CN102238965A - 选择性抗癌嵌合肽 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供一种可用作抗癌剂或DDS的物质，该物质具有细胞内稳定性，该物质针对正常细胞能避免副作用以免功能紊乱，或者该物质具有瞬时效应。本发明人研究开发了一种新颖的嵌合肽，该嵌合肽通过结合肽序列(例如与EGFR结合的肽序列)和溶解肽序列靶向过表达EGFR或诸如此类的癌细胞，从而达到此目的。具体而言，通过使用包括EGF受体结合肽或诸如此类以及细胞毒素肽的嵌合肽，从而达到此目的。

Description

选择性抗癌嵌合肽
相关申请的交叉引用
本申请要求2008年12月5日提出的日本专利申请号2008-309176和2009年6月9日提出的日本专利申请号2009-138279的优先权，这些申请的全部内容以引用方式并入本文内容中。
技术领域
本发明涉及肽毒素，一种新颖的靶向治疗剂。
背景技术
业内对针对可用作抗癌药的一种免疫毒素进行了广泛的研究，这种免疫毒素中，抗癌细胞表面过表达蛋白的单克隆抗体或配体与植物毒素或细菌毒素偶联(非专利文件1)。在临床前期和临床试验中对多种免疫毒素进行了实验，且白介素-2-白喉(interleukin-2-diphteria)毒素(IL2-DT；OntakTM)已得到批准用于治疗慢性T淋巴细胞白血病(Chronic T Cell Lymphocytic Leukemia，CLL)(非专利文件2，非专利文件3)。此外，基于包括白介素-4-绿脓杆菌(interleukin-4-Pseudomonas)外毒素(IL4(38-37)-PE38KDEL)和白介素-13-绿脓杆菌(interleukin-13-Pseudomonas)外毒素(IL13-PE38QQR)的绿脓杆菌外毒素的免疫毒素已在临床试验中进行了实验(非专利文件4，非专利文件5)。白喉毒素与绿脓杆菌外毒素二者都在摄取进入溶酶体、激活并转运进入胞质后，通过催化使核糖体复合物中的延伸因子2(elongation factor 2)蛋白失活而起作用。此作用机制使得免疫毒素有效地破坏休眠、非复制型的肿瘤细胞。
尽管针对癌症使用基于细菌毒素的免疫毒素的靶向方法有极大吸引力，但其使用限制在于由细菌毒素导致的肝毒性和由毒素蛋白造成的免疫原性(非专利文件2，非专利文件4，非专利文件6)。此外，免疫毒素的分子大小与化学化合物或片段抗体药物相比通常较大，此可能妨碍药物有效地渗透到人体内的肿瘤中。为了解决这些问题，迫切需要采用改进方法的新一代免疫毒素。
多年以来，表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)已成为重要的肿瘤特异性靶点(非专利文件7，非专利文件8)。EGFR在细胞生长、分化和迁移中扮演着重要的角色。发现其正向信号可使增殖增加、凋亡减少，并且提高肿瘤细胞的迁移和血管新生(非专利文件9)。EGFR过表达常见于广谱上皮源性的人类肿瘤中，包括乳腺癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌和卵巢癌(非专利文件10)。所有这些发现都表明，EGFR作为靶点对于受体介导的药物递送系统是重要的。近来，若干研究报导，通过筛选噬菌体展示库可成功鉴定EGFR的肽配体，这暗示了可能的靶向EGFR的药物递送(非专利文件11，非专利文件12)。
治疗性肽在多种应用中的使用越来越受欢迎(例如，肿瘤疫苗(非专利文件13)、抗菌疗法(非专利文件14)和核酸给药(非专利文件15))(非专利文件16)。此外，业内已着手关于涉及肽类药物的癌症新疗法的研究与开发(非专利文件17，非专利文件18)。业内也公知，借助重组体或固相化学合成技术，可相对容易地发生肽治疗，且与基于抗体的治疗相比时成本较低。近年来，已报导，由含有D-和L-型亮氨酸和赖氨酸的15-氨基酸非对映异构序列组成的新溶解型肽可破坏质膜(非专利文件19)。与正常细胞相比，这种肽更容易杀伤肿瘤细胞，且以类似去垢剂的方式使细胞膜解体。这种细胞选择性很可能是主要通过癌细胞壁上酸性成分或磷脂酰丝氨酸的水平增加决定的(非专利文件19)。非对映异构序列在血清中且在蛋白水解酶存在下都保持活性(非专利文件20)。表明，肽的选择性很可能主要受癌细胞壁上酸性成分或磷脂酰丝氨酸的水平增加影响(非专利文件19)。这种溶解肽在正常细胞与癌细胞之间具有选择性细胞毒性，但仍以较低的浓度杀伤正常细胞，因而不适合与具有靶向部分的肽组合。而且，文件17、19和20中所报道的肽不适于分子靶向，因为未观察到通过EGFR靶向作用的细胞杀伤效应提高。
多种潜在的分子靶向抗癌上市药物都抑制受体酪氨酸激酶(receptortyrosine kinase)和肿瘤生长。在某些情况下，癌细胞中与激酶有关的信号分子基因的突变导致对酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine Kinase Inhibitor，TKI)药物产生耐药性。近来，研究人员发现k-ras突变明显与患有非小细胞肺癌和晚期结直肠癌的患者体内缺少对表皮生长因子受体的(EGFR)TKI和西妥昔(cetuximab)的响应有关(非专利文件21)。为了解决这个关键问题，业内需要开发研究直接杀伤癌细胞的新颖的分子靶向抗癌药物，该抗癌药物优于信号通路阻断剂。
[现有技术文件]
[非专利文件]
非专利文件1：Pastan I.Targeted therapy of cancer with recombinantimmunotoxins.Biochim Biophys Acta 1997；1333：C1-6
非专利文件2：Kawakami K，Nakajima O，Morishita R，Nagai R.Targetedanticancer immunotoxins and cytotoxic agents with direct killing moieties.The SciWorld J 2006；6：781-90
非专利文件3：Kreitman RJ.Immunotoxins for targeted cancer therapy.AAPSJ 2006；8：E532-51
非专利文件4：Rand RW，Kreitman RJ，Patronas N，Varricchio F，Pastan I，PuriRK.Intratumoral administration of recombinant circularly permutedinterleukin-4-Pseudomonas exotoxin in patients with high-grade glioma.Clin CancerRes 2000；6：2157-65
非专利文件5：Kunwar S，Prados MD，Chang SM等人，Cintredekin BesudotoxIntraparenchymal Study Group.Direct intracerebral delivery of cintredekinbesudotox(IL13-PE38QQR)in recurrent malignant glioma：a report by theCintredekin Besudotox Intraparenchymal Study Group.J Clin Oncol 2007；25：837-44
非专利文件6：Frankel AE，Kreitman RJ，Sausville EA.Targeted toxins.ClinCancer Res 2000；6：326-34
非专利文件7：Grunwald V，Hidalgo M.Developing inhibitors of the epidermalgrowth factor receptor for cancer treatment.J Natl Cancer Inst 2003；95：851-67
非专利文件8：Janne PA，Engelman JA，Johnson BE.Epidermal growthfactor receptor mutations in non-small-cell lung cancer：implications for treatmentand tumor biology.J Clin Oncol 2005；23：3227-34
非专利文件9：Woodburn JR.The epidermal growth factor receptor and itsinhibition in cancer therapy.Pharmacol Ther 1999；82：241-50
非专利文件10：Salomon DS，Brandt R，Ciardiello F，Normanno N.Epidermalgrowth factor-related peptides and their receptors in human malignancies.Crit RevOncol Hematol 1995；19：183-232
非专利文件11：Li Z，Zhao R，Wu X等人，Identification and characterizationof a novel peptide ligand of epidermal growth factor receptor for targeted delivery oftherapeutics.FASEB J 2005；19：1978-85
非专利文件12：Yao G，Chen W，Luo H等人，Identification of core functionalregion of murine IL-4 using peptide phage display and molecular modeling.IntImmunol 2005；18：19-29
非专利文件13：Fuessel S，Meye A，SchmitzM等人，Vaccination ofhormone-refractory prostate cancer patients with peptide cocktail-loaded dendriticcells：results of a phase I clinical trial.Prostate 2006；66：811-21
非专利文件14：Chromek M，Slamova Z，Bergman P等人，The antimicrobialpeptide cathelicidin protects the urinary tract against invasive bacterial infection.NatMed 2006；12：636-41
非专利文件15：Kumar P，Wu H，McBride JL等人，Transvascular delivery ofsmall interfering RNA to the central nervous system.Nature 2007；448：39-43
非专利文件16：Lien S，Lowman HB.Therapeutic peptides.Trends Biotechnol2003；21：556-62
非专利文件17：Ellerby HM，Arap W，Ellerby LM等人，Anti-cancer activity oftargeted pro-apoptotic peptides.Nat Med 1999；5：1032-8
非专利文件18：Plescia J，Salz W，Xia F等人，Rational design of shepherdin，anovel anticancer agent.Cancer Cell 2005；7：457-68
非专利文件19：Papo N，Shai Y.New lytic peptides based on the D，L-amphipathic helix motif preferentially kill tumor cells compared to normal cells.Biochemistry 2003；42，：9346-54
非专利文件20：Papo N，Braunstein A，Eshhar Z，Shai Y.Suppression ofhuman prostate tumor growth in mice by a cytolytic D-，L-amino acid peptide：membrane lysis，increased necrosis，and inhibition of prostate-specific antigensecretion.Cancer Res 2004；64：5779-86
非专利文件21：Karapetis，C.S.等人，K-ras mutations and benefit fromcetuximab in advanced colorectal cancer.N Engl J Med.359，1757-1765(2008)
发明内容
本发明要解决的问题
本发明的目的是提供一种具有新结构的新药(例如，抗癌剂)。
解决问题的方法
借助本发明人关于与EGFR结合的肽序列和溶解型肽序列的最近鉴定信息，本发明人开发研究了靶向EGFR-过表达癌细胞的新嵌合肽，发现包括受体结合肽和细胞毒素肽的嵌合肽可用作药物，例如抗癌剂。此嵌合肽(本文中称为EGFR-靶向的肽毒素)优选地由受体结合肽(例如，EGFR-结合部分)和细胞毒素肽(例如，细胞膜-溶解部分)及间隔(例如，三个甘氨酸间隔)组成。这种嵌合肽的特征在于，与靶向肽组合时稳定，且与原始溶解型肽相比对正常细胞系具有较低的毒性作用。在本发明中，本发明人披露了在7种得自乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌和脑瘤的人类癌细胞系中，由本发明的嵌合肽(例如，EGFR-靶向的肽毒素)诱导的体外细胞毒性和细胞死亡的选择性。本发明人还对EGFR-靶向的肽毒素与癌细胞表面的相互作用，和肽毒素诱导的癌细胞死亡的作用模式进行了研究。体内实验还显示，本发明的嵌合肽呈现出明显的抗肿瘤活性。此使得所述肽还可应用于除作为实际的抗癌药物外的可行领域，例如，筛选药物或诸如此类的应用，迄今为止此应用尚属未知。这是由于，可能采用筛选形式的应用以发现与特定蛋白(例如受体)结合的肽序列，其中合成多种具有候选序列的嵌合肽和溶解肽且以体外细胞杀伤效应作为指标。举例而言，可使用氨基酸序列来实现筛选药物/抗癌剂的方法，所述氨基酸序列靶向EGFR高表达的癌细胞中的EGFR和所述癌细胞的细胞膜。如上所述，常规技术中的溶解型肽在正常细胞与癌细胞之间具有选择性细胞毒性，而本发明的肽对正常细胞具有降低的毒性。因而，已揭示本发明的肽适合与肽和靶向部分结合。
此肽毒素是由靶结合肽和细胞毒性溶解肽部分组成的化学合成肽。作为一个实施例，表皮生长因子受体(EGFR)-结合肽与包括富含阳离子氨基酸的溶解型肽偶联，此通过正电荷崩解细胞膜来杀伤癌细胞。在EGFR过表达的癌细胞系中，EGFR-靶向的肽毒素与单独的溶解肽相比可诱导IC50(使对照细胞的增殖受到50％抑制的肽浓度)增加约3倍。相反，正常细胞系对EGFR靶向的肽毒素或单独的溶解肽具有低敏感性。在正常细胞中，显示IC50比在癌细胞中高4-8倍。有趣的是，EGFR在细胞表面上的表达与靶向EGFR所致的肽毒素的细胞杀伤效应的提高程度明显相关，此表明存在特异性。令人惊奇地，EGFR靶向的肽毒素暴露不到10分钟时，足以杀伤超过50％的癌细胞。而且，本发明人发现，在提供有肽毒素的癌细胞中，聚半胱天冬酶的激活和Annexin V(膜连蛋白)阳性表达受到诱导，并提出细胞凋亡机制被诱导。综上所述，靶向在癌细胞中高度表达蛋白的肽毒素可成为新颖的癌症靶向治疗的重要手段。
因而，本发明包括下列内容。
在本发明的第一方面中，本发明提供一种包括受体结合肽和细胞毒素肽的嵌合肽。
在一个实施例中，受体结合肽可为表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)受体结合肽、白介素-4(IL-4)受体结合肽、白介素-13(IL-13)受体结合肽、神经纤毛蛋白(Neuropilin，NRP)受体-结合肽、2型人类表皮生长因子受体(Human EGF Receptor，HER2)-结合肽、血管内皮生长因子受体(VascularEpidermal Growth Factor Receptor，VEGFR)-结合肽、转铁蛋白受体(TransferrinReceptor，TfR)-结合肽、酪氨酸蛋白激酶受体(ephrin)B1(EphB1)-结合肽、ephrin B2(EphB2)-结合肽、葡萄糖调节蛋白78(Glucose-regulated Protein 78，GRP78)-结合肽、前列腺特异性膜抗原(Prostate-specific Membrane Antigen，PSMA)-结合肽或诸如此类。
从另一观点来论述，在本发明的主要方面中，本发明提供一种肽毒素，一种包括抗癌靶向肽和细胞膜-溶解肽部分的嵌合肽。
本发明主要方面中的具体实施例包括(例如)使用与受体结合的肽的肽毒素，所述受体是(例如)表皮生长因子(EGF)、2型人类表皮生长因子受体(HER)、血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)、转铁蛋白受体(TfR)、白介素-4(IL4)、白介素-13(IL13)、神经纤毛蛋白(NRP)、神经纤毛蛋白1(NRP1)/血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、ephrin B1(EphB1)、ephrinB2(EphB2)、葡萄糖调节蛋白(GRP78)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)或诸如此类。下文为嵌合肽示例(本文所用的每个字母表示单字母氨基酸表示法)。
EB-溶解：YHWYGYTPQNVIGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(SEQ ID NO：2)
EB(H2R)-溶解：YRWYGYTPQNVIGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(SEQ IDNO：14)
HER2-溶解：YCDGFYACYMDVGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(SEQ ID NO：15)
VEGFR1-溶解：WHSDMEWWYLLGGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(SEQ IDNO：16)
TfR-溶解：THRPPMWSPVWPGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(SEQ ID NO：17)
LyticL肽：KLLLKLLKKLLKLLKKK(SEQ ID NO：27)
IL4-LyticL：KQLIRFLKRLDRNGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(SEQ ID NO：18)
IL13-LyticL：KDLLLHLKKLFREGQFNGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(SEQ IDNO：19)
Sema3A-LyticL(与人类神经纤毛蛋白-1结合)：NYQWVPYQGRVPYPRGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(SEQ ID NO：20)
EGFbuf：YHWYGYTPQNVIGGGGGRLLRRLLRRLLRK(SEQ ID NO：21)
在一个实施例中，本发明中所使用的细胞膜-溶解肽部分由具有正电荷的氨基酸(K、R或(H))和疏水性氨基酸(L、A、F或诸如此类)组成，且具有10-至30-氨基酸序列及两亲性螺旋结构。
在一个实施例中，本发明中所使用的抗癌靶向肽具有与在癌细胞中高表达的受体特异性结合的序列，溶解肽部分具有癌细胞膜-溶解序列，且具有间隔。
在一个实施例中，本发明中所使用的溶解肽部分由具有正电荷的氨基酸(K、R或(H))和疏水性氨基酸(L、A、F或诸如此类)组成，且具有10-至30-氨基酸序列及两亲性螺旋结构。
在一个实施例中，本发明中所使用的间隔是由G和P组成的0-至5-氨基酸序列。
在一个方面中，本发明提供一种包括EGF受体结合肽和细胞毒素肽或细胞溶解肽的嵌合肽。
在一个实施例中，本发明中所使用的EGF受体结合肽具有氨基酸序列YHWYGYTPQNVI(SEQ ID NO：7)，其中每个字母表示单字母氨基酸表示法，或其修饰的序列。
在一个实施例中，本发明中所使用的EGF受体结合肽具有氨基酸序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12(SEQ ID NO：8)，其中：
X1是Y或与Y类似的氨基酸；
X2是H或与H类似的氨基酸；
X3是W或与W类似的氨基酸；
X4是Y或与Y类似的氨基酸；
X5是G或与G类似的氨基酸；
X6是Y或与Y类似的氨基酸；
X7是T或与T类似的氨基酸；
X8是P或与P类似的氨基酸；
X9是Q或与Q类似的氨基酸；
X10是N或与N类似的氨基酸；
X11是V或与V类似的氨基酸；且
X12是I或与I类似的氨基酸。
在优选实施例中，X1是Y或具有OH基团或芳香基团的与Y类似的氨基酸；
X2是H或具有正电荷的与H类似的氨基酸；
X3是W或具有芳香基团的与W类似的氨基酸；
X4是Y或具有OH基团的与Y类似的氨基酸；
X5是G或具有脂肪族侧链的与G类似的氨基酸；
X6是Y或具有OH基团的与Y类似的氨基酸；
X7是T或具有OH基团的与T类似的氨基酸；
X8是P或与P类似的亚氨基酸类氨基酸；
X9是Q或与Q类似的酰胺类氨基酸；
X10是N或具有OH基团的与N类似的氨基酸；
X11是V或具有脂肪侧链的与V类似的氨基酸；且
X12是I或具有脂肪侧链的与I类似的氨基酸。
在更为优选的实施例中，X1是Y或与Y类似的氨基酸S、H或F；
X2是H或与H类似的氨基酸R或K；
X3是W或与W类似的氨基酸Y、F或H；
X4是Y或与Y类似的氨基酸S、H或F；
X5是G或与G类似的氨基酸A、V、I或L；
X6是Y或与Y类似的氨基酸S、H或F；
X7是T或与T类似的氨基酸S、H或F；
X8是P或与P类似的氨基酸羟脯氨酸；
X9是Q或与Q类似的氨基酸N；
X10是N或与N类似的氨基酸S、H或F；
X11是V或与V类似的氨基酸G、A、L或I；且
X12是I或与I类似的氨基酸G、A、V或L。
在更为优选实施例中，X2是H或与H类似的氨基酸R或K。
在更为优选的实施例中，本发明的嵌合肽具有序列YRWYGYTPQNVI(SEQ ID NO：9)或YKWYGYTPQNVI(SEQ ID NO：10)。
在一个实施例中，本发明中所使用的细胞毒素肽选自包含下列的组：细胞膜-溶解肽、细胞膜电位-去稳定化肽、细胞膜-溶解肽和线粒体膜-崩解肽。
在优选实施例中，本发明中所使用的细胞膜-溶解肽具有仅由K和L组成的10-至20-氨基酸序列，且氨基酸是L-、D-或D，L-混合氨基酸。
在优选实施例中，本发明中所使用的细胞膜-溶解肽是KLLLKLLKKLLKLLKKK(SEQ ID NO：48；特别地SEQ ID NO：1或27或诸如此类)，且氨基酸是L-、D-或D，L-混合氨基酸。
在优选实施例中，本发明中所使用的细胞膜电位-去稳定化肽是FLKLLKKLAAKLF(SEQ ID NO：11)。
在优选实施例中，本发明中所使用的细胞膜-溶解肽是RLLRRLLRRLLRRLLRRLLR(SEQ ID NO：12)或RLLRRLLRRLLRK(SEQID NO：13)。
在优选实施例中，本发明中所使用的线粒体膜-崩解肽是KLAKLAKKLAKLAK(SEQ ID NO：4)。
在一个实施例中，本发明中所使用的细胞毒素肽由具有正电荷的氨基酸(K、R或(H))和疏水性氨基酸(L、A、F或诸如此类)组成，且具有10-至30-氨基酸序列及两亲性螺旋结构。
在优选实施例中，本发明中所使用的具有正电荷的氨基酸是K、R或H。
在优选实施例中，本发明中所使用的疏水性氨基酸是I、L、V、A或F。
在更为优选的实施例中，本发明中所使用的疏水性氨基酸是KLLLKLLKKLLKLLKKK(SEQ ID NO：1)，其中每个氨基酸都是L-或D-氨基酸且加下划线的字母表示D-氨基酸。
在一个实施例中，本发明中所使用的细胞毒素肽由具有正电荷的氨基酸(K、R或(H))和疏水性氨基酸(L、A、F或诸如此类)组成且具有10-至30-氨基酸序列及两亲性螺旋结构。
在一个实施例中，本发明中所使用的具有正电荷的氨基酸是K、R或H。
在一个实施例中，本发明中所使用的疏水性氨基酸是I、L、V、A或F。
在一个实施例中，本发明中所使用的疏水性氨基酸是KLLLKLLKKLLKLLKKK(SEQ ID NO：1)，其中每个氨基酸都是L-或D-氨基酸且加下划线的字母表示D-氨基酸。
在一个实施例中，本发明的嵌合肽进一步含有间隔肽。
在一个实施例中，本发明中所使用的间隔肽呈现连接有0至4个单独的甘氨酸、单独的脯氨酸或混合的甘氨酸与脯氨酸的序列，且优选地为GGG。
在一个实施例中，本发明的嵌合肽具有序列YHWYGYTPQNVIGGGKLLLKL LKKLLKLLKKK(SEQ ID NO：2)。
在一个实施例中，本发明的嵌合肽具有序列YRWYGYTPQNVIGGGKLLLKL LKKLLKLLKKK(SEQ ID NO：43)，其中加下划线的字母表示D-氨基酸。
在一个实施例中，本发明的嵌合肽的受体结合肽是白介素-4(IL-4)受体结合肽，且具有氨基酸序列KQLIRFLKRLDRN(SEQ ID NO：26)或其修饰的序列。
在一个实施例中，本发明的嵌合肽的受体结合肽是白介素-13(IL-13)受体结合肽，且具有氨基酸序列KDLLLHLKKLFREGQFN(SEQ ID NO：28)或其修饰的序列。
在一个实施例中，本发明的嵌合肽的受体结合肽是神经纤毛蛋白受体结合肽，且具有氨基酸序列NYQWVPYQGRVPYPR(SEQ ID NO：29)或其修饰的序列。
在一个实施例中，本发明的嵌合肽的受体结合肽是2型人类表皮生长因子受体(HER2)-结合肽，且具有氨基酸序列YCDGFYACYMDV(SEQ ID NO：30)、LLGPYELWELSH(SEQ ID NO：52)、ALVRYKDPLFVWGFL(SEQ IDNO：53)、KCCYSL(SEQ ID NO：54)、WTGWCLNPEESTWGFCTGSF(SEQID NO：55)、DTDMCWWWSREFGWECAGAG(SEQ ID NO：56)或其修饰的序列。
在一个实施例中，本发明的嵌合肽的受体结合肽是血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)-结合肽，且具有氨基酸序列WHSDMEWWYLLG(SEQ ID NO：31)、VEPNCDIHVMWEWECFERL-NH2(SEQ ID NO：32))或GGNECDAIRMWEWE CFERL(SEQ ID NO：33)或其修饰的序列。
在一个实施例中，本发明的嵌合肽的受体结合肽是转铁蛋白受体(TfR)-结合肽且具有氨基酸序列THRPPMWSPVWP(SEQ ID NO：34)或其修饰的序列。
在一个实施例中，本发明的嵌合肽的受体结合肽是：成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast Growth Factor Receptor，FGFR)-结合肽，且为MQLPLAT(SEQID NO：5)或AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO：6)；神经纤毛蛋白1(NRP1)/血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)-结合肽，且为ATWLPPR(SEQ ID NO：36)；ephrinB1(EphB1)-结合肽，且为EWLS(SEQ ID NO：37)；ephrinB2(EphB2)-结合肽，且为SNEW(SEQ ID NO：38)；白介素-11受体(IL11R)-结合肽，且为CGRRAGGSC(环状)(SEQ ID NO：22)；葡萄糖调节蛋白78(GRP78)-结合肽，且为WDLAWMFRLPVG(SEQ ID NO 39)或CTVALPGGYVRVC(环状)(SEQ ID NO：40)；前列腺特异性膜抗原(PSMA)-结合肽，且为CQKHHNYLC(SEQ ID NO：35)；或其修饰的序列。
在一个实施例中，本发明的嵌合肽具有选自包含下列的组的序列：SEQ IDNO：2、14、21、42和43，或其修饰的序列。
在一个实施例中，本发明的嵌合肽具有SEQ ID NO：15中所阐明的序列或其修饰的序列。
在一个实施例中，本发明的嵌合肽具有SEQ ID NO：16中所阐明的序列或其修饰的序列。
在一个实施例中，本发明的嵌合肽具有SEQ ID NO：17中所阐明的序列或其修饰的序列。
在一个实施例中，本发明的嵌合肽具有SEQ ID NO：18或44中所阐明的序列或其修饰的序列。
在一个实施例中，本发明的嵌合肽具有SEQ ID NO：19中所阐明的序列或其修饰的序列。
在一个实施例中，本发明的嵌合肽具有SEQ ID NO：20、46或47中所阐明的序列或其修饰的序列。
在一个方面中，本发明提供编码本发明嵌合肽的核酸。
在另一方面中，本发明提供包括编码本发明嵌合肽的核酸的载体。
在另一方面中，本发明涉及包括编码本发明嵌合肽的核酸的细胞。
在另一方面中，本发明涉及一种药物，优选地涉及一种药物组合物，其包括本发明的嵌合肽。
在另一方面中，本发明涉及包括本发明嵌合肽的抗癌剂。
在又一方面中，本发明涉及本发明嵌合肽用来制造药物组合物的用途。
在另一方面中，本发明涉及本发明嵌合肽用来制造抗癌剂的用途。
在再一方面中，本发明涉及一种治疗方法，其包括给药本发明嵌合肽的步骤。
在另一方面中，本发明涉及治疗癌症的方法，其包括给予本发明嵌合肽的步骤。
在一个方面中，本发明涉及一种筛选药物的方法，其使用由本发明EGF受体-结合肽靶向的氨基酸序列。
在一个方面中，本发明涉及一种筛选抗癌剂的方法，其使用由本发明EGF受体-结合肽靶向的氨基酸序列。
已对各种类型嵌合肽的制备进行了尝试。与最新的现有技术(Ellerby HM，Arap W，Ellerby LM等人，Nat Med 1999；5：1032-8；PapoN，Shai Y.Biochemistry2003；42：9346-54；和Papo N，Braunstein A，Eshhar Z，Shai Y.Cancer Res 2004；64：5779-86)比较而言，可了解，作为本发明嵌合化的结果，与癌细胞膜-单独的溶解肽相比本发明获得明显的效果，在于其达成癌细胞靶向，和针对癌细胞的细胞杀伤效应的提高和即刻性。确切地说，尽管另一最新的现有技术，针对癌症利用基于细菌毒素的免疫毒素的靶向方法具有极大吸引力，但其使用限制在于由细菌毒素所致的肝毒性和由毒素蛋白所引起的免疫原性(非专利文件2、4、6)。此外，免疫毒素的分子大小与化学化合物或片段抗体药物相比通常较大，此可能妨碍药物有效地渗透到人体内的肿块中(非专利文件2、4、6)。这些文件仅提出蛋白调配物(例如免疫毒素)的问题，但未提出解决问题的方式。为了解决这个问题，迫切需要采用改进方法的新一代免疫毒素。
在所有这些方面中，应了解，本文中所阐述的每一实施例都可应用到其他方面中，只要其适用即可。
[本发明效果]
本发明提供可用作抗癌剂或DDS的物质，其具有细胞内稳定性，针对正常细胞能避免副作用以免功能紊乱，或者其具有瞬时效应。
附图说明
图1A示出了各种人类癌细胞系中EGFR-结合(EB)-溶解嵌合肽或单独的溶解肽的细胞杀伤效应。将癌细胞系H322、BT-20、H460、U251、BxPC-3、SU.86.86或LNCaP与不同浓度(0至30μM)的EB-溶解嵌合肽或溶解肽一起培养72小时，并使用WST-8试剂检测细胞毒性。结果以一式三份测量值的平均值±SD(bar)(SD：Standard Deviation，标准差)表示。将此分析重复3次。黑色圆圈，EB-溶解嵌合肽；白色圆圈，溶解肽。
图1B示出了各种人类正常细胞系中EB-溶解嵌合肽或单独的溶解肽的细胞杀伤效应。将正常细胞系MRC-5、WI-38或HEK293与不同浓度(0至100μM)的肽一起培养72小时，并检测细胞毒性。结果以一式三份测量值的平均值±SD(bar)表示。将此分析重复3次。黑色圆圈，EB-溶解嵌合肽；白色圆圈，溶解肽。
图1C示出了各种人类癌细胞和正常细胞中EB-原始溶解嵌合肽或单独的原始溶解肽的细胞杀伤效应。将癌细胞系H322和正常细胞系MRC-5与不同浓度(0至30μM)的EB-原始溶解嵌合肽或单独的原始溶解肽一起培养，并如上所述实施细胞毒性分析。黑色圆圈，EB-原始溶解嵌合肽；白色圆圈，原始溶解肽。
图1D示出了借助圆二色谱(Circular Dichroism Spectrum，CD谱)分析新颖嵌合肽的设计结构和二级结构。上面示出了与由Papo和Shai报导的溶解肽(a)(原始溶解肽)或与新设计的溶解肽(b)偶联的EGFR-结合(EB)肽的Schiffer Edmundson轮形投影。在肽序列中，加下划线的斜体字母表示D-氨基酸。轮形线图中的粗体字母表示亲水性氨基酸(主要是Lys)。箭头表示这些肽的亲水性表面的方向。显示了在PC SUV或PC/PS(4∶1)SUV存在下EB-原始溶解肽(c)和EB-溶解肽(d)的CD谱。肽和脂质的浓度分别为50μM和4mM。
图1E示出了k-ras突变的癌细胞系对酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine KinaseInhibitor，TKI)的抗性。将野生型k-ras癌细胞系(H322(黑色圆圈)和BT-20(黑色三角形))和突变的k-ras癌细胞系(MDA-MB-231(白色圆圈)、HCT116(白色三角形)、SW837(白色菱形)和DLD-1(x))与不同浓度的埃罗替尼(erlotinib)(左；0至80μM)或抗EGFR抗体(右；0至20μM)一起培养72小时，并使用WST-8试剂检测细胞毒性。纵轴表示相对于对照的细胞存活率(％)，且横轴表示埃罗替尼(左)和抗EGFR抗体(右)的浓度。将该分析重复3次，且结果以一式三份测量值的平均值±SD(bar)表示。
图1F示出了野生型k-ras细胞系中TKI与EB-溶解嵌合肽间的细胞毒性比较。将癌细胞系(H322、BT-20和BxPC-3)和肺正常细胞系(MRC-5)与不同浓度的TKI(埃罗替尼(白色圆圈)、吉非替尼(gefitinib)(白色三角形)和PD153035(白色菱形)；0至20μM)或EB-溶解嵌合肽(黑色圆圈；0至20μM)一起培养72小时，并使用WST-8试剂检测细胞毒性。纵轴表示相对于对照的细胞存活率(％)，且横轴表示TKI和EB-溶解的浓度(μM)。将该分析重复3次，且结果以一式三份测量值的平均值±SD(bar)表示。
图1G示出了用EB-溶解嵌合肽处理对具有k-ras突变的TKI-抗性癌细胞系产生足够的细胞毒性。将四种类型的突变k-ras癌细胞系(MDA-MB-231)与不同浓度的TKI(埃罗替尼(白色圆圈)、吉非替尼(白色三角形)和PD153035(白色菱形)；0至20μM)或EB-溶解嵌合肽(黑色圆圈；0至20μM)一起培养72小时，并使用WST-8试剂检测细胞毒性。纵轴表示相对于对照的细胞存活率(％)，且横轴表示TKI和EB-溶解的浓度(μM)。将该分析重复3次，且结果以一式三份测量值的平均值±SD(bar)表示。
图2A示出了EB-溶解嵌合肽的细胞杀伤效应的提高取决于EGFR在细胞表面的表达。在7种癌细胞系和3种正常细胞系中，EGFR抗体结合的相对平均荧光强度与EB-溶解嵌合肽的IC50(左)、溶解肽的IC50(中间)、或溶解肽相对于EB-溶解嵌合肽的IC50比(右)之间的关联。
图2B示出了EB-溶解嵌合肽对BxPC-3细胞的细胞杀伤效应可通过添加EGFR抗体或EGF蛋白重组体得到抑制。在暴露于肽1小时前通过添加抗EGFR的多克隆抗体或EGF蛋白重组体，来检测对EB-溶解嵌合肽对BxPC-3的细胞杀伤效应的抑制。*P＜0.05，**P＜0.01。
图3A示出了EB-溶解嵌合肽和溶解肽与EGFR蛋白的结合特性。在传感器表面上对梯度稀释的EB-溶解嵌合肽(27μM至13μM)或溶解肽(24μM至12μM)的样品进行分析。
图3B示出了单独的溶解肽与自H322或MRC-5细胞提取的细胞表面膜蛋白结合的相互作用谱。在传感器表面上对梯度稀释的膜蛋白(0.1mg/ml至0.025mg/ml)的样品进行分析。
图3C示出了EB-溶解嵌合肽与自H322或MRC-5细胞提取的细胞表面膜蛋白结合的相互作用谱。在传感器表面上对梯度稀释的膜蛋白(0.1mg/ml至0.025mg/ml)的样品进行分析。
图3D示出了EB-溶解嵌合肽(黑色柱)或单独的溶解肽(白色柱)与自H322、BT-20或MRC-5细胞提取的细胞表面膜蛋白的相对KD值。
图4A示出了EB-溶解嵌合肽诱导癌细胞的迅速杀伤。H322和BT-20细胞用EB-溶解嵌合肽(黑色柱)或溶解肽(白色柱)处理10分钟、30分钟、1小时或48小时，且随后用新鲜培养基替代含有肽的培养基，并再实施培养48小时。使用WST-8分析细胞的存活率。
图4B示出了MDA-MB-231乳腺癌细胞中借由EB-溶解嵌合肽的细胞膜的通透。以最终浓度10μM添加EB-溶解肽-TAMRA后，使细胞(3×104个细胞/ml)存于钙黄绿素溶液中0分钟、2分钟、5分钟、10分钟和20分钟。箭和箭头分别表示透化的细胞和穿过膜的肽。
图4C示出了MDA-MB-231乳腺癌细胞中借由溶解肽细胞膜的通透。以最终浓度10μM添加溶解肽-TAMRA后，使细胞(3×104个细胞/ml)存于钙黄绿素溶液中0分钟、2分钟、5分钟、10分钟和20分钟。
图4D示出了借由EB-溶解嵌合肽对细胞生长的抑制。将H322细胞在含有不同浓度(0至22.5μM)的EB-溶解嵌合肽的培养基中培养10天。用结晶紫染色后，给由至少50个细胞组成的集落划线，且结果基于集落数，处理的细胞相对于未经处理细胞的百分比表示。未经处理的细胞形成117±10个集落。数据为一式两份测量值的平均值；bar表示SD。
图5示出了EB-溶解嵌合肽诱导癌细胞中半胱天冬酶(caspase)激活和Annexin V(膜连蛋白)-阳性表达。2小时后用双色流式细胞仪对与EB-溶解嵌合肽(5μM)一起培育的BT-20细胞进行分析，所述双色流式细胞仪在绿色通道中分析Annexin V标记(上图)或由DEVDase活性表示的半胱天冬酶活性(下图)，并在红色通道中分析PI染色。值表示各象限中细胞的百分比。
图6示出了H322肺癌细胞的体外细胞生长抑制。将H322细胞在含有不同浓度(0至22.5μM)的EB-嵌合肽或单独的溶解肽的培养基中培养10天。用结晶紫染色后，给由至少50个细胞组成的集落划线，且结果以集落数的百分比表示(100％，未经处理的细胞)。未经处理的细胞形成117±10个集落。数据是一式两份测量值的平均值；bar表示SD。
图7A示出了EGFR-结合序列突变肽和人类EGFR重组体的亲和力经BIACORE分析的结果。突变体是通过将野生型EGFR-结合肽序列中带电荷的第二个H经化学合成变成K或R，使用BIACORE生物传感器响应的提高作为指标来检测与EGFR的亲和力。
图7B示出了在与EGFR具有高亲和力的R-突变肽和癌细胞膜-单独的溶解肽之间细胞杀伤效应的比较结果。将人类肺癌细胞系H322与具有梯度稀释浓度(0至30μM)的两种肽一起培养72小时，并使用WST-8试剂检测细胞杀伤效应。这些结果以一式三份测量值的平均值±SD(bar)表示，且将该分析重复3次。三角形，EB-嵌合肽；黑色圆圈：R-突变体EB-嵌合肽；白色圆圈，膜-溶解肽。
图8A示出了IL4R-结合肽和扰频序列肽与人类IL4R重组体的结合特性。在传感器表面上对梯度稀释的IL4R-结合肽(29μM至7.4μM)的样品进行分析。
图8B示出了在IL4R-靶向的癌细胞膜-溶解嵌合肽(IL4-LyticL；四边形)与癌细胞膜-单独的溶解肽(LyticL；菱形)间细胞杀伤效应的比较结果。将人类乳腺癌细胞系MDA-MB-231(左)和人类胰腺癌细胞系BxPC-3(右)与具有梯度稀释浓度(0至10μM)的两种肽一起培养72小时，并使用WST-8试剂检测细胞杀伤效应。将该分析重复3次，且结果以一式三份测量值的平均值±SD(bar)表示。
图8C示出了IL4R-靶向的癌细胞膜-溶解嵌合肽(IL4-LyticL)诱导癌细胞的迅速杀伤。BxPC-3细胞用10μM的IL4-LyticL(黑色柱)或LyticL(灰色柱)处理2分钟、5分钟、10分钟、30分钟或1小时，且随后用新鲜的培养基替代含肽的培养基，并再继续培养48小时。使用WST-8分析细胞的存活率。
图9A示出了IL13R-结合肽和扰频序列肽与人类IL13R重组体的结合特性。在传感器表面上对梯度稀释的IL13R-结合肽(24μM至6.0μM)的样品进行分析。
图9B示出了在IL13R-靶向的癌细胞膜-溶解嵌合肽(IL13-LyticL)与癌细胞膜-单独的溶解肽(LyticL)间细胞杀伤效应的比较结果。将人类脑肿瘤细胞系U251(左)和人类头和颈部癌细胞系HN-12(右)与具有梯度稀释浓度(0至20μM)的两种肽一起培养72小时，并使用WST-8试剂检测细胞杀伤效应。将该分析重复3次，且结果以一式三份测量值的平均值±SD(bar)表示。菱形，LyticL；四边形，IL13-LyticL。
图9C示出了IL13R-靶向的癌细胞膜-溶解嵌合肽(IL13-LyticL)诱导癌细胞的迅速杀伤。U251细胞用10μM的IL13-LyticL(黑色柱)或LyticL(灰色柱)处理2分钟、5分钟、10分钟、30分钟、或1小时至24小时，且随后用新鲜的培养基替代含肽的培养基，再继续培养48小时。使用WST-8分析细胞的存活率。
图10A示出了神经纤毛蛋白-1(NRP1)-结合肽和扰频序列肽与人类NRP1重组体的结合特性。在传感器表面上对梯度稀释的NRP1-结合肽(24μM至6.0μM)样品进行分析。
图10B示出了在NRP1-靶向的癌细胞膜-溶解嵌合肽(Sema3A-LyticL；黑色圆圈)和癌细胞膜-单独的溶解肽(LyticL；白色圆圈)间细胞杀伤效应的比较结果。将人类胰腺癌细胞系SU8686(左)和人类乳腺癌细胞系SKBR-3(右)与具有梯度稀释浓度(0至10μM)的两种肽一起培养72小时，并使用WST-8试剂检测细胞杀伤效应。将该分析重复3次，且结果以一式三份测量值的平均值+SD(bar)表示。
图11A示出了在细胞膜-溶解和核酸-结合序列(buf；白色圆圈)与其EGFR-靶向的嵌合肽(EGFbuf；黑色圆圈)间细胞杀伤效应的比较结果。将人类肺癌细胞系H322(左)和人类前列腺癌细胞系DU145(右)与具有梯度稀释浓度(0至30μM)的两种肽一起培养72小时，并使用WST-8试剂检测细胞杀伤效应。结果以一式三份测量值的平均值±SD(bar)表示。
图11B示出了EGFR-靶向的嵌合肽(EGFbuf)对肺癌细胞系H322(白色圆圈)和肺正常细胞系MRC-5(黑色圆圈)的细胞杀伤效应的比较结果。将两种细胞与具有梯度稀释浓度(0至20μM)的EGFbuf肽一起培养72小时，并使用WST-8试剂检测细胞杀伤效应。结果以一式三份测量值的平均值±SD(bar)表示。
图12A和12B表示由癌细胞膜-单独的溶解序列(D，L-混合；与实施例1中相同的序列)和3种与癌细胞中高表达的受体(her2，VEGF受体，转铁蛋白受体)结合的序列靶向的嵌合肽的细胞杀伤效应的比较结果。将人类肺癌细胞系H322(图12A)或人类肺正常细胞系MRC-5(图12B)与具有梯度稀释浓度(0至80μM)的4种肽一起培养72小时，并使用WST-8试剂检测细胞杀伤效应。将该分析重复3次，且结果以一式三份测量值的平均值±SD(bar)表示。黑色三角形：TfR-溶解；白色圆圈：Her2-溶解；白色三角形：VEGFR1-溶解；黑色圆圈：溶解。
图13示出了具有人类胰腺癌细胞系BxPC-3的小鼠模型中，与实施例1中相同的EB-溶解嵌合肽的抗瘤作用。将人类胰腺癌细胞系BxPC-3皮下移植至裸鼠。移植5天后，瘤内给予肽，每周3次，持续3周。结果以每组4个小鼠的平均值±SD(bar)表示。白色圆圈是给予溶剂的组，白色三角形是给予0.3mg/kgEB-溶解嵌合肽的组，且黑色圆圈是给予1mg/kg EB-溶解嵌合肽的组。
图14示出了具有人类胰腺癌细胞系BxPC-3的小鼠模型中全身给予与实施例1中相同的EB-溶解嵌合肽，检测其抗瘤作用。将人类胰腺癌细胞系BxPC-3皮下移植至裸小鼠。移植5天后，经静脉内给予肽，每周3次，持续3周。结果以每组三个小鼠的平均值±SD(bar)表示。白色圆圈是给予盐水的组，白色三角形是给予1mg/kg EB-溶解嵌合肽的组，且黑色圆圈是给予5mg/kg EB-溶解嵌合肽的组。
图15A示出了具有人类胰腺癌细胞系BxPC-3的小鼠模型中(上面)和具有人类乳腺癌细胞系MDA-MB-231的小鼠模型中(下面)与实施例1中相同的EB-溶解嵌合肽的抗癌效果。将BxPC-3胰腺癌细胞或乳腺癌细胞皮下移植至无胸腺裸鼠。如箭头所示，从第5天起，经静脉内给予盐水(对照(白色圆圈))或EB-溶解肽(2mg/kg(黑色四边形)、5mg/kg(白色四边形)或10mg/kg(黑色三角形))。各组都由6个动物组成(n＝6)，且将实验重复两次。结果以平均值±SD表示。
图15B示出了静脉内治疗后，无胸腺裸鼠体内MDA-MB-231肿瘤的减小。将MDA-MB-231细胞经背侧移植至小鼠。移入后，经静脉内注射盐水(左图)或EB-溶解肽(右图)对小鼠进行治疗。箭头表示肿瘤的位置。
图15C示出了用与实施例1中相同的EB-溶解嵌合肽治疗后MDA-MB-231肿瘤的组织学实验。福尔马林固定和石蜡包埋的肿瘤切片(得自用盐水(左图)或EB-溶解嵌合肽(右图)治疗的动物)用苏木精染色，并用光学显微镜分析。
图16A示出了使用BIACORE系统的结合分析。
图16B示出了借助CD谱对EB-溶解肽(虚线)和EB(H2R)-溶解肽(实线)的二级结构分析。肽的浓度为50μM。
图16C示出了BT20细胞中溶解肽(菱形)、EB-溶解肽(四边形)和EB(H2R)-溶解肽(三角形)的细胞毒性。
图17A示出了对于提高对癌细胞的细胞毒性，新设计的溶解肽适合于嵌合肽。将癌细胞系H322、BT-20、U251、BxPC-3、SU8686和LNCaP与不同浓度(0至20μM)的EB-溶解嵌合肽(黑色圆圈)或EB(H2R)-溶解嵌合肽(白色圆圈)一起培养，并使用WST-8试剂检测细胞毒性。
图17B示出了各种人类正常细胞系中EB(H2R)-溶解嵌合肽或EB-溶解肽的细胞毒性。将正常细胞系MRC-5和HEK293与不同浓度(0至20μM)的前述肽一起培养，检测细胞毒性，并如上所述实施细胞毒性分析。白色圆圈，EB(H2R)-溶解肽；黑色圆圈，EB-溶解肽。
图18示出了EB-溶解嵌合肽崩解细胞膜以诱导癌细胞的迅速杀伤。H322细胞用10μM的EB-溶解嵌合肽(白色柱)或EB(H2R)-溶解嵌合肽(黑色柱)处理2分钟、5分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时或24小时，且随后用新鲜的培养基替代含肽的培养基。细胞再继续培养24小时。使用WST-8分析细胞存活率。结果以平均值±SD(bar)表示。
图19A示出了H322肺癌细胞中借由溶解肽细胞膜的透化。其示出了，以最终浓度10μM添加溶解肽后，在钙黄绿素溶液中0分钟、2分钟、5分钟、10分钟和20分钟时细胞的共聚焦显微图像。从上面开始，为单独的溶解肽、EB-溶解肽和EB(H2R)-溶解肽的图像。这些图像表明，对于单独的溶解肽变绿(细胞膜崩解)的细胞数并未随时间而变化，而对于EB-溶解肽和EB(H2R)-溶解肽变绿的细胞数随时间而增加，且经EB(H2R)-溶解肽处理的变绿细胞数量增加的时间比EB-溶解肽短。
图19B示出了培养基流入细胞的百分比随时间的图示，其由图19A的结果计算而得。由此图形还可以看到，经EB(H2R)-溶解肽处理(白色四边形)的培养基流入细胞的百分比比EB-溶解肽(黑色四边形)快。
图20A示出了癌细胞中EB(H2R)-溶解肽诱导Annexin V-阳性表达比EB-溶解肽强。在37℃下将人类乳腺癌细胞系BT20细胞与EB-溶解肽或EB(H2R)-溶解肽(各自都是5μM)一起培养2小时，并由双色流式细胞仪分析Annexin V标记。
图20B示出了癌细胞中EB(H2R)-溶解肽诱导caspase3 & 7活性比EB-溶解肽强。在37℃下将人类乳腺癌细胞系BT20细胞与EB-溶解肽或EB(H2R)-溶解肽(各自都是5μM)一起培育2小时，并由羧基二乙酸荧光素FLICA聚半胱天冬酶分析来分析半胱天冬酶3 & 7活性。
图21示出了具有人类乳腺癌细胞系MDA-MB-231的小鼠模型中EB-溶解肽和EB(H2R)-溶解嵌合肽的抗癌效果。将MDA-MB-231乳腺癌细胞皮下移植至无胸腺裸鼠，且如图中箭头所示，移植5天后，经静脉内注射盐水(对照：黑色圆圈)、EB-溶解肽(1mg/kg；四边形)或EB(H2R)-溶解嵌合肽(1mg/kg；三角形)。各组都由6个动物组成(n＝6)。纵轴表示肿瘤的体积(mm3)且横轴表示乳腺癌细胞移植后的天数(天)。数据以平均值±SD表示。可以看出，其中EB肽的第二个位置由H变成R的嵌合肽(EB(H2R)-溶解)具有比EB-溶解嵌合肽(EB-溶解)高的活体内抗癌效果。
图22A示出了对于提高对癌细胞的细胞毒性，TfR-溶解肽是适合的嵌合肽。将癌细胞系T47D、MDA-MB-231和SKBR-3与不同浓度(0至30μM)的TfR-溶解嵌合肽(白色四边形)或溶解肽(黑色四边形)一起培养72小时，并使用WST-8试剂检测细胞毒性。
图22B示出了各种正常细胞系中TfR-溶解嵌合肽的细胞毒性。将正常细胞系MRC-5、PE和HC与不同浓度(0至100μM)的前述肽一起培养72小时，并检测细胞毒性。将自未经处理的细胞得到的绝对值定义为100％。黑色四边形，TfR-溶解嵌合肽；白色四边形，溶解肽。
图23示出了与通过添加TfR-溶解嵌合肽使细胞毒性提高有关的IC50值间的关联。示出了7种癌细胞系的TfR-溶解嵌合肽的IC50(A)和溶解肽的IC50(B)或溶解肽/TfR-溶解嵌合肽的IC50比(C)与TfR单克隆抗体结合的平均荧光强度。
图24A示出了TfR-溶解肽崩解细胞膜以迅速杀伤T47D癌细胞。将T47D细胞暴露于TfR-溶解嵌合肽(黑色柱)或溶解肽(白色柱)不同的时间段(1至180分钟)，且在暴露一定时间段后，用新鲜培养基代替含肽培养基。将细胞继续培养72小时，并使用WST-8分析细胞存活率。结果以平均值±SD(bar)表示。
图24B示出了T47D乳腺癌细胞中经由TfR-溶解嵌合肽的膜透化。其显示以浓度10μM添加TfR-溶解嵌合肽后在钙黄绿素溶液中0分钟、5分钟、10分钟和15分钟的细胞。箭头表示透化的细胞和穿过膜的肽。
图25A示出了借由TfR-溶解嵌合肽抑制癌细胞系的细胞存活率。在用肽(5μM)处理之前，将T47D细胞与渐增浓度的抗-TfR单克隆抗体(黑色柱)或非特异性小鼠IgG1(同型对照；白色柱)一起培育3小时。
图25B示出了siRNA或扰频序列(scramble sequence，sc)RNA对癌细胞系的细胞毒性。用siRNA或scRNA转染T47D细胞和MDA-MB-231细胞。转染4天后，由流式细胞技术来分析细胞中靶基因的水平(数据未示出)，并使用WST-8试剂检测抑制的百分比。将该分析重复3次，且结果以一式三份测量值的平均值±SD(bar)表示。
图26A示出了在癌细胞中TfR-溶解嵌合肽诱导Annexin V阳性表达。将T47D细胞和PE细胞与TfR-溶解嵌合肽(10μM)和溶解肽(10μM)一起培育。2小时后，在绿色通道中针对Annexin V-阳性且在红色通道中针对碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色实施双色流式细胞分析。
图26B示出了在癌细胞中TfR-溶解嵌合肽诱导caspase激活。将T47D细胞和PE细胞分别与TfR-溶解嵌合肽(10μM)和溶解肽(10μM)一起培育。2小时后，在绿色通道中针对caspase3 & 7活性且在红色通道中针对PI染色实施双色流式细胞分析。
图26C示出了癌细胞系中各种溶解肽的作用比较。用线粒体跨膜电位-依赖的荧光染料JC-I标记的T47D细胞未经处理(未经处理：上面左图)或经星形孢菌素(Staurosporine)(对照线粒体膜电位：上面右图)、溶解肽(下面左图)或TfR-溶解嵌合肽(下面右图)处理。2小时后，由流式细胞技术来分析指示跨膜电位的红色荧光或绿色荧光明显的变化比。
图26D示出了用各种溶解肽处理的细胞中对细胞色素c释放的Western印记分析(Western blot analysis)。将T47D细胞与星形孢菌素、TfR-溶解嵌合肽(10μM)和溶解肽(10μM)一起培养。2小时后，分离胞浆提取物，使用细胞色素c抗体通过Western blot来研究细胞色素c的释放。
图27A示出了TfR-溶解嵌合肽(瘤内注射)的体内抗瘤活性。将MDA-MB-231乳腺癌细胞皮下移植至无胸腺裸鼠。如箭头所示，从第5天起，瘤内注射盐水(对照(黑色圆圈))或TfR-溶解肽(0.3mg/kg(黑色菱形)、1mg/kg(白色三角形)或3mg/kg(白色四边形))。各组都由3个动物组成(n＝3)。数据以平均值±SD表示。
图27B示出了TfR-溶解嵌合肽(静脉内注射)的体内抗瘤活性。将MDA-MB-231细胞皮下移植至无胸腺裸小鼠。如箭头所示，从第5天起，经静脉内注射盐水(对照(黑色圆圈))或TfR-溶解肽(0.5mg/kg(白色三角形)、1mg/kg(黑色菱形)、2mg/kg(白色四边形)或5mg/kg(白色圆圈))。各组都由3个动物组成(n＝3)。数据以平均值±SD表示。
图28示出了白介素-4(IL4)和白介素-4受体α螺旋(IL-4Rα)的三维复合结构。(A)表示IL4和IL-4Rα的整个结构。(B)表示IL4与IL-4Rα间界面位置的放大区域。对于IL4与IL-4Rα结合很重要的残基由黑体字表示。
图29示出了与L，D-溶解肽偶联的设计嵌合肽(IL4-溶解(L，D))在正常细胞与癌细胞间的选择性毒性。将正常细胞系WI-38(A，B)和癌细胞系KCCT873(C，D)与不同浓度(0至30μM)的IL4-溶解(L)嵌合肽、溶解(L)肽、IL-4-溶解(L，D)嵌合肽或溶解(L，D)肽一起培养72小时。使用WST-8试剂检测细胞毒性。白色四边形，溶解(L)肽；黑色四边形，IL4-溶解(L)肽；白色三角形，溶解(L，D)肽；黑色三角形，IL4-溶解(L，D)肽。
图30示出了检测IL-4Rα在癌细胞系的细胞表面上的表达。将得自A172、BxPC-3和正常细胞系HEK293的总RNA反转录为cDNA，随后使用IL-4Rα-特异性引物，由定量PCR检测。使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase，GAPDH)作为内参。
图31示出了IL4-溶解(L，D)嵌合肽迅速杀伤癌细胞。PE细胞(A)、KCCT873细胞和BxPC-3细胞(B)用IL4-溶解(L，D)嵌合肽(黑色柱)或溶解(L，D)肽(白色柱)处理2分钟、5分钟、10分钟、30分钟、1小时或2小时。用新鲜培养基替代含肽的培养基，将细胞再继续培养72小时。使用WST-8试剂测定细胞存活率。结果以平均值±SD(bar)表示。
图32示出了IL4-溶解(L，D)嵌合肽诱导癌细胞的Annexin V-阳性表达。将PE细胞(其为正常细胞，上面)和KCCT873细胞(其为癌细胞，下面)与IL4-溶解(L，D)嵌合肽或溶解(L，D)肽(10μM)一起培养2小时。随后，在绿色通道中针对Annexin V标记，且在红色通道中针对PI染色进行双色流式细胞技术分析。细胞的百分比显示在各象限内。
图33A示出了IL4-溶解(L，D)嵌合肽(瘤内注射)的体内抗瘤活性。将MDA-MB-231乳腺癌细胞皮下移植至无胸腺裸鼠。如箭头所示，从第5天起，瘤内注射盐水(NaCl；对照(白色菱形))或IL4-溶解(L，D)肽(0.5mg/kg(黑色四边形)或2mg/kg(黑色三角形))。各组都由3个动物组成(n＝3)。
图33B示出了IL4-溶解(L，D)嵌合肽(静脉内注射)的体内抗瘤活性。将MDA-MB-231乳腺癌细胞皮下移植至无胸腺裸鼠。如箭头所示，从第5天起，经静脉内注射盐水(对照(白色菱形))或IL4-溶解(L，D)肽(2mg/kg(黑色四边形)或5mg/kg(黑色圆圈))。各组都由3个动物组成(n＝3)。数据以平均值±SD(bar)表示。
图34A示出了Sema3A-nLytic对各种细胞系的细胞毒性。将胰腺细胞系与不同浓度(0至50μM)的Sema3A-nLytic肽或单独的nLytic肽一起培养48小时，并使用WST-8试剂检测细胞毒性。菱形，nLytic肽；四边形，Sema3A-nLytic(363-377)肽；三角形，Sema3A-nLytic(371-377)肽。
图34B示出了Sema3A-nLytic对各种细胞系的细胞毒性。将乳腺癌细胞与不同浓度(0至20μM)的Sema3A-nLytic(371-377)或Sema3A-nLytic(363-377)一起培养48小时，并使用WST-8试剂检测细胞毒性。将该分析重复3次，且结果以一式三份测量值的平均值±SD(bar)表示。四边形，Sema3A-nLytic(363-377)肽；三角形，Sema3A-nLytic(371-377)肽。
图34C示出了Sema3A-nLytic对各种细胞系的细胞毒性。将两种细胞(左：HuCCT1；右：HEK293)与不同浓度(0至20μM)的Sema3A-nLytic(363-377)或Sema3A-nLytic(371-377)一起培养48小时，并使用WST-8试剂检测细胞毒性。将该分析重复3次，且结果以一式三份测量值的平均值±SD(bar)表示。四边形，Sema3A-nLytic(363-377)肽；三角形，Sema3A-nLytic(371-377)肽。
图35示出了通过BIACORE对神经纤毛蛋白-1(NRP1)与Sema3A野生型肽和某些突变型肽的相互作用进行分析。(A)示出了Sema3A野生型肽与NRP1蛋白的结合。在并联传感器表面上对梯度稀释的不同浓度(1.6μM，13μM，26μM)的Sema3A野生型肽样品进行分析。(B)示出了Sema3A野生型肽和突变型肽(R372K和R372K/R377K)与NRP1蛋白的结合。在并联传感器表面上对不同的梯度稀释的Sema3A肽样品(26μM)进行分析。(C)示出了各种Sema3A肽与NRP1蛋白结合能力的略图。(D)示出了Sema3A野生型肽和突变型肽的肽序列。
图36示出了NRP1在胰腺癌细胞系和乳腺癌细胞系中的表达。(A)示出了NRP1在某些胰腺癌细胞系(BxPC-3，CFPAC-1，Panc-1和SU8686)和胰腺上皮细胞中的表达，由RT-PCR分析来检测。(B)示出了NRP1在乳腺癌细胞系(BT-20，MDA-MB-231，SKBR-3，TD47D和ZR-75-1)中的表达，由RT-PCR分析来检测。在所有RT-PCR分析中，使用β-肌动蛋白(actin)作为阳性对照。
图37示出了癌细胞中Sema3A-nLytic诱导Annexin V-阳性表达。在37℃下将PE细胞(上图)和BxPC-3细胞(下图)与Sema3A-nLytic肽(5μM)一起培养3小时，且6小时后，由双色流式细胞技术分析Annexin V标记。
图38A示出了Sema3A(aa363-377)-kLytic或单独的kLytic对癌细胞的细胞杀伤效应的图示。将4种胰腺癌细胞系((a)BxPC-3，(b)CFPAC-1，(c)Panc-1和(d)SU8686)与不同浓度的Sema3A(aa363-377)-kLytic(四边形)或kLytic(三角形)一起培养48小时，并使用WST-8试剂检测细胞毒性。纵轴表示细胞存活率(％)，横轴表示肽浓度(μM)。
图38B示出了kLytic(四边形)或Sema3A(aa363-377)-kLytic(三角形)对正常细胞的细胞杀伤效应的图示。将3种正常细胞系((a)PE、(b)MRC-5和(c)人类正常肝细胞)与不同浓度的Sema3A(aa363-377)-kLytic或kLytic一起培养48小时，并使用WST-8试剂检测细胞毒性。纵轴表示细胞存活率(％)，横轴表示肽浓度(μM)。
图39A示出了神经纤毛蛋白-1在某些胰腺癌细胞系(BxPC-3、Panc-1、SU8686和CFPAC-1)和胰腺上皮细胞中的表达，由RT-PCR分析来检测。对于全部RT-PCR分析，都使用GAPDH作为阳性对照。
图39B示出了借由实时PCR检测神经纤毛蛋白-1的表达。对于图39A的图示中所显示的各种细胞，使用实时PCR检测神经纤毛蛋白-1的表达。所有对照都使用GAPDH来分析。
图40示出了人类胰腺癌细胞系SU8686与Sema3A(363-377)-kLytic肽(10μM)在37℃下一起培养3小时，并针对Annexin V标记实施双色流式细胞技术分析的结果。这些结果表明，Sema3A(363-377)-kLytic也诱导针对癌细胞的Annexin V-阳性表达。
图41示出了VEGFR2-溶解肽对癌细胞和正常细胞的细胞毒性。将5种癌细胞系(OE19(白色三角形)、T47D(黑色三角形)、Bxpc3(白色菱形)、U937(黑色菱形)和LNCaP(x))和2种正常细胞系(HEK293(白色圆圈)和MRC-5(黑色圆圈))与不同浓度(0至20μM)的VEGFR2-溶解肽一起培养72小时，并使用WST-8试剂检测细胞毒性。纵轴表示细胞存活率(％)，横轴表示肽浓度(μM)。将该分析重复3次，且结果以一式三份测量值的平均值±SD(bar)表示。可以看出，VEGFR2-溶解肽对癌细胞具有特异的细胞毒性。
具体实施方式
关于本发明，将在下文中解释本发明的实施例。应了解，在本发明整个说明书中，除非特别提及，否则单数表达(用其他语言表示的相应的物件、形容词及诸如此类，例如用英语表示的“一(a)、一(an)”和“所述(the)”)还包含复数形式的概念。此外，应了解，本文所使用的术语以本领域中通常所使用的含义来使用，除非特别提及。因而，除非另有定义，否则本文所使用的全部技术术语和科学技术术语都具有与本领域技术人员通常所了解的含义相同的含义。在出现冲突的情况下，以本发明说明书(包括定义)为优先。
(术语的定义)
下文列示本文中具体所使用的术语的定义。
本文所用“表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)”是指属于EGF超家族的生长因子。从历史角度来讲，EGF的代表性例子是分子量约6,000且由53个氨基酸组成的多肽，已报导该肽作为药理活性物质出现在雄性小鼠的颌下腺中，分子中具有由6个半胱氨酸组成的3个二硫键。人们开始认为EGF特异地影响表皮细胞的生长，但其也影响非表皮细胞，呈现出不同的生物活性。作为EGF，可包括具有下列GenBank登录号等的基因作为代表例子：GenBank#NM_001963(人类(human))或Entrez Gene ID 1950。
本文所用“表皮生长因子受体”和“EGF受体”(EGFR)可互换使用，指配体是EGF的受体。业内已发现EGF受体v-erbB，这是一种出现在鸟类骨髓成红细胞增多症病毒(Avian Erythroblastosis Virus，AEV)的基因组中的病毒癌基因。人类基因组中出现的对应基因c-erbB1是一种EGFR基因。其结构如下文所述。
具体而言，EGF受体由单一多肽组成。N-端延伸形成具有配体结合位点的胞外区，并形成单次跨膜区。C-端形成具有酪氨酸激酶活性的胞内区。受体经由与配体结合，致使酪氨酸激酶激活。人类EGF受体是分子质量约170kDa的跨膜糖蛋白，其中以配体依赖性方式结合受体的胞外区是约95kDa的糖蛋白(Ogiso H等人，2002，Cell，110：775-87)。EGF或TGF-α与EGFR的结合激活信号转导途径，以促使细胞生长。EGFR分子的二聚化、高阶结构改变和内化的作用是转导细胞内信号，以控制细胞生长(G.Carpenter和S.Cohen，1979，Ann.Rev.Biochem.，48：193-216)。基因改变(其对生长因子受体的控制产生影响)的作用于或者促使过表达受体及/或配体，从而促使细胞生长(M.-J.Oh等人，2000，Clin.Cancer Res.，6：4760-4763)。GenBank#是NM_005228(人类)。此外，作为EGFR，可具有以下GenBank登录号或诸如此类的基因作为代表性实施例：Entrez Gene ID 1956。
本文所用“靶向结合”肽或“靶向结合”序列是指与靶点(例如，EGF受体或其他靶点)结合的肽或序列。举例而言，对在癌细胞中高表达的受体特异的结合序列可作为其实施例。
本文所用“对在癌细胞中高表达的受体特异的结合序列”是指与在癌细胞中高表达的受体特异性结合的序列。如下文所特别定义的，在癌细胞中高表达的受体包括分别特异性结合与细胞生长有关的生长因子受体、与血管生成有关的受体、细胞因子/趋化因子受体及诸如此类的肽序列。可通过噬菌体展示技术、三维结构分析或诸如此类，发现特异性结合序列。
本文所用“EGF受体结合肽(EB肽)”或“EGF受体-结合序列(EB序列)”是指与EGF受体结合的肽或序列。
通常，可纳入下列作为EGF受体-结合序列的实施例。
1)YHWYGYTPQNVI(SEQ ID NO：7；其中H可被R或K取代)。这些修饰的序列是通过噬菌体展示技术从肽库中筛选出来的序列，且迄今为止从未在突变分析或诸如此类中公布。它们是具有正电荷的H被R或K取代的突变体，同时注意带有电荷的氨基酸被认为对受体-配体键结很重要，且在本发明中预期具有重要作用。
本文中，当未特别提及时，“溶解肽部分”、“细胞毒素肽”和“细胞毒性序列”与“细胞溶解肽(序列)”或“细胞膜-溶解肽(序列)”可互换使用。其含有可溶解细胞膜的肽。典型地，其实施例包括那些由具有正电荷的氨基酸(K、R或(H))和疏水性氨基酸(L、A、F或诸如此类)组成且具有10-至30-氨基酸序列，及两亲性螺旋结构的肽(序列)。代表性肽序列阐述于下文中，如那些作用于癌细胞膜并呈现细胞杀伤效应和特别地可用于本发明中的肽序列：
KLLLKLLKKLLKLLKKK(SEQ ID NO：48；特别地SEQ ID NO：1、27或诸如此类)：细胞膜-溶解，FLKLLKKLAAKLF(SEQ ID NO：11)：抗菌肽衍生物、细胞膜电位-崩解，RLLRRLLRRLLRRLLRRLLR(SEQ ID NO：12)和RLLRRLLRRLLRK(SEQ ID NO：13)：抗菌肽衍生物、细胞膜-溶解和核酸-结合，KLAKLAKKLAKLAK(SEQ ID NO：4)：线粒体膜崩解。
因而，从此信息来看，可了解代表性细胞毒素肽是由具有正电荷的氨基酸(K、R或(H))和疏水性氨基酸(L、A、F或诸如此类)组成的10-至30-氨基酸序列，且具有两亲性螺旋结构。
根据以下观点显示，与称为原始序列的LKLLKKLLKKLLKLL-NH2(SEQID NO：41；加下划线的字母表示D-氨基酸)比较而言，使用KLLLKLLKKLLKLLKKK(SEQ ID NO：1；加下划线的字母表示D-氨基酸)获得效果显著：举例而言，其显示在该序列前组合EGFR-结合序列可以癌细胞特异性方式使细胞杀伤活性产生协同作用。其也显示，可实现对正常细胞的更大选择性。可与各种靶蛋白杂交。因而，可进一步靶向癌细胞。
此外，被称为nLytic的肽(LLKLLKKLLKKLLKL；SEQ ID NO：45；加下划线的字母表示D-氨基酸)在以下几点获得效果显著：可以发现，实现了对正常细胞的选择性，认为其毒性较低。还可以发现，与Sema3A肽组合可以癌细胞特异性方式使细胞杀伤活性产生协同作用。因而，可进一步靶向癌细胞。
本文所用“间隔(spacer)”是指在链大分子的分子间形成化学键的部分，如桥键。间隔的代表性实施例包括由G和P组成的0-至5-氨基酸序列。本文中，具体而言，间隔可介于溶解肽与EGF受体结合肽之间且可于其间键结。此间隔的例子包括(例如)GGG、GG、G、PP和GPG。间隔并非关键且可不存在，但在本发明中，优选包括此间隔。
本文所用“肽毒素”是指具有细胞毒性和细胞杀伤能力的抗癌-靶向肽。本发明肽毒素可包括通过将对应于爆炸(explosive)部分的细胞毒性部分与对应于弹头(warhead)部分的对癌细胞有特异性的指定部分组合在一起而形成的肽(例如，与在癌细胞中高度表达的受体特异性结合的肽/序列)。实际情况下，就“爆炸部分”而言优选细胞膜-溶解序列，就“弹头部分”而言可为与在癌细胞中高表达的蛋白(具体而言为受体)特异性结合的任何序列。举例而言，“癌细胞膜-溶解肽毒素”可作为代表性实施例，其由对在癌细胞中高表达的受体特异的结合序列、间隔和癌细胞膜-溶解序列组成。
“癌细胞膜-溶解肽毒素”的制备和使用方法阐述于下文中，其由对在癌细胞中高表达的受体特异的结合序列、间隔和癌细胞膜-溶解序列组成。本文中，对在癌细胞中高表达的受体特异的任何结合序列、任何间隔和任何癌细胞膜-溶解序列可任意组合。其制备和使用方法具体地阐述于下文中。
(制备方法)
对于由多个弹头和爆炸序列组合形成的肽毒素(其允许早期个性化治疗癌症)而言，能在较短时间内提供这些的化学合成是适宜的，但也可以是其中肽毒素通过基因重组强制表达且随后纯化的方法。
(使用方法)
就要处理的癌细胞而言，对细胞表面高表达的蛋白和对杀伤癌细胞的针对爆炸肽的敏感性进行研究。根据结果，选择弹头和爆炸部分，并设计对癌细胞最佳的肽毒素。视需要而定，将通过化学合成或诸如此类所获得的特制肽毒素与药物递送系统(DDS，Drug Delivery System)(例如去端肽胶原(atelocollagen))组合在一起，局部或全身给药治疗。
当本发明人所使用的细胞膜-溶解序列单独使用时，需要接触较长时间才呈现对癌细胞的杀伤效应，且细胞杀伤效应也较温和。然而，当细胞膜-溶解序列与要嵌合的癌细胞-靶向序列偶联时，所产生的序列优选地与该序列的靶分子高表达的癌细胞结合。因而，可减少接触时间，并也提高细胞杀伤效应。实际上，结合序列(例如IL4受体、her2或诸如此类)嵌合时，细胞杀伤效应的提高和接触时间的减少已得到证实。因此，可理性地预期，甚至其他类似的嵌合序列也可获得类似的效果：细胞杀伤效应提高和接触时间减少。
关于在早期允许此个性化治疗的肽毒素，弹头和爆炸部分的组合可成为癌症患者的重要治疗手段。因而，本发明的新概念肽毒素的重要性在于其为癌症患者提供最大益处。
应注意本发明的嵌合肽或肽毒素，因为作为嵌合的结果，与单独的细胞膜-溶解肽相比，甚至在各种类型的嵌合肽被授权专利的最新的现有技术相比，其针对癌细胞获得了癌细胞靶向、细胞杀伤效应的提高和瞬时细胞杀伤效应。
指定用于细胞膜通透性且本文可使用的部分序列如下文所述。共同的特征包括(例如)含有大量带电荷的氨基酸。
本文所用“细胞穿膜肽(cell permeable peptide)”是指能穿过细胞膜以侵入细胞内部的肽。某肽是否是“细胞穿膜肽”，可由下列实验进行检测。具体而言，本文中，关于Antp(如习知方法中所阐述(参见Derossi等人，J.Biol.Chem.1996，271，18188-18193))，可将生物素化的Antp肽添加到细胞中，随后添加经链霉亲和素化学标记的化合物，并使用荧光显微镜确定Antp肽在细胞中的定位。或者，对于与链霉亲和素-结合抗体反应且随后以相同方式化学标记的抗体，可使用荧光显微镜类似地确定其定位，从而证实侵入到细胞内部。
细胞穿膜肽的实施例可包括(例如)RQIKIQFQNRRMKWKK(Antp；SEQID NO：58)(其是触角足(Antennapedia)同源异型盒序列)、YGRKKRRQRRR(TAT；SEQ ID NO：23)、RRRRRRRRRRR(SEQ ID NO：24)及诸如此类。通常，其结构可包括(例如)Gene ID 155871(TAT蛋白本身)。此外，作为细胞穿膜肽，具有下列GenBank登录号或诸如此类的基因可成为代表性实施例：NP_057853；Tat(人类免疫缺陷病毒1，氨基酸序列)MEPVDPRLEPWKHPGSQPKT ACTNCYCKKC CFHCQVCFIT KALGISYGRK KRRQRRRAHQNSQTHQASLS KQPTSQPRGD PTGPKE 1(SEQ ID NO：57)。
细胞质中用于特异性抑制癌细胞生长且本文中可使用的部分序列的实施例包括KAYARIGNSYFK(TPR；SEQ ID NO：59)，该序列是HSP90 TPR域-结合肽，及诸如此类。
本文中所使用的代表性细胞毒素肽可包括细胞膜-溶解肽、细胞膜电位-去稳定化肽、细胞膜-溶解与核酸-结合肽和线粒体膜-崩解肽。
本文所用“细胞膜-溶解肽”是指由具有正电荷的氨基酸(K、R或(H))和疏水性氨基酸(L、A、F或诸如此类)组成，且具有10-至30-氨基酸序列及两亲性螺旋结构的肽，其从外部崩解细胞膜以呈现细胞杀伤效应。代表性具体实施例包括：具有仅由K和L组成的10-至20-氨基酸序列的肽，其中氨基酸是L-、D-或D，L-混合氨基酸，例如KLLLKLLKKLLKLLKK(SEQ ID NO：48；特别地SEQ ID NO：1、27或诸如此类)。
本文所用“细胞膜电位-去稳定化肽”是指由具有正电荷的氨基酸(K、R或(H))和疏水性氨基酸(L、A、F或诸如此类)组成且具有10-至30-氨基酸序列的肽，其从外部在细胞膜上形成孔，使细胞膜电位不稳定，崩解细胞膜，并呈现细胞杀伤效应。代表性具体实施例包括FLKLLKKLAAKLF(SEQ ID NO：11)及诸如此类。
本文所用“细胞膜-溶解和核酸-结合肽”是指由具有正电荷的氨基酸(K、R或(H))和疏水性氨基酸(L、A、F或诸如此类)组成且具有10-至30-氨基酸序列及两亲性螺旋结构的肽，其从外部崩解细胞膜，侵入到细胞内部，与核酸结合并诱导细胞死亡。代表性具体实施例包括具有仅由K和L组成的10-至20-氨基酸序列的肽，其中氨基酸是L-、D-或D，L-混合氨基酸，例如RLLRRLLRRLLRRLLRRLLR(SEQ ID NO：12)、RLLRRLLRRLLRK(SEQ IDNO：13)及诸如此类。
本文所用“线粒体膜-崩解肽”是指由具有正电荷的氨基酸(K、R或(H))和疏水性氨基酸(L、A、F或诸如此类)组成且具有10-至30-氨基酸序列及两亲性螺旋结构的肽，其仅在成功侵入细胞内部后才崩解线粒体膜以诱导细胞死亡。代表性具体实施例包括KLAKLAKKLAKLAK(SEQ ID NO：4)及诸如此类。
细胞毒素肽的优选实施例包括由具有正电荷的氨基酸(K、R或(H))和疏水性氨基酸(L、A、F或诸如此类)组成且具有10-至30-氨基酸序列及两亲性螺旋结构的肽。优选地，具有正电荷的氨基酸可为K、R或H，且疏水性氨基酸可为I、L、V、A或F。
本发明中所使用的疏水性氨基酸是KLLLKLLKKLLKLLKKK，其中每一氨基酸都是L-或D-氨基酸，且加下划线的字母表示D-氨基酸。
作为由本发明所阐释的事项，其显示其中与受体结合肽(例如EGFR)偶联的嵌合肽具有两亲性螺旋结构是有利的，优选为α-螺旋结构。因而，在构建包括其他受体结合肽和细胞毒素肽的嵌合肽的情况下，有利地，此肽也具有两亲性螺旋结构，且优选地为α-螺旋结构。应了解，这些事项也可由图1D中所示的结果推断出来。具体而言，已证实EB-溶解肽与由磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine，PC)(其是正常细胞膜表面上的主要脂质物)组成的单层小泡囊(Small Unilamellar Vesicle，SUV)结合较弱，且与PC脂质体不能很好的构建；但此EB-溶解肽能与含有磷酸酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)(其特异地暴露在癌细胞膜上)的SUV结合，且符合特征为双重最小值在209-210和222nm的部分螺旋结构。已发现，EB-原始的溶解肽能与PC和PC/PS脂质体二者强结合，且符合螺旋结构(图1D(c))。这表明，本发明中新设计的嵌合肽对含PS的膜具有选择性且符合螺旋结构，所述螺旋结构被认为对在细胞表面上形成孔是至关重要的(Papo，N.& Shai，Y.New Lytic peptides based on the D，L-amphipathic helix motif preferentially kill tumor cells compared to normal cells.Biochemistry 42，9346-9354(2003))。因而，这些数据可作为参考且有助于设计其他形式的溶解肽。
此实施例包括选自包含SEQ ID NO：2、14、21、42和43的序列或其修饰序列的组。此处，修饰的序列包括以下序列：包括对这里所具体阐述的序列经一个或多个氨基酸取代、添加或缺失、优选地保守性取代的序列。
在一个实施例中，本发明的嵌合肽具有SEQ ID NO：15中所阐明的序列或其修饰的序列。此处，修饰的序列包括以下序列：包括对这里具体所阐述的序列经一个或多个氨基酸取代、添加或缺失、优选地保守性取代的序列。
在一个实施例中，本发明的嵌合肽具有SEQ ID NO：16中所阐明的序列或其修饰的序列。此处，修饰的序列包括以下序列：包括对这里具体所阐述的序列经一个或多个氨基酸取代、添加或缺失、优选地保守性取代的序列。
在一个实施例中，本发明的嵌合肽具有SEQ ID NO：17中所阐明的序列或其修饰的序列。此处，修饰的序列包括以下序列：包括对这里具体所阐述的序列经一个或多个氨基酸取代、添加或缺失、优选地保守性取代的序列。
在一个实施例中，本发明的嵌合肽具有SEQ ID NO：18或44中所阐明的序列或其修饰的序列。此处，修饰的序列包括以下序列：包括对这里具体所阐述的序列经一个或多个氨基酸取代、添加或缺失、优选地保守性取代的序列。
在一个实施例中，本发明的嵌合肽具有SEQ ID NO：19中所阐明的序列或其修饰的序列。此处，修饰的序列包括以下序列：包括对这里具体所阐述的序列的经一个或多个氨基酸取代、添加或缺失、优选地保守性取代的序列。
在一个实施例中，本发明的嵌合肽具有SEQ ID NO：20、46或47中所阐明的序列或其修饰的序列。此处，修饰的序列包括以下序列：包括对这里具体所阐述的序列经一个或多个氨基酸取代、添加或缺失、优选地保守性取代的序列。
就其修饰的序列而言，根据本文描述，本领域的技术人员可做出改变，以使序列具有优选的两亲性(α)螺旋结构。此外，例如，就一个氨基酸取代而言，已证实与EGF-R有关的嵌合肽中仍保留两亲性(α)螺旋结构。应了解，也可预期其他嵌合肽仍保留两亲性(α)螺旋结构。进一步，应了解，本领域的技术人员参照实施例中的描述可适当地做出其他改变，例如多个氨基酸的取代，及诸如此类。
在另一优选实施例中，作为在细胞内起作用的癌细胞生长-抑制肽，使用具有序列RQIKIQFQNRRMKWKKKAYARIGNSYFK(SEQ ID NO：25)的肽。或者，也可使用称为TAT的肽(YGRKKRRQRRR)(SEQ ID NO：23)。已知，其中连接有11个R的序列RRRRRRRRRRR(SEQ ID NO：24)可穿过细胞，因此也可使用此序列。而且，本领域的技术人员可适当地确定细胞穿膜肽与TPR域-结合肽的优选组合。优选地，可使用采用与Antp的组合。
本文所用“嵌合肽”是指由两个或两个以上的具有不同基因型的部分(肽)构成的肽，也被称为融合蛋白，用来研究某一蛋白结构域的作用或检测所感兴趣蛋白的表达。
本文所用“类似的氨基酸”是指具有保守性取代关系的氨基酸，且对应以下氨基酸：
A：G、I、V、L
C：M(含S的氨基酸)
D：N、Q或E
E：Q、N或D
F：Y、A或诸如此类
G：A
H：W、R、K或诸如此类
I：A、L、V、(G)
K：R、H
L：A、I、V、(G)
M：S或诸如此类
N：D、E或Q
P：HyP
Q：E、N或D
R：K、H
S：T、Y
T：S、Y
V：I、L、A、(G)
W：H
Y：F、S、T。
本文中将这些氨基酸间的取代称为“保守性取代”。
本文中，经常见于EGF受体结合肽中的氨基酸是指那些经常见于各种EGF受体结合肽中的氨基酸。通常，包括具有保守性取代关系的氨基酸。或者，对应以下氨基酸：
具有氨基酸序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12(SEQ ID NO：8)的肽，其中：
X1是Y或与Y类似的氨基酸；
X2是H或与H类似的氨基酸；
X3是W或与W类似的氨基酸；
X4是Y或与Y类似的氨基酸；
X5是G或与G类似的氨基酸；
X6是Y或与Y类似的氨基酸；
X7是T或与T类似的氨基酸；
X8是P或与P类似的氨基酸；
X9是Q或与Q类似的氨基酸；
X10是N或与N类似的氨基酸；
X11是V或与V类似的氨基酸；且
X12是I或与I类似的氨基酸。
优选地，X1是Y或具有OH基团或芳香基团的与Y类似的氨基酸；
X2是H或具有正电荷的与H类似的氨基酸；
X3是W或具有芳香基团的与W类似的氨基酸；
X4是Y或具有OH基团的与Y类似的氨基酸；
X5是G或具有脂肪侧链的与G类似的氨基酸；
X6是Y或具有OH基团的与Y类似的氨基酸；
X7是T或具有OH基团的与T类似的氨基酸；
X8是P或与P类似的亚氨基酸类氨基酸；
X9是Q或与Q类似的酰胺类氨基酸；
X10是N或具有OH基团的与N类似的氨基酸；
X11是V或具有脂肪侧链的与V类似的氨基酸；且
X12是I或具有脂肪侧链的与I类似的氨基酸。
更为优选地，X1是Y或与Y类似的氨基酸S、H或F；
X2是H或与H类似的氨基酸R或K；
X3是W或与W类似的氨基酸Y、F或H；
X4是Y或与Y类似的氨基酸S、H或F；
X5是G或与G类似的氨基酸A、V、I或L；
X6是Y或与Y类似的氨基酸S、H或F；
X7是T或与T类似的氨基酸S、H或F；
X8是P或与P类似的氨基酸羟脯氨酸；
X9是Q或与Q类似的氨基酸N；
X10是N或与N类似的氨基酸S、H或F；
X11是V或与V类似的氨基酸G、A、L或I；且
X12是I或与I类似的氨基酸G、A、V或L。
优选X2是H或与H类似的氨基酸R或K(例如，YRWYGYTPQNVI(SEQID NO：9)或YKWYGYTPQNVI(SEQ ID NO：10))的序列，因为发现这样的序列可提高活性。
本文中，当所使用的受体结合肽是白介素4(IL-4)受体结合肽时，可使用氨基酸序列KQLIRFLKRLDRN(SEQ ID NO：26)或其修饰的序列。此处，修饰的序列可以与EGFR-结合肽相同的方式进行修饰。该修饰，可参照Thorsten Hage等人，Cell.1999，vol.97，No.2，pp.271-81。该文献以引用方式并入本文中。
本文中，当所使用的受体结合肽是白介素13(IL-13)受体结合肽时，可使用氨基酸序列KDLLLHLKKLFREGQFN(SEQ ID NO：28)或其修饰的序列。此处，修饰的序列可以与EGFR-结合肽相同的方式进行修饰。该修饰，可参照Yuichiro Yoshida等人，Biochem Biophys Res Commun.2007，vol.358，No.1，pp.292-297。此文献以引用方式并入本文中。
本文中，当所使用的受体结合肽是神经纤毛蛋白(neuropilin)受体结合肽时，可使用氨基酸序列NYQWVPYQGRVPYPR(SEQ ID NO：29)或其修饰的序列。此处，修饰的序列可以与EGFR-结合肽相同的方式进行修饰。该修饰，可参照Alexander Antipenko等人，Neuron.2003，vol.39，No.4，pp.589-598。此文献以引用方式并入本文中。这些文献仅提出蛋白制剂(例如免疫毒素)中的问题，但未提供如本发明中的嵌合肽。
本文中，当所使用的受体结合肽是2型人类表皮生长因子受体(HumanEpidermal Growth Factor Receptor Type 2，HER2)-结合肽时，可使用氨基酸序列YCDGFYACYMDV(SEQ ID NO：30)、LLGPYELWELSH(SEQ ID NO：52)、ALVRYKDPLFVWGFL(SEQ ID NO：53)、KCCYSL(SEQ ID NO：54)、WTGWCLNPEESTWGFCTGSF(SEQ ID NO：55)、DTDMCWWWSREFGWECAGAG(SEQ ID NO：56)或其修饰的序列。此处，修饰的序列可以与EGFR-结合肽相同的方式进行修饰。该修饰，可参照Valeria R.Fantin等人，Cancer Res.2005，vol.65，No.15，pp.6891-6900。此文献以引用方式并入本文中。
本文中，当所使用的受体结合肽是血管内皮生长因子受体1(VascularEndothelial Growth factor 1，VEGFR1)-结合肽时，可使用氨基酸序列WHSDMEWWYLL(SEQ ID NO：31)或其修饰的序列。此处，修饰的序列可以与EGFR-结合肽相同的方式进行修饰。该修饰，可参照Kimberly J.Peterson等人，Analytical Biochemistry 2008，vol.378，No.1，pp.8-14(关于VEPNCDIHVMWEWECFERL-NH2(SEQ ID NO：32))和Borlan Pan等人，J.Mol.Biol.2002，vol.316，No.3，pp.769-787(关于GGNECDAIRMWEWECFERL(SEQ ID NO：33))。这些文献以引用方式并入本文中。
本文中，当所使用的受体结合肽是转铁蛋白受体(Transferrin Receptor，TfR)-结合肽时，可使用氨基酸序列THRPPMWSPVWP(SEQ ID NO：34)或其修饰的序列。此处，修饰的序列可以与EGFR-结合肽相同的方式进行修饰。该修饰，可参照Jae H.Lee等人，Eur.J.Biochem.2001，vol.268，pp.2004-2012。此文献以引用方式并入本文中。
此外，受体结合肽可以是：成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast GrowthFactor Receptor，FGFR)-结合肽，其是MQLPLAT(SEQ ID NO：5)或AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO：6)；神经纤毛蛋白1(NRP1)/血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)-结合肽，其是ATWLPPR(SEQ ID NO：36)；ephrinB1(EphB1)-结合肽，其是EWLS(SEQ ID NO：37)；ephrin B2(EphB2)-结合肽，其是SNEW(SEQ ID NO：38)；白介素-11受体(IL11R)-结合肽，其是CGRRAGGSC(环状)(SEQ ID NO：22)；葡萄糖调节蛋白78(Glucose-Regulating Protein，GRP78)-结合肽，其是WDLAWMFRLPVG(SEQID NO 39)或CTVALPGGYVRVC(环状)(SEQ ID NO：40)；前列腺特异性膜抗原(Prostate-Specific Membrane Antigen，PSMA)-结合肽，其是CQKHHNYLC(SEQ ID NO：35)；或其修饰的序列。此处，修饰的序列可以与EGFR-结合肽相同的方式进行修饰。该修饰，可参照以下文献：对于FGFR(MQLPLAT(SEQ ID NO：5))，Fukuto Maruta等人，Cancer Gene Therapy.2002，vol.9，pp.543-552；对于FGFR(AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO：6))，Akiko Komi等人，Exp.Cell Res.2003，vol.283，No.1，pp.91-100；对于NRP1/VEGFR2(ATWLPPR(SEQ ID NO：36))，Loraine Tirand等人，J.ControlRelease.2006，vol.111，pp.153-164；对于EphB1和EphB2，Mitchell Koolpe等人，J.Biol.Chem.2005，vol.280，No.17，pp.17301-11；对于IL11R，Amado J.Zurita等人，Cancer Res.2004，vol.64，pp.435-439；对于GRP78(WDLAWMFRLPVG(SEQ ID NO：39))，Marco A.Arap等人，Cancer Cell.2004，vol.6，pp.275-284；对于GRP78(CTVALPGGYVRVC(SEQ ID NO：40)及诸如此类)，Ying Liu等人，Mol.Pharmaceutics.2007，vol.4，No.3，pp.435-447，Hardy B等人，Therapeutic angiogenesis of mouse hind limb ischemia by novelpeptide activating GRP78 receptor on endothelial cells.Biochemical Pharmacology75，891-899，2008；且对于PSMA，Kaushal Rege等人，Cancer Res.2007，vol.67，No.13，pp.6368-6375。这些文献以引用方式并入本文中。
这些取代可单独使用或通过一个以上的组合使用。应了解，这些优选取代的任何组合都可有效，因为作为这些取代的结果，发现效果得到提高。应了解，可引入这些突变中的一种或多种。这是由于，尽管不希望受限于理论，但应了解当容许突变时，应了解原始活性类型的三维结构及与生物靶点相互作用的活性及诸如此类应得到保留或提高，从而预期其多个取代的组合也具有类似效应。在本发明情况下，对取代1个氨基酸而使活性改变而言，预期与其伴侣蛋白的相互作用受到影响，但从本发明的最终目的即抗癌活性来看，活性得到保留。因而，可预期即使在这些氨基酸取代组合的情况下也可获得类似效应。
本文所用“蛋白”、“多肽”、“寡肽”和“肽”在本说明书中以相同含义使用，且是指具有任一长度的氨基酸聚合物。此聚合物可为直链、支链或环状。氨基酸可以是天然存在或非天然存在的氨基酸，且可以是修饰的氨基酸。这些术语可涵盖那些与具有多个多肽链的复合物组合者。这些术语进一步涵盖天然存在或人工修饰的氨基酸聚合物。此修饰的实施例包括(例如)二硫键的形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酰化或任何其他操作或修饰(例如，与标记成分偶联)。所述定义也涵盖(例如)包括一种或以上的氨基酸(包括，例如人造氨基酸及诸如此类)类似物的多肽、拟肽化合物(例如，类肽)和本领域中习知的其他修饰形式。
本文所用“氨基酸”可为天然存在或非天然存在的氨基酸，只要其满足本发明目的即可。
本文所用“核酸”可与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。特定的核酸序列也涵盖“剪接变异体”。类似地，由核酸编码的特定蛋白无疑地涵盖由该核酸的剪接变异体编码的任何蛋白。如由名称所表明，“剪接变体”是基因选择性剪接的产物。转录后，可剪接第一核酸转录产物，以使不同(其他)的核酸剪接产物编码不同的多肽。改变剪接变体的产生机制，且纳入外显子的选择性剪接。在此定义中也涵盖通过通读转录由同一核酸衍生的其他多肽。在此定义中涵盖剪接反应的任何产物(包括重组体形式的剪接产物)。或者，也可将等位基因突变体纳入此范围中。
本文所用“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”以相同含义使用，且是指具有任一长度的核苷酸聚合物。这些术语可涵盖“寡核苷酸衍生物”或“多核苷酸衍生物”。“寡核苷酸衍生物”或“多核苷酸衍生物”是指包括核苷酸衍生物或其中核苷酸间的键与平常不同的寡核苷酸或多核苷酸，且这些术语可互换使用。该寡核苷酸的具体实施例包括(例如)2’-O-甲基-核糖核苷酸、通过将寡核苷酸中的磷酸二酯键转化为硫代磷酸酯键而获得的寡核苷酸衍生物、通过将寡核苷酸中的磷酸二酯键转化为N3′-P5′磷酰胺酯键而获得的寡核苷酸衍生物、通过将寡核苷酸中的核糖和磷酸二酯键转化为肽核酸键而获得的寡核苷酸衍生物、通过用C-5丙炔尿嘧啶取代寡核苷酸中的尿嘧啶而获得的寡核苷酸衍生物、通过用C-5噻唑尿嘧啶取代寡核苷酸中的尿嘧啶而获得的寡核苷酸衍生物、通过用C-5丙炔胞嘧啶取代寡核苷酸中的胞嘧啶而获得的寡核苷酸衍生物、通过用吩恶嗪修饰的胞嘧啶取代寡核苷酸中的胞嘧啶而获得的寡核苷酸衍生物、通过用2′-O-丙基核糖取代DNA中的核糖而获得的寡核苷酸衍生物、通过用2′-甲氧基乙氧基核糖取代寡核苷酸中的核糖而获得的寡核苷酸衍生物、及诸如此类。除非另外指明，否则特定核酸序列涵盖明确阐述的序列和其经保守修饰的变体(例如，用简并密码子取代的变体)和互补序列。具体而言，用简并密码子取代的变体可通过产生其中一个或多个所选(或全部)密码子的第3位经混合碱基及/或脱氧次黄苷残基取代的序列来达成(Batzer等人，Nucleic AcidRes.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。
本文所用“核苷酸”可以是天然存在或非天然存在的核苷酸，只要仍保留所需功能即可。
本文所用“搜索”是指通过电子或生物方法或其他方法，利用核酸碱基序列来发现具有特定功能及/或特性的其他核酸碱基序列。电子搜索包括(但不限于)包括(但不限于)BLAST(Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990))、FASTA(Pearson & Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 85：2444-2448(1988))、Smith和Waterman方法(Smith和Waterman，J.Mol.Biol.147：195-197(1981))、和Needleman与Wunsch方法(Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443-453(1970))。生物搜索包括(但不限于)严格杂交、通过将基因组DNA粘附在尼龙膜上所形成的微阵列(microarray)或诸如此类、通过将基因组DNA粘附到玻璃板所形成的微阵列(微阵列分析)、PCR、原位杂交(in situ hybridization)及诸如此类。本文中，本发明中所使用的基因(例如，HSP90或诸如此类)应包括由此电子搜索或生物搜索所确定的相应基因。
本文中，也可使用与特定基因序列杂交的核酸序列，只要其起作用即可。此处，杂交的“严格条件”是指在所述条件下，具有与靶序列相似或同源性的核酸链的互补链优选地与靶序列杂交，而不具相似或同源性的核酸链的互补链基本上不杂交。核酸序列的“互补链”是指基于核酸碱基之间的氢键配对的核酸序列(例如，T对A和C对G)。严格条件有序列依赖性，且在不同情况下有所变化。具体而言较长的序列在较高温度下杂交。通常，在确定的离子强度和pH下，特定序列的严格条件选定比热解链温度(Tm)低约5℃。Tm是指在确定的离子强度、pH和核酸浓度下，与靶序列互补的核苷酸的50％与靶序列杂交的平衡状态的温度。“严格条件”有序列依赖性，且视不同的环境参数而有所不同。核酸杂交的一般指导原则见于Tijssen(Tijssen(1993)，LaboratoryTechniquesIn Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid ProbesPart I，Chapter 2，“Overview of principles of hybridization and the strategy ofnucleic acid probe assay”，Elsevier，New York)。
通常，严格条件是在所述条件下盐浓度低于约1.0M Na+。通常，在pH 7.0至8.3时Na+浓度(或其他盐)为约0.01至1.0M，且对于短核苷酸(例如，10至50个核苷酸)温度至少约30℃，且对于长核苷酸(例如，多于50个核苷酸)温度至少约60℃。严格条件也可通过添加去稳定剂(例如甲酰胺)达成。在本发明说明书中，严格条件的实施例包括在缓冲液(50％甲酰胺，1M NaCl，1％SDS)(37℃)中杂交，并在60℃下于0.1×SSC(Saline-sodium citrate，盐水-柠檬酸钠)中洗涤。
本文所用“严格条件下的多核苷酸杂交”是指本领域中常用的众所周知的条件。通过使用选自本发明多核苷酸的多核苷酸作为探针，且通过使用菌落杂交技术、噬菌斑杂交技术或Southern印迹法(Southern blot)杂交技术或诸如此类，可得到所述多核苷酸。具体而言，所述术语指可通过下列鉴定的多核苷酸：使用固定有菌落或来自噬菌斑的DNA的滤纸，在65℃，存在0.7至1.0M NaCl下杂交；随后使用0.1至2倍浓度的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成是150mM氯化钠和15mM柠檬酸钠)在65℃洗涤滤纸。杂交可根据实验教科书中所阐述的方法进行，例如Molecular Cloning，第2版，Current Protocols inMolecular Biology，增刊1-38，DNA Cloning 1：CoreTechniques，A PracticalApproach，第2版，OxfordUniversity Press(1995)。此处，优选地，将只包含A碱基或只包含T碱基的序列排除在严格条件下杂交的序列之外。“可杂交多核苷酸”是指在前述杂交条件下能与其他多核苷酸杂交的多核苷酸。可杂交多核苷酸的实施例，具体而言包括与DNA的碱基序列(编码具有本发明中具体所阐述的氨基酸序列的多肽)至少有60％同源性的多核苷酸，优选地具有80％或80％以上同源性的多核苷酸，或具有90％或90％以上同源性的多核苷酸，且更为优选地，具有95％或95％以上同源性的多核苷酸。
氨基酸在本文中可以如通常所习知的三字母密码或者由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(Biochemical Nomenclature Commission)所推荐的单字母密码表示。核苷酸也可以如通常所了解的单字母密码提及。
本文所用基因的“同源性”是指两个或两个以上的基因序列间相互一致的程度。因而，两基因的同源性越高，序列的一致性或相似性越高。两基因是否具有同源性，可通过直接比较序列来研究，或对于核酸而言，通过在严格条件下杂交来研究，或诸如此类。在直接比较两基因序列的情况下，当DNA序列在基因序列间典型地具有至少50％一致性、优选地至少70％一致性、更为优选地至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性时，所述基因具有同源性。
本文中，氨基酸序列和碱基序列的相似性、一致性和同源性的比较是使用缺省参数的BLAST(一种用于序列分析的工具)计算而得。一致性搜索可通过使用NCBI BLAST 2.2.9(2004年5月12日公布)进行。本文所阐述的一致性的值通常是指在对齐情况下，于缺省条件下进行BLAST的值。然而，当通过改变参数给出较高值时，则使用最高值作为一致性的值。当在多个区域中检测一致性时，使用其最高值作为一致性的值。
本文所用的“相应”基因是指在某一物种中具有或预期具有与作为比较基础的指定物种基因类似作用的基因。当具有该作用的多个基因存在时，“相应”基因是指具有进化上同源的基因。因而，与某一基因(例如，EGFR)相应的基因可以是所述基因的直系同源。因而，与某一人类基因相应的基因也可见于其他动物(例如小鼠、大鼠、猪、兔、豚鼠、牛和羊)中。该相应基因可使用本领域中众所周知的技术鉴定。因此，举例而言，可通过使用相应基因基础的基因序列作为查询序列，在动物(例如，小鼠、大鼠、猪、兔、豚鼠、牛、羊或诸如此类)的序列数据库中进行搜索，进而发现动物的相应基因。
本文所用“片段”是指相对于全长多肽或多核苷酸(长度：n)序列中，序列长度长达1至n-1的多肽或多核苷酸。片段的长度视目的而定，可适当地变化。长度的下限实施例包括3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50个和更多个氨基酸。此处未具体列示的整数所表示的长度(例如，11)也可适当地作为下限。而且，在多核苷酸的情况下，下限的实施例包括5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、75、100个和更多个核苷酸，且此处未具体列示的整数所表示的长度(例如，11)也可适当地作为下限。本文中，多肽和多核苷酸的长度可分别由氨基酸和核酸的数量表示，如上文所述。前述数字并非绝对的。前述作为上限或下限的数字也包括比前述数字多或少一些(或者，例如多或少10％)的数字，只要具有相同功能即可。为了表达此意向，本文中，数字可用附在数字之前的“约”来表达。然而，应了解，本文中“约”的存在或不存在不影响对数值的诠释。本文中，视作为片段基础的全长蛋白(其是片段的基础)是否保留至少一种功能而定，可确定有用片段的长度。
本文所用“变体”、“修饰的序列”或“类似物”是指相对于原始物质(例如多肽或多核苷酸)其包括部分变化，其优选地基本上仍保留原始多肽或多核苷酸的至少一种功能。此变体的实施例包括取代变体、添加变体、缺失变体、截短变体、等位基因突变体及诸如此类。等位基因是指位于相同基因位点的一对不同基因变体的一个成员。因此，“等位基因突变体”是指与某基因的等位基因有一定关系的变体。“物种同源或同源”是指在氨基酸或核苷酸水平上与某一物种的给定基因具有同源性(优选地60％或60％以上的同源性，且更为优选地80％或80％以上、85％或85％以上、90％或90％以上、和95％或95％以上的同源性)。由本说明书的描述可明了获得此物种同源的方法。
在本说明书中，为了制备功能相当的多肽，除氨基酸取代以外也可实施氨基酸添加、缺失或修饰。氨基酸取代是指用一个或多个(例如，1至10个、优选地1至5个、且更为优选地1至3个)氨基酸替代原始肽的氨基酸。氨基酸添加是指给原始肽添加一个或多个(例如，1至10个、优选地1至5个、且更为优选地1至3个)氨基酸。氨基酸缺失是指从原始肽缺失一个或多个(例如，1至10个、优选地1至5个、且更为优选地1至3个)氨基酸。氨基酸修饰包括(但不限于)酰胺化、羧基化、硫酸化、卤化、烷基化、磷酸化、羟基化、酰化(例如，乙酰化)及诸如此类。欲取代或添加的氨基酸可为天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸或氨基酸类似物。优选天然存在的氨基酸。
所述核酸可通过众所周知的PCR技术获得，且也可用化学方法合成。举例而言，定点突变技术、杂交技术或诸如此类可与此方法组合。
本文所用多肽或多核苷酸的“取代、添加及/或缺失”是指原始多肽或多核苷酸中氨基酸或其取代物、或核苷酸或其取代物的取代、添加或去除。此取代、添加及/或缺失技术在本领域内众所周知，包括(例如)定点突变技术。在作为基础的核酸分子或多肽中，这些变化可发生在核酸分子的5′或3′末端、发生在代表此多肽的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端，或者可发生在这些末端之间的任何地方，并在作为基础的序列中的残基间单独扩展，只要仍保留所需的功能即可(例如，与TPR域结合)。可进行任何数目的取代、添加或缺失，只要所述数目是一个或多个即可。可增大此数目，只要所需的功能(例如，与TPR域结合)仍保留在具有此取代、添加或缺失的变体中即可。举例而言，所述数目可以是一个或数个，且优选地可以是全长的20％或20％以下、15％或15％以下、10％或10％以下或5％或5％以下，或者150个或150个以下、100个或100个以下、50个或50个以下、25个或25个以下或诸如此类。
(肽的制备和分析)
本发明肽(例如，嵌合肽)可通过本领域中众所周知的方法(例如，下文所论述的化学合成和通用工业技术)获得或制备。举例而言，与包括所需区域或域的一部分肽对应的肽，或在体外介导期望活性的肽，可使用肽合成仪来合成。肽也可由亲水性分析来分析，所述亲水性分析可用来确定肽的疏水性和亲水性区域(参见，例如，Hopp and Woods，1981.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.78：3824-3828)，从而有助于设计供实验操作(例如，结合实验或抗体合成)的物质。也可实施二级结构分析，以便确定建立特定结构模体(motif)的肽的区域(参见，例如，Chou and Fasman，1974，Biochem.13：222-223)。操纵、翻译、二级结构预测、亲水性和疏水性图、开放读取框的预测和绘制、序列同源性的确定，都可使用本领域中可利用的计算机软件程序来达成。用于结构分析的其他方法的实施例包括X-射线结晶分析(参见，例如，Engstrom，1974.Biochem.Exp.Biol.11：7-13)；质谱法和气相色谱法(参见，例如，METHODSIN PROTEIN SCIENCE，1997.J.Wiley and Sons，New York，NY)。也可使用计算机模拟技术(参见，例如，Fletterick和Zoller编辑，1986.Computer Graphicsand Molecular Modeling：CURRENT COMMUNICATION IN MOLECULARBIOLOGY，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。
本发明进一步涉及编码含有L-氨基酸的本发明肽的核酸。编码本发明肽的核酸的适当源包括人类基因组序列。其他源，包括大鼠基因组序列。蛋白质序列对应见于GenBank，且其全部以引用方式并入本文中。编码肽的核酸可由本领域中所习知的任何方法(例如，使用可与序列的3′-和5′-末端杂交的合成引物经PCR扩增，及/或使用cDNA特异性的寡核苷酸序列或预设的基因序列自基因组文库中克隆)得到。
对于肽重组体的表达，可将包括全部或部分编码所述肽的核酸序列的核酸插入到适当的表达载体中(即，包括插入的肽编码序列进行转录和翻译所需元件的载体)。在某些实施例中，调控元件有异源性(即，非原生的基因启动子)。或者，必需的转录信号和翻译信号由基因原生的启动子及/或与其邻近的区域提供。各种宿主载体系统可用于编码肽序列的表达。其包括(但不限于)：(i)受痘苗病毒、腺病毒或诸如此类感染的哺乳动物细胞系统；(ii)受杆状病毒或诸如此类感染的昆虫细胞系统；(iii)含有酵母载体的酵母；或(iv)经噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌。根据所使用的宿主细胞系统，可使用多种适宜的转录元件和翻译元件中的任何一种。
作为表达载体中的启动子/增强子序列，可使用本发明中所提供的植物、动物、昆虫或霉菌调节序列。举例而言，可使用得自酵母和其他霉菌的启动子/增强子元件(例如，GAL4启动子、醇脱氢酶启动子、磷酸甘油激酶启动子、碱性磷酸酶启动子)。表达载体或其衍生物的实施例包括人类或动物病毒(例如，痘苗病毒或腺病毒)；昆虫病毒(例如，杆状病毒)；酵母载体；噬菌体载体(例如，λ噬菌体)；质粒载体和粘粒载体。
作为宿主细胞系，可对插入的所需序列的表达进行调节，或者可通过特定的期望方式对由所述序列编码的表达肽进行修饰、处理或选择。此外，在选定宿主细胞系中，在特定诱导物存在下可提高来自特定启动子的表达，从而有助于控制普通设计肽的表达。而且，不同的宿主细胞针对表达肽的翻译和翻译后加工及修饰(例如，糖基化、磷酸化或诸如此类)具有特定的特征机制。因而，可选择适当的细胞系或宿主细胞系统，以保证外源肽达成期望的修饰和加工。举例而言，可使用在细菌系统中表达的肽来产生非糖基化的核心肽。另一方面，在哺乳动物细胞中表达保证异源性肽的“原生”糖基化。
本发明包括肽的衍生物、片段、同源物、类似物和突变体，及编码这些肽的核酸。就核酸而言，本文所提供的衍生物、片段和类似物定义为至少六个(连续的)的核酸序列，且具有足以进行特异性杂交的长度。就氨基酸而言，本文所提供的衍生物、片段和类似物定义为至少四个(连续的)的氨基酸序列，且具有足以进行特异性识别的长度。
在设计变体时，根据下列文件中所阐述的其他受体的序列信息及诸如此类，可设计类似的受体结合肽：对于IL-13，Yuichiro Yoshida等人，Biochem BiophysRes Commun.2007，vol.358，No.1，pp.292-7；对于IL-4，Thorsten Hage等人，Cell.1999，vol.97，No.2，pp.271-81；对于神经纤毛蛋白-1，Alexander Antipenko等人，Neuron.2003，vol.39，No.4，pp.589-98；对于转铁蛋白，R，Jae H.Lee等人，Eur.J.Biochem.2001，vol.268，pp.2004-2012；对于VEGFR1(WHSDMEWWYLLG(SEQ ID NO：31))，Ping AN等人，2004，Int.J.Cancer.vol.111，pp.165-173；对于HER-2，Valeria R.Fantin等人，Cancer Res.2005，vol.65，No.15，pp.6891-6900，Stephanie C.Pero等人，Int J Cancer.2004，vol.111，pp.951-960，Beihai Jiang等人，J Biol Chem.2006，vol.280，No.6，pp.4656-4662；对于VEGFR1(VEPNCDIHVMWEWECFERL-NH2(SEQ ID NO：32))，KimberlyJ.Peterson等人，Analytical Biochemistry 2008，vol.378，No.1，pp.8-14；对于VEGFR1(GGNECDAIRMWEWECFERL(SEQ ID NO：33))，Borlan Pan等人，J.Mol.Biol.2002，vol.316，No.3，pp.769-87；对于抗菌肽(Buforin)，HyunSoo Lee等人，Cancer Lett.2008，vol.271，No.1，pp.47-55；对于FGFR(MQLPLAT(SEQ ID NO：5))，Fukuto Maruta等人，Cancer Gene Therapy.2002，vol.9，pp.543-552；对于FGFR(AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO：6))，Akiko Komi等人，Exp.Cell Res.2003，vol.283，No.1，pp.91-100；对于NRP1/VEGFR2(ATWLPPR(SEQ ID NO：36))，Loraine Tirand等人，J.Control Release.2006，vol.111，pp.153-164；对于EphB1和EphB2，MitchellKoolpe等人，J Biol.Chem.2005，vol.280，No.17，pp.17301-11；对于IL11R，Amado J.Zurita等人，Cancer Res.2004，vol.64，pp.435-439；对于GRP78(WDLAWMFRLPVG(SEQ ID NO：39))，Marco A.Arap等人，Cancer Cell.2004，vol.6，pp.275-284；对于GRP78(CTVALPGGYVRVC(SEQ ID NO：40))，Ying Liu等人，Mol.Pharmaceutics.2007，vol.4，No.3，pp.435-447；对于PSMA，Kaushal Rege等人，Cancer Res.2007，vol.67，No.13，pp.6368-6375(这些文件以引用方式并入本文中)。此修饰包括(但不限于)保守性取代。此处，IL4-结合序列、IL13-结合序列和神经纤毛蛋白-1-结合序列是根据三维结构分析的结果来设计。在本说明书中，对于HER2、VEGFR和TfR，在那些使用了前述文件本身所阐述的结合序列信息者中，以及EGFR中发现活性。
此外，对穿膜肽的修饰，可参照常识并根据本文描述来进行修饰。举例而言，Daniele Derossi等人，THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，vol.271，No.30，7月26日发行，pp.18188-18193，1996提供了与Antp的机制和通过加入部分突变所获得的其变体有关的知识。该文件阐述对细胞穿透很重要的位点，且在制备本发明变体或类似物时可作为参照。该文件的整个内容以引用方式并入本文中。
其他文件，包括Genevie Ave Dom等人，Nucleic Acids Research，2003，vol.31，No.2，556-561；Wenyi Zhang和Steven O.Smith，Biochemistry 2005，44，10110-10118；ISABELLE LE Roux等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA vol.90，pp.9120-9124，1993年10月，提供了与跨膜机制和突变有关的信息。这些文件也可作为制备本发明变体或类似物时的参照。这些文件的整个内容以引用方式并入本文中。
(药物)
本发明的化合物或其制药上可接受的盐可单独给药，但优选地通常作为各种药物制剂提供。而且，此等药物制剂用于动物和人类。
优选地使用治疗最为有效的给药路径。给药路径的实施例包括经口路径或非肠道路径，例如直肠内路径、颊内路径、皮下路径、肌内路径、静脉内路径及诸如此类。给药形式的实施例包括胶囊、锭剂、颗粒剂、粉剂、糖浆剂、乳液、栓剂、注射剂及诸如此类。适合口服的液体制剂(例如乳液和糖浆剂)可使用水、糖类(例如蔗糖、山梨醇、果糖及诸如此类)、二醇类(例如聚乙二醇、丙二醇及诸如此类)、油类(例如芝麻油、橄榄油、大豆油及诸如此类)、防腐剂(例如对羟基苯甲酸酯)、矫味剂(例如草莓矫味剂、薄荷及诸如此类)来制备。此外，胶囊、锭剂、粉剂、颗粒剂及诸如此类可使用赋形剂(例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇及诸如此类)、崩解剂(例如淀粉、苏打海藻酸盐及诸如此类)、润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石粉及诸如此类)、粘合剂(例如聚乙烯醇、羟基丙基纤维素、明胶及诸如此类)、去垢剂(例如脂肪酸酯及诸如此类)和增塑剂(例如甘油及诸如此类)来制备。
适合非经肠给药的制剂优选地由含有对接受者的血液等渗的活性化合物的无菌含水制剂组成。举例而言，注射时，使用由盐溶液、葡萄糖溶液或盐水和葡萄糖溶液的混合物所形成的载剂来制备注射用溶液。
局部制剂是通过将活性化合物溶于或悬浮于一种或以上的溶剂(例如，矿物油、石油、多元醇或局部药物制剂中所使用的其他基质)中来制备。用于肠内给药的制剂是使用平常载剂(例如，可可脂、氢化酯、氢化脂肪羧酸及诸如此类)来制备，且作为栓剂提供。
在本发明中，在非经肠制剂中也使用一种或以上的辅助组分，其选自与经口制剂有关的示例：二醇类、油类、矫味剂、防腐剂(包括抗氧化剂)、赋形剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂、去垢剂、增塑剂及诸如此类。
根据给药形式、患者的年龄和体重、欲治疗症状的性质和严重程度及诸如此类，本发明化合物或其药学上可接受的盐给药的有效剂量和次数有所不同。通常，剂量为0.01至1000毫克/人/天，优选地5至500毫克/人。关于给药次数，优选地每天给药一次或分别给药。
本发明还涉及一种用来制备本发明药物组合物的系统、装置和试剂盒。应了解，可使用本领域中所习知的元件作为此系统、装置和试剂盒的元件，此可由本领域的技术人员适当地设计。
本发明还涉及使用本发明化合物、其药学上可接受的盐或前药(例如其水合物)的系统、装置和试剂盒。应了解，可使用本领域中所习知的元件作为此系统、装置和试剂盒的元件，此可由本领域的技术人员适当地设计。
(DDS)
本文所用“递送制剂”或“递送介质”是指介导感兴趣物质递送的载剂(媒剂)。若欲递送的物质是药物，则其被称为“药物递送介质”。可将药物递送系统(Drug Delivery System，DDS)划分为吸收-控制DDS、释放-控制DDS和靶向DDS。理想的DDS是将“必需剂量”的药物递送到“身体必需的位点”持续“必需时间”的系统。靶向DDS划分为被动靶向DDS和主动靶向DDS。前者是利用载剂(药物载剂或药物媒剂)的物理化学特性(例如粒径和亲水性)来控制身体内行为的方法。后者是向其中加入特殊机制，以主动控制靶向组织的方向性的方法。举例而言，所述方法使用与抗体偶联的载剂，所述抗体对组成靶组织的特定细胞上的靶分子具有特异性分子识别功能(例如，本发明TPR-结合肽)，也可将其称为“导弹药物”。
本文所用“药物递送介质”是指递送所需药物的媒剂。
本文所用“感兴趣的物质”尤其是指期望递送到细胞中的物质。
本文所用“脂质体”通常是指由以膜形态聚集的脂质层和内部水层组成的封闭型泡囊。除通常所使用的磷脂以外，也可并入胆固醇、糖脂及诸如此类。由于脂质体是内部含水的封闭型泡囊，因此也可将水溶性药物或诸如此类保留在泡囊内。因此，此脂质体用来递送不能通过细胞膜进入细胞的药物或基因。此外，由于良好的生物相容性，明显地预期脂质体可作为DDS的纳米粒子载剂的材料。在本发明中，为了可选地使用连接体、交联剂或诸如此类加入修饰基团，脂质体可作为具有官能团以提供酯键的结构单元(例如，糖脂、神经节苷脂、磷脂酰甘油或诸如此类)，或具有官能团以得到肽键的结构单元(例如，磷脂酰乙醇胺)。
脂质体可由本领域中所习知的任何方法来制备。举例而言，在习知方法中，包括由胆酸透析的方法。在胆酸透析中，通过下面的过程进行制备：a)制备脂质和去垢剂的混合胶粒，和b)透析所述混合胶粒。接着，就本发明中所使用的糖链脂质体而言，在优选实施例中，优选地使用蛋白作为连接体，且其中糖链已与蛋白结合的糖蛋白与脂质体的偶合可通过以下两步骤反应进行：a)脂质体膜上神经节苷脂部分的高碘酸盐氧化，和b)通过还原胺化反应，糖蛋白与氧化脂质体偶合。通过此方法，可使包括所需糖链的糖蛋白与脂质体结合，从而获得具有所需糖链的各种糖蛋白-脂质体偶联物。为了观察脂质体的纯度和稳定性，对粒径分布进行研究极为重要。为此，作为一种方法，可使用凝胶渗透色谱法(Gel Permeation Chromatography，GPC)、扫描电子显微镜(Scanning ElectricMicroscope，SEM)、动态光散射(Dynamic Light Scattering，DLS)及诸如此类。
本文所用“连接体”是指介导表面结合分子(例如，TRP-结合肽)和其他分子(例如，脂质体表面)结合的分子。在本发明中所使用的糖链修饰的脂质体中，肽可经由连接体与脂质体表面结合。连接体可由本领域的技术人员适当地选择，但优选地生物相容的，且更为优选地，药学上可接受的连接体。本文所用“连接体蛋白”是指在连接体分子中的蛋白、肽、氨基酸聚合物。
本文所用“连接体(蛋白)基团”是当连接体(蛋白)与其他基团结合时所给出的名称。连接体(蛋白)基团是指一价或二价基团，视情况而定。其实施例包括哺乳动物衍生的蛋白基团、人类衍生的蛋白基团、人类血清蛋白基团和血清白蛋白基团。连接体(蛋白)基团优选地衍生自“人类”，因为认为在对人类给药时其具有高生物相容性。此外，优选不具免疫原性的蛋白。
本文所用“交联基团”是指在链大分子的分子间形成化学键(如桥键)的基团。因而，此术语作为一种概念与“连接体”部分重叠。通常，此术语是指该基团在大分子(例如脂质、蛋白、肽、糖链及诸如此类)与其他分子(例如脂质、蛋白、肽和糖链)之间起作用以形成共价键，将分子中或分子之间缺少共价键的部分连接起来的基团。在本发明说明书中，交联基团根据欲交联的靶点而有所不同，其实施例包括(但不限于)醛(例如戊二醛)、碳二亚胺、亚胺酯及诸如此类。当含有氨基的物质交联时，可使用含有醛的基团，例如戊二醛。
本文所用“生物相容性”是指具有与生物体组织或器官相容，且不会引起毒性、免疫应答、损伤及诸如此类的特性。生物相容性缓冲液的实施例包括(但不限于)磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline，PBS)、盐水、三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液、碳酸盐缓冲液(Carbonate buffer solution，CBS)、三(羟基甲基)甲基氨基丙磺酸盐(TAPS)缓冲液、2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸盐(HEPES)、其他Good′s缓冲液(例如，2-吗啉基乙磺酸一水合物(MES)、双(2-羟基乙基)亚胺基三(羟基甲基)甲烷(Bis-tris)、N-(2-乙酰胺)亚胺基乙酰乙酸(ADA)、1，3-双[三(羟基甲基)甲基氨基]丙烷(Bis-tris丙烷)、哌嗪-1，4-双(2-乙磺酸)(PIPES)、N-(2-乙酰胺)-2-氨基乙磺酸(ACES)、可拉明(coramine)氯化物、N，N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、3-吗啉基丙磺酸(MOPS)、N-三(羟基甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)、N-(2-羟基乙基)哌嗪-N′-3-丙磺酸(HEPPS)、N-[三(羟基甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)、氨基乙酰胺(甘氨酰胺)、N，N-双(2-羟基乙基)甘氨酸(Bicine)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS))及诸如此类。
如上文所述，本发明提供用来将感兴趣的物质递送到癌细胞的递送剂，该递送剂包含受体结合肽，例如EGFR域-结合肽。感兴趣的物质可与受体结合肽(例如EGFR域-结合肽)偶联或者不与其偶联。当偶联时，所述物质变成融合物质，如果是肽，将此肽称为嵌合肽。也可将本发明的嵌合肽视为此实施例。就此物质而言，可使用介质(媒剂)形成偶联剂。对于此介质，可使用脂质体，且感兴趣的物质可在脂质体的外部或者纳入其内部。
(筛选)
本文所用“筛选”是指通过特定的操纵/检测方法，从包括主体的群中选择靶，例如具有特定感兴趣特性的生物体或物质。对于筛选，可使用本发明的特定部分。
举例而言，也可将本文所用的，借助免疫应答实施的筛选称为“免疫表型”。在此情况下，本发明的肽可用于细胞系和生物样品的分类。本发明可用作细胞特异性标记，或者更具体而言，用作在特定细胞类型的分化及/或成熟的各个阶段特异性表达不同的细胞标记。针对特异性表位或表位组合的单克隆抗体可以筛选表达某一标记的细胞群。可通过使用单克隆抗体，使用各种技术来筛选表达该标记的细胞群。此技术的实施例包括使用由抗体包被的磁珠进行磁性分离、使用附着在固体基质(即，板)上的抗体进行“淘选(panning)”和流式细胞技术(参见，例如，美国专利号5,985,660和Morrison等人，Cell，96：737-49(1999))。
举例而言，所述筛选可用来筛选包括未分化细胞(例如，胚胎干细胞、组织干细胞及诸如此类)的细胞群，例如可出现细胞生长及/或分化(此可见于人类脐带血中)的细胞群，或其中已对未处理状态实施修饰处理的细胞群。
本文中所引用的参考文献，例如科学论文、专利、专利申请或诸如此类的全部内容都以引用方式并入本文中，其引用程度与以特定方式分别阐述一样。
在下文中，将根据实施例阐述本发明。下文所阐述的实施例仅出于阐释之目的而提供。因而，本发明范围既不受前述实施例限制也不受下文实施例限制，但其仅受限于随附其后的权利要求书。
[实施例]
在下文中，将以实施例方式更详细地阐述本发明，但本发明的技术范围并不受此等实施例限制。除非特别说明，否则下文所阐述实施例中所使用的试剂可得自Nakalai Tesque，Sigma-Aldrich，Wako Pure Chemical Industries有限公司或诸如此类。根据由京都大学(Kyoto University)确定的标准并根据动物保护精神实施动物实验。
(实施例1：EGFR-靶向的嵌合肽)
[材料和方法]
(细胞系)
人类乳腺癌(BT-20和T47D)、肺癌(H322和H460)、胰腺癌(SU.86.86)、前列腺癌(LNCaP)、脑瘤(U251)和肺成纤维细胞(MRC-5和WI-38)细胞系都购自美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection，(马纳萨斯(Manassas)，美弗吉尼亚洲(VA))。人类胰腺癌细胞系(BxPC-3)和结肠癌细胞系(HCT116和DLD-1)购自欧洲细胞保藏中心(European Collectionof Cell Cultures，ECACC；索尔兹伯里(Salisbury)，威尔特郡(Wiltshire)，UK)。人类胚肾细胞系(HEK293)购自RIKEN细胞文库(RIKEN Cell Bank)(筑波(Tsukuba)，日本(Japan))。细胞在含有10％FBS(Bio West，迈阿密(Miami)，弗罗里达州(FL))、100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Nakalai Tesque，京都(Kyoto)，日本(Japan))的RPMI1640(BT-20、T47D、H322、H460、SU.86.86、LNCaP、U251、BxPC-3、DLD-1和SW837)、MEM(MRC-5和WI-38)、McCoy′s 5a(HCT116)或D-MEM(HEK293)中培养。
(肽)
以下肽购自Invitrogen，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加州(CA)：
1.癌细胞膜-溶解肽：KLLLKLLKKLLKLLKKK(SEQ ID NO：1；加下划线的字母表示D-氨基酸)；
2.EGFR结合(EB)-癌细胞膜-溶解嵌合肽：YHWYGYTPQNVIGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(SEQ ID NO：2)；
3.原始溶解肽：LKLLKKLLKKLLKLL-NH2(SEQ ID NO：41)；和
4.EB-原始溶解嵌合肽：YHWYGYTPQNVIGGGLKLLKKLLKKLLKLL-NH2(SEQ ID NO：42)。
所述肽是使用固相化学法进行化学合成得到，并由高效液相色谱法纯化直至其变得均匀(即纯度高于90％)为止，并由质谱法检测。将肽溶于水中，并缓冲至pH 7.4。每次仅在使用之前新制备肽溶液，以防止重复使用。
(药物)
吉非替尼(Gefinitib)和埃罗替尼(Erlotinib)购自Toronto Research Chemicals(安大略省(Ontario)，加拿大(Canada))。抗EGFR的小鼠单克隆抗体(克隆225)和PD153035购自Calbiochem(拉由拉(La Jolla)，加州(CA))。
(单层小泡囊(SUV)的制备)
单层小泡囊(Small Unilamilar Vesicle，SUV)如前文所述来制备(Matsuzaki，K.& Horikiri，C.Interactions of Amiloid β-肽(1-40)with Ganglioside-containingmembranes.Biochemistry 38，4137-4142(1999))。简言之，将具有期望组成的脂质膜分散于水或Tris缓冲液(10mM Tris/150mM NaCl/1mM EDTA，pH7.4)中。使所产生的MLV经受5次冻-融循环，且随后使用探针型超声破碎器(TomyUD-201)在冰冷水中，于氮气环境中超声处理15分钟。来自探针钛尖的金属屑通过离心除去。通过磷分析，一式三份测定脂质浓度(Bartlett，G.R.Phosphorusassay in column chromatography.J.Biol.Chem.234，466-468(1959))。
(CD谱)
CD谱是在Jasco J-820中，使用1mm光程长度的石英比色池来测量，以最大程度减少因缓冲液组分所造成的吸收。对于每一个样品，测定8次扫描的平均值。减去平均的空白谱(小泡囊悬浮液或溶剂)。肽和脂质的浓度分别为50μM和4mM。
膜通透性的可视化(Iraura Y.，Choda，N.，& Matsuzaki，K.Magainin 2inaction：distinct modes of membrane permeabilization in living bacterial andmammalian cells.Biophys.J.95，5757-5765(2008))。在玻璃底平皿中以最终浓度2μM将钙黄绿素(一种可溶性的荧光分子)添加至MDA-MB-231细胞中。将小份的经标记的肽、EB-溶解-TAMRA-OH或溶解-TAMRA-OH(Invitrogen)(15μl)以最终浓度10μM直接添加至平皿中。使用Olympus FV1000共聚焦激光扫描显微镜(Olympus)，获取共聚焦图像。
(细胞活性分析)
将3×103个细胞/孔接种在96-孔板中，在含有10％FBS的培养基中培养24小时，并在37℃下与100μl渐增浓度的肽一起培养48至72小时。用WST-8溶液(Cell Count Reagent SF；Nakalai Tesque)检测细胞活性。
(免疫荧光染色)
使1x105个细胞与偶联有异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate，FITC)的EGFR的人单克隆抗体(Santa Cruz)一起孵育，通过流式细胞技术检测EGFR的表达。所有染色都在室温下实施40分钟。细胞荧光通过流式细胞仪(FACSCalibur，Becton Dickinson，圣荷西(San Jose)，加州(CA))检测。EGFR-阳性细胞的平均荧光强度(Means Fluorescence Intensity，MFI)使用CellQuest软件(Becton Dickinson)确定。
(Annexin V分析和半胱天冬酶(caspase)分析)
BT-20细胞在37℃下，用5μM EB-溶解嵌合肽处理2小时或者不使用EB-溶解嵌合肽而处理2小时。对于半胱天冬酶激活或Annexin V(膜连蛋白)-阳性表达的测定，使用羧基荧光素于FLICA半胱天冬酶3&7分析(Immunochemistry Technologies，布卢明顿(Bloomington)，明尼苏达州(MN))同时对经肽处理的培养物进行半胱天冬酶活性和碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染色分析，或者，作为选择通过多参数的流式细胞技术进行Annexin V标记和PI染色分析。此外，根据制造商的说明书，使用共聚焦激光扫描显微镜，借由MEBSTAIN Apoptosis Kit Direct(MBL)实施末端脱氧核苷酸转移酶-dUTP缺口末端标记(TUNEL)分析。
(生物分子相互作用)
表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)实验，用BIACORE生物传感器系统3000(BIACORE公司，乌普萨拉(Uppsala)，瑞典(Sweden))进行。通过N-羟基琥珀酰亚胺和N-乙基-N′-(二甲基氨基丙基)碳化二亚胺激活化学法，将约5000RU的链霉亲和素(Sigma)固定在CM5传感器芯片的表面，且随后在经链霉亲和素固定的传感器芯片上注射2000-3000RU与生物素偶联的肽。作为非特异性结合的对照，用乙醇胺封闭未固定链霉亲和素的传感器芯片上未反应的羧甲基集团。作为分析物，在25℃，以20μl/min的流速将细胞表面蛋白(使用Mem-PER真核膜蛋白提取试剂盒(Pierce)制备)注射在流动池上。为了防止在分析期间非特异性结合，使用HBS缓冲液(0.01M HEPES、0.15MNaCl、0.005％Tween 20、3mM EDTA(pH 7.4))作为电泳缓冲液。人类EGF受体重组体(recombinant human EGF receptor，rhEGFR)与EB-溶解嵌合肽的相互作用分析如下实施：如上文所述将约5000RU的rhEGFR(SEQ ID NO：3)固定在CM5传感器芯片上，且随后在此传感器芯片上注射多种浓度的肽。这些实验中所使用的全部蛋白浓度都由Bradford方法测定(Bradford MM.A rapidand sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizingthe principle of protein-dye binding.Anal Biochem 1976；72：248-54)。使用BIA检测软件3.2版本(BIACORE)进行数据分析。
(集落-形成分析)
针对H322细胞，溶解肽或嵌合肽的体外细胞毒性，由集落-形成分析测定。将细胞接种在6厘米平皿中，所述平皿含有3ml含10％FBS的RPMI 1640，并使其贴壁。设定细胞/平皿的数量，以便在对照组中获得＞100个集落。细胞接种24小时后，将细胞暴露于不同浓度的溶解肽或EB-溶解嵌合肽(0至22.5μM)并培养10天。用磷酸盐缓冲液冲洗平皿，并用结晶紫(0.25％于25％乙醇中)染色。由对照和处理组中所形成的集落数确定集落存活的百分比。
[结果]
(基于二级结构设计新颖的嵌合肽)
先前，Papo和Shai报导了由含有D-和L-亮氨酸和赖氨酸的15-氨基酸非对映异构序列组成的新颖溶解肽(Papo，N.& Shai，Y.New Lytic peptides basedon the D，L-amphipathic helix motif preferentially kill tumor cells compared tonormal cells.Biochemistry 42，9346-9354(2003))。在本研究中，根据二级结构的两亲性，本发明人设计了适合与EGFR-结合(EB)肽组合的新颖溶解肽。如图1D中所示，与EB-溶解肽相比，新设计的溶解肽中，带正电荷的氨基酸(Lys)簇的位置在与EB肽组合后仍保留(图1D a和b)。CD谱分析证实，EB-溶解肽与由磷脂酰胆碱(PC)(其是正常细胞膜表面的主要脂质物)组成的单层小泡囊(SUV)结合较弱，且与PC脂质体组成的结构不甚良好，但此EB-溶解肽能与含有磷酸酰丝氨酸(PS)(其特异地暴露在癌细胞膜上)的SUV结合，且符合特征为双重最小值在209-210和222nm的部分螺旋结构(图1D(d))。另一方面，EB-原始溶解肽能与PC和PC/PS脂质体二者强结合，且符合螺旋结构(图1D(c))。这些结果表明，本研究中新设计的嵌合肽对含PS的膜具有选择性，且符合螺旋结构，所述螺旋结构被认为对在细胞表面上形成孔是至关重要的(Papo，N.& Shai，Y.New Lytic peptides based on the D，L-amphipathic helixmotif preferentially kill tumor cells compared to normal cells.Biochemistry42，9346-9354(2003))。
(在EGFR-表达的癌细胞中，EGFR靶向提高溶解肽的细胞毒性作用)
针对7种EGFR表达的癌细胞系，将溶解肽的细胞毒性与EGFR-靶向的肽毒素(一种EGFR-结合-溶解嵌合肽)相比较。如图1A中所示，在所实验的所有癌细胞系中采用溶解肽或嵌合肽处理可产生浓度依赖性的细胞毒性。当与单独的溶解肽相比时，证明嵌合肽对癌细胞的细胞毒性得到了相当大的提高。在所有细胞系中，15至20μM浓度的嵌合肽足以诱导超过80％的细胞死亡。相比之下，相同浓度的单独溶解肽不能诱导足够的癌细胞杀伤效果。如表1中所示，通过EGFR靶向，溶解肽将癌细胞的IC50(产生对照细胞生长50％抑制的肽浓度)提高1.6至3.1倍，表明与单独的溶解肽相比EGFR靶向提高了癌细胞对EB-溶解嵌合肽的敏感性。随后，本发明人检测了三种正常细胞系中EB-溶解嵌合肽和单独溶解肽的细胞毒性。如图1B中所示，包括MRC-5、WI-38和HEK293的三种正常细胞系对溶解肽的敏感性较低，表明与癌细胞系细胞相比毒性较小。正常细胞系中，嵌合肽的IC50比癌细胞中高3.6至8倍(表1)。EB-溶解嵌合肽也提高对正常细胞的细胞毒性，此与癌细胞中的现象类似。这些发现表明，溶解肽在癌细胞中的细胞毒性比在正常细胞中强，且EGFR-靶向的肽毒素对高EGFR表达的癌细胞具有优良的细胞毒性。令人感兴趣地，与原始溶解肽组合的EB肽未显示出细胞毒性提高，且此外EB-原始溶解肽甚至在肽浓度较低时仍杀伤正常细胞系(MRC-5)，表明原始溶解肽不适合与EB肽嵌合化(图1C)。
(采用EB-溶解嵌合肽处理，对具有酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine KineaseInhibitor，TKI)抗性的癌细胞产生足够的细胞毒性)
在具有或不具有k-ras突变的癌细胞中，比较EB-溶解肽和TKI的细胞毒性。
(检测k-ras突变的癌细胞对TKI的敏感性)
对在k-ras突变存在和不存在时，各种癌细胞对埃罗替尼或抗EGFR抗体的敏感性进行研究。
以3×103个细胞/孔，将k-ras野生型(Wild-type，WT)癌细胞系(H322和BT-20)和k-ras突变的癌细胞系(MDA-MB-231、HCT116、SW837和DLD-1)接种在96-孔板中，并在含有10％FBS的培养基中培养24小时。将这些细胞与不同浓度的埃罗替尼(0至80μM)或抗EGFR抗体(右：0至20μg/ml)一起培养72小时，并使用WST-8试剂检测细胞毒性(Cell Count Reagent SF；NakalaiTesque)。
k-ras WT癌细胞系(H322和BT-20)对埃罗替尼和抗EGFR抗体敏感，但k-ras突变的癌细胞系(MDA-MB-231、HCT116、SW837和DLD-1)对埃罗替尼和抗EGFR抗体二者都有抗性(图1E)。
(k-ras野生型细胞中TKI或EB-溶解的细胞毒性)
研究TKI或EB-溶解嵌合肽对没有k-ras突变的癌细胞和正常细胞的细胞毒性。
以3×103个细胞/孔，将3种k-ras野生型(WT)癌细胞系(H322、BT-20和BxPC-3)和肺正常细胞系(MRC-5)接种在96-孔板中，并在含10％FBS的培养基中培育24小时。将这些细胞与不同浓度的TKI(埃罗替尼、吉非替尼和PD153035；0至20μM)或EB-溶解嵌合肽(0至20μM)一起培养72小时，使用WST-8试剂检测细胞毒性(Cell Count Reagent SF；Nakalai Tesque)。
采用三种TKI(埃罗替尼、吉非替尼和PD153035)的处理于k-ras WT癌细胞系(H322、BT-20和BxPC-3)中产生浓度依赖性的生长抑制，但细胞毒性不足。另一方面，采用EB-溶解肽处理对这些癌细胞系呈现出足够的细胞毒性，但对肺正常细胞系MRC-5未呈现细胞毒性(图1F)。
(EB-溶解对具有k-ras突变的抗TKI的癌细胞系的细胞毒性)
研究EB-溶解嵌合肽对具有k-ras突变的抗TKI的癌细胞的细胞毒性。
以3×103个细胞/孔，将四种k-ras突变的癌细胞系(MDA-MB-231、HCT116、SW837和DLD-1)接种在96-孔板中，并在含10％FBS的培养基中培育24小时。将这些细胞与不同浓度的TKI(埃罗替尼、吉非替尼和PD153035；0至20μM)或EB-溶解嵌合肽(0至20μM)一起培养72小时，并使用WST-8试剂检测细胞毒性。
k-ras突变的癌细胞系(MDA-MB-231、HCT116、SW837和DLD-1)对埃罗替尼、吉非替尼和PD153035有抗性，但采用EB-溶解嵌合肽处理对具有k-ras突变的抗TKI的癌细胞系呈现出足够的细胞毒性(图1G)。
因而，说明EB-溶解嵌合肽呈现对k-ras突变的癌细胞系特异的细胞毒性。
(由EB-溶解嵌合肽诱导的细胞毒性的提高程度，视EGFR在细胞表面的表达水平而定)
本发明人接着检测了EB-溶解嵌合肽的细胞毒性增加是否与EGFR在细胞表面的表达水平有关。通过流式细胞技术，使用FITC-偶联的抗EGFR多克隆抗体来检测七种癌细胞系和三种正常细胞系中EGFR的表达水平。如图2A和表1中所示，EGFR的表达水平与EB-溶解嵌合肽或溶解肽的IC50无关(对于嵌合肽r＝-0.37(图2A，左)，且对于溶解肽r＝-0.14(图2A，中间))。然而，EGFR的表达水平与溶解肽与EB-溶解嵌合肽的IC50比显著相关，表明与单独的溶解肽情况相比，EB-溶解嵌合肽对细胞毒性的提高程度，视EGFR在细胞表面的表达水平而定(r＝0.89；图2A，右)。
为了进一步确认EB-溶解嵌合肽对EGFR的特异性，在暴露于EB-溶解嵌合肽1小时前将抗EGFR多克隆抗体(Ab)或人类EGF重组体添加至BxPC-3培养物中，检测对细胞的细胞毒性。如图2B中所示，EGF蛋白与EGFR-Ab二者都能阻断EB-溶解嵌合肽的细胞毒性，显示出由EGF配体得到27％的抑制，由EGFR-Ab得到23％抑制。这些结果表明EB-溶解嵌合肽与细胞的结合视EGFR在细胞表面上的表达水平而定。
(EB-溶解嵌合肽与EGFR蛋白和细胞表面膜蛋白结合的相互作用谱)
为了解肽与EGFR的结合特性，将EGFR蛋白固定在传感器芯片上，并使用BIACORE来分析其与EB-溶解嵌合肽或单独溶解肽的相互作用谱。如图3A中所示，共振信号强度随EB-溶解嵌合肽的浓度增加而增大，表明与EGFR蛋白结合的EB-溶解嵌合肽的量与EB-溶解嵌合肽的浓度增加成比例。相比之下，单独溶解肽的共振信号强度随浓度增加很少。与EGFR蛋白结合的EB-溶解嵌合肽的KD值为2.6×10-5(M)。接着，为了解肽与细胞的结合特性，将EB-溶解嵌合肽或单独的溶解肽固定在传感器芯片上，并使用BIACORE对与自H322、BT-20或MRC-5提取的细胞表面膜蛋白的相互作用谱进行分析。如图3B和3C中所示，共振信号强度随细胞膜蛋白的浓度增加而增大，表明与肽结合的细胞膜蛋白的量与细胞膜蛋白的浓度增加成比例。细胞膜蛋白与单独溶解肽的相互作用证实，随着肽含量的增加各细胞系中的结合常数相似。另一方面，EB-溶解嵌合肽与H322或BT-20癌细胞膜蛋白的结合常数比单独溶解肽高出4.2倍(H322)或4.4倍(BT-20)(图3B、3C和3D)。相比之下，与MRC-5正常细胞膜蛋白的结合常数，EB-溶解嵌合肽与单独的溶解肽相比没有明显变化(图3D)。这些结果与自WST分析所获得的数据一致(图1)，表明EB-溶解嵌合肽的细胞毒性与对细胞膜的亲和性密切相关。
(EB-溶解嵌合肽诱导癌细胞的迅速杀伤)
为了检测EB-嵌合肽杀伤癌细胞的适当的时间长度，H322或BT-20细胞用EB-嵌合肽或单独的溶解肽处理10分钟、30分钟、1小时或48小时。如图4中所示，用单独的溶解肽处理的H322或BT-20细胞使得存活率以时间依赖性方式降低。相比之下，H322或BT-20细胞暴露于EB-嵌合肽(10μM)仅10分钟时，足以杀伤癌细胞，且呈现出超过70％的细胞杀伤效应。共聚焦显微镜分析也证实，该嵌合肽穿过细胞膜而在癌细胞表面上形成孔。20分钟内观察到经钙黄绿素标记的培养基流入癌细胞的细胞质(图4B)。然而，在单独溶解肽的情况下没有观察到此快速穿过(图4C)。这些结果表明，与单独的溶解肽相比EB-嵌合肽相当迅速地杀伤癌细胞。体外集落-形成分析也证实，此嵌合肽以浓度依赖性方式抑制H322癌细胞的细胞生长(图4D)。
(在癌细胞中，EB-嵌合肽诱导半胱天冬酶激活和Annexin V-阳性表达)
为了研究由EB-嵌合肽引起的细胞死亡的作用机制，使用多参数的流式细胞技术分析来实施Annexin V分析和半胱天冬酶分析。如图5A中所示，BT-20乳腺癌细胞暴露于EB-溶解嵌合肽(5μM)2小时即诱导半胱天冬酶激活和Annexin V-阳性表达。由这些结果标明，EB-溶解嵌合肽崩解癌细胞的质膜，且从而很明显的嵌合肽通过细胞凋亡机制诱导癌细胞的细胞死亡。
(H322癌细胞生长的体外抑制)
为了进一步确认EB-溶解嵌合肽对H322癌细胞的细胞毒性，实施集落-形成分析(Kawakami K，Kawakami M，Leland P，Puri RK.Internalization property ofinterleukin-4 receptor alpha chain increases cytotoxic effect of interleukin-4receptor-targeted cytotoxin in cancer cells.Clin Cancer Res 2002；8：258-66；Kawakami K，Joshi BH，Puri RK.Sensitization of cancer cells to interleukin13-pseudomonas exotoxin-induced cell death by gene transfer of interleukin 13receptor alpha chain.Hum Gene Ther 2000；11：1829-35)。如图6中所示，尽管H322细胞对单独的溶解肽敏感(IC50，14.2μM)，但细胞对嵌合肽的敏感性高至少2倍(IC50＜7.5μM)。通过集落-形成分析得到的两种肽的IC50值与由WST分析所测定的IC50值相关。
[表1]
表1.肽对各种细胞系的细胞毒性及EGFR表达
Figure BPA00001385381300651
*相对MFI(平均荧光强度)是FITC-偶联的抗EGFR多克隆抗体与细胞的结合程度，其中将BT-20和HEK293细胞的平均MFI值分别设定在100％和0％。
[讨论]
在此研究中，本发明人连接氨基酸的两个功能域以产生本发明称为“肽毒素”的新颖的嵌合肽，其被设计成与EGFR结合的双功能肽来溶解用于靶向EGFR-过表达癌细胞的质膜。本发明人发现，当与单独的溶解肽相比时，EB-溶解嵌合肽更加迅速且有效地杀伤癌细胞。另一方面，本发明人发现，正常细胞对两种肽都不是很敏感。
本发明人提出EB-溶解嵌合肽在癌症杀伤时的作用机制如下。首先，嵌合肽的EB部分结合细胞表面的EGFR，随后与嵌合肽的溶解部分结合，并以比自由的溶解肽快的速度崩解细胞膜。EB肽与EGFR特异性且有效地结合，且解离常数为22nM(Li Z，Zhao R，Wu X等人，Identification and characterization of anovel peptide ligand of epidermal growth factor receptor for targeteddelivery oftherapeutics.FASEB J 2005；19：1978-85)。因此表明，EB-EGFR相互作用的亲和性比溶解肽与细胞膜的亲和性大。
与溶解肽类似，线粒体毒性肽和促凋亡肽具有多聚阳离子型序列(KLAKLAK)2(SEQ ID NO：4)，通过具有穿膜序列的肽侵入内吞泡且不崩解细胞膜，并诱导线粒体损伤(Ellerby HM，Arap W，Ellerby LM等人，Anti-canceractivity of targeted pro-apoptotic peptides.Nat Med 1999；5：1032-8)。细胞膜-溶解肽在细胞膜崩解后侵入细胞，诱导线粒体损伤和半胱天冬酶激活，并引发凋亡。另一方面，基于绿脓杆菌(Pseudomonas)外毒素的免疫毒素(白介素-13-绿脓杆菌外毒素(IL13-PE38QQR)(SEQ ID NO：6))诱导部分凋亡，且仅10-30％的头和颈部癌细胞发生凋亡性细胞死亡(Kawakami M，Kawakami K，Puri RK.Apoptotic pathways of cell death induced by an interleukin-13 receptor-targetedrecombinant cytotoxin in head and neck cancer cells.Cancer Immunol Immunother2002；50：691-700)。当由流式细胞技术分析时，用此杂交肽处理的癌细胞存在Annexin V-和半胱天冬酶3，7-阳性。此外，所述肽也诱导癌细胞快速死亡。因而，此靶向的嵌合肽与基于细菌毒素的免疫毒素相比，具有快速诱导癌细胞死亡的益处，且在体内的治疗部位能诱导旁观者作用(bystander action)或天然免疫性。
一般而言，肽可被人体内的血清成分相对容易地去活(Papo N，Braunstein A，Eshhar Z，Shai Y.Suppression of human prostate tumor growth in mice by acytoLytic D-，L-amino  acid peptide：membrane lysis，increased necrosis，andinhibition of prostate-specific antigen secretion.Cancer Res 2004；64：5779-86)。已证明，非对映异构肽相对不受在血清中失活的影响，且经瘤内或经静脉内给药的溶解非对映异构肽可降低具有人类前列腺癌的动物模型中的肿瘤生长，且血液中的肽不会迅速降解(Papo N，Braunstein A，Eshhar Z，Shai Y.Suppression ofhuman prostate tumor growth in mice by a cytoLytic D-，L-amino acidpeptide：membrane lysis，increased necrosis，and inhibition of prostate-specific antigensecretion.Cancer Res 2004；64：5779-86)。最近报导的其他类型的肽类药物(其与癌细胞中的Hsp90结合，以使其下游蛋白不稳定)以浓度50mg/kg给小鼠静脉内注射时，也可抑制小鼠体内的人类乳腺癌细胞的生长(Plescia，J.等人，Rational design of shepherdin，a novel anticancer agent.Cancer Cell7，457-468(2005))。在此研究中，发现与其他肽类药物候选者相比，由本发明人新设计的EB-溶解肽静脉内给药时，可以较低浓度降低肿瘤生长，表明此新颖的嵌合肽作为癌症治疗的新颖且有用的工具具有高潜能。尽管EB-溶解嵌合肽对在血流中去活具有抗性，但作为一种使肽在体内具有较高效能的方法，与其他材料或局部给药组合使用是有效的。举例而言，业已证明端胶原(由胃蛋白酶处理高度纯化的I型小牛真皮胶原)是蛋白药物和siRNA极具吸引力的药物递送系统(Drug Delivery System，DDS)(Fuj ioka K，Maeda M，Hojo T，SanoA.Protein release from collagen matrices.Adv Drug Deliv Rev 1998；31：247-66；Takeshita F，Minakuchi Y，Nagahara S，等人，Efficient delivery of small interferingRNA to bone-metastatic tumors by using atelocollagen in vivo.Proc Natl Acad SciUSA 2005；102：12177-82)。已报导，与端胶原一起局部给药的蛋白药物在较长时间段内从所注射部位不断地释放出来(Fuj ioka K，Maeda M，Hojo T，Sano A.Protein release from collagen matrices.Adv Drug Deliv Rev 1998；31：247-66)。因而，认为足以值得在人类癌症的体内模型中，试验端胶原与本发明人的肽毒素组合。当前，这些可能性正在本发明人的实验室中进行研究。
免疫毒素是由具有杀伤部分的蛋白毒素和与其连接的产生癌细胞选择性的靶向部分(例如配体或抗体)组成。可将免疫毒素划分成两类，即作为第一代免疫毒素的化学偶联物和作为第二代免疫毒素的重组体蛋白(Reiter Y，PastanI.Recombinant Fv immunotoxins and Fv fragments as novel agents for cancertherapy and diagnosis.Trens Biotechnol 1998；16：513-520)。常见的免疫毒素在临床使用中通常出现障碍(例如，免疫原性、不期望的毒性、生产困难、有限的半衰期和在体内产生中和抗体)(Kreitman RJ.Immunotoxins for TargetedCancer Therapy.AAPS J 2006；8：E532-51；Li Z，Yu T，Zhao P，Ma J.Immunotoxins and Cancer Therapy.Cell Mol Immunol 2005；2：106-112；Posey JA，Khazaeli MB，Bookman MA等人，A phase I trial of the single-chain immunotoxinSGN-10(BR96 sFv-PE40)inpatients with advanced solid tumors.Clin Cancer Res2002；8：3092-3029)。然而，由于肽可用化学方法合成，因此与蛋白药物相比，肽的制备可以可承受的成本实施。此外，靶向部分和毒性部分的各种候选肽的组合一般可在临床使用前的设置中容易地实验。举例而言，可利用具有杀瘤活性的毒性部分，例如线粒体毒素(Ellerby HM，Arap W，Ellerby LM等人，Anti-cancer activity of targeted pro-apoptotic peptides.Nat Med 1999；5：1032-8)或抗生素类衍生物肽(Kim S，Kim SS，Bang YJ，Kim SJ，Lee BJ.In vitro activitiesof native anddesignedpeptide antibiotics against drug sensitive and resistant tumorcell lines.Peptides 2003；24：945-953)。作为靶向部分，除EGFR外，也可靶向白介素-11(Zurita AJ，Troncoso P，Cardo-Vila M，Logothetis CJ，Pasqualini R，ArapW.Combinatorial screenings in patients：the Interleukin-11 receptor α as a candidatetarget in the progression of human prostate cancer.Cancer Res 2004；64：435-439)和前列腺特异性膜抗原(PSMA；Rege K，Patel SJ，Megeed Z，Yarmush ML.Amphipathic peptide-based fusion peptides and immunoconjugates for the targetedablation of prostate cancer cells.Cancer Res 2007；67：6368-6375)。然而，爆炸部分肽需要像植物或细菌毒素那样的更强的细胞杀伤活性，且必须与靶向至癌细胞的弹头肽一起广泛地使用。
综上所述，由本发明所提供的肽毒素(其靶向癌细胞上的特殊蛋白)是抗癌靶向治疗的可能的新工具。本发明人提出此嵌合肽、肽毒素的概念来作为下一代免疫毒素的概念。研究与开发肽毒素，将来根据个体特征能个体化治疗癌症，即用对来自患者的切除肿瘤特异性靶向的嵌合肽治疗。最后，此策略不但可用来治疗癌症也可用来治疗其他疾病。
(实施例2：EGF-受体结合肽的详尽分析)
在本发明实施例中，实施各种实验来确定是否可使用EGF受体结合肽类似物，其具有氨基酸序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12(SEQ ID NO：8)，其中：
X1是Y或与Y类似的氨基酸S、H或F；
X2是H或与H类似的氨基酸R或K；
X3是W或与W类似的氨基酸Y、F或H；
X4是Y或与Y类似的氨基酸S、H或F；
X5是G或与G类似的氨基酸A、V、I或L；
X6是Y或与Y类似的氨基酸S、H或F；
X7是T或与T类似的氨基酸S、H或F；
X8是P或与P类似的氨基酸羟脯氨酸；
X9是Q或与Q类似的氨基酸N；
X10是N或与N类似的氨基酸S、H或F；
X11是V或与V类似的氨基酸G、A、L或I；且
X12是I或与I类似的氨基酸G、A、V或L。
除肽序列不同以外，所有方案都根据实施例1实施。
(方案)
在前述突变肽中，首先注意带有电荷的第二个H，用化学方法合成K-和R-突变体。如实施例1中所述，借助BIACORE，通过与野生型EGFR-结合肽比较，来检测与人类EGFR重组体的亲和力。仅出于结果中获得较高效应的目的，合成具有癌细胞膜-溶解序列的嵌合肽，并比较野生型EGFR-结合嵌合肽与癌细胞膜-单独的溶解肽对人类肺癌细胞系H322的细胞杀伤效应。
(结果)
结果示于图7中。与野生型肽比较而言，对于经K取代的肽，观察到生物传感器响应得到一些提高，且对于经R取代的肽，观察到其响应是野生型的两倍(图7A)。经R取代的嵌合肽(黑色圆圈)对H322的细胞杀伤效应比野生型EGFR-结合嵌合肽(三角形)提高更多(图7B)。
(实施例3：癌细胞膜-溶解序列(仅L-氨基酸)与作为癌细胞-靶向序列的IL-4受体(IL4R)靶向的序列的组合)
在本实施例中，研究通过将癌细胞膜-溶解序列KLLLKLLKKLLKLLKKK(所有氨基酸都是L-氨基酸；LyticL；SEQ ID NO：27)与IL4R-靶向序列组合而形成的嵌合肽来观察效果是否与实施例1一样，例如细胞杀伤效应的提高。嵌合肽序列如下：
IL4-LyticL：KQLIRFLKRLDRNGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(SEQ IDNO：18)。
(方案)
基于IL4R和IL-4的结合三维结构分析的结果，设计且化学合成对结合很重要的部分肽序列(KQLIRFLKRLDRN(SEQ ID NO：26))。通过BIACORE分析，检测与人类IL4R蛋白重组体的亲和力。合成前述嵌合肽，并检测对人类乳腺癌细胞系MDA-MB-231和人类胰腺癌细胞系BxPC-3的体外细胞杀伤效应。
(结果)
结果示于图8中。对于IL4R-结合肽序列(KQLIRFLKRLDRN(SEQ ID NO：26))，通过BIACORE分析来观察与人类IL4R蛋白重组体的亲和力(图8A)。对于IL4R-靶向的癌细胞膜-溶解嵌合肽(IL4-LyticL)，与癌细胞膜-单独的溶解肽(LyticL)相比，两种癌细胞系中的细胞杀伤效应都有所提高(图8B)。业已证实，作为嵌合化的结果，接触10分钟足以诱导癌细胞(BxPC-3)细胞死亡(图8C)。
(实施例4：癌细胞膜-溶解序列(仅L-氨基酸)与作为癌细胞-靶向序列的IL-13受体(IL13R)-靶向序列的组合)
在本实施例中，调查研究使用通过将癌细胞膜-溶解序列KLLLKLLKKLLKLLKKK(所有氨基酸都是L-氨基酸；LyticL；SEQ ID NO：27)与IL13R-靶向序列组合而形成的嵌合肽来观察效果是否与实施例1一样，例如细胞杀伤效应的提高。嵌合肽序列如下：
IL13-LyticL：KDLLLHLKKLFREGQFNGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(SEQ ID NO：19)。
(方案)
基于IL13R和IL-13的结合三维结构分析结果，设计并化学合成对结合很重要的部分肽序列(KDLLLHLKKLFREGQFN(SEQ ID NO：28))。通过BIACORE分析，检测与人类IL13R蛋白重组体的亲和力。合成前述嵌合肽，并检测对人类脑肿瘤细胞系U251和人类头和颈部癌细胞系HN-12的体外细胞杀伤效应。
(结果)
结果示于图9中。对于IL13R-结合肽序列(KDLLLHLKKLFREGQFN(SEQID NO：28))，通过BIACORE分析来观察与人类IL13R蛋白重组体的亲和力(图9A)。对于IL13R-靶向的癌细胞膜-溶解嵌合肽(IL13-LyticL)，与癌细胞膜-单独的溶解肽(LyticL)相比，两种癌细胞系中的细胞杀伤效应都有所提高(图9B)。业已证实，作为嵌合化的结果，接触10分钟足以诱导癌细胞(U251)细胞死亡(图9C)。
(实施例5：癌细胞膜-溶解序列(仅L-氨基酸)与作为癌细胞-靶向序列的神经纤毛蛋白-1(NRP1)-靶向序列的组合)
在本实施例中，研究使用通过将癌细胞膜-溶解序列KLLLKLLKKLLKLLKKK(所有氨基酸都是L-氨基酸；LyticL；SEQ ID NO：27)与NRP1-靶向序列组合而形成的嵌合肽，来观察效果是否与实施例1一样，例如细胞杀伤效应的提高。嵌合肽序列如下：
Sema3A-LyticL：NYQWVPYQGRVPYPRGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(SEQ ID NO：20).
(方案)
基于NRP1和Sema3A(其一种配体)的结合三维结构分析结果，设计并化学合成对结合很重要的部分肽序列(NYQWVPYQGRVPYPR(SEQ ID NO：29))。通过BIACORE分析，检测与人类NRP1蛋白重组体的亲和力。合成前述嵌合肽，并检测对人类胰腺癌细胞系SU86.86和人类乳腺癌细胞系SKBR3的体外细胞杀伤效应。
(结果)
结果示于图10中。对于NRP1-结合肽序列(NYQWVPYQGRVPYPR(SEQID NO：29))，通过BIACORE分析来观察与人类NRP1蛋白重组体的亲和力(图10A)。对于NRP1-靶向的癌细胞膜-溶解嵌合肽(Sema3A-LyticL)，与癌细胞膜-单独的溶解肽(LyticL)相比，两种癌细胞系中的细胞杀伤效应都有所提高(图10B)。
(实施例6：细胞膜-溶解和核酸-结合序列与作为癌细胞-靶向序列的EGFR-靶向序列的组合)
在本实施例中，研究使用通过将细胞膜-溶解和核酸-结合序列(RLLRRLLRRLLRK(SEQ ID NO：13)；在下文中，简写为buf)与EGFR-靶向序列组合而形成的嵌合肽，来观察效果是否与实施例1一样，例如细胞杀伤效应的提高。嵌合肽序列如下：
EGFbuf：YHWYGYTPQNVIGGGGGRLLRRLLRRLLRK(SEQ ID NO：21)。
(方案)
合成前述嵌合肽(EGFbuf)和单独的爆炸部分肽(buf)，并检测对人类肺癌细胞系H323、人类前列腺癌细胞系DU145和人类肺正常细胞系MRC-5的体外细胞杀伤效应。
(结果)
结果示于图11中。对于EGFR-靶向的嵌合肽(EGFbuf)，与癌细胞膜-单独的溶解肽(buf)相比，两种癌细胞系中的细胞杀伤效应都有所提高(图11A)。此外，当将EGFbuf对肺癌细胞系H322和肺正常细胞系MRC-5的细胞杀伤效应相比较时，对癌细胞的细胞杀伤敏感性高(图11B)。
(实施例7：癌细胞膜-溶解序列(L-，D-混合氨基酸组成)和三种与癌细胞中高表达的受体结合的序列的组合)
在本实施例中，研究使用通过将细胞膜-溶解序列(KLLLKLLKKLLKLLKKK(加下划线的字母表示D-氨基酸，且其他是L-氨基酸；SEQ ID NO：1))和三种与癌细胞中高表达的受体(her2，VEGF受体，转铁蛋白受体)结合的序列组合而形成的嵌合肽，来观察效果是否与实施例1一样，例如细胞杀伤效应的提高。嵌合肽序列如下(加下划线的字母表示D-氨基酸，且其他是L-氨基酸)：
HER2-溶解：YCDGFYACYMDVGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(SEQ IDNO：15)
VEGFR-溶解：WHSDMEWWYLLGGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(SEQID NO：16)
TfR-溶解：THRPPMWSPVWPGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(SEQ ID NO：17)。
(方案)
通过搜索文件，发现前述三种受体结合肽序列，设计并化学合成具有癌细胞膜-溶解序列的嵌合肽(KLLLKLLKKLLKLLKKK；加下划线的字母表示D-氨基酸；在下文中，简写为Lytic；SEQ ID NO：1)。合成前述嵌合肽，并检测对人类肺癌细胞系H322和人类肺正常细胞系MRC-5的体外细胞杀伤效应。
(结果)
结果示于图12中。对于三种抗癌靶向的细胞膜-溶解嵌合肽中的任一种，与单独的溶解肽相比，人类肺癌细胞系H322中的细胞杀伤效应有所提高(图12A)。此外，其对人类肺正常细胞系MRC-5的活体外细胞杀伤效应与两种癌细胞系相比较为温和(图12B)。
(实施例8：关于其他在癌细胞高表达的受体肽的实验)
在本实施例中，研究是否可使用其他在癌细胞中高表达的受体肽。
欲使用的肽如下。除肽序列不同外，所有方案都根据实施例1实施。
(癌细胞生长系统受体)
成纤维细胞生长因子受体(FGFR)：MQLPLAT(SEQ ID NO：5)或AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO：6)。
(血管生成系统受体)
2型人类表皮生长因子受体(HER2)：LLGPYEL WELSH(SEQ ID NO：52)，ALVRYKDPLFVWGFL(SEQ ID NO：53)，KCCYSL(SEQ ID NO：54)，WTGWCLNPEESTWGFCTGSF(SEQ ID NO：55)或DTDMCWWWSREFGWECAGAG(SEQ ID NO：56)
神经纤毛蛋白1(NRP1)/血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)：ATWLPPR(SEQ ID NO：36)
血管内皮生长因子受体1(VEGFR1/Flt1)：VEPNCDIHVMWEWECFERL-NH2(SEQ ID NO：32)或GGNECDAIRMWEWECFERL(SEQ ID NO：33)
Ephrin B1(EphB1)：EWLS(SEQ ID NO：37)
Ephrin B2(EphB2)：SNEW(SEQ ID NO：38)
(细胞因子/趋化因子受体)
白介素-11受体(IL11R)：CGRRAGGSC(环状)(SEQ ID NO：22)
(其他在癌细胞中高表达的受体)
葡萄糖调节蛋白78(GRP78)：WDLAWMFRLPVG(SEQ ID NO：39)，CTVALPGGYVRVC(环状)(SEQ ID NO：40)或YPHIDSLGHWRR(SEQ IDNO：58)
(癌表面抗原蛋白)
前列腺特异性膜抗原(PSMA)：CQKHHNYLC(SEQ ID NO：35)
(结果)
与使用EGFR的情况类似，通过BIACORE分析，可确定对各受体特异的亲和力，且可预期具有各结合序列和癌细胞膜-溶解序列的嵌合序列与癌细胞膜-单独的溶解肽相比具有较高的细胞杀伤效应。
(实施例9：使用抗癌靶向的嵌合肽(肽毒素)治疗)
使用实施例1中所制备的嵌合肽，确定治疗效果。设计抗癌靶向的嵌合肽(肽毒素)，其可通过使弹头部分肽(其与在癌细胞中高表达的分子(例如受体)结合)和爆炸部分肽(其对癌细胞呈现强细胞杀伤效应)结合而形成。在患癌症的动物模型中对抗癌效果进行研究。
(方案)
向5周龄雌性裸鼠balb/c-nu/nu皮下注射人类胰腺癌细胞系BxPC-3(5×106个细胞/150μl磷酸盐缓冲液)。移植5天后，以0mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg(50μl磷酸盐缓冲液/小鼠)瘤内给药EB-溶解嵌合肽，每周三次，持续三周。使用电子卡尺随时间测量肿瘤直径，并以较长直径×较短直径×较短直径×0.5计算肿瘤体积(mm3)。
(结果)
结果示于图13中。
在给予磷酸盐缓冲液的组中，观察到肿瘤随时间增大，但在给予EB-溶解嵌合肽的组中(在给予0.3mg/kg和1mg/kg的两组中)，肿瘤的扩张明显得到抑制。0.3mg/kg的剂量是极小的量，且预期在人体内也具有足够的抗癌效果。此结果证明，尽管认为肽在体内较容易分解且具有弱效应，但与常见技术相比此肽仍具有相当强的效果。通过对肽进行化学修饰或诸如此类产生稳定性，或与DDS或诸如此类组合进一步增强在体内的稳定性，且也可预期提高药物效应。
鉴于本实施例的结果，对结果数据的理论解释证实了嵌合肽是人类实际的抗癌剂。意即，借助图13中所显示的数据，本领域的技术人员应了解所述数据可与人体内的数据“视为等同”。由于所移植的癌细胞系来自人类，且临床使用的许多抗癌剂经历类似的研究过程，因此其被视为本领域中既定的理论。因而，从本实施例的结果来看，应了解本发明的嵌合肽可被断定为人类的“抗癌剂”。
(实施例10：静脉内给予EB-溶解的抗癌效果)
以与前述部分中所阐述相同的方式，使用实施例1中所制备的嵌合肽确定治疗效果。在本实施例中，检验全身给药的抗癌效果。
(方案)
向5周龄雌性裸鼠balb/c-nu/nu皮下注射人类胰腺癌细胞系BxPC-3(5×106个细胞/150μl磷酸盐缓冲液)。移植5天后，以0mg/kg(对照)、1mg/kg和5mg/kg经静脉内给予EB-溶解(EB-溶解)嵌合肽，每周三次，持续三周，或者作为与其分开的实验系统以0mg/kg、2mg/kg、5mg/kg和10mg/kg(50μl磷酸盐缓冲液/小鼠)给药。使用电子卡尺随时间测量肿瘤直径，并以较长直径×较短直径×较短直径×0.5计算肿瘤体积(mm3)。
(结果)
结果示于图14和图15A的上面部分中。由以上阐述明显看出，图14和15A分别示出了独立实验系统的结果。
对于给予磷酸盐缓冲液的组，观察到肿瘤随时间增大，但对于以1mg/kg和5mg/kg给予EB-溶解嵌合肽的两组，肿瘤的扩张明显得到抑制。全身给药时1mg/kg的剂量是极小的量，且预期在人体内也具有足够的抗癌效果。此外，在给予2mg/kg、5mg/kg和10mg/kg的组中第55天时肿瘤体积与经盐水治疗的对照组的肿瘤体积相比分别是(1310mm3)、34％(440mm3，P＜0.05)、30％(399mm3，P＜0.05)和19％(244mm3，P＜0.01)。此等结果显示，尽管迄今为止肽在体内立即分解且具有弱效应，且被认为全身给予肽极为困难，但与常见技术相比所述肽有极强效果。通过对肽的化学修饰或诸如此类所产生的稳定性、与DDS或诸如此类组合及诸如此类，体内稳定性得到进一步增强，且也可预期药物效应的提高。
(实施例11：治疗方法)
在本实施例中，对实际治疗的应用进行研究。
这里，借助DDS(药物递送系统)在患癌症的动物模型中，针对针对体内动力学稳定性并结合关于体内动力学稳定性的论述，针对控制释放及诸如此类，对抗癌效果进行研究。
(DDS)
将EB-溶解嵌合肽与端胶原混合，并使用供局部给药的凝胶制剂对抑制分解和控制释放效应进行研究。此外，针对全身给药，对呈现抑制肽分解效应且不胶凝的调配物进行研究。对于此研究，实施体外不含肽的端胶原混合物的分析，并测定端胶原含量的最佳百分比。
(患癌症动物模型中的抗癌效果)
将供局部给药的凝胶混合物(EB-溶解嵌合肽和端胶原)经瘤内给药，检测对患癌症的裸鼠模型的抗癌效果，其方式与实施例9中相同。此外，以相同方式检测全身给药的混合物的抗癌效果，该全身给药是通过静脉内给药。针对两种给药方法，实施设定用量和剂量的实验。
通过实施此等实验，可预期瘤内给予EB-溶解嵌合肽和端胶原的凝胶混合调配物产生足够的抗癌效果，此是由于抑制肽分解和控制释放效应所致，即使减少给药次数也如此。对于静脉内给药供全身给药的非凝胶混合物，与单独的肽相比可预期较高的抗癌效果。
(实施例12：设定剂量的体内实验)
使用实施例1中所制备的嵌合肽，研究剂量设定。
(方案)
向5周龄雌性裸鼠balb/c-nu/nu皮下注射人类胰腺癌细胞系BxPC-3(5×106个细胞/150μl磷酸盐缓冲液)。移植5天后，以0mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg或5mg/kg(50μl磷酸盐缓冲液/小鼠)经静脉内给予EB-溶解嵌合肽，每周三次，持续三周。使用电子卡尺随时间测量肿瘤直径，并以较长直径×较短直径×较短直径×0.5计算肿瘤体积(mm3)。
(实施例13：设定用量的体内实验)
使用实施例1中所制备的嵌合肽，研究用量设定。
(方案)
向5周龄雌性裸鼠balb/c-nu/nu皮下注射人类胰腺癌细胞系BxPC-3(5×106个细胞/150μl磷酸盐缓冲液)。移植5天后，以1mg/kg(50μl磷酸盐缓冲液/小鼠)经静脉内给予EB-溶解嵌合肽，每周三次持续三周，或每周五次持续一周。使用电子卡尺随时间测量肿瘤直径，并以较长直径×较短直径×较短直径×0.5计算肿瘤体积(mm3)。
(实施例14：在其他癌细胞的实验)
使用实施例1中所制备的嵌合肽，研究在其他类型癌症中的抗癌效果。
(方案)
向5周龄雌性裸鼠balb/c-nu/nu皮下注射人类乳腺癌细胞系MDA-MB-231或人类前列腺癌细胞系DU145(5×106个细胞/150μl磷酸盐缓冲液)。移植5天后，以0.5mg/kg(50μl磷酸盐缓冲液/小鼠)经静脉内给予EB-溶解嵌合肽，每周三次，持续三周。使用电子卡尺随时间测量肿瘤直径，并以较长直径×较短直径×较短直径×0.5计算肿瘤体积(mm3)。
(乳腺癌细胞系MDA-MB-231)
为了检测EB-溶解嵌合肽在人类癌症移植模型中的抗癌效果，研究EB-溶解嵌合肽在移植瘤中的体内抗瘤活性。将乳腺癌细胞系MDA-MB-231(5×106个细胞/150μl磷酸盐缓冲液)皮下注射至7-至9-周龄雌性裸鼠balb/c-nu/nu(体重：17-21g)的侧腹区域。当肿瘤达到体积20至60mm3的时间点时，将动物随机分成三组，经静脉内给予(50μl/注射)盐水(对照)或EB-溶解肽(2mg/kg或5mg/kg)，每周三次，持续三周(共给药九次)。使用电子卡尺随时间测量肿瘤直径，并以较长直径×较短直径×较短直径×0.5计算肿瘤体积(mm3)。终止治疗时，杀死小鼠并提取肿瘤。用苏木精染色后，借助光学显微镜实施组织学实验。所有值都以平均值±SD表示，并由单向方差分析(one-way ANOVA)和Dunnet检测实施统计分析。P＜0.05时，认为差异显著。
对照组呈现肿瘤逐渐生长且在第48天时达到1885mm3。另一方面，给予EB-溶解肽(2mg/kg、5mg/kg或10mg/kg，静脉内给药，每周三次)明显抑制肿瘤生长(图15A(下面部分)和15B)。第48天时，给予2mg/kg的组中平均肿瘤体积为933mm3，且给予5mg/kg的组中为419mm3(P＜0.01，与对照组中的小鼠相比)。如图15C中所示，在经EB-溶解肽治疗的小鼠中肿瘤细胞的数量明显减少(图15C，右图)。这些结果表明，新设计的EB-溶解嵌合肽成功地诱导肿瘤死亡。
(实施例15：EB(H2R)-溶解嵌合肽)
在本实施例中，研究EB(H2R)-溶解嵌合肽的活性。
对于野生型EB-溶解(YHWYGYTPQNVIGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK；SEQ ID NO：2；下划线表示D-氨基酸)和突变型EB(H2R)-溶解(YRWYGYTPQNVIGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK；SEQ ID NO：43；加下划线的字母表示D-氨基酸)，借由BIACORE系统实施亲和力比较。结果示于图16A中。此外，借助CD谱，对EB-溶解肽和EB(H2R)-溶解肽实施二级结构分析。结果示于图16B中。肽浓度为50μM。除肽序列不同外，根据实施例1实施此方案。
(细胞存活率分析)
使用溶解肽、野生型EB-溶解肽和EB(H2R)-溶解肽，实施对BT20细胞的细胞毒性比较。以3×103个细胞/孔接种在96-孔板中，在含10％FBS的培养基中培养24小时，并在37℃下与100μl浓度渐增的肽一起培养48至72小时。用WST-8溶液测量细胞存活率(Cell Count Reagent SF；Nakalai Tesque)。结果示于图16C中。
(EB(H2R)-溶解提高对癌细胞的细胞毒性)
将癌细胞系H322、BT-20、U251、BxPC-3、SU86.86和LNCaP与不同浓度(0至20μM)的EB-溶解嵌合肽或EB(H2R)-溶解嵌合肽一起培养72小时，并使用WST-8试剂检测细胞毒性。结果示于图17A中。此外，将正常细胞系MRC-5和HEK293与不同浓度(0至20μM)的前述肽一起培养72小时，检测细胞毒性，并如上所述实施细胞毒性分析。结果示于图17B中。结果表明，新设计的溶解肽适合于嵌合肽，用于提高对癌细胞的细胞毒性。
(EB(H2R)-溶解诱导癌细胞的迅速杀伤)
H322细胞用EB-溶解嵌合肽(白色柱)或EB(H2R)-溶解嵌合肽(黑色柱)处理2分钟、5分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时或24小时，且随后用新鲜的培养基替代含肽的培养基。细胞再继续培养24小时。使用WST-8来分析细胞存活率。结果示于图18中。结果表明，EB-溶解嵌合肽穿过质膜并诱导癌细胞的迅速杀伤。
结果汇总于表2中。
[表2]
表2.肽对各种细胞系的细胞毒性和EGFR表达.
Figure BPA00001385381300801
*相对MFI(平均荧光强度)是FITC-偶联的抗EGFR多克隆抗体与细胞的结合程度，其中将BT-20和HEK293细胞的平均MFI值分别设定为100％和0％。
(EB(H2R)-溶解崩解癌细胞膜比EB-溶解有效)
对EB(H2R)-溶解和EB-溶解崩解癌细胞膜的能力进行研究。
在玻璃底平皿中以最终浓度2μM将钙黄绿素(一种可溶性荧光分子)添加至H322肺癌细胞中。将小份的单独溶解肽、EB-溶解或EB(H2R)-溶解(15μl)以最终浓度10μM直接添加至平皿中。在添加肽0分钟、2分钟、5分钟、10分钟和20分钟后，使用Olympus FV1000共聚焦激光扫描显微镜(Olympus)获取共聚焦图像。图像示于图19A中。
由图19A中所示出的图像，可以看出，对于单独溶解肽(上面)，变绿的细胞(细胞膜崩解的细胞)数量没有变化，即使一段时间之后也如此；而对于EB-溶解肽(中间)和EB(H2R)-溶解肽(下面)，变绿的细胞数量随时间增加，且经EB(H2R)-溶解肽处理的变绿细胞数量增加的时间比EB-溶解肽短。
图19B示出了培养基流入细胞的百分比随时间的图示，其是根据图19A的结果计算而得。此图也表明，经EB(H2R)-溶解肽处理的培养基流入细胞的百分比比EB-溶解肽快。
应了解，作为钙黄绿素溶液穿过细胞膜的结果，显示EB(H2R)-溶解比EB-溶解有效。就图19A和19B而言，作为阴性对照，可使用图19A中单独溶解肽的显微镜数据。意即，此单独的溶解肽难以获得膜溶解能力。图19B是关于含钙黄绿素的培养基流入百分比的图示。因而，清晰可见EB(H2R)-溶解明显较早地穿过膜。
(在癌细胞中EB(H2R)-溶解通过细胞凋亡机制诱导细胞死亡，其作用比EB-溶解强)
对癌细胞中EB(H2R)-溶解和EB-溶解诱导Annexin V-阳性表达的能力进行研究。
根据实施例1的方法，实施Annexin V分析和半胱天冬酶分析。具体而言，在37℃下BT20细胞用5μM EB-溶解嵌合肽或EB(H2R)-溶解嵌合肽处理2小时，或者不用5μM EB-溶解嵌合肽或EB(H2R)-溶解嵌合肽而处理2小时。对于半胱天冬酶激活或Annexin V-阳性表达的测定，在FLICA半胱天冬酶-3&7分析(Immunochemistry Technologies，布卢明顿(Bloomington)，明尼苏达州(MN))中使用羧基荧光素同时对经肽处理的培养物进行半胱天冬酶活性和碘化丙啶(PI)染色分析，或者，作为选择，借由多参数流式细胞技术进行AnnexinV标记和PI染色分析。结果示于图20A(Annexin V)和图20B(半胱天冬酶活性)中。
就图20A而言，应了解EB(H2R)-溶解在诱导Annexin V-阳性表达方面优于EB-溶解。在用各个肽处理的BT-20细胞中，表示Annexin V-阳性细胞的右半图的比例增加，且EB(H2R)-溶解较强地诱导Annexin V-阳性表达。
此外，就图20B而言，应了解，EB(H2R)-溶解对半胱天冬酶活性的诱导优于EB-溶解。在经各个肽处理的BT-20细胞中，表示半胱天冬酶3，7-活化细胞的右半图的比例增加，且EB(H2R)-溶解较强地诱导半胱天冬酶3，7激活。
从优良抗癌剂的观点出发，认为促使自杀以避免向周围扩散要比出现副作用和其他体内影响时才杀伤有利得多。就本发明的嵌合肽而言，杀伤机制几乎不对肿瘤周围的细胞产生影响(例如紊乱)，在于其作用可对癌细胞有特异性并诱导凋亡。因而，本发明的杂交肽可被视为良好的药物。而且，使用此检测系统是由于其在准确计算Annexin V-阳性表达和半胱天冬酶3，7激活(其是凋亡的重要指标)方面的重要性。
此外，在本实施例中，揭示了当给予本发明的肽时，活细胞明显减少。因而，也可证明本发明肽选择性地杀伤更多的癌细胞，不管其是否介导细胞凋亡机制都如此。
此外，可了解，鉴于具有用常规抗癌剂不可达成的程度和选择性，本实施例证实EB-溶解和EB(H2R)-溶解的细胞杀伤效应是优良的。
(EB-溶解嵌合肽和EB(H2R)-溶解嵌合肽在具有人类乳腺癌细胞系MDA-MB-231的小鼠模型中的抗癌效果)
在具有人类乳腺癌细胞系MDA-MB-231的小鼠模型中，对EB-溶解嵌合肽和EB(H2R)-溶解嵌合肽的抗癌效果进行研究。
将MDA-MB-231乳腺癌细胞皮下移植至无胸腺裸鼠。移植5天后，将动物分成三组(n＝6/组)，并经静脉内注射盐水(对照)、EB-溶解肽(1mg/kg)或EB(H2R)-溶解嵌合肽(1mg/kg)。肿瘤直径随时间的测量结果示于图21中。
由图明显可以看出，其EB肽的第二个H由H变成R的嵌合肽(EB(H2R)-溶解)与EB-溶解嵌合肽(EB-溶解)相比在体内具有更高的抗癌效果。
图4的结果是肽浓度为1mg/kg时的比较结果。基于这些结果，应注意EB(H2R)-溶解可获得足够的抗癌效果，甚至以1mg/kg全身给药时也如此。由其他结果明显了解到，给予5mg/kg时产生具有可观治疗水平的抗癌作用。就给予1mg/kg而言，EB(H2R)-溶解仍获得足够的效应。鉴于常规的工艺现状，这是令人惊奇的数值。
具体而言，EB(H2R)-溶解甚至在浓度1mg/kg时也呈现足够的抗癌效应，且可以看出EB(H2R)-溶解是极具希望的抗癌治疗药物。
(实施例16：TfR-溶解嵌合肽)
在本实施例中，研究TfR-溶解嵌合肽的活性。
(EfR-溶解提高对癌细胞的细胞毒性)
使用TfR-溶解嵌合肽(THRPPMWSPVWPGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK；SEQ ID NO：17；加下划线的字母表示D-氨基酸)，研究对癌细胞的细胞毒性。
将3×103个细胞/孔的癌细胞系T47D、MDA-MB-231和SKBR-3与不同浓度(0至30μM)的TfR-溶解嵌合肽或溶解肽一起培养72小时，并使用WST-8试剂检测细胞毒性。结果示于图22A中。此外，将正常细胞系MRC-5、PE和HC与不同浓度(0至100μM)的前述肽一起培养72小时，并检测细胞毒性。将得自未经处理细胞的绝对值定义为100％。结果示于图22B中。进一步，就通过添加TfR-溶解嵌合肽提高细胞毒性而言，对TfR-溶解嵌合肽的IC50和溶解肽的IC50、或溶解肽/TfR-溶解嵌合肽的IC50比进行研究。发现在所述IC50值间存在关联。这些结果表明，对于提高针对癌细胞的细胞毒性，TfR-溶解肽适合于嵌合肽。结果汇总于表3中。
[表3]
表3.对各种细胞系，肽的细胞毒性和TfR表达.
Figure BPA00001385381300841
*MFI(平均荧光强度)是PE-偶合的抗转铁蛋白受体单克隆抗体与细胞结合的程度。
(TfR-溶解诱导对TfR-表达的癌细胞特异的迅速杀伤)
表明，TfR-溶解肽穿过质膜以迅速杀伤T47D癌细胞。T47D细胞用TfR-溶解嵌合肽(黑色柱)或溶解肽(白色柱)处理不同的时间段(1至180分钟)，且随后用新鲜的培养基替代含肽的培养基。将细胞继续培养72小时。使用WST-8分析细胞的细胞存活率。结果示于图24A中。
而且，以浓度10μM添加TfR-溶解嵌合肽后，于0分钟、5分钟、10分钟和15分钟后观察钙黄绿素溶液中的细胞。在T47D乳腺癌细胞中，观察到穿过膜的TfR-溶解嵌合肽(图24B)。
再者，在用肽(5μM)处理之前，将T47D细胞与浓度渐增的抗-TfR单克隆抗体或非特异性小鼠IgG1(同型对照)一起培育3小时，证实TfR-溶解嵌合肽抑制细胞存活率(图25A)。
(siRNA或扰频序列(scramble sequence，sc)RNA对癌细胞系的细胞毒性)
用siRNA或scRNA转染T47D和MDA-MB-231细胞，且在转染4天后，由流式细胞技术来分析细胞中靶基因的水平(数据未示出)。使用WST-8试剂检测抑制比。将该分析重复3次，且结果以一式三份测量值的平均值±SD(bar)表示。结果示于图25B中。
(在癌细胞中TfR-溶解嵌合肽经由细胞凋亡机制诱导细胞死亡的可能性)
将T47D和PE细胞分别与TfR-溶解嵌合肽(10μM)和溶解肽(10μM)一起培育2小时。在绿色通道中检测Annexin V(图26A)和半胱天冬酶3，7活性(图26B)，且在红色通道中检测PI染色，并进行流式细胞分析。在经TfR-溶解嵌合肽处理的T47D细胞中，显示Annexin V-阳性细胞和半胱天冬酶3，7-活化细胞的右半图的比例增加。另一方面，在正常细胞PE中，即使用TfR-溶解嵌合肽处理，Annexin V-阳性细胞和半胱天冬酶3，7-活化细胞的百分比也不会增加。表明，TfR-溶解嵌合肽以癌细胞选择性方式，通过细胞凋亡机制诱导癌细胞死亡。
(在癌细胞系中各种溶解肽通过细胞凋亡机制诱导细胞死亡的作用比较)
经线粒体跨膜电位-依赖性荧光染料JC-1标记的T47D细胞未经处理(未经处理：上面左图)或经星形孢菌素(对照线粒体膜电位：上面右图)处理、或溶解肽(下面左图)处理或TfR-溶解嵌合肽(下面右图)处理。2小时后，由流式细胞术来分析指示跨膜电位的红色荧光或绿色荧光的明显的变化比。结果示于图26C中。
此外，将T47D细胞与星形孢菌素、TfR-溶解嵌合肽(10μM)和溶解肽(10μM)一起培养。2小时后，分离胞浆提取物，使用细胞色素c的抗体通过Western印记法(Western blot)来研究细胞色素的释放。Western blot的结果示于图26D中。
(TfR-溶解嵌合肽的体内抗瘤活性)
将MDA-MB-231乳腺癌细胞皮下移植至无胸腺裸鼠。如箭头所示，从第5天起，瘤内注射盐水(对照)或TfR-溶解肽(0.3mg/kg、1mg/kg或3mg/kg)。各组都由三个动物组成(n＝3)。肿瘤直径随时间的测量结果示于图27A中。
另外，如箭头所示，从第5天起，向以相同方式皮下移植MDA-MB-231乳腺癌细胞的无胸腺裸鼠经静脉内注射盐水(对照)或TfR-溶解肽(0mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg或5mg/kg)。各组都由3个动物组成(n＝3)。肿瘤直径随时间的测量结果示于图27B中。
观察TfR-溶解嵌合肽的体内抗瘤活性。
(实施例17：IL4-溶解嵌合肽)
在本实施例中，研究IL4-溶解嵌合肽的活性。
(IL4-溶解(L，D)对癌细胞呈现选性择毒性)
使用仅由L氨基酸形成的IL4-LyticL(KQLIRFLKRLDRNGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK；SEQ ID NO：18)和D，L-混合IL4-溶解(D，L)(KQLIRFLKRLDRNGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK；SEQ ID NO：44；加下划线的字母表示D-氨基酸)，研究对癌细胞的细胞毒性。
以3×103个细胞/孔将正常细胞系WI-38(A，B)和癌细胞系KCCT873(C，D)接种在96-孔板中，在含10％FBS的培养基中培养24小时，并在37℃下与渐增浓度(0至30μM)的IL4-溶解(L)嵌合肽、溶解(L)肽、IL-4-溶解(L，D)嵌合肽或溶解(L，D)肽以100μl一起培养72小时。用WST-8溶液测量细胞存活率(Cell Count Reagent SF；Nakalai Tesque)。结果示于图29和表4中。
[表4]
表4.肽对各种细胞系的细胞毒性.
Figure BPA00001385381300871
由这些结果，应了解与使用仅由L-氨基酸组成的序列相比，在治疗上优选D，L-混合序列。也可确定，癌细胞与正常细胞间的选择性仍被保留。
(检测在癌细胞系的细胞表面IL-4Rα的表达)
将得自A172、BxPC-3和正常细胞系HEK293的总RNA反转录为cDNA，随后使用IL-4Rα-特异性引物，由定量PCR来检测。使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase，GAPDH)作为内参。结果示于图30中。
(IL4-溶解(L，D)嵌合肽迅速杀伤癌细胞)
PE细胞(A)、KCCT873细胞和BxPC-3细胞(B)经IL4-溶解(L，D)嵌合肽(黑色柱)或溶解(L，D)肽(白色柱)处理2分钟、5分钟、10分钟、30分钟、1小时或2小时。用新鲜培养基代替含肽的培养基，将细胞再继续培养72小时。使用WST-8试剂测定细胞存活率。结果示于图31中。
(通过IL4-溶解(L，D)嵌合肽介导细胞凋亡机制引起癌细胞死亡的可能性)
将PE细胞(其是正常细胞)和KCCT873细胞(其是癌细胞)与IL4-溶解(L，D)嵌合肽或溶解(L，D)肽(10μM)一起培育2小时。随后，实施双色流式细胞分析，在绿色通道中分析Annexin V标记且在红色通道中分析PI染色。结果示于图32中。各值表示每一象限中细胞的百分比。
(IR4-溶解(L，D)嵌合肽的体内抗瘤活性)
将MDA-MB-231乳腺癌细胞皮下移植至无胸腺裸鼠。如箭头所示，从第5天起，瘤内注射盐水(对照)或IL4-溶解(L，D)肽(0.5mg/kg或2mg/kg)。各组都由3个动物组成(n＝3)。肿瘤直径随时间的测量结果示于图33A中。
此外，如箭头所示，从第5天起，向以相同方式皮下移植MDA-MB-231乳腺癌细胞的无胸腺裸鼠经静脉内注射盐水(对照)或IL4-溶解(L，D)肽(2mg/kg或5mg/kg)。各组都由3个动物组成(n＝3)。肿瘤直径随时间的测量结果示于图33B中。
(实施例18：Sema3A-nLytic嵌合肽)
在本实施例中，研究Sema3A-nLytic嵌合肽的活性。
(Sema3A-nLytic对各种细胞系的细胞毒性)
使用新设计的nLytic肽(LLKLLKKLLKKLLKL；SEQ ID NO：45；加下划线的字母表示D-氨基酸)、Sema3A(aa363-377)-nLytic肽(NYQWVPYQGRVPYPRGGLLKLLKKLLKKLLKL；SEQ ID NO：46；加下划线的字母表示D-氨基酸)和Sema3A(aa371-377)-nLytic肽(D，L)(GRVPYPRGGLLKLLKKLLKKLLKL；SEQ ID NO：47；加下划线的字母表示D-氨基酸)，研究对癌细胞的细胞毒性。
以3×103个细胞/孔将胰腺细胞系接种在96-孔板中，在含10％FBS的培养基中培养24小时，并在37℃下与100μl渐增浓度(0至50μM)的Sema3A-nLytic肽或单独的nLytic肽以一起培育48小时。用WST-8溶液(Cell Count Reagent SF；Nakalai Tesque)测量细胞存活率。结果示于图34A和表5中。
[表5]
表5.Sema3A-nLytic对胰腺细胞系的细胞毒性.
Figure BPA00001385381300891
*IC50，是与未经处理的细胞相比细胞存活率受到50％抑制时肽的浓度。
(Sema3A-nLytic对乳腺癌细胞系的细胞毒性)
将乳腺癌细胞与不同浓度(0至20μM)的Sema3A(371-377)-nLytic或Sema3A(363-377)-nLytic一起培养48小时，并用WST-8试剂检测细胞毒性。结果示于图34B和表6中。
[表6]
表6.Sema3A-nLytic对乳腺癌细胞系的细胞毒性.
Figure BPA00001385381300892
*IC50，是与未经处理的细胞相比细胞存活率受到50％抑制时肽的浓度。
在正常细胞中，如表5中所示，IC50的数值＞50，且在表6中所示的癌细胞中可以较低浓度获得此效果。鉴于此，认为Sema3A-nLytic在正常细胞与癌细胞之间具选择性。
(Sema3A-nLytic对各种细胞系的细胞毒性)
将各种细胞与不同浓度(0至20μM)的Sema3A-nLytic(363-377)或Senaa3A-nLytic(371-377)一起培养48小时，并用WST-8试剂检测细胞毒性。将该分析重复3次，且结果以一式三份测量值的平均值±SD(bar)表示。结果示于图34C和表7中。
[表7]
表7.Sema3A-nLytic对各种细胞系的细胞毒性.
*IC50，是与未经处理的细胞相比细胞存活率受到50％抑制时肽的浓度。
此外，借助BIACORE来分析Sema3A野生型肽和某些突变型肽与神经纤毛蛋白-1(NRP-1)间的相互作用。结果示于图35中。(A)野生型Sema3A肽与NRP-1蛋白的结合。在并联传感器表面上分析梯度稀释的不同浓度(1.6μM、13μM、26μM)的野生型Sema3A肽样品。(B)Sema3A野生型肽和突变型肽(R372K和R372K/R377K)与NRP-1蛋白的结合。在并联传感器表面上分析各种梯度稀释的野生型Sema3A肽样品(26μM)。(C)各种Sema3A肽与NRP-1蛋白的结合能力的略图。(D)Sema3A野生型肽和突变型肽的肽序列。
(神经纤毛蛋白-1在胰腺癌细胞系和乳腺癌细胞系中的表达)
神经纤毛蛋白在某些胰腺癌细胞系(BxPC-3、CFPAC-1、Panc-1和SU8686)和胰腺上皮细胞和乳腺癌细胞(BT-20、MDA-MB-231、SKBR-3和T47D)中的表达，由RT-PCR来检测。在所有RT-PCR分析中，使用β-肌动蛋白作为阳性对照。结果示于图36中。
(通过Sema3A-溶解介导细胞凋亡机制引起癌细胞死亡的可能性)
在37℃下将PE细胞(上图)和BxPC-3细胞(下图)与Sema3A-溶解肽(5μM)一起培养3小时，并在6小时后由双色流式细胞技术分析Annexin V标记。结果示于图37中。由图显而易见，在经Sema3A-nLytic处理的BxPC-3细胞中，显示Annexin V-阳性细胞的右半图的比例增大。另一方面，在正常细胞PE中，Annexin V-阳性的死亡细胞的百分比未增大，即使经Sema3A-nLytic处理也如此。表明，Sema3A-nLytic以癌细胞选择性方式，经由细胞凋亡机制诱导癌细胞死亡。
(实施例19：Sema3A-kLytic嵌合肽)
在本实施例中，使用新设计的kLytic肽(KLLLKLLKKLLKLLKKK；加下划线的字母表示D-氨基酸；SEQ ID NO：49)和Sema3A(aa363-377)-kLytic肽(NYQWVPYQGRVPYPRGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK；加下划线的字母表示D-氨基酸；SEQ ID NO：50)，研究对癌细胞的细胞毒性。
以3×103个细胞/孔将胰腺细胞系接种在96-孔板中，在含10％FBS的培养基中培养24小时，并在37℃下与100μl渐增浓度(0至50μM)的Sema3A-kLytic(aa3ββ-377)肽或单独的kLytic肽一起培养48小时。用WST-8溶液(Cell CountReagent SF；Nakalai Tesque)测量细胞存活率。结果示于图38和表8中。
[表8]
表8.Sema3A-kLytic对胰腺癌细胞和正常细胞的细胞毒性.
Figure BPA00001385381300921
*IC50，是与未经处理的细胞相比细胞存活率受到50％抑制时肽的浓度。
鉴于如表8中所示的癌细胞中是以较低浓度获得的效果，认为Sema3A-kLytic在正常细胞与癌细胞间具选择性。
(神经纤毛蛋白-1在胰腺癌细胞系中的表达)
神经纤毛蛋白-1在某些胰腺癌细胞系(BxPC-3、Panc-1、SU8686和CFPAC-1)和胰腺上皮细胞中的表达由RT-PCR分析来检测。在所有RT-PCR分析中，使用GAPDH作为阳性对照。结果示于图39A中。
此外，对于每一种细胞都使用实时PCR来检测神经纤毛蛋白-1的表达。对于所有分析，都使用GAPDH作为对照。结果示于图39B中。
由图39A和39B明显可见，NRP-1在SU8686和CFPAC-1中的表达水平较高。在这些细胞系中，Sema3A(366-377)-kLytic肽的细胞杀伤效应是优良的，且因而可预期由对NRP-1靶向的杂交肽所产生的抗癌效果。
(通过Sema3A(363-377)-kLytic介导细胞凋亡机制引起癌细胞死亡的可能性)
研究在高表达NRP-1的人类胰腺癌细胞系SU8686中Sema3A(363-377)-kLytic肽是否诱导Annexin V-阳性表达。
在37℃下将SU8686细胞与Sema3A(363-377)-kLytic肽(10μM)一起培养3小时，并由双色流式细胞技术来分析Annexin V标记。结果示于图40中。由图明显看出，在经Sema3A(363-377)-kLytic处理的SU8686细胞中，显示Annexin V-阳性死亡细胞的右半图的比例增大。表明，Sema3A(363-377)-kLytic借由细胞凋亡机制也诱导癌细胞的细胞死亡。
具体而言，由这些结果，也可预期体内Sema3A(363-377)-kLytic肽与EB(H2R)-溶解等效的抗癌效应。
(Sema3A(363-377)-kLytic肽的体内抗癌作用)
(方案)
将人类胰腺癌细胞系BxPC-3(5×106个细胞/150μl磷酸盐缓冲液)皮下注射至雌性5周龄裸鼠balb/c-nu/nu。移植5天后，以0mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg或5mg/kg/50μl磷酸盐缓冲液/小鼠的剂量，经静脉内注射Sema3A(363-377)-kLytic肽，每周三次，持续三周。随时间用电子卡尺测量肿瘤直径，并以较长直径×较短直径×较短直径×0.5计算肿瘤体积(mm3)。
(实施例20：VEGFR2-溶解肽)
使用VEGFR2-溶解肽ATWLPPRGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(加下划线的字母表示D-氨基酸；SEQ ID NO：51)，研究对癌细胞的细胞毒性。
以3×103个细胞/孔将5种癌细胞系(OE19、T47D、BxPC-3、U937和LNCaP)和2种正常细胞系(HEK293和MRC-5)接种在96-孔板中，在含10％FBS的培养基中培养24小时，并与100μl渐增浓度(0至20μM)的VEGFR2-溶解肽一起培养72小时。用WST-8试剂(Cell Count Reagent SF；Nakalai Tesgue)检测细胞毒性。结果示于表9和图41中。
[表9]
表9.VEGFR1-溶解对各种癌细胞和正常细胞的细胞毒性.
Figure BPA00001385381300941
*IC50，是与未经处理的细胞相比细胞存活率受到50％抑制时肽的浓度。
如表中所示，在癌细胞中是以较低浓度获得此效果。鉴于此，认为VEGFR2-溶解肽在正常细胞与癌细胞间具选择性。
(VEGFR2-溶解肽的体内抗癌作用)
(方案)
将人类胰腺癌细胞系BxPC-3(5×106个细胞/150μl磷酸盐缓冲液)皮下注射至雌性5周龄裸鼠balb/c-nu/nu。移植5天后，以0mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg或5mg/kg/50μl磷酸盐缓冲液/小鼠的剂量，经静脉内注射VEGFR2-溶解肽，每周三次，持续三周。随时间用电子卡尺测量肿瘤直径并以较长直径×较短直径×较短直径×0.5计算肿瘤体积(mm3)。
(实施例21：肽稳定性的实验)
研究实施例1中所制备的嵌合肽的稳定性。
(方案)
在-20℃、4℃和25℃下将肽毒素在盐水或血清中储存较短或较长时间。根据HPLC的定量分析和对培养癌细胞的细胞杀伤效应及诸如此类，检测化学和生物活性。
(实施例22：使用氨基酸序列筛选药物/抗癌剂的方法，所述氨基酸序列靶向高表达EGFR的癌细胞中的EGFR和癌细胞的癌细胞膜)
在本实施例中，演示使用氨基酸序列筛选药物/抗癌剂的方法，所述氨基酸序列靶向高表达EGFR的癌细胞中的EGFR和癌细胞的癌细胞膜。
(方案)
制备具有高EGFR表达的癌细胞(人类肺癌细胞系H322或诸如此类)的细胞膜样品，并如下实施BIACORE分析。欲筛选的实验药物需生物素化。
用BIACORE生物传感器系统3000(BIACORE公司，乌普萨拉(Uppsala)，瑞士(Sweden))进行表面等离子共振(Surface plasmon Resonance，SPR)实验。经由N-羟基琥珀酰亚胺和N-乙基-N′-(二甲基氨基丙基)碳化二亚胺激活化学法将约5000RU的链霉亲和素(Sigma)固定在CM5传感器芯片的表面上，且随后将2000-3000RU的偶联生物素的实验药物(例如肽)注射在链霉亲和素固定的传感器芯片上。作为非特异性结合的对照，不含固定的链霉亲和素的传感器芯片上未反应的羧甲基用乙醇胺封闭。作为分析物，在25℃下以20μl/min的流速将细胞表面蛋白(使用Mem-PER真核膜蛋白提取试剂盒(Pierce)制备)注射在流动池上。为了防止在分析期间非特异性结合，使用HBS缓冲液(0.01M HEPES、0.15M NaCl、0.005％Tween 20、3mM EDTA(pH 7.4))作为电泳缓冲液。这些实验中所使用的全部蛋白浓度都由Bradford方法测定(BradfordMM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities ofprotein utilizing the principle of protein-dye binding.AnalBiochem1976；72：248-54)。使用BIA评估软件3.2版本(BIACORE)实施数据分析。
(结果)
具有高EGFR表达的癌细胞的膜样品与固定有实验药物的传感器芯片反应。
在实验药物与EGFR和癌细胞膜二者结合的情况下，呈现较高的响应，且可筛选实验药物。
如上文所述，通过本发明的优选实施例已对本发明进行阐释，但本发明不应解释为受限于这些实施例。应了解，本发明的范围仅应根据权利要求书进行解释。应了解，本领域的技术人员根据本发明的阐述和普通的常识可实施与特别优选的实施例等效的范围。应了解，出于说明之目的，本文所引用的专利内容、专利申请和文件应以引用方式并入本文中，以使其内容与本文具体所阐述者等效。
工业适用性
本发明提供减轻副作用的抗癌剂。
[序列表的非关键词文字]
SEQ ID NO：1：癌细胞膜-溶解肽的氨基酸序列KLLLKLLKKLLKLLKKK(加下划线的字母表示D-氨基酸)
SEQ ID NO：2：EB(EGFR-结合)-癌细胞膜-溶解嵌合肽的氨基酸序列YHWYGYTPQNVIGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(加下划线的字母表示D-氨基酸)
SEQ ID NO：3：人类EGF受体(rhEGFR)重组体NP_005219的氨基酸序列(在1210AA中，保留1186AA，加下划线的N-末端24AA除外)
SEQ ID NO：4：线粒体毒性肽和诱导凋亡的肽的聚阳离子氨基酸序列KLAKLAKKLAKLAK
SEQ ID NO：5：成纤维细胞生长因子受体(FGFR)-结合肽的氨基酸序列：MQLPLAT
SEQ ID NO：6：成纤维细胞生长因子受体(FGFR)-结合肽的氨基酸序列：AAVALLPAVLLALLAP
SEQ ID NO：7：EGF受体结合肽的氨基酸序列：YHWYGYTPQNVI
SEQ ID NO：8：EGF受体结合肽的氨基酸序列：X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12
SEQ ID NO：9：YRWYGYTPQNVI
SEQ ID NO：10：YKWYGYTPQNVI
SEQ ID NO：11：FLKLLKKLAAKLF
SEQ ID NO：12：RLLRRLLRRLLRRLLRRLLR
SEQ ID NO：13：RLLRRLLRRLLRK
SEQ ID NO：14：EB(H2R)-溶解：YRWYGYTPQNVIGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK
SEQ ID NO：15：HER2-溶解：YCDGFYACYMDVGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(加下划线的字母表示D-氨基酸且其余是L-氨基酸)
SEQ ID NO：16：VEGFR1-溶解：WHSDMEWWYLLGGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(加下划线的字母表示D-氨基酸且其余是L-氨基酸)
SEQ ID NO：17：TfR-溶解：THRPPMWSPVWPGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(加下划线的字母表示D-氨基酸且其余是L-氨基酸)
SEQ ID NO：18：IL4-LyticL：KQLIRFLKRLDRNGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK
SEQ ID NO：19：IL13-LyticL：KDLLLHLKKLFREGQFNGGGKLLLKLLKKLLKLKKK
SEQ ID NO：20：Sema3A-LyticL<与人类神经纤毛蛋白-1结合>：NYQWVPYQGRVPYPRGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK
SEQ ID NO：21：EGFbuf：YHWYGYTPQNVIGGGGGRLLRRLLRRLLRK
SEQ ID NO：22：白介素-11受体(IL11R)-结合肽的氨基酸序列：CGRRAGGSC(环状)
SEQ ID NO：23：细胞穿膜肽TA序列：YGRKKRRQRRR
SEQ ID NO：24：细胞穿膜肽R11序列：RRRRRRRRRRR
SEQ ID NO：25：细胞毒素肽：RQIKIQFQNRRMKWKKKAYARIGNSYFK
SEQ ID NO：26：IL4R-结合肽序列：KQLIRFLKRLDRN
SEQ ID NO：27：LyticL：KLLLKLLKKLLKLLKKK(单独的L-氨基酸)
SEQ ID NO：28：IL13R-结合肽序列：KDLLLHLKKLFREGQFN
SEQ ID NO：29：与神经纤毛蛋白受体结合肽结合所需的序列(对与配体Sema3A结合重要的序列)：NYQWVPYQGRVPYPR
SEQ ID NO：30：人类表皮生长因子受体2(HER2)-结合肽序列：YCDGFYACYMDV
SEQ ID NO：31：血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)-结合肽的氨基酸序列：WHSDMEWWYLLG
SEQ ID NO：32：血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)-结合肽的氨基酸序列：VEPNCDIHVMWEWECFERL
SEQ ID NO：33：血管内皮生长因子受体(VEGFR)-结合肽的氨基酸序列：GGNECDAIRMWEWECFERL
SEQ ID NO：34：转铁蛋白受体(TfR)-结合肽的氨基酸序列：THRPPMWSPVWP
SEQ ID NO：35：前列腺特异性膜抗原(PSMA)-结合肽的氨基酸序列：CQKHHNYLC
SEQ ID NO：36：神经纤毛蛋白-1(NRP1)/血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)结合肽的氨基酸序列：ATWLPPR
SEQ ID NO：37：ephrin B1(EphB1)-结合肽的氨基酸序列：EWLS
SEQ ID NO：38：ephrin B2(EphB2)结合肽的氨基酸序列SNEW
SEQ ID NO：39：葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的结合肽的氨基酸序列：WDLAWMFRLPVG
SEQ ID NO：40：葡萄糖调节蛋白78(GRP78)结合肽的氨基酸序列：CTVALPGGYVRVC(环状)
SEQ ID NO：41：原始溶解肽：LKLLKKLLKKLLKLL-NH2(加下划线的字母表示D-氨基酸且其余是L-氨基酸)
SEQ ID NO：42：EB-原始溶解：YHWYGYTPQNVIGGGLKLLKKLLKKLLKLL-NH2(加下划线的字母表示D-氨基酸且其余是L-氨基酸)
SEQ ID NO：43：EB(H2R)-溶解：YRWYGYTPQNVIGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(加下划线的字母表示D-氨基酸且其余是L-氨基酸)
SEQ ID NO：44：IL4-溶解(D，L)：KQLIRFLKRLDRNGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(加下划线的字母表示D-氨基酸且其余是L-氨基酸)
SEQ ID NO：45：nLytic：LLKLLKKLLKKLLKL(加下划线的字母表示D-氨基酸且其余是L-氨基酸)
SEQ ID NO：46：Sema3A(aa363-377)-nLytic：NYQWVPYQGRVPYPRGGLLKLLKKLLKKLLKL(加下划线的字母表示D-氨基酸且其余是L-氨基酸)
SEQ ID NO：47：Sema3A(aa371-377)-nLytic：GRVPYPRGGLLKLLKKLLKKLLKL(加下划线的字母表示D-氨基酸且其余是L-氨基酸)
SEQ ID NO：48：KLLLKLLKKLLKLLKKK(其中各氨基酸独立地为L-、D-、或D，L-混合氨基酸)
SEQ ID NO：49：kLytic肽：KLLLKLLKKLLKLLKKK(加下划线的字母表示D-氨基酸且其余是L-氨基酸)
SEQ ID NO：50：Sema3A(363-377)-kLytic肽：NYQWVPYQGRVPYPRGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(加下划线的字母表示D-氨基酸且其余是L-氨基酸)
SEQ ID NO：51：VEGFR2-溶解肽：ATWLPPRGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(加下划线的字母表示D-氨基酸且其余是L-氨基酸)
SEQ ID NO：52：2型人类表皮生长因子受体(HER2)-结合肽序列：LLGPYELWELSH
SEQ ID NO：53：2型人类表皮生长因子受体(HER2)-结合肽序列：ALVRYKDPLFVWGFL
SEQ ID NO：54：2型人类表皮生长因子受体(HER2)-结合肽序列：KCCYSL
SEQ ID NO：55：2型人类表皮生长因子受体(HER2)-结合肽序列：WTGWCLNPEESTWGFCTGSF
SEQ ID NO：56：2型人类表皮生长因子受体(HER2)-结合肽序列：DTDMCWWWSREFGWECAGAG
SEQ ID NO：57：Tat(人类免疫缺陷病毒1)(NP_057853)的氨基酸序列：MEPVDPRLEP WKHPGSQPKT ACTNCYCKKC CFHCQVCFITKALGISYGRK KRRQRRRAHQ NSQTHQASLS KQPTSQPRGD PTGPKE
Figure IPA00001385380900011
Figure IPA00001385380900021
Figure IPA00001385380900031
Figure IPA00001385380900041
Figure IPA00001385380900051
Figure IPA00001385380900061
Figure IPA00001385380900081
Figure IPA00001385380900091
Figure IPA00001385380900101
Figure IPA00001385380900111
Figure IPA00001385380900121
Figure IPA00001385380900131
Figure IPA00001385380900141
Figure IPA00001385380900151
Figure IPA00001385380900161
Figure IPA00001385380900181
Figure IPA00001385380900191

Claims (56)

1.一种嵌合肽，其特征在于，包括受体结合肽和细胞毒素肽。
2.根据权利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述受体结合肽选自包括下列的组：EGF受体结合肽、白介素-4(IL-4)受体结合肽、白介素-13(IL-13)受体结合肽、神经纤毛蛋白受体结合肽、2型人类表皮生长因子受体(HER2)-结合肽、血管内皮生长因子受体(VEGFR)-结合肽和转铁蛋白受体(TfR)-结合肽。
3.根据权利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，包括EGF受体结合肽和细胞毒素肽。
4.根据权利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述受体结合肽是EGF受体结合肽，且具有氨基酸序列YHWYGYTPQNVI(SEQ ID NO：7)，其中每个字母表示单字母氨基酸表示法，或其修饰的序列。
5.根据权利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述受体结合肽是EGF受体结合肽，且具有氨基酸序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12(SEQ ID NO：8)，其中：
X1是Y或与Y类似的氨基酸；
X2是H或与H类似的氨基酸；
X3是W或与W类似的氨基酸；
X4是Y或与Y类似的氨基酸；
X5是G或与G类似的氨基酸；
X6是Y或与Y类似的氨基酸；
X7是T或与T类似的氨基酸；
X8是P或与P类似的氨基酸；
X9是Q或与Q类似的氨基酸；
X10是N或与N类似的氨基酸；
X11是V或与V类似的氨基酸；且
X12是I或与I类似的氨基酸。
6.根据权利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述受体结合肽是EGF受体结合肽且具有氨基酸序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12(SEQ ID NO：8)，其中：
X1是Y或具有OH基团或芳香基团的与Y类似的氨基酸；
X2是H或具有正电荷的与H类似的氨基酸；
X3是W或具有芳香基团的与W类似的氨基酸；
X4是Y或具有OH基团的与Y类似的氨基酸；
X5是G或具有脂肪侧链的与G类似的氨基酸；
X6是Y或具有OH基团的与Y类似的氨基酸；
X7是T或具有OH基团的与T类似的氨基酸；
X8是P或与P类似的亚氨基酸类氨基酸；
X9是Q或与Q类似的酰胺类氨基酸；
X10是N或具有OH基团的与N类似的氨基酸；
X11是V或具有脂肪侧链的与V类似的氨基酸；且
X12是I或具有脂肪侧链的与I类似的氨基酸。
7.根据权利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述受体结合肽是EGF受体结合肽且具有氨基酸序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12(SEQ ID NO：8)，其中：
X1是Y或与Y类似的氨基酸S、H或F；
X2是H或与H类似的氨基酸R或K；
X3是W或与W类似的氨基酸Y、F或H；
X4是Y或与Y类似的氨基酸S、H或F；
X5是G或与G类似的氨基酸A、V、I或L；
X6是Y或与Y类似的氨基酸S、H或F；
X7是T或与T类似的氨基酸S、H或F；
X8是P或与P类似的氨基酸羟脯氨酸；
X9是Q或与Q类似的氨基酸N；
X10是N或与类似的氨基酸S、H或F；
X11是V或与V类似的氨基酸G、A、L或I；且
X12是I或与I类似的氨基酸G、A、V或L。
8.根据权利要求5所述的嵌合肽，其特征在于，所述序列中的X2是H或与H类似的氨基酸R或K。
9.根据权利要求3所述的嵌合肽，其特征在于，所述EGF受体结合肽具有YRWYGYTPQNVI(SEQ ID NO：9)或YKWYGYTPQNVI(SEQ ID NO：10)。
10.根据权利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述细胞毒素肽选自包含下列的组：细胞膜-溶解肽、细胞膜电位-去稳定化肽、细胞膜-溶解和核酸-结合肽以及线粒体膜-崩解肽。
11.根据权利要求10所述的嵌合肽，其特征在于，所述细胞膜-溶解肽具有仅由K与L组成的10-至20-氨基酸序列，且所述氨基酸是L-、D-或D，L-混合氨基酸。
12.根据权利要求11所述的嵌合肽，其特征在于，所述细胞膜-溶解肽是KLLLKLLKKLLKLLKKK(SEQ ID NO：48)，所述氨基酸是L-、D-或D，L-混合氨基酸。
13.根据权利要求10所述的嵌合肽，其特征在于，所述细胞膜电位-去稳定化肽是FLKLLKKLAAKLF(SEQ ID NO：11)。
14.根据权利要求10所述的嵌合肽，其特征在于，所述细胞膜-溶解和核酸-结合肽是RLLRRLLRRLLRRLLRRLLR(SEQ ID NO：12)或RLLRRLLRRLLRK(SEQ ID NO：13)。
15.根据权利要求10所述的嵌合肽，其特征在于，所述线粒体膜-崩解肽是KLAKLAKKLAKLAK(SEQ ID NO：4)。
16.根据权利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述细胞毒素肽由具有正电荷的氨基酸和疏水性氨基酸组成，且具有10-至30-氨基酸序列及两亲性螺旋结构。
17.根据权利要求16所述的嵌合肽，其特征在于，所述具有正电荷的氨基酸是K、R或H，且所述疏水性氨基酸是I、L、V、A或F。
18.根据权利要求16所述的嵌合肽，其特征在于，所述细胞毒素肽是KLLLKLLKKLLKLLKKK(SEQ ID NO：1)，其中每个氨基酸都是L-或D-氨基酸，加下划线的字母表示D-氨基酸。
19.根据权利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述嵌合肽进一步包括间隔肽。
20.根据权利要求19所述的嵌合肽，其特征在于，所述间隔肽是连接有0至5个甘氨酸、脯氨酸或甘氨酸和脯氨酸混合物的序列。
21.根据权利要求19所述的嵌合肽，其特征在于，所述间隔肽是GGG。
22.根据权利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述嵌合肽具有序列YHWYGYTPQNVIGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(SEQ ID NO：2)，其中加下划线的字母表示D-氨基酸。
23.根据权利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述嵌合肽具有序列YRWYGYTPQNVIGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(SEQ ID NO：43)，其中加下划线的字母表示D-氨基酸。
24.根据权利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述受体结合肽是白介素-4(IL-4)受体结合肽，且具有氨基酸序列KQLIRFLKRLDRN(SEQ ID NO：26)或其修饰的序列。
25.根据权利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述受体结合肽是白介素-13(IL-13)受体结合肽，且具有氨基酸序列KDLLLHLKKLFREGQFN(SEQID NO：28)或其修饰的序列。
26.根据权利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述受体结合肽是神经纤毛蛋白受体结合肽，且具有氨基酸序列NYQWVPYQGRVPYPR(SEQ ID NO：29)或其修饰的序列。
27.根据权利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述受体结合肽是2型人类表皮生长因子受体(HER2)-结合肽，且具有氨基酸序列YCDGFYACYMDV(SEQ ID NO：30)或其修饰的序列。
28.根据权利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述受体结合肽是血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)-结合肽，且具有氨基酸序列WHSDMEWWYLLG(SEQ ID NO：31)、VEPNCDIHVMWEWECFERL-NH2(SEQ ID NO：32)或GGNECDAIRMWEWECFERL(SEQ ID NO：33)或其修饰的序列。
29.根据权利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述受体结合肽是转铁蛋白受体(TfR)-结合肽且具有氨基酸序列THRPPMWSPVWP(SEQ ID NO：34)或其修饰的序列。
30.根据权利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述受体结合肽是成纤维细胞生长因子受体(FGFR)-结合肽，且是MQLPLAT(SEQ ID NO：5)、AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO：6)；神经纤毛蛋白1(NRP1)/血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)-结合肽，且是ATWLPPR(SEQ ID NO：36)；酪氨酸蛋白激酶受体B1(EphB1)-结合肽，且是EWLS(SEQ ID NO：37)；酪氨酸蛋白激酶受体B2(EphB2-结合肽，且是SNEW(SEQ ID NO：38)；白介素-11受体(IL11R)-结合肽，且是CGRRAGGSC(环状)(SEQ ID NO：22)；葡萄糖调节蛋白78(GRP78)-结合肽，且是WDLAWMFRLPVG(SEQ ID NO：39)或CTVALPGGYVRVC(环状)(SEQ ID NO：40)；前列腺特异性膜抗原(PSMA)-结合肽，且是CQKHHNYLC(SEQ ID NO：35)；或其修饰的序列。
31.根据权利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述嵌合肽具有选自包含下列的组的序列：SEQ ID NO：2、14、21、42、43和21，或其修饰的序列。
32.根据权利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述嵌合肽具有SEQ IDNO：15中所阐明的序列或其修饰的序列。
33.根据权利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述嵌合肽具有SEQ IDNO：16中所阐明的序列或其修饰的序列。
34.根据权利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述嵌合肽具有SEQ IDNO：17中所阐明的序列或其修饰的序列。
35.根据权利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述嵌合肽具有SEQ IDNO：18或44中所阐明的序列或其修饰的序列。
36.根据权利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述嵌合肽具有SEQ IDNO：19中所阐明的序列或其修饰的序列。
37.根据权利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述嵌合肽具有SEQ IDNO：20、46或47中所阐明的序列或其修饰的序列。
38.一种核酸，其特征在于，编码根据权利要求1至37中任一项所述的嵌合肽。
39.一种载体，其特征在于，包括编码根据权利要求1至37中任一项所述嵌合肽的核酸。
40.一种细胞，其特征在于，包括编码根据权利要求1至37中任一项所述的嵌合肽的核酸。
41.一种药物组合物，其特征在于，包括根据权利要求1至37中任一项所述的嵌合肽。
42.一种抗癌剂，其特征在于，包括根据权利要求1至37中任一项所述的嵌合肽。
43.一种根据权利要求1至37中任一项所述的嵌合肽的用途，其特征在于，用来制造药物组合物。
44.一种根据权利要求1至37中任一项所述的嵌合肽的用途，其特征在于，用来制造抗癌剂。
45.一种治疗方法，其特征在于，包括给予根据权利要求1至37中任一项所述的嵌合肽的步骤。
46.一种治疗癌症的方法，其特征在于，包括给予根据权利要求1至37中任一项所述的嵌合肽的步骤。
47.一种筛选药物的方法，其特征在于，使用由EGF受体结合肽靶向的氨基酸序列。
48.一种筛选抗癌剂的方法，其特征在于，使用由EGF受体结合肽靶向的氨基酸序列。
49.一种肽毒素，其特征在于，是靶向性嵌合肽，包括靶-结合肽部分和细胞毒性溶解肽部分。
50.根据权利要求49所述的肽毒素，其特征在于，所述靶-结合肽具有与在癌细胞中高表达的受体特异性结合的序列，且所述溶解肽部分具有癌细胞膜-溶解序列，且具有间隔。
51.根据权利要求50所述的肽毒素，其特征在于，所述溶解肽部分由具有正电荷的氨基酸和疏水性氨基酸组成，且具有10-至30-氨基酸序列及两亲性螺旋结构。
52.根据权利要求50所述的肽毒素，其特征在于，所述具有正电荷的氨基酸是K、R或H，且所述疏水性氨基酸是I、L、V、A或F。
53.根据权利要求50所述的肽毒素，其特征在于，所述间隔是连接有0至5个甘氨酸或脯氨酸或甘氨酸和脯氨酸的混合物的序列。
54.一种筛选药物的方法，其特征在于，所述方法使用靶向高EGFR表达的癌细胞中的EGFR和高EGFR表达的癌细胞的癌细胞膜的氨基酸序列。
55.根据权利要求54所述的筛选方法，其特征在于，所述药物是抗癌剂。
56.根据权利要求54所述的筛选方法，其特征在于，所述氨基酸序列是YHWYGYTPQNVIGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(SEQ ID NO：2)。
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