CN101194017B - 用于癌症治疗的包含p21蛋白质的缀合物 - Google Patents

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Abstract

P21蛋白质被用作癌症治疗中的一种药剂。一种缀合物包括，一个包括P21蛋白质或者它的同系物或功能性片段的第一区域；和一个包括一个易位因子的第二区域。

Description

用于癌症治疗的包含P21蛋白质的缀合物
技术领域
本发明涉及P21蛋白质和包含P21蛋白质的缀合物和组合物。这些产物在癌症治疗中特别有用。
背景技术
癌症是人类死亡的主要原因之一，并且一直是被广泛研究的对象。众所周知，几乎所有的恶性肿瘤都源于单个的细胞转化成为不死状态，此时所述细胞失去控制增殖的能力。
不受控的增殖源于细胞周期控制方面的机能障碍，所述细胞周期在真核生物中主要是由细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)控制。控制细胞周期蛋白和CDK磷酸化状态的复杂机制控制着细胞周期蛋白/CDK复合体是否能够驱动细胞进入该周期的下一阶段。细胞周期蛋白/CDK复合体磷酸化状态的重要性可以通过大量癌症都涉及P53和P21肿瘤抑制蛋白的突变这一事实体现，所述P53和P21肿瘤抑制蛋白是调控细胞周期蛋白/CDK磷酸化和复合体形成的关键组分。特别是，P21可以阻断cycD/cdk4复合体形成并引起G1期停滞。对P21蛋白质及其生物学功能详细叙述的综述可以参看O′Reilly MA，Antioxid Redox Signal.2005 Jan-Feb；7(1-2)：108-18和Liu G&Lozano G，Cancer Cell.2005 Feb；7(2)：113-4。
癌症的治疗通常包括外科手术、放射疗法和化学疗法(包括免疫疗法)的综合使用。尽管最近几年在癌症治疗方面有显著的进步，但是在开发改进的疗法上仍然存在持续不断的需求。理想的癌症疗法可特异性地靶向并仅破坏癌细胞。
需要解决的另外一个问题是化学疗法产生的抗药性。持续的给予一种细胞毒性药物可能会导致起初对该药物敏感的肿瘤的抗药性逐渐增加，从而使所述药物失去治疗效果。因此也需要能提高癌细胞对药物敏感性的方法。
发明内容
本发明是基于P21蛋白质可用于癌症治疗这一发现。特别是，当P21蛋白质与至少一种用于癌症疗法的其他药剂一起给药时可以观察到协同效应。
根据本发明的第一方面，一种缀合物包括：
(a)一个第一区域，包括P21蛋白质或者它的同系物或功能性片段；和
(b)一个第二区域，包括一个易位因子。
根据本发明的第二方面，一种组合物包括一种缀合物，所述缀合物包括一个包含P21蛋白质或者它的同系物或功能性片段的第一区域，和一个包含一个易位因子的第二区域，以及至少一种药物。
根据本发明的第三方面，本发明一种缀合物或组合物可以被用作一种药物，特别用于癌症治疗。
根据本发明的第四方面，P21蛋白质或者它的同系物或功能性片段可以被用作一种药物，特别用于癌症治疗。
附图说明
参照下列附图对本发明加以描述，其中
图1示出向卵巢癌细胞系SKOV-3和骨肉瘤细胞系SAOS-2给予的触角/P21融合蛋白的细胞毒性，所述细胞系是在96孔ELISA板中生长的，所处条件类似于人体中的环境；
图2示出触角/P21融合蛋白对SKOV-3细胞的细胞毒性以及它与顺铂的协同效应；
图3示出触角/P21融合蛋白、顺铂和紫杉醇对SKOV-3的细胞毒性，表明所述触角/P21融合蛋白、顺铂和紫杉醇在组合使用时起到协同作用；
图4示出无肿瘤小鼠中纯化的放射标记的触角蛋白(4A)和触角-P21融合蛋白(4B)从血液中的清除；
图5示出触角蛋白(5A)和触角-P21融合蛋白(5B)的器官-血液比和蛋白质在各种器官中的蓄积；
图6示出在使用触角/P21融合蛋白时，肿瘤生长的下降；
图7为Kaplan-Meier存活曲线，所述曲线表明当接受的触角/P21融合蛋白的浓度最高时，小鼠的存活率最高；
图8证明当使用触角/P21融合蛋白、紫杉醇和顺铂时的体内协同效应。
图9示出接受触角/P21融合蛋白和化学疗法的小鼠的Kaplan-Meier存活曲线，显然同时接受所述融合蛋白和补充化学疗法的动物表现出最佳存活益处；
图10示出接受触角/P21融合物的小鼠和同时也接受顺铂和紫杉醇的动物的Kaplan-Meier存活曲线；和
图11显示接受触角/P21融合物和一种附加的化学疗法的小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。
具体实施方式
本发明使用P21蛋白质作为治疗药剂。所述P21蛋白质可被单独用作治疗药剂或与其他治疗药剂组合使用。当与其他药剂组合使用时，观察到意想不到的协同作用。在一个优选的实施方案中，所述P21蛋白质被附着到一个易位因子上，以使得所述P21蛋白质能够进入靶细胞。
在本发明之前，没有人意识到P21可广泛地用于癌症治疗中。大多数癌症是由P53基因的突变造成的，因此当设计癌症疗法时，P53基因是明显的和首选的目标。P21蛋白质在凋亡级联的更下游发挥作用，它没有被认为是一种治疗药剂。本发明绕过P53并允许直接送递活性P21进行癌症的治疗。
P21和一种化学治疗药物的给药会意想不到地改善抗癌疗法。
本文所用术语“蛋白质”是指一种聚合物分子，包括经由肽键连接的多个氨基酸残基，这是本领域技术人员熟知的。肽和多肽包含在术语“蛋白质”的含义之中。
人P21蛋白质在本文中被定义为SEQ ID NO.1。SEQ ID NO.1：SEPAGDVRQN PCGSKACRRL FGPVDSEQLSRDCDALMAGC IQEARERWNF DFVTETPLEG DFAWERVRGLGLPKLYLPTG PRRGRDELGG GRRPGTSPAL LQGTAEEDHVDLSLSCTLVP RSGEQAEGSP GGPGDSQGRK RRQTSMTDFYHSKRRLIFSK RKP
人P21序列的注释可在SWISSPORT数据库中找到，该序列原始注册号为P38936(录入名为CDN1A HUMAN)。虽然所述人的序列(SEQ ID NO.1)是优选的，但是根据本发明可以使用来自任何物种的P21蛋白质，例如小家鼠(Mus musculus)的蛋白质(SWISSPORT原始注册号为P39689)或家猫(Felis sivestris catus)(猫)蛋白质(SWISSPORT原始注册号为O19002)。编码P21蛋白质的多核苷酸也在本发明的范围之内。
人P21蛋白质(SEQ ID NO.1)的功能变体(即同系物)和片段也被包括在本发明之中。例如，与SEQ ID NO.1具有高度序列相似性水平(例如，超过60％、优选地超过70％、更优选地超过80％和最优选地超过90％，例如超过95％)的蛋白质在本发明的范围之内。术语“相似性”是本领域已知的。该术语是指氨基酸序列之间的比较，不但考虑在对应位置上相同的氨基酸，而且考虑在对应位置上功能相似的氨基酸。因此多肽序列之间的相似性除表明序列相似性之外，还表明功能的相似性。
氨基酸序列之间的相似性水平可以使用已知的方法来计算。用于确定相似性的可公开获得的基于计算机的方法包括BLASTP、BLASTN和FASTA程序，BLASTX程序可从NCBI获得，Gap程序可从Genetics Computer Group，Madison WI获得。本文涉及的相似性水平例如可用Gap程序确定，使用12的空位罚分(gap penalty)和4的空位长度罚分(gap length penalty)。
P21的变体或片段可以用例如定点突变等标准重组DNA技术来生成，对于本领域术技术人员来说，基于常规蛋白质技术这是显而易见的。P21蛋白质的片段或同系物应该保持天然P21蛋白质的功能，即应该是“功能性”片段或同系物。所述的必须保持的功能是用作肿瘤抑制蛋白和阻断cycD/CDK4复合体形成并且从而导致真核细胞G1期停滞的能力。细胞分裂和活力的测试是本领域公知的，例如可从美国威斯康辛的普洛麦格公司(Promega Corp.)获得的CellTiter 96
Figure 2006800207462_0
和CytoTox 96
Figure 2006800207462_1
测定。
在一个优选的实施方案中，将所述P21蛋白质与易位因子相连，形成缀合物。本文所用术语“缀合物”是指由易位因子和P21蛋白质形成的嵌合分子。所述缀合物因此是一种杂交分子，在天然形式下它们并不一起出现。优选地，缀合物的形成不会减弱所述P21蛋白质或易位因子起到其预期作用的能力或对其能力造成不利影响。
本文所用术语“易位”是指蛋白质穿过细胞膜的送递。对于本领域技术人员来说显而易见的是，需要易位因子来将P21蛋白质送递到靶细胞。本文所用术语“易位因子”是指具有跨细胞膜易位能力的任何部分，所述细胞膜即外细胞膜。当P21蛋白质在缀合物中与易位因子相连时，P21也会跨细胞膜易位。
所述易位因子优选是蛋白质。许多具有跨细胞膜易位能力的蛋白质是本领域已知的，包括组蛋白、单纯疱疹病毒VP22蛋白质和HIV tat结构域。I型HIV的tat蛋白质包括由两个外显子编码的86个氨基酸。起始的72个氨基酸由外显子1编码并且表现出完全的反式激活活性。这一区域中的一簇碱性氨基酸残基已知能够跨细胞膜易位。该簇包含在37-72位的氨基酸残基内，该簇在本发明的范围内。更具体地说，如Vives et al，J.Biol.Chem：272(1997)；25：pp16010-16017中所公开的，49-58位氨基酸是一个优选的易位因子，上述文献通过引用的方式纳入本说明书。HIV TAT的49-58位氨基酸在下面列出，为SEQ ID NO.2：
SEQ ID NO.2：RKKRRQRRR。
然而，1型HIV tat蛋白质的任何保留了跨细胞膜易位的能力的片段或同系物都在本发明的范围内。
具有易位能力的具体的氨基酸基序在WO03/002598中有记载，该文件通过引用的方式纳入本说明书中。根据本发明，优选地使用果蝇触角蛋白的同源结构域作为易位因子。也可以使用触角蛋白同源结构域的功能变体和同系物，只要它们保持有易位能力。WO-A-99/11809中给出了触角蛋白同源结构域易位因子的详尽描述，其内容通过引用的方式纳入本说明书。Antp基因的同源结构域示于SEQ ID No.3中。
SEQ ID NO.3：RKRGRQTYTR YQTLELEKEF HFNRYLTRRRRIEIAHALCL TERQIKIWFQ NRRMKWKKEN
为避免疑议，果蝇触角蛋白的氨基酸序列包含已知为同源结构域的约60个氨基酸的一个基序，所述基序具有用作易位因子的能力。该全长蛋白质、同源结构域或者(蛋白质或同源结构域的)保持易位能力的任何同系物或片段可在本发明中用作易位因子。一种同系物优选地包含与果蝇触角蛋白同源结构域具有高度(例如，超过60％、优选地超过70％、更优选地超过80％和最优选地超过90％，例如95％或更多)序列相似性的区域。
尽管果蝇同源结构域和全长触角蛋白是优选的，但是本领域技术人员应知道功能同系物可以源自任何生物。触角蛋白同系物已在大多数的多细胞生物体内被发现，并且非常保守。例如，人和果蝇同源结构域的区别仅是一个保守性氨基酸的置换。人工(例如利用定点突变)制备的同系物也在本发明的范围内。天然存在的序列或人工序列的跨膜易位能力可以用本领域公知的常规方法来测试。
保持了跨膜易位能力的同源结构域的变体已在本领域中被报道，并在本发明的范围内。例如CNRS的EP-B-0 485 578公开了包含pAntp第3螺旋序列的同源肽，这些内容通过引用的方式纳入本说明书中。
CNRS的WO97/12912公开了pAntp第3螺旋的真实序列及其变体。这些内容也通过引用的方式纳入本说明书中。具体而言，第3螺旋被认为具有序列：
SEQ ID NO.4：Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys
所述变体被认为具有序列：
SEQ ID NO.5：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16
或
SEQ ID NO.6：X16-X15-X14-X13-X12-X11-X10-X9-X8-X7-X6-X5-X4-X3-X2-X1
其中每个X代表一个α-氨基酸，X6代表色氨酸；所述肽包括6至10个疏水氨基酸。
其他变体公开于例如Gehring W(1987)Homeo Boxes in the Studyof Development.Science 236 1245-1252中公开了一种62氨基酸的同源结构域，即在0位为glu且在61位为lys。Bloch-Gallego E et al(1993)Antennapedia Homeobox Peptide Enhances Growth and Branching ofEmbryonic Chicken Motoneurons In Vitro.The Journal of Cell Biology120(2)485-492中公开了一种被称为pAntp40P2的突变体，所述突变体仍然能够易位穿越运动神经元膜并到达细胞核。在该突变体中，第40和41位的亮氨酸和苏氨酸残基被两个脯氨酸残基所替代。Le Rouxet al(1993)Neurotropic activity of the Antennapedia homeodomaindepends on its specific DNA-binding properties.Proc.Natl.Acad.Sci90 9120-9124公开了如图2所示的两种突变体pAntp 50A和pAntp40P2，所述变体保持了易位穿越神经元膜的能力。Schutze-Redelmeieret al(1996)supra公开了一个16氨基酸C末端(第3螺旋)区段被用于将寡核苷酸和寡肽运送至细胞培养物的细胞质和细胞核中。
以上列出的所有参考文献都通过引用的方式纳入本文。优选地，使用一种约60个残基的同源结构域。
优选地，P21蛋白质和易位因子为共价连接。该共价键可以为化学连接分子的形式。更优选地，P21蛋白质和易位因子被制成单个的融合蛋白。在该融合蛋白中，P21蛋白质和易位因子可以是按任何顺序的。优选地，易位因子位于P21蛋白质的氨基末端。采用标准的重组核酸工艺生产融合蛋白的方法是本领域公知的，如Sambrook et al，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring HarbourLaboratory Press)中所述，其内容通过引用的方式纳入本说明书中。编码融合蛋白的核酸在本发明的范围内，含有编码所述融合蛋白的核酸和至少一个启动子区域的表达载体也在本发明的范围内。
包含所述P21蛋白质和一个易位因子的缀合物可以被包括在一种组合物中，所述组合物还含有至少一种药物。优选地，所述药物用于癌症治疗。在一个优选的实施方案中，所述药物为一种化学治疗药物，例如顺铂和紫杉醇。然而，用于癌症治疗的其他药物也可以与本发明的缀合物并用，所述其他药物例如为消炎药、抗体(包括单克隆抗体)、免疫调节药、激素和激素拮抗剂、抗细菌药、抗真菌药和抗病毒药。非限制性实例在下面给出。
(1)细胞毒性药物/细胞抑制药：烷化剂类(例如环磷酰胺、美法仑等)、细胞毒性抗生素类(多柔比星、表柔比星、博来霉素、丝裂霉素等)、抗代谢药类(甲氨蝶呤、卡培他滨、吉西他滨、氟尿嘧啶、长春花生物碱和依托泊苷(长春碱、长春新碱等)、铂化合物类(卡铂、顺铂、奥沙利铂)、紫杉烷类(紫杉醇、多西他赛等)、拓扑异构酶I抑制剂类(伊立替康、托泊替康等)。
(2)免疫应答调节剂类：抗增殖免疫抑制剂类、皮质类固醇类。
(3)免疫调节药类：干扰素类、白细胞介素类。
(4)单克隆类：曲妥单抗(transtuzumab)、利妥昔单抗、阿仑单抗。
(5)抗细菌药物类：青霉素类、头孢菌素类、头霉素类、四环素类、大环内酯类、氨基糖甙类、其它抗细菌药类(氯霉素、夫西地酸、万古霉素等)。
(6)激素类：甲状腺激素类、雌激素类、孕酮类、雄激素类和所有它们的拮抗剂。
(7)其他：维生素类、非甾体抗炎药类(例如塞来考昔、罗非考昔等)、疫苗类、抗血清、抗真菌药类、抗病毒药类和甾族化合物类。
P21蛋白质或它的同系物或功能片段，或者如上所述的缀合物可用于治疗癌症。优选地，包含P21蛋白质或如上所述的缀合物以及其他药物的组合物被用于治疗癌症。
含有活性成份的药物组合物可以为任何适合的形式。优选地，P21蛋白质或缀合物为适于经皮给药或静脉内给药的形式。适合的可药用缓冲剂、赋形剂、稀释剂等也可以存在，这也应为本领域技术人员所理解。所述组合物可以为一种旨在用于直接给药到患病组织的形式或者可以为一种间接靶向患病组织的形式。
在上述病症的治疗中，每天每千克体重从约0.1mg至约25mg级别的剂量水平是有效的(每天每位患者约8mg至约2g)。例如通过每天每千克体重约0.25至12.5mg P21化合物的给药(每天每位患者约20mg至约1mg)，患者可被有效地治疗。
所述量的活性成份可与载体物质组合以制成单剂量形式，该量将根据治疗的主体和具体的给药方式而变化。剂量单位形式通常含有约1mg至约500mg的活性成份。
然而，应该理解的是，用于任何特定患者的具体剂量水平将取决于各种因素，所述因素包括所使用的具体化合物的活性、年龄、体重、总体健康水平、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄速率、药物并用和接受治疗的具体疾病的严重程度。
此外，P21化合物能够通过机械手段来送递到疾病部位，或者通过使用系统靶向技术来靶向到疾病部位，所述系统靶向技术例如脂质体(具有或不具有为它们提供对疾病组织的亲和性的化学修饰)、抗体、适体、凝集素或者化学配体，它们具有针对患病组织的某些特征的亲和性，所述患病组织特征在正常组织上不多或不存在。
本发明可通过以下实施例来进一步描述。
实施例1
构建细菌质粒克隆以用于P21蛋白质的单独表达或用于P21蛋白质和触角肽融合物的表达。ANTP-P21融合物(所述“融合蛋白”)的表达在诱导后三个小时达到最高水平，之后在变性条件下用盐酸胍和尿素进行蛋白质纯化。在复性和重折叠过程中，观察到蛋白质沉淀。这说明需要测试各种缓冲液。试验了五种缓冲液；20mM Tris-碱/0.5MNaCl/0.1％吐温-20(pH8)可以使蛋白质维持在溶液状态。
融合蛋白的生成使得细胞易位实验可以进行，从而能够测试含有触角蛋白的融合蛋白的跨生物膜易位能力。该实验中使用了两种细胞系即ASPC1和Hela(ASPC1-人胰腺癌、Hela-人宫颈腺癌)。在37℃下，将各种稀释度的所述蛋白在细胞上孵育10和60分钟。所述融合蛋白的易位在两种细胞系中都很明显，甚至在仅孵育10分钟后易位也很明显。单独的P21蛋白质没有出现跨细胞易位。在4℃下孵育之后，蛋白质的细胞内摄作用甚至也很明显，这显示了一种不涉及经典内吞作用的非能量依赖性的易位机制。
实施例2
融合蛋白的表达被放大以纯化出足够的物质来进行细胞毒性测定。将所述蛋白质在盐酸胍溶液而非Tris溶液中透析以防止它形成沉淀。被预料到的是，当被细胞吸收时，胞内二硫化物异构酶和陪伴分子会导致产生一种功能性蛋白质。将卵巢癌细胞系SKOV-3和骨肉瘤系SAOS-2在96孔ELISA板上培养，所处条件类似于人体内的环境(组织培养设备)。
将融合蛋白和单独的P21分别以50mg/ml的浓度给予细胞，持续24小时和48小时。对照包括未处理的细胞以给出本底细胞死亡；只加入盐酸胍的细胞；和用洗涤剂完全裂解的细胞以给出100％的细胞死亡。在24小时和48小时时终止实验并且评价平板上的凋亡性细胞死亡。结果表明在暴露很长一段时间之后，所用的缓冲液(盐酸胍)本身对细胞来说有细胞毒性。本底细胞死亡不考虑融合蛋白导致的任何细胞毒性的存在。因此，在重折叠之后，该蛋白在PBS缓冲液中透析，PBS缓冲液已知对细胞没有毒性。通过离心去除任何的沉淀物质。
然后将蛋白质加到细胞培养基中。如图1所示，给予融合蛋白后，在两个癌细胞系中观察到了显著的细胞死亡。
进行了针对细胞给药条件的优化实验。测试了给药持续时间，以及这种细胞毒剂(Antp-P21融合蛋白)与其他已知可杀死SKOV-3细胞的药剂的组合。本实验中用到的药剂为顺铂。该药通过在DNA中产生链内和链间交联来抑制DNA合成。蛋白质和RNA合成也有较小程度的抑制。结果表明两种治疗方式之间存在协同效应，并且这两种药物以相对低浓度同时存在时会产生惊人地增强的细胞毒性效应，所述浓度应模拟体内状况。
图2显示了能够明确证明Antp-P21分子杀伤能力以及它与杀伤药剂-顺铂的协同效应的数据集。
然后将该融合蛋白与顺铂和紫杉醇组合进行测试。紫杉醇可破坏微管系统内的动态平衡，并阻断处于细胞周期的G2末期和M期的细胞，从而抑制细胞复制。结果表明三种治疗方式之间存在协同效应，且这些药物与融合蛋白以较低浓度同时存在时会产生增强的细胞毒性效应。
图3中示出了能够证明融合蛋白杀伤能力以及它与其他杀伤药剂的协同效应的数据。当与细胞毒剂顺铂和紫杉醇共同孵育时，Antp-P21蛋白质导致细胞死亡增加。Antp-P21、顺铂和紫杉醇组合使用时起到了协同作用。
实施例3
测试了无肿瘤小鼠中纯化的、放射性标记的触角蛋白(单独)的动力学和生物分布。这可证明所述蛋白通过血液易位到身体的所有组织。图4A中显示结果的总结。
所述触角蛋白似乎具有快速的初始清除率，但是从循环系统中彻底清除需要超过15个小时。对于带正电荷的蛋白质来说，该行为是预料之中的。这段时间间隔应足够触角蛋白脱离血管并在组织中蓄积。在解剖出小鼠的全部器官和组织并且对其计数之后，计算出器官-血液比和各器官中所述蛋白质的蓄积；如图5A中所示。
所述蛋白质对任何特定类型的组织都没有亲和性。它似乎在高度血管化的组织中蓄积。
然后，测试了无肿瘤小鼠中纯化的、放射性标记的触角-P21融合蛋白的动力学和生物分布。结果在图4B和5B中示出。所述融合蛋白似乎具有快速的初始清除率，但是从循环系统中彻底清除需要超过17个小时(图4B)。该行为类似于单独测试触角蛋白时观察到的情况，并且是带正电荷蛋白质的预期结果。预计这段时间间隔应足够触角-P21融合蛋白脱离血管并在组织中蓄积。在解剖出小鼠的全部器官和组织并且对其计数后，我们能够计算出器官-血液比并绘制所述蛋白的生物分布图，如图5B中所示。
正如预料的，所述融合蛋白对任何特定类型的组织都没有亲和性。它似乎在高度血管化的组织中蓄积。通过抗蛋白质抗体(抗-HIS抗体-Qiagen)染色来进行的实验使我们可以在组织中定位该蛋白。这些免疫组织化学研究是在冰冻组织切片上进行的。
如表1所示，结果表明所述融合蛋白在主要器官中蓄积，并且以全长分子形式存在。在荷瘤小鼠体内，除了在实际的肿瘤中大量蓄积之外，所述分子的行为可能基本上保持不变。
器官     染色
肌肉结肠小肠脾肝心脑肺肾     +++++++++---
表1
然后，在荷瘤动物体内进行实验，所述实验显示了肿瘤中的蛋白质蓄积的最佳时间以及因此融合蛋白脱离血液循环进入邻近组织所消耗的时间。这一信息是设计包括重复剂量和每次给药之间的时间间隔的实验所需的。
放射性标记的融合蛋白以单剂量形式通过尾静脉给予至荷瘤小鼠，并且在各时间点检查肿瘤。结果证明肿瘤定位的最佳时间为给药后三小时。这段时间之后，染色强度以及因此的蛋白数量都会下降。结果被选择性地显示于下表中。
Figure S2006800207462D00121
表2
Figure S2006800207462D00122
表3
表4
Figure S2006800207462D00124
表5
然后测试了能够安全给予荷瘤小鼠的最大耐受剂量。通过静脉内和肿瘤内方式测试了三种不同浓度的融合蛋白以及对照。监测动物的痛苦和毒性征候，并记录肿瘤直径大小、小鼠体重和白细胞计数。2.5mg/ml的融合蛋白浓度被证明是能够被重复使用而不具毒性作用的最高剂量，并因此被用于后续的研究中。
使用具有SKOV3卵巢腺癌的异种移植物。触角-P21治疗的动物分在具有8只动物的大组中，该实验包括对照，例如8个接受盐水溶液的动物和8个仅接受递增剂量的触角蛋白的动物。每周进行6次注射。图6中所示的第0天为注射的第一天。
结果表明融合蛋白显示出最大的肿瘤延迟曲线。2.5mg/ml的融合蛋白浓度被证明是具有最大效力的剂量。当进一步分析结果时，确定了一条进一步支持我们的治疗药剂作用模式的存活曲线。当根据肿瘤大小将动物分组并且将具有小初始肿瘤和具有大初始肿瘤的动物分开观查时，发现在小肿瘤动物中的治疗效果高于在大肿瘤动物中的治疗效果。蛋白质的渗透和治疗效果在较小肿瘤中已经显示有提高。这一现象背后的原因是大肿瘤核心中的组织间隙压较高且其环境对非靶向分子来说更难渗透。因此，在具有较低组织间隙压的较小肿瘤中治疗效果更好。
这一理论得到了Kaplan-Meier数据的支持。如图7所示，对所有动物一起进行的分析可以得出以最高浓度接受融合蛋白的实验组具有明显的存活益处。
将传统的化学治疗药物顺铂和紫杉醇以标准的公开剂量加入到治疗方案中。在体外观察到了正效应。结果表明这三种治疗方式之间存在协同效应，且这些药物与融合蛋白以选定的浓度同时存在时会产生增强了的肿瘤生长迟滞效应，如图8所示。
接受了融合蛋白和化学疗法的动物的Kaplan-Meier存活曲线在图9中给出。很明显，同时接受融合蛋白和补充化学疗法的动物表现出了最佳的存活益处。
当将接受融合蛋白的动物的存活曲线与接受融合蛋白加补充化学疗法的动物的曲线比较时，如图10所示，显然，化学疗法的加入总是增加存活动物的百分比。这证明，体外的结果与体内观察到的情况具有良好的相关性。
实施例4
在对SKO-V3肿瘤的实验之后，在用结肠癌RKO-E6细胞异种移植的裸鼠中测试了融合蛋白触角-P21。这些细胞含有一种受巨细胞病毒(CMV)启动子控制的稳定整合的人乳头瘤病毒(HPV)E6癌基因。所述HPV E6癌基因会导致正常p53水平和功能下降，达到使该细胞系缺少足够的功能性p53的程度。
p53的缺乏会阻断下游p53介导的靶基因例如Cdk-抑制子P21的反式激活。P21的表达导致Rb磷酸化的抑制，并因此阻断E2F-依赖性基因的后续表达。
RKO-E6细胞系经常被应用于研究p53缺失对细胞参数的影响，所述细胞参数例如p53介导的转录和凋亡。在本文所述的实验中，它被用于研究P21给药对细胞的影响，因此绕过了对激活p53的需求。通过肿瘤细胞死亡和肿瘤尺寸减小来测定凋亡。
用RKO E6肿瘤对裸鼠进行异种移植，随机分成四组并通过尾静脉注射给予下述中的一种：
i.磷酸缓冲溶液(每周1次持续5周)
ii.2.5mg/ml触角-P21融合物(每周1次持续5周)
iii.2mg 5-氟尿嘧啶/1mg亚叶酸、0.2mg奥沙利铂(每周1次持续5周)
iv.2.5mg/ml触角-P21融合物+2mg 5-氟尿嘧啶/1mg亚叶酸、0.2mg奥沙利铂(每周1次持续5周)
按以前记录的剂量给予化学治疗药物以产生可测量的肿瘤的消减。评估肿瘤的消退情况，将肿瘤消退转而转换为存活益处。
结果在图11中出示。单独使用PBS、融合蛋白或化学疗法的治疗对整体存活情况几乎没有影响，所有组的存活中位数在30天的范围内。在用融合物和化学疗法治疗的动物中观察到了明显的存活率改善，其存活中位数为45天，这证明了协同性相互作用的存在。
由于大多数死于结肠直肠癌的患者是死于继发的全身性转移性疾病，因此需要对转移性疾病有效果的治疗策略，从而显著地作用于该癌症。所述触角-P21融合蛋白被期望具有这样的作用，因为触角-P21融合蛋白的给药已经在先前研究中被证明会产生在各个组织的蓄积，并且因为触角-P21融合蛋白的应用已经被证明不会被剂量依赖性毒性所限制。
序列表
<110>特洛伊科技有限公司
<120>用于癌症治疗的包括P21蛋白的缀合物
<130>JWJ01161WO
<150>GB0507598.1
<151>2005-04-14
<160>6
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>163
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
Ser Glu Pro Ala Gly Asp Val Arg Gln Asn Pro Cys Gly Ser Lys Ala
1               5                   10                  15
Cys Arg Arg Leu Phe Gly Pro Val Asp Ser Glu Gln Leu Ser Arg Asp
            20                  25                  30
Cys Asp Ala Leu Met Ala Gly Cys Ile Gln Glu Ala Arg Glu Arg Trp
        35                  40                  45
Asn Phe Asp Phe Val Thr Glu Thr Pro Leu Glu Gly Asp Phe Ala Trp
    50                  55                  60
Glu Arg Val Arg Gly Leu Gly Leu Pro Lys Leu Tyr Leu Pro Thr Gly
65                  70                  75                  80
Pro Arg Arg Gly Arg Asp Glu Leu Gly Gly Gly Arg Arg Pro Gly Thr
                85                  90                  95
Ser Pro Ala Leu Leu Gln Gly Thr Ala Glu Glu Asp His Val Asp Leu
            100                 105                 110
Ser Leu Ser Cys Thr Leu Val Pro Arg Ser Gly Glu Gln Ala Glu Gly
        115                 120                 125
Ser Pro Gly Gly Pro Gly Asp Ser Gln Gly Arg Lys Arg Arg Gln Thr
    130                 135                 140
Ser Met Thr Asp Phe Tyr His Ser Lys Arg Arg Leu Ile Phe Ser Lys
145                 150                 155                 160
Arg Lys Pro
<210>2
<211>9
<212>PRT
<213>人类免疫缺陷病毒
<400>2
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1               5
<210>3
<211>60
<212>PRT
<213>黑腹果蝇(Drosophila melamogaster)
<400>3
Arg Lys Arg Gly Arg Gln Thr Tyr Thr Arg Tyr Gln Thr Leu Glu Leu
1               5                   10                  15
Glu Lys Glu Phe His Phe Asn Arg Tyr Leu Thr Arg Arg Arg Arg Ile
            20                  25                  30
Glu Ile Ala His Ala Leu Cys Leu Thr Glu Arg Gln Ile Lys Ile Trp
        35                  40                  45
Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Glu Asn
    50                  55                  60
<210>4
<211>16
<212>PRT
<213>黑腹果蝇
<400>4
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1               5                   10                  15
<210>5
<211>16
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>pAntp第3螺旋变体；第6至10位的氨基酸残基是疏水的。
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(5)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(16)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400>5
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                   10                  15
<210>6
<211>16
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>pAntp第3螺旋变体；第6至10位的氨基酸残基是疏水的。
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(5)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(16)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400>6
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                   10                  15

Claims (6)

1.一种组合物，包括
（i）一种缀合物，包括
a）一个第一区域，所述第一区域是SEQ ID No.1；和
b）一个第二区域，所述第二区域是SEQ ID No.3，其中所述第一区域和所述第二区域形成嵌合蛋白质；和
（ii）一种化学治疗药物。
2.根据权利要求1的组合物，其中所述缀合物为一种融合蛋白形式。
3.根据权利要求1或2的组合物，所述组合物用作一种药剂。
4.根据权利要求1或2的组合物在制备用于癌症治疗的药剂中的应用。
5.根据权利要求1的组合物，其中所述化学治疗药物是细胞毒性药物或细胞抑制药物。
6.根据权利要求5的组合物，其中所述药物是顺铂或紫杉醇。
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