MX2011004019A - Conjugados de etoposido y doxorubicina para entrega de farmacos. - Google Patents

Conjugados de etoposido y doxorubicina para entrega de farmacos.

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Christian Che
Reinhard Gabathuler
Gaoqiang Yang
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Abstract

La inversión se refiere a mejoras en el campo de entrega de fármacos. Mas particularmente, la invención se refiere a pilipéptidos teniendo un enlace covalente hidrolizable a un agente terapéutico que incluye, etopósido, etopósido 4´-dimetil-glicina o doxorubicina. Estos conjugados de polipéptidos pueden usarse como vectores para transportar el derivado de podofiloto-xina a través de la barrera hematoencefalica (BBB) o hacia tipos de células particulares tales como ovarios, hígado, pulmón o riñón. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que incluyen los compuestos de la invención y a usos de las mismas en métodos de tratamiento.

Description

CONJUGADOS DE ETOPÓSIDO Y DOXORUBICINA PARA ENTREGA DE FÁRMACOS Campo de la Invención La invención se refiere a mejoras en el campo de entrega de fármacos. Mas particularmente, la invención se refiere a polipéptidos teniendo un enlace covalente hidrolizable a un agente terapéutico tal como un derivado de podofilotoxina (v.gr., etopósido o un derivado de etopósido tal como etopósido 4'-dimetilglicina) o a doxorubicina o un derivado de doxorubicina . Estos conjugados de polipéptido pueden usarse como vectores para transportar el agente terapéutico a través de la barrera hematoencefálica (BBB) o hacia tipos celulares particulares tales como ovarios, hígado, pulmón, o riñon. Estos conjugados pueden mostrar propiedades fisicoquímicas (v.gr., solubilidad incrementada) y farmacéuticas (v.gr., direccionamiento mejorado que permite para dosis sub-terapéuticas o toxicidad reducida que permite dosis super-terapéuticas ) con relación al agente terapéutico no conjugado. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que incluyen los compuestos de la invención y a usos de las mismas en métodos de tratamiento.
Antecedentes de la Invención Muchos agentes terapéuticos para tales enfermedades tienen efectos secundarios (v.gr., agentes quimioterapéuticos) o, por razones tales como estabilidad in vivo, transporte, u otras propiedades farmacocinéticas, son difíciles de proporcionar a una concentración suficientemente alta en el tejido objetivo o por una duración suficientemente larga para permitir máximo efecto terapéutico en el tejido objetivo. De manera acorde, hay una necesidad por métodos y composiciones que incrementan concentraciones de agentes terapéuticos y de diagnóstico en órganos o tejidos objetivo tal como en el cerebro, ovarios, hígado, o pulmón .
Compendio de la Invención Se han desarrollado conjugados péptido-terapéutico, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, donde etopósido se une de manera covalente al polipéptido Angiopep-2 (SEQ ID NO: 97) en el hidroxilo 2" mediante un enlazador de ácido glutárico hidrolizable (v.gr., Compuesto (1) mostrado en el Esquema 1) . Un conjugado péptido-terapéutico relacionado también se ha preparado en el cual etopósido 41 -dimetilglicina se usa en lugar de etopósido, y propiedades mejoradas (v.gr., solubilidad) se observan.
Esquema 1 Doxorubicina también se ha unido de manera covalente en el 14-hidroxilo al polipéptido Angiopep-2 usando un enlazador de ácido succinico (v.gr., la sal de trihidrocloruro de Compuesto (2) mostrado en el Esquema 2) . Unión covalente de la sal de hidrocloruro de doxorubicina también puede producir propiedades mejoradas (v.gr., solubilidad).
Scheme 2 Estos conjugados pueden mostrar propiedades mejoradas con relación al agente terapéutico no conjugado correspondiente tales como propiedades fisicoquímicas (v.gr., solubilidad incrementada) y farmacéuticas (v.gr., direccionamiento acrecentado que permite para dosis sub-terapéuticas o toxicidad reducida que permite para dosis super-terapéuticas) . La solubilidad de los conjugados de etopósidoDMG y de hidrocloruro de doxorubicina también puede ser útil al ajustar regímenes de dosificación. La invención por lo tanto presenta estos compuestos, así como compuestos relacionados. Métodos para hacer y usar estos compuestos también son provistos.
De manera acorde, en un aspecto, la invención presenta un compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 1-105 y 107-116, o un derivado funcional del mismo, donde la secuencia de aminoácidos incluye un enlace covalente a partir de un aminoácido de la secuencia de aminoácidos a un derivado de podofilotoxina . En algunas formas de realización, el derivado de podofilotoxina es un compuesto teniendo una estructura de acuerdo con la Fórmula (I): o un estereoisomero o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde cada uno de Rlf R2, y R3 se selecciona, de manera independiente, a partir de H, alquilo opcionalmente sustituido, C(0)R8, P (0) (0R9) (OR10) , S(0)2(OR9), o un enlazador hidroliza-ble Y que comprende un enlace covalente a un aminoácido del polipéptido; X es O o NR7; cada uno de R4, R5, y R7 se selecciona, de manera independiente, a partir de H, alquilo C^.g opcionalmente sustituido, C(0)R8, o un enlazador hidrolizable Y que comprende un enlace covalente a un aminoácido del polipéptido; R6 es h, alquilo C^.g opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, R8 se selecciona a partir de alquilo C1-6 opcionalmente sustituido o arilo opcionalmente sustituido; cada uno de R9 y R10 se selecciona, de manera independiente, a partir de H, alquilo C^ opcionalmente sustituido, o arilo opcionalmente sustituido; y n es l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 ; donde uno de R1( R2, R3, R4, R5, y R7 es Y y no mas de uno de Rlf R2, R3, R4, R5v, y R es Y.
En algunas formas de realización, Y es -C(0) (CH2)nC(0)-y n es 2, 3, o 4. En ciertas formas de realización, n es 3.
En algunas formas de realización, la sal farmacéuticamente aceptable del compuesto es la sal de adición de mono-, di-, o tri-ácido (v.gr., sal de mono-, di-, o tri-hidrocloruro) .
En algunas formas de realización, cada compuesto de la Fórmula (I) se selecciona, de manera independiente, a partir de: donde cada R2 es, de manera independiente, H, P(O) (OH)2, o C (O) CH2N (CH3) 2; cada R6 es, de manera independiente, CH3 o 2-tiofeno; cada Y se selecciona a partir de -C(0) (CH2) mC (O) - ; - [ C ( O ) {OCH2CH2} nOC (0! ] -; -S (0) 2 (CH2) nS (0) 2- ; -[S(0)2{OCH2CH2}nOS(0)2]-; -[{P(O) (OR9) } (CH2)n{P(0) (OR9) }]-; y - [{P(O) (OR9) } (OCH2CH2)nO{P(0) (OR9) }]-; cada n es, de manera independiente, 1, 2, 3, 4, 5, o 6; y donde cada Y es enlazada de manera covalente a un aminoácido. En algunas formas de realización, cada Y es -C (0) (CH2)„C (0) - o - [C (0) { OCH2CH2 } n0C (0) ] - y n es 2, 3, o 4. En algunas formas de realización, cada R2 es C (0) CH2N (CH3) 2. En algunas formas de realización, cada compuesto de la Fórmula (I) es: En algunas formas de realización, el compuesto de la invención tiene la siguiente estructura: T F F Y G G S R G R N N F K T E E Y I I I Fórmula (I) Fórmula (I) Fórmula (I) donde cada grupo (-(Fórmula (I) representa un enlace covalente opcional entre el aminoácido indicado y un compuesto de la Fórmula (I), y donde hay por lo menos un enlace covalente entre un aminoácido del polipéptido y dicho compuesto de la Fórmula (I). En algunas formas de realización, dos compuestos de la Fórmula (I) se unen a la secuencia de aminoácidos. En otras formas de realización, la treonina en la posición 1 y las lisinas en las posiciones 10 y 15 del polipéptido cada una incluyen un enlace covalente a un compuesto teniendo una estructura de acuerdo con la Fórmula (I) .
En algunas formas de realización, R2 es H o -C (O) CH2N (CH3) 2 (es decir, N, N-dimetilglicina C-enlazada) . En otras formas de realización, cada R2 es H. En aun otras formas de realización, cada R2 es -C (O) CH2N (CH3) 2.
En algunas formas de realización, el alquilo 0?_6 opcionalmente sustituido se selecciona, de manera independiente, a partir de metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, iso-butilo, sec-butilo, sec-pentilo, iso-pentilo, ter-butilo, n-pentilo, neopentilo, n-hexilo, o sec-hexilo. En algunas formas de realización, el alquilo se sustituye con por lo menos un grupo amino opcionalmente sustituido (v.gr., NH2 o N(CH3)2) en cualquier carbono.
En algunas formas de realización, el cicloalquilo C3.10 opcionalmente sustituido se selecciona, de manera independiente, a partir de ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, y cicloheptilo .
En algunas formas de realización, el grupo arilo opcionalmente sustituido se selecciona, de manera independiente, a partir de fenilo, naftilo, tetrahidrnaftilo, indanilo, o indenilo .
En algunas formas de realización, el grupo heterocicli-lo opcionalmente sustituido se selecciona, de manera independien-te, a partir de azaciclopropanilo, azaciclobutanilo, 1,3-diazatidinilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, tiranilo, tietanilo, tetrahidrotiofenilo, ditiolanilo, tetrahi-drotiopiranilo, oxiranilo, oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, dioxanilo, oxatiolanilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, tioxanilo, y quinuclidinilo .
En algunas formas de realización, el grupo heterocicli-lo opcionalmente sustituido se selecciona a partir de pirrolilo, pirazolilo, imadazolilo, piridinilo, pirimidinilo, pirazinilo, piridazinilo, triazinilo, tetrazinilo, pirrolizinilo, indolilo, quinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, indazolilo, quinolizinilo, cinolinilo, quinazolinilo, ftalazinilo, naftiridi-nilo, quinoxalinilo, tiofenilo, tiepinilo, furanilo, benzofurani-lo, tiazolilo, isotiazolilo, tiadiazolilo, oxazolilo, isoxazoli-lo, y oxadiazolilo .
En algunas formas de realización, un alquilo, cicloal-quilo, arilo, heterociclilo, o heteroarilo sustituido es sustituido con 1, 2, 3, 4, 5, o 6 sustituyentes seleccionados a partir de: alquilo C1-6; halógeno; azido (-N3) , nitro (-N02) , ciano (-CN), aciloxi, acilo (-C(O)R), (-OC(O)R), alcoxi (-OR), amido (-NRC(O)R' o -C(O)NRR'), amino (-NRR' ) , arilo, ácido carboxilico (-C02H) , éster carboxilico (-C02R) , carbamoilo (-OC(O)NRR' o -NRC(O)OR'), cicloalquilo, heterociclilo, hidroxi (-OH), isociano (-NC), fosfato (-P (O) (OR) (OR' ) ) , sulfonato (-S02OR) , o sulfonilo (-S02R) , donde cada R o R' se selecciona, de manera independien- te, a partir de H, alquilo 0^6, cicloalquilo, heterociclilo, arilo, o heteroarilo, como se definen en la presente. En algunas formas de realización, estos sustituyentes no son adicionalmente sustituidos. En oras formas de realización, los sustituyentes pueden por si mismos ser adicionalmente sustituidos con 1, 2, 3, 4, 5, o 6 grupos sustituyentes.
En algunas formas de realización, R4 es Y. En otras formas de realización, R5 es Y.
En otras formas de realización, la secuencia de aminoácidos es enlazada de manera covalente a derivados de podofilotoxina adicionales a través de un segundo, tercer, cuarto, o quinto aminoácido de dicha secuencia de aminoácidos. En algunas formas de realización, el derivado de podofilotoxina es un compuesto de la Fórmula (I).
En ciertas formas de realización, el compuesto de la Fórmula I tiene la estructura: , donde Y es -C ( 0) ( CH2)„C { 0) - o - [C (0) {OCH2CH2}nOC (0) ] - y n es 2, 3, o 4.
En otras formas de realización, el compuesto de la Fórmula (I) tiene la siguiente estructura donde Y es -C ( 0 ) ( CH2 ) nC ( 0 ) - o -[C(0) {OCH2CH2}nOC(0) ] - y n es 2, 3, o 4.
En aun otras formas de realización, el compuesto de la Fórmula (I) tiene la siguiente estructura: donde Y es -C ( 0 ) ( CH2 ) nC ( 0 ) - o - [C(0) {OCH2CH2}nOC(0) ] - y n es 2, 3, o 4.
En otras formas de realización, cada compuesto de la Fórmula (I) se selecciona, de manera independiente, a partir de: donde cada R8A y R8B es, de manera independiente, H o alquilo 0?.6 opcionalmente sustituido, o R8A y R8B se combinan para formar un anillo de 3-7 miembros opcionalmente sustituido. En algunas formas de realización, cada R8A y R8B es alquilo C1-6 opcionalmente sustituido. En otras formas de realización, cada compuesto de la Fórmula (I) tiene la siguiente estructura: En formas de realización adicionales, el compuesto tiene la siguiente estructura: En formas de realización particulares, el compuesto tiene la estructura: (1), o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma (v.gr., la sal de trihidrocloruro) , donde en el compuesto (I), etopósido se refiere a etopósido 4 ' -dimetilglicina .
En ciertas formas de realización, cada aminoácido que se enlaza de manera covalente al enlazador hidrolizable Y se une mediante un grupo funcional amino-, guanidino-, hidroxilo-, fenol-, o tiol de dicho aminoácido. En algunas formas de realización, el aminoácido que se enlaza de manera covalente al enlazador hidrolizable Y es lisina, tirosina, serina, treonina, o arginina.
En un segundo aspecto, la invención presenta un compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 1-105 y 107-116, o un derivado funcional del mismo, en donde dicha secuencia de aminoácidos incluye un enlace covalente a partir de un aminoácido de dicha secuencia de aminoácidos a un derivado de doxorubicina, y en donde dicho derivado de doxorubicina es un compuesto teniendo una estructura de acuerdo con la Fórmula (II): (II), o un estereoisómero o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde cada Xlr X2, X3, X4, y X5 se selecciona, de manera independiente, a partir de un enlace covalente, O, o NR25; cada R17, R18, R^g, R201 ^21 r ^22» ^23 ¾< Y ¾5 se selec-ciona, de manera independiente, a partir de H, alquilo Ci_6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2_6 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-6 opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, o un enlazador hidrolizable Y; y en donde uno y solamente uno de R17, R18, R19, R20, R2i, En algunas formas de realización, la sal farmacéuticamente aceptable del compuesto es la sal de adición de mono-, di-, o tri-ácido (v.gr., la sal de mono-, di-, o tri-hidrocloruro) .
En ciertas formas de realización, el compuesto de la Fórmula (II) tiene la siguiente estructura: , donde X2R18 es H o NH2; X3R19 es H u OH; X4R20 es H o alquilo opcionalmente sustituido; y Y es un enlazador hidrolizable como se describe en la presente. En formas de realización adicionales, el compuesto de la Fórmula (II) tiene la siguiente estructura: (II-A), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En formas de realización adicionales, el compuesto de la Fórmula (II) tiene la siguiente estructura: En ciertas formas de realización, el compuesto tiene la siguiente estructura: T F F Y G G S R G K R N N F K T E E Y I I I Formula (II) Formula (II) Formula (II) en donde cada (-(Fórmula (II)) representa un enlace covalente opcional entre el aminoácido indicado y un compuesto de la Fórmula (II), y donde hay por lo menos un enlace covalente entre un aminoácido del polipéptido y dicho compuesto de la Fórmula (II) . En algunas formas de realización, la treonina en la posición 1 y las lisinas en las posiciones 10 y 15 del polipéptido cada una comprenden un enlace covalente a un compuesto teniendo una estructura de acuerdo con la Fórmula (II) .
En algunas formas de realización, Y es -C(0) (CH2)nC(0)-, y n es 2, 3, o 4. En ciertas formas de realización, n es 2. En otras formas de realización, la secuencia de aminoácidos es enlazada de manera covalente a un compuesto teniendo una estructura de acuerdo con la Fórmula (II) a través de un segundo, tercer, cuarto, o quinto aminoácido de la secuencia de aminoácidos. En otra forma de realización, cada aminoácido enlazado de manera covalente a dicho enlazador hidrolizable Y se une mediante un grupo funcional amino-, guanidino-, hidroxilo-, fenol-, o tiol de dicho aminoácido. En ciertas formas de realización, el aminoácido es lisina o treonina.
En algunas formas de realización, el compuesto de la Fórmula (II) tiene la siguiente estructura: o una sal farmacéuticamente acep-table del mismo.
En formas de realización particulares, el compuesto tiene la estructura: (2), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo (v.gr. , la sal de trihidrocloruro) .
En otro aspecto, la invención presenta al siguiente compuesto, ("etopósido ' -dimetilglicina" o "eto-pósidoDMG"), o cualquier estereoisómero, o cualquier sal farmacéuticamente aceptable o solvente del mismo.
En cualquiera de los aspectos anteriores, la secuencia de aminoácidos puede ser sustancialmente idéntica a cualquiera de las secuencias señaladas en la Tabla 1, o un fragmento de las mismas o una sal farmacéuticamente aceptable de las mismas. En ciertas formas de realización, la secuencia de aminoácidos tiene una secuencia de Angiopep-1 (SEQ ID NO: 67), Angiopep-2 (SEQ ID NO: 97), Angiopep-3 (SEQ ID NO: 107), Angiopep-4a (SEQ ID NO: 108), Angiopep-4b (SEQ ID NO: 109), Angiopep-5 (SEQ ID NO: 110), Angiopep-6 (SEQ ID NO: 111), o Angiopep-7 (SEQ ID NO:112)). La secuencia de aminoácidos o los compuestos de la invención pueden transportarse de manera eficiente hacia un tipo de células particular (v.gr., cualquiera uno, dos, tres, cuatro, o cinco de hígado, ovario, pulmón, riñon, bazo, y músculo) o puede cruzar la BBB mamífera de manera eficiente (v.gr., Angiopep-1, -2, -3, -4a, -4b, -5, y -6) . En algunas formas de realización, las células son células de ovario. En otra forma de realización, el conjugado es capaz de ingresar a un tipo celular particular (v.gr., cualquiera uno, dos, tres, cuatro, o cinco de hígado, ovario, pulmón, riñon, bazo, y músculo) pero no cruza la BBB de manera eficiente (v.gr., un conjugado incluyendo Angiopep-7). En algunas formas de realización, las células son células de ovario. El polipéptido puede ser de cualquier longitud, por ejemplo, por lo menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 25, 35, 50, 75, 100, 200, o 500 aminoácidos. En ciertas formas de realización, el polipéptido es de 10 a 50 aminoácidos de longitud. El conjugado puede ser sustancialmente puro. El polipéptido puede producirse por una tecnología genética recombinante o síntesis química. El conjugado puede formularse con un portador farmacéuticamente aceptable.
Tabla 1 : Polipéptidos Ejemplares SEQ ID NO: 1 T F V Y G G C R A K R N N F K s A E D 2 T F Q Y G G C M G N G N N F V T E K E 3 P F F Y G G C G G N R N N F D T E E Y 4 S F Y Y G G C L G N K N N Y L R E E E 5 T F F Y G G C R A K R N N F K R A K Y 6 T F F Y G G C R G K R N N F K R A K Y 7 T F F Y G G C R A K K N N Y K R A K Y 8 T F F Y G G C R G K K N N F K R A K Y 9 T F Q Y G G C R A K R N N F K R A K Y 10 T F Q Y G G C R G K K N N F K R A K Y 11 T F F Y G G c L G K R N N F K R A K Y 12 T F F Y G G s L G K R N N F K R A K Y 13 P F F Y G G c G G K K N N F K R A K Y 14 T F F Y G G c R G K G N N Y K R A K Y 15 P F F Y G G c R G K R N N F L R A K Y 16 T F F Y G G c R G K R N N F K R E K Y 17 P F F Y G G c R A K K N N F K R A K E 18 T F F Y G G c R G K R N N F K R A K D 19 T F F Y G G c R A K R N N F D R A K Y 20 T F F Y G G c R G K K N N F K R A E Y 21 P F F Y G G c G A N R N N F K R A K Y 22 T F F Y G G c G G K K N N F K T A K Y 23 T F F Y G G c R G N R N N F L R A K Y 24 T F F Y G G c R G N R N N F K T A K Y 25 T F F Y G G s R G N R N N F K T A K Y 26 T F F Y G G c L G N G N N F K R A K Y 27 T F F Y G G c L G N R N N F L R A K Y 28 T F F Y G G c L G N R N N F K T A K Y 29 T F F Y G G c R G N G N N F K S A K Y 30 T F F Y G G c R G K K N N F D R E K Y 31 T F F Y G G c R G K R N N F L R E K E 32 T F F Y G G c R G K G N N F D R A K Y 33 T F F Y G G s R G K G N N F D R A K Y 34 T F F Y G G c R G N G N N F V T A K Y 35 P F F Y G G c G G K G N N Y V T A K Y 36 T F F Y G G c L G K G N N F L T A K Y 37 s F F Y G G c L G N K N N F L T A K Y 38 T F F Y G G c G G N K N N F V R E K Y 39 T F F Y G G c M G N K N N F V R E K Y 4 0 T F F Y G G S M G N K N N F V R E K Y 4 1 ? F F Y G G C L G N R N N Y V R E K Y 42 ? F F Y G G C L G N R N N F V R E K Y 4 3 ? F F Y G G C L G N K N N Y V R E K Y 4 4 t F F Y G G C G G N G N N F L T A K Y 4 5 t F F Y G G c R G N R N N F L T A E Y 4 6 t F F Y G G c R G N G N N F K S A E Y 47 ? F F Y G G c L G N K N N F K T A E Y 4 8 t F F Y G G c R G N R N N F K T E E Y 4 9 t F F Y G G c R G K R N N F K T E E D 50 ? F F Y G G c G G N G N N F V R E K Y 51 S F F Y G G c M G N G N N F V R E K Y 52 ? F F Y G G c G G N G N N F L R E K Y 53 t F F Y G G c L G N G N N F V R E K Y 54 S F F Y G G c L G N G N N Y L R E K Y 55 t F F Y G G s L G N G N N F V R E K Y 56 t F F Y G G c R G N G N N F V T A E Y 57 t F F Y G G c L G K G N N F V S A E Y 58 t F F Y G G c L G N R N N F D R A E Y 59 t F F Y G G c L G N R N N F L R E E Y 60 t F F Y G G c L G N K N N Y L R E E Y 61 ? F F Y G G c G G N R N N Y L R E E Y 62 ? F F Y G G s G G N R N N Y L R E E Y 63 ? R ? D F C L E P P Y T G P C V A R I 64 A R I I R Y F Y N A K A G L C Q T F V 65 Y G G c R A K R N N Y K S A E D C M R 66 ? D F c L E P P Y T G P C V A R I I R 67 t F F Y G G c R G K R N N F K T E E Y 68 ? F F Y G G c R G K R N N F K T E E Y 69 t F Y Y G G c R G K R N N Y K T E E Y 70 t F F Y G G s R G K R N N F K T E E Y 7 1 C ? F F Y G c C R G K R N N F K T E E 72 t F F Y G G c R G K R N N F K T E E Y 7 3 C ? F F Y G s C R G K R N N F K T E E 7 4 t F F Y G G s R G K R N N F K T E E Y 7 5 ? F F Y G G c R G K R N N F K T E E Y 7 6 t F F Y G G c R G K R N N F K T K E Y 7 7 t F F Y G G K R G K R N N F K T E E Y 7 8 t F F Y G G c R G K R N N F K T K R Y 7 9 t F F Y G G K R G K R N N F K T A E Y 80 t F F Y G G K R G K R N N F K T A G Y 8 1 t F F Y G G K R G K R N N F K R E K Y 82 t F F Y G G K R G K R N N F K R A K Y 8 3 t F F Y G G c L G N R N N F K T E E Y 8 4 t F F Y G C G R G K R N N F K T E E Y 85 t F F Y G G R C G K R N N F K T E E Y 8 6 t F F Y G G c L G N G N N F D T E E E 87 t F Q Y G G c R G K R N N F K T E E Y 88 Y ? ? E F G T F N T K G C E R G Y R F 8 9 R F ? Y G G c L G N N N F E T L E E 90 R F K Y G G C L G N K N N F L R L K Y 91 R F K Y G G C L G N K N N Y L R L K Y 92 K T K R K R K K Q R V K I A Y E E I F K N Y 93 K T K R K R K K Q R V K I A Y 94 R G G R L S Y s R R F s T S T G R 95 R R L S Y S R R R F 96 R Q I K I W F Q N R R M K W K K 97 T F F Y G G S R G K R N N F K T E E Y 98 M R P D F C L E P P Y T G P c V A R I I R Y F Y N A K A G L C Q T F V Y G G C R A K R N N F K S A E D C M R T C G G A 99 T F F Y G G C R G K R N N F K T K E Y 100 R F K Y G G C L G N K N N Y L R L K Y 101 T F F Y G G C R A K R N N F K R A K Y 102 N A K A G L C Q T F V Y G G c L A K R N N F E S A E D C M R T C G G A 103 Y G G C R A K R N N F K S A E D C M R T C G G A 104 G L C Q T F V Y G G C R A K R N N F K S A E 105 L C Q T F V Y G G C E A K R N N F K S A 107 T F F Y G G s R G K R N N F K T E E Y 108 R F F Y G G s R G K R N N F K T E E Y 109 R F F Y G G s R G K R N N F K T E E Y 110 R F F Y G G s R G K R N N F R T E E Y 111 T F F Y G G s R G K R N N F R T E E Y 112 T F F Y G G s R G R R N N F R T E E Y 113 C T F F Y G G S R G K R N N F K T E E Y 114 T F F Y G G S R G K R N N F K T E E Y C 115 C T F F Y G G S R G R R N N F R T E E Y 116 T F F Y G G S R G R R N N F R T E E Y C Los polipéptidos 5, 67, 76 y 91, incluyen las secuencias de las SEQ ID NOs: 5, 67, 76, y 91, respectivamente, y son amidados en la terminal C.
Los polipéptidos 107, 109, y 110 incluyen las secuencias de las SEQ ID NOs: 107, 109, y 110, respectivamente, y son acetilados en la terminal N.
En cualquiera de los aspectos anteriores, el polipépti-do puede incluir una secuencia de aminoácidos teniendo la fórmula : XI-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-XI0-XI1-XI2-XI3-XI -XI5-XI6-XI7- XI8-XI9 donde cada uno de X1-X19 (v.gr., X1-X6, X8, X9, X11-X14, y X16-X19) es, de manera independiente, cualquier aminoácido (v.gr., un aminoácido tal como aparece en la naturaleza tal como Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, y Val) o ausente y por lo menos uno (v.gr., 2 o 3) de XI, X10, y X15 es arginina. En algunas formas de realización, X7 es Ser o Cys; o X10 y X15 cada uno de manera independiente es Arg o Lys. En algunas formas de realización, los residuos de XI a X19, inclusive, son sustancialmente idénticos a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOs:l-105 y 107-116 (v.gr., Angiopep-1, Angiopep-2, Angiopep-3, Angiopep-4a, Angiopep-4b, Angiopep-5, Angiopep-6, y Angiopep-7) . En algunas formas de realización, por lo menos uno (v.gr., 2, 3, 4, o 5) de los aminoácidos X1-X19 es Arg. En algunas formas de realización, el polipéptido tiene uno o mas residuos de cisteina adicionales en la terminal N del polipéptido, la terminal C del polipéptido, o ambas.
En ciertas formas de realización de cualquiera de los aspectos anteriores, el polipéptido es modificado (v.gr., como se describe en la presente) . El polipéptido puede ser amidado, acetilado, o ambos. Tales modificaciones a polipéptidos pueden estar en las terminales amino o carboxi del polipéptido. Los conjugados de la invención también pueden incluir peptidomiméti-cos (v.gr., aquellos descritos en la presente) de cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente. El polipéptido puede estar en una forma multimérica, por ejemplo, forma dimérica (v.gr., formado por enlaces de disulfuro a través de residuos de cisteina) .
En ciertas formas de realización, el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos descrita en la presente con por lo menos una sustitución de aminoácidos (v.gr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 sustituciones) . El polipéptido puede contener, por ejemplo, 1 a 12, 1 a 10, 1 a 5, o 1 a 3 sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, 1 a 10 (v.gr., a 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2) sustituciones de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser conservadoras o no conservadoras. Por ejemplo, el polipéptido puede dar una arginina en una, dos, o tres de las posiciones correspondientes a las posiciones 1, 10 y 15 de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO:l, Angiopep-1, Angiopep-2, Angiopep-3, Angiopep-4a, Angiopep-4b, Angiopep-5, Angiopep-6, y Angiopep-7.
En cualquiera de los aspectos anteriores, el conjugado puede excluir específicamente un polipéptido incluyendo o consistiendo de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-105 y 107-116 (v.gr., Angiopep-1, Angiopep-2, Angiopep-3, Angiopep-4a, Angiopep-4b, Angiopep-5, Angiopep-6, y Angiopep-7). En algunas formas de realización, los polipéptidos y conjugados de la invención excluyen los polipéptidos de las SEQ ID NOs: 102, 103, 104, y 105.
En algunas formas de realización, la secuencia de aminoácidos tiene por lo menos 35%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 1-105 y 107-116, o un derivado funcional de las mismas. En ciertas formas de realización, la secuencia de aminoácidos tiene por lo menos 35%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en Angiopep-2 (SEQ ID NO: 97), Angiopep-4b, Angiopep-5, Angiopep-6, y Angiopep-7 (SEQ ID NOs : 109-112) . En aun otras formas de realización, la secuencia de aminoácidos tiene por lo menos 35%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% de identidad con una secuencia de aminoácidos de Angiopep-2 (SEQ ID NO: 97) .
En algunas formas de realización, la secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 1-105 y 107-116, o un derivado funcional de las mismas. En ciertas formas de realización, la secuencia de aminoácidos es aquella de Angiopep-2 (SEQ ID NO: 97), Angiopep-4b, Angiopep-5, Angiopep-6, y Angiopep-7 (SEQ ID NOs: 109-112) .
En algunas formas de realización, los compuestos de la invención pueden alterar la acumulación de un agente biológicamente activo (v.gr., derivados de podofilotoxina tales como los compuestos de la Fórmula (I) o derivados de doxorubicina tales como los compuestos de la Fórmula (II)) en un tipo de célula objetivo o tejido relativo al agente biológicamente activo no conjugado correspondiente. En aun otras formas de realización, el compuesto de la invención promueve acumulación del agente biológicamente activo en un tipo de célula objetivo o tejido. En ciertas formas de realización, la concentración del agente biológicamente activo se incrementa por 0%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650%, 700%, 750%, 800%, 850%, 900%, 950%, 1,000%, 2,000%, 3,000%, 4,000%, 5,000%, 6,000%, 7,000%, 8,000%, 9,000%, 10,000%, 12500%, 15,000%, 17,500%, o 20,000% con relación a aquella observada con el agente biológicamente activo no conjugado. En algunas formas de realización, el tipo de célula objetivo o tejido es el cerebro, ovario, hígado, pulmón, riñon, bazo, o músculo. En algunas formas de realización, el tipo de célula objetivo es el cerebro o el ovario. En ciertas formas de realización, el agente biológicamente activo se selecciona a partir de etopósido, fosfato de etopósido, etopósidoDMG, tenipósi-do, doxorubicina, o epirubicina. En otras formas de realización, el compuesto de la invención incluye la secuencia de aminoácidos de Angiopep-2 (SEQ ID NO: 7), Angiopep-4b, Angiopep-5, Angiopep-6, o Angiopep-7 (SEQ ID NOs : 109-112), o un derivado funcional de los mismos.
En un tercer aspecto, la invención presenta una composición farmacéutica que incluye cualquier compuesto de la invención como se describe en la presente (v.gr., un compuesto que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 1-105 y 107-116, o un derivado funcional o sal farmacéuticamente aceptable de la misma, donde la secuencia de aminoácidos incluye un enlace covalente a partir de un aminoácido de la secuencia de aminoácidos a un compuesto de las Fórmulas (I) o (II) (v.gr., compuesto (1) o (2)) y un portador farmacéuticamente aceptable. En un cuarto aspecto, la invención presenta un método para tratar o tratar profilácticamente un cáncer, donde el método incluye administrar a un paciente un cantidad terapéuticamente efectiva de cualquier compuesto de la invención como se describe en la presente (v.gr., un compuesto que incluye una secuencia de aminoácidos sustancial-mente idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs : 1-105 y 107-116, o un derivado funcional de la misma, donde la secuencia de aminoácidos incluye un enlace covalente a partir de un aminoácido de la secuencia de aminoácidos a un compuesto de las Fórmulas (I) o (II) ) . En algunas formas de realización, el compuesto es compuesto (1) o (2) . En algunas formas de realización, el derivado de podofilotoxina se selecciona a partir de donde Y es ?; cada R2 es, de manera independiente, H o P(0) (OH) 2 o -C(0)R8; cada R6 es, de manera independiente, CH3 o 2-tiofeno; cada Y es -C(0) (CH2) nC (0) -; cada R8 es, de manera independiente, alquilo C1.6 opcionalmente sustituido; y cada n es, de manera independiente, 2, 3, o 4. En algunas formas de realización, n es 3. En algunas formas de realización, cada R2 es -C(0)R8. En algunas formas de realización, R8 es alquilo 0.6 que incluye por lo menos un grupo amino opcionalmente sustituido (v.gr., NH2 o N(CH3)2). En ciertas formas de realización -C(0)R8 es un aminoácido C-enlazado. En algunas formas de realización, el derivado de podofilotoxina es etopósido, fosfato de etopósido, etopósido 4 ' -dimetilglicina (etopósidoDMG) , o tenipósido. En aun otras formas de realización, el compuesto es doxorubicina o cualquiera de los derivados de doxorubicina (v.gr., un compuesto de la Fórmula (II)) descrito en la presente.
En algunas formas de realización, el método también incluye la administración de un segundo agente. En aun otras formas de realización, el agente es un agente terapéutico. En ciertas formas de realización, el segundo agente terapéutico también es enlazado de manera covalente al compuesto de la invención. En aun otras formas de realización, el segundo agente terapéutico no es enlazado de manera covalente a los compuestos de la invención. En algunas formas de realización, el agente terapéutico es un fármaco, una medicina, un agente emisor de radiación, una toxina celular, un fragmento biológicamente activo del mismo, o una mezcla de los mismos para tratar una enfermedad. En otras formas de realización, la administración es concurrente con otro régimen terapéutico. En algunas formas de realización, el régimen terapéutico es terapia de radiación, quimioterapia, trasplante de células madre, trasplante de médula de huesos, cirugía, o tratamiento de hipertermia. En algunas formas de realización, el segundo agente terapéutico es un polipéptido que incluye o que consiste de la secuencia de Angiopep-2 (SEQ ID NO: 97), de preferencia donde el Angiopep-2 es conjugado a un agente anti-cáncer (v.gr., paclitaxel) , v.gr., ANG1005, el cual tiene la siguiente estructura A G1005: TxlAn2 (conjugado 3:1) Aun otros segundos agentes terapéuticos ejemplares se describen en la patente US 7,557,182, incorporada en la presente por referencia .
En algunas formas de realización, el cáncer es cáncer del cerebro. En otras formas de realización, el cáncer del cerebro es glioblastoma, un glioma, un neuroma acústico, un adenoma, un astrocitoma, un papiloma del plexus coroideo, linfoma del SNC, ependimoma, un gangliocitoma, un ganglioglioma, un meduloblastoma (mdl) , un meningioma anaplástico (maligno) , o neurofibromatosis . En aun otras formas de realización, el cáncer es leucemia linfocitica aguda, leucemia mieloblástica aguda, cáncer aderenocortical, cáncer de vejiga intravenoso e intravesi-cal, sarcoma de huesos, cáncer de pecho, síndrome carcinoide (intestino delgado), cáncer endometrial, sarcoma de Ewing, sarcoma gineocológico, cáncer de la cabeza y el cuello (células escuamosas) , cáncer hepático, enfermedad de Hodgkin, cáncer de células de isleta, leucemia, cáncer de pulmón, linfoma maligno, mieloma múltiple, neuroblastoma, linfoma no de Hodgkin, cáncer pancreático, cáncer de próstata, sarcoma osteogénico, cáncer de ovarios, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer estomacal, cáncer testicular, cáncer de la tiroides, carcinoma de vejiga de células transitorias, sarcoma de tejido suave, o tumor de Wilms.
En cualquiera de los métodos terapéuticos descritos en la presente, el compuesto de la invención (v.gr., Compuesto (1) o (2)), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, puede administrarse a un paciente como una dosis sub-terapéutica o una dosis super-terapéutica relativo al agente terapéutico no conjugado (v.gr., etopósido, fosfato de etopósido, etopósido 4-dimetilglicina, o doxorubicina) .
En otro aspecto, la invención presenta un método para hacer cualquiera de los compuestos de la invención descrita en la presente, donde el método incluye el paso de enlazar de manera covalente un derivado de podofilotoxina a cualquier secuencia de aminoácidos descrita en la presente, o derivado funcional del mismo, usando un grupo enlazador hidrolizable difuncional. En algunas formas de realización, la secuencia de aminoácidos se selecciona a partir de las SEQ ID NOs : 1-105 y 107-116, o un derivado funcional de la misma. En otras formas de realización, la secuencia de aminoácidos incluye la secuencia de aminoácidos de Angiopep-2 (SEQ ID NO: 97), Angiopep-4b, Angiopep-5, Angiopep-6, o Angiopep-7 (SEQ ID NOs: 109-112).
En algunas formas de realización, el método para hacer cualquiera de los compuestos de la invención incluye los pasos de (a) combinar dicho compuesto de la Fórmula (I) con dicho grupo enlazador hidrolizable difuncional para formar un aducto covalente; y (b) combinar al aducto de (a) con dicha secuencia de aminoácidos; y donde el aducto de (a) puede ser opcionalmente purificado previo a uso en (b) .
En algunas formas de realización, 1.0-10.0 equivalentes del grupo enlazador hidrolizable difuncional se usa con relación al compuesto de la Fórmula (I). Por ejemplo, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0. 2.1, 2.2., 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, o 3.0 equivalentes pueden usarse. En otras formas de realización, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0. 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, o 10.0 equivalentes del grupo enlazador hidroliza-ble difuncional se usan. En ciertas formas de realización, el método incluye el uso de un agente de acoplamiento de péptido. En algunas formas de realización, el agente de acoplamiento de péptido es tetrafluoroborato de N, N, ' , N' -tetrametil-O-(benzotriazol-l-il) uronio (TBTU) .
En algunas formas de realización, el grupo enlazador difuncional hidrolizable se selecciona a partir de ácidos dicarboxilicos, dicarbonatos , anhídridos carboxílicos, diisocia-natos, o ácidos difosfóricos . En ciertas formas de realización, el grupo enlazador difuncional hidrolizable se selecciona a partir de ácido succinico, ácido glutárico, anhídrido glutárico, o ácido butárico.
En algunas formas de realización, el derivado de podofilotoxina se selecciona a partir de: donde Y es H; cada R2 es, de manera independiente, H o P(0) (OH) 2 o -C(0)R8; cada R6 es, de manera independiente, CH3 o 2-tiofeno; cada Y es -C(O) (CH2) nC (O) -; cada R8 es, de manera independiente, alquilo C1-6 opcionalmente sustituido; y cada n es, de manera independiente, 2, 3, o 4. En algunas formas de realización, n es 3. En algunas formas de realización, cada R2 es -C(0)R8. En algunas formas de realización, R8 es un alquilo que incluye por lo menos un grupo amino opcionalmente sustituido (v.gr., NH2 o N(CH3)2). En ciertas formas de realización -C(0)R8 es un aminoácido C-enlazado. En algunas formas de realización, el derivado de podofilotoxina es etopósido, fosfato de etopósido, etopósidoDMG, o tenipósido.
En cualquiera de los métodos o composiciones descritos en la presente, la sal farmacéuticamente aceptable del compuesto puede ser la sal de adición de mono-, di-, tri-, o tetra-ácido (v.gr., la sal de trihidrocloruro) . En cualquiera de las formas de realización descritas en la presente, cualquiera de los compuestos de las Fórmulas (I) o (II) (v.gr., etopósido, etopósidoDMG, o doxorubicina) que se enlaza de manera covalente al polipéptido es el sitio de protonación. Por ejemplo, en el compuesto (1), 1, 2, o 3 de las fracciones de etopósidoDMG son protonadas, o en el compuesto (2), 1, 2, o 3 de las fracciones de doxorubicina, se protonan para formar la sal de adición de ácido (v.gr., la sal de mono-, di-, o tri-hidroclururo) .
El término "alquilo C1.6" o "alquilo" como se usa en la presente se refiere a un grupo hidrocarburo saturado opcionalmente sustituido. Un grupo alquilo puede ser lineal o ramificado. Ejemplos de radicales alquilo incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, iso-butilo, sec-butilo, sec-pentilo, iso-pentilo, ter-butilo, n-pentilo, neopentilo, n-hexilo, sec-hexilo, n-heptilo, n-octilo, n-decilo, n-undecilo, dodecilo, y similares, los cuales pueden portar uno o mas sustituyentes . Por ejemplo, grupos alquilo sustituidos pueden tener 1, 2, 3, 4, 5, o 6 sustituyentes.
El término "arilo" como se usa en la presente se refiere a una fracción completamente de carbonos aromática, mono-o poli-ciclica, teniendo 5-14 átomos de carbono. En ciertas formas de realización de la presente invención, "arilo" se refiere a un grupo monociclico o biciclico sustituido o no sustituido. Grupos arilo ejemplares incluyen, pero no se limitan a, fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo, indenilo, y similares, los cuales pueden portar uno o mas sustituyentes. Arilos también incluyen heteroarilos.
El término "aminoácido C-enlazado" como se usa en la presente se refiere a un aminoácido que se une de manera covalente a otro compuesto (v.gr., cualquiera de los derivados de podofilotoxina descritos en la presente) por la terminal C del aminoácido .
El término "cicloalquilo C3_10" o "cicloalquilo" como se usa en la presente se refiere a un sistema de anillos de hidrocarburo monociclicos o biciclicos de 3 a 10 miembros saturado opcionalmente sustituido. Cicloalquilos ejemplares incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, y cicloheptilo. Un cicloalquilo sustituido puede tener, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 7 sustituyentes .
El término "heteroarilo" como se usa en la presente se refiere a una fracción aromática mono- o poli-ciclica sustituida o no sustituida teniendo 5-14 átomos de anillo de los cuales uno, dos, tres, o cuatro átomos de anillo pueden seleccionarse a partir de S, 0, y N y los átomos de anillo restantes son carbono. Grupos heteroarilo ejemplares incluyen, pero no se limitan a, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, piridinilo, pirimidinilo, pirazinilo, piridazinilo, triazinilo, tetrazinilo, pirrolizinilo, indolilo, quinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, indazoli-lo, quinolizinilo, cinolinilo, quinazolinilo, ftalazinilo, naftiridinilo, quinoxalinilo, tiofenilo, tiepinilo, furanilo, benzofuranilo, tiazolilo, isotiazolilo, tiadiazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, oxadiazolilo, y similares, los cuales pueden portar uno o mas sustituyentes.
El término "heterocíclico" o "heterociclilo", como se usa en la presente, se refiere a un sistema de anillos de 3-10 miembros, parcialmente insaturado o completamente saturado, no aromático opcionalmente sustituido, el cual incluye anillos sencillos de 3 a 8 átomos en tamaño, y sistemas de anillos bi- y tri-ciclicos que pueden incluir grupos arilo o heteroarilo de cinco o seis miembros aromáticos fusionados a un anillo no aromático. Estos anillos heterocíclicos incluyen aquellos teniendo uno a tres heteroátomos seleccionados de manera independiente a partir de oxigeno, azufre, y nitrógeno, en los cuales los heteroátomos de nitrógeno y azufre pueden opcionalmen-te oxidarse y el heteroátomo de nitrógeno puede opcionalmente ser cuaternizado o sustituido. En ciertas formas de realización, el término heterociclico se refiere a un anillo monociclico de 5, 6, o 7 miembros no aromático donde por lo menos un átomo de anillo es un heteroátomo seleccionado a partir de 0, S, y N (donde los heteroátomos de nitrógeno y azufre pueden ser opcionalmente oxidados) , y los átomos de anillo restantes son carbono, el radical siendo unido al resto de la molécula mediante cualquiera de los átomos de anillo. Heterociclicos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, azaciclopropanilo, azaciclobutanilo, 1,3-diazatidinilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, tiranilo, tietanilo, tetrahidrotiofenilo, ditiolanilo, tetrahi-drotiopiranilo, oxiranilo, oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, dioxanilo, oxatiolanilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, tioxanilo, quinuclidinilo, y similares, los cuales pueden portar uno o mas sustituyentes .
El término "sal farmacéuticamente aceptable" como se usa en la presente, representa aquellas sales de adición de ácido que son, dentro del alcance del juicio médico sano, adecuadas para uso en contacto con los tejidos de humanos y animales sin toxicidad indebida, irritación, respuesta alérgica y similares y son conmensurados con una relación beneficio/riesgo razonable. Sales farmacéuticamente aceptables son bien conocidas en la materia. Por ejemplo, sales farmacéuticamente aceptables se describen en: Berge et al., J. Phar aceutical Sciences 66:1-19, 1977 y en Pharmaceutical Salts: Properties , Selection , and Use, (Eds. P. H. Stahl y C. G. Wermuth) , iley-VCH, 2008. Las sales pueden prepararse in situ durante el aislamiento final y purificación de los compuestos descritos en la presente o por separado mediante hacer reaccionar un compuesto teniendo uno o grupos básicos (v.gr., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10) con los equivalentes deseados de un ácido orgánico o inorgánico adecuado. Sales de adición de ácido representativas incluyen sales de acetato, adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfona-to, benzoato, bisulfato, borato, butirato, canforato, canforsul-fonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsul-fato, etanosulfonato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, hemisulfato, heptonato, hexanoato, hidrobromuro, hidrocloruro, hidroyoduro, 2-hidroxi-etanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, lauril sulfato, malato, maleato, malonato, metanosulfo-nato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, toluenosulfonato, trifluoroaceta-to, trifluorometilsulfonato, undecanoato, y valerato, y similares. Sales de metales álcali o de tierra alcalina representativas incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio y similares, asi como cationes de amonio no tóxico, amonio cuaternario, y amina, incluyendo pero no limitados a amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, etilamina y similares. Deseablemente, la "sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable" es la sal de adición de mono-, bis-, tri-, o tetra-ácido de cualquiera de los compuestos descritos en la presente (v.gr., una sal de mono-, bis-, tris-, o tetra-hidrocloruro de cualquiera de los compuestos descritos en la presente) .
El término "fosfato" como se usa en la presente se refiere a un grupo de fósforo pentavalente teniendo la fórmula -OP (=0) (0R' ) (0R") , donde cada R' y R" se selecciona de manera independiente, a partir de hidrógeno, alquilo € .6, alquenilo C2_6, alquinilo C2_6, cicloalquilo C3.10, heterociclilo, arilo, o heteroarilo .
Donde un grupo es descrito como "opcionalmente sustituido", los sustituyentes opcionales pueden seleccionarse, de manera independiente, a partir de grupos que incluyen, pero no se limitan a: alquilo C1-6; halógeno; azido (-N3) , nitro (-N02) , ciano (-CN) , aciloxi, acilo (-C(O)R), (-OC(O)R), alcoxi (-0R) , amido (-NRC(O)R' o -C(O)NRR'), amino (-NRR'), arilo, ácido carboxilico (-C02H) , éster carboxilico (-C02R) , carbamoilo (-OC(O)NRR' o -NRC(O)OR'), cicloalquilo, heterociclilo, hidroxi (-0H), isociano (-NC) , fosfato ( -P (0) (OR) (OR' ) ) , sulfonato (-S020R) , o sulfonilo (-S02R) , donde cada R o R' se selecciona, de manera independiente, a partir de H, alquilo C^.g, cicloalqui-lo, heterociclilo, arilo, o heteroarilo. Un grupo sustituido puede tener, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9 sustituyen-tes. En algunas formas de realización, un grupo sustituyente puede por si mismo sustituirse adicionalmente mediante reemplazar un hidrógeno con un grupo sustituyente tal como aquellos descritos en la presente.
Por "vector" se entiende un compuesto o molécula tal como un polipéptido que es capaz de transportarse hacia un tipo de células particular (v.gr., hígado, ovario, pulmones, riñon, bazo, o músculo) o a través de la BBB . El vector puede unirse a (de manera covalente o no) o conjugarse con un agente y por ende puede ser capaz de transportar al agente hacia un tipo de célula particular o a través de la BBB . En ciertas formas de realización, el vector puede ligarse a receptores presentes en células de cáncer o células endoteliales del cerebro y por ende transportarse hacia la célula de cáncer o a través de la BBB por transcitosis . El vector puede ser una molécula para la cual altos niveles de transporte transendotelial pueden obtenerse, sin afectar la integridad de la célula o BBB . El vector puede ser un polipéptido o un peptidomimético y puede ser tal como aparece en la naturaleza o producido por síntesis química o tecnología genética recombinante .
Por "conjugado" se entiende un vector enlazado a un agente. La conjugación puede ser química en naturaleza, tal como mediante un enlazador, o genética en naturaleza, por ejemplo, por tecnología genética recombinante, tal como en una proteina de fusión con por ejemplo una molécula reportera (v.gr., proteina fluorescente verde, ß-galactosidasa, Histag, etc. ) .
Por un vector el cual es "transportado de manera eficiente a través de la BBB" se entiende un vector que es capaz de cruzar la BBB por lo menos tan eficientemente como Angiopep-6 (es decir, mas de 38.5% de aquel de Angiopep-1 (250 nM) en el ensayo de perfusión cerebral in situ descrito en la presente) . De manera acorde, un vector o conjugado el cual "no se transporta de manera eficiente a través de la BBB" se transporta al cerebro a niveles mas bajos (v.gr., se transporta menos eficientemente que Angiopep-6) .
Por un vector o conjugado el cual es "eficientemente transportado a un tipo de célula particular" se entiende un vector o conjugado que es capaz de acumular (v.gr., ya sea debido a transporte incrementado hacia la célula, eflujo disminuido a partir de la célula, o una combinación de los mismos) en ese tipo de célula por lo menos 10% (v.gr., 25%, 50%, 100%, 200%, 500%, 1,000%, 5,000% o 10,000%) mayor extensión que ya sea una sustancia de control, o, en el caso de un conjugado, según se compara con el agente no conjugado.
Por "sustancialmente puro" o "aislado" se entiende un compuesto (v.gr., un polipéptido o conjugado) que ha sido separado de otros componentes químicos. Típicamente, el compuesto es sustancialmente puro cuando está por lo menos 30%, por peso, libre de otros componentes. En ciertas formas de realización, la preparación es por lo menos 50 % , 60% , 75% , 85% , 90% , 95% , 95% , 97% , 98 % , o 99% por peso libre de otros componentes. Un polipéptido purificado puede obtenerse, por ejemplo, por expresión de un polinucleótido recombinante codificando tal un polipéptido o mediante sintetizar químicamente al polipéptido. La pureza se puede medir por cualquier método apropiado, por ejemplo, cromatografía en columna, electroforesis de gel de poliacrilami-da, o por análisis de HPLC.
Por "análogo" se entiende un polipéptido originando a partir de una secuencia original o de una porción de una secuencia original y que puede incluir una o mas modificaciones; por ejemplo, una o mas modificaciones en la secuencia de aminoácidos (v.gr., una adición, supresión, inserción, o sustitución de aminoácido) , una o mas modificaciones en el esqueleto o cadena secundaria de uno o mas aminoácidos, o una adición de un grupo u otra molécula a uno o mas aminoácidos (cadenas secundarias o esqueleto) . Un análogo puede tener una o mas inserciones de aminoácidos, en cualquiera o en ambos de los extremos del polipéptido o dentro de la secuencia de aminoácidos del polipéptido. Un análogo puede tener similitud de secuencia y/o identidad de secuencia (v.gr., puede ser sustancialmente idéntico) con aquel de una secuencia original o una porción de una secuencia original. Análogos pueden incluir una modificación de su estructura, v.gr., como se describe en la presente. El grado de similitud entre dos secuencias se basa en el porcentaje de identidades (aminoácidos idénticos) y de sustitución conservadora. Un análogo puede tener por lo menos 35%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 95% (v.gr., 96%, 97%, 98%, 99%, y 100%) de similitud de secuencia con una secuencia original con una combinación de una o mas modificaciones en un esqueleto o cadena secundaria de un aminoácido, o una adición de un grupo u otra molécula. Aminoácidos ejemplares que tienen la intención de ser similares (un aminoácido conservador) a otros se conocen en la materia e incluyen, por ejemplo, aquellos listados en la Tabla 3.
Por "sustancialmente idéntico" se entiende un polipép-tido o ácido nucleico exhibiendo por lo menos 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95% o aun 99% de identidad con una secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos de referencia. Para polipéptidos, la longitud de secuencias de comparación generalmente será por lo menos 4 (v.gr., por lo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 50, o 100) aminoácidos. Para ácidos nucleicos, la longitud de secuencias de comparación generalmente será por lo menos 60 nucleótidos, de preferencia por lo menos 90 nucleótidos, y mas preferentemente por lo menos 120 nucleótidos, o la longitud completa. Se entenderá en la presente que espacios pueden encontrarse entre los aminoácidos de análogos que son idénticos o similares a aminoácidos del polipéptido original. Los espacios pueden incluir ningún aminoácido, uno o mas aminoácidos que no son idénticos o similares al polipéptido original. Análogos biológicamente activos de los vectores (polipéptidos ) de la invención se abarcan con la presente. Identidad porcentual puede determinarse, por ejemplo, con un algoritmo n GAP, BESTFIT, o FASTA en el Paquete de Software Wisconsin Genetics Emisión 7.0, usando pesos de espacio predeterminados.
Por "derivado funcional" se entiende una secuencia biológicamente activa o porción de un vector o agente o conjugado "derivado químico", "fragmento", o "variante" y una sal de los mismos de la invención. Un derivado funcional de vector puede ser capaz de unirse a o conjugarse con un agente e ingresar a un tipo de célula particular, con ello transportando al agente hacia esa célula .
Por "derivado químico" se entiende un vector, un agente, o un conjugado de la invención, el cual contiene fracciones químicas adicionales no una parte del vector, agente o conjugado vector-agente, incluyendo modificaciones covalentes. Un derivado químico puede prepararse mediante síntesis química directa usando métodos conocidos en la materia. Tales modificaciones pueden introducirse dentro de un vector de proteína o péptido, agente, o conjugado vector-agente mediante hacer reaccionar residuos de aminoácidos objetivo con un agente derivador orgánico capaz de reaccionar con cadenas secundarias seleccionadas o residuos terminales. Un derivado químico de vector puede ser capaz de cruzar la BBB o ingresar o acumularse en un tipo de célula particular (v.gr., aquellos descritos en la presente tales como el ovario) . En una forma de realización preferida, niveles muy elevados de transporte transendotelial a través de la BBB se obtienen sin afectar la integridad de la BBB.
Por "fragmento" se entiende un polipéptido originándose a partir de una porción de una secuencia original o progenitora o a partir de un análogo de dicha secuencia progenitora. Fragmentos abarcan polipéptidos teniendo truncaciones de uno o mas aminoácidos, en donde la truncación puede originarse a partir de la terminal amino (terminal N) , terminal carboxi (terminal C) , o a partir del interior de la proteina. Un fragmento puede incluir la misma secuencia como la porción correspondiente de la secuencia original. Fragmentos funcionales del vector (polipéptido) descrito en la presente se abarcan por la invención. Fragmentos pueden ser de por lo menos 5 (v.gr., por lo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 25, 28, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 75, 100, o 150) aminoácidos. Fragmentos de la invención pueden incluir, por ejemplo, un polipéptido de 7, 8, 9 o 10 aminoácidos a 18 aminoácidos. Fragmentos pueden contener cualquiera de las modificaciones descritas en la presente (v.gr., acetilación, amidación, sustituciones de aminoácidos) .
Un "aminoácido que no aparece en la naturaleza" es un aminoácido el cual no se produce naturalmente o se encuentra en un mamífero.
Por "agente" se entiende cualquier compuesto, por ejemplo, un anticuerpo, o un agente terapéutico, un marcador, un trazador, o un compuesto para toma de imágenes.
Por "agente terapéutico" se entiende un agente teniendo una actividad biológica. En algunos casos, el agente terapéutico se usa para tratar los síntomas de una enfermedad, una condición física o mental, una lesión, o una infección e incluye agentes anti-cáncer, antibióticos, agentes anti-angiogénicos, y moléculas activas en el nivel del sistema nervioso central.
Por "fármaco de molécula pequeña" se entiende un fármaco teniendo un peso molecular de 1,000 g/mol o menos (v.gr., menos de 800, 600, 500, 400, o 200 g/mol) .
Por "sujeto" se entiende un humano o animal no humano (v.gr., un mamífero).
Por "tratar" una enfermedad, trastorno, o condición en un sujeto se entiende reducir por lo menos un síntoma de la enfermedad, trastorno, o condición mediante administrar un agente terapéutico al sujeto.
Por "tratar profilácticamente" una enfermedad, trastorno, o condición en un sujeto se entiende reducir la frecuencia de ocurrencia de (v.gr., prevenir) una enfermedad, trastorno o condición mediante administrar un agente terapéutico al sujeto.
Por "cáncer" se entiende cualquier proliferación celular cuyo rasgo único es la pérdida de controles normales que pueden resultar en crecimiento desregulado, falta de diferenciación, o habilidad para invadir tejidos y metastasizarse . El cáncer puede desarrollarse en cualquier tejido o en cualquier órgano. El cáncer tiene la intención de incluir, sin limitación, cáncer del cerebro, ovario, hígado, pulmones, riñon, o bazo. Cánceres adicionales se describen en la presente.
Por "proporcionar" se entiende, en el contexto de un vector o conjugado de la invención, llevar al vector o conjugado hacia contacto con una célula o tejido objetivo ya sea in vivo o in vitro. Un vector o conjugado puede ser provisto mediante administrar al vector o conjugado a un sujeto.
Por "administrar" y "administración" se entiende un modo de entrega incluyendo, sin limitación intra-arterialmente, intra-nasalmente, intra-peritonealmente, intra-venosamente, intra-muscularmente, sub-cutáneamente, trans-dérmicamente o per os. Una dosis diaria puede dividirse en una, dos o mas dosis en una forma adecuada para administrarse en una, dos o mas veces durante un periodo de tiempo.
Por "terapéuticamente efectiva" o "cantidad efectiva" se entiende una cantidad de un agente terapéutico suficiente para mejorar, disminuir, prevenir, retrasar, suprimir, o arrestar cualquier síntoma de la enfermedad o condición siendo tratada. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente no necesita curar una enfermedad o condición pero proporcionará un tratamiento para la enfermedad o condición tal que el establecimiento de la enfermedad o condición se retrase, obstruya, o prevenga, o los síntomas de enfermedad o condición se mejoren, o el término de la enfermedad o condición se cambie o, por ejemplo, sea menos severo o recuperación se acelere en un individuo. Una "dosis sub-terapéutica" es una dosis menor que la cantidad efectiva mínima de un agente terapéutico que ha sido aprobada para uso clínico por un paciente. Una "dosis super-terapéutica" es una dosis mayor que la cantidad efectiva máxima de un agente terapéutico que ha sido aprobada para uso clínico por un paciente. La cantidad de una dosis sub-terapéutica o una dosis super-terapéutica puede variar de acuerdo con la demografía de pacientes (v.gr., adulto, pediátrico, o geriátrico) o cuando se usa en conjunto con la administración de agentes terapéuticos adicionales (v.gr., cuando se administra concurrentemente con otros agentes terapéuticos o regímenes de tratamiento tales como, por ejemplo, en quimioterapia de cáncer) .
Por "condición" se entiende cualquier situación ocasionando dolor, molestia, malestar, enfermedad o incapacidad (mental o física) a o en un individuo, incluyendo enfermedad neurológica, lesión, infección, o dolor crónico o agudo. Enfermedades neurológicas incluyen tumores cerebrales, metástasis del cerebro, esquizofrenia, epilepsia, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, y apoplejía.
Por "composición farmacéutica" se entiende una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente junto con diluyentes, conservador, solubilizante, emulsionante, o adyuvante farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, cualquiera de aquellas descritas en la presente.
Por "dosis terapéutica" se entiende la dosificación de un agente de tal un fármaco (sin el vector) aceptable para uso clínicamente con respecto a su toxicidad o eficacia. Mediante conjugación de un agente a un vector de la invención, puede ser posible administrar el agente a una dosificación ya sea menor o mayor que la dosis terapéutica.
Si un "rango" o "grupo de sustancias" se menciona con respecto a una característica particular (v.gr. , temperatura, concentración, tiempo y similares) , la invención se refiere a y explícitamente incorpora en la presente cada uno de los miembros específicos y combinación de sub-rangos o sub-grupos en el mismo. Por ende, por ejemplo, con respecto a una longitud de 9 a 18 aminoácidos, se entenderá como específicamente incorporando en la presente cada una de las longitudes individuales, v.gr., una longitud de 18, 17, 15, 10, 9, y cualquier número entre ellos. Por lo tanto, a menos de que se mencione específicamente, cada rango mencionado en la presente se deberá entender como siendo inclusivo. Por ejemplo, en la expresión de 5 a 19 aminoácidos de longitud es incluyendo 5 y 19. Esto de manera similar aplica con respecto a otros parámetros tales como secuencias, longitud, concentraciones, elementos, y similares.
Las secuencias, regiones, porciones definidas en la presente cada una incluye cada una de secuencia, región, y porción individual descrita por la misma asi como cada una sub-secuencia, sub-región, y sub-porción posible ya sea que tales sub-secuencias, sub-regiones, y sub-porciones se definan como incluyendo positivamente posibilidades particulares, como excluyendo posibilidades particulares o una combinación de las mismas. Por ejemplo, una definición excluyente para una región puede leerse como sigue: "provisto que dicho polipéptido no sea mas corto que 4, 5, 6, 7, 8 o 9 aminoácidos". .Un ejemplo adicional de una limitación negativa es el siguiente: una secuencia incluyendo la SEQ ID NO: X con la exclusión de un polipéptido de la SEQ ID NO: Y, etc. Un ejemplo adicional de una limitación negativa es el siguiente: provisto que dicho polipéptido no sea (no incluya o consista de) la SEQ ID NO: Z.
Otras características y ventajas de la invención serán aparentes a partir de la siguiente Descripción Detallada, los dibujos, y las reivindicaciones.
Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 muestra inhibición de crecimiento de tumor de xeno-injerto U87 (s.c. U87) usando el conjugado de doxorubicina-An2 (3:1) ( "Doxorubicina-An2 (3:1)").
La figura 2A muestra la captación cerebral del conjugado 3:1 Etopósido : Angiopep-2 ("Etop-An2 (3:1)") medido por perfusión cerebral in situ.
La figura 2B muestra la captación cerebral del conjugado 3:1 etopósido 4 ' -dimetilglicina : Angiopep-2 ("EtopDMG-An2 (3:1)") medido por perfusión cerebral in situ.
La figura 2C muestra la captación cerebral de Doxorubicina-An2 (3:1) medido por perfusión cerebral in situ.
La figura 3 muestra la perfusión in situ de Etop-An2 (3:1) .
La figura 4A muestra la captación parenquimal de etopósido no conjugado comparado con Etop-An2 (3:1).
La figura 4B muestra la repartición cerebral de Etop-An2 (3:1) siguiendo a agotamiento capilar cerebral.
La figura 5 muestra la perfusión cerebral in situ de Etop-An2 (3:1) comparada con etopósido no conjugado en ratones de derribo CD-1 contra P-gp.
La figura 6 muestra la inhibición de captación cerebral de Etop-An2 (3:1) por Angiopep-2.
La figura 7 muestra la perfusión cerebral in situ de EtopDMG-An2 comparada con EtopDMG no conjugado en ratones de derribo CD-1 contra P-gp.
La figura 8 muestra datos sobre los datos de cinética de plasma de Etop-An2 (3:1).
La figura 9 muestra la distribución cerebral de EtopD G-An2 siguiendo administración de bolo IV en ratones.
La figura 10 muestra la distribución cerebral de Etop- An2 (3:1) .
La figura 11 muestra la distribución cerebral de Etop-An2 (3:1) comparada con etopósido no conjugado treinta minutos después de administración de bolo IV.
La figura 12 muestra la distribución de tejido de Etop-An2 (3:1) comparado con etopósido no conjugado treinta minutos después de administración de bolo IV.
Las figuras 13A y 13B muestran cada una el efecto in vivo de (DoxSu)3-An2 en ratones que han sido inyectados intracra-nialmente con células de glioblastoma U87. La figura 13A muestra los resultados obtenidos en la primera prueba (Prueba 1) . La figura 13B muestra los resultados obtenidos en la segunda prueba (Prueba 2) mostrando que la administración del Compuesto (2) resulta en una extensión estadísticamente significativa de tiempo medio de supervivencia.
Descripción Detallada de la Invención La invención presenta compuestos, o cualquier sal farmacéuticamente aceptable, que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de las secuencias de aminoácidos descritas en la presente (v.gr. SEQ ID NOs: 1-105 y 107-116), o un derivado funcional de las mismas, donde dicha secuencia de aminoácidos incluye un enlace covalente a partir de un aminoácido de la secuencia de aminoácidos a un agente anti-cáncer (v.gr., derivados de podofilotoxina, doxorubicina, o derivados de doxorubicina ) . Derivados de podofilotoxina ejemplares incluyen, por ejemplo, un compuesto teniendo una estructura de acuerdo con la Fórmula (I) independiente, a partir de H, alquilo C:_6 opcionalmente sustituido, C(0)R8 (v.gr., C (0) CH2N (CH3) 2) , P (0) (0R9) (OR10) , S(0)2(OR9), o un enlazador hidrolizable Y que comprende un enlace covalente a un aminoácido del polipéptido; X es 0 o NR7; cada uno de R4, R5, y R7 se selecciona, de manera independiente, a partir de H, alquilo C1_6 opcionalmente sustituido, C(0)R8, o un enlazador hidrolizable Y que comprende un enlace covalente a un aminoácido del polipéptido; R6 es H, alquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, R8 se selecciona a partir de alquilo C^g opcionalmente sustituido o arilo opcionalmente sustituido; cada uno de R9 y R10 se selecciona, de manera independiente, a partir de H, alquilo Cx.6 opcionalmente sustituido, o arilo opcionalmente sustituido; y n es 2, 3, o 4 ; y donde uno de R1( R2, R3, R , R5, y R-, es Y. En algunas formas de realización, no mas de uno de Rlr R2, R3, R4, R5, y R7 es Y. En algunas formas de realización, Y es -C (0) (CH2)nC(0)- En algunas formas de realización, R2 es H o C (0) CH2N (CH3) 2. En ciertas formas de realización, el polipéptido puede tener por lo menos 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, o aun 100% de identidad con un polipéptido descrito en la presente. El polipéptido puede tener una o mas (v.gr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15) sustituciones con relación a una de las secuencias descritas en la presente. En ciertas formas de realización, la secuencia de aminoácidos se enlaza de manera covalente a derivados de podofilotoxina adicionales (v.gr., un compuesto de la Fórmula (I)) a través de un segundo, tercero, cuarto, quinto, o aun sexto aminoácido de dicha secuencia de aminoácidos y en cualquier posición de la secuencia de aminoácidos.
Compuestos ejemplares de la invención incluyen, pero no se limitan a, aquellos teniendo una secuencia de polipéptidos de acuerdo con la (SEQ ID NO: 97). En algunas formas de realización, los compuestos tienen la siguiente estructura: T F F Y G G S R G R N N F K T E E Y I I I Fórmula (I) Formula (I) Formula (I) , donde cada (-( Fórmula (I) representa un enlace covalente entre el aminoácido indicado y un compuesto de la Fórmula (I) . En ciertas formas de realización, compuestos de la Fórmula (I) tienen siguiente estructura: , donde n es 1, 2, o 3, R6 es CH3 o 2-tienilo, y R2 es H, -0P(0) (0H)2í o -C (0) CH2N (CH3) 2, o cualquier sal farmacéuticamente aceptable de las mismas. En algunas formas de realización, n es 3, R6 es CH3, y R2 es H. En otras formas de realización, n es 3, R6 es CH3, y R2 es -C (0) CH2N (CH3) 2.
Otras formas de realización se describen en mayor detalle mas adelante.
Derivados de Podofilotoxina Derivados de podofilotoxina incluyen compuestos tales como aquellos descritos por la Fórmula (I), v.gr., etopósido, tenipósido, y derivados de los mismos, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma. Derivados de podofilotoxina son agentes terapéuticos ejemplares y pueden enlazarse de manera covalénte a un aminoácido en cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente (v.gr., Angiopep-2) . Estos compuestos pueden tener, por ejemplo, actividad anti-neoplástica, inhibir la actividad de topoisomerasa II, o tener actividad anti-viral.
Etopósido y Derivados de Etopósido Etopósido (también conocido como Toposar, Vepesid, o VP16) es un derivado de podofilotoxina teniendo la siguiente estructura 4* La estructura química de etopósido puede variarse para lograr derivados de etopósido. Un derivado ejemplar de etopósido es fosfato de etopósido (ETOPOPHOS) , donde el -OH fenólico es reemplazado con -OP(0) (OH)2, o cualquier sal farmacéuticamente aceptable del mismo (v.gr., -OP (0) (ONa) 2) . Fosfato de etopósido ha mejorado solubilidad de agua comparada con etopósido.
Otros derivados de etopósido incluyen aquellos donde el -OH fenólico se reemplaza con un grupo aciloxi (v.gr., -0C(0)R8, como se describe en la presente) tal como el siguiente compuesto: ("etopósido 4 ' -dimetilglicina" o "etopósidoDMG") .
Estos derivados de etopósido acetilados también pueden mostrar solubilidad en agua mejorada con relación a etopósido cuando se unen de manera covalente a cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente.
Etopósido, fosfato de etopósido, etopósidoDMG, o derivados de las mismas, pueden unirse de manera covalente a un aminoácido en un polipéptido mediante unir un enlazador covalente hidrolizable Y a, por ejemplo, el hidroxilo 2" o el hidroxilo 3" de la molécula. Enlazadores ejemplares pueden derivarse, por ejemplo, a partir de ácidos dicarboxilicos tales como ácidos succinico, glutárico, y butárico, o cualquier anhídrido de los mismos. Adicionalmente, un enlazador covalente puede unirse a etopósido, o derivados de los mismos, en el grupo fenol -OH.
Derivados de etopósido pueden describirse generalmente por la siguiente fórmula: (1-A), o cualquier estereoisómero del mismo, donde cada R1# R2, y R3 se selecciona, de manera independiente, a partir de H, alquilo C1.6 opcionalmente sustituido, C(0)R8, P(0) (0R9) (OR10) , o S(0)2(OR9) ; X es 0 o NR7; cada R4, R5, y R7 se selecciona, de manera independiente, a partir de H, alquilo C1-6 opcionalmente sustituido, o C(0)R8; R6 es H, alquilo x.6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, R8 se selecciona a partir de alquilo r.6 opcionalmente sustituido o arilo opcionalmente sustituido; y cada R9 y R10 se selecciona, de manera independiente, a partir de H, alquilo C-¡_.6 opcionalmente sustituido, o arilo opcionalmente sustituido.
Cuando los compuestos de la invención incluyen un derivado de etopósido de acuerdo con la Fórmula (I), uno de i~ 6 incluye un enlazador hidrolizable Y como se describe en la presente. En algunas formas de realización, Y es -C(0) (CH2)nC(0)-y n es 2, 3, o 4. En formas de realización no limitativas, ejemplares, donde R2 es C(0)R8, R8 puede ser alquilo incluyendo un sustituyente amino y teniendo sustituyentes adicionales opcionales. En algunas formas de realización C(0)R8 es un a-aminoácido C-enlazado. El a-aminoácido C-enlazado puede ser un aminoácido natural o no natural.
Otros derivados de podofilotoxina ejemplares de la Fórmula (I) que pueden unirse de manera covalente a cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente incluyen teniposido y NK611 (Esquema 3) .
Esquema 3 TENIPOSIDO N 611 Derivados de Podofilotoxina Adicionales Aun otros derivados de podofilotoxina adecuados para uso en la invención se describen en las patentes US 4,567,253; 4,609,644; 4,900,814; 4,958,010; 5,489,698; 5,536,847; 5,571,914; 6,051,721; 6,107,284; 6,475,486; 6,610,299; 6,878,746; 6,894,075; 7,087,641; 7,176,236; 7,241,595; 7,342,114; and 7, 378, 19; y en publicaciones de patente US 20030064482, 20030162722, 20040044058, 20060148728, y 20070249651, cada una de las cuales es por ende incorporada por referencia.
Por ejemplo, los derivados de etopósido descritos en la patente US 7,176,236 pueden enlazarse de manera covalente a un aminoácido en cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente (v.gr., Angiopep-2) . De manera acorde, en una forma de realización, los compuestos de la invención incluyen una estructura de acuerdo con la Fórmula (I) donde R2 y Y son como se describen para la Fórmula (I) ; X2 es -0-, -S-, -NH-, -C0-, -CH=N-, o -CH2NH- ; X3 es 0R2 o N(R2)2; Z1 es un enlace covalente, -NHCO-, -CONH-, -0C0-, o -C00-; Z2 es un -(CH2)0R15 covalente, o -(CH2)Q se incorpora en Z2 como un anillo de 5-8 miembros; R14 es un enlace covalente o alquilo, alquenilo, o fenilo opcionalmente sustituido; y R15 es alquilo sustituido, alquenilo sustituido, o arilo sustituido, en donde el grupo sustituido incluye por lo menos un grupo amino.
En algunas formas de realización, X3 es -OH, -OC (O) CH2NH2, -OC (O) CH2NHCH3, o -OC (O) CH2N (CH3) 2. En otras formas de realización, X es -NH-. En algunas formas de realización, -Ri4-Z!-Z2- es (p-C6H4-R16) -, donde R1G es -N02, -F, -CONHCH2CH2C6H5, o -CONHCH2CH2 (p-C6H4OH) .
En cualquier compuesto de las Fórmulas (I) o (I-Á), el grupo OR2 puede ser -OC(0)R8.
En algunas formas de realización, el compuesto de la Fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que se usa puede permitir para propiedades fisicoquímicas (v.gr., solubilidad) mejoradas. Por ejemplo, cuando solubilidad incrementada se desea, el compuesto de la Fórmula (I) es de preferencia EtopósidoDMG .
Derivados de Doxorubicina En algunas formas de realización, el agente anti-cáncer es doxorubicina (hidroxidaunorubicina o Adriamycin) o un derivado de doxorubicina tal como epirubicina (Ellence o Pharmorubicin) , o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. Las estructuras de estos compuestos ejemplares se muestran en el Esquema 4. Doxorubicina y derivados de doxorubicina pueden unirse de manera covalente a un aminoácido en cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente a través de un enlazador covalente hidrolizable Y, como se define en la presente, unido de manera covalente a, por ejemplo, el grupo 14-hidroxilo.
Esquema 4 doxorubicina epirubicina Derivados de doxorubicina pueden describirse de manera general por la siguiente Fórmula (II): (II), en donde cada uno de Xlr X2, X3, X4, y X5 se selecciona, de manera independiente, a partir de un enlace covalente, 0, o NR25; cada uno de R1 , RIB? Ri9> ^21 ^22» ^24» y ¾s se selecciona, de manera independiente, a partir de H, alquilo C1-6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2_6 opcionalmente sustituido, alquinilo C2_6 opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, o es un enlazador hidrolizable Y como se define en la presente.
Cuando un compuesto de la Fórmula (II) se une a cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente, uno de R17, R18, R19, R20, R2i# 22Í R23 R2<u Y R25 es Y. En ciertas formas de realización, R21 es Y. Compuestos de la Fórmula (II) incluyen compuestos teniendo una estructura de acuerdo con la Fórmula (II- A) I-A), en donde Y es un enlazador hidrolizable como se describe en la presente; X2R18 es H o NH2; X3Ri9 es H u OH; y X4R20 es H o alquilo <_ 3 opcionalmente sustituido. En algunas formas de realización, el enlazador hidrolizable Y es -C(O) (CH2)nC(0)- y n es 2, 3, o 4. En ciertas formas de realización, el compuesto de la Fórmula (II) es : Otros derivados de doxorubicina pueden encontrarse en las patentes US 4,098,884, 4,301,277, 4,314,054, 4,464,529, 4,585,859, 4,672,057, 4,684,629, 4,826,964, 5,200,513, 5,304,687, 5,594,158, 5,625,043, y 5,874,412, cada una de las cuales es por ende incorporada por referencia.
En algunas formas de realización, el compuesto de la Fórmula (II), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que se usa puede permitir para propiedades fisicoquímicas (v.gr., solubilidad) mejoradas. Por ejemplo, cuando se desea solubilidad incrementada, el compuesto de la Fórmula (II) es de preferencia la sal de hidrocloruro de doxorubicina .
Además de Angiopep-2, derivados de podofilotoxina tales como etopósido, fosfato de etopósido, etopósidoDMG, tenipósido, NK611, y otros compuestos de las Fórmulas (I) y (I-A), o doxorubicina, epirubicina, y otros derivados de doxorubicina (v.gr., compuestos de la Fórmula (II)) también se pueden conjugar a cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente (v.gr., Angiopep-4b, Angiopep-5, Angiopep-6, o Angiopep-7). Enlazadores hidrolizables, tales como enlazadores que incluyen grupos éster, pueden usarse para enlazar de manera covalente al agente anticáncer (v.gr., derivados de podofilotoxina o derivados de doxorubicina) a un polipéptido (v.gr., ejemplo 1 descrito en la presente) . Etopósido, fosfato de etopósido, etopósidoDMG, otros derivados de podofilotoxina de los mismos, doxorubicina, epirubicina, y otros derivados de doxorubicina tienen múltiples posiciones estratégicas (v.gr., los 2" y 3" hidroxilos de etopósido, fosfato de etopósido, y etopósidoDMG, y el 14-hidroxilo de doxorubicina y epirubicina) . Por ejemplo, un grupo difuncional (v.gr., un reactivo derivado de ácido succinico, ácido glutárico, anhídrido glutárico, o ácido butárico, o cualquier anhídrido de los mismos) puede unirse a etopósido en el 2" hidroxilo o a doxorubicina en el 14 hidroxilo. Estos intermediarios ejemplares pueden entonces activarse con un reactivo de acoplamiento de péptido tal como BTTU y tratarse con un polipéptido. Otros agentes de acoplamiento de péptido incluyen carbodiimidas (v.gr., diciclohexilcarbodiimida (DCC), diisopropilcarbodiimida (DIC), y hidrocloruro de l-etil-3- ( 3-dimetilaminpropil ) carbodiimida) (EDC-HC1)), triazolas (v.gr., 1-hidroxi-benzotriazola (HOBt) y 1-hidroxi-7-aza-benzotriazola (HOAt) ) , agentes de acoplamiento de péptidos de benzotriazola relacionados tales como hexafluoro-fosfato de O-benzotriazola-N, N, N' , N' -tetrametil-uronio (HBTU) , hexafluorofosfato de 2- ( 6-cloro-lH-benzotriazola-l-il) -1, 1, 3, 3-tetrametilaminio (HCTU) , hexafluorofosfato de 2-(lH-9-azobenzotriazola-l-il) -1, 1, 3, 3-tetrametilaminio (HATU) , hexafluo-rofosfato de benzotriazola-l-il-oxi-tris- (dimetilamino) -fosfonio (reactivo BOP) , y hexafluorofosfato de benzotriazol-l-il-oxitripirrolidinofosfonio (PyBOP), y 3- (dietoxifosforiloxi ) - 1, 2, 3-benzotriazin-4 (3H) -ona (DEPBT) . El conjugado puede entonces purificarse. Cada intermediario o producto de este procedimiento sintético se purifica y valida usando diferentes enfoques tales como HPLC, cromatografía de líquidos delgada, RMN (intercambio de 13C o XH) , punto de fusión, espectrometría de masas. El conjugado final se analiza por espectrometría de masas y electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida . Esto permite la determinación del número de moléculas (v.gr. , de etopósido, fosfato de etopósido, etopósidoDMG, doxorubicina, o epirubicina) conjugadas a cada vector.
Enlazadores Hidrolizables Cuando un compuesto de la Fórmula (I) se une de manera covalente por un enlazador hidrolizable Y a un aminoácido en un polipéptido, el enlazador puede localizarse en Rlr R2, R3, R4, R5, o R7. De manera similar, cuando un compuesto de la Fórmula (II) se une de manera covalente por un enlazador hidrolizable Y a un aminoácido en un polipéptido, el enlazador puede localizarse en cualquiera de R17, R18, R19, R20, R21, R22, R23, R24, y R25. Enlazadores hidrolizables no limitativos, ejemplares, pueden prepararse a partir de ácidos dicarboxílieos , dicarbonatos, anhídridos carboxílicos, diisocianatos, o ácidos difosfónicos . Un compuesto que incluye un compuesto de la Fórmula (I) o (II) que se une de manera covalente a un aminoácido en cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en la presente también puede describirse por la siguiente fórmula D-G-X-G'-A (III), donde cada G y G' es un grupo seleccionado, de manera independiente, a partir de -C(0)-, -C(0)0-, -0C(0)-, S(0)20-, -0S(0)2-, -S(0)2NH-, -NHS(0)2-, y -0P (0) (0Rn) 0- ; G se enlaza de manera covalente a D, donde D es un derivado de podofilotoxina (v.gr., un compuesto de la Fórmula (I)) o doxorubicina o un derivado de doxorubicina (v.gr., un compuesto de la Fórmula (II)); G' se enlaza de manera covalente a A, donde A es un aminoácido en una secuencia de aminoácidos descrita en la presente (v.gr., las secuencias de aminoácidos descritas en la Tabla 1, o derivados funcionales de las mismas); y X es - (arilo opcionalmente sustituido)-, - (CR12Ri3) n-, -0{ (CR12R13)20}n-, -{ (CR12R13)20(CR12R13)2}n-, o - (CR12R13) 0Y (CR12R13) p- , donde cada n, o, y p es, de manera independiente, un entero entre 1-10; Rn es H o alquilo C^.g inferior; Ri2 Y Ri3 se seleccionan cada uno, de manera independiente, a partir de H, OH, alquilo C1-6 inferior; y Y es 0, NH, N (alquilo C1-6 inferior), o -arilo opcionalmente sustituido.
Cada n, o, y p pueden ser, de manera independiente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10.
En algunas formas de realización, la fracción G-X-G' en la Fórmula (III) se selecciona a partir de -C (0) CH2C (0) -, -C (0) (CH2) 2C (0) -, -C(0) (CH2) 3C (0) - -C ( 0 ) ( CH2 ) 4C ( 0 ) - , -C(0) (CH2)5C(0)-, -C (0) (CH2) 6C (0) -, -C (0) (OCH2CH2) 0C (0) -, -C(0) (OCH2CH2)2OC (0) - -C(0) (OCH2CH2) 30C (0) -, y -C(0) (OCH2CH2) 40C (0) - . Polipéptidos Secuencias ejemplares de aminoácidos útiles en los compuestos de la invención incluyen, pero no se limitan a, las secuencias de aminoácidos descritas en la Tabla 1.
Además de las secuencias de aminoácidos descritas en la Tabla 1, la invención también presenta fragmentos de estas secuencias de aminoácidos (v.gr., un fragmento funcional). En ciertas formas de realización, los fragmentos son capaces de ingresar o acumularse en un tipo de célula particular (v.gr., ovario, hígado, pulmón, riñon, bazo, o músculo) o capaces de cruzar la BBB. Truncaciones del polipéptido pueden ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, o mas aminoácidos a partir de la terminal N del polipéptido, la terminal C del polipéptido, o una combinación de los mismos. Otros fragmentos incluyen secuencias donde porciones internas del polipéptido se suprimen.
Polipéptidos adicionales de la invención se pueden identificar mediante usar uno de los ensayos o métodos descritos en la publicación de solicitud de patente US 2006/0189515, la cual por ende se incorpora por referencia, o por cualquier método conocido en la materia. Por ejemplo, un vector candidato puede producirse por síntesis de polipéptido convencional y conjugarse con, por ejemplo, un compuesto de las Fórmulas (I) o (II), y administrarse a un animal de laboratorio. Un vector biológicamente activo puede identificarse, por ejemplo, con base en su eficacia para incrementar la supervivencia de un animal inyectado con células de tumor y tratado con el conjugado según se compara con un control el cual no ha sido tratado con un conjugado (v.gr., tratado con el agente no conjugado).
En otro ejemplo, un polipéptido biológicamente activo de la invención puede identificarse con base en su ubicación en la parenquima en un ensayo de perfusión cerebral in situ. Ensayos de BBB in vitro, tal como el modelo desarrollado por CELLIAL Technologies, pueden usarse para identificar tales vectores.
Ensayos para determinar acumulación en otros tejidos pueden llevarse a cabo también y ensayos ejemplares son descritos en la presente. Polipéptidos marcados de la invención pueden administrarse a un animal, y acumulación en diferentes órganos puede medirse. Por ejemplo, un polipéptido conjugado a un marcador detectable (v.gr., un marcador de espectroscopia de fluorescencia casi IR tal como Cy5.5) permite visualización in vivo. Tal un polipéptido puede ser administrado a un animal, y la presencia del polipéptido en un órgano puede detectarse, por ende permitiendo determinación de la tasa y cantidad de acumulación del polipéptido en el órgano deseado. En otras formas de realización, el polipéptido de la invención puede marcarse con un isótopo radioactivo (v.gr., 125I) . El polipéptido es entonces administrado a un animal. Después de un periodo de tiempo, el animal es sacrificado, y los órganos del animal son extraídos. La cantidad de radio-isótopo en cada órgano puede entonces medirse usando cualquier medio conocido en la materia. Mediante comparar la cantidad de polipéptido candidato marcado en un órgano particular sin la cantidad de control marcado, la habilidad del polipéptido candidato, la tasa o cantidad de acumulación de un polipéptido candidato en un tejido particular puede evaluarse. Controles negativos apropiados incluyen cualquier polipéptido conocido por no transportarse hacia un tipo de célula particular.
Por ejemplo, los grupos amina de Angiopep-1 (SEQ ID NO: 67) y Angiopep-2 (SEQ ID NO: 97) pueden usarse como sitios para conjugación de agentes. Para estudiar el rol de grupos amina en conjugación y su impacto en la capacidad de transporte global de estos vectores, otros vectores han sido desarrollados con base en la secuencia de Angiopep-1 y Angiopep-2. Estos vectores tienen grupos amino reactivos variables y carga global variable. Estos polipéptidos se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2: Vectores con objetivos de grupo amina variables * Angiopep-3 es una forma acetilada de Angiopep-2. 1 Ac representa acetilación.
Polipéptidos modificados La invención también puede incluir polipéptidos teniendo una modificación de una secuencia de aminoácidos descrita en la presente (v.gr., polipéptido teniendo una secuencia descrita en cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-105 y 107-116 tal como Angiopep-3, -4a, -4b, -5, -6, o -7) y en la cual el polipéptido incluye un aminoácido que se enlaza de manera covalente a un compuesto de las Fórmulas (I) o (II). En ciertas formas de realización, la modificación no destruye significativamente una actividad biológica deseada. En algunas formas de realización, la modificación puede ocasionar una reducción en la actividad biológica (v.gr., por al menos 5%, 10%, 20%, 25%, 35%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, o 95%). En otras formas de realización, la modificación no tiene efecto sobre la actividad biológica o puede incrementar (v.gr., por al menos 5%, 10%, 25%, 50%, 100%, 200%, 500%, o 1,000%) la actividad biológica del polipéptido original. El polipéptido modificado puede tener o puede optimizar una o mas de las características de un polipéptido de la invención las cuales, en alguna instancia pudieran ser necesarias o deseables. Tales características incluyen estabilidad in vivo, biodisponibilidad, toxicidad, actividad inmunológi-ca, o identidad inmunológica .
Polipéptidos de la invención pueden incluir aminoácidos o secuencias modificadas ya sea por procesos naturales, tales como procesamiento post-translacional, o por técnicas de modificación química conocidas en la materia. Modificaciones pueden ocurrir en cualquier punto en un polipéptido incluyendo al esqueleto de polipéptido, las cadenas secundarias de aminoácidos y las terminales amino o carboxi. El mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo o variables grados en varios sitios en un polipéptido dado, y un polipéptido puede contener mas de un tipo de modificación. Polipéptidos pueden ramificarse como resultado de ubiquitinación, y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Polipéptidos cíclicos, ramificados, y ramificados cíclicos pueden resultar de procesos naturales post-transla-ción o pueden hacerse de manera sintética. Otras modificaciones incluyen pegilación, acetilación, acilación, adición de grupo acetomidometilo (Acm) , ADP-ribosilación, alquilación, amidación, biotinilación, carbamoilación, carboxietilación, esterificación, unión covalente a fiavina, unión covalente a una fracción heme, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de fármaco, unión covalente de un marcador (v.gr., fluorescente o radioactivo) , unión covalente de un lípido o derivado de lípidos, unión covalente de fosfatidilinositol, reticulación, ciclización, formación de enlace de disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de ancla GPI, hidroxila-ción, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfación, adición mediada por transferencia de ADN de aminoácidos a proteínas tales como arginilación y ubiquitinación .
Un polipéptido modificado de la invención puede además incluir inserción, supresión, o sustitución de aminoácidos, ya sea conservadora o no conservadora (v.gr., D-aminoácidos, desaminoácidos) en la secuencia de polipéptidos (v.gr., donde tales cambios no alteran sustancialmente la actividad biológica del polipéptido) .
Por ejemplo, en algunas formas de realización, la secuencia de aminoácidos (v.gr., SEQ ID NOs : 1-105 y 107-116) se modifica mediante insertar uno o mas residuos de cisteina adicionales en la terminal N del péptido, la terminal C del péptido, o ambas. La adición de uno o mas residuos de cisteina a las terminales amino o carboxi de cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en la presente puede facilitar conjugación de estos polipéptidos a ácidos nucleicos (v.gr., moléculas de ARNsi) o vectores de lipidos, v.gr., enlace de disulfuro. Por ejemplo, Angiopep-1 (SEQ ID NO: 67), Angiopep-2 (SEQ ID NO: 97), o Angiopep-7 (SEQ ID NO: 112) pueden modificarse para incluir un solo residuo de cisteina en la terminal amino (SEQ ID NOs: 71, 113, y 115, respectivamente) o un solo residuo de cisteina en la terminal carboxi (SEQ ID NOs: 72, 114, y 116, respectivamente).
Sustituciones pueden ser conservadoras (es decir, en donde un residuo se reemplaza por otro del mismo tipo general o grupo) o no conservadoras (es decir, donde un residuo se reemplaza por un aminoácido de otro tipo) . Además, un aminoácido no tal como se presenta en la naturaleza puede ser sustituido por un aminoácido tal como se presenta en la naturaleza (es decir, sustitución de aminoácido conservadora no tal como se presenta en la naturaleza o una sustitución de aminoácido no conservadora no tal como se presenta en la naturaleza) .
Polipéptidos hechos de manera sintética pueden incluir sustituciones de aminoácidos no codificados naturalmente por ADN (v.gr., aminoácido no tal como aparece en la naturaleza o no natural) . Ejemplos de aminoácidos no tal como aparecen en la naturaleza incluyen D-aminoácidos , un aminoácido teniendo un grupo acetilaminometilo unido a un átomo de azufre de una cisteina, un aminoácido pegilado, los aminoácidos omega de la fórmula NH2 (CH2) nCOOH donde n es 2-6, aminoácidos no polares neutros, tales como sarcosina, t-butil alanina, t-butil glicina, N-metil isoleucina, y norleucina. Fenilglicina puede sustituirse por Trp, Tyr, o Phe; citrulina y sulfóxido de metionina son no polares neutros, ácido cisteico es ácido, y ornitina es básica. Prolina puede sustituirse con hidroxiprolina y retener las propiedades que confieren conformación.
Análogos pueden generarse por mutagénesis de sustitución y retener la actividad biológica del polipéptido original. Ejemplos de sustituciones identificadas como "sustituciones conservadoras" se muestran en la Tabla 3. Si tales sustituciones resultan en un cambio no deseado, entonces otro tipo de sustituciones, denominadas "sustituciones ejemplares" en la Tabla 3, o como se describe adicionalmente en la presente en referencia a clases de aminoácidos, se introducen y los productos se clasifican.
Modificaciones sustanciales en función o identidad inmunológica se logran mediante seleccionar sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre mantener (a) la estructura del esqueleto de polipéptido en el área de sustitución, por ejemplo, como una conformación de hoja o hélice, (b) la carga o hidrofobia de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena secundaria. Residuos que aparecen en la naturaleza se dividen en grupos con base en propiedades de cadena secundaria comunes: (1) hidrófobos: norleucina, metionina (Met) , alanina (Ala), valina (Val), leucina (Leu), isoleucina (lie), histidina (His), triptofano (Trp) , tirosina (Tyr) , fenilalanina (Phe) , (2) hidrófilos neutros : cisteina (Cys) , serina (Ser), treonina (Thr) , (3) ácidos/cargados negativamente: ácido aspártico (Asp) , ácido glutámico (Glu) , (4) básicos: asparagina (Asn) , glutamina (Gln) , histidina (His), lisina (Lys), arginina (Arg) , (5) residuos que tienen influencia en orientación de cadena: glicina (Gly) , prolina (Pro), (6) aromáticos: triptofano (Trp), tirosina (Tyr), fenilalanina (Phe), histidina (His), (7) polares: Ser, Thr, Asn, Gln, (8) básicos cargados positivamente: Arg, Lys, His; y (9) cargados: Asp, Glu, Arg, Lys, His.
Otras sustituciones conservadoras de aminoácidos se listan en la Tabla 3.
Tabla 3 Residuo original Sustitución ejemplar Sustitución conservadora Ala (A) Val, Leu, He Val Arg (R) Lys, Gln, Asn Lys Asn (N) Gln, His, Lys, Arg Gln Asp (D) Glu Glu Cys (C) Ser Ser Gln (Q) Asn Asn Glu (E) Asp Asp Gly (G) Pro Pro His (H) Asn, Gln, Lys, Arg Arg He (I) Leu, Val, Met, Ala, Phe, norleucina Leu Leu (L) Norleucina, He, Val, Met, Ala, Phe He Lys (K) Arg, Gln, Asn Arg Met (M) Leu, Phe, lie Leu Phe (F) Leu, Val, He, Ala Leu Pro (P) Gly Gly Ser (S) Thr Thr Thr (T) Ser Ser Trp (W) Tyr Tyr Tyr (Y) Trp, Phe, Thr, Ser Phe Val (V) He, Leu, Met, Phe, Ala, norleucina Leu Análogos de polipéptido adicionales Los compuestos de la invención pueden incluir análogos de polipéptidos de aprotinina conocidos en la materia donde los análogos incluyen un aminoácido que es enlazado de manera covalente a un derivado de podofilotoxina (v.gr., un compuesto de la Fórmula (I)) o a doxorubicina o un derivado de doxorubicina (v.gr., un compuesto de la Fórmula (II)) . Por ejemplo, la patente US 5,807,980 describe inhibidores derivados de Inhibidor de Tripsina Pancreática Bovina (aprotinina) así como un método para su preparación y uso terapéutico, incluyendo al polipéptido de la SEQ ID NO: 102. Estos polipéptidos han sido usados para el tratamiento de una condición caracterizada por una apariencia anormal o cantidad de factor de tejido y/o factor Villa tal como trombosis anormal. La patente US 5,780,265 describe inhibidores de serina proteasa capaces de inhibir kalikreína de plasma, incluyendo SEQ ID NO: 103. La patente US 5,118,668 describe variantes de Inhibidor de Tripsina Pancreática Bovina, incluyendo la SEQ ID NO: 105. La secuencia de aminoácidos de aprotinina (SEQ ID NO: 98) , la secuencia de aminoácidos de Angiopep-1 (SEQ ID NO: 67), y la SEQ ID NO: 104, asi como algunas secuencias de análogos biológicamente activos pueden encontrarse en la publicación de solicitud internacional WO 2004/060403.
Una secuencia de nucleótidos ejemplar que codifica un análogo de aprotinina se ilustra en la SEQ ID NO: 106 (atgagccag atttctgcct cgagccgccg tacactgggc cctgcaaagc tcgtatcatc cgttacttct acaatgcaaa ggcaggcctg tgtcagacct tcgtatacgg cggctgcaga gctaagcgta acaacttcaa atccgcggaa gactgcatgc gtacttgcgg tggtgcttag; no. de acceso Genbank X04666). Esta secuencia codifica una lisina en la posición 16 en lugar de una valina, como se encuentra en la SEQ ID NO: 98. Una mutación en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 106 puede introducirse por métodos conocidos en la materia para cambiar el producto del polipéptido de la SEQ ID NO: 98 teniendo una valina en la posición 16. Mutaciones o fragmentos adicionales pueden obtenerse usando cualquier técnica conocida en la materia.
Otros ejemplos de análogos de aprotinina pueden encontrarse mediante llevar a cabo un BLAST de proteínas (Genbank: www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) usando la secuencia de aprotinina sintética (o porción de la misma) divulgada en la solicitud internacional PCT/CA2004/000011. Análogos de aprotinina ejemplares se encuentran bajo los nos. de acceso CAA37967 (GI.58005) y 1405218C (GI : 3604747) .
Preparación de derivados de polipéptidos y peptidomiméticos Además de polipéptidos consistiendo solamente de aminoácidos tales como aparecen en la naturaleza, peptidomiméticos o análogos de polipéptidos también son abarcados por la presente invención. Análogos de polipéptido son comúnmente usados en la industria farmacéutica como fármacos no de polipéptido con propiedades análogas a aquellas del polipéptido de plantilla. Los compuestos no de polipéptido son denominados "miméticos de polipéptido" o peptidomiméticos (Fauchere et al., Infect. ímmun. 54:283-287, 1986; Evans et al., J. Med. Chem. 30:1229-1239, 1987) . Miméticos de polipéptido que son relacionados estructural-mente a polipéptidos terapéuticamente útiles pueden usarse para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente o acrecentado. Generalmente, peptidomimétidos son estructuralmente similares al polipéptido de paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una actividad biológica o farmacológica) tal como polipéptidos de ligadura a receptor que aparecen en la naturale-za, pero teniendo uno o mas enlaces de péptido opcionalmente reemplazados por enlaces tales como -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis y trans), -CH2SO-, CH(OH)CH2-, COCH2-, etc., por métodos bien conocidos en la materia ( (Spatola, Peptide Backbone Modifications, Vega Data, 1(3):267, 1983); Spatola et al. {Life Sci. 38:1243-1249, 1986); Hudson et al. (Int. J. Pept. Res. 14:177-185, 1979); y Weinstein. B., 1983, Chemistry and Bioche-mistry, of Amino Acids, Peptides and Proteins, Weinstein eds, Marcel Dekker, New York) . Tales miméticos de polipéptido pueden tener ventajas significativas sobre polipéptidos tales como aparecen en la naturaleza incluyendo producción mas económica, mayor estabilidad química, propiedades farmacológicas acrecentadas (v.gr., media vida, absorción, potencia, eficiencia), antigenicidad reducida y otras.
Aunque los polipéptidos de la invención pueden ser efectivos al ingresar a tipos de células particulares (v.gr., aquellos descritos en la presente) , su efectividad puede reducirse por la presencia de proteasas. Proteasas de suero tienen requerimientos de sustrato específicos. El sustrato debe tener tanto L-aminoácidos y enlaces de péptido para disociación. Mas aun, exopeptidasas, las cuales representan el componente mas prominente de la actividad de proteasa en suero, usualmente actúan sobre el primer enlace de péptido del polipéptido y requieren una terminal N libre (Powell et al., Pharm. Res. 10:1268-1273, 1993). A la luz de esto, es frecuentemente ventajoso usar versiones modificadas de polipéptidos . Los polipéptidos modificados retienen las características estructurales de los polipéptidos de L-aminoácido originales que confieren actividad biológica con respecto a IGF-1, pero son ventajosamente no fácilmente susceptibles a disociación por proteasa y/o exopeptidasas .
Sustitución sistemática de uno o mas aminoácidos de una secuencia de consenso con D-aminoácido del mismo tipo (v.gr., D-lisina en lugar de L-lisina) puede usarse para generar polipéptidos mas estables. Por ende, un derivado de polipéptido o peptidomimético de la presente invención puede ser un polipéptido todo L, todo D o mixto D, L. La presencia de un D-aminoácido terminal N o terminal C incrementa la estabilidad in vivo de un polipéptido debido a que las peptidasas no pueden utilizar un D-aminoácido como un sustrato (Powell et al., Pharm. Res. 10:1268-1273, 1993) . Polipéptidos inversos D son polipéptidos conteniendo D-aminoácidos, arreglados en una secuencia en reversa con relación a un polipéptido conteniendo L-aminoácidos. Por ende, el residuo terminal C de un polipéptido de L-aminoácidos se vuelve terminal N para el polipéptido de D-aminoácidos, y asi sucesivamente. Polipéptidos inversos D retienen la misma conformación terciaria y por lo tanto la misma actividad, como los polipéptidos de L-aminoácidos, pero son mas estables a degradación enzimática in vitro e in vivo, y por ende tienen mayor eficacia terapéutica que el polipéptido original (Brady y Dodson, Nature 368:692-693, 1994; Jameson et al., Nature 368:744-746, 1994). Además de polipéptidos inversos D, polipéptidos restringidos comprendiendo una secuencia de consenso o una variación de secuencia de consenso sustancialmente idéntica pueden generarse por métodos bien conocidos en la materia (Rizo y Gierasch, Ann. Rev. Biochem. 61:387-418, 1992). Por ejemplo, polipéptidos restringidos pueden generarse mediante añadir residuos de cisteina capaces de formar puentes de disulfuro y, por ende, resultando en un polipéptido cíclico. Polipéptidos cíclicos no tienen terminales ? o C libres. De manera acorde, no son susceptibles a proteólisis por exopeptidasas, aunque son, por supuesto, susceptibles a endopeptidasas , las cuales no disocian en terminales de péptido. Las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos con D-aminoácidos terminales ? o terminales C y de los polipéptidos cíclicos son usualmente idénticas a las secuencias de los polipéptidos a los cuales corresponden, excepto por la presencia de residuos de D-aminoácidos terminales N o terminales C, o su estructura circular, respectivamente.
Un derivado cíclico conteniendo un enlace de disulfuro intramolecular puede prepararse or síntesis en fase sólida convencional mientras se incorporan residuos de cisteína u homocisteína S-protegidos adecuados en las posiciones seleccionadas para ciclización tales como las terminales amino y carboxi (Sah et al., J. Pharm. Pharmacol. 48:197, 1996). Siguiendo a terminación del ensamblaje de cadena, ciclización puede llevarse a cabo ya sea (1) por remoción selectiva del grupo S-protector con una oxidación sobre soporte consecuente de las correspondientes dos funciones-SH libres, para formar enlaces S-S, seguido por remoción convencional del producto a partir del soporte y procedimiento de purificación apropiado o (2) por remoción del polipéptido a partir del soporte junto con desprotección de cadena secundaria completa, seguida por oxidación de las funciones SH libres en solución acuosa altamente diluida.
El derivado cíclico conteniendo un enlace de amida intramolecular puede prepararse por síntesis de fase sólida convencional mientras se incorporan derivados de aminoácidos protegidos de cadena secundaria amino y carboxilo adecuados, en la posición seleccionada para ciclización. Los derivados cíclicos conteniendo enlaces alguilo -S- intramolecular puede prepararse por química en fase sólido convencional mientras se incorpora un residuo de aminoácidos con una cadena secundaria amino-protegida, y un residuo de cisteina u homocisteína S-protegido adecuado en la posición seleccionada para ciclización.
Otro enfoque efectivo para conferir resistencia a peptidasas actuando sobre los residuos terminal N o terminal C de un polipéptido es añadir grupos químicos en las terminales de polipéptido, tal que el polipéptido modificado no sea mas un sustrato para la peptidasa. Una tal modificación química es glicosilación de los polipéptidos en cualquiera o ambos términos. Ciertas modificaciones químicas, en particular glicosilación terminal N, se han mostrado incrementando la estabilidad de polipéptidos en suero humano (Powell et al., Pharm. Res. 10:1268-1273, 1993) . Otras modificaciones químicas que acrecientan estabilidad en suero incluyen, pero no se limitan a, la adición de un grupo alquilo terminal N, consistiendo de un alquilo inferior de uno a veinte carbonos, tal como un grupo acetilo, y/o la adición de una amida terminal C o grupo amida sustituido. En particular, la presente invención incluye polipéptidos modificados consistiendo de polipéptidos portando grupo acetilo terminal N y/o grupo amida terminal C.
También incluidos por la presente invención son otros tipos de derivados de polipéptido conteniendo fracciones químicas adicionales que normalmente no son parte del polipéptido, provisto que el derivado retenga la actividad funcional deseada del polipéptido. Ejemplos de tales derivados incluyen (1) derivados de N-acilo de la terminal amino o de otro grupo amino libre, donde el grupo acilo puede ser un grupo alcanoilo (v.gr., acetilo, hexanoilo, octanoilo) , un grupo aroilo (v.gr., benzoilo) o un grupo de bloqueo tal como F-moc (fluorenilmetil-0-CO- ) ; (2) ésteres de la terminal carboxi o de otro grupo carbóxi o hidroxilo libre; (3) amida de la terminal carboxi o de otro grupo carboxilo libre producido por reacción con amoniaco o con una amina adecuada; (4) derivados fosforilados; (5) derivados conjugados a un anticuerpo u otro ligando biológico y otros tipos de derivados .
Secuencias de polipéptidos mas largas que resultan de la adición de residuos de aminoácidos adicionales a los polipéptidos de la invención también se abarcan en la presente invención. Se esperaría que tales secuencias de polipéptidos mas largas tengan la misma actividad biológica (v.gr., ingresar a tipos de células particulares) como los polipéptidos descritos anteriormente. Aunque polipéptidos teniendo un número sustancial de aminoácidos adicionales no se excluyen, se reconoce que algunos polipéptidos largos pueden asumir una configuración que enmascara la secuencia efectiva, por ende previniendo ligadura a un objetivo (v.gr., un miembro de la familia de receptores LRP tal como LRP o LRP2) . Estos derivados podrían actuar como antagonistas competitivos. Por ende, aunque la presente invención abarca polipéptidos o derivados de los polipéptidos descritos en la presente teniendo una extensión, deseablemente la extensión no destruye la actividad de direccionamiento a células del polipép-tido o derivado.
Otros derivados incluidos en la presente invención son polipéptidos duales consistiendo de dos de los mismos, o dos polipéptidos diferentes de la presente invención enlazados de manera covalente entre sí ya sea directamente o a través de un separador, tal como por una extensión corta de residuos de alanina o por un sitio putativo para proteólisis (v.gr., por catepsina, ver v.gr., la patente US 5,126,249 y la patente europea 495 049) . Multímeros de los polipéptidos de la presente invención consisten de polímero de moléculas formadas a partir de los mismos o diferentes polipéptidos o derivados de los mismos.
La presente invención también presenta derivados de polipéptido que son proteínas quiméricas o de fusión conteniendo un polipéptido descrito en la presente, o fragmento del mismo, enlazado en su extremo terminal amino o carboxi, o ambos, a una secuencia de aminoácidos de una proteína diferente. Tal una proteína quimérica o de fusión puede producirse por expresión recombinante de un ácido nucleico codificando la proteína. Por ejemplo, una proteína quimérica o de fusión puede contener por lo menos 6 aminoácidos de un polipéptido de la presente invención y deseablemente tiene una actividad funcional equivalente o mayor que un polipéptido de la invención.
Derivados de polipéptido de la presente invención pueden hacerse mediante alterar las secuencias de aminoácidos por sustitución, adición, o supresión o un residuo de aminoácidos para proporcionar una molécula funcionalmente equivalente, o molécula funcionalmente acrecentada o disminuida, según se desee. El derivado de la presente invención incluye, pero no se limita a, aquellos conteniendo, como secuencia de aminoácidos primaria, todo o parte de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos descritos en la presente (v.gr., cualquiera una de las SEQ ID NOs : 1-105 y 107-112) incluyendo secuencias alteradas conteniendo sustituciones de residuos de aminoácidos funcionalmente equivalentes. Por ejemplo, uno o mas residuos de aminoácidos dentro de la secuencia se pueden sustituir por otro aminoácido de una polaridad similar que actúa como un equivalente funcional, resultando en una alteración silenciosa. La sustitución por un aminoácido dentro de la secuencia puede seleccionarse a partir de otros miembros de la clase a la cual pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen, arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen, leucina, isoleucina, alanina, fenilalanina, valina, prolina, triptofano y metionina. Los aminoácidos polares no cargados incluyen serina, treonina, cisteina, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido glutámico y ácido aspártico. El aminoácido glicina puede incluirse en ya sea la familia de aminoácidos no polares o la familia de aminoácidos polares (neutros) no cargados. Sustituciones hechas dentro de una familia de aminoácidos generalmente se entienden siendo sustitu-ciones conservadoras.
Ensayos para identificar peptidomiméticos Como se describe anteriormente, compuestos no de peptidilo generados para replicar la geometría de esqueleto y despliegue de farmacoforos (peptidomiméticos) de los polipéptidos identificados por los métodos de la presente invención frecuentemente posee atributos de mayor estabilidad metabólica, mayor potencia, mayor duración de acción y mejor bio-disponibilidad.
Los compuestos peptidomimétidos de la presente invención pueden obtenerse usando cualquiera de los numerosos enfoques en métodos de biblioteca de combinación conocidos en la materia, incluyendo: bibliotecas biológicas; bibliotecas en fase sólida o fase de solución paralelas dirigibles espacialmente; métodos de biblioteca sintética requiriendo desenvolvimiento; el método de biblioteca de "una perla-un compuesto"; y métodos de biblioteca sintéticos usando selección de cromatografía por afinidad. El enfoque de biblioteca biológica se limita a bibliotecas de polipéptido, mientras que los otros cuatro enfoques son aplicables a bibliotecas de compuestos de polipéptido, oligómero no de péptido o molécula pequeña (Lam, Anticancer Drug Des. 12:145, 1997). Ejemplos de métodos para la síntesis de bibliotecas moleculares pueden encontrarse en la materia, por ejemplo, en: DeWitt et al. [Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6909, 1993); Erb et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 : 11422, 1994); Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37:2678, 1994); Cho et al. (Science 261 : 1303, 1993); Carell et al. {Angew. Chem, Int. Ed. Engl. 33:2059, 1994 e ibid 2061); y en Gallop et al. (Med. Chem. 37:1233, 1994). Bibliotecas de compuestos pueden presentarse en solución (v.gr., Houghten, Biotechniques 13:412-421, 1992) o sobre perlas (Lam, Nature 354:82-84, 1991), hojuelas (Fodor, Nature 364:555-556, 1993), bacterias o esporas (patente US 5,223,409), plásmidos (Culi et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:1865-1869, 1992) o sobre fago (Scott y Smith, Science 249:386-390, 1990), o luciferasa, y el marcador enzimático detectado por determinación de conversión de un sustrato apropiado a producto.
Una vez que un polipéptido de la presente invención se identifica, puede ser aislado y purificado por cualquier número de métodos estándar incluyendo, pero no limitado a, solubilidad diferencial (v.gr., precipitación), centrifugación, cromatografía (v.gr., afinidad, intercambio de iones, exclusión de tamaño, y similares) o por cualquier otra técnica estándar usada para la purificación de polipéptidos , peptidomimétidos o proteínas. Las propiedades funcionales de un polipéptido identificado de interés puede evaluarse usando cualquier ensayo funcional conocido en la materia. Deseablemente, ensayos para evaluar función de receptor corriente abajo en señalización intracelular se usan (v.gr., proliferación celular) .
Por ejemplo, los compuestos peptidomiméticos de la presente invención pueden obtenerse usando el siguiente proceso de tres fases: (1) explorar los polipéptidos de la presente invención para identificar regiones de estructura secundaria necesarias para apuntar a los tipos de células particulares descritos en la presente; (2) usar sustitutos de dipéptido restringidos en cuanto a conformación para refinar la geometría de esqueleto y proporcionar plataformas orgánicas correspondientes a estos sustitutos; y (3) usar las mejores plataformas orgánicas para desplegar farmacoforos orgánicos en bibliotecas de candidatos designados para imitar la actividad deseada del polipéptido nativo. En mas detalle las tres fases son como sigue. En la fase 1, los polipéptidos candidatos líderes son explorados y su estructura puenteada para identificar los requerimientos para su actividad. Una serie de análogos de polipéptido del original son sintetizados. En la fase 2, los mejores análogos de polipéptido son investigados usando los sustitutos de dipéptido restringidos en cuanto a conformación. Aminoácidos indolizidin-2-ona, indolizidin-9-ona y quinolizidinona (I2aa, I9aa y Qaa) se usan como plataformas para estudiar geometría de esqueleto de los mejores candidatos de polipéptido. Estas y plataformas relacionadas (revisadas en Halab et al., Biopolymers 55:101-122, 2000; y Hanessian et al. Tetrahedron 53:12789-12854, 1997) pueden introducirse en regiones específicas del polipéptido, para orientar los farmacoforos en diferentes direcciones. Evaluación biológica de estos análogos identifican polipéptidos líderes mejorados que imitan los requerimientos geométricos para actividad. En la fase 3, las plataformas a partir de los polipéptidos líderes mas activos se usan para desplegar sustitutos orgánicos de los farmacóforos responsables para actividad del polipéptido nativo. Los farmacóforos y andamiajes se combinan en un formato de síntesis paralelo. Derivación de polipéptidos y las fases anteriores pueden lograrse por otros medios usando métodos conocidos en la materia.
Relaciones estructura función determinadas a partir de los polipéptidos, derivados de polipéptido, peptidomiméticos u otras moléculas pequeñas de la presente invención se pueden usar para refinar y preparar estructuras moleculares análogas teniendo propiedades similares o mejores. De manera acorde, los compuestos de la presente invención también incluyen moléculas que comparten la estructura, polaridad, características de carga y propiedades de cadena secundaria de los polipéptidos descritos en la presente .
En resumen, con base en la divulgación presente, los técnicos en la materia pueden desarrollar ensayos de clasificación de polipéptidos y peptidomimétidos que son útiles para identificar compuestos para dirigir un agente a tipos de células particulares (v.gr., aquellos descritos en la presente). Los ensayos de esta invención pueden desarrollarse para formatos de clasificación de bajo rendimiento, alto rendimiento, o rendimiento ultra-elevado. Ensayos de la presente invención incluyen ensayos que son receptivos a automatización.
Conjugados de Polipeptido Enlazados de Manera Covalente a Agentes Adicionales Los compuestos descritos en la presente, o derivados funcionales de los mismos, además de incluir una secuencia de aminoácidos que se enlaza de manera covalente a través de un aminoácido a un derivado de podofilotoxina (v.gr., un compuesto teniendo una estructura de acuerdo con la Fórmula (I)) o a doxorubicina o un derivado de doxorubicina (v.gr., un compuesto de la Fórmula (II)), puede también incluir un enlace covalente a otro agente (v.gr., otro agente terapéutico, un agente de diagnóstico, o a un marcador) . En ciertas formas de realización, la secuencia de aminoácidos también se enlaza a o se marca con un marcador detectable, tal como un agente de toma de imágenes de radio, para diagnóstico de una enfermedad o condición. Ejemplos de estos agentes incluyen un conjugado agente de toma de imágenes de radio-anticuerpo-vector, donde el anticuerpo se liga a un antigeno especifico de enfermedad o condición (v.gr., para diagnóstico o terapia) . Otras moléculas de ligadura también se contemplan por la invención. En otros casos, el compuesto de la invención, o un derivado funcional del mismo, se enlaza a otro agente terapéutico, para tratar una enfermedad o condición, o puede enlazarse a o marcarse con mezclas de los mismos. La enfermedad o condición puede tratarse mediante administrar un conjugado de vector-agente a un individuo bajo condiciones que permiten transporte del agente a través de la BBB o hacia un tipo de célula particular. Cada polipéptido puede incluir por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 7 agentes adicionales. En otras formas de realización, cada agente tiene por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 15, 20, o mas polipéptidos unidos al mismo. Los conjugados de la invención pueden ser capaces de promover acumulación (v.gr., debida a captación incrementada o remoción reducida) del agente en un tipo de célula particular o tejido tal como el cerebro, ovario, hígado, pulmón, riñon, bazo o músculo de un sujeto.
Un agente (v.gr., un derivado de podofilotoxina tal como un compuesto de la Fórmula (I) o doxorubicina o derivado de doxorubicina (v.gr., un compuesto de la Fórmula (II)), otro agente terapéutico, un agente de diagnóstico, o un marcador) gue tiene un enlace covalente a un aminoácido en cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en la presente (v.gr., aquellos listados en la Tabla 1, o derivados funcionales de los mismos) puede ser liberable a partir del vector después de transporte hacia un tipo de célula particular o a través de la BBB. El agente puede liberarse, por ejemplo, por disociación enzimática u otro rompimiento de un enlace químico entre el vector y el agente. El agente liberado puede entonces funcionar en su capacidad pretendida en ausencia del vector.
Otros métodos y reticuladores pueden usarse para conjuntar los polipéptidos y agentes de ARNi de la invención. Por ejemplo, una cadena de sentido de ARNsi conteniendo 5' o 3' tiol puede enlazarse a un enlace de disulfuro con un residuo de cisteína colocado en ya sea la terminal amino o carboxi del polipéptido. Muratovsksa et al. (FEBS Letters 558:63-68, 2004) y Turner et al. (Blood Cells, Molecules, and Diseases 38:1-7, 2007) proporcionan métodos de enlace químico ejemplares para conjugar polipéptidos a moléculas de ARN y son por ende incorporados por referencia .
Agentes Terapéuticos Un agente terapéutico puede ser cualquier agente biológicamente activo. Por ejemplo, un terapéutico puede ser un fármaco, una medicina, un agente emisor de radiación, una toxina celular (por ejemplo, un agente quimioterapéutico) , un fragmento biológicamente activo de los mismos para tratar una enfermedad (v.gr., para matar células de cáncer) o puede ser un agente para tratar una enfermedad o condición en un individuo. Derivados de podofilotoxina (v.gr., los compuestos de la Fórmula (I)) y doxorubicina y derivados de doxorubicina (v.gr., compuestos de la Fórmula (II)) son clases útiles ejemplares de agentes terapéuticos. Un agente terapéutico puede ser un producto sintético o un producto de origen fungal, bacteriano o de otro microorganismo (v.gr., micoplasma o virus), animal, tal como reptil, o de planta. Un agente terapéutico y/o fragmento biológicamente activo del mismo puede ser un agente enzimáticamente activo y/o fragmento del mismo, o puede actuar mediante inhibir o bloquear una trayectoria celular importante y/o esencial o mediante competir con un componente celular que aparece en la naturaleza importante y/o esencial. Otros agentes terapéuticos incluyen anticuerpos y fragmentos de anticuerpo.
Cualquier agente anti-cáncer conocido en la materia puede ser parte de un conjugado de la invención. Derivados de podofilotoxina (v.gr., los compuestos de la Fórmula (I)) y doxorubicina y derivados de doxorubicina (v.gr., compuestos de la Fórmula (II)) pueden ser agente anti-cáncer. Agentes anti-cáncer adicionales también pueden conjugarse con los compuestos de la invención como se describen en la presente. Cánceres del cerebro pueden tratarse con un conjugado conteniendo un vector que es transportado de manera eficiente a través de la BBB (v.gr., Angiopep-2, Angiopep-3, Angiopep-4a, Angiopep-4b, Angiopep-5, o Angiopep-6) . Cánceres de ovario, hígado, pulmón, riñon o bazo pueden tratarse con un agente anti-cáncer conjugado a un vector que se transporta de manera eficiente hacia el tipo de célula apropiado (v.gr., Angiopep-7) .
Actividades de conjugado Compuestos, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, que incluyen una secuencia de aminoácidos, donde la secuencia de aminoácidos se enlaza de manera covalente a través de un aminoácido a un derivado de podofilotoxina (v.gr., un compuesto teniendo una estructura de acuerdo con la Fórmula (I) ) o a doxorubicina o derivados de doxorubicina (v.gr., compuestos de la Fórmula (II)) puede lograr propiedades deseables, tales como farmacocinética alterada o distribución de tejido alterada (v.gr., entrega incrementada a tejidos o tipos de células particulares tales, como ovario, hígado, cerebro, pulmón, bazo, o riñon) con relación al agente biológicamente activo no conjugado. De manera acorde, los compuestos de la invención pueden usarse como vectores. Polipéptidos tales como Angiopep-3, Angiopep-4a, Angiopep-4b, Angiopep-5, y Angiopep-6 transportan de manera eficiente agentes a través de la BBB. Como Angiopep-2, estos polipéptidos también pueden ser capaces de dirigir agentes a otros tipos de células o tejidos (v.gr., ovario, hígado, pulmón, riñon, bazo, o músculo). El polipéptido Angiopep-7, el cual no se transporta de manera eficiente a través de la BBB, se transporta a tejidos particulares (v.gr., ovario, hígado, pulmón, riñon, bazo, o músculo) . Esta actividad puede ser útil donde transporte a través de la BBB no se desea. Por ejemplo, el uso de un compuesto de la invención puede incrementar la concentración del agente terapéutico en el tejido objetivo por cualquiera de 10%-20,000% con relación a aquel observado en el agente biológicamente activo no conjugado (por ejemplo, etopósido, fosfato de etopósido, etopósidoD G, tenipósido, doxorubicina, o epirubici-na) .
Debido a que los compuestos de la invención pueden transportar agentes a tejidos específicos, agentes conjugados pueden resultar en menor toxicidad (v.gr., menores efectos secundarios), mayor eficacia (v.gr., debido a que el agente se concentra en un tejido objetivo debido a captación incrementada o eflujo disminuido a partir del tejido o debido a que el agente tiene mayor estabilidad cuando se conjuga) , o combinaciones de los mismos. Tales actividades se describen mas adelante y en la publicación internacional O 2007/009229, por ende incorporada por referencia.
En algunos casos, conjugación de un agente a un vector permite que el agente escape la acción de P-glicoproteína (P-gp), una bomba de eflujo capaz de expulsar ciertos agentes de una célula. Mediante disminuir la habilidad de P-gp para expulsar un agente de una célula, la potencia de ese agente en una célula se puede incrementar. Estos conjugados pueden por ende inhibir de manera activa proliferación de células de cáncer. Mas aun, resultados obtenidos para crecimiento de tumores in vivo indican que los vectores de la invención pueden apuntar al receptor LRP. También, conjugación puede modificar la farmacocinética o bio-distribución del agente no conjugado.
Tomados juntos, conjugados pueden usarse contra tumores primarios incluyendo cánceres de ovario, pecho, pulmón, y piel asi como metástasis originándose a partir de tumores primarios. Métodos de tratamiento La invención también presenta métodos de tratamiento usando los compuestos de la invención, o composiciones farmacéuticas de las mismas, descritas en la presente. Los compuestos de la invención (v.gr., compuestos que incluyen una secuencia de aminoácidos que es enlazada de manera covalente a través de un aminoácido a un derivado de podofilotoxina tal como un compuesto de la Fórmula (I) o a doxorubicina o derivados de doxorubicina (v.gr., compuestos de la Fórmula (II)) que son transportados eficientemente a través de la BBB (v.gr., Angiopep-2, Angiopep-3, Angiopep-4a, Angiopep-4b, Angiopep-5, y Angiopep-6) pueden usarse para tratar cualquier enfermedad del cerebro o sistema nervioso central. Enfermedades neurológicas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, cánceres del cerebro tales como un tumor cerebral, un tumor de la médula espinal (v.gr., cordoma) , y una metástasis cerebral .
Tumores del cerebro pueden ser tumores cerebrales metastásicos primarios. Tumores cerebrales que se originan en el cerebro son tumores cerebrales primarios. Tumores cerebrales ocasionados por el esparcimiento de cáncer desde otro punto en el cuerpo (v.gr., pulmón, pecho, melanoma, colon, riñon, y otros cánceres) son tumores cerebrales metastásicos. Categorías ejemplares de tumores, como se describen por su ubicación en el cerebro, incluyen tumores de tronco encefálico, tumores de ángulo cerebelopontino (v.gr., tumores de nervio acústico), tumores de hemisferio cerebral, tumores de lóbulo frontal, tumores de lóbulo parietal, tumores de región pineal, tumores de lóbulo occipital, tumores de lóbulo temporal, tumores sub-corticales, tumores de cerebro meningeales, tumores de línea media (v.gr., craniofarin-gioma, glioma del nervio óptico, y tumores del tálamo y áreas selares) , tumores de fosa posterior (v.gr., tumores del cuarto ventriculo, y tumores cerebelares) .
Tumores cerebrales ejemplares incluyen neuroma acústico (neurilemoma, schwanoma, neurinoma) , adenoma, astrocitoma (V.gr., astrocitomas pilocíticos juveniles, astrocitomas de células gigantes sub-ependimales , astrocitoma gemistocitico, astrocitoma anaplástico, astrocitoma maligno, glioblastoma multiforme, y gliosarcoma) , glioma del tronco encefálico que puede ser anastrocitoma, astrocitoma anaplástico, glioblastoma multiforme, o un tumor mixto, papiloma del plexus coroide, linfoma del SNC, ependimoma (v.gr., ependimoma anaplástico), gangliocitoma, ganglioglioma, glioma, glioblastoma multiforme, meduloblastoma (mdl), meningioma anaplástico (maligno), glioma mixto, neurofi-bromatosis (enfermedad de von Recklinghausen) , oligodendroglioma, y glioma del nervio óptico (v.gr., astrocitoma pilocitico) .
Conjugados también pueden transportarse de manera eficiente al hígado, ovario, pulmón, riñon, bazo o músculo y por lo tanto también pueden usarse, en conjunto con un agente terapéutico apropiado, para tratar una enfermedad asociada con estos tejidos (v.gr., un cáncer). Debido a que Angiopep-7 no se transporta de manera eficiente al cerebro, pero se transporta de manera eficiente a tejidos y células tales como hígado, pulmón, riñon, bazo y músculo, compuestos de la invención que incluyen Angiopep-7 pueden ser especialmente bien adecuados como tratamiento de vector de enfermedades asociadas con estos tejidos cuando el direccionamiento del agente al cerebro no se desea.
Enfermedades ejemplares del hígado incluyen carcinoma hepatocelu-lar (hepatoma) y cáncer del hígado. Enfermedades pulmonares ejemplares incluyen cánceres de pulmón tales como carcinoma de células pequeñas' (v.gr., cáncer de células de avena), carcinoma mixto de células pequeñas/células grandes, carcinoma de células pequeñas combinado, y tumores metastásicos . Tumores metastásicos pueden originarse a partir de cáncer de cualquier tejido, incluyendo cáncer de pecho (v.gr., carcinoma de pecho metastási-co) , cáncer de colon, cáncer de próstata (v.gr., carcinoma de próstata metastásico) , sarcoma, cáncer de vejiga, neuroblastoma, y tumor de Wilms (nefroblastoma) . Enfermedades del bazo incluyen cánceres tales como linfoma, linfoma no de Hodgkin y ciertos linfornas de células T.
Cánceres ejemplares adicionales que pueden tratarse usando un conjugado o composición de la invención incluyen cáncer de pecho, cánceres de la cabeza y el cuello incluyendo varios lin ornas tales como linfoma de células de manto, adenoma, carcinoma de células escuamosas, carcinoma laringeal, cánceres de la retina, cánceres del esófago, mieloma múltiple, cáncer de los ovarios (v.gr., tumores de células germinales de ovarios y carcinoma de ovarios), cáncer uterino, melanoma, cáncer colorrec-tal, cáncer de la vejiga, cáncer de próstata, cáncer de pulmón (incluyendo carcinoma de pulmón de células pequeñas y carcinoma de pulmón de células no pequeñas) , cáncer pancreático, cáncer cervical, cáncer de la cabeza y el cuello, cánceres de la piel, carcinoma nasofaríngeo, liposarcoma, carcinoma epitelial, carcinoma de células renales, adenocarcinoma de vesícula biliar, adenocarcinoma parótido, sarcoma endometrial, cánceres resistentes a múltiples fármacos; y enfermedades y condiciones prolifera-tivas, tales como neovascularización asociada con angiogénesis de tumores, degeneración macular (v.gr., ADM húmeda/seca) , neovascularización corneal, retinopatía diabética, glaucoma neovascular, degeneración miópica y otras enfermedades y condiciones prolife-rativas tales como restenosis y enfermedad de pulmón policística.
Como se describe en la presente, cánceres del cerebro que pueden ser tratados con los compuestos o las composiciones de la invención que son transportados de manera eficiente a través de la BBB incluyen astrocitoma, astrocitoma pilocítico, tumor neuroepitelial disembioplástica, oligodendrogliomas, ependimoma, glioblastoma multiforme, gliomas mixtos, oligoastrocitomas , meduloblastoma, retinoblastoma, neuroblastoma, germimoma, y teratoma. Otros cánceres ejemplares que pueden ser tratados con los compuestos o composiciones de la invención incluyen micosis fungoides (también conocida como síndrome de Alibert-Bazin o granuloma fungoides) , enfermedad de Hodgkin (linfoma de Hodgkin) , leucemia mielogenosa aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielogenosa crónica, sarcoma de Kaposi relacionado con síndrome de inmuno-deficiencia adquirida (SIDA) , linfoma no de Hodgkin relacionado con SIDA, tumores trofoblásticos gestacionales, sarcoma de Ewing, rabdomiosarcoma, cáncer de pecho avanzado refractorio, cáncer testicular (v.gr., tumor maligno de los testes, neoplasma testicular refractorio, y carcinoma de tumor de células germinales testiculares ) , neoplasmas malignos avanzados refractorios, linfoma de células B grandes difusas, osteosarcoma, linfoma de Burkitt, leucemia linfocitica aguda adulta, leucemia de Burkitt, neoplasmas mediastinales, linfoma linfoblástico, linfoma anaplástico de células grandes, neoplasma de células de plasma .
Un compuesto o composición de la invención se puede administrarse por cualquier medio conocido en la materia, v.gr., oralmente, intra-arterialmente, intra-nasalmente, intra-perito-nealmente, intra-venosamente, intra-muscularmente, sub-cutánea-mente, trans-dérmicamente, o per os al sujeto. El agente puede ser, por ejemplo, un compuesto anti-angiogénico .
Terapias de Combinación Los compuestos de la invención pueden administrarse de manera concurrente con otros agentes terapéuticos u otros regímenes terapéuticos. En algunas formas de realización, el agente o agentes terapéuticos adicionales también pueden un enlace covalente a los polipéptidos, o derivados de los mismos, descritos en la presente (v.gr., los polipéptidos de la Tabla 1 y derivados de los mismos) . En otras formas de realización, el agente o agentes terapéuticos adicionales no se enlazan de manera covalente a los polipéptidos descritos en la presente. Regímenes terapéuticos y agentes terapéuticos ejemplares que pueden usarse en terapia de combinación con los compuestos de la invención incluyen, pero no se limitan a: terapia de radiación, quimioterapia, quimioterapia de alta dosis, trasplante de células madre (v.gr., trasplante de células madre autólogas) , trasplante de médula ósea, cirugía, cirugía para remover tumores, tratamiento de hipertermia, cisplatina, irinotecano, hidrocloruro de irinotecano, carboplatina, clorambucilo (Leukeran) , tositumomab (Bexxar) , rituximab (Rituxan y abThera) , bleomicina, vincristi-na, vinblastina, ciclofosfamida, procarbazina, mitoxantrona, prednisona, prednisolona, gemcitabina (Gemzar) , paclitaxel (Taxol) , ifosfamida, metotrexato, doxorubicina (Adriamycin) , dexametasona, ciclosporina, Rad-001 (Certican) , citarabina (Ara-C) , daunorubicina, fludarabina, idarubicina, vorinostat (SAHA) , niacinamida, AZD2171, mitotano, Gemtuzumab ozogamicina (Mylo-targ) , mitoxantrona, clofarabina, asparaginasa, mercaptopurina, factor estimulante de colonia de granulocitos (G-CSF o GCSF) , vindesina, tioguanina, VM26, VP16, dacarbazina, dactinomicina, temozolomida, tiotepa, hidrocloruro de epirubicina, carmustina, fligrastim, docetaxel, gefitinib, o sales farmacéuticamente aceptables de las mismas, o cualquier combinación de las mismas.
Los segundos agentes terapéuticos usados en los métodos descritos en la presente pueden también ser un polipéptido que incluye o que consiste de la secuencia de Angiopep-2 (SEQ ID NO: 97), de preferencia donde el Angiopep-2 se conjuga a un agente anti-cáncer (v.gr., paclitaxel). Un agente terapéutico ejemplar que puede usarse en combinación con cualquiera de los compuestos descritos en la presente es ANG1005, el cual tiene la siguiente estructura : ANG1005: TxlAn2 (conjugado 3:1) Aun otros agentes terapéuticos segundos ejemplares son descritos en la patente US 7,557,182, incorporada en la presente por referencia .
Composiciones farmacéuticas Composiciones farmacéuticas de la invención incluyen un compuesto de la invención como se describe en la presente, en asociación con un portador f rmacéuticamente aceptable. Tales composiciones son líquidos o liofilizadas o de otra manera formulaciones secas e incluyen diluyentes de contenido de varios reguladores (v.gr., Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y resistencia iónica, aditivos tales como albúmina o gelatina para prevenir absorción a superficies, detergentes (v.gr., Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sales de ácido biliar) . Agentes de solubilización (v.gr., glicerol, polietileno glicerol) , anti-oxidantes (v.gr., ácido ascórbico, metabisulfito de sodio), conservadores (v.gr., timerosal, alcohol bencílico, parabenos), sustancias de volumen o modificadores de tonicidad (v.gr., lactosa, manitol), unión covalente de polímeros tales como polietileno glicol a la proteína, formación de complejos con iones de metal, o incorporación del material hacia o sobre preparaciones de partículas de compuestos de polímero tales como poli (ácido láctico), poli (ácido glicólico) , hidrogeles, etc., o sobre liposomas, micro-emulsiones, micelas, vesículas unilamelares o multilamelares, fantasmas de eritrocitos, o esferoplastos . Tales composiciones tendrán influencia sobre el estado físico, solubilidad, estabilidad, tasa de liberación in vivo, y tasa de eliminación in vivo. Composiciones de liberación controlada o sostenida incluyen formulación en depósitos lipófilos (v.gr., ácidos grados, ceras, aceites). También comprendidos por la invención son composiciones en partículas revestidas con polímeros (v.gr., poloxámeros o poloxaminas) . Otras formas de realización de las composiciones de la invención incorporan revestimientos protectores en formas de partículas, inhibidores de proteasa o mejoradores de permeación para varias rutas de administración, incluyendo rutas parentera-les, pulmonares, nasales, orales, vaginales, rectales. En una forma de realización la composición farmacéutica se administra parenteralmente, para-cranialmente, trans-mucosalmente, trans-dérmicamente, intra-muscularmente, intra-venosamente, intra-dérmicamente, sub-cutáneamente, intra-peritonealmente, intra-ventricularmente, intra-cranialmente, e intra-tumoralmente .
Portadores farmacéuticamente aceptables además incluyen regulador de fosfato 0.01-0.1 o 0.05 M o solución salina al 0.8%. Adicionalmente , tales portadores farmacéuticamente aceptables pueden ser soluciones acuosas o no acuosas, suspensiones, y emulsiones. Ejemplos de solventes no acuosos son propileno glicol, polietileno glicol, aceites vegetales tales como aceite de olivo, ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Portadores acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo medios de solución salina y regulados. Vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer lactada o aceites fijos. Vehículos intravenosos incluyen restablecedores de fluidos y nutrientes, restablecedores de electrolitos tales como aquellos a base de dextrosa de Ringer, y similares. Conservadores y otros aditivos también pueden estar presentes, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes de cotejo, gases inertes y similares .
Otras formulaciones incluyen poli (ésteres de oxietileno de un ácido graso) (v.gr., ácido 12-hidroxiesteárico) tales como Solutol HS15. Por ende, en algunas formas de realización, una composición farmacéutica puede comprender a) un conjugado descrito en la presente, b) Solutol HS15 y c) una solución acuosa o regulador (v.gr., solución de Ringer/Hepes a un pH de 5 a 7). La concentración de Solutol HS15 en la formulación puede ser por lo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, o 60% (v.gr., 30%) o dentro de cualquier rango entre cualesquiera dos de estos números. La concentración de conjugado puede determinarse con base en la dosis requerida para tratar de manera eficiente a un sujeto, o la cantidad de éster requerido para solubilidad del conjugado siendo administrado. El uso de Solutol en una formulación para administración de un conjugado de Taxol se describe, por ejemplo, en la publicación internacional WO 2007/009229, por ende incorporada por referencia.
Composiciones parenterales La composición farmacéutica puede administrarse parenteralmente por inyección, infusión, o implantación (subcutánea, intravenosa, intramuscular, intra-peritoneal , o similares) en formas de dosificación, formulaciones, o mediante dispositivo o implantes de entrega adecuados conteniendo portadores y adyuvantes farmacéuticamente aceptables no tóxicos, convencionales. La formulación y preparación de tales composiciones son bien conocidas por los técnicos en la materia de formulación farmacéutica.
Composiciones para uso parenteral pueden ser provistas en formas de dosificación unitaria (v.gr., en ampollas de una sola dosis) , o en frascos conteniendo varias dosis y en las cuales un conservador adecuado puede añadirse (ver mas adelante) .
La composición puede estar en la forma de una solución, una suspensión, una emulsión, un dispositivo de infusión, o un dispositivo de entrega para implantación, o puede presentarse como un polvo seco para ser reconstituido con agua u otro vehículo adecuado antes del uso. Además de los agentes activos, la composición puede incluir portadores y/o excipientes parenteralmente aceptables adecuados. Los agentes activos pueden incorporarse en micro-esferas, micro-cápsulas, nano-partículas, liposomas, o similares para liberación controlada. Mas aun, la composición puede incluir agentes de suspensión, agentes de solubilización, agentes de estabilización, agentes de ajuste de PH, agentes de ajuste de tonicidad, y/o agentes de dispersión.
Como se indica anteriormente, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención pueden estar en la forma adecuada para inyección estéril. Para preparar tal una composición, los agentes activos adecuados se disuelven o suspenden en un vehículo líquido parenteralmente aceptable. Entre vehículos y solventes aceptables que pueden emplearse están agua, agua ajustada a un pH adecuado por adición de una cantidad apropiada de ácido clorhídrico, hidróxido de sodio o un regulador adecuado, 1, 3-butanodiol, solución de Ringer, solución de dextrosa, y solución isotónica de cloruro de sodio. La formulación acuosa también puede contener uno o mas conservadores (v.gr., p-hidroxibenzoato de metilo, etilo o n-propilo) . En casos donde uno de los compuestos es solo escasamente o ligeramente soluble en agua, un agente mejorador o solubilizador de disolución puede añadirse, o el solvente puede incluir 10-60% peso/peso de propileno glicol o similares.
La administración de una composición o formulación parenteral que incluye un compuesto de la invención puede administrarse a un paciente sobre un periodo de tiempo que es, por ejemplo, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, o 120 minutos o, por ejemplo, sobre 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, o 5.0 horas .
Composiciones parenterales de liberación controlada Composiciones parenterales de liberación controlada pueden estar en la forma de suspensiones acuosas, micro-esferas, micro-cápsulas, micro-esferas magnéticas, soluciones de aceite, suspensiones de aceite, o emulsiones. La composición también se puede incorporar en portadores bio-compatibles, liposomas, nano-particulas, implantes, o dispositivos de infusión.
Materiales para uso en la preparación de micro-esferas y/o micro-cápsulas son, v.gr., polímeros bio-degradables/bio-erosibles tales como poligalactina, poli (cianoacrilato de isobutilo) , poli (2-hidroxietil L-glutamina) , poli (ácido láctico) , poli (ácido glicólico) , y mezclas de los mismos. Portadores bio-compatibles que pueden usarse cuando se formulan una formulación parenteral de liberación controlada son carbohidratos (v.gr., dextranos) , proteínas (v.gr., albúmina), lipoproteínas, o anticuerpos. Materiales para uso en implantes puede ser no biodegradable (v.gr., polidimetil siloxano) o biodegradable (v.gr., poli (caprolactona) , poli (ácido láctico), poli (ácido glicólico) o poli (orto ésteres) ) o combinaciones de los mismos. Formas de Dosificación Sólidas para Uso Oral Formulaciones para uso oral incluyen tabletas conteniendo los ingredientes activos en una mezcla con excipientes farmacéuticamente aceptables no tóxicos, y tales formulaciones se conocen por los técnicos en la materia (v.gr., patentes US 5,817,307, 5,824,300, 5,830,456, 5,846,526, 5,882,640, 5,910,304, 6,039,949, 6,372,218, por ende incorporadas por referencia). Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes o rellenos inertes (v.gr., sacarosa, sorbitol, azúcar, manitol, celulosa micro-cristalina, almidones incluyendo almidón de papa, carbonato de calcio, cloruro de sodio, lactosa, fosfato de calcio, sulfato de calcio, o fosfato de sodio) ; agentes de granulación y desintegración (v.gr., derivados de celulosa incluyendo celulosa micro-cristalina, almidones incluyendo almidón de papa, croscar-melosa sódica, alginatos, o ácido alginico) ; agentes aglutinantes (v.gr., sacarosa, glucosa, sorbitol, acacia, ácido alginico, alginato de sodio, gelatina, almidón, almidón pre-gelatinizado, celulosa micro-cristalina, silicato de magnesio y aluminio, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropil metilcelulosa, etilcelulosa, polivinilpirrolidona, o polietileno glicol) ; y agentes lubricantes, deslizantes, y anti-adhesivos (v.gr., estearato de magnesio, estearato de zinc, ácido esteárico, sílices, aceites vegetales hidrogenados, o talco) . Otros excipientes farmacéuticamente aceptables pueden ser colorantes, agentes saborizantes, plastificantes, humectantes, agentes reguladores, y similares.
Las tabletas pueden ser no revestidas o pueden ser revestidas por técnicas conocidas, opcionalmente para retrasar desintegración y absorción en el tracto gastro-intestinal y por ende proporcionar una acción sostenida sobre un periodo mas largo. El revestimiento puede adaptarse para liberar al agente en un patrón predeterminado (v.gr., para lograr una formulación de liberación controlada) o puede adaptarse no para liberar al agente hasta después del pasaje del estómago (revestimiento entérico) . El revestimiento puede ser revestimiento de azúcar, un revestimiento de película (v.gr., con base en hidroxipropil metilcelulosa, metilcelulosa, metil hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa, co-polímeros de acrilato, polietileno glicoles, y/o polivinilpirrolidona) , o un revestimiento entérico (v.gr., con base en co-polímero de ácido metacrílico, acetato ftalato de celulosa, ftalato de hidroxipropil metilceluluosa, acetato succinato de hidroxipropil metilcelulosa, ftalato de poli (acetato de vinilo) , goma laca, y/o etilcelulosa) . Mas aun, un material de retraso de tiempo tal como, v.gr., monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, puede emplearse.
Las composiciones de tableta sólida pueden incluir un revestimiento adaptado para proteger la composición de cambios químicos no deseados (v.gr., degradación química previo a la liberación de las sustancias activas) . El revestimiento puede aplicarse sobre la forma de dosificación sólida en una manera similar como aquella descrita en Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, supra. composiciones de la invención pueden mezclarse juntas en la tableta, o pueden particionarse . En un ejemplo, un primer agente se contiene en el interior de la tableta, y un segundo agente está en el exterior, tal que una porción sustancial del segundo agente se libere previo a la liberación del primer agente.
Formulaciones para uso oral también pueden presentarse como tabletas masticables, o como cápsulas de gelatina duras en donde el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido inerte (v.gr., almidón de papa, lactosa, celulosa micro-cristalina, carbonato de calcio, fosfato de calcio, o caolín) , o como cápsulas de gelatina suave en donde el ingrediente activo se mezcla con agua o un medio de aceite, por ejemplo, aceite de maní, parafina líquida, o aceite de olivo. Polvos y granulados pueden prepararse usando los ingredientes anteriormente mencionados bajo tabletas y cápsulas en una manera convencional usando, v.gr., un mezclador, un aparato de lecho fluido, o equipo de secado por rocío.
Regímenes de Dosificación La dosificación de cualquier compuesto, conjugado, o composición descrita en la presente o identificada usando los métodos descritos en la presente depende de varios factores, incluyendo: el método de administración, la enfermedad (v.gr., cáncer) a ser tratada, la severidad de la enfermedad, si el cáncer va a ser tratado prevenido, y la edad, peso, y salud del sujeto a ser tratado.
Con respecto a los métodos de tratamiento de la invención, no se tiene la intención de que la administración de un vector, conjugado, o composición a un sujeto se limite a un modo de administración, dosificación, o frecuencia de dosificación particulares; la invención contempla todos los modos de administración. El conjugado, o composición puede administrarse al sujeto en una sola dosis o en múltiples dosis. Por ejemplo, un compuesto conjugado descrito en la presente o identificado usando métodos de clasificación de la invención puede ser administrado, por ejemplo, una vez a la semana por, v.gr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, o mas semanas. Un compuesto de la invención también puede administrarse, por ejemplo, diariamente por 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 7 días o por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, o mas semanas .
Periodos de tiempo durante los cuales el compuesto de la invención se administra pueden seguirse o precederse por periodos de tiempo durante los cuales el compuesto no se administra. Por ejemplo, después de administración del compuesto como se describe en la presente, el compuesto de la invención no se administra al paciente por 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 7 días o por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, o mas semanas. En algunas formas de realización, el paciente puede recibir otros agentes terapéuticos durante dicho periodo de tiempo. Estos ciclos de quimioterapia que incluyen un periodo de tiempo durante el cual el compuesto de la invención se administra a un paciente que es seguido por un periodo de tiempo durante el cual el compuesto de la invención no se administra a dicho paciente puede repetirse como sea médicamente necesario (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 veces).
Se entenderá que, para cualquier sujeto particular, regímenes de dosificación específicos deberán ajustarse con el tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional de la persona administrando o supervisando la administración del vector, conjugado, o composición. Por ejemplo, la dosificación de un conjugado puede incrementarse si la dosis menor no proporciona actividad suficiente en el tratamiento de una enfermedad o condición descrita en la presente (v.gr., cáncer) . Por el contrario, la dosificación del compuesto puede disminuirse si la enfermedad (v.gr., cáncer) se reduce o elimina.
Aunque el médico que atiende finalmente decidirá la cantidad apropiada y el régimen de dosificación, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto, vector, conjugado, o composición descrita en la presente puede estar, por ejemplo, en el rango de 0.0035 pg a 20 pg/kg de peso corporal/día o 0.010 pg a 140 pg/kg de peso corporal/semana. Deseablemente, una cantidad terapéuticamente efectiva está en el rango de 0.025 pg a 10 pg/kg, por ejemplo, al menos 0.025, 0.035, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, o 9.0 pg/kg de peso corporal administrados diariamente, cada otro día, o dos veces a la semana. Además, una cantidad terapéuticamente efectiva puede estar en el rango de 0.05 pg a 200 pg/kg, por ejemplo, por lo menos 0.05, 0.7, 0.15, 0.2, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 10.0, 12.0, 14.0, 16.0, o 18.0 pg/kg de peso corporal administrados semanalmente, cada otra semana, o una vez al mes. Mas aun, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto puede estar, por ejemplo, en el rango de 0.100 mg/m2 a 2,000 mg/m2 administrados cada otro dia, una vez a la semana, o cada otra semana. En una forma de realización deseable, la cantidad terapéuticamente efectiva está en el rango de 1 mg/m2 a 1, 000 mg/m2, por ejemplo, por lo menos 100, 150, 400, u 800 mg/m2 del compuesto administrados diariamente, cada otro dia, dos veces a la semana, semanalmente, o cada otra semana.
Por ejemplo, los compuestos de la invención (v.gr., compuesto (I)) pueden usarse para administrar derivados de podofilotoxina (v.gr., un compuesto de la Fórmula (I) tal como etopósido, fosfato de etopósido, etopósidoDMG, y tenipósido) o para administrar doxorubicina o derivados de doxorubicina (v.gr., - incompuesto (2) o un compuesto de la invención que incluye un compuesto de la Fórmula (II)) a un paciente usando cualquiera de los métodos de administración, cantidades de dosificación, y programas de dosificación descritos en la presente. Debido a que los compuestos de la invención pueden incluir enlaces covalentes a, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, o 5 moléculas de un derivado de podofilotoxina tal como aquellos de la Fórmula (I) (v.gr., etopósido, fosfato de etopósido, etopósidoDMG, y tenipósido) o de la Fórmula (II) (v.gr., doxorubicina o epirubicina) , esta estequiometria puede usarse para calcular y para ajustar la cantidad de dosificación a ser administrada ("dosis equivalente") . Por ejemplo, el conjugado Etopósido: Angiopep-2 (3:1) ("Etop-An2 (3-1) ") tiene un peso molecular de 4,354 g/mol, con el contenido de etopósido tomando en cuenta por 40% del peso molecular. De manera similar, el conjugado Doxorubicina : Angiopep- 2 (3:1) tiene un peso molecular de 4,178 g/mol, con la doxorubicina tomando en cuenta por 40% del peso molecular. Usando esta información, la cantidad de un compuesto de la invención que se incluye en una composición para administración, (v.gr., parente-ral u oral) puede calcularse para administrar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, o 500 mg/m7día de un derivado de podofilotoxina (v.gr., etopósido, fosfato de etopósido, etopósidoDMG, y etopósido) a un paciente. Esta dosificación puede administrarse a un paciente diariamente por 2, 3, 4, 5, 6, o 7 días. El periodo de administración puede seguirse por 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 7 días o por 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 semanas de descanso sin administración de un compuesto de la invención, con el ciclo de periodos de administración/periodos de descanso repetido por, v.gr., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 veces adicionales .
Los compuestos de la invención (v.gr., Compuestos (1) y (2), o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos) puede mostrar propiedades fisicoquímicas y farmacéuticas relativas al agente terapéutico no conjugado respectivo (v.gr., etopósido, etopósido 4-dimetilglicina, o doxorubicina) . Por ejemplo, direccionamiento incrementado de tipos de células ejemplares, tejidos, u órganos como se describe en la presente (v.gr., cerebro, ovarios, hígado, pulmón, riñon, bazo, o músculo) permite para dosis sub-terapéuticas del compuesto (v.gr., Compuestos (1) o (2) ) a ser administrado a un paciente. Compuestos de la invención también pueden exhibir toxicidad reducida con relación al agente terapéutico no conjugado respectivo y por ende permitir para que dosis super-terapéuticas del compuesto sean administradas a un paciente. Por ejemplo, doxorubicina no conjugada se administra típicamente en programas de dosis que varían de 60-75 mg/m2 cuando se administra solo como una sola inyección intravenosa o de 40-50 mg/m2 cuando se administra en combinación con otro agente quimioterapéutico. Programas de dosis típicos para etopósido o fosfato de etopósido no conjugados pueden variar de 1-5 mg/m2/día, 1-50 mg/m2/día, 35-50 mg/m2/día, o 50-100 mg/m2/día. Direccionamiento mejorado de tipos de células, tejidos, u órganos por los compuestos de la invención (v.gr., Compuestos (1) o (2)) pueden permitir para dosis reducidas del agente terapéutico con relación a aquellos usados para el agente terapéutico no conjugado correspondiente ("dosis sub-terapéuticas", es decir, una dosis efectiva que es, por ejemplo, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1, 000, 2, 000, 3, 000, 4,000, o 5,000 veces menos que la dosis efectiva mínima del agente terapéutico no conjugado correspondiente) . Toxicidad reducida que puede asociarse con los compuestos de la invención (v.gr., Compuestos (1) o (2)) puede permitir para que dosis incrementadas sean administradas de manera segura a un paciente con relación a aquellas usadas para el agente terapéutico no conjugado correspondiente ("dosis super-terapéuticas", es decir, una dosis efectiva que es, por ejemplo, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1, 000, 2, 000, 3, 000, 4,000, o 5,000 veces mayor que la dosis permitida máxima del agente terapéutico no conjugado. De manera similar, propiedades fisicoquimicas mejoradas también pueden afectar las dosis administradas a un paciente. Por ejemplo, solubilidad mejorada puede permitir para la administración de dosis sub-terapéuticas. Estas características farmacéuticas fisicoquímicas pueden permitir para la administración segura de los compuestos de la invención (v.gr., Compuestos (1) o (2)) a, por ejemplo, poblaciones de pacientes pediátricos o geriátricos.
Los siguientes ejemplos tienen la intención de ilustrar, en lugar de limitar, la invención.
Ejemplos Ejemplo 1: Síntesis de un Conjugado 3:1 de Etopósido :Angiopep-2 La síntesis de los compuestos de la invención puede lograrse por la combinación de un derivado de podofilotoxina (v.gr., un compuesto de la Fórmula (I) tal como etopósido, fosfato de etopósido, etopósidoDMG, o tenipósido) , un grupo de enlace hidrolizable difuncional (v.gr., un ácido dicarboxílico o un diisocianato) , y cualquier secuencia de aminoácidos descrita en la presente, o un derivado funcional de la misma. Variación de los equivalentes del intermediario de podofilotoxina derivado (v.gr., 2"-glutaril etopósido) con relación al polipéptido puede permitir la síntesis de conjugados de polipéptido con diferentes estequiometrías (por ejemplo, "Etop-An2 ( 1 : 1) " o "Eto-An2 (1:1)", donde una molécula de etopósido se liga al polipéptido Angiopep-2) .
El esquema 5 muestra la síntesis de un compuesto que incluye un polipéptido Angiopep-2 enlazado de manera covalente a tres moléculas de etopósido ("Etop-An2 (3:1)" o "Eto-An2 (3:1)") . (2 "-Glutaril) -Etopósido. A una solución de etopósido (10 g, 17 mmol) en CHC13 (120 mL) se añadió anhídrido glutárico (3.13 g, 27.4 mmol) y DMAP (115 mg, 0.942 mmol). Después de 72 horas a temperatura ambiente, la mezcla se evaporó y se purificó por cromatografía de fase inversa usando una columna de poliesti-reno/DVB (15 a 35% de acetonitrilo (ACN) en H20, sin ácido trifluoroacético (TFA) ) . HPLC del producto crudo mostró una mezcla de regio-isómeros 2"-Glutaril Etopósido (2"-glu-Etop) y 3"-Glutaril Etopósido (3"-glu-Etop) en una relación 2:1. Después de evaporación y liofilización, (2"-Glutaril) -Etopósido se obtuvo como un polvo blanco (4.1 g, 34%). El (3"-glutaril) -etopósido regio-isoraérico también se aisló como un sólido blanco (2.4 g, 20%) . Las purezas de 2"-glu-Etop y 3"-glu-Etop se determinaron por RP-HPLC. Usando una columna MetaChem Taxsil-3 y elución de gradiente (1 mL/min; 10% a 65% (0.05% TFA en H2O):(0.05% TFA en ACN) durante 15 minutos) , 2"-glu-Etop tiene un tiempo de retención de 9.00 minutos y 3"-glu-Etop tiene un tiempo de retención de 9.42 minutos. La pureza de 2"-glu-Etop (tiempo de retención = 9.00 minutos) fue >98% (99.4%) y la pureza de 3"-glu-Etop fue >98% (99.6%) . ( (2"-Glutaril) -Etop)3- (Angiopep-2) (Etop-An2 (3:1)). A una solución de (2"-Glutaril) -Etopósido (2.83 g, 4.025 mmol) en DMF anhidro (400 mL) se añadió trietilamina (Et3N; 0.84 mL, 6.037 mmol) y tetrafluoroborato de N, N, N' , ' -tetrametil-O- (benzotriazol-l-il ) uronio (TBTU; 1.32 g, 4.682 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 1 hora (pH = 9.3). Una solución de AN2 (Angiopep-2, 75% en contenido, 3.68 g, 1.207 mmol) en regulador 10X de PBS (pH 7.3; 200 mL) se preparó mediante ajustar el pH con NaOH 10 N (a pH 7.3). Después de enfriar con baño helado seco, el ácido previamente activado se añadió (4 x 100 mL) a Angiopep-2, y el pH de la mezcla se ajustó a 7.2 por adición de NaOH 10 N. Después de 1 hora a temperatura ambiente, la reacción se filtró para eliminar sales de fosfato y se evaporó para obtener 35 mL de la mezcla cruda. HPLC del producto crudo mostró una mezcla de conjugados (3:1) y (2:1) en una relación 3:1. El residuo se purificó por cromatografía en fase inversa usando una columna de poliestireno/DVB (15 a 37.5% ACN en H20) . Después de purificación, ácido acético al 0.1% se añadió a las fracciones combinadas para incrementar la solubilidad. Evaporación y liofilización de la mezcla produjeron al producto Etop-An2 (3:1) como un sólido blanco (596 mg, 12%). Usando una columna MetaChem Taxsil-3 y elución de gradiente (1 mL/min; 10% a 65% (1 mL/min; 10% a 65% (0.05% TFA en H2O):(0.05% TFA en ACN) durante 15 minutos) , el producto aislado se encontró teniendo un tiempo de retención de 9.36 minutos y siendo >95% (97.3%) puro, m/z (ESI-TOF) : 2,178 (+2), 1,452 (+3).
Ejemplo 2 : Síntesis de un Conjugado 3 : 1 de EtopósidoDMs-Angiópep-2 El procedimiento descrito en el ejemplo 1 puede usarse para preparar compuestos que incluyen péptidos conjugados a otros derivados de podofilotoxina . Por ejemplo, etopósidoDMG puede usarse para preparar al conjugado mostrado en el Esquema 7 ("EtopDMG-An2 (3:1)") usando al procedimiento sintético mostrado en el Esquema 6.
Esquema 6 ((2"-Glutaril)-EtopósídoDMG)3.AN2 Scheme 7 E opósido ' -Dimetilglicina: Una mezcla de etopósido (235 mg, 0.4 mmol) y DMAP (73 mg, 0.6 mmol) en D F (4 mL) se agitó a temperatura ambiente por 20 minutos, y luego cloruro de N, -dimetilacetilo (96 mg, 0.52 mmol) se añadió en una olla con agitación. Después de 30 minutos, la reacción se completó de acuerdo con HPLC. Ácido fórmico (1 M en DMF, 0.5 mL) se añadió, y el solvente se concentró a 1 mL. La solución resultante se cargó sobre una columna AKTA RPC para purificación (gradiente 10% a 30% MeCN en H20 con ácido fórmico al 1%) . Después de liofiliza-ción, etopósido 41 -dimetilglicina ("EtopósidoDMG" o "EtopDMG"; 180 mg, 67%) se obtuvo como un polvo incoloro. RMN 1H (CD3OD) d 7.01 (1H, s), 6.56 (1H, s), 6.39 (2H, s) , 5.98 (2H, d, J=2.9 Hz) , 5.05 (1H, d, J=3.4 Hz), 4.77 (1H, q, J= .9 Hz) , 4.68 (1H, d, J=5.4 Hz), 4.66 (1H, d, J=7.8 Hz) , 4.46 (2H, s) , 4.45 (1H, dd, J=10.3, 8.8 Hz), 4.31 (1H, t, J=8.0 Hz) , 4.17 (1H, dd, J=10.3, 4.9 Hz) , 3.68 (6H, s), 3.56 (1H, q, J=10 Hz) , 3.54 (1H, t, J=9.3 Hz) , 3.52 (1H, dd, J=14.2, 5.6 Hz), 3.32 (1H, m) , 3.26 (1H, dd, J=9.1, 4.1 Hz), 3.24 (1H, dd, J=9.2, 5.4 Hz) , 3.02 (6H, s) , 2.96 (1H, m) , 1.33 (3H, d, J=4.9 Hz) . RMN 13C (DMSO) d 175.26, 168.68, 151.35, 148.49, 147.01, 139.39, 132.74, 129.6, 127.28, 110.65, 110.45, 108.02, 102.19, 102.02, 99.25, 80.78, 75.06, 73.39, 72.41, 68.43, 68.01, 66.44, 59.73, 56.63, 56.47, 45.03, 43.86, 37.89, 20.99; HRMS (MicroTOF) calculado para C33H39N014 673.2371, encontrado 274.2534 (M+l) . Ácido Etopósido ' -Dimetilglicina 2"-Glutárico: Una mezcla de etopósido 4 ' -dimetilglcina (655 mg, 0.97 mmol) y DMAP (18 rag, 0.15 mmol) en cloroformo (11 mL) se enfrió a 0°C. DMF (3 mL) y N, N-diisopropiletilamina (DIEA; 0.25 mL, 1.46 mmol) se añadieron consecutivamente, seguidos por anhídrido glutárico (222 mg, 1.94 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente, monitorizado por HPLC. Después de 2 días, el solvente se concentró a 3 mL. La solución resultante se cargó a una columna AKTA RPC para purificación (elución de gradiente, 10% a 30% MeCN en H20) , y ácido Etopósido 4 ' -Dimetilglicina 2"-Glutári-co (305 mg, 40%) se obtuvo como un polvo blanco después de liofilización. RMN :H (CD3OD) d 7.0 (1H, s), 6.53 (1H, s) , 6.39 (2H, s), 5.99 (2H, d, J=4.6 Hz) , 4.97 (1H, q, J=7.9 Hz) , 4.78 (1H, q, J=4.75 Hz) , 4.74 (1H, d, J=7.9 Hz), 4.68 (1H, d, J=5.6 Hz), 4.45 (2H, s), 4.41 (1H, dd, J=9.6, 8.8 Hz) , 4.29 (1H, t, J=8.2 Hz), 4.15 (1H, dd, J=10.0, 4.5 Hz) , 3.78 (1H, t, J=9.4 Hz) , 3.69 (6H, s), 3.61 (1H, t, J=10.2 Hz) , 3.42 (1H, td, J=9.6, 5.2 Hz), 3.33 (1H, dd, J=8.7, 8.2 Hz), 3.3 (1H, dd, J=13.4, 5.3 Hz) , 3.02 (6H, s), 2.93 (1H, m) , 2.26 (1H, m) , 2.16 (2H, m) , 2.02 (1H, m) , 1.64 (2H, m) , 1.32 (3H, d, J=4.9 Hz) . RMN 13C (DMSO) d 175.96, 175.33, 172.46, 163.74, 151.14, 148.96, 147.43, 139.53, 131.90, 129.83, 126.42, 110.20, 109.18, 107.40, 101.91, 100.65, 99.63, 80.39, 74.55, 73.95, 71.55, 71.29, 68.43, 67.82, 66.46, 56.43, 55.35, 43.90, 43.15, 40.82, 38.0, 32.86, 32.59, 19.93, 19.39. HRMS (MicroTOF) calculado para C38H45N017 787.2687, encontrado 788.2432 (M+l).
Conjugado (Etopósido- ' -Dimetilglicina-2 "-Glutárico) 3-Angiopep-2 ("Etop-41 -DMGly-2"-Glu) 3-An2" o "EtopDMG-An2 (3:1)"): DIEA (0.17 itiL, 0.98 mmol) se añadió a manera de gotas a una mezcla de ácido Etopósido 4 ' -Dimetilglicina 2"-Glutárico (330 mg, 0.42 mmol) y TBTU (145 mg, 0.46 mmol) en DMF (24 mL) . La mezcla se agitó a temperatura ambiente por 50 minutos. Una solución de Angiopep-2 (422 mg, 0.14 mmol) en DMSO (1.5 mL) y DMF (9 mL) se añadió entonces, seguido por DIEA (0.084 mL, 0.48 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente por 20 minutos. Una alícuota (10 mL) se tomó para análisis de UPLC, y mostró que la reacción estuvo completa. Después de agitar por otros 10 minutos, la solución de reacción se concentró a 3 mL y se purificó usando columna AKTA RPC (elución de gradiente, 10% a 25% de MeCN en H20 con ácido fórmico al 0.05%) . (Etop-4 ' -DMGly-2"-Glu) 3-An2 (172 mg, 26%) se produjo como un polvo incoloro después de liofilización. MS (MicroTOF) , m/z, 2305.9327 (2+) , 1537.6443 (3+) , 1153-7463 (4+) , 922. 7970 (5+) .
Ejemplo 3: Síntesis de un Conjugado 3 : 1 de Doxorubicina:Angiopep-2 (" (DoxSu)3-An2") Un conjugado 3:1 de doxorubicina : Angiopep-2 puede prepararse de acuerdo con el esquema sintético mostrado en el' Esquema 8 y descrito en la presente.
Esquema 8 FmocDoxorubicina: DIEA (1.5 mL, 8.63 mmol) se añadió en gotas a una solución de doxorubicina (2.0 g, 3.45 mmol) y carbonato de 9-fluorenilmetil N-succinimidilo (FmocOSu; 2.32 g, 6.9 mmol) en DMF (35 mL) con agitación. La mezcla se agitó a temperatura ambiente por 3 horas y se concentró. El residuo resultante se trituró con TFA al 0.1% en H20 (3 x 20 mL) , se lavó con Et20 (8 x 20 mL) . El sólido rojo resultante se recolectó y se secó sobre vacio para obtener FmocDoxorubicina como un polvo rojo (2.1 g, 80% de rendimiento. Pureza UPLC, 98%. MS (ESI , MicroTOF) , 788.2411 (M+Na) .
FmocDoxSuOH: DIEA (0.17 mL, 1.0 mmol) se añadió a manera de gotas a una solución de FmocDoxorubicina (0.28 g, 0.366 mmol) y anhídrido succínico (0.11 g, 1.1 mmol) en DMF (20 mL) bajo agitación. La mezcla se agitó a temperatura ambiente y se monitorizó por UPLC. Después de dos días, el solvente se removió y el residuo resultante se purificó usando una columna Biotage (gel de sílice, 2% a 9% MeOH en DCM) para obtener FmocDoxSuOH como un polvo rojo (100 mg, 33% de rendimiento) . Pureza UPLC: 95%. MS (ESI, MicroTOF) , 888.2577 (M+Na) .
(FmocDoxSu) 3-An2 : DIEA (0.25 mL, 1.44 mmol) se añadió a manera de gotas a una solución de FmocDoxSuOH (599 mg, 0.692 mmol) y TBTU (231 mg, 0.72 mmol) en DMF (21 mL) bajo agitación. La mezcla se agitó a temperatura ambiente por 50 minutos y luego una solución de Angiopep-2 (671 mg, 0.229 mmol) en DMSO (2 mL) y DMF (12 mL) se añadió. La mezcla se agitó a temperatura ambiente por 20 minutos, en el cual tiempo HPLC mostró que la reacción fue completa. Después de agitar por otros 10 minutos, el solvente se removió y el residuo se purificó usando una columna Biotage C18 (40% a 80% de MeCN en agua y 0.05% de TFA) para dar ( FmocDoxSu) 3-An-2 como un polvo rojo (500 mg, 45% de rendimiento) . Pureza de UPLC, 95%. MS (ESI, MicroTOF), m/z 2423.4239 (2+) , 1615.6190 (3+) .
(DoxSu) 3-An2 : Piperidina (20% en DMF, 1.5 mL) se añadió a una solución de ( FmocDoxSu) 3An-2 (260 mg, 0.053 mmol) en DMSO (1 mL) y DMF (12 mL) . La solución se volvió azul. Después de agitar por 10 minutos, la solución se enfrió a 0°C y se trató con ácido fórmico (0.5 M en DMF, 6 mL) para obtener una solución roja o* clara. El solvente se removió usando bomba al vacio, y el residuo resultante se trituró con Et20 (3 x 10 mi) y AcOEt (3 x 10 mi) . El sólido rojo resultante se purificó usando columna AKTA RPC30 (10% a 40% de MeCN en agua y ácido fórmico al 0.15%) para dar (DoxSu)3An-2 como un polvo rojo (82 mg, 37% de rendimiento) . Pureza UPLC: 95%. MS (ESI, MicroTOF) , m/z 2089.9674 (2+) , 1393.2419 (3+), 1045.4395 (4+).
Ejemplo 3: Efecto de etopósido, conjugados etopósido-Angiopep, doxorubicina , y conjugados de doxorubicina-Angiopep en proliferación celular Para el ensayo de proliferación celular in vitro, entre 2.5 y 5 x 10" de células U87 o SK-HEP-1 se sembraron en una micro-placa de cultivo de tejido de 24 pozos en un volumen final de 1 mL de medio con 10% de suero y se incubaron por 24 horas a 37 °C y C02 al 5%. El medio entonces se reemplazó con medio libre de suero y se incubó durante la noche. La mañana siguiente el agente se disolvió de manera fresca en sulfóxido de dimetilo (DMSO) y el medio se reemplazó con medio completo conteniendo al agente en diferentes concentraciones por triplicado. La concentración final de DMSO fue 0.1%. El control usado fue un pozo de micro-placa con células y sin agente. Las células se incubaron por 48 a 72 horas a 37 °C y C02 al 5%. Después de la incubación, el medio se cambió y se reemplazó con 1 mL de medio completo conteniendo [3H] -timidina (1 pCi/ensayo) . La placa se incubó a 37°C y C02 al 5% por 4 horas. El medio se removió, y las células se lavan con PBS a 37°C. Las células se fijaron con una mezcla de etanolrácido acético (3:1), se lavaron con agua, y de precipitaron 3 veces con 10% de TCA (ácido tricloroacético) helado. Finalmente 500 de PCA (ácido perclórico) se añadieron a los pozos y las micro-placas se calentaron por 30 minutos a 65°C y 30 minutos a 75°C. Los contenidos de cada pozo se transfirieron entonces a un frasco de centelleo con 10 mL de coctel de centelleo y la actividad se midió en CPM (conteo por minuto) en un contador de centelleo liquido Tri-Carb de Packard. Los resultados de ensayo de proliferación celular usando etopósido no conjugado, Etop-An2 (1:1), y Etop-An2 (3:1) se muestran en la Tabla 4. La Tabla 5 muestra los resultados obtenidos para EtopDMG-An2 (3:1), etopósidoDMG no conjugado, el conjugado de doxorubicina/Angiopep-2 (3:1) ("Doxorubicina-An2 (3:1)"), y doxorubicina no conjugada.
Además de los estudios in vitro, la inhibición de proliferación celular ha sido estudiada en modelos de tumor de xeno-injerto y estos resultados se muestran en la figura 1. Células de glioblastoma U87 (2.5xl06) se implantaron de manera sub-cutánea en el flanco derecho de ratones nudos. Tratamientos comenzados en el día 15 después de implantación (correspondiente al dia 0 en la gráfica mostrada en la figura 1) cuando el volumen de tumor alcanzó alrededor de 150-200 mm3. Los ratones se trataron una vez a la semana por tres semanas por inyección de bolo i.v. con doxorubicina (6 mg/kg) y conjugado de doxorubicina-An2 (20 y 40 mg/kg) . El conjugado de doxorubicina-An2 se diluyó en D5 acidificado (dextrosa al 5% en agua) a 5 mg/ml.
Tabla 4 Tabla 5 Ejemplo 3: Estudios de perfusión cerebrales in situ Los procedimientos descritos en la publicación de patente US 2006/0189515, incorporado en la presente por referencia, se usaron para estudios de perfusión cerebral in situ. Estos procedimientos se describen en la presente adicionalmente .
Ejemplo 3a: Etop-An2 (3:1) La captación cerebral de los compuestos de la invención (v.gr., Etop-An2 (3:1), EtopDMG-An2 (3:1), y Doxorubicina-An2 (3:1)) con relación a los fármacos no conjugados correspondientes se midieron usando técnicas de perfusión cerebral in situ descritas en la presente y en Dagenais et al., J. Cereb. Blood Flow Metab. 20 ( 2 ): 381-386 (2000). La captación de [125I] -polipép-tidos al lado luminal de capilares de cerebro de ratón se midió usando el método de perfusión cerebral in situ adaptado en el laboratorio para el estudio de captación de agente en el cerebro de ratón.
Polipéptidos fueron yodados con procedimientos estándar usando perlas de yodo de Sigma. Polipéptidos brevemente se diluyeron en regulador de fosfato 0.1 M, pH 6.5 (PB) . Dos perlas de yodo se usaron para cada proteina. Estas perlas se lavaron dos veces con 3 mL de PB en un filtro Whatman y se re-suspendieron en 60 \iL de PB. 125I (1 mCi) de Amersham-Pharmacia Biotech se añadió a la suspensión de perla por 5 minutos a temperatura ambiente. Cada yodación se inició por la adición del polipéptido (100 g) . Después de una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente, el yodo libre se removió por HPLC.
Brevemente, la carótida común derecha de ratones anestesiados con cetamina/xilazina (140/8 rag/kg i.p.) se expuso y se ligó en el nivel de la bifurcación de la carótida común, rostral a la arteria occipital. La carótida común se cateterizó en el rostro con entubado de polietileno lleno con heparina (25 U/mL) y se montó sobre una aguja de calibre 26. La jeringa conteniendo el fluido de perfusión ( [125I ] -polipéptidos o [14C] -inulina en Krebs/regulador de bicarbonato a un pH 7.4 gasificado con 95% de 02 y 5% de C02) se colocó en una bomba de infusión (bomba Harvard PHD 2000; Harvard Apparatus) y se conectó al catéter. Previo a la perfusión, la contribución de flujo sanguíneo contralateral se eliminó mediante cortar ventrículos del corazón. El cerebro se perfundió para los tiempos indicados a una tasa de flujo de 1.15 mL/min. Después de 14.5 minutos de perfusión, el cerebro se perfundió adicionalmente por 60 segundos con regulador de Krebs para lavar el exceso de [125I ] -proteínas . Ratones entonces se decapitaron para terminar perfusión del hemisferio derecho se aisló en hielo antes de someterse a agotamiento capilar. Alícuotas de homogenados, sobrenadantes, pelotillas y perfusados se tomaron para medir sus contenidos en [125I ] -conjugados por precipitación en TCA y para evaluar el volumen aparente de distribución.
Los resultados de estos experimentos se ilustran en las figuras 2A-D y 3. En la figura 2A, perfusión in situ muestra que la Vd es mayor para Etop-An2 (3:1) que para el etopósido no conjugado (es decir, la pendiente observada para Etop-An2 (3:1) es mayor que aquella observada para etopósido no conjugado) . Tendencias similares se observan para EtopDMG-An2 (3:1) (figura 2B) con relación a EtopósidoDMG no conjugado y para doxorubicina An2 (3:1) con relación a doxorubicina no conjugada (figura 2C) . Como se puede observar a partir de la figura 2C, la relación de la Kin para Doxorubicina-An2 ( 3 : 1 ): doxorubicina no conjugada es 15. Este procedimiento también distingue entre compuestos permaneciendo en el compartimiento vascular del cerebro a partir de aquellos teniendo cruzada la membrana endotelial abluminal para ingresar a la parenquima cerebral. La figura 3 muestra la perfusión in situ de Etop-An2 (3:1) . En cada agrupamiento en esta gráfica, la barra izquierda representa etopósido no conjugado, la barra media representa EtopDMG-An2 (3:1) (Lote 1), y la barra derecha representa EtopDMG-An2 (3:1) (Lote 2). La repartición cerebral de Etop-An2 (3:1) siguiendo agotamiento capilar cerebral se ilustra en las figuras 4A y 4B. Mas aun, en contraste a etopósido la captación cerebral de Etop-An2 (3:1) es similar en ratones de tipo silvestre y de derribo P-gp, indicando que Etop-An2 (3:1) no es un sustrato P-gp (figura 5). En esta figura, la barra izquierda de cada grupo muestra los resultados obtenidos usando ratones CD-1 y la barra derecha muestra los resultados obtenidos usando ratones de derribo P-gp. La captación cerebral de Etop-An2 (3:1) puede inhibirse por la co-administración de un polipéptido no conjugado. Figura 6 muestra que la co-perfusión de [125I ] -Etop-An2 (3:1) con un exceso de dos veces de Angiopep-2 no conjugado reduce la parenquima Vd por 27%.
Ejemplo 3b: EtopDMG-An2 (3:1) y Doxorubicina-An2 (3:1) La captación cerebral de EtopDMG-An2 (3:1) con relación a EtopDMG no conjugado se midió usando los métodos descritos para el ejemplo 3a, y estos resultados se muestran en la Tabla 6 y en la figura 7. La Tabla 6 también incluye los datos correspondiente para Doxorubicina-An2 (3:1) y doxorubicina . En contraste a ÉtopDMG no conjugado, la captación cerebral de doxorubicina-An2 (3:1) es similar en ratones de tipo silvestre y de derribo P-gp, indicando que doxorubicina-An2 (3:1) no es un sustrato P-gp.
Tabla 6 Ejemplo 4 : Cinética de plasma del conjugado 3:1 de etopósido-Angiopep-2 La figura 8 describe la cinética de plasma de Etop-An2 (3:1) siguiendo administración como un bolo. (125I ) Etop-An2 radio-marcado (20 mg/kg) se inyectó en bolo por rutas intravenosa (i.v.) o intra-peritoneal (i.p.) en ratones CD-1 pesando alrededor de 25-30 g. La solución de inyección se compuso de 12.5% de dimetilsulfóxido (DMSO) , 12% de etanol anhidro, 25% de polietileno glicol 400 (PEG400) y 50% de regulador de NaCl/-glicina. En varios intervalos de tiempo (0.5, 1, 2, y 6 horas) la sangre se colectó por punción cardiaca y animales se sacrificaron. Después de centrifugación cerebral, la radioactividad de plasma se midió en un contador gamma (Contador Gamma Automático Wizard 1470) . La radioactividad se interpretó como % de dosis inyectada por gramo de plasma. Los resultados se trazaron usando software Prism GraphPad y el área bajo la curva (AUC) para cada modo de inyección se calculó. La bio-disponibilidad de conjugado Etop-An2 intraperitoneal se estimó entonces mediante dividir el AUC después de inyección i.p. por la AUC después de inyección i.v. La bio-disponibilidad estimada después de administración i.p. se calculó como 46%. Parámetros farmacocinéticos de Etop-An2 (3:1) después de administración de bolo IV en ratones se muestran en la Tabla 7. Datos de literatura para etopósido no conjugado muestran una ?1/2a=0.13 horas (Reddy et al., Journal of drug tergeting, 13 ( 10 ): 543-553 (2005)).
Tabla 7 Ejemplo 5: Distribución de tejido de conjugado 3:1 de etopósidoDMG-Angiopep-2 y conjugado 3:1 de etopósido-Angiopep-2 El efecto de conjugación de un agente a un vector sobre la distribución del agente o la farmacocinética de un polipéptido que se conjuga a un agente se evaluó mediante administrar un polipéptido o conjugado marcado a un animal y medir la distribución del polipéptido o conjugado a órganos (v.gr., usando conjugados marcados 3H o 125I) a ratones. Experimentos similares pueden ser llevados a cabo con compuestos que incluyen cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente (v.gr., los polipéptidos descritos en la Tabla 1 tales como Angiopep-3, Angiopep-4a, Angiopep-4b, Angiopep-5, Angiopep-6, y Angiopep-7, o análogos de los mismos) . Aquí, el agente anti-cáncer no conjugado y los conjugados se inyectaron de manera intravenosa a ratones como un bolo. Tejidos se recolectaron en tiempos diferentes (0.25, 0.5, 1, y 4 h) y se homogeneizaron . Para cuantificar la cantidad de conjugado 3H-marcado, homogenados de tejido se digirieron con solubilizador de tejido, y 10 iriL de centellador liquido se añadieron a las muestras. La cantidad del conjugado 125I-marcado, en los diferentes tejidos se mide después de precipitación por TCA. Radioactividad asociada con los tejidos se cuantifica. El área bajo la curva (AUC 0-4) se estima usando el software Prism y se traza para los diferentes tejidos.
La figura 9 muestra la distribución de EtopDMG-An2 siguiendo administración de bolo IV en ratones. En esta figura, la barra izquierda de cada agrupamiento muestra resultados obtenidos con etopósido no conjugado y la barra derecha muestra resultados obtenidos con Etop-An2 (3:1). La figura 10 muestra la distribución cerebral de Etop-An2 (3:1) después de administración de bolo IV o IP en ratones. La figura 11 compara la distribución cerebral de Etop-An2 (3:1) contra etopósido no conjugado treinta minutos después de administración de bolo IV en ratones. La figura 12 muestra la distribución de tejido de Etop-An2 (3:1) comparado con etopósido no conjugado. En esta figura, la barra izquierda de cada agrupamiento muestra resultados obtenidos con etopósido no conjugado y la barra derecha muestra resultados obtenidos con Etop-An2 (3:1); el uso de Etop-An2 (3:1) lleva a concentración incrementada en los tejidos estudiados.
Ejemplo 6: Efecto Anti-Tumor de Conjugado (3:1) de Doxorubicina-An2 en un Modelo de Ratón de Tumor Cerebral Humano Todos los animales usados en estos estudios se manejaron y se mantienen de acuerdo con los Lineamientos del Consejo Canadiense sobre Cuidado Animal (CCAC) . Protocolos animales se aprobaron por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Université du Québec á Montréal.
El modelo de tumor cerebral humano intra-cerebral se estableció por inoculación estereotáctica de 5xl05 células U87 en cerebro de ratón desnudo. Ratones desnudos atimicos hembra (Crl : Nu/Nu-nuBR; 20-25 g, 4-6 semanas de edad; Charles River Canadá, St-Constant, QC) se usaron para modelos de tumor y se mantuvieron en un ambiente libre de patógenos. Una hora antes de cirugía, los ratones recibieron una inyección sub-cutánea de buprenorfina (0.1 mg kg"1) . Para inoculación de células de tumor, ratones se anestesiaron con inyección i.p. de cetamina/xilazina (120/10 mg kg"1) y se colocaron en un aparato estereotáctico (Kopf; Tujunga, CA) . Una perforación de fresa se perforó 1.5 ram anterior y 2.5 mm lateral a la bregma. La suspensión celular en 5 de medio de cultivo celular libre de suero se inyectó durante un periodo de 5 minutos usando una jeringa Hamilton a una profundidad de 3.5 mm.
El tratamiento con fármacos comenzó 3 días postinoculación (Tabla 8). El compuesto terapéutico (v.gr., doxorubi-cina o conjugado (3:1) de doxorubicina-An2 ) fue dado intravenosamente por inyección de vena de cola de bolo (una vez por semana) . Soluciones de fármaco se prepararon en agua de dextrosa al 5% (D5W) . Soluciones de inyección se prepararon frescas antes de cada administración. Signos clínicos de progresión de enfermedad y pesos corporales se monitorizaron cada día. Cuando los ratones alcanzaron los puntos finales terminales (20% de disminución en peso corporal) , se sacrificaron por asfixia de dióxido de carbono.
Tabla 8 Cada una de las figuras 13A y 13B muestran la eficacia del conjugado (DoxSu) 3-An2 cuandos e administra solo o en combinación con un conjugado de paclitaxel-Angiopep2. La figura 13A muestra resultados obtenidos en una prueba y la figura 13B muestra resultados obtenidos en un segundo conjunto de experimentos. Análisis estadístico de los datos obtenidos a partir de la prueba 2 (figura 13B) mostró que la mejora de 27% observada fue estadísticamente significativa (p < 0.007).
Otras formas de realización El contenido de cada publicación, patente, y solicitud de patente mencionado en la presente solicitud se incorpora por referencia. Aunque la invención ha sido descrita en detalles presentes e ilustrada en los dibujos acompañantes, se entenderá que la invención no se limita a las formas de realización descritas en la presente y que varios cambios y modificaciones pueden efectuarse sin salir del alcance o espíritu de la invención.
Aunque la invención ha sido descrita en conexión con formas de realización específicas de la misma, se entenderá que es capaz de modificaciones adicionales y esta solicitud tiene la intención de cubrir cualquier variación, uso, o adaptación de la invención siguiendo, en general, los principios de la invención e incluyendo tales salidas de la presente divulgación como vienen dentro de práctica conocida o acostumbrada dentro de la materia a la cual pertenece la invención y como se pueden aplicar a las características esenciales hasta ahora señaladas, y como sigue en el alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (92)

REIVI DICACIONES
1. Un compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, comprendiendo una secuencia de aminoácidos sustancial- mente idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs : 1-105 y 107-116, o un derivado funcional de la misma, en donde dicha secuencia de aminoácidos comprende un enlace covalente a partir de un aminoácido de dicha secuencia de aminoácidos a un derivado de podofilotoxina, y en donde dicho derivado de podofilotoxina es un compuesto teniendo una estructura de acuerdo con la Fórmula (I) o un estéreo-isómero o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde cada uno de R:, R2, y R3 se selecciona, de manera independiente, a partir de H, alquilo Cj.g opcionalmente sustituido, C(0)R8, P (O) (OR9) (OR10) , S(0)2(OR9), o un enlazador hidroliza- ble Y que comprende un enlace covalente a un aminoácido del polipéptido; X es O o NR7; cada uno de R4, R5, y R7 se selecciona, de manera independiente, a partir de H, alquilo Cx_6 opcionalmente sustituido, C(0)R8, o un enlazador hidrolizable Y que comprende un enlace covalente a un aminoácido del polipéptido; R6 es h, alquilo Ci_e opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, R8 se selecciona a partir de alquilo C]_6 opcionalmente sustituido o arilo opcionalmente sustituido; cada uno de R9 y R10 se selecciona, de manera independiente, a partir de H, alquilo Cx_6 opcionalmente sustituido, o arilo opcionalmente sustituido; y n es l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8; donde uno y solamente uno de Rl t R2, R3, R4, R5, y R7 es Y.
2. El compuesto de la reivindicación 1, en donde cada compuesto de la Fórmula (I) se selecciona, de manera independiente, a partir de en donde cada R2 es, de manera independiente, H, P(0) (0H)2, o -C(0)R8; cada R6 es, de manera independiente, CH3 o 2-tiofeno; cada R8 es, de manera independiente, alquilo C^g opcionalmente sustituido; cada Y es -C (0) (CH2) nC (0) -; y cada n es, de manera independiente, 2, 3, o 4; y en donde cada Y se enlaza de manera covalente a un aminoácido.
3. El compuesto de las reivindicaciones 1 o 2, en donde Y es C(0) (CH2)nC(0)- y n es 2, 3, o 4.
4. El compuesto de las reivindicaciones 1 o 2, en donde cada R2 es -C (0) CH2N (CH3) 2.
5. El compuesto de las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicha secuencia de aminoácidos se enlaza de manera covalente a un compuesto teniendo una estructura de acuerdo con la Fórmula (I) a través de un segundo aminoácido de dicha secuencia de aminoácidos .
6. El compuesto de la reivindicación 5, en donde dicha secuencia de aminoácidos se enlaza de manera covalente a un compuesto teniendo una estructura de acuerdo con la Fórmula (I) a través de un tercer aminoácido de dicha secuencia de aminoácidos .
7. El compuesto de la reivindicación 1, en donde dicho aminoácido enlazado de manera covalente a dicho enlazador hidrolizable Y se une mediante un grupo funcional amino-, guanidino-, hidroxilo, fenol-, o tiol de dicho aminoácido.
8. El compuesto de la reivindicación 7, en donde cada aminoácido enlazado de manera covalente a dicho enlazador hidrolizable Y se une mediante un grupo funcional amino.
9. El compuesto de la reivindicación 7, en donde dicho aminoácido es lisina o treonina.
10. El compuesto de las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicha secuencia de aminoácidos tiene por lo menos 50% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en Angiopep-2 (SEQ ID NO: 97), Angiopep-4b, Angiopep-5, Angiopep-6, y Angiopep-7 (SEQ ID NOs: 109-112) .
11. El compuesto de la reivindicación 10, en donde dicha secuencia de aminoácidos tiene por lo menos 70% de identidad con la secuencia de aminoácidos de Angiopep-2 (SEQ ID NO: 97) .
12. El compuesto de la reivindicación 10, en donde dicha secuencia de aminoácidos tiene por lo menos 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos de Angiopep-2 (SEQ ID NO: 97) .
13. El compuesto de las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicha secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de aminoácidos de Angiopep-2 (SEQ ID NO: 97), Angiopep-4b, Angiopep-5, Angiopep-6, y Angiopep-7 (SEQ ID NOs: 109-112).
14. El compuesto de la reivindicación 13, en donde dichas secuencias de aminoácidos consisten de la secuencia de aminoácidos de Angiopep-2 (SEQ ID NO: 97), Angiopep-4b, Angiopep-5, Angiopep-6, y Angiopep-7 (SEQ ID NOs : 109-112) .
15. El compuesto de la reivindicación 14, en donde dicha secuencia de aminoácidos consiste de la secuencia de aminoácidos de Angiopep-2 (SEQ ID NO: 97) .
16. El compuesto de la reivindicación 12, teniendo la siguiente estructura: T F F Y G G' S R G K R N N F K T E E Y I I I Formula (I) Formula (I) Formula (I) , en donde cada (-(Fórmula (I)) representa un enlace covalente opcional entre el aminoácido indicado y un compuesto de la Fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y en donde hay por lo menos un enlace covalente entre un aminoácido del polipéptido y dicho compuesto de la Fórmula (I) .
17. El compuesto de la reivindicación 16, en donde la treonina en la posición 1 y las Usinas en las posiciones 10 y 15 del polipéptido cada uno comprenden un enlace covalente a un compuesto teniendo una estructura de acuerdo con la Fórmula (I) .
18. El compuesto de la reivindicación 16, en donde cada R2 es, de manera independiente, H o P(0) (OH)2-
19. El compuesto de la reivindicación 16, en donde cada compuesto de la Fórmula (I) tiene la siguiente estructura
20. El compuesto de la reivindicación 19, en donde n es 3.
21. El compuesto de la reivindicación 16, en donde cada R2 es un a-aminoácido C-enlazado.
22. El compuesto de la reivindicación 16, en donde R8 es un alquilo C^.g comprendiendo un sustituyente amino.
23. El compuesto de la reivindicación 16, en donde -C(0)R8 es dimetilglicina .
24. El compuesto de la reivindicación 16, en donde cada compuesto de la Fórmula (I) se selecciona, de manera independiente, a partir de e n donde cada R8A y R8B es, de manera independiente, H, alquilo C^.g opcionalmente sustituido, o R8A y R8B se combinan para formar un anillo de 3-7 miembros opcionalmente sustituido.
25. El compuesto de la reivindicación 24, en donde cada R8A y R8B es alquilo 0?_6 opcionalmente sustituido.
26. El compuesto de la reivindicación 16, en donde cada compuesto de la Fórmula (I) es
27. compuesto de la reivindicación 1, en donde dicho compuesto tiene la siguiente estructura: (1) , en donde cada "Etopósido" representa etopósido 41 -dimetilglicina, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, unido al grupo carbonilo en el 2"-hidroxilo.
28. Una composición farmacéutica que comprende al compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-27, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, y un portador farmacéuticamente aceptable.
29. método para tratar un cáncer, dicho método comprendiendo administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-27, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
30. El método de la reivindicación 29, comprendiendo además la administración de un segundo agente terapéutico.
31. El método de la reivindicación 30, en donde dicha administración es concurrente con otro régimen terapéutico.
32. El método de la reivindicación 31, en donde dicho régimen terapéutico es terapia de radiación, quimioterapia, trasplante de células madre, trasplante de médula ósea, cirugía, o tratamiento de hipertermia.
33. El método de cualquiera de las reivindicaciones 29-32, en donde dicho compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, tiene la estructura T F F Y G G S R G K R N N F K T E E Y I I I Formula (I) Formula (I) Formula (I) , en donde cada (-(Fórmula (I)) representa un enlace covalente entre el aminoácido indicado y un compuesto de la Fórmula (I) en donde cada R2 es, de manera independiente, H, P(0) (OH)2, o -C(0)R8; cada R8 es, de manera independiente, alquiló C^.g opcionalmente sustituido; cada Y es -C (0) (CH2)„C (0) -; y cada n es, de manera independiente, 2, 3, o 4
34. El método de la reivindicación 33, en donde cada R2 es, de manera independiente, H o P(0) (0H)2.
35. El método de la reivindicación 33, en donde cada R2 es -C(0)R8 y R8 es alquilo 0?_6 comprendiendo un grupo amino opcionalmente sustituido.
36. El método de la reivindicación 35, en donde cada compuesto de la Fórmula (I) se selecciona a partir de:
37. El método de la reivindicación 36, en donde n es 3.
38. El método de cualquiera de las reivindicaciones 29-37, en donde dicho segundo agente terapéutico es un polipépti-do comprendiendo la secuencia de Angiopep-2 (SEQ ID NO: 97), y en donde dicho Angiopep-2 se conjuga a un agente anti-cáncer.
39. El método de la reivindicación 38, en donde dicho agente anti-cáncer es paclitaxel.
40. El método de las reivindicaciones 38 o 39, en donde dicho segundo agente terapéutico es ANG1005,
41. El método de la reivindicación 29, en donde dicho cáncer es cáncer del cerebro.
42. El método de la reivindicación 41, en donde dicho cáncer es un glioblastoma, un glioma, un neuroma acústico, un adenoma, un astrocitoma, un papiloma de plexus coroideo, linfoma del SNC, ependimoma, un gangliocitoma, un ganglioglioma, un meduloblastoma (mdl), un meningioma anaplástico (maligno), o neurofibromatosis .
43. El método de la reivindicación 42, en donde dicho cáncer es glioblastoma.
44. Un método para hacer el compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-27, dicho método comprendiendo el paso de enlazar de manera covalente un derivado de podofilotoxina a una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de SEQ ID NOs: 1- 105 y 107-116, o un derivado funcional del mismo, usando un grupo enlazador hidrolizable difuncional.
45. El método de la reivindicación 44, en donde dicho derivado de podofilotoxina se selecciona a partir de en donde Y es H; cada R2, es, de manera independiente, H, P(O) (OH)2, o -C(0)R8; cada R6 es, de manera independiente, CH3 o 2-tiofeno; y cada RB es, de manera independiente, alquilo <- 6 opcionalmente sustituido.
46. El método de la reivindicación 45, en donde cada R2 es, de manera independiente, H, P(0) (OH)2 o -C(0)R8, donde R8 es alquilo C^g comprendiendo un sustituyente amino.
47. El método de la reivindicación 47, en donde dicho grupo enlazador hidrolizable difuncional se selecciona a partir de ácido succinico, ácido glutárico, anhídrido glutárico, o ácido butárico.
48. El método de la reivindicación 47, donde dicha secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de aminoácidos de Angiopep-2 (SEQ ID NO: 97), Angiopep-4b, Angiopep-5, Angiopep-6, o Angiopep-7 (SE ID NOs : 109-112).
49. El método de la reivindicación 44, en donde (a) dicho compuesto de la Fórmula (I) se combina primero con dicho grupo enlazador hidrolizable difuncional para formar un aducto covalente; y (b) el aducto de (a) es entonces combinado con dicha secuencia de aminoácidos; en donde el aducto de (a) puede purificarse opcionalmente previo a uso en (b) .
50. El método de la reivindicación 44, en donde 1.1-3.0 equivalentes de dicho grupo enlazador hidrolizable difuncional se usa con relación al compuesto de la Fórmula (I) .
51. El método de la reivindicación 44, en donde el grupo enlazador hidrolizable difuncional de (a) es anhídrido glutárico .
52. El método de la reivindicación 44, en donde dicho compuesto de la Fórmula (I) es etopósido, fosfato de etopósido, etopósido ' -dimetilglicina, o tenipósido, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
53. El método de las reivindicaciones 44 o 49, comprendiendo además el uso de un agente de acoplamiento de péptido .
54. El método de la reivindicación 53, en donde dicho agente de acoplamiento de péptido es tetrafluoroborato de N, , N' , ' -tetrametil-O- (benzotriazol-l-il ) uronio .
55. Un compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, comprendiendo una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-105 y 107-116, o un derivado funcional del mismo, en donde dicha secuencia de aminoácidos comprende un enlace covalente a partir de un aminoácido de dicha secuencia de aminoácidos a un derivado de doxorubicina, y en donde dicho derivado de doxorubicina es un compuesto teniendo una estructura de acuerdo con la Fórmula (II) : (II), o un estéreo-isómero o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde cada uno de Xl7 X2, X3, X , y X5 se selecciona, de manera independiente, a partir de un enlace covalente, O, o NR25; cada uno de R17, R18, R19, R20, R2i, R22 R23 ^ZM Y ^25* se selecciona, de manera independiente, a partir de H, alquilo Cx.6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-6 opcionalmente sustituido, alquinilo C2_6 opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, o es un enlazador hidrolizable Y; y en donde uno y solamente uno de R17, Ri8' ^19 ¾0' ^21'
56. El compuesto de la reivindicación 55, en donde el compuesto de la Fórmula (II) tiene la siguiente estructura: en donde X2R18 es H o NH2; X3R19 es H u OH; X4R20 es H o alquilo opcionalmente sustituido; Y es -C(0) (CH2)nC(0)-; y n es 2, 3, o 4.
57. El compuesto de la reivindicación 56, en donde compuesto tiene la siguiente estructura:
58. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 55-57, en donde Y es -C(0) (CH2)nC(0)- y n es 2, 3, o 4.
59. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 55-57, en donde dicha secuencia de aminoácidos se enlaza de manera covalente a un compuesto teniendo una estructura de acuerdo con la Fórmula (II) a través de un segundo aminoácido de dicha secuencia de aminoácidos.
60. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 55-57, en donde dicha secuencia de aminoácidos se enlaza de manera covalente a un compuesto teniendo una estructura de acuerdo con la Fórmula (I) a través de un tercer aminoácido de dicha secuencia de aminoácidos.
61. El compuesto de la reivindicación 60, en donde cada aminoácido enlazado de manera covalente a dicho enlazador hidrolizable Y se une mediante un grupo funcional amino-, guanidino-, hidroxilo-, fenol-, o tiol de dicho aminoácido.
62. El compuesto de la reivindicación 61, en donde cada aminoácido enlazado de manera covalente a dicho enlazador hidrolizable Y se une mediante un grupo funcional amino.
63. El compuesto de la reivindicación 61, en donde dicho aminoácido es lisina o treonina.
64. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 55-57, en donde dicha secuencia de aminoácidos tiene por lo menos 50% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en Angiopep-2 (SEQ ID NO: 97), Angiopep-4b, Angiopep-5, Angiopep-6, y Angiopep-7 (SEQ ID NOs : 109-112) .
65. El compuesto de la reivindicación 64, en donde dicha secuencia de aminoácidos tiene por lo menos 70% de identidad con la secuencia de aminoácidos de Angiopep-2 (SEQ ID NO: 97).
66. El compuesto de la reivindicación 65, en donde dicha secuencia de aminoácidos tiene por lo menos 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos de Angiopep-2 (SEQ ID NO: 97).
67. El compuesto de la reivindicación 66, en donde dicha secuencia de aminoácidos consiste de la secuencia de aminoácidos de Angiopep-2 (SEQ ID NO: 97), Angiopep-4b, Angiopep-5, Angiopep-6, y Angiopep-7 (SEQ ID NOs: 109-112).
68. El compuesto de la reivindicación 67, en donde dicha secuencia de aminoácidos consiste de la secuencia de aminoácidos de Angiopep-2 (SEQ ID NO: 97), Angiopep-4b, Angiopep-5, Angiopep-6, y Angiopep-7 (SEQ ID NOs: 109-112) .
69. El compuesto de la reivindicación 68, en donde dicha secuencia de aminoácidos consiste de la secuencia de aminoácidos de Angiopep-2 (SEQ ID NO: 97) .
70. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 55-57, teniendo la siguiente estructura T F F Y G G S R G K R N N F K T E E Y I I I Formula (II) Formula (?) Formula (?) en donde cada (-(Fórmula (II)) representa un enlace covalente opcional entre el aminoácido indicado y un compuesto de la Fórmula (II), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y en donde hay por lo menos un enlace covalente entre un aminoácido del polipéptido y dicho compuesto de la Fórmula (II) .
71. El compuesto de la reivindicación 70, en donde la treonina en la posición 1 y las Usinas en las posiciones 10 y 15 del polipéptido cada uno comprenden un enlace covalente a un compuesto teniendo una estructura de acuerdo con la Fórmula (II) .
72. El compuesto de la reivindicación 70, en donde Y es -C(O) (CH2)nC(0)- y n es 2.
73. El compuesto de la reivindicación 55, en donde dicho compuesto tiene la siguiente estructura: (2) , en donde cada doxorubicina, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se une por el grupo succinico en el grupo hidroxilo C14.
74. El compuesto de la reivindicación 73, en donde dicho compuesto comprende la sal de hidrocloruro de 1, 2, o 3 de las fracciones de doxorubicina unidas de manera covalente.
75. El compuesto de las reivindicaciones 73 o 74, en donde dicho compuesto es la sal de trihidrocloruro del compuesto (2) .
76. Una composición farmacéutica que comprende al compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 55-75 y un portador farmacéuticamente aceptable.
77. Un método para tratar un cáncer, dicho método comprendiendo administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 55-75.
78. El método de la reivindicación 77, comprendiendo además la administración de un segundo agente terapéutico.
79. El método de la reivindicación 78, en donde dicha administración es concurrente con otro régimen terapéutico.
80. El método de la reivindicación 79, en donde dicho régimen terapéutico es terapia de radiación, quimioterapia, trasplante de células madre, trasplante de médula ósea, cirugía, o tratamiento de hipertermia.
81. El método de cualquiera de las reivindicaciones 77-80, en donde dicho compuesto tiene la estructura T F F Y G G S R G R N N F K T E E Y I I I Formula (II) Formula (?) Formula (II) en donde cada (-(Fórmula (II)) representa un enlace covalente entre el aminoácido indicado y un compuesto de la Fórmula (II), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que tiene la siguiente estructura en donde X2R18 es H o NH2; X3R19 es H u OH; X4R20 es H o alquilo opcionalmente sustituido; Y es -C(O) (CH2)nC(0)-; y n es 2 , 3, o 4.
82. El método de la reivindicación 81, en donde dicho compuesto tiene la siguiente estructura: o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
83. El método de cualquiera de las reivindicaciones 77-82, en donde dicho segundo agente terapéutico es un polipépti-do que comprende la secuencia de Angiopep-2 (SEQ ID NO: 97), y en donde dicho Angiopep-2 se conjuga a un agente anti-cáncer.
84. El método de la reivindicación 83, en donde dicho agente anti-cáncer es paclitaxel.
85. El método de las reivindicaciones 83 u 84, en donde dicho agente terapéutico es ANG1005, el cual tiene la siguiente estructura
86. El método de la reivindicación 77, en donde dicho cáncer es leucemia linfocitica aguda, leucemia mieloblástica aguda, cáncer adrenocortical, cáncer de vejiga intravenoso e intravesical, sarcoma de huesos, cáncer de pecho, síndrome de carcinoide (intestino delgado), cáncer endometrial, sarcoma de Ewing, sarcoma gineocológico, cáncer de la cabeza y el cuello (células escuamosas), cáncer hepático, enfermedad de Hodgkin, cáncer de células de isleta, leucemia, cáncer de pulmón, linfoma maligno, mieloma múltiple, neuroblastoma, linfoma no de Hodgkin, cáncer pancreático, cáncer de próstata, sarcoma osteogénico, cáncer de ovarios, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer estomacal, cáncer testicular, cáncer de la tiroides, carcinoma de vejiga de células transitorias, sarcoma de tejido suave, o tumor de Wilms.
87. El método de la reivindicación 29, en donde dicho método comprende dosificación sub-terapéutica del derivado de podofilotoxina, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de la reivindicación 77, en donde dicho método comprende dosificación sub-terapéutica del derivado de podofilotoxina, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
88. El método de la reivindicación 87, en donde dicho método comprende dosificación sub-terapéutica de etopósido o etopósido ' -dimetilglicina .
89. El método de la reivindicación 87, en donde dicho método comprende dosificación sub-terapéutica de doxorubicina.
90. El método de la reivindicación 29, en donde dicho método comprende dosificación super-terapéutica del derivado de podofilotoxina de la reivindicación 77, en donde dicho método comprende dosificación super-terapéutica del derivado de podofilotoxina .
91. El método de la reivindicación 90, en donde dicho método comprende dosificación super-terapéutica de etopósido o etopósido 4 ' -dimetilglicina .
92. El método de la reivindicación 90, en donde dicho todo comprende dosificación super-terapéutica de doxorubicina.
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