型鉴定PCR结果
1.pPIC9K质粒扩增(494bp)
2.GS115毕赤酵母扩增(2.2Kb)
3.分子量标准DL2000
4.pPIC9K-GrB高表达转化子扩增(2.2Kb,1350bp)
5.pPIC9K-mGrB高表达转化子扩增(2.2Kb,135bp)
6.pPIC9K-GrBLG高表达转化子扩增(2.2Kb,1395bp)
7.pPIC9K-mGrBLG高表达转化子扩增(2.2Kb,1395bp)
8.pPIC9K-mGrBLG质粒扩增(1395bp)
图16.酵母表达目的蛋白及其纯化结果
1.低分子量标准蛋白(自上而下:97.4,66.2,42.7,31.0,20.1,14.4kDa)
2.酵母分泌表达目的蛋白GrB
3.亲和层析纯化目的蛋白GrB(预期无糖基化分子量25.6kD)
4.酵母分泌表达目的蛋白mGrB
5.亲和层析纯化目的蛋白mGrB(预期无糖基化分子量25.6kD)
6.酵母分泌表达目的蛋白GrBLG
7.亲和层析纯化目的蛋白GrBLG(预期无糖基化分子量27.3kD)
8.酵母分泌表达目的蛋白mGrBLG
9.亲和层析纯化目的蛋白mGrBLG(预期无糖基化分子量27.3kD)
10.pPIC9K空质粒诱导表达阴性对照
(注:A图与B图为同一图片曝光不同的结果,可分别看清不同泳道的条带。)
图17.Western Blot分析酵母表达蛋白实验结果
1.GrB免疫印迹
2.mGrB免疫印迹
3.GrBLG免疫印迹
4.mGrBLG免疫印迹
图18.GrB及其突变与靶向融合蛋白的酶促活性检测结果
图19.GrB及其突变与靶向衍生物的单独细胞杀伤结果
图20.GrB及其突变与靶向衍生物与氯喹的协同细胞杀伤结果
图21.氯喹对GrBLG细胞杀伤作用的影响实验结果
图22.氯喹对mGrBLG细胞杀伤作用的影响实验结果
图23.GrBLG/氯喹对不同细胞株的协同杀伤结果
图24.mGrBLG/氯喹对不同细胞株的协同杀伤结果
图25.GrB对MCF-7的杀伤功能影响实验结果
图26.mGrB对MCF-7的杀伤功能影响实验结果
图27.GrBLG对MCF-7的杀伤功能影响实验结果
图28.mGrBLG对MCF-7的杀伤功能影响实验结果
图29.重组蛋白杀伤效应结构域功能分析结果
图30.重组蛋白靶向结构域功能分析结果
图31.GrB及其突变与靶向融合蛋白诱导MCF-7凋亡的显微观察结果
图32.GrB及其突变与靶向融合蛋白诱导MCF-7凋亡的流式检测结果
具体实施方式
本发明涉及的人颗粒酶B(GrB)是具有天冬氨酸酶活性的丝氨酸蛋白酶,在细胞毒淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CL)介导的颗粒胞吐(granulesexocytosis)免疫效应中发挥重要的细胞杀伤作用。生理条件下,人体天然GrB以无活性酶原形式储存于细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)和自然杀伤(natural killer,NK)细胞的分泌颗粒(secretory granules)中,只有其N端20个氨基酸的前导肽经信号肽酶及组织蛋白酶C(cathepsin C)切除后才能生成具有完全活性的成熟蛋白酶。人成熟颗粒酶B的cDNA全长681bp,编码227个氨基酸,蛋白分子量约25kD。其结构类似于糜蛋白酶,含57His102Asp195Ser催化三联体,底物切割序列为I/V-G/M/E-X-D↓-X-G(异亮氨酸/缬氨酸-甘氨酸/甲硫氨酸/谷氨酸-任意氨基酸-天冬氨酸↓-任意氨基酸-甘氨酸)。GrB能够通过切割半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteine aspartate protease,caspase)前体(pro-csapase)或者激活B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)家族成员Bid,高效诱导caspase依赖性的细胞凋亡级联反应;也可以直接作用于凋亡级联下游的CAD(caspase-activated DNase)和ICAD(theinhibitor of caspase-activated DNase),启动caspase非依赖性的细胞凋亡。GrB还能通过直接切割DNA断裂因子45(DFF45)、多聚ADP核糖聚合酶(PARP)、核纤层蛋白(nuclear lamins)等多种死亡底物发挥细胞毒作用。GrB不仅能够利用不同途径、在不同阶段诱发细胞凋亡,而且当一种死亡路径被阻断后,仍能利用其它途径诱导靶细胞死亡,这对于消除肿瘤细胞中普遍存在的凋亡规避机制无疑具有重要意义。作为人体正常细胞因子,GrB从根本上避免了异源蛋白具有的免疫原性,为靶向蛋白药物应用于临床提供了重要的安全保障。
本发明还改造了人颗粒酶B,获得突变体mGrB,以消除GrB原有的静电结合并进入靶细胞的功能。传统理论认为,GrB通过膜裂解蛋白穿孔素(perforin)制造的跨膜通道进入靶细胞,但并无直接证据证明GrB这样的大分子能够经该模式转运。而GrB在无穿孔素协助情况下单独进入靶细胞现象的发现使穿孔素协助理论进一步受到质疑。其后,阳离子非依赖性的6-磷酸甘露糖受体(CI-MPR)被认为是GrB进入靶细胞的膜受体,但研究却发现CI-MPR缺陷细胞仍可胞饮摄入GrB。近期提出的“静电交换-吸附模型”(electrostatic exchange-adsorptionmodel)则认为,人GrB是一种阳离子蛋白,能够与靶细胞表面携带负电荷的粘多糖(glycosaminoglycan,GAG)物质相互作用,从而通过依赖于电荷的非选择性吸附胞饮进入靶细胞。由于GrB结合及进入靶细胞的机制目前尚无最终定论,本发明依据最新的静电交换模型,利用DNA重组技术,对GrB蛋白中的GAG结合序列进行改造,将其中两段阳离子序列(Cationic Sequeces,CS)中具有细胞结合功能的部分碱性氨基酸替换为非极性氨基酸。蛋白活性检测及细胞毒实验显示,该突变在不影响GrB杀细胞活性的前提下,减少了其非特异性的细胞结合作用,从而提高了所构建融合蛋白mGrBLG的靶向准确性和安全性,降低了蛋白的毒副作用,体现了药物的智能化设计理念。
本发明涉及的第二种细胞因子是人体促性腺激素释放激素(GnRH)。GnRH是由下丘脑分泌的十肽激素,主要通过与细胞表面特异受体的结合,在下丘脑—垂体—性腺轴神经内分泌调节中发挥重要作用。GnRH对垂体外多种外周组织的生理功能也具有调节作用,并与性激素依赖性肿瘤细胞的增殖调控密切相关。有研究认为,GnRH能够通过引发肿瘤细胞凋亡抑制其增殖。GnRH受体(GnHR)是一种G蛋白耦联受体,主要分布于正常脑垂体、性腺和胎盘组织细胞膜,其它垂体外周正常组织也分布有数量不等、亲和力较低的GnRHR。多种性腺轴器官起源的腺癌(如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、垂体瘤等)细胞及非性腺轴器官起源的腺癌(如结肠癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、肺癌等)细胞表面异化,生成大量具有高亲和力的GnRHR,原因可能是机体通过自分泌机制调节癌细胞的分化。对人类原发癌标本的研究也证实,86%的前列腺癌、80%的卵巢癌和子宫内膜癌、50%的乳腺癌中有高亲和力的GnRHR分布。由于GnRHR在腺癌细胞表面广泛富集且亲和力强,加之GnRH为人体正常蛋白而无免疫原性、其本身又具有一定的肿瘤抑制活性,本发明选择GnRH作为本智能药物的细胞表面相应受体的结合域以靶向治疗一类GnRHR阳性的腺癌。
本发明运用DNA重组技术,将人成熟GrB基因与人GnRH基因经G4S柔性短肽编码序列相连接,构建、表达GrB-G4S-GnRH(GrBLG)融合蛋白,并验证了其在一类GnRHR阳性的腺癌靶向治疗中的用途。另外,本发明对人GrB自身细胞结合位点的蛋白编码序列进行替换突变,获得突变基因mGrB,再将其与人体GnRH靶向基因经G4S编码序列相连接,构建、表达mGrB-G4S-GnRH(mGrBLG)融合蛋白,并验证了其靶向治疗一类GnRHR阳性腺癌的功能。同时,本发明还表达了天然GrB及突变mGrB作为对照,以全面分析人GrB蛋白衍生物的智能化抗癌功能。
实施例1编码靶向融合蛋白的GrB基因片断的获得
本发明以Trizol法提取人皮肤T淋巴瘤细胞HuT-78的总RNA,方法为:离心收集培养细胞约106个,重悬于100μl PBS,放入DEPC处理过的1.5mlEppendorf管中,加入1.1ml Trizol,充分震荡混匀,0℃冰浴5分钟。加入350μl氯仿,充分震荡,稍静置至出现分层,于4℃12000rpm离心10分钟。将上清转移至另一支DEPC处理过的1.5ml Eppendorf管中,加入等体积4℃预冷的异丙醇,混匀。-20℃放置1小时,于4℃12000rpm离心20分钟。在沉淀中加入0.25ml75%乙醇,于4℃12000rpm离心5min,沉淀于37℃烘干或真空抽干。以20μl~50μl DEPC处理过的去离子水溶解沉淀,紫外检测RNA浓度,1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量,随即使用或-80℃保存待用。
以提取的HuT-78细胞总RNA为模板,利用引物GBW和GBS(引物序列如PRIMER SEQ ID NO.1和2所示),通过两步法RT-PCR反应,扩增人成熟GrB基因片段。RT-PCR反应采用通用RT-PCR试剂盒I(BioDev-Tec公司)进行。第一步逆转录反应,体系总体积20μl,组成为:dNTPs2pmol,MMLV1μl,5×MMLV Buffer4μl,Olig(dT)161μl,Rnasin0.4μl,Total RNA1μg,DEPC-treatedddH2O补至20μl。体系于37℃水浴2小时,95℃变性5分钟,所得cDNA立即使用或保存于-70℃。第二步PCR反应,体系总体积50μl,组成为:cDNA1μg,dNTPs0.01μmol,Pyrobest DNA聚合酶(TAKARA公司)1U,10×PCR Buffer(20mM Mg2+)5μl,10μM引物各0.3μl,ddH2O补至50μl。反应条件为:94℃预变性5min;94℃变性50sec,55℃复性50sec,72℃延伸1min,循环30次;72℃延伸5min。本发明后续PCR反应体系及条件均照此进行,各参数可能随情 况作适当调整,不再一一列出。
以EcoR I和BamHI双酶切过渡质粒pBluescriptII SK(+),回收2982bp大片断。对707bp扩增产物同样进行双酶切,纯化后16℃过夜连接两酶切片段,构建pBSSK—GrB过渡质粒。实验结果见图1。
实施例2酵母真核表达重组体pPIC9K—GrB的构建
以引物NK266及CK266(引物序列如PRIMER SEQ ID NO.3和4所示)扩增原始pPIC9K表达质粒中α-factor信号序列(SP)起始密码子上游BamH I切割位点至Kex2断裂位点(GAGAAAAGA↓)间270bp的DNA片段。以实施例1中的pBSSK—GrB过渡质粒为模板,利用引物NKB及CKB(引物序列如PRIMER SEQ ID NO.5和6所示)扩增739bp DNA片段。利用OVERLAP-PCR连接上述两段扩增产物。扩增反应体系I总体积50μl,组成为:PCR扩增产物各1μl,dNTPs0.01μmol,Pyrobest DNA聚合酶1U,10×PCR Buffer(20mM Mg2+)5μl,ddH2O补至50μl。反应体系II总体积10μl,组成为:dNTPs0.01μmol,PyrobestDNA聚合酶1U,10×PCR Buffer(20mM Mg2+)1μl,10μM引物各1μl,ddH2O补至10μl。反应条件为:反应体系I于94℃预变性3min;94℃变性50sec,50℃复性40sec,72℃延伸1min,循环8次;72℃延伸5min;加入反应体系II,95℃变性50sec,50℃复性40sec,72℃延伸1min,循环20次;72℃延伸5min。本发明后续OVERLAP-PCR反应体系及条件均照此进行,各参数可能随情况作 适当调整,不再一一列出。经OVERLAP-PCR扩增,最终得到全长985bp DNA片段,其编码蛋白碳末端含有根据酵母偏好密码子设计的6-组氨酸亲和标签(His6-tag)。用BamHI和EcoR I双酶切pPIC9K,回收8992bp载体片段。对985bp扩增片段同样进行双酶切,纯化后连接两酶切片段,构建pPIC9K—GrB表达重组体。重组体构建流程见图2,实验结果见图3和图4。
实施例3酵母真核表达重组体pPIC9K—mGrB的构建
本发明将人成熟GrB蛋白的两段阳离子序列CS1(96RKAKRTRA,96精氨酸—赖氨酸—丙氨酸—赖氨酸—精氨酸—苏氨酸—精氨酸—丙氨酸)和CS2(221KKTMKRY,221赖氨酸—赖氨酸—苏氨酸—甲硫氨酸—赖氨酸—精氨酸—酪氨酸)中具有细胞结合功能的部分碱性氨基酸编码序列替换为非极性丙氨酸(A)的编码序列,使之分别突变为96 AKAKATAA(96 丙氨酸—赖氨酸—丙氨酸—赖氨酸—丙氨酸—苏氨酸—丙氨酸—丙氨酸)和221 AATMAAY(221 丙氨酸—丙氨酸—苏氨酸—甲硫氨酸—丙氨酸—丙氨酸—酪氨酸),以获得突变基因mGrB。
以实施例2中的pPIC9K—GrB为模板,利用引物NK266及Ncsl(引物序列如PRIMER SEQ ID NO.7所示)扩增558bp DNA片段。以实施例1中的pBSSK—GrB为模板,利用引物cs1及cs2(引物序列如PRIMER SEQ ID NO.8和9所示)扩增434bp DNA片段。利用引物NK266和CKmB(引物序列如PRIMER SEQID NO.10所示)进行OVERLAP-PCR以连接上述两段扩增产物,最终得到全长985bp DNA片段,其编码蛋白碳末端含有根据酵母偏好密码子设计的6-组氨酸亲和标签。用BamHI和EcoR I双酶切pPIC9K,回收8992bp载体片段。对985bp扩增片段同样进行双酶切,纯化后按酶连比例连接载体片段,构建pPIC9K—mGrB表达重组体。重组体构建流程见图5,实验结果见图3、图4。
实施例4酵母真核表达重组体pPIC9K—GrBLG的构建
以重组质粒pPIC9K—GrB为模板,利用引物NK266及CKG(引物序列如PRIMER SEQ ID NO.11所示)在GrB编码序列碳末端添加G4S及GnRH编码序列,扩增得到997bp DNA片段。利用引物NK266及CK(引物序列如PRIMER SEQID NO.12所示)对997bp扩增产物及合成DNA片段CHG CK(引物序列如PRIMER SEQ ID NO.13所示)进行OVERLAP-PCR,在GnRH序列碳末端添加His6-tag及EcoR I酶切位点,最终得到1030bp DNA片段。用BamH I和EcoR I双酶切pPIC9K,得8992bp载体片段。对1030bp DNA片段同样进行双酶切,纯化后连接两酶切片段,构建pPIC9K—GrBLG表达重组体。重组体构建流程见图6,实验结果见图3、图4。
实施例5酵母真核表达重组体pPIC9K—mGrBLG的构建
以重组质粒pPIC9K—mGrB为模板,利用引物NK266及CKG在mGrB编码序列碳末端添加G4S及GnRH编码序列,扩增得到997bp DNA片段。利用引物NK266及CK对997bp扩增产物及合成片段CHG进行OVERLAP-PCR,在GnRH序列碳末端添加His6-tag编码序列及EcoR I酶切位点,最终得到1030bp DNA片段。用BamHI和EcoR I双酶切pPIC9K,得8992bp载体片段。对1030bp DNA片段同样进行双酶切,纯化后连接两酶切片段,构建pPIC9K—mGrBLG表达重组体。重组体构建流程见图7,实验结果见图3、图4。
实施例6大肠杆菌原核表达重组体pET32a—GrB的构建
以原始pET32a质粒为模板,利用引物NpT7及CpEK(引物序列如PRIMERSEQ ID NO.14和15所示)扩增T7promoter至EK(肠激酶)切割位点间562bpDNA片段。以实施例1中的pBSSK—GrB过渡质粒为模板,利用引物NbEK(引物序列如PRIMER SEQ ID NO.16所示)及GBS扩增712bp GrB DNA片段。利用引物NpT7及GBS进行OVERLAP-PCR以连接上述两段扩增产物,最终得到全长1259bp DNA片段。用Xba I和BamH I双酶切pET32a,回收5369bp载体片段。对1259bp扩增片段同样进行双酶切,纯化后按酶联比例连接载体片段,构建pET32a—GrB表达重组体。重组体构建流程见图8,实验结果见图9。
实施例7大肠杆菌原核表达重组体pET32a—mGrB的构建
以实施例6中的pET32a—GrB为模板,利用引物NpT7及Ncsl扩增得到850bpDNA片段。以实施例1中的pBSSK—GrB过渡质粒为模板,利用引物cs1及cs2扩增得到434bp DNA片段。利用引物NpT7及mGBS(引物序列如PRIMER SEQID NO.17所示)进行OVERLAP-PCR以连接上述两段扩增产物,最终得到全长1259bp DNA片段。用Xba I和BamHI双酶切pET32a,回收5369bp载体片段。对1259bp扩增片段同样进行双酶切,纯化后按酶联比例连接载体片段,构建pET32a—mGrB表达重组体。重组体构建流程见图10,实验结果见图9。
实施例8大肠杆菌原核表达重组体pET32a—GrBLG的构建
以实施例6中的pET32a—GrB为模板,利用引物NpT7及CbL(引物序列如PRIMER SEQ ID NO.18所示)在GrB编码序列碳末端添加G4S编码序列,扩增得到1268bp DNA片段。利用引物NpT7及CGn(引物序列如PRIMER SEQ IDNO.19所示)对1268bp扩增产物及合成片段LGn(引物序列如PRIMER SEQ IDNO.20所示)进行OVERLAP-PCR,得1305bp扩增片段。用Xba I和BamH I双酶切pET32a,得5369bp载体片段。对1305bp DNA片段同样进行双酶切,纯化后按酶联比例连接载体片段,构建pET32a—GrBLG表达重组体。重组体构建流程见图11,实验结果见图9。
实施例9大肠杆菌原核表达重组体pET32a—mGrBLG的构建
以实施例7中的pET32a—mGrB为模板,利用引物NpT7及cs2在mGrB编码序列碳末端添加G4S编码序列,扩增得到1259bp DNA片段。利用引物NpT7及CGn对1259bp扩增产物及合成片段LGn进行OVERLAP-PCR,得1305bp扩增片段。用Xba I和BamHI双酶切pET32a,得5369bp载体片段。对1305bp DNA片段同样进行双酶切,纯化后按酶联比例连接载体片段,构建pET32a—mGrBLG表达重组体。重组体构建流程见图12,实验结果见图9。
实施例10蛋白GrB、mGrB、GrBLG和mGrBLG的大肠杆菌表达及鉴定
分别以鉴定后的阳性表达重组体pET32a-GrB、pET32a-mGrB、pET32a-GrBLG和pET32a-mGrBLG转化E.coli宿主菌Origami,37℃培养过夜。同时设置pET32a空载体及无DNA的转化体系作为阳性和阴性对照。挑取阳性转化单菌落接种含50μg/ml氨苄青霉素的5ml LB液体培养基,37℃振荡培养过夜。菌液按1~2%(v/v)比例转接于150~200ml LB抗性液体培养基,37℃振荡培养至菌液OD600达0.4~0.6。以1/1000(v/v)比例向菌液中加入1M IPTG,37℃振荡培养3~5小时。同时设置非诱导阴性对照。菌液于6000rpm离心10分钟,收集菌体沉淀,进行SDS-PAGE,检测目的蛋白的表达。结果显示,与非诱导阴性对照相比,诱导表达质粒pET32a-GrB(预期蛋白分子量42.4kD)、pET32a-mGrB(预期蛋白分子量42.4kD)、pET32a-GrBLG(预期蛋白分子量44kD)和pET32a-mGrBLG(预期蛋白分子量44kD)均于43kD附近出现特异性条带,分子量与预期一致。实验结果见图13。Western Blot鉴定结果见图14。
实施例11蛋白GrB、mGrB、GrBLG和mGrBLG的酵母表达及鉴定
以Sal I单酶切鉴定后的阳性重组表达质粒pPIC9K-GrB、pPIC9K-mGrB、pPIC9K-GrBLG和pPIC9K-mGrBLG,于7500kV/cm、5ms条件下电转化毕赤酵母GS115。电击后立即在电转杯中加入0.8ml冰冷的1mol/L山梨醇,混匀。同时设置pPIC9K空载体、无DNA及无细胞的转化体系作为阳性和阴性对照。将细胞悬液涂布于MD或RDB培养基上,30℃培养至His+阳性转化子出现。将各表达重组体His+转化菌落分别制备成细胞悬液,涂布于G418浓度为0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml和2.0mg/ml的YPD平板上,置于30℃培养。将筛选出的抗性转化菌落对应地分别接种于MM和MD平板,30℃培养以确定其MutS或Mut+表型。小量诱导各表型抗性株分泌表达目的蛋白,SDS-PAGE分析其表达量。
PCR鉴定高表达株表型及其外源基因整合进入毕赤酵母基因组情况。取10ul酵母菌液或直接挑取单克隆菌落混悬于10ul ddH2O中,加入25U溶细胞酶(litycase),30℃温育10min,—80℃冻存10min,室温溶解后作为PCR模板,利用引物3’AOX1和5’AOX1(引物序列如PRIMER SEQ ID NO.21和22所示)进行PCR扩增。
同时以GS115、pPIC9K原始质粒和水的消化产物作为对照。Mut+表型株扩增应见两条特异条带:一条为长约2.2kb的毕赤酵母AOX1基因;另一条与外源目的基因相关,在pPIC9K—GrB(mGrB)和pPIC9K—GrBLG(mGrBLG)表达质粒中分别应为1350bp和1395bp。而MutS表型的转化子在AOX1基因位点发生重组,扩增只得与目的基因相关的一条带。GS115得2.2kb的野生型AOX1基因片段,pPIC9K原始质粒得494bp DNA片段,水的消化产物则无扩增产物。实验结果见图15。
分别挑取四种蛋白的Mut+表型高表达单菌落,接种于2ml BMGY培养基中,30℃摇床250rpm培养过夜。菌液转接于20~50ml BMGY培养基中,培养至OD600达1.0。室温1500g离心10分钟收集菌体,接种于含2%甲醇的500ml BMMY培养基,25℃诱导96小时,每天补加终浓度2%的甲醇及蒸发的水分。菌液于4℃6000g离心15分钟,收集上清,SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的分泌表达。诱导表达质粒pPIC9K—GrB(预期蛋白分子量25.6kD)、pPIC9K—mGrB(预期蛋白分子量25.6kD)、pPIC9K—GrBLG(预期蛋白分子量27.3kD)和pPIC9K—mGrBLG(预期蛋白分子量27.3kD)均于31~43kD之间出现特异性条带。实验结果见图16。由于GrB一级结构中含有两个毕赤酵母N-型糖基化位点(N—X—S/T)及多个潜在的O-型糖基化位点,该位点的糖基化可能造成了四种目的蛋白分子量与预期值的差异。Western Blot鉴定结果参见图17。调节上清pH至7.4,经0.22μm或0.45μm滤膜过滤,4℃储存以备蛋白纯化。
实施例12酵母表达蛋白GrB、mGrB、GrBLG和mGrBLG的纯化
蛋白纯化使用HisTrap HP Ni2+亲和柱,参照Amersham Biosciences产品手册于4℃恒温冷室进行操作。所有亲和层析用溶液必须先经0.22μm或0.45μm滤膜过滤。层析时,按下列顺序使各溶液通过层析柱(流速1ml/min):5ml去离子水→5ml结合缓冲液(1000mM NaCl,10mM Na2HPO4,10mMNaH2PO4,10mM Imidazole,pH7.4)→5ml洗脱缓冲液(1000mM NaCl,10mMNa2HPO4,10mM NaH2PO4,500mM Imidazole,pH7.4)→10ml结合缓冲液→待纯化蛋白样品→10ml结合缓冲液→5ml洗脱缓冲液(1ml/管收集洗脱蛋白)→10ml结合缓冲液→5ml去离子水
测定各洗脱蛋白的OD280,取紫外吸光值明显升高的蛋白样品进行SDS—PAGE鉴定,实验结果见图16。利用GrB抗体2C5(Calbiochem公司)对四种纯化的目的蛋白进行Western Blot免疫分析,实验结果见图17。利用BCA蛋白定量试剂盒(Pierce公司)测定各纯化蛋白浓度,按照蛋白样品与培养液的体积比例确定四种纯化蛋白的产量约为0.8~1.0mg/L培养液。将蛋白透析至PBS,定量后分装,低温冷冻干燥,保存于-80℃备用。
实施例13GrB及其突变与靶向融合蛋白的酶促活性检测
本发明利用合成的GrB特异性肽底物Ac-IETD-pNA(acetyl-Ile-Glu-Thr-Asp-p-nitroanilide,乙酰异亮氨酸-谷氨酸-苏氨酸-天冬氨酸-对硝基苯胺)(GLBiochem公司)检测目的蛋白GrB、mGrB、GrBLG和mGrBLG的生物酶活性,并与商品化的人重组GrB标准蛋白(Standard GrB,sGrB)(Calbiochem公司)活性进行对比。实验分别取5、10、20、40、80、160、320nM的sGrB、GrB、mGrB、GrBLG、mGrBLG与200μM Ac-IETD-pNA,于100μl反应液(50mM Tris,150mM NaCl,0.01%(v/v)X-100,pH8)、25℃温浴3小时,在405nm波长处检测各反应体系于不同时间点的光吸收值(A405)。各实验组均设3个重复,并以无蛋白反应体系为对照。实验结果见图18。
实验结果显示,四种蛋白均表现出与标准GrB蛋白相似的酶促反应模式,即以浓度依赖的方式对特异性肽底物进行切割;同时具有与标准GrB蛋白基本相同的酶促反应活性。在实验剂量范围内,随着蛋白浓度的增加,sGrB与GrB的酶促反应活性逐渐达到最大值并趋于稳定;突变及融合蛋白mGrB、GrBLG和mGrBLG的酶促活性逐渐升高,全部接近甚至超越sGrB的活性。这说明GrB的突变改造及靶向融合均未影响其酶促反应活性,这一改造也成为GrBLG和mGrBLG靶向杀伤一类GnRH受体阳性腺癌的基础。
实施例14GrB及其突变与靶向融合蛋白的细胞毒活性分析
在人体正常生理环境中,GrB必须经胞吞后形成的内涵体(endosome)释放进入靶细胞质才能行使杀伤作用。在体外培养细胞实验中,这一过程通常由传统抗疟药氯喹(chloroquine)协助完成。为全面、深入地研究酵母表达的GrB系列蛋白的生物活性,本发明分别检验了各蛋白单独以及与氯喹协同作用下对细胞的杀伤作用。实验选择CCC-ESF-1(人胚胎皮肤成纤维细胞,GnRHR-)、HEK293(人胚肾细胞,GnRHR+,低表达)和MCF-7(人乳腺癌细胞,GnRHR+,高表达)3种细胞,涵盖了GnRHR阴性和阳性的正常细胞及GnRHR阳性的肿瘤细胞系,尝试探索GrB蛋白及其靶向衍生物对不同类型人体细胞的影响。
实验采用MTT比色法。1.5~2×104细胞/孔接种96孔细胞培养板,于DMEM完全培养基、37℃5%CO2条件下过夜培养。蛋白GrB、mGrB、GrBLG与mGrBLG分别选取0.1、1、10、100、1000、10000ng/ml共6个剂量组,每孔加入100μl蛋白样品,每个样品重复3次。同时设置不含细胞及蛋白的调零实验组,以及含细胞而不加蛋白的对照实验组。37℃5%CO2条件下培养14小时后,每孔加入100μgMTT,37℃温育4~6小时。每孔加入150μlDMSO,摇床混匀10min,检测OD490。计算平行实验的平均值,并以标准差(SD)形式反应数值的波动范围。计算细胞杀伤活性:细胞增殖抑制率=(1—实验组/对照组)×100%。利用统计学软件(SPSS15.0)分析不同蛋白各剂量组与对照组间差异的显著性(P),以衡量实验结果在统计学上是否有意义。
在无协同因子氯喹的体外杀伤实验中,蛋白GrB、mGrB、GrBLG与mGrBLG对细胞的总体杀伤率较低。在0.1~10000ng/ml蛋白剂量范围内,四种蛋白对GnRHR-细胞CCC-ESF-1均未表现出杀伤活性;在10μg/ml最高蛋白剂量下,以GnRHR+细胞HEK293为杀伤对象的实验中,GrB表现出1.133%的杀伤率,mGrB的杀伤率仅为0.470%,靶向蛋白GrBLG与mGrBLG的杀伤率也未超过10%,分别仅为9.185%和4.133%;而以GnRHR+肿瘤细胞MCF-7为对象的杀伤实验中,靶向蛋白GrBLG与mGrBLG在10μg/ml最高蛋白剂量下的杀伤率分别达到21.623%和17.603%,高于蛋白GrB(11.591%)和mGrB(5.241%)。这说明两种靶向蛋白的杀伤作用与细胞表面GnRHR的表达水平呈正相关关系:对表面富集GnRHR的肿瘤细胞杀伤率相对较高,对GnRHR数量较少的正常细胞杀伤率相对较低,而对表面不表达GnRHR的细胞则不敏感。作用于GnRHR+细胞时,GrBLG和mGrBLG的细胞毒活性明显高于不具有GnRH靶向结构域的对照蛋白GrB和mGrB,而GrB靶细胞结合位点突变蛋白mGrB和mGrBLG的细胞毒活性则低于未突变蛋白GrB和GrBLG。显然二者未能经由原途径进入细胞。实验结果见表1~3和图19。
表1GrB蛋白及其突变和靶向衍生物对CCC-ESF-1细胞的杀伤作用
表2GrB蛋白及其突变和靶向衍生物对HEK293细胞的杀伤作用
表3GrB蛋白及其突变和靶向衍生物对MCF-7细胞的杀伤作用
在有协同因子氯喹的体外杀伤实验中,氯喹对非靶向对照蛋白GrB和mGrB杀伤各实验细胞株的效应均无明显协同作用。在10μg/ml最高蛋白剂量下,GrB和mGrB对GnRHR-细胞CCC-ESF-1均未表现出明显杀伤作用,GrB对GnRHR+细胞HEK293的杀伤率为3.122%,而mGrB对HEK293的杀伤率仅为1.895%。该结果同时说明,较之GrB,mGrB对GnRHR+正常细胞的毒副作用降低了39.3%。在该协同杀伤实验中,氯喹对靶向蛋白GrBLG和mGrBLG杀伤GnRHR+肿瘤细胞MCF-7的效应表现出显著的协同作用,但对它们杀伤GnRHR+细胞HEK293和GnRHR-细胞CCC-ESF-1的效应则未表现出明显协同作用(见表4~6和图20)。
表4蛋白/氯喹对CCC-ESF-1细胞的协同杀伤作用
表5蛋白/氯喹对HEK293细胞的协同杀伤作用
表6蛋白/氯喹对MCF-7细胞的协同杀伤作用
在0.1~10000ng/ml蛋白剂量范围内,GrBLG和mGrBLG对MCF-7的杀伤率显著提高,最高蛋白剂量下的杀伤率分别达到93.453%和96.294%。与无突变靶向蛋白GrBLG相比,在10μg/ml剂量下,mGrBLG/氯喹对HEK293的杀伤率降低了55.2%(GrBLG为13.211%,mGrBLG为5.909%),说明突变有效提高了mGrBLG杀伤细胞的准确性,降低了其毒副作用。而靶向蛋白/氯喹对不表达GnRHR的CCC-ESF-1不敏感,在10μg/ml蛋白剂量下,细胞存活率仍高于99%。另外,氯喹对无靶向基团的对照蛋白GrB和mGrB杀伤GnRHR+肿瘤细胞MCF-7的协同作用远远小于对靶向融合蛋白GrBLG和mGrBLG的协同作用。在氯喹协同作用下,对比各蛋白在10μg/ml剂量下对MCF-7的杀伤率,GrBLG分别为GrB(8.277%)和mGrB(3.521%)的11.3倍和26.5倍,mGrBLG则分别为GrB和mGrB的11.6倍及27.3倍。实验结果分析见见表1~6和图21~24。该结果显示,靶向设计对于将GrB改造成为有可能应用于临床治疗一类恶性肿瘤的药物,是一个极其重要的技术步骤。
上述实验结果显示:GrBLG和mGrBLG具有与天然GrB相似的作用模式,它们通过GnRH靶向结合域进入细胞内涵体,在氯喹作用下释放入细胞质,在低剂量下对肿瘤细胞MCF-7产生显著的杀伤效应。在无氯喹协助的情况下,可能仅有少量蛋白由内涵体释放并发挥作用,细胞毒效应不明显。值得注意的是,氯喹协同作用下的蛋白杀细胞活性并非孤立存在,它必须在目的蛋白通过GnRHR进入靶细胞的前提下才能实现,受体与氯喹都是GrB效应蛋白发挥生物活性不可或缺的重要因素。由于氯喹本身是一种临床药物,本实验所用剂量又仅为其临床单次用量的1%,据此推测与其协同可能不会严重限制融合蛋白的临床应用。在实验剂量范围内,GrBLG和mGrBLG的细胞毒性与靶细胞表面GnRHR表达水平呈正相关,体现了GnRH靶向域具有较好的受体识别和结合特异性,是靶向蛋白发挥杀伤作用的重要前提和安全保障。无论有无氯喹的协同,mGrBLG的细胞毒性在实验中总体低于GrBLG(见表1~6和图19、20)。而在蛋白活性测定中,mGrBLG的酶促活性均高于GrBLG(见图18)。这说明本研究采取的突变这一技术步骤,在不影响GrB生物活性的前提下,显著减少了融合蛋白无选择性的细胞杀伤作用,从而提高了GrBLG和mGrBLG的靶向性和安全性。而蛋白各基团功能的正常发挥,也显示出连接短肽G4S促进了蛋白各部分的正确折叠和相对独立,进而维护了其各自正常的生物活性。
此外,上述结果均为体外实验所得。如将上述融合蛋白引入机体血循环,其情况将有不同。由于人体内正常组织细胞表面GnRHR数量远远少于该受体阳性肿瘤细胞的受体数量,当GrBLG或mGrBLG被导入GnRHR+腺癌患者血液循环,在竞争性结合原理驱动下,预计两者将以更大的几率靶向结合并高效杀伤该类肿瘤细胞,并将以更小的几率结合并进入少量GnRHR+的正常细胞,而对GnRHR-的正常细胞将基本无杀伤作用,从而可望显示出比体外试验时原己较低的毒副作用更低的水平。可见,GrBLG和mGrBLG均具有进一步开发成为靶向治疗一类腺癌的临床药物的应用前景。
实施例15靶向融合蛋白GrBLG和mGrBLG的结构域功能分析
本发明利用GrB蛋白抗体2C5及商品化的GnRH蛋白(Calbiochem公司)设计了包含13种不同组合的蛋白体外细胞杀伤实验,以进一步探讨融合蛋白GrBLG和mGrBLG各结构域的功能。实验选用表面富集GnRHR的人乳腺癌细胞MCF-7,采用MTT法(方法同实施例9)进行,每组3个平行实验。实验共分7个对照组(1~7组)及6个实验组(8~13),具体分组情况及剂量如表7。
表7融合蛋白结构域功能分析实验分组说明
分组 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 |
蛋白(100ng/ml) | - | - | - | - | - | - | - | + | + | + | + | + | + |
GnRH(3nM) | - | - | + | - | - | - | - | - | - | - | - | - | |
GnRH(3μM) | - | - | - | + | + | - | - | - | + | - | - | + | - |
氯喹(20μM) | - | + | - | - | + | - | + | - | - | - | + | + | + |
2C5(1μg/ml) | - | - | - | - | - | + | + | - | - | + | - | - | + |
分组说明:
(1)无蛋白空白对照组;
(2)20μM氯喹;
(3)3nM GnRH,该剂量相当于100ng/ml GrBLG和mGrBLG中所含的GnRH靶向结构域的浓度,用以分析融合蛋白中的靶向结构域对蛋白细胞毒活性的影响;
(4)3μM GnRH,该剂量1000倍于100ng/ml GrBLG和mGrBLG中所含的GnRH靶向结构域的浓度,用以竞争性结合细胞表面的GnRH受体,从而检测融合蛋白靶向结构域的功能;
(5)3μM GnRH+20μM氯喹;
(6)1μg/ml2C5,该剂量2C5是100ng/ml GrBLG和mGrBLG中所含的GrB效应结构域的过量竞争性抑制剂,用以分析GrB基团在融合蛋白中的细胞杀伤作用;
(7)1μg/ml2C5+20μM氯喹;
(8)100ng/ml实验蛋白,实验蛋白分别为GrB、mGrB、GrBLG和mGrBLG;
(9)100ng/ml实验蛋白+3μM GnRH;
(10)100ng/ml实验蛋白+1μg/ml2C5;
(11)100ng/ml实验蛋白+20μM氯喹;
(12)100ng/ml实验蛋白+20μM氯喹+3μM GnRH;
(13)100ng/ml实验蛋白+20μM氯喹+1μg/ml2C5。
1μg/ml2C5及3μM GnRH均先于各实验蛋白30min加入反应体系。计算平行实验的平均值,并以标准差(SD)形式反映数值的波动范围。计算细胞杀伤活性:细胞增殖抑制率=(1—实验组/对照组)×100%。利用统计学软件(SPSS15.0)分析不同蛋白各剂量组与对照组间差异的显著性(P),以衡量实验结果在统计学上是否有意义。实验结果见表8。
表8融合蛋白结构域功能分析实验结果
结果显示,实验对照组2(20μM氯喹)、6(1μg/ml2C5)、7(1μg/ml2C5+20μM氯喹)均未表现出显著的杀伤效应,细胞MCF7存活率均接近100%,这说明20μM氯喹和1μg/ml2C5本身对杀伤实验结果无明显影响。对照组3(3nM GnRH)无细胞死亡,说明融合蛋白的GnRH靶向结构域主要起细胞结合作用,其本身并无明显的细胞毒活性。只有对照组4(3μM GnRH)和5(3μM GnRH+20μM氯喹)出现约8%的细胞杀伤效应,显示出3μM GnRH对MCF-7恶性肿瘤细胞具有一定杀伤作用。
在非靶向蛋白GrB和mGrB对MCF-7的杀伤功能分析中,加入过量GrB抗体2C5后,实验组10(蛋白+2C5)和13(蛋白+氯喹+2C5)的细胞存活率均超过99%。这说明2C5的竞争性结合作用有效抑制了蛋白的细胞毒活性。实验组9(蛋白+GnRH)和12(蛋白+氯喹+GnRH)的细胞杀伤率分别接近对照组4(3μMGnRH)和5(3μM GnRH+氯喹)的水平,氯喹协同实验组11(蛋白+氯喹)、12(蛋白+氯喹+GnRH)、13的细胞存活率略低于非协同实验组8(蛋白)、9、10的水平。实验结果见表8和图25、26。在靶向蛋白GrBLG和mGrBLG对MCF-7的杀伤功能分析中,加入过量GrB抗体2C5后,实验组10(蛋白+2C5)和13(蛋白+氯喹+2C5)的细胞存活率均超过98%。实验组11(蛋白+氯喹)与13的对比尤其显著,GrBLG的细胞杀伤率由加入2C5前的57.174%降至1.223%,mGrBLG的细胞存活率由44.891%增至98.342%,蛋白细胞毒活性基乎完全被抗体封闭。加入过量GnRH后,实验组9(蛋白+GnRH)的细胞杀伤率接近对照组4(3μM GnRH)的水平;实验组12(蛋白+氯喹+GnRH)的细胞存活率变化显著,GrBLG由加入GnRH前的42.826%上升至88.071%,mGrBLG则由44.891%上升至89.592%。这说明过量GnRH优先竞争性结合了细胞表面的GnRHR,阻止了GrBLG和mGrBLG与该受体的结合,致使蛋白未能进入细胞发挥其杀细胞作用。实验结果见表8和图27、28。
上述实验结果显示,目的蛋白对MCF-7的杀伤主要体现在同氯喹的协同作用中。2C5与GrB的竞争性结合完全封闭了各蛋白的细胞杀伤作用,细胞存活率接近100%,与对照组差异很小;而过量GnRH与靶细胞表面受体的竞争性结合显著阻止了靶向蛋白对细胞的杀伤作用,各组细胞存活率最终接近对照组水平。实验结果见表8和图29、30。
对GrBLG和mGrBLG的结构域功能分析说明:靶向结合域GnRH能够引导融和蛋白mGrBLG和GrBLG高效靶向进入相应的GnRHR+靶细胞,是蛋白靶向结合、进而发挥特异细胞毒效应的重要结构单位。虽然融合蛋白理论上也能通过GrB杀伤效应域的自身结合进入靶细胞,但数量很少;而本发明设计的GrB结合位点突变则基本上消除了此类非特异结合的发生,使GnRH结合域成为融合蛋白准确靶向结合一类肿瘤细胞的保障,同时显著降低了非特异性结合导致的对正常细胞的盲目杀伤。实验结果同时证实:效应结构域GrB能够在较低剂量下杀伤靶细胞,是靶向蛋白发挥细胞毒效应的核心成分,而对GrB的改造没有显著影响该蛋白的细胞毒活性。另外,靶向蛋白的结合结构域与效应结构域功能均得以正常发挥,也从侧面说明G4S保证了蛋白各部分构像的相对独立与功能的正常。
实施例16GrB及其突变与靶向融合蛋白诱导细胞凋亡
凋亡是一种程序性的细胞死亡,在机体的胚胎发育、组织修复及内环境的稳定等方面起着重要作用,是细胞的基本功能之一。天然GrB能够通过不同途径诱导细胞凋亡。本发明对蛋白GrB、mGrB、GrBLG和mGrBLG诱导MCF-7细胞凋亡的作用进行了显微观察和流式细胞分析。
16.1蛋白诱导细胞凋亡的形态学观察
实验分别取100ng/ml蛋白GrB、mGrB、GrBLG、mGrBLG及20μM氯喹与106细胞/ml的MCF-7于37℃温育14小时诱导细胞凋亡,同时设置PBS(含20μM氯喹)阴性对照。凋亡诱导期间利用倒置显微镜(XSZ-D2型,重庆光学仪器厂)观察发现,GrB及mGrB实验组在细胞形态上未表现出与PBS对照组的显著差异;而GrBLG和mGrBLG实验组出现明显细胞膜皱缩、凋亡小体形成等特征性凋亡细胞形态改变。该结果证明:在氯喹协同作用下,靶向蛋白GrBLG和mGrBLG具有诱导GnRHR阳性细胞凋亡的生物活性。具体实验结果见图31。
16.2蛋白诱导细胞凋亡的流式分析
磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine,PS)是一种带负电荷的磷脂,在细胞凋亡早期会外翻到细胞膜外侧。Annexin-V是磷脂结合蛋白,可选择性结合和标记PS。将Annexin-V进行绿色荧光蛋白EGFP标记,可作为探针检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(Propidum Iodide,PI)是一种活细胞非透过性核酸染料,在凋亡早期不能进入细胞内,但能透过凋亡中晚期细胞和死细胞的细胞膜进行染色。将Annexin V与PI匹配使用,是检测细胞凋亡的经典方法。
本发明分别取100ng/ml蛋白GrB、mGrB、GrBLG和mGrBLG协同20μM氯喹与106细胞/ml的MCF-7于37℃温育16小时诱导凋亡。同时设置PBS(含20μM氯喹)阴性对照。消化细胞,1000g离心5min,收集细胞。用4℃预冷的PBS重悬细胞,1000g离心5min,收集细胞。利用Annexin V-EGFP细胞凋亡检测试剂盒(Vigorous Biotechnology公司)进行染色:将细胞轻轻重悬于100μl AnnexinV染色液(1:500(v/v)Annexin V-EGFP/Annexin V Binding Buffer)中,于20~25℃避光孵育10~15min。加入500μl PI染色液(1:1000(v/v)PI/AnnexinV Binding Buffer),轻轻混匀,20~25℃避光孵育5min。立即使用流式细胞仪(COULTER EPICS XL)进行检测。采用488nm双波长激发,测定~510nm和>575nm波长处的发射。
检测结果显示:GrB和mGrB实验组的凋亡早期细胞数量分别占总检测细胞数的1.0%和1.1%,接近于对照组水平(0.8%);而它们的Annexin V-EGFP/PI双染阳性细胞比例略高于对照组的6.6%,分别为11.6%和10.3%;总体致凋亡水平与对照组相似,作用不明显。靶向蛋白GrBLG造成了7.5%的细胞早期凋亡,其Annexin V-EGFP/PI双染阳性细胞占39.9%;mGrBLG实验组中有6.3%的凋亡早期细胞,而Annexin V-EGFP/PI双染阳性细胞达40.6%,显著高于对照组水平。在氯喹协同作用下,GrBLG和mGrBLG分别导致了47.4%和46.9%的MCF-7细胞凋亡,证明这两种靶向蛋白具有类似于天然GrB的细胞致凋亡活性。
具体实验结果见图32。
序列表
<110>中国医学科学院基础医学研究所
<120>人颗粒酶B蛋白衍生物及其在靶向治疗腺癌中的用途
<130>
<160>11
<170>PatentIn version3.2
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引物表
<110>中国医学科学院基础医学研究所
<120>人颗粒酶B蛋白衍生物及其在靶向治疗腺癌中的用途
<130>
<160>22
<170>PatentIn version3.2
<210>1
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<400>1
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gactggttccaattgac 17
Claims (9)
1.一种经突变改型的颗粒酶B(Granzyme B,GrB)的衍生物蛋白质mGrB,其氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示,其相应的突变基因mGrB的DNA编码序列如SEQ ID NO.8所示。
2.一种由mGrB与连接肽G4S及人促性腺激素释放激素(Gonadotropin Releasing Hormone,GnRH)按从N端至C端方向依序连接起来的靶向融合蛋白mGrB-G4S-GnRH( 简称为mGrBLG);其中,G4S的氨基酸序列为GlyGlyGlyGclySer,GnRH的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示,上述三片段连接而成的靶向融合蛋白mGrB-G4S-GnRH( 简称mGrBLG)的氨基酸序列如SEQID NO.11所示。
3.如权利要求2所述的靶向融合蛋白mGrB-G4S-GnRH( 简称mGrBLG)相应的编码基因mGrB-G4S-GnRH( 简称mGrBLG),其DNA序列如SEQ ID NO.9所示。
4.一种融合蛋白编码基因mGrBLG的表达型重组体,其特征在于,所述融合蛋白编码基因的DNA序列即如SEQ ID NO:9所示。
5.如权利要求4所述的表达型重组体,是酵母真核表达型重组体pPIC9K-mGrBLG,如图7所示。
6.如权利要求4所述的表达型重组体,是大肠杆菌原核表达型重组体pET32a-mGrBLG,如图12所示。
7.一种表达型重组体的工程菌,其特征在于,所述表达型重组体是 权利要求4-6任一项所述的表达型重组体。
8.如权利要求7所述的工程菌,是将权利要求5所述的重组体转化入巴斯德-毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株GS115而获得的GS115/pPIC9K-mGrBLG,或者是将权利要求6所述的重组体转化入大肠杆菌(E.coli)菌株Origami而获得的Origami/pET32a-mGrBLG。
9.经表达纯化的如权利要求2所述的靶向融合蛋白mGrB-G4S-GnRH在制备靶向杀灭人促性腺激素释放激素受体(GnRHR)阳性的腺癌细胞的药物中的用途。
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