CN102993314B - 一种抗肿瘤融合蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤融合蛋白及其制备方法和用途，其氨基酸序列为SEQ.ID.NO:1所示。所述EFB的制备方法还是首先获得编码有上述融合蛋白的DNA。本发明所述药品制剂可用于治疗肾癌，胰腺癌，非小细胞肺癌，前列腺癌，卵巢癌，神经胶质瘤，头颈癌，乳腺癌、肺癌、胃癌、膀胧癌、前列腺癌、直肠结肠癌、子宫颈癌、和脑瘤等各种肿瘤。

Description

一种抗肿瘤融合蛋白及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及DNA重组技术和医药制药领域，具体地说是涉及与人表皮生长因子受体密切关联的一种抑肿瘤融合蛋白及其制备方法和用途。

背景技术

恶性肿瘤是威胁人类健康与生命的重大疾病之一，其发病率和死亡率逐年升高，而目前临床仍然缺乏非常有效的药物。近年来研究发现肿瘤的发生往往是由肿瘤细胞对凋亡抵抗所致，同时细胞凋亡机制发生异常。因此如何调控细胞凋亡成为了当今抗肿瘤药物研究中的重要课题。在细胞凋亡研究中人们发现，Bcl-2家族蛋白是细胞凋亡通路的关键蛋白分子。Bcl-2家族至少包含17个以上成员。按照其结构与功能上的不同，Bcl-2家族可以分为3组：①抗凋亡（antiapoptotic orprosurvival）家族，包括Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、Bcl-w和A1，它们均含有4个BH结构域（BH1-4）；②含有多个BH结构域促凋亡（pro-apoptotic）家族，包括Bax和Bak；③唯BH3域结构促凋亡家族，它们仅含有与Bcl-2同源的BH3结构域，包括Bad、Bid、Bik、Bim、Bmf、Hrk、Noxa、PUMA和Beclin-1。唯BH3结构域蛋白是凋亡作用的效应分子，其惟一的已知结构域BH3是其促凋亡功能的关键效应结构。抗凋亡Bcl-2家族蛋白和促凋亡Bcl-2蛋白家族成员之间发生失衡是引发肿瘤发生的重要原因和标志性事件。当Bcl-2抗凋亡家族蛋白在细胞中有过度表达时，使得细胞的凋亡过程受阻，从而导致肿瘤发生。随着细胞凋亡研究的深入，人们发现Bcl-2家族蛋白的BH3结构域在线粒体介导的细胞凋亡过程中亦发挥着重要的作用。Bcl-2家族促凋亡蛋白在细胞凋亡信号刺激下活化，其通过BH3结构域结合Bcl-2抗凋亡蛋白，由此形成二聚体，从而拮抗了抗凋亡蛋白的活性，由此促使肿瘤细胞凋亡。基于这些研究成果，许多小分子BH3模拟物如SAHB-BID,Cpm-1285，ABT-737,Obatoclax等多种肿瘤抑制剂已经进入临床前和临床试验阶段。实验表明，这类抑制剂可与某些抗凋亡蛋白相互作用，拮该抗凋亡蛋白功能。但是这类药物开发中也发现，仅抑制肿瘤细胞中一种或几种Bcl-2抗凋亡蛋白，其抗肿瘤效果并不十分理想。如ABT-737只能有效的结合Bcl-xL，Bcl-2和Bcl-w，并不能结合Mcl-1，这样就会导致肿瘤细胞对ABT-737产生抗性；反义核酸Genasense在联合化疗治疗多肿瘤时疗效欠佳。另外，也有研究表明，即使设计的分子BH3结构域模拟物如TW37可以所有类型的Bcl-2抗凋亡家族发生反应，其单独应用的疗效仍不尽如人意，因此，在应用时仍需与其他抑制剂协同用药。

目前，小分子BH-3模拟物类抑制剂还存在的问题有：（1）小分子BH-3模拟靶向特异性差，其不只会进入肿瘤细胞，同样也会进入到正常细胞内。（2）现有的BH3肽段细胞透过性以及生物利用度均较低，结构的可溶性和代谢的稳定性也有待进一步完善。

在肿瘤细胞学研究中人们还发现表皮生长因子受体（EGFR）在许多肿瘤细胞（胃癌、乳腺癌、膀胱癌和头颈部鳞癌）中都有过度表达。表皮生长因子受体EGFR正常情况下主要表达在表皮细胞和间充质细胞系，其配体包括EGF、TGFα、HB-EGF等。EGFR本身具有酪氨酶激酶活性，一旦与表皮生长因子（EGF）组合可启动细胞核内的有关基因，从而促进细胞分裂增殖。当EGFR过度表达时，常常会导致肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移及抗凋亡。EGFR过度表达常常预示着无病生存期和总生存期下降、复发及远处转移的风险增加。因此，针对EGFR靶向治疗，阻断EGFR信号传导通路，亦是抗肿瘤药物研究的重要方向之一。目前，有研究人员将抗EGFR抗体或EGF与强效的细胞毒素如白喉毒素、蓖麻毒素和天花粉蛋白藕联后与EGFR结合，由此诱导细胞凋亡。也有研究人员通过细胞杀伤因子、放射性粒子等来选择性杀死富含EGFR肿瘤细胞。但这些方法的靶向特异性尚待进一步改善。

本发明的目的有以下几个方面：

第一是提供一种具有双靶向、特异性好、并可有效抑制肿瘤细胞的抗肿瘤融合蛋白；

第二是提供一种编码有所述抗癌融合蛋白的DNA；

第三是提供一种含有所述抗癌融合蛋白DNA的载体；

第四是提供所述抗肿瘤融合蛋白在制备抑制肿瘤药物中的应用；

第五是提供一种含有所述抗肿瘤融合蛋白的药物组合物。

第六是提供一种制备所述抗肿瘤融合蛋白的方法。

本发明的第一方面通过以下方式实现的：

本发明所提供的抗肿瘤融合蛋白的名称为抗肿瘤融合蛋白EFB（简称EFB），其氨基酸序列为SEQ.ID.NO:1所示。其包括有：

a、EGF氨基酸序列；

b、BID含BH3结构域的蛋白的部分或者全长氨基酸序列；

c、EGF氨基酸序列与含BH3结构域的蛋白的部分或者全长氨基酸序列选用Furin敏感位点连接。

本发明可在不改变EGF进入细胞功能的情况下，添加不同的氨基酸序列使得它有不同的细胞定位如定位到内质网，线粒体，溶酶体囊泡等。

本发明所述含BH3结构域的蛋白为Bcl-2促凋亡家族中的Bid。

本发明是将EGF基因与含BH3结构域的蛋白基因通过连接肽（绿脓杆菌外毒素A(TRHRQPRGWE,Fpe)）进行融合的。由此构成兼具EGF、BH3结构域两者生物功能的融合蛋白。其中EGF与BH3结构域也可以直接连接。

本发明所述EFB可通过基因重组技术获得，即首先获得编码有上述融合蛋白的DNA。 DNA的获得可以通过常规技术，如PCR合成，化学合成等方法，使用酶切的技术被克隆到载体中。所用载体可以是分子生物学所常用的质粒、病毒或DNA片断。载体序列中包含适合重组蛋白表达的所有原件如驱动基因表达的增强子和启动子，蛋白质翻译起始和终止信号，以及多聚腺苷酸序列等表达原件。载体中有抗菌素抗性基因以利于质粒在细菌中所繁殖。另外，载体中还包括真核细胞选择性基因用于稳定转染细胞株的选择。

在完成上列各种融合蛋白的质粒构建以后，即可用质粒DNA转染细胞，表达相应的蛋白质。能够用于表达这些融合蛋白的表达系统有多种，它们包括(但不限于)哺乳动物细胞，细菌，酵母，昆虫细胞，等等。编码重组蛋白的质粒可经转染((transfection)进入细胞。转染细胞的方法有多种，其中包括(但不限于):电转(electroporation)，脂质体(liposome)介导，钙介导，等等。

本发明所述EFB进行拼接时，连接肽的设计可按照本领域中的常规方法进行设计（如参见Hudson PJ,Recombinant antibody fragments.Current Opinion in Biotechnology，1998,3:279-299.Gary Thomas.Furin at the cutting edge:From protein traffic to embryogenesis anddisease.Nat Rev Mol Cell Biol.2002,3(10):753–766）。

本发明第二方面通过以下方式实现：：

编码有本发明所述抗肿瘤融合蛋白的DNA，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO:2所示。

该编码DNA可以化学合成，也可以通过常规技术的PCR扩增、酶切被克隆到载体中。

本发明第三方面通过以下方式实现：

本发明所提供的抗肿瘤载体pET-28a(+)-EFB，含有编码有本发明所述抗癌融合蛋白的DNA。

即采用常规的PCR扩增、酶切技术将所述编码DNA克隆到载体中。所述载体可以是分子生物学所常用的质粒、病毒或DNA片断。载体序列中包含适合重组蛋白表达的所有原件如驱动基因表达的增强子和启动子，蛋白质翻译起始和终止信号，以及多聚腺苷酸序列等表达原件。载体中有抗菌素抗性基因以利于质粒在细菌中所繁殖。另外，载体中还包括真核细胞选择性基因用于稳定转染细胞株的选择。

本发明所述EFB，其EGF基因和含BH3结构域的蛋白基因的排列可以为EGF在重组蛋白的N端，BH3结构域的蛋白基因在重组蛋白的C端；也可以是BH3结构域的蛋白基因在重组蛋白的N端，EGF基因在重组蛋白的C端。

本发明所述的抗肿瘤融合蛋白，还可以是具有序列表中序列的氨基酸残基序列或将序列的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列的氨基酸残基序列相同活性的由序列衍生的蛋白质。

为了进一步提高本发明所述抗肿瘤融合蛋白的溶解性，可将糖或脂质（如胆固醇或其它类脂）加入到本发明所述抗肿瘤融合蛋白。如将亲脂性的糖或脂质部分可以链接到的氨基酸侧链，特别是具有羟基和氨基的基团的侧链的。

本发明第四方面通过以下方式实现：

所提供的所述抗肿瘤融合蛋白EFB用于制备抑制肿瘤药物。

即以本发明所述抗肿瘤融合蛋白EFB为活性成分，与药学可接受载体，按照制药领域的常规技术起制备成各种药品制剂，尤其是特别适合于静脉注射给药、腹腔注射、皮下注射的药品制剂。

本发明第五方面提供一种抗肿瘤药物组合物，是以所述抗肿瘤融合蛋白EFB为活性成分，同时含有至少一种药学上可接受的载体、辅料或赋形剂。

本发明中所述的“药学上可接受的载体、辅料或赋形剂”是指可以与本发明所述抗肿瘤融合蛋白一起施用给患者的任何载体或辅料，它们不破坏本发明抗肿瘤融合蛋白的药理活性。

应用本发明药物组合物中的可药用载体、辅料和载体包括但不限于卵磷脂，半乳化药物递送系统(SEDDS)例如dα一生育酚聚乙二醇1000琥珀酸盐；在药物剂型中使用的表面活性剂例如吐温或其它类似聚合递送基质；缓冲物质例如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钟，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质例如硫酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐，胶态二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，基于纤维素的物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡，聚乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，聚乙二醇和羊毛脂。也可以使用环糊精例如α-环糊精、β-环糊精、和γ-环糊精，或化学修饰的衍生物例如是羟基烷基环糊精，包括2-和3-羟基丙基-β-环糊精、或其它增溶衍生物来促进本发明抗肿瘤融合蛋白的递送。

本发明所述药品制剂可用于治疗肾癌，胰腺癌，非小细胞肺癌，前列腺癌，卵巢癌，神经胶质瘤，头颈癌，乳腺癌、肺癌、胃癌、膀胧癌、前列腺癌、直肠结肠癌、子宫颈癌、和脑瘤等各种肿瘤。

本发明所述药品制剂的用量可根据临床的需要、具体疾病、患者体重、病情、病程、临床医生的经验而定，作为指导，可以按照每次给药0.1mg-3000mg，优选lmg-2000mg，可以每日、每2日、每3日、每4日、每5日、每6日、每周、每两周、每三周等给药一次，或者每日给药一次以上。

本发明第六方面提供的抗肿瘤融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

a、抗肿瘤融合蛋白融合基因的构建：

按照常规化学合成法，合成SEQ.ID.NO:2所示抗肿瘤融合蛋白EFB基因序列，其中包括

EGF、furin酶切位点和BH3结构区域，所得的序列经过大肠杆菌密码子优化，以适合在大肠杆菌中表达；

b、原核表达载体pET-28a(+)-EFB的构建与鉴定；

设计引物：使用常规PCR方法得到含有EcoRI和XhoI酶切位点的基因产物；使用限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切分别酶切PCR产物和pET-28a，回收后连接，测序鉴定；经鉴定的重组载体，使用分子克隆的常规方法转化感受态Rosset DE3，得到含有重组质粒pET-28a(+)-EFB的菌株；

c、抗肿瘤融合蛋白EFB的收集、纯化：

用IPTG诱导表达蛋白，使用NI⁺柱和脱盐柱纯化，最后使用SDS-PAGE鉴定。

本发明中b步所述的设计引物更具体的方法包括：

设计EFB正向引物5'-CGGAATTCATGAACTCTGACTCTGA-3'和反向引物5'-AAACTCGAGAGCAGAGAACGAACGTAGG-3'，使用下面的体系扩增EFB基因，

PCR反应体系

所述正向引物的浓度为50uM，所述反向引物的浓度为50uM，所述模版的浓度为20ng/1ul。

本发明c步所述EFB的收集、纯化优选以下方法：

1）刮取冻存的菌液或新鲜的含有EFB的单菌落加入到含有卡那霉素100ug的5ml LB培养液中，37℃摇床250-300r/min，培养过夜；

2）各取5ml过夜培养的菌液，分别加入到含有卡那霉素1mg、50ml LB培养液的三角瓶中培养，37℃摇床培养到OD600值为0.6；

3）当菌液OD600值达到0.6时，加入IPTG终浓度为2mM，20℃，诱导2-3h；收集菌体：4℃，4000g，离心收集菌体；

4）用3ml的PBS重悬菌体，并加入1%蛋白酶抑制剂PMSF，加入0.02g的溶菌酶，混匀，冰上搅拌、放置1h；超声破碎菌体；4℃，12000转/分离心10分钟，收集上清；

5)将NTA树脂装入层析柱，层析用10倍NTA体积的NTA-0Buffer洗涤填料；

6)将上清样品加至NTA层析柱中，流速在15ml/h左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况；

7)层析用NTA-0Buffer洗涤填料，流速控制在30ml/h左右；

8)用PD10柱子脱盐；

9)经纯化的的蛋白经SDS-PAGE检测，得到纯化的EFB。

本发明还提供一种宿主细胞，该宿主细胞中含有克隆有抗肿瘤融合蛋白的载体。这些细胞选自真核细胞或原核细胞，可用于本发明所述EFB的表达。

本发明所提供的抗肿瘤融合蛋白EFB，既可以与表皮生长因子受体（EGFR结合，又可通过BH3结构域结合Bcl-2抗凋亡蛋白，因此是一个具有双靶向、且特异性更高的融合蛋白分子。

实验表明，本发明提供的抗肿瘤融合蛋白EFB只特异地杀伤具有EGFR、HER2、HER3或HER4的细胞，对其他正常人体组织细胞无伤害。

动物实验表明，本发明所提供的抗肿瘤融合蛋白EFB在较低浓度下即能在体外对多种人表皮生长因子受体（EGFR）阳性肿瘤细胞有明显的杀伤作用，对体内移植的实体瘤亦有显著的抑制。

附图说明

图1是pET-28a(+)-EFB的酶切鉴定电泳图谱，其中1，2泳道为pET-28a(+)-EFB EcoRI和XhoI酶切后鉴定M：2000bp marker（琼脂糖凝胶浓度1%）

图2是EFB纯化蛋白的SDS-PAGE分析图，其中1为Rosset DE3诱导前蛋白分析；2为IPTG诱导后蛋白分析；3为纯化脱盐后蛋白分析（SDS-PAGE胶浓度15%）。

具体实施方式

以下实例对本发明所涉及的融合蛋白构建，试验和应用作了详细说明。但是本发明的内容及用途并不限制于实例的范围。

实施例1EFB的制备：

a、抗肿瘤融合蛋白融合基因的构建：

使用常规化学合成方法获得编码抗肿瘤融合蛋白EFB的基因序列（SEQ.ID.NO:2），其中包括EGF，furin酶切位点，和Bid中包含BH3的序列，所得的序列经过大肠杆菌密码子优化，以适合在大肠杆菌中表达。

b、原核表达载体pET-28a(+)-EFB的构建与鉴定；

1）引物设计设计EFB正向引物5'-CGGAATTCATGAACTCTGACTCTGA-3'和反向引物

5'-AAACTCGAGAGCAGAGAACGAACGTAGG-3'，使用下面的体系扩增EFB基因。

PCR反应体系

2）使用限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切分别酶切PCR产物和pET-28a，回收后连接，测序鉴定（见图1）。

4）经鉴定的重组载体，使用分子克隆的常规方法转化感受态Rosset DE3，得到含有重组质粒pET-28a(+)-EFB的菌株。

c、EFB的收集、纯化：

1）用灭过菌的枪头刮取冻存的菌液或新鲜的含有重组基因的单菌落加入到有含有卡那霉素100ug的5ml LB培养液中，37℃摇床250-300r/min，培养过夜。

2）次日，各取5ml过夜培养的菌液，分别加入到含有含有卡那霉素1mg的250ml三角瓶50ml LB培养液培养，37℃摇床培养到OD600值为0.6左右

3）当菌液OD600值达到0.6时，加入IPTG终浓度为2mM，20℃，诱导2-3h。收集菌体：4℃，4000g，离心收集菌体，尽量去除干净。

4）用3ml的PBS（pH8.0）重悬菌体，并加入1%蛋白酶抑制剂PMSF，加入0.02g的溶菌酶，混匀，冰上放置1h，并不时的轻轻搅拌。

5）超声破碎菌体：超声时间6s，间隔时间10s，超声20次，10次后停3min后再超声10次，超声功率200W。4℃，12000转/分离心10分钟，收集上清。

6)将NTA树脂装入层析柱，层析用10倍NTA体积的NTA-0Buffer平衡填料。

7)将上清样品加至NTA层析柱中，流速在15ml/h左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况。

8)层析用5倍NTA体积的NTA-0Buffer洗涤填料，流速控制在30ml/h左右。

9)PD10柱子脱盐(按Amersham脱盐柱说明进行操作)。

10)经纯化的的蛋白经SDS-PAGE检测，可以发现得到纯化的22kD的EFB（见图2）。测序鉴定，其氨基酸序列同SEQ.ID.NO:1所示。

实施例2、EFB对癌细胞的作用

（1）用胰蛋白酶消化汇合的单层肿瘤乳腺癌细胞(MCF-7)、人结直肠腺癌细胞(SW480)、人基底细胞癌A431和人多形性胶质母细胞瘤细胞株BT325，人非小细胞肺癌A549， 乳腺癌MDA-MB-231，人宫颈癌细胞HeLa，食管癌细胞系TE1等，将细胞收集到含血清的1640培养基中。

（2）离心细胞悬液，使细胞沉积下来。用培养基重悬细胞，计数。

（3）将细胞稀释至2.5×10³-5×10⁴个/ml，每个微滴定板可容纳100ul细胞重悬液。

4）用培养基将EFB2倍系列稀释，共制备5个浓度2.5nM，5nM，10nM，20nM，40nM。

（5）在生长期末，每孔中各加入100μl新鲜的培养基，在所有孔中各加入50μl MTT。

（6）用铝箔包裹培养板，于37℃湿润环境中温育4h。

（7）弃去孔中的培养基和MTT，所有孔中各加入200μl DMSO

（8）立即在570nm处记录吸光值。使用含培养基和MTT但不含细胞的各孔调零。

（9）使用SPSS软件计算IC₅₀

以EGF为对照，用EFB分别对乳腺癌(MCF-7)、人结直肠腺癌细胞(SW480)、人基底细胞癌A431和人多形性胶质母细胞瘤细胞株BT325，人非小细胞肺癌A549，乳腺癌MDA-MB-231，人宫颈癌细胞HeLa食管癌细胞系TE1等八株肿瘤细胞做量效关系试验，融合蛋白的IC₅₀(ng/ml)分别是16.5nM，18.4nM，12.7nM，8.9nM，12.6nM，14.7nM，25.7nM，23.8nM。由此可见，本发明对多种肿瘤细胞均有良好的抑制作用。

实施例3EFB有效地抑制小鼠肿瘤的生长的比较研究。

选用10只生长良好的裸鼠，每只背部注射人基底细胞癌A4311X10⁵,0.05m1，再尾静脉分别注射提纯的EFB2mg/kg,，4mg/kg，8mg/kg每周两次，到31天。对照组注射相同剂量的PBS。EFB对肿瘤具有非常显著的治疗作用，到第35天，对照组肿瘤体积是1200±212.3，而EFB（8mg/kg）高剂量组肿瘤体积是136.6±67.4mm³，抑制率为88.2%；EFB（4mg/kg）中剂量组肿瘤体积是424.5±86.7mm³，抑制率为64.7%；EFB（2mg/kg）低剂量组肿瘤体积是613.4±78.6mm³，抑制率为48.9%。无论是低剂量还是高剂量都与对照组PBS相比都能显著抑制肿瘤的生长（P<0.01）。见表1。

综上所述，本发明所述EFB能在体内非常显著抑制肿瘤的生长，可用于多种肿瘤的治疗。

表1融合蛋白对人基底细胞癌的抑制作用

组别	剂量	动物数	瘤体积mm3	抑瘤率(%)	P
						PBS	安慰剂	12	1200±212.3
EFB	2mg/kg	12	613.4±78.6	48.9%	<0.01
							4mg/kg	12	424.5±86.7	64.7%	<0.01
	8mg/kg	12	136.6±67.4	88.2%	<0.01

SEQ.ID.NO:1、SEQ.ID.NO:2如下：

序列表

<110>河北大学

<120>一种抗肿瘤融合蛋白及其制备方法和用途

<130>

<160>2

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>199

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

Met Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu

1 5 10 15

His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Gly Ala

20 25 30

Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu

35 40 45

Lys Trp Trp Glu Leu Arg Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu

50 55 60

Gly Asn Arg Ser Ser His Ser Arg Leu Gly ArgIle Glu Ala Asp Ser

65 70 75 80

Glu Ser Gln Glu Asp Ile Ile Arg Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gln

85 90 95

Val Gly Asp Ser Met Asp Arg Ser Ile Pro Pro Gly Leu Val Asn Gly

100 105 110

Leu Ala Leu Gln Leu Arg Asn Thr Ser Arg Ser Glu Glu Asp Arg Asn

115 120 125

Arg Asp Leu Ala Thr Ala Leu Glu Gln Leu Leu Gln Ala Tyr Pro Arg

130 135 140

Asp Met Glu Lys Glu Lys Thr Met Leu Val Leu Ala Leu Leu Leu Ala

145 150 155 160

Lys Lys Val Ala Ser His Thr Pro Ser Leu Leu Arg Asp Val Phe His

165 170 175

Thr Thr Val Asn Phe Ile Asn Gln Ala Arg Asn Gly Met Asp Asn Leu

180 185 190

Arg Thr Tyr Val Arg Ser Leu

195

<210>2

<211>600

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

atgaactctg actctgaatg cccgctgtct cacgacggtt actgcctgca cgacggtgtt 60

tgcatgtaca tcgaagctct ggacaaatac ggtgcttgca actgcgttgt tggttacatc 120

gaacgttgcc agtaccgtga cctgaaatgg tgggaactgc gtacccgtca ccgtcagccg 180

cgtggttggg aaatggactg cgaagttaac aacggttctt ctctgatcga agctgactct 240

gaatctcagg aagacatcat ccgtaacatc gctcgtcacc tggctcaggt tggtgactct 300

atggaccgtt ctatcccgcc gggtctggtt aacggtctgg ctctgcagct gcgtaacacc 360

tctcgttctg aagaagaccg taaccgtgac ctggctaccg ctctggaaca gctgctgcag 420

gcttacccgc gtgacatgga aaaagaaaaa accatgctgg ttctggctct gctgctggct 480

aaaaaagttg cttctcacac cccgtctctg ctgcgtgacg ttttccacac caccgttaac 540

ttcatcaacc aggctcgtaa cggtatggac aacctgcgta cctacgttcg ttctctgtag 600

Claims (7)

1.一种抗肿瘤融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ.ID.NO:1所示。

2.编码有权利要求1所述抗肿瘤融合蛋白的DNA，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO:2所示。

3.一种抗肿瘤载体，其特征在于它含有权利要求2所述DNA。

4.权利要求1所述抗肿瘤融合蛋白在制备抑制肿瘤药物中的应用。

5.一种抑制肿瘤药物组合物，其以权利要求1所述抗肿瘤融合蛋白为活性成分，同时含有至少一种药学上可接受的载体、辅料或赋形剂。

6.一种抗肿瘤融合蛋白的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：

a、抗肿瘤融合蛋白融合基因的构建：

按照常规化学合成法，合成SEQ.ID.NO:2所示抗肿瘤融合蛋白EFB基因序列，其中包括EGF、furin酶切位点和BH3结构区域，所得的序列经过大肠杆菌密码子优化，以适合在大肠杆菌中表达；

b、原核表达载体pET-28a(+)-EFB的构建与鉴定：

设计引物，使用常规PCR方法得到含有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的基因产物：设计EFB正向引物5'-CGGAATTCATGAACTCTGACTCTGA-3'和反向引物5'-AAACTCGAGAGCAGAGAACGAACGTAGG-3'，使用下面的体系扩增EFB基因：PCR反应体系

所述正向引物的浓度为50uM，所述反向引物的浓度为50uM，所述模版的浓度为20ng/1ul；使用限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切分别酶切PCR产物和pET-28a，回收后连接，测序鉴定；经鉴定的重组载体，使用分子克隆的常规方法转化感受态Rosset DE3，得到含有重组质粒pET-28a(+)-EFB的菌株；

c、抗肿瘤融合蛋白EFB的收集、纯化：

IPTG诱导表达蛋白，使用NI+柱和脱盐柱纯化，最后使用SDS-PAGE鉴定。

7.根据权利要求6所述的抗肿瘤融合蛋白的制备方法，其特征在于c步所述的EFB的收集、纯化包括：

1)刮取冻存的菌液或新鲜的含有EFB的单菌落加入到有含有卡那霉素100ug的5ml LB培养液中，37℃摇床250-300r/min，培养过夜；

2)各取5ml过夜培养的菌液，分别加入到含有卡那霉素1mg、50ml LB培养液的三角瓶中培养，37℃摇床培养到OD600值为0.6；

3)当菌液OD600值达到0.6时，加入IPTG终浓度为2mM，20℃，诱导2-3h；收集菌体：4℃，4000g，离心收集菌体；

4)用3ml的PBS重悬菌体，并加入1%蛋白酶抑制剂PMSF，加入0.02g的溶菌酶，混匀，冰上搅拌、放置1h；超声破碎菌体；4℃，12000转/分离心10分钟，收集上清；

5)将NTA树脂装入层析柱，层析用10倍NTA体积的NTA-0Buffer洗涤填料；

6)将上清样品加至NTA层析柱中，流速在15ml/h左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况；

7)层析用NTA-0Buffer洗涤填料，流速控制在30ml/h左右；

8)用PD10柱子脱盐；

9)经纯化的的蛋白经SDS-PAGE检测，得到纯化的EFB。

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