CN106589064A

CN106589064A - 高活性的肿瘤抑制剂及其制法和应用

Info

Publication number: CN106589064A
Application number: CN201510670992.3A
Authority: CN
Inventors: 李康善
Original assignee: Shanghai Baoheng Hongkang Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Baoheng Hongkang Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2015-10-15
Filing date: 2015-10-15
Publication date: 2017-04-26

Abstract

本发明提供了高活性的肿瘤抑制剂及其制法和应用。具体地，本发明获得了YAP蛋白与TEAD的关键结合位点，筛选出YAP抑制活性最佳的多肽并对其进行改造，例如加入二硫键、对氨基酸进行替换、缺失和/或添加(如加入细胞穿透片段)，并最终筛选并验证获得了具有YAP蛋白活性抑制作用且稳定性良好的系列多肽。实验证明，本发明多肽能够有效抑制YAP蛋白与TEAD结合活性，从而对消化道肿瘤(尤其是肝癌)具有良好的治疗作用。

Description

高活性的肿瘤抑制剂及其制法和应用

技术领域

本发明涉及肿瘤治疗领域，具体地，涉及新的YAP蛋白抑制多肽，用于治疗消化道肿瘤。

背景技术

肝癌是全球高发病率的癌症种类之一，特别是在中国，由于病毒性肝炎高发，慢性病毒性肝炎的主要预后将发展成为肝硬化，以致肝癌。目前的医疗水平还没有掌握任何技术和方法可以治愈肝癌，最主要的治疗方法是采取外科手术局部切除肿瘤，极少数可以进行肝脏切除并接受肝脏移植。由于没有办法彻底清除潜在的病灶，接受手术后肝癌的复发率极高，据统计，3年内的复发率约40％，七年内超过90％。

近年来，虽然已经开发了各种不同的肿瘤治疗药物和手段，但对于肝癌等恶性肿瘤，疗效并不理想。

因此本领域迫切需要寻找一种有效的治疗消化道肿瘤，尤其是肝癌的方法。

发明内容

本发明提供了一种创新的消化道肿瘤治疗药物，所述药物为多肽，可极其有效地抑制YAP蛋白，进而抑制肿瘤。

本发明提供了一种YAP蛋白抑制多肽及其用于治疗消化道肿瘤尤其是肝癌的用途。

本发明第一方面，提供了一种分离的多肽，所示的多肽具有式A所示的结构：

X₀-Y₁-Y₂-Y₃-Y₄-Y₅-Y₆-X_A-X_E-X_F 式A

式中，

X₀或X_A为无，或1、2、3或4个氨基酸残基；

Y₁为AP、VP、或无；

Y₂为X₁-X₂-X_2a，其中X₁选自M、F、C或Hcy；X₂为任意氨基酸残基(较佳地X₂为C、Hcy、L、M、F)；以及X_2a为L、Nle、C、Hcy、K或R；

Y₃为X_3a-X₃-X₄，其中X_3a为碱性氨基酸R或K；X₃为任意氨基酸(较佳地X₃为K、R、Hcy、C、Orn或Dab)；以及X₄为任意氨基酸(较佳地为L、Nle、Hcy、C),且Y₃中至少一个氨基酸为Hcy或C；

Y₄为P；

Y₅为X₅，且X₅为任意氨基酸(较佳地X₅为A、D、或E)；

Y₆为S-X_6a-X₆，其中X_6a为F、C、或Hcy；和X₆为任意氨基酸残基(较佳地X₆为C、Hcy、F、K或R)

Y₇为X₇-P-X_7a，其中X₇为任意氨基酸残基(较佳地X₇为C、Hcy、K、R或P)；以及X_7a为C、Hcy或P；

X_E为无或细胞穿透元件；

X_F为无或K；且所述的多肽具有Yes相关蛋白(Yes-associated protein，YAP)活性抑制作用。

在另一优选例中，所述细胞穿透元件的末端为K(lys)。

在另一优选例中，X_A为K。

在另一优选例中，X_E为无且X_A为K。

在另一优选例中，X_A为无且X_E为K。

在另一优选例中，Y₂和/或Y₃中至少一个氨基酸为Hcy或C；和Y₆或Y₇中至少一个氨基酸为Hcy或C。

在另一优选例中，Y₂中至少一个氨基酸为Hcy或C。

在另一优选例中，Y₃中的X_3a或X₃为Hcy或C。

在另一优选例中，Y₅(或X₅)为Hcy或C，或任意氨基酸残基。

在另一优选例中，Y₆中的X_6a或X₆为Hcy或C。

在另一优选例中，Y₇中的X₇或X_7a为Hcy或C。

在另一优选例中，所述的X_E为细胞穿透元件。

在另一优选例中，所述的X₁、X₂、X_2a、X₃、X_3a、X₅、X₆、X_6a、X₇和X_7a之间任选地形成至少一对二硫键。

在另一优选例中，所述的X₁、X₂、X_2a、X₃、X_3a、X₅、X₆、X_6a、X₇和X_7a之间任选地形成1或2对二硫键。

在另一优选例中，所述的二硫键在选自X₁、X₂、X_2a、X₃、X_3a的一个氨基酸与选自X₅、X₆ _、X_6a _、X₇和X_7a的一个氨基酸之间形成。

在另一优选例中，所述的二硫键位于X₁和X_6a之间、X₂和X₆之间、X_2a和X7之间、X_3a和X7之间、X₃和X_7a之间。

在另一优选例中，所述的二硫键位于X₂与X₆之间、X₅与X₇之间、X₂与X₇之间、或X₅与X₆之间。

本发明第二方面，提供了一种分离的多肽，所述的多肽具有式V所示的结构：

X₀-Z-X_A-X_E-X_F (V)

式中，

X₀或X_A为无，或1、2、3或4个氨基酸残基；

X_E为无或细胞穿透元件；

X_F为无或K；

Z为具有引入的链内二硫键的YAP抑制多肽，

并且所述Z中去除所述链内二硫键所对应的氨基酸之后具有式Va所示的基本序列：

Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11-Z12-Z13-Z14-Z15-Z16

式Va

式中，

Z1为V、A或无；

Z2为P、A或无；

Z3为M、F、L或氯苯丙氨酸；

Z4为R、K、A或无；

Z5为L、Nle、A或无；

Z6为R、或K；

Z7为K、R、Orn、Dab、或A；

Z8为L、或Nle；

Z9为P；

Z10为任意天然或非天然氨基酸，优选D、A、V、L、I或E；

Z11为S、或T；

Z12为F、L、或氯苯丙氨酸；

Z13为F、L、氯苯丙氨酸、或无；

Z14为K、R、A或无；

Z15为P、A或无；

Z16为P、A或无；

其中，所述的二硫键的第一氨基酸B1位于所述基本序列中Z1至Z8所构成的第一区段中任意两个氨基酸之间或位于所述第一区段的第一个氨基酸之前，而二硫键的第二氨基酸B2位于所述基本序列中Z9至Z16所构成的第二区段中任意两个氨基酸之间或位于所述第二区段的最后一个氨基酸之后。

在另一优选例中，Z4和Z5不同时为无。

在另一优选例中，第一氨基酸B1位于Z2和Z3之间、Z3和Z4之间、Z3和Z5之间(此时Z4为无)、Z4和Z5之间、Z7和Z8之间；和/或

第二氨基酸B2位于Z11和Z12之间、Z12和Z13之间、Z13和Z14之间、Z14之后(此时Z15和Z16为无)、Z15之后(此时Z16为无)、Z16之后。

在另一优选例中，所述式Va中Z3至Z13所示序列与SEQ ID NO.:1中第3－13位所示的序列相差不超过1、2、3、4、5个氨基酸，较佳地，不超过3、4个氨基酸。

注：SEQ ID NO.:1中第3-13位或对应于的Z3至Z13所构成的序列为核心序列。

在另一优选例中，第一氨基酸B1和第二氨基酸B2之间间隔3-14个(较佳地4-12个，更佳地4-10个，最佳地7、8、或9个)氨基酸。

在另一优选例，所述的第一氨基酸B1和第二氨基酸B2各自独立地选自Hcy或C。

在另一优选例中，一个或多个选自Z1、Z2、Z14-Z16的氨基酸为无。

在另一优选例中，所述的任意氨基酸包括天然或非天然氨基酸。

在另一优选例中，所述二硫键之间的间隔距离为4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸(不含形成二硫键的氨基酸)。较佳地，间隔距离为5、6、7、8、或9个氨基酸。

在另一优选例中，所述二硫键的数量为1对。

在另一优选例中，所述式A或式V多肽含有至少一个非天然氨基酸。

在另一优选例中，所述式A或式V多肽与SEQ ID No.:1的相同性(或同源性)≥50％，≥60％，≥70％，≥80％，≥90％。

在另一优选例中，所述式A或式V多肽保留了SEQ ID No.:1的生物活性的至少≥50％，≥60％，≥70％，≥80％，≥90％、≥100％，例如80-500％，较佳地100-400 ％。

在另一优选例中，所述的生物活性指的是YAP-TEAD结合抑制活性。

在另一优选例中，所述的多肽具有式I所示的结构：

X₀-VP-X_1-X₂-LRX₃-X₄-P-X₅-SF-X₆-X₇-PP-X_A-X_E-X_F式I，

且所述的多肽满足以下特征：

(a)X₀或X_A为无，或1、2、3或4个氨基酸残基；

(b)X₁选自M或F；

(c)X₂、X₅、X₆或X₇分别为任意氨基酸残基，且所述的X₂、X₅、X₆和X₇之间任选地形成至少一对二硫键；

(d)X₃或X₄为任意氨基酸；和

(e)X_E为无或细胞穿透元件；

(f)X_F为无或K；

且所述的多肽具有Yes相关蛋白(Yes-associated protein，YAP)活性抑制作用。

在另一优选例中，在X₂与X₆形成二硫键和/或在X₅与X₇之间形成二硫键。

在另一优选例中，X₃为K或相似氨基酸，较佳地选自K、Orn、或Dab。

在另一优选例中，X₄为L或相似氨基酸，较佳地选自L或Nle。

在另一优选例中，所述的细胞穿透元件的长度为4-20个氨基酸，较佳地为5-15个氨基酸。

在另一优选例中，所述抑制YAP活性包括抑制YAP与TEAD蛋白结合。

在另一优选例中，所述多肽抑制YAP界面3(aa86-100)与TEAD蛋白之间的结合。

在另一优选例中，所述的多肽具有式II所示的结构：

X₀-VP-X_1-X₂-LRKLPDSF-X₆-KPP-X_A-X_E-X_F

式II，

在另一优选例中，在X₂、X₅、X₆和X₇之间形成二硫键的氨基酸残基独立地选自Cys或Hcy。

在另一优选例中，所述的二硫键由Cys-Hcy、Cys-Cys形成。

在另一优选例中，所述的X₂、X₅、X₆与X₇相同或不相同。

在另一优选例中，所述的X₂为Hcy，和/或X₆为Cys。

在另一优选例中，所述的X_E选自如SEQ ID NO.:13-15所示的序列(RRMKWKK/GRKKRRQRRR/KKKRKV)。

在另一优选例中，所述的多肽的序列包括SEQ ID NOs.:1-12，22-37中任一所示序列。

在另一优选例中，所述的Z基本序列来源于哺乳动物YAP，较佳地来自于啮齿动物或人的YAP。

本发明第三方面，提供了一种分离的核酸，所述的核酸编码权利要求1-8中任一所述的多肽。

本发明第四方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明第一或第二方面任一所述多肽或本发明第八方面的修饰多肽作为活性成分，以及药学上可接受的盐。

在另一优选例中，所述的药物组合物为脂质体制剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物(如脂质体制剂)含有本发明第一或第二方面任一所述的多肽或本发明第八方面所述的修饰多肽。

在另一优选例中，所述的药物通过选自下组的用药方式进行给药：静脉内、瘤内、口服、腔内、皮下或肝动脉给药(如注射、滴注等)。

在另一优选例中，所述的药物的制剂选自下组：片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、喷雾剂、冻干剂。

在另一优选例中，所述的药物制剂为注射剂。

在另一优选例中，所述的多肽以0.01-20mg/kg体重的剂量(每次或每天)施用于哺乳动物。

本发明第五方面，提供了本发明第一或第二方面任一所述多肽或本发明第八方面所述修饰多肽的用途，其特征在于，所述多肽用于制备治疗肿瘤的药物组合物、抑制肿瘤细胞生长的组合物、和/或用于制备抑制YAP活性的药物组合物。

在另一优选例中，所述的肿瘤或肿瘤细胞为YAP高表达的。

在另一优选例中，所述的“YAP高表达”指肿瘤组织中YAP的表达量Ec与癌旁组织(或正常组织)中YAP的表达量En之比值(Ec/En)≥2、≥3、≥5(如2-20)。

在另一优选例中，所述的表达量包括蛋白表达量或mRNA表达量。

在另一优选例中，所述的YAP高表达肿瘤包括消化道肿瘤。

本发明第七方面，提供了一种治疗肿瘤的方法，包括步骤：

向需要的对象施用安全有效量的权利要求1所述的多肽或权利要求10所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述需要的对象为患有YAP蛋白高表达型肿瘤的对象。

在另一优选例中，所述的肿瘤是YAP高表达肿瘤。

在另一优选例中，所述的肿瘤包括：消化道肿瘤。

在另一优选例中，所述消化道肿瘤包括肝癌、胃癌、结直肠癌、胆囊癌、胰腺癌

在另一优选例中，所述的对象是人。

本发明第八方面，提供了一种修饰多肽，所述的修饰多肽是经权利要求本发明第一或第二方面任一所述多肽经酰化后形成的修饰多肽。

在另一优选例中，所述修饰多肽是经C₁₀-C₂₄ _、优选为C₁₂-C₂₀ _、更优选为C₁₆-C₁₈的酰化剂酰化后形成的修饰多肽。

在另一优选例中，所述修饰多肽具有如下结构：

P₀-X_G 式B

其中，X_G为C₁₀-C₂₄的酰基，所述的P0为式A或式V所代表的多肽。

在另一优选例中，X_G连接于P₀的末端(如C端)或中间。

在另一优选例中，X_G连接于P₀末端K的侧链氨基。

在另一优选例中，所述的修饰多肽具有如下结构：

式A-X_G；或

式V-X_G。

在另一优选例中，所述的酰基为饱和或不饱和和/或取代或未取代的酰基。

本发明第九方面，提供了本发明第一方面或第二方面任一所述多肽，或本发明第八方面所述修饰多肽的用途，所述多肽用于制备治疗肿瘤的药物组合物、抑制肿瘤细胞生长的组合物、和/或用于制备抑制YAP活性的药物组合物。

本发明第十方面，提供了一种YAP抑制多肽的修饰方法，包括步骤：

(i)将本发明第一或第二方面所述多肽在合适条件下与酰化剂反应，从而获得酰基化修饰的YAP抑制多肽。

在另一优选例中，所述的酰化剂为C₁₀-C₂₀、优选为C₁₂-C₂₀、更优选为C₁₆-C₁₈ 的酰化剂，优选为酰卤。

在另一优选例中，所述的修饰方法还包括步骤：

(ii)将(i)中获得酰基化修饰的YAP抑制多肽进行脂质体化。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明多肽的筛选方法即TR-FRET试验的原理图。

图2显示了YAP-TEAD结合示意图，其中③为本发明多肽与YAP竞争性结合TEAD的位点。

图3显示了本发明多肽的筛选流程。

图4显示了分别在高表达和低表达的YAP蛋白的肿瘤细胞系中，SEQ ID NO.:1所示多肽与细胞增殖情况的量效关系。

图5显示了在体内实验中，施用本发明YAP抑制多肽后的肿瘤体积显著小于空白对照。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次利用YAP蛋白排列形成多肽库,经筛选并制备了多个YAP抑制多肽，该类抑制多肽可以有效地抑制YAP-TEAD的相互作用。具体地，本发明综合了蛋白多肽生产技术，吻合肽技术及细胞穿透元件等多种不同技术，成功开发了能够有效穿透细胞并显著抑制细胞内YAP-TEAD蛋白复合物的稳定YAP蛋白抑制多肽。实验表明，本发明多肽在体内的药稳定性及穿透细胞效能良好，在血液中的半衰期达到24小时以上，并达到80％以上的细胞进侵率，且抑制YAP-TEAD结合的EC₅₀达到纳米摩尔的效率。

本发明人还根据所筛选获得的SEQ ID NO.:1序列，对其进行了大量的改造和衍生。实验表明，利用特定位置插入或取代的二硫键形成氨基酸(Hcy或Cys)，和/或对核心序列(Z)的部分氨基酸残基进行一定范围的取代后，本发明多肽的稳定性更佳，而在这些多肽的N-末端加入了细胞穿透多肽后，能够获得YAP蛋白抑制活性良好(甚至更佳)的抑制多肽。

此外，本发明人对筛选获得的蛋白进行了进一步的修饰和改造。具体地，本发明人在连接有穿膜片段的本发明多肽的C端连接了酰基(如C₁₀-C₂₄的酰卤)，从而大幅改善了本发明多肽的成药性，并在进一步制成脂质体制剂后，有效地增强了细胞增殖抑制效果。

YAP蛋白

YAP是一种在Hippo信号通路中的重要肿瘤基因，可以影响肿瘤细胞的生长。Yes相关蛋白1Yes-associated protein 1的人基因可参见公共数据库(如蛋白GenBank)或文献。Yes相关蛋白1的基因序列的ID为10413；蛋白序列见AAH38235.1。

已有的研究表明，YAP蛋白在人的肝细胞癌中明显发达，在多种实体肿瘤中过度表达，在肝癌超过60％，在肝细胞癌，其表达的程度与临床预后密切相关。

此外，YAP蛋白被认为在多种消化系统实体肿瘤中高表达，例如胃癌、结直肠癌、胆囊癌、胰腺癌等。因此，YAP被认为是在消化道肿瘤的一种潜在肿瘤基因。如本文所用，所述的“YAP高表达”指肿瘤组织中YAP的表达量Ec与癌旁组织(或正常组织)中YAP的表达量En之比值(Ec/En)≥2、≥3、≥5(如2-20)。通常，YAP蛋白的表达量可通过常规方法检测获得。

YAP-TEAD复合物

YAP与TEAD是肝细胞的胞核内控制细胞生长的主要分子。YAP-TEAD的相互作用，致使生长基因激活进而促进细胞的分裂，生长。

本发明人利用YAP蛋白排列技术，构建了不同的噬菌体多肽库。透过大量筛选试验，首次证明了YAP界面3(AA86-100)是影响YAP与TEAD结合的最重要界面，其他界面只能在YAP与TEAD的相互结合中发挥有限作用。

本发明多肽能够有效地与TEAD蛋白的结合，进而抑制YAP-TEAD之间的结合。

病人来源肿瘤异种动物模型(Patient-Derived Tumor X_Enograft，PDTX)

病人来源肿瘤异种动物模型是最先进的动物模型。将取得的病人癌组织植入裸鼠，经过特殊处理，植入组织小片能长成一个癌亦实体瘤。文献显示异种动物模型比传统细胞系动物模型在病理学及癌组织结构上更接近人类的癌症，具有很高的转化医学价值。本发明中动物实验模型可参照Patient-derived tumor X_Enografts as models for oncology drug development.Tentler et al,Nat Rev Clin Oncol；9:338-350(2012)。

活性多肽

在本发明中，术语“本发明多肽”、“本发明小肽”、“YAP抑制多肽”可互换使用，都指具有YAP抑制活性的氨基酸序列(式I、式A、式V或式Va)的蛋白或多肽。此外，所述术语还包括具有YAP抑制活性的符合式I、式A、式V或式Va的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：在N末端添加一个或数个(通常为5个以内，较佳地为3个以内，更佳地为2个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。在N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。

本发明还包括本发明多肽的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持抑制YAP蛋白或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)本发明多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的然后蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

一类优选的活性衍生物指与式I的氨基酸序列相比，有至多5个，较佳地至多3个，更佳地至多2个，最佳地1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1a进行氨基酸替换而产生。

表1a

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val

Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

发明还提供本发明多肽的类似物。这些类似物与天然本发明多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。例如，Cys可与非天然的Hcy形成二硫键。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

一些常用的非天然氨基酸列于下表1b。

表1b

名称	缩写	分子式	残基分子式
				a-Aminobutyric acid	Abu	C₄H₉NO₂	C₁₅H₁₃NO

a,y-Diaminobutyric acid	Dab	C₄H₁₀N₂O₂	C₄H₈N₂O
				Norleucine	Nle	C₆H₁₃NO₂	C₆H₁₁NO
Ornithine	Orn	C₅H₁₂N₂O₂	C₅H₁ON₂O
				Hydroxy-proline	Hyp	C₅H₉NO₃	C₅H₇NO₂
Homocysteine	Hcy(hC)	C₄H₉NO₂S	C₄H₇NOS
				6-Hydroxy-lysine	Hyl	C₆H₁₄N₂O₃	C₆H₁₂N₂O₂
Homoarginine	Har	C₇H₁₆N₄0₂	C₇H₁₄N₄0
				Chlorophenylalanine	(Cl-)F	C₉H₁₀ClNO₂	C₉H₈ClNO

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽，优选地，为经过酰基化修饰的、溶解性能增强的多肽。

在优选例中，本发明特别提供了一种经C₁₀-C₂₄酰基修饰的修饰多肽，以及含有本发明修饰多肽的脂质体制剂。应理解，可用于本发明酰化修饰的酰基没有特殊限制，可以是具有10-24个碳原子的酰基，包括取代或为取代的、和/或饱和或未饱和的酰基。优选地，可用于本发明的具有10-24个碳原子的酰基包括含有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、或24个碳原子的酰基，例如酰卤。

在优选例中，本发明多肽具有至少一个内部的二硫键(引入的链内二硫键)。令人意外的是，该内部二硫键的存在不仅不影响其抑制活性，而且有助于延长半衰期和提高抑制活性。通常，可用本领域常规的方法来形成，例如使半胱氨酸或同型半胱氨酸巯基在氧化条件下结合形成二硫键。本发明多肽中引入的链内二硫键的第一氨基酸B1位于所述基本序列中Z1至Z8所构成的第一区段中任意两个氨基酸之间或位于所述第一区段的第一个氨基酸之前，而二硫键的第二氨基酸B2位于所述基本序列中Z9至Z16所构成的第二区段中任意两个氨基酸之间或位于所述第二区段的最后一个氨基酸之后。通常，二硫键的第一氨基酸B1和第二氨基酸B2之间至少间隔一个氨基酸，也可以接受任何能够形成链内二硫键的合理距离，例如，3-12个氨基酸。一种优选的本发明多肽还包括对SEQ ID NO.:1所示多肽进行改造后的多肽(SEQ ID NO.:21-34)。

本发明多肽还可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下酸形成的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羟乙磺酸。其他盐包括：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式。

编码序列

本发明还涉及编码本发明多肽的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与编码区序列相同或者是简并的变异体。本发明的多肽的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。

另一方面，本发明还包括对本发明多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体或抗体片段，尤其是单克隆抗体。

制备方法

本发明多肽可以是重组多肽或合成多肽。本发明的多肽可以是化学合成的，或重组的。相应地，本发明多肽可用常规方法人工合成，也可用重组方法生产。

一种优选的方法是使用液相合成技术或固相合成技术，如Boc固相法、Fmoc固相法或是两种方法联合使用。固相合成可快速获得样品，可根据目的肽的序列特征选用适当的树脂载体及合成系统。例如，Fmoc系统中优选的固相载体如连接有肽中C端氨基酸的Wang树脂，Wang树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-烷氧基苄醇；用25％六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温处理20分钟，以除去Fmoc保护基团，并按照给定的氨基酸序列由C端逐个向N端延伸。合成完成后，用含4％对甲基苯酚的三氟乙酸将合成的胰岛素原相关肽从树脂上切割下来并除去保护基，可过滤除树脂后乙醚沉淀分离得到粗肽。将所得产物的溶液冻干后，用凝胶过滤和反相高压液相层析法纯化所需的肽。当使用Boc系统进行固相合成时，优选树脂为连接有肽中C端氨基酸的PAM树脂，PAM树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-羟甲基苯乙酰胺；在Boc合成系统中，在去保护、中和、偶联的循环中，用TFA/二氯甲烷(DCM)除去保护基团Boc并用二异丙基乙胺(DIEA/二氯甲烷中和。肽链缩合完成后，用含对甲苯酚(5-10％)的氟化氢(HF),在0℃下处理1小时，将肽链从树脂上切下，同时除去保护基团。以50-80％乙酸(含少量巯基乙醇)抽提肽，溶液冻干后进一步用分子筛Sephadex G10或Tsk-40f分离纯化，然后再经高压液相纯化得到所需的肽。可以使用肽化学领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各氨基酸残基，例如可使用二环己基碳二亚胺(DCC)，羟基苯骈三氮唑(HOBt)或1,1,3,3-四脲六氟磷酸酯(HBTU)进行直接偶联。对于合成得到的短肽，其纯度与结构可用反相高效液相和质谱分析进行确证。

在一优选例中，本发明多肽，按其序列，采用固相合成的方法制备，行高效液相色谱纯化，获得高纯度目的肽冻干粉，-20℃贮存。

另一种方法是用重组技术产生本发明多肽。通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸用来表达或生产重组的本发明多肽。一般来说有以下步骤：

(1)用本发明的编码本发明多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

由于本发明多肽较短，因此可以考虑将多个多肽串联在一起，重组表达后获得表达产物，然后通过酶切等方法形成所需的小肽。

细胞穿透元件

如本文所用，术语“细胞穿透元件”、“细胞穿透肽”可互换使用，均指在对细胞无任何破坏的情况下,能将抑制多肽有效地渗透进细胞内且不影响抑制多肽活性的小肽段。在优选的情况下，可用于本发明细胞穿透元件的序列包括但不限于如下所示的小肽：RRMKWKK(SEQ ID NO.:13)、GRKKRRQRRR(SEQ ID NO.:14)或KKKRKV(SEQ ID NO.:15)。

脂质体制剂

药剂学定义脂质体(liposome):系指将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊体。脂质体是由磷脂分子在水相中通过疏水作用形成的，因此制备脂质体所强调的不是膜组装，而是如何形成适当大小、包封率高和稳定性高的囊泡。制备的方法不同，脂质体的粒径可从几十纳米到几微米，并且结构也不尽相同。本发明脂质体制剂指的是通过常规方法将本发明多肽或其修饰多肽制备成脂质体形式的制剂。优选的制备方法包括膜分散法、表面活性剂透析法、乙醇注入法。优选地，本发明提供了一种经酰基修饰的脂质体制剂。

药物组合物和施用方法

另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，它含有(a)安全有效量的本发明多肽或其药学上可接受的盐；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。本发明多肽的数量通常为10微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。

为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/千克，较佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克体重的本发明多肽。此外，本发明的多肽可以单用，也可与其他治疗剂一起使用(如配制在同一药物组合物中)。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂、及其组合。

治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。

通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。

一旦配成本发明的组合物，可将其通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、肌内、静脉内、肝动脉、口服、皮下、皮内、或局部给药。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。

当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物。较佳地为静脉用或肝动脉药制剂或瘤内用药注射剂。

这些药物组合物可根据常规方法通过混合、稀释或溶解而进行配制，并且偶尔添加合适的药物添加剂，如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂(isotonicities)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和助溶剂，而且该配制过程可根据剂型用惯常方式进行。

例如，可进行静脉施用的溶剂可这样进行：将本发明多肽或其药学上可接受的盐与基本物质一起溶解于无菌水(在无菌水中溶解有表面活性剂)中，调节渗透压和酸碱度至生理状态，并可任意地加入合适的药物添加剂如防腐剂、稳定剂、缓冲剂、等渗剂、抗氧化剂和增粘剂，然后使其完全溶解。

本发明的药物组合物还可以缓释剂形式给药。例如，本发明多肽或其盐可被掺入以缓释聚合物为载体的药丸或微囊中，然后将该药丸或微囊通过手术植入待治疗的组织。作为缓释聚合物的例子，可例举的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羟基甲基丙烯酸酯(polyhydrometaacrylate)、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、乳酸聚合物、乳酸-乙醇酸共聚物等，较佳地可例举的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和乳酸-乙醇酸共聚物。

当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，作为活性成分的本发明多肽或其药学上可接受的盐的剂量，可根据待治疗的每个病人的体重、年龄、性别、症状程度而合理地加以确定。

本发明有益效果

1.本发明多肽能竞争性抑制YAP-TEAD复合物的形成，从而抑制肝癌细胞的生长、诱导肝癌细胞的死亡。

2.本发明多肽内部形成二硫键，使多肽结构更稳定，在血液中半衰期高达24小时以上。

3.本发明多肽具有细胞穿透元件，能够有效进入肝癌细胞内抑制YAP活性，其癌细胞进侵率高达80％，能够获得YAP蛋白抑制活性良好(甚至更佳)的抑制多肽。

4.本发明多肽的二硫键长度以及位置可以基于核心序列进行改变，或对核心序列中的个别氨基酸进行一定范围的替换后，所改变的多肽仍具有YAP抑制活性，且稳定性更佳。

5.经酰化的本发明多肽能够更高效地制备成脂质体制剂，其穿膜性能更强，从而达到了更高效的肿瘤抑制活性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

通用方法：

TR-FRET试验

作为YAP抑制多肽筛选方法，该试验基于在显微感光板阅读器上的时间分辨荧光能量转移，用两种荧光团标记YAP抑制多肽及其目标TEAD。两个分子之间的相互作用会使两个荧光团互相靠近，并使其之间产生能量转移，从而使其在特定波长下发出特殊的荧光。通过在显微感光板阅读器上测定该特定波长，即可在很短的时间内筛选出潜在的YAP抑制多肽，其原理如图2所示。

肽序列

SEQ ID NO.:	序列
		1	VPMRLRKLPDSFFKPPE
2	VPM(Hcy)LRKLPDSFCKPPE
		3	VPM(Hcy)LRKLPDSFCKPPRRMKWKK
4	VPF(Hcy)LRKLPDSFCKPPE

5	VPF(Hcy)LR(Orn)LPDSFCKPPE
		6	VPF(Hcy)LR(Dab)LPDSFCKPPE
7	VPF(Hcy)LR(Dab)LPDSFCKPPRRMKWKK
		8	VPMCLRKLPESFCHPPE
9	VPM(Hcy)LRKLPCSFCDPPE
		10	PQTVPMRLRKLPDSFFKPPE
11	VPM(Hcy)LRK(Nle)PASFCKPPE
		12	VP(3-Cl)F(Hcy)LRK(Nle)PASFCKPPE
13	RRMKWKK
		14	RGRKKRRQRRR
15	KKKRKV

实施例1 YAP抑制多肽的筛选

1.1本发明人利用YAP蛋白排列，构建了不同的噬菌体多肽库。透过多次筛选试验，选出能有阻断YAP-TEAD结合的候选多肽。再从众多候选多肽中筛选出能有效穿透细胞，减低TEAD活跃度及下调其他YAP目标基因的抑制多肽。对经过筛选得到的YAP抑制多肽进行试管测试及PTDX动物实验模型予以证实，最终获得具有疗效的成功YAP抑制多肽。

研究结果表明，YAP(AA50-171)交互环绕着TEAD1(AA194-411)的球状结构,并通过三个高度保守的蛋白界面形成广泛的相互作用。界面1是YAPβ1(AA53-58)和TEADβ7的反平行β片层结构。界面2是YAP1α1(AA61-73)螺旋和TEADα3和α4螺旋TEAD之间的相互结构。界面3是结合YAP(AA86-100)螺旋区域与TEAD1的β4，β11，β12，α1和α4TEAD而形成的深口袋区域(图1)。

1.2根据初步筛选的YAP蛋白抑制序列，并对候选序列(SEQ ID NOs.:1,16-20)的N末端加入了实施例2中所述的细胞穿透元件(SEQ ID NO.:13)，其中部分候选多肽序列及如下表所示：

表6

SEQ ID NO.:	YAP位置	序列
			16	aa24-40	PQGQGPPSGPGQPAPA
17	aa54-70	IVHVRGDSETDLEALF
			1	aa84-100	VPMRLRKLPDSFFKPPE
18	aa114-130	TAGALTPQHVRAHSSP
			19	aa144-160	PTGVVSGPAATPTAQH

20

aa174-190

PAGWEMAKTSSGQRYF

利用表6中的多肽序列，从而对具有YAP表达高低差异的肿瘤细胞系进行了细胞增殖抑制和多肽用量的量效关系测定。

其中BEL7404(购自中国科学院细胞库)肝癌细胞系为YAP蛋白高表达细胞线；HCCLM3(购自中国科学院细胞库)为YAP蛋白低表达细胞系。取肝癌细胞线(BEL7404或HCCLM3)以2000个细胞/孔的浓度接种于96孔板中，并在37℃1％牛血清的RPMI1640中孵育过夜。肝癌细胞在37℃接受不同浓度的多肽治疗测试72个小时。

结果显示(图4)，SEQ ID NO.:1所示的多肽无论对YAP蛋白高表达还是低表达的细胞系在一定浓度下均较其他多肽具有更显著的癌细胞增殖抑制作用。其中，在YAP蛋白高表达的BEL7404细胞系中抑制作用更显著。可见在YAP蛋白高表达的细胞系中，本发明多肽具有非常优异的癌细胞抑制作用。

此外，还对1.1中的细胞进行了IC₅₀值的测定，IC₅₀将通过CCK-8试剂盒测定。

结果可见表7，SEQ ID NO.:16、17所示的多肽在YAP蛋白高表达的细胞系中具有很低的IC₅₀值，但在YAP蛋白低表达的细胞系中几乎没有作用。而同样在YAP蛋白高表达的细胞系中具有较低IC₅₀值的SEQ ID NO.:1所示多肽，其对于YAP蛋白低表达的细胞系也具有最低的IC₅₀值，因此综合考虑，SEQ ID NO.:1所示的多肽可作为YAP抑制活性最强的多肽，其能够抑制YAP与TEAD的结合。

表7 1％浓度的多肽的72小时IC₅₀(μM)

实施例2 YAP抑制多肽的改造

虽然SEQ ID NO.:1所示的多肽可在体外与TEAD结合，然而进一步分析发现其难以有效被细胞摄取，且稳定性较低。

在本实施例中，基于SEQ ID NO.:1对其序列进行改造。部分经测定的有利改造包括：增加肽内二硫键、增加细胞穿透元件。

测试结果如表2所示。

表2

*稳定性为测定的血浆稳定性，在所测定时间，时残留的肽的百分比。

结果表明，SEQ ID NO.:1所示序列在添加了二硫键后的多肽，血浆稳定性有显著提高；另外，在尾端添加细胞穿透元件(RRMKWKK或RGRKKRRQRRR)(SEQ ID NO.:34)，能够穿透细胞的多肽比例从小于10％上升至100％(以添加了RRMKWKK的多肽的穿透率为100％)和135％。

实施例3 YAP抑制多肽的改造

基于SEQ ID NO.:1多肽进行改造：

a.在SEQ ID NO.:1肽内增加了二硫键，改造后的序列如SEQ ID NO.:2所示；

b.基于如SEQ ID NO.:2所示的序列，将其X₄分别替换为Orn或Dab，改造后的序列如SEQ ID NO.:5或6所示。

对a和b中经改造的YAP抑制多肽进行TEAD结合的IC₅₀值以及血浆稳定性的测定，测试结果如表3所示：

表3

结果显示，加入了二硫键的多肽血浆稳定性显著提高，且对多肽进行了进一步改造后，稳定性更佳优越。且所有改造的多肽其IC₅₀值均在纳米摩尔数量级内。

实施例4 YAP抑制多肽的改造

对实施例3中的SEQ ID NO.:2进一步进行改造，区别在于X₅和X₇分别被替换成E和H、或C和D，并使X₂和X₆的氨基酸之间形成二硫键，其序列如SEQ ID NOs.:8-9所示，并对其进行TEAD结合的IC₅₀值以及血浆稳定性的测定，结果如表4所示：

表4

结果显示，对本发明多肽进行进一步改造后的多肽血浆稳定性显著提高，且所有改造的多肽其IC₅₀值均在纳米摩尔数量级内。

实施例5 YAP抑制多肽的改造

对本发明SEQ ID NO.:1多肽进行改造，并对其进行TEAD结合的IC₅₀值以及血浆稳定性的测定，结果如表5所示：

表5

SEQ ID NO.:	序列	IC₅₀
			1	VPMRL RKLPD SFFKP PE	49μM
10	PQT VPMRL RKLPD SFFKP PE	37μM
			11	VPM(Hcy)L RK(Nle)PA SFCKP PE	15nM
12	VP(3-Cl)F(Hcy)L RK(Nle)PA SFCKP PE	23nM

结果表明，本发明多肽能够更有效阻止YAP与TEAD的結合。

实施例6丙氨酸扫描筛选活性测试

本实施例将SEQ ID NO.:1所示序列的多肽中各个氨基酸分别经丙氨酸扫描替换筛选。结果表明，不同氨基酸经替换的多肽显示出了SEQ ID NO.:1所示多肽的30％-120％的活性，然而对应于YAP蛋白第86-96位中，分别有7个位置的氨基酸(M86、R89、L91、P92、S94、F95、F96)在替换为Ala后形成的多肽活性相对较低，因此，这些位点可以视为本发明多肽的关键氨基酸位点(位于aa86-96内，分别对应于式Va中的Z3-Z13位置)，提示后续实验中对这些位点进行保留或保守性替换。

实施例7 YAP抑制多肽的改造及活性测试

对SEQ ID NO.:1所示的多肽进行进一步改造，同样测定1％浓度多肽下细胞培养72h条件下的IC₅₀值(μM)，各多肽的序列和测定结果如表8所示。

表8

注：(3-Cl)F表示3－氯苯丙氨酸

结果可见，所有经改造的序列均表现出良好的YAP抑制活性，其中，SEQ ID NOs.:21、23、31、33所示多肽的效果最佳。此外，对实施例7中获得的关键位点进行保守性替换或二硫键取代后还发现，如将对应于式Va中的Z4和Z13位置进行缺失并插入形成二硫键的氨基酸，所获得的多肽仍能保持良好的YAP抑制活性。

实施例8动物实验

40个不同的肝癌病人来源肿瘤异种模型的肿瘤样本进行了YAP表达分析，选择了二个高YAP表达肝癌病人来源肿瘤异种模型在NOD-SCID小鼠接种皮下肿瘤。一旦皮下肿瘤体积大于0.2立方厘米，肿瘤小鼠，将随机分组，接受不治疗或3周每周三次的75mg/kg YAP抑制多肽(SEQ ID NO.:21、23、31和33)肿瘤内注射。每周三次利用游标卡尺测量肿瘤体积。

结果表明，上述各YAP抑制多肽均可显著抑制肿瘤的生长，用药约一周后(实验开始后第30天)抑瘤率(试验组肿瘤大小/对照组肿瘤大小)远大于50％(P<0.05)。SEQ ID NO.:23的抑制曲线如图5所示。

实施例9修饰肽的制备

将SEQ ID NO.:33所示的序列的跨膜片段替换为“GRKKRRQRRR”，并进行了一系列的修饰。

具体地，采用手动固相Fmoc法，以Rink Amide MBHA树脂为起始原料，从C端向N端方向合成了表9所示多肽序列。

表9

其中，用3倍当量Fmoc-Lys(Dde)-OH/HOBt/DIC与树脂进行接枝引入C端第二个氨基酸残基。而后，25％六氢吡啶/DMF(体积比)去除N端Fmoc保护基使N端成为自由氨基。如此反复依次连接各个氨基酸残基以完成整条多肽的合成。N端乙酰化封端(3倍当量Ac₂O，6倍当量二异丙基乙胺)后，用2％水合肼/DMF溶液去除C端Lys的侧链Dde保护基。再将硬脂酰氯(C18酰卤)与本发明多肽的C端Lys的侧链氨基直接反应获得修饰后的硬脂酰化多肽P47、P48和P49，序列如SEQ ID NO.:35-37所示。

实施例10脂质体制剂的制备

通过多种脂质体制备方法将硬脂酰化多肽P47、P48和P49制备成脂质体制剂，方法如下：

10.1代号1.1的P49脂质体制备

方法：薄膜分散法

将多肽与脂质体(HSPC+CHOL)以摩尔比1：20比例混匀于茄形瓶，氮气吹干，加5％的葡萄糖超声水化，过膜，得到脂质混悬液，透析。

10.2代号1.2的P49脂质体制备

方法：表面活性剂透析法

将脂质体(HSPC+CHOL)和氯仿混匀于茄形瓶，氮气吹干，加5％的葡萄糖超声水化，过膜，得到脂质混悬液。将多肽与5％的葡萄糖及辛基葡萄糖苷(OG)混合，以摩尔比1：3的比例注入脂质混悬液，摇匀，透析。

10.3代号2.1的P48脂质体制备

方法：乙醇注入法

将脂质体(HSPC+CHOL)和氯仿混匀于茄形瓶，氮气吹干，加5％的葡萄糖超声水化，得脂质混悬液。将多肽加乙醇制备成溶液，以摩尔比1：10的比例缓慢注入脂质混悬液，过膜，透析。

10.4代号2.2的P48脂质体制备

方法：乙醇注入法

将脂质体(HSPC+CHOL)和氯仿混匀于茄形瓶，氮气吹干，加5％的葡萄糖超声水化，得脂质混悬液。将多肽加乙醇制备成溶液，以摩尔比1：20的比例缓慢注入脂质混悬液。过膜。透析。

10.5代号1.3的P48脂质体制备

方法：表面活性剂透析法

将脂质体(HSPC+CHOL)和氯仿混匀于茄形瓶，氮气吹干，加5％的葡萄糖超声水化，过膜，得到脂质混悬液。将多肽与5％的葡萄糖和OG混合，以摩尔比1：3的比例注入脂质混悬液，摇匀，透析。

10.6代号3.1的P47脂质体制备

方法：表面活性剂透析法

将脂质体(HSPC+CHOL)和氯仿混匀于茄形瓶，氮气吹干，加5％的葡萄糖超声水化，过膜，得到脂质混悬液。将多肽与5％的葡萄糖和OG混合，以摩尔比1：5的比例注入脂质混悬液，摇匀，透析。

10.7代号3.2的P47脂质体制备

方法：表面活性剂透析法

实施例11多肽脂质体制剂的表征

对实施例10中制备的P47、48、49脂质体按常规方法进行了表征：

表10

表10可见，多种脂质体常规方法均可将本发明修饰多肽制成脂质体制剂，其中以表面活性透析法制备的包封率最高，可优选此法用于以下实验中脂质体制剂的制备。

实施例12多肽脂质体制剂的细胞增殖抑制实验

对实施例10中制备的多肽脂质体制剂进行细胞实验，步骤如下：

将BEL7404(ATCC)细胞按2000个细胞/孔的密度与含1％FBS的1640培养基接种于96孔板中，将MHCC97L(ATCC)细胞按4000个细胞/孔的密度与含10％FBS的DMEM培养基接种于96孔板中，37℃孵育过夜。次日，采用实施例10中制备的多肽脂质体制剂(9个浓度，起始浓度为50uM，连续对半稀释9个浓度后计算IC₅₀值)处理细胞后，采用含1％FBS的1640培养基或含10％FBS的DMEM培养基分别处理BEL7404和MHCC97L细胞并在37℃下孵育72小时。采用CCK-8试剂盒对细胞存活率进行测定，结果可见，多肽脂质体制剂抑制肿瘤细胞的 IC50值很低，对肿瘤细胞具有显著的抑制效果，其结果如表11所示：

表11

“/”代表未做。

对比例1未修饰YAP抑制多肽的细胞抑制实验

在本实施例中，采用了未修饰的YAP抑制多肽(未经酰化或加穿膜片段的原始多肽、未经脂质体包封的酰化修饰多肽)，并对其进行了细胞抑制实验比较。

表12

由表11可见，未经酰化修饰的肽中，存在不能脂质体或细胞抑制效率较低的缺陷，而将本发明肽进行C₁₀-C₂₄酰化修饰后，即使不制成脂质体，其细胞抑制效率也已大幅提高，与制备成脂质体的药物IC50值相当，可见，采用本发明方法对多肽进行酰化后，不仅提高了其成药结果，更能够获得良好的细胞增殖抑制效果。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种分离的多肽，其特征在于，所示的多肽具有式A所示的结构：

X₀-Y₁-Y₂-Y₃-Y₄-Y₅-Y₆-X_A-X_E-X_F 式A

式中，

X₀或X_A为无，或1、2、3或4个氨基酸残基；

Y₁为AP、VP、或无；

Y₄为P；

Y₅为X₅，且X₅为任意氨基酸(较佳地X₅为A、D、或E)；

X_E为无或细胞穿透元件；

X_F为无或K；

2.如权利要求1所示的多肽，其特征在于，Y₂和/或Y₃中至少一个氨基酸为Hcy或C；和Y₆或Y₇中至少一个氨基酸为Hcy或C。

3.如权利要求1所示的多肽，其特征在于，所述的X₁、X₂、X_2a、X₃、X_3a、X₅、X₆、X_6a、X₇和X_7a之间任选地形成至少一对二硫键。

4.一种分离的多肽，其特征在于，所述的多肽具有式V所示的结构：

X₀-Z-X_A-X_E-X_F (V)

式中，

X₀或X_A为无，或1、2、3或4个氨基酸残基；X_E为无、或细胞穿透元件；

X_F为无或K；

Z为具有引入的链内二硫键的YAP抑制多肽，

Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11-Z12-Z13-Z14-Z15-Z16

式Va

式中，

Z1为V、A或无；

Z2为P、A或无；

Z3为M、F、L或氯苯丙氨酸((Cl-)F)；

Z4为R、K、A或无；

Z5为L、Nle、A或无；

Z6为R、或K；

Z7为K、R、Orn、Dab、或A；

Z8为L、或Nle；

Z9为P；

Z10为任意天然或非天然氨基酸，优选D、A、V、L、I或E；

Z11为S、或T；

Z12为F、L、或氯苯丙氨酸；

Z13为F、L、氯苯丙氨酸、或无；

Z14为K、R、A或无；

Z15为P、A或无；

Z16为P、A或无；

5.如权利要求1或4所述的多肽，其特征在于，第一氨基酸B1位于Z2和Z3之间、Z3和Z4之间、Z3和Z5之间(此时Z4为无)、Z4和Z5之间、Z7和Z8之间；和/或

6.如权利要求1或4所述的多肽，其特征在于，所述二硫键之间的间隔距离为4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸(不含形成二硫键的氨基酸)；较佳地，间隔距离为5、6、7、8、或9个氨基酸。

7.如权利要求1或4所述的多肽，其特征在于，所述的多肽具有式I所示的结构：

X₀-VP-X_1-X₂-LRX₃-X₄-P-X₅-SF-X₆-X₇-PP-X_A-X_E-X_F式I，

且所述的多肽满足以下特征：

(a)X₀或X_A为无，或1、2、3或4个氨基酸残基；

(b)X₁选自M或F；

(d)X₃或X₄为任意氨基酸；和

(e)X_E为无或细胞穿透元件；

(f)X_F为无或K；

8.如权利要求1或4所述的多肽，其特征在于，所述的多肽的序列如SEQ IDNOs.:1-12，22-37中任一序列所示。

9.一种修饰多肽，其特征在于，所述的修饰多肽是经权利要求1-8任一所述多肽经酰化后形成的修饰多肽。

10.如权利要求9所述的修饰多肽，其特征在于，所述修饰多肽具有如下结构：

P₀-X_G 式B

11.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-8中任一所述多肽或权利要求9所述修饰多肽作为活性成分，以及药学上可接受的盐。

12.权利要求1-8中任一所述多肽或权利要求9所述修饰多肽的用途，其特征在于，所述多肽用于制备治疗肿瘤的药物组合物、抑制肿瘤细胞生长的组合物、和/或用于制备抑制YAP活性的药物组合物。

13.一种YAP抑制多肽的修饰方法，包括步骤：

(i)将权利要求1-8任一所述多肽在合适条件下与酰化剂反应，从而获得酰基化修饰的YAP抑制多肽。