KR20080016798A - 암 치료를 위한 ｐ21 단백질 포함 컨쥬게이트 - Google Patents

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아가멤논 에페네토스
크리스티나 코우스파루
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트로잔 테크놀러지스 리미티드
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Abstract

P21 단백질은 암의 치료에 치료제로 이용된다. 컨쥬게이트는 P21 단백질, 또는 그것의 동족체 또는 기능적 단편을 포함하는 제 1 영역과 전좌 인자를 포함하는 제 2 영역을 포함하는 컨쥬게이트를 포함한다.
컨쥬게이트, 전좌 인자

Description

암 치료를 위한 Ｐ21 단백질 포함 컨쥬게이트{CONJUGATE COMPRISING P21 PROTEIN FOR THE TREATMENT OF CANCER}
본 발명은 P21 단백질과 P21 단백질을 포함하는 컨쥬게이트 및 조성물에 관한 것이다. 이 제조물들은 암의 치료에 특히 유용하다.
암은 인간 죽음의 주요 원인 중에 하나이고 집중적인 연구의 대상이다. 거의 모든 악성 종양이 단일 세포의 불멸적인 상태로의 전환에서 기인한다는 것은 잘 알려져 있고, 여기서 세포는 증식을 조절하는 능력을 잃어버린다.
조절되지 않은 증식은 진핵생물에서는 사이클린 및 사이클린-의존 키나아제(CDKs)에 의해 주로 조절되는 세포 주기의 조절 이상으로부터 비롯된다. 사이클린 및 CDKs의 인산화 상태에 대한 조절의 복합 기전은, 사이클린/CDK 복합체가 세포를 주기의 다음 단계로 진행시킬 수 있는지 여부를 조절한다. 사이클린/CDK 복합체의 인산화 상태의 중요성은, 많은 수의 암이 사이클린/CDK 인산화 및 복합체 형성을 조절하는 핵심 요소인 P53 및 P21 종양 억제 단백질에서의 돌연변이와 연관된다는 사실에서 나타난다. 특히, P21은 cycD/cdk4 복합체 형성을 막고 G1을 정지시킨다. P21 단백질과 그것의 생물학적 기능을 상술하는 검토서는 O'Reilly MA, 항산화 레독스 시그널. 2005 1월-2월;7(1-2):108-18 및 Liu G & Lozano G, 암 세포. 2005 2월;7(2):113-4에서 찾을 수 있다.
암의 치료는 일반적으로 수술 과정, 방사선치료 및 (면역 요법을 포함한) 화학요법의 병용을 포함한다. 최근의 암 치료법들에서의 상당한 발전에도 불구하고, 향상된 치료법을 개발할 필요성이 여전히 남는다. 이상적인 암 치료법은 암적인 세포들만 정확하게 표적화하고 소멸시킬 것이다.
언급할 필요성이 있는 추가적인 문제는 화학요법에서 기인하는 약물 내성이다. 세포독성 약물의 계속적인 투약은 종양을 유발할 수 있고, 약물에 대해 초기엔 민감하다가, 약물이 그것의 치료적인 효과를 잃게 되도록 약물 내성이 증가한다.
따라서 약물에 대한 암적인 세포의 민감도를 개선하는 방법도 요구된다.
본 발명은 P21 단백질이 암의 치료에 유용하다는 발견에 기초한다. 특히, P21 단백질이 하나 이상의 암치료에 사용되는 다른 약제와 함께 투약 되었을때 시너지 효과가 관찰된다.
본 발명의 첫째 견지에 의해, 컨쥬게이트는 하기를 포함한다:
(a) P21 단백질, 또는 그것의 동족체 또는 기능적 단편을 포함하는 제1 영역; 그리고
(b) 전좌 인자를 포함하는 제2 영역.
본 발명의 둘째 견지에 의해, 조성물은 P21 단백질, 또는 그것의 동족체 또는 기능적 단편을 포함하는 첫째 영역과 전좌 인자를 포함하는 둘째 영역을 포함하는 하나 이상의 약물들과 병용하여 컨쥬게이트를 포함한다.
본 발명의 셋째 견지에 의해, 본 발명에 의한 컨쥬게이트 또는 조성물은, 특히 암의 치료를 위한 의약으로 사용할 수 있다.
본 발명의 넷째 견지에 의해, P21 단백질 또는 그것의 동족체 또는 기능적 단편은, 특히 암 치료를 위한 의약으로 사용할 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 P21 단백질을 치료적 약제로 활용한다. P21 단백질은 단독의 치료적 약제로 또는 다른 치료적 약제들과 병용하여 이용할 수 있다. 다른 치료적 약제들과 병용하여 이용할때, 놀라운 시너지작용이 관찰된다. 바람직한 구현예에서, P21 단백질은 전좌 인자에 결합되어, P21 단백질이 표적 세포에 진입 가능하게 한다.
본 발명 이전에는, P21이 암 치료에서 광범위하게 이용될 수 있을 것이라고 생각되지 않았다. 대부분의 암들은 P53 유전자에서의 돌연변이로부터 기인하고, 이것은 따라서 암 치료제를 고안하는데 분명하고 가장 바람직한 표적이다. 세포사멸 단계반응에서 기능하는 P21 단백질은 치료적 약제로 생각되지 않았다. 본 발명은 암의 치료를 위해 P53을 무시하고 활성 P21의 직접 전달을 가능하게 한다.
P21의 투약과 화학요법은 항암 치료에서 놀라운 증진을 제공한다.
여기에 이용된, 용어 "단백질"은 이 분야의 당업자들이 이해하는 바와 같이, 펩티드 결합으로 연결된 다수의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리머 분자를 지칭한다. 펩티드 및 폴리펩티드는 "단백질"이라는 용어에 포함된다.
인간 P21 단백질은 여기서 SEQ ID NO.1로 정의된다.
SEQ ID NO .1: SEPAGDVRQN PCGSKACRRL FGPVDSEQLS RDCDALMAGC IQEARERWNF DFVTETPLEG DFAWERVRGL GLPKLYLPTG PRRGRDELGG GRRPGTSPAL LQGTAEEDHV DLSLSCTLVP RSGEQAEGSP GGPGDSQGRK RRQTSMTDFY HSKRRLIFSK RKP
주석이 달린 인간 P21 서열은 SWISSPORT 데이터베이스에서 제 1 기탁 번호 P38936(등록 명칭 CDN1A_HUMAN)으로 찾을 수 있다. 인간 서열(SEQ ID NO.1)이 바람직하지만, 어느 종으로부터의 P21 단백질도, 예를 들면 Mus musculus 단백질(SWISSPROT 제 1 기탁 번호 P39689) 또는 Felis Silvestris catus(고양이) 단백질(SWISSPROT 제 1 기탁 번호 O19002)도 본 발명에 의해 이용할 수 있다. P21 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드도 본 발명의 범위 안에 있다.
기능적 변이체들(즉, 동족체들) 및 인간 P21 단백질(SEQ ID No.1)의 단편들도 본 발명에 포함된다. 예를 들면, SEQ ID NO.1에 대한 서열 유사성이 높은 (예를 들면, 60%를 초과, 바람직하기는 70%를 초과, 더 바람직하기는 80%를 초과, 가장 바람직하기는 90%를 초과, 예를 들면 95%를 초과) 단백질은 본 발명의 범위 안에 있다. 용어 "유사성"은 이 분야에서 통용되는 것이다. 용어는 아미노산 서열 사이의 비교를 지칭하고, 상응하는 위치에서의 동일한 아미노산만이 아니라, 상응하는 위치에서의 기능적으로 유사한 아미노산도 포함한다. 따라서, 폴리펩티드 서열 사이의 유사성은 서열 유사성에 더하여 기능적 유사성을 나타낸다.
아미노산 서열 사이의 유사성의 정도는 알려진 방법으로 계산할 수 있다. 유사성을 판단하기 위한 공개적으로 사용가능한 컴퓨터-베이스 방법들은 BLASTP, BLASTN 및 FASTA 프로그램들, NCBI에서 입수가능한 BLASTX 프로그램 및 Genetics Computer Group, Madison WI의 Gap 프로그램을 포함한다. 여기에서 인용한 유사성의 정도는 예를 들면, 12의 Gap 패널티(penalty)와 4의 gap 길이 패널티로 하여, Gap 프로그램을 이용하여 판단할 수 있다.
P21의 변이체 또는 단편은 부위-지정 돌연변이 같은 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 생산할 수 있고, 당업자는 보편적인 단백질 기술을 기초하여 식별할 수 있을 것이다. P21 단백질의 단편 또는 동족체는 고유의 P21 단백질의 기능을 보유해야 하고, 즉 "기능적인" 단편 또는 동족체이어야 한다. 반드시 보유해야 할 기능은 종양-억제 단백질로서 작용하고, 그리고 cycD/CDK4 복합체의 형성을 막고, 그에 따라 진핵세포의 G1 정지를 유발하는 능력이다. 세포 분열과 생육성을 위한 검사는 이 분야에서 널리 통용되는, 예를 들면 미국 위스콘신, Promega Corp.에서 입수가능한 CellTiter 96®와 CytoTox 96® 검사법이다.
바람직한 구현예에서, P21 단백질이 전좌 인자와 연합되어 컨쥬게이트를 형성한다. 여기에 이용된, 용어 "컨쥬게이트"는 전좌 인자 및 P21 단백질로 형성된 키메라 분자를 지칭한다. 컨쥬게이트는 따라서 혼성 분자이며 천연적인 형태에서 결합되지 않는다. 바람직하기는, 컨쥬게이트의 형성은 의도된 기능을 하는 P21 단백질 또는 전좌 인자의 능력을 감소시키거나 악영향을 미치지 않는다.
여기에 이용된 용어 "전좌"는 세포 멤브레인을 가로지르는 단백질의 전달을 지칭한다. 이 분야의 당업자는 P21 단백질을 표적 세포로 전달하기 위해 전좌 인자가 필요하다는 것을 분명히 알 것이다. 여기에 이용된 용어 "전좌 인자"는 세포 멤브레인, 즉 외부 세포 멤브레인을 가로질러 전좌하는 능력을 가진 어떤 모이어티를 지칭한다. P21 단백질이 전좌 인자와 컨쥬게이트 내에서 연합되면, P21도 세포 멤브레인을 가로질러 전좌 된다.
전좌 인자는 바람직하기는 단백질이어야 한다. 세포 멤브레인을 전좌하는 능력을 가진 몇몇의 단백질이 이 분야에 알려져 있고, 히스톤 단백질, 단순 헤르페스 바이러스 VP22 단백질 및 HIV tat 도메인이 포함된다. HIV-타입 I으로부터의 tat 단백질은 두 엑손(exon)에 의해 암호화된 86개의 아미노산을 포함한다. 우선 72개의 아미노산은 엑손 1에 의해 암호화되고 완전한 전사-활성 능력을 나타낸다. 이 영역 내의 기초 아미노산 잔기의 클로스터(cluster)는 세포 멤브레인을 가로질러 전좌할 수 있다고 알려졌다. 아미노산 잔기 37-72에 함유된 이 클러스터는 본 발명의 범위 안에 있다. 더 정확히는 Vives et al, J. Biol. Chem: 272 (1997); 25: pp16010-16017에 기재된 바와 같이, 아미노산 잔기 49-58는 바람직한 전좌 인자이고, 참조로 여기에 편입되었다. HIV TAT의 아미노산 49-58는 SEQ ID NO.2로 하기에 열거하였다.
SEQ ID NO .2: RKKRRQRRR
세포 멤브레인을 전좌하는 능력을 보유하는 어느 HIV-타입 I tat 단백질의 단편 또는 동족체는 본 발명의 범위 안에 있다.
전좌 능력을 가진 특정한 아미노산 모이어티가 WO03/002598에 기재되어 있고, 참조로 여기에 편입되었다. 본 발명에 의해, 전좌 인자로 이용되는 초파리 안테나페디아 단백질의 동종도메인(homeodomain)이 바람직하다. 전좌하는 능력이 유지되는 한, 안테나페디아 동종도메인의 기능적 변이체 및 동족체도 이용할 수 있다. 안테나페디아 동종도메인 전좌 인자의 완전한 설명은 W0-A-99/11809에 있고, 그것의 내용은 참조로 여기에 편입되었다. Antp 유전자의 동종도메인을 SEQ ID No.3에 나타내었다.
SEQ ID NO .3: RKRGRQTYTR YQTLELEKEF HFNRYLTRRR RIEIAHALCL TERQIKIWFQ NRRMKWKKEN
의심의 여지 없이, 초파리 안테나페디아 단백질의 아미노산 서열은 동종도메인으로 알려진 약 60개 아미노산의 모이어티를 함유하고, 전좌 인자로 기능하는 능력을 가진다. 전좌하는 능력을 유지하는 전체 길이 단백질, 동종도메인 또는 (단백질 또는 동종도메인의) 어느 동족체 또는 단편은 본 발명에서 전좌 인자로 이용할 수 있다. 동족체는 초파리 안테나페디아 동종도메인에 대해 높은 정도(예를 들면 60%를 초과, 바람직하기는 70%를 초과, 더 바람직하기는 80%를 초과 그리고 가장 바람직하기는 90%를 초과, 예를 들면 95% 또는 그 이상)의 서열 유사성을 가지는 영역을 바람직하게 포함한다.
초파리 동종도메인 및 안테나페디아 전체-길이 단백질이 바람직하지만, 이 분야의 당업자는 기능적 동족체가 어느 유기체이든 나올 수 있다는 것을 알 것이다. 안테나페디아 동족체는 다세포 유기체의 대다수에서 발견되고 잘 보존되어 있다. 예를 들면, 인간과 초파리 동종도메인은 오직 하나의 보존성 아미노산 치환체만 다르다. 예를 들면 부위-지정 돌연변이를 이용하여 인위적으로 생산한 동족체는, 역시 본 발명의 범위 안에 있다. 멤브레인을 전좌하는 천연적인 또는 인위적인 서열의 능력은 이 분야에 널리 통용되는 표준적인 방법들로 검사할 수 있다.
멤브레인을 전좌하는 능력을 보유한 동종도메인의 변이체들은 이 분야에 보고되었고 본 발명의 범위 안에 있다. 예를 들면, CNRS의 EP-B-0 485 578는 pAntp의 나선 3 서열을 포함하는 호메오펩티드를 기재하고 있고 그것들은 참조로 여기에 편입되었다.
WO97/12912도 CNRS에 대한 pAntp의 3 나선의 실제 서열과 그것의 변이체들을 기재하고 있다. 그것들도 참조로 여기에 편입되었다. 특히, 나선 3은 하기의 서열을 갖는다:
SEQ ID NO .4: Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys
변이체는 하기의 서열을 갖는다:
SEQ ID NO .5: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16
또는
SEQ ID NO .6: X16-X15-X14-X13-X12-X11-X10-X9-X8-X7-X6-X5-X4-X3-X2-X1
여기서 X는 각각 α-아미노산을 나타내고, X6은 트립토판을 나타내고; 상기 펩티드는 6 내지 10의 소수성 아미노산을 포함한다.
다른 변이체들은, 예를 들면 Gehring W(1987)의 성장 연구에서의 호메오 박스(Homeo Boxes in the Study of Development)에 기재되어 있다. 사이언스 236 1245-1252는 62개 아미노산의 동종도메인, 즉 위치 0에 glu를 그리고 위치 61에 lys를 갖는 것을 기재하고 있다. Bloch-Gallego E et al (1993) 안테나페디아 호메오박스 펩티드는 생체 외 닭 배아 운동뉴우런의 성장 및 분지형성을 향상시킨다. The Journal of Cell Biology 120(2) 485-492는 운동뉴우런 멤브레인을 통해 전좌할 수 있고 핵에 도달할 수 있는 pAntp40P2로 지칭되는 돌연변이를 개시한다. 이 돌연변이에서 위치 40 및 위치 41의 류신 및 트레오닌 잔기는 2개의 프롤린 잔기로 치환되어 있다. Le Roux et al (1993) 안테나페디아 동종도메인의 신경친화 활동도는 그것의 특정 DNA-결합 특성들에 의존된다. Proc . Natl . Acad . Sci 90 9120-9124은 도 2에 표시한 바와 같이, 신경세포 멤브레인을 통해 전좌하는 능력을 보유하는 pAntp 50A 및 pAntp 40P2 두 돌연변이를 기재하고 있다. Schutze-Redelmeier et al (1996)은 16 아미노산 C-터미널 (셋째 나선) 분절이 올리고뉴클레오티드 및 올리고펩티드를 세포질 및 세포배양 핵에 어드레싱 하는데 이용되는 것에 대해 기재하고 있다.
상기에 기술한 모든 참조들을 참조로서 여기에 편입되었다. 약 60개 잔기의 동종도메인을 이용하는 것이 바람직하다.
P21 단백질과 전좌 인자가 공유적으로 연결된 것이 바람직하다. 공유 연결은 화학적 연결 분자의 형성으로 이루어질 수 있다. 더 바람직하기는, P21 단백질과 전좌 인자가 단일 융합 단백질로 생산된다. 융합 단백질에서, P21 단백질과 전좌 인자는 어떤 순서라도 된다. 전좌 인자가 P21 단백질의 아미노 터미널 끝에 위치하는 것이 바람직하다. 융합 단백질을 생산하는 방법은 이 분야에서 널리 통용되고, Sambrook et al, 분자 복제: 실험 설명서 (Cold Spring Harbour Laboratory Press)에 기재된 표준 재조합 핵산 공정을 이용하고, 그 내용은 참조로 여기에 편입되었다. 융합 단백질을 암호하하는 핵산은 본 발명의 범위 안에 있고, 이것은 융합 단백질을 암호화하는 핵산 및 하나 이상의 프로모터 영역을 포함하고 있는 발현 벡터들이다.
P21 단백질과 전좌 인자를 포함하는 컨쥬게이트는 하나 이상의 약물을 추가적으로 함유한 조성물에 포함될 수 있다. 바람직하기는, 약물은 암 치료에 이용된다. 바람직한 구현예에서, 약물은 화학요법, 예를 들면 시스플라틴 또는 택솔이다. 하지만, 암 치료에 이용되는 다른 약물들, 예를 들면 항-염증 약물, (모노클로날 항체를 포함하는) 항체, 면역 조절 약물, 호르몬제 및 호르몬 대항제, 항균제, 항진균제 및 항바이러스제도 본 발명에 의한 컨쥬게이트와 결합하여 사용할 수 있다. 비-제한적 예를 하기에 표시했다.
(1) 세포독성 약물/세포증식억제제: 알킬화제 (예를 들면 시클로포스파미드, 멜팔란 등), 세포독성 항생제 (독소루비신, 에피루비신, 블레오마이신, 미토마이신 등), 항대사제 (메토트렉사트, 캡사이타빈, 젬시타빈, 플루러유러실, 빈카 알칼로이드 및 에토포시드 (빈블라스틴, 빈크리스틴 등), 백금 화합물 (카보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴), 탁산 (파클리탁셀, 도세탁셀 등), 토포아이소머라아제 I 억제제 (이리노테칸, 토포테칸 등).
(2) 면역 반응 조절제: 항증식 면역억제제, 코르티코스테로이드.
(3) 면역조절제: 인터페론, 인터루킨.
(4) 모노클로날: 트랜스투주맵, 리툭시맵, 알렘투주맵.
(5) 항균 약물: 페니실린, 세팔로스포린, 세파마이신, 테크라사이클린, 마이크롤라이드, 아미노글리코시드, 다른 항균제(클로람페니콜, 푸시딘산, 반코마이신 등).
(6) 호르몬제: 갑상선 호르몬제, 에스트로겐제, 프로게스테론제, 안드론겐제 및 그것의 모든 길항근제.
(7) 기타: 비타민제, 비-스테로드성 항-염증 약물들 (예를 들면, 셀레콕시브, 로페콕시브 등), 백신, 안티세라, 항진균 약물, 항바이러스 약물 및 스테로이드.
상기와 같은 P21 단백질, 그것의 동족체 또는 기능성 단편, 또는 컨쥬게이트는 암 치료에 이용될 수 있다. 바람직하게는, 상기와 같은 P21 단백질 또는 컨쥬게이트와 추가적인 약물을 포함하는 조성물이 암의 치료에 이용된다.
활성 성분을 함유한 약제학적인 조성물은 어느 적절한 형태일 수 있다. P21 단백질 또는 컨쥬게이트는 경피 또는 정맥내 투약하기 적당한 형태인 것이 바람직하다. 적당한 약제학적으로 허용가능한 완충액, 부형제, 희석액 등이 존재할 수 있고, 당업자가 알 수 있을 것이다. 조성물은 질환 조직에 직접적으로 투약하기 위한 형태 또는 질환 조직을 간접적으로 표적화하는 형태일 수 있다.
처방하는 투여량 수준은 하루에 체중 1킬로그램당 약 0.1mg 내지 약 25mg이 상기에 나타난 조건들의 치료에 유용하다(환자당 하루에 약 8mg 내지 약 2g). 예를 들면, 하루에 체중 킬로그램당 P21 화합물 약 0.25 내지 12.5mg를 투약하여 환자를 효과적으로 치료할 수 있다(환자당 하루에 약 20mg 내지 1mg).
단일 투여량 형태를 생산하기 위한 전달체 물질과 결합하는 유효 성분의 양은 치료할 숙주 및 투약의 특정 양식에 따라 변할 것이다. 투여량 단위 형태는 통상적으로 1mg 내지 500mg의 유효 성분을 함유한다.
그러나 어느 특정한 환자를 위한 특정한 투약 수준은 이용된 특정한 화합물의 활성도, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 식이요법, 투약 시간, 투약 경로, 배설 속도, 약물 조합 그리고 치료가 진행되는 특정 질환의 중증도를 포함하는 다양한 변수들에 의존한다는 것을 알 수 있다.
추가적으로 P21 화합물은 기계적인 수단에 의해 질환의 부위에 전달되거나, (질환 조직에 대한 친화력을 가지도록 화학적 변형을 가하거나 가하지 않은) 리포솜, 항체, 압티머, 렉틴, 정상 조직에는 많지 않거나 또는 존재하지 않는 질환 조직에 대한 친화력을 갖는 화학적 리간드들과 같은 조직적인 약물 표적화 기술들의 이용을 통해 질환 부위에 표적화 될 수 있다.
본 발명은 다음의 도면 참조로 기재된다.
도 1은 난소암 세포주 SKOV-3 및 골육종주 SAOS-2에 투여한 안테나페디아/P21 융합 단백질의 세포독성을 예시하고, 이들은 인체 환경과 유사한 조건인 96-월 ELISA 접시에서 배양되었다.
도 2는 안테나페디아/P21 융합 단백질의 세포독성, 그것의 시스플라틴과의 시너지 효과 및 SKOC-3 세포를 예시한다.
도 3은 SKOV-3 세포에 대한 시스플라틴 및 택솔과 병용한 안테나페디아/P21 융합물의 세포독성을 예시하고, 이것은 안테나페디아/P21 융합 단백질, 시스플라틴 및 택솔이 병용되어 사용될때 시너지 작용을 한다는 것을 나타낸다.
도 4는 종양-보유 마우스에서의 정제되고, 방사선표지된 안테나페디아 단백질 (4A) 및 안테나페디아-P21 융합 단백질 (4B)의 혈액의 제거율을 예시한다.
도 5는 안테나페디아 단백질 (5A)와 안테나페디아-P21 융합 단백질 (5B)에 대한, 여러 기관에서의 기관-대-혈액 비율과 단백질 축적을 예시한다.
도 6은 안테나페디아/P21 융합 단백질을 이용한 종양 성장의 감소를 예시한다.
도 7은 최대 농도의 안테나페디아/P21 융합 단백질이 주어졌을때 마우스 생존이 최대가 된다는 것을 나타내는 Kaplan-Meier 생존 곡선이다.
도 8은 안테나페디아/P21 융합 단백질, 택솔 및 시스플라틴을 사용할때의 생체 내의 시너지 효과를 나타낸다.
도 9는 안테나페디아/P21 융합 단백질 및 화학요법을 받는 마우스들의 Kaplan-Meier 생존 곡선을 예시하고, 여기서, 최대 생존 이익은 융합 단백질 및 추가적인 화학요법 둘 다를 받는 동물에서 나타난다는 것이 분명하다.
도 10은 안테나페디아/P21 융합물을 받는 마우스들과 시스플라틴 및 택솔을 또한 받는 동물들의 Kaplan-Meier 생존 곡선을 예시한다; 그리고
도 11은 안테나페디아/P21 융합물과 추가적인 화학요법을 받는 마우스들의 Kaplan-Meier 생존 곡선을 표시한다.
본 발명을 다음의 실시예들로 더 기술하였다.
실시예 1
P21 단백질을 단독으로 또는 안테나페디아 펩티드에 대한 융합물의 발현을 위한 박테리아성 플라스미드 클론을 만들었다. ANTP-P21 융합물("융합 단백질")의 발현은 도입 후 3시간이었고, 그 후 염산 구아니딘 및 우레아에 의한 변성 조건하에서 단백질을 정제하였다. 재생과 되접기 동안에, 단백질 침전이 관찰되었다. 이것은 다양한 완충액을 실험할 필요성이 있다는 것을 암시했다. 5개의 완충액을 시도하였다: 2OmM Tris-염기/0.5M 염화나트륨/0.1% Tween-20 용액 안의 단백질을 pH 8로 유지하였다.
융합 단백질의 생산으로 생물학적 멤브레인을 가로질러 전좌하는 안테나페디아-함유 융합 단백질의 능력을 검사하기 위한 세포 전좌 실험을 실시할 수 있었다. 이 실험에서 두 세포주, ASPC1 및 HeLa(ASPC1 - 인간 췌장 선암종, HeLa - 인간 자궁 선암종)가 이용되었다. 단백질을 37℃인 다양한 희석액 내의 세포에서 10 및 60분간 배양하였다. 단 10분의 배양 후에도 융합 단백질의 전좌가 세포주 둘 다에서 분명히 나타났다. P21 단백질 단독으로는 세포를 가로질러 전좌하는 것이 나타나지 않았다. 단백질 내부화(internalisation)는 4℃의 배양 후에도 분명히 나타났고, 전좌의 에너지-독립적인 기전은 전형적인 엔도시토시스(endocytosis)를 수반하지 않는다는 것을 암시한다.
실시예 2
융합 단백질의 발현을 세포독성 분석을 실행하기에 충분한 물질을 정제하도록 확대하였다. 단백질을 Tris 대신 염산 구아니딘 용액에 투석하여, 그것의 침전을 방지했다. 세포에 의해 흡수되면, 세포내 디설페이드 아이소머라제 및 샤페론이 기능성 단백질을 가져온다고 예상되었다. 난소암 세포주 SKOV-3 및 골육종주 SAOS-2를 96-웰 ELISA 접시에서 인체 환경과 유사한 조건(조직 배양 시설)으로 배양하였다.
세포 위에 융합 단백질 및 P21 단독 50mg/ml을 24시간 및 48시간 동안 놓았다. 대조군은 기본 세포사를 입증할 무처리 세포; 염산 구아니딘만 추가된 세포; 그리고 100% 세포사를 하기 위해 세정제로 완전히 용해된 세포를 포함한다. 실험은 24 및 48시에 종료되었고, 접시들을 세포사멸 세포사 검사하였다. 결과는 이용된 완충액(염산 구아니딘) 자체가 장시간의 노출 후에는 세포에 대한 세포독성을 가진다는 것을 나타냈다. 기본 세포사는 융합 단백질로 인한 세포독성의 증거가 되지 못했다. 따라서, 재접기 후 단백질은 세포에 무독성으로 알려진 PBS 완충액에서 투석하였다. 어느 침전 물질이든 원심분리하여 제거하였다.
이어서 단백질을 세포 배양체에 넣었다. 융합 단백질의 투약으로 도 1에 나타난 바와 같이, 두 암 세포주에서 상당한 세포사가 관찰되었다.
세포성 투약 조건에 대한 최적화 실험을 실행하였다. 투약의 지속시간을 본 세포독성 약제(Antp-P21 융합물)와 SKOV-3 세포를 사멸시킨다고 알려진 다른 약제들의 결합물에 대해서도 실험하였다. 실험에 이용된 약제는 시스플라틴이다. 이 약물은 DNA에서 가닥-내 및 가닥-사이의 교차연결을 생산하여 DNA 합성을 억제한다. 또한, 단백질 및 RNA 합성이 적은 범위에서 되도록 억제된다.
결과는 치료 두 양식 사이의 시너지 효과 및 생체내 환경을 모방하는, 상대적으로 낮은 농도에서 둘 다의 존재에서 놀랍게 향상된 세포독성 효과를 나타낸다.
Antp-P21 분자의 살상 능력과 더불어, 살상제 시스플라틴과의 시너지 효과를 분명히 나타내는 일련의 자료를 도 2에 표시하였다.
이어서 융합 단백질을 시스플라틴 및 택솔과 병용하여 실험하였다. 택솔은 미세소관계 내의 동적 평형을 붕괴시키고 세포 주기의 후기 G2 단계 및 M 단계에서 세포를 차단하여, 세포 복제를 억제한다. 결과는 치료의 3가지 양식 사이의 시너지 효과와, 상대적으로 낮은 농도에서 융합 단백질과 함께 약물이 존재할때 향상된 세포독성 효과를 나타낸다.
융합 단백질의 살상 능력과 함께 다른 살상제들과 그것의 시너지 효과를 나타내는 자료를 도 3에 표시하였다. 세포독성 약제인 시스플라틴 및 택솔과 배양하였을때, Antp-P21 융합 단백질의 세포사가 증가되는 결과를 나타냈다. Antp-P21, 시스플라틴 및 택솔은 병용하여 이용될때 시너지적으로 작용한다.
실시예 3
종양-보유 마우스에서 정제되고, 방사능표지된, 안테나페디아 단백질(단독)의 동역학 및 생분포(biodistribution)를 실험하였다. 이것은 단백질이 혈액을 거쳐 생체의 모든 조직으로의 전좌된다는 것을 나타낸다. 요약된 결과를 도 4A에 표시하였다.
안테나페디아 단백질은 빠른 초기 제거율을 가진 것으로 보이지만, 순환에서 완전히 제거되는데 15시간 이상 걸렸다. 이 작용은 양으로-하전된 단백질에서 예상되었다. 이 간격은 그것이 혈관에서 탈출하여 조직에 축적되기 위한 충분한 시간이어야 한다. 해부한 후에 마우스들의 모든 기관 및 조직을 측정하여, 기관-대-혈액 비율 및 다양한 장기에서의 단백질 축적을 계산하였고; 도 5A에 표시하였다.
단백질은 어느 특정한 유형의 조직에 친화력을 가지지 않았다. 혈관 조직에 높게 축적되는 것으로 나타냈다.
종양-보유 마우스들에서의 정제되고, 방사능표지된, 안테나페디아-P21 융합 단백질의 동역학 및 생분포를 실험하였다. 결과를 도 4B 및 5B에 표시하였다. 융합 단백질은 빠른 초기 제거율을 가진 것으로 보이지만, 순환에서 완전히 제거되는데 17시간 이상 걸렸다(도 4B). 이 작용은 안테나페디아 단백질을 단독으로 실험 하였을때와 유사하고, 양으로-하전된 단백질으로부터 예상되었다. 이 간격은 그것이 혈관에서 탈출하여 조직에 축적되기 위한 충분한 시간이라고 예상되었다. 해부한 후에 마우스들의 모든 기관 및 조직을 측정하여, 기관-대-혈액 비율을 계산하고 단백질의 생분포를 그렸고; 도 5B에 예시하였다.
예상된대로, 융합 단백질은 어느 특정한 유형의 조직에 친화력을 가지지 않았다. 혈관 조직에 높게 축적되는 것으로 보였다. 항-단백질 항체(항-HIS 항체 - Qiagen)로 염색하여 조직 내의 단백질을 발견할 수 있도록 실험을 실시하였다. 이들 면역조직화학 연구들은 얼린 조직 부위로 실시하였다.
결과는 표 1에 나타난 바와 같이, 융합 단백질이 주요 기관 내에 축적되고, 전체 길이 단백질로 발견된다는 것을 보여주었다. 분자의 습성은 종양-보유 마우스들에서는 본질상 변형되지 않은 채로 남고, 실제 종양에는 많은 양이 축적되는 예외성을 가진 것으로 보인다.
표 1
기관 염색
근육 + 결장 ++ 목표 점막(SM. INTEST.) + 비장 ++ 간 ++ 심장 + 뇌 - 폐 - 신장 -
이어서 종양을 가진 동물들에서 실험을 실시하였고, 이것은 종양 내에 단백질이 축적되는 최적의 시간과 그것을 위해 융합 단백질이 혈관에서 탈출하여 이웃하는 조직으로 들어가는 시간을 나타낸다. 이 정보는 반복된 투여량 및 각각의 투여량 사이의 시간 간격에 관련한 실험을 계획할때 유용하다.
종양-보유 마우스들의 꼬리 정맥을 통해서 방사능표지된 융합 단백질을 단일 투여량으로 투약하였고 다양한 시점에서 종양을 검사하였다. 결과는 종양의 국지화의 최적 시간이 투약 3시간 후라는 것을 나타낸다. 이 시기 후에는, 염색 강도 및 그것의 단백질 양이 감소한다. 결과를 다음의 표에 선택적으로 나타내었다.
표 2
T=15분 SKOV-3 종양을 가진 암컷 누드 마우스에 I125-표지된 안테나페디아-P21 융합 단백질 25μg을 꼬리 정맥에 주사하였다. 실제적으로 염색이 관찰되지 않았다. %i.d./g 조직 3.2211
표 3
T=1시간 SKOV-3 종양을 가진 암컷 누드 마우스에 I125-표지된 안테나페디아-P21 융합 단백질 25μg을 꼬리 정맥에 주사하였다. 세포 전체에서 번진 염색이 관찰되었다. %i.d./g 조직 1.7389
표 4
T=3시간 SKOV-3 종양을 가진 암컷 누드 마우스에 I125-표지된 안테나페디아-P21 융합 단백질 25μg을 꼬리 정맥에 주사하였다. 방사능 위치가 관찰되었다. 이 시점에서 최대의 염색이 관찰되었다. %i.d./g 조직 1.4930
표 5
T=6시간 SKOV-3 종양을 가진 암컷 누드 마우스에 I125-표지된 안테나페디아-P21 융합 단백질 25μg을 꼬리 정맥에 주사하였다. 염색 농도가 감소하였다. 융합 단백질은 세포내에서 저하되었을 가능성이 있다. %i.d./g 조직 1.1064
이어서 종양을 가진 마우스들에게 안전하게 투약할 수 있는 최대 허용 투여량을 실험하였다. 융합 단백질의 3가지 다른 농도를, 대조군과 더불어, 정맥 내 및 종양 내 둘 다에서 실험하였다. 동물의 고통 및 독성의 신호를 관찰하고, 마우스들의 체중과 백혈구 숫자를 기록하였다. 융합 단백질의 농도 2.5mg/ml가 반복적인 양식에서 독성의 효과를 가지지 않고 이용할 수 있는 최대치로 보이고, 차후의 연구에서 이용되었다.
SKOV3 난소 선암을 가진 이종 이식을 이용하였다. 안테나페디아-P21-처리 동물들을 동물 8마리의 큰 군으로 나누었고, 그리고 실험은 식염수를 받는 8마리 동물과 안테나페디아 단백질만이 증가되는 투여량으로 받는 8마리 동물과 같은 대조군을 포함한다. 주 단위로 하여 6번의 주사를 실행하였다. 도 6에 표시된 0일은 주사 첫째날이다.
결과는 융합 단백질이 최대 종양 지연 프로파일을 증명한다는 것을 나타낸다. 융합 단백질의 농도 2.5mg/ml가 최대 효능을 증명하는 것으로 보인다. 결과를 더 분석하여, 본 발명의 치료 약제의 활동 양식을 더욱 입증해주는 생존 계수를 확 인하였다. 동물들은 종양의 크기로 분류하고, 작은 초기 종양을 가진 동물들을 큰 초기 종양을 가진 동물들로부터 분리해서 보면, 작은 종양 동물에서의 치료 이익이 큰 종양을 가진 동물보다 큰 것을 알 수 있다. 단백질의 침투력 및 치료 효과는 더 작은 종양에서 개선되는 것으로 보인다. 이것의 원인은 큰 종양의 핵 내의 세포간 압력이 더 높고, 이 환경은 비-표적 분자들이 침투하기에 더 어렵기 때문이다. 따라서 치료 이익은 낮은 세포간 압력을 가진 작은 종양에서 더 컸다.
이 학설은 Kaplan-Meier 자료에 의해 입증된다. 도 7에서 나타난 바와 같이, 모든 동물들을 분석하면 융합 단백질을 그것의 최대 농도로 받은 군에서 분명한 생존 이익이 나타난다.
보편적인 화학요법 약물인 시스플라틴 및 택솔을 치료 처방에 표준 공식 투여량으로 첨가하였다. 생체 외에서 긍정적인 효과가 발견되었다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 결과는 3가지 치료 양식 사이의 시너지 효과와, 선택된 농도로 융합 단백질과 넣었을때의 향상된 세포독성 효과를 나타낸다.
융합 단백질 화학요법을 받은 동물들의 Kaplan-Meier 생존 곡선을 도 9에 기재하였다. 최대 생존 이익이 융합 단백질 및 보충적인 화학요법 둘 다를 받는 동물들에 의해 나타난다는 것은 분명하다.
융합 단백질을 받는 동물들의 생존 곡선과 융합 단백질 및 추가로 보충적인 화학요법을 받는 동물들의 곡선을 비교하면, 표 10에서, 추가적인 화학요법이 모든 시간에서 동물들의 생존 퍼센트를 증가시킨다는 것은 분명하다. 이것은 생체 외에서의 결과와 생체 내에서 관찰되는 상태가 서로 상관 관계를 갖는다는 것을 나타낸 다.
실시예 4
SKO-V3 종양에서의 다음 실험에서, 융합 단백질 안테나페디아-P21를 대장암종 RKO-E6 세포를 이식한 누드 마우스들에서 실험하였다. 이 세포들은 거대세포바이러스(CMV) 촉진자의 조절하에 있는 안정적으로 융화된 인간 유두종 바이러스(HPV) 종양유전자를 함유하고 있다. HPV E6 종양유전자는 정상적인 p53 수준과 기능의 감소를 일으키고, 이로 인해 이 주에서 기능적인 p53가 상당히 부족하게 된다.
p53의 부족은, Cdk 억제자 P21 같은, 표적 유전자의 하부 p53-매개 전이활성을 차단한다. P21의 발현은 Rb 인산화의 억제를 일으키고, 그로 인해 E2F-독립 유전자의 순차적인 발현이 차단된다.
RKO-E6 세포주는 p53-매개 전이활성 및 세포자멸사 같은 세포 계수에서의 p53 손실 효과를 조사하는데 자주 이용되었다. 여기에 기재된 실험에서는, 세포에 대한 P21의 투약 효과를 연구하기 위해 이용되었기 때문에, 따라서 p53 활성화의 필요성은 생략하였다. 세포자멸사는 종양 세포의 사멸 및 종양 크기의 감소로 측정하였다.
누드 마우스들을 RKO E6 종양으로 이종 이식하고, 4개의 군으로 무작위화하고 다음 중 하나를 꼬리 정맥 주사로 투약하였다:
i. 인산염-완충 용액 (5주간 주 1회)
ii. 안테나페디아-P21 융합물 2.5mg/ml (5주간 주 1회)
iii. 5-플루오로우라실 2mg/류코보린 1mg, 옥살리플라틴 0.2mg (5주간 주 1회)
iv. 안테나페디아-P21 융합물 2.5mg/ml + 5-플루오로우라실 2mg/류코보린 1mg, 옥살리플라틴 0.2mg (5주간 주 1회)
화학요법 약물을 측정할 수 있는 정도의 종양 감소를 일으킨다고 알려진 투여량으로 투약하였다. 종양의 퇴화도를 평가하고, 이것을 생존 이익으로 변환하였다.
결과를 도 11에 표시하였다. PBS, 융합 단백질 또는 화학요법 단독으로의 치료는 전체적인 생존율에서 거의 효과를 나타내지 않았고, 모든 군에서 30일의 범위인 평균 생존율을 나타냈다. 화학요법과 병용한 융합물로 치료한 동물에서 생존율의 상당한 증진이 관찰되었고, 평균 생존율은 45일이었고, 시너지적 관련성을 나타냈다.
결장 암으로 죽는 대다수의 환자들은 속발성 전신 전이성 질환으로도 그러하기 때문에, 암에 충분한 효과를 주기 위해, 전이성 질환에도 효과를 가지고 있는 치료적 전략이 필요하다. 이전의 투약에서 다양한 조직 내에 축적되는 결과를 보여주었고, 적용은 투여-의존 독성으로 제한되지 않기 때문에, 안테나페디아-P21 융합 단백질이 그런 효과를 가질 것이라 예상된다.
SEQUENCE LISTING <110> Trojan Technologies Limited <120> Conjugate Comprising P21 Protein for the Treatment of Cancer <130> JWJ01161WO <150> GB0507598.1 <151> 2005-04-14 <160> 6 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 163 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Glu Pro Ala Gly Asp Val Arg Gln Asn Pro Cys Gly Ser Lys Ala 1 5 10 15 Cys Arg Arg Leu Phe Gly Pro Val Asp Ser Glu Gln Leu Ser Arg Asp 20 25 30 Cys Asp Ala Leu Met Ala Gly Cys Ile Gln Glu Ala Arg Glu Arg Trp 35 40 45 Asn Phe Asp Phe Val Thr Glu Thr Pro Leu Glu Gly Asp Phe Ala Trp 50 55 60 Glu Arg Val Arg Gly Leu Gly Leu Pro Lys Leu Tyr Leu Pro Thr Gly 65 70 75 80 Pro Arg Arg Gly Arg Asp Glu Leu Gly Gly Gly Arg Arg Pro Gly Thr 85 90 95 Ser Pro Ala Leu Leu Gln Gly Thr Ala Glu Glu Asp His Val Asp Leu 100 105 110 Ser Leu Ser Cys Thr Leu Val Pro Arg Ser Gly Glu Gln Ala Glu Gly 115 120 125 Ser Pro Gly Gly Pro Gly Asp Ser Gln Gly Arg Lys Arg Arg Gln Thr 130 135 140 Ser Met Thr Asp Phe Tyr His Ser Lys Arg Arg Leu Ile Phe Ser Lys 145 150 155 160 Arg Lys Pro <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 2 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 3 <211> 60 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <400> 3 Arg Lys Arg Gly Arg Gln Thr Tyr Thr Arg Tyr Gln Thr Leu Glu Leu 1 5 10 15 Glu Lys Glu Phe His Phe Asn Arg Tyr Leu Thr Arg Arg Arg Arg Ile 20 25 30 Glu Ile Ala His Ala Leu Cys Leu Thr Glu Arg Gln Ile Lys Ile Trp 35 40 45 Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Glu Asn 50 55 60 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <400> 4 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> pAntp Helix 3 Variant; between 6 and 10 of the amino acid residues are hydrophobic. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (7)..(16) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 5 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> pAntp Helix 3 Variant; between 6 and 10 of the amino acid residues are hydrophobic. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (7)..(16) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 6 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15

Claims (13)

  1. 하기를 포함하는 컨쥬게이트:
    c) P21 단백질, 또는 동족체 또는 그것의 기능적 단편을 포함하는 제 1 영역; 그리고
    d) 전좌 인자를 포함하는 제 2 영역.
  2. 제 1항에 있어서, 전좌 인자가 안테나페디아의 호메오도메인 또는 동족체 또는 그것의 기능적 단편을 포함하는 컨쥬게이트.
  3. 제 1항에 있어서, 전좌 인자가 히스톤 단백질 또는 동족체 또는 그것의 기능적 단편을 포함하는 컨쥬게이트.
  4. 제 1항에 있어서, 전좌 인자가 TAT 단백질 또는 동족체 또는 그것의 기능적 단편을 포함하는 컨쥬게이트.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질 형태인 것인 컨쥬게이트.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 컨쥬게이트를 암호화하는 핵산.
  7. 제 6항의 핵산을 포함하고, 촉진자에게 기능적으로 연결된 발현 벡터.
  8. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 컨쥬게이트를 하나 이상의 약물과 결합하여 포함하는 조성물.
  9. 제 8항에 있어서, 약물은 화학요법제인 것인 조성물.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로 사용하기 위한 생성물.
  11. 암의 치료용 의약의 제조를 위한 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 한에 따른 생성물의 용도.
  12. 의약으로 사용하기 위한 P21 단백질 또는 동족체 또는 그것의 기능적 단편.
  13. 암의 치료용 의약의 제조를 위한 P21 단백질 또는 동족체 또는 기능적 단편의 용도.
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