MX2008000994A - Agentes de transporte para cruzar la barrera hematoencefalica y hacia el interior de las celulas de cancer cerebral, y metodos para el uso de los mismos. - Google Patents

Agentes de transporte para cruzar la barrera hematoencefalica y hacia el interior de las celulas de cancer cerebral, y metodos para el uso de los mismos.

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MX2008000994A
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brain
complex
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MX2008000994A
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Ananda Chakrabarty
Gupta Tapas Das
Tohru Yamada
Arsenio Fialho
Chang Hong
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Univ Illinois
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Abstract

La presente invencion se refiere a metodos y materiales para suministrar un compuesto de cargo en una celula de cancer cerebral y/o a traves de la barrera hematoencefalica. El suministro del compuesto de cargo se realiza por el uso de peptidos de transporte de proteina suministrados a partir de proteinas de la membrana externa de Neisseria, tales como Laz. La invencion tambien proporciona peptidos temporales sinteticos comprendidos del pentapeptido AAEAP. La invencion ademas, describe metodos para tratar cancer y especificamente, cancer cerebral, asi como tambien otras condiciones relacionadas con el cerebro. Ademas, la invencion proporcionar metodos para formar imagenes y diagnosticar el cancer, particularmente, cancer cerebral.

Description

AGENTES DE TRANSPORTE PARA CRUZAR LA BARRERA HEMATOENCEFÁLICA Y HACIA EL INTERIOR DE LAS CÉLULAS DE CÁNCER CEREBRAL, Y MÉTODOS PARA EL USO DE LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN El desarrollo de nuevos fármacos para el cerebro ha progresado a un ritmo mucho más lento que para el resto del cuerpo. Este progreso lento se ha debido en gran parte a la incapacidad de la mayoría de los fármacos para cruzar la pared capilar del cerebro, la cual forma la barrera hematoencefálica (BBB), para entrar el cerebro. Aproximadamente 100% de los fármacos de moléculas grandes, y más del 98% de los fármacos de moléculas pequeñas no cruzan la BBB. Sólo una pequeña clase de fármacos, moléculas pequeñas con una alta solubilidad en lipidos y una masa molecular menor a 400-500 dalton cruzan realmente la BBB. Y de las moléculas pequeñas que cruzan la BBB. Sólo un pequeño porcentaje cruzan la BBB en una cantidad farmacéuticamente significativa (Pardrige, Molecular Innovations 3:90-103 (2003)).
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Sólo algunas enfermedades del cerebro responden a los fármacos de moléculas pequeñas que pueden cruzar la BBB, tales como la depresión, los trastornos emocionales, el dolor crónico y la epilepsia. Muchas más enfermedades del cerebro no responden. Muchas otras enfermedades del cerebro no responden a los fármacos convencionales con masa molecular pequeña, solubles en lipidos, tales como la enfermedad de Alzheimer, apoplejia/neuroprotección, lesiones del cerebro y la medula espinal, cáncer cerebral, infecciones del cerebro por VIH, varios trastornos que producen ataxia, esclerosis lateral a iotrófica, enfermedad de Huntington, errores genéticos congénitos que afectan el cerebro en la infancia, enfermedad de Parkinson y esclerosis múltiples. Aun las pocas enfermedades del cerebro para las cuales están disponibles fármacos de moléculas pequeñas requieren investigación adicional y el desarrollo de nuevos fármacos mejorados. Id. Los cánceres del cerebro son particularmente difíciles de tratar. Las formas comunes de cáncer en el cerebro son el glioblastoma multiforme (GMB) y el astrocitoma anaplásico (AA) . La esperanza de vida de los pacientes con GMB es de aproximadamente 10 a 12 meses, en tanto que la esperanza de vida de los pacientes con AA es de 3 a 4 años. Para los pacientes con GMB, la cirugía prolonga su esperanza de vida unos cuantos meses. (Kufe et al., Cáncer Medicine, §§ 23 y 83, (6a ed. BC. Decker, 2003)). La mayoría de los casos donde el tratamiento del GMB es mediante cirugía e irradiación local resultan en la reincidencia en un radio de 2 a 4 cm de los bordes del tumor original. Id.
Las técnicas actuales para administrar un fármaco que no cruza la BBB hacia el cerebro incluyen la craneotomia, un proceso por el cual se practica un orificio en la cabeza y el fármaco se administra ya sea por inyección intracerebroventricular (ICV) o intracerebral (IC) . Con la administración IC, el fármaco permanece en el sitio del depósito en la punta de la aguja. Con la administración ICV, el fármaco sólo se distribuye hasta la superficie ependimal del ventrículo isolateral y no penetra significativamente en el parénquima cerebral. Por lo tanto, los métodos de administración IVC e IC alcanzan menos del 1% del volumen del cerebro, y existen pocas enfermedades del cerebro que pueden ser tratadas por tal penetración limitada. Id. En contraste, una ruta de administración de fármacos transvascular podría tratar virtualmente el 100% de las neuronas del cerebro. Puesto que cada neurona se inunda por sus propios vasos sanguíneos, un fármaco administrado de manera transvascular puede alcanzar cada neurona del cerebro después de cruzar la BBB. Sin embargo, puesto que no existe ningún sistema de focalización de fármacos que permita que los fármacos crucen la BBB, la ruta de administración transvascular no está disponible para la inmensa mayoría de los fármacos candidatos. A pesar del hecho de que la mayoría de los fármacos y otras moléculas no pueden cruzar la BBB, se sabe que ciertas bacterias y patógenos fúngicos/virales cruzan la BBB para provocar infecciones (Nassif, et al., Trends Microbiol. 10:227-232 (2002)). Tales patógenos bacterianos podrían ser extracelulares, tales como Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae y Escherichia coli K-l, o bien intracelulares, tales como Listeria monocytogenes o Mycobacterium tuberculosis . En tanto que los patógenos intracelulares invaden principalmente las meninges cerebrales ocultándose dentro de leucocitos infectados, los patógenos extracelulares entran al sistema nervioso central diseminándose primero en el flujo sanguíneo y después interactuando directamente con el lado luminal del endotelio cerebral, desestabilizando por ello las compactas uniones de las células del endotelio microvascular del cerebro. (Nassif et al., id; Drevents & Leenen, Microbes Infect. 2:1609-1618 (2000); Kim, Subcell. Biochem. 33:47-59 (2000)). Esta infección permite que los patógenos invadan las meninges cerebrales, provocando meningitis. Usando modelos monocapa y bicapa in vitro para cruzar la BBB, asi como aislando mutantes bacterianos incapaces de pasar a través de tales modelos mono o bicapa, se ha implicado una variedad de proteínas bacterianas en la invasión global y el cruce de la BBB. (Huang & Jong, Cell. Microbiol. 3:277-287 (2001)). Por ejemplo, se ha sugerido los genes de E. coli K-l tales como ibeA, ibeB, aslA, yijP y o pA o los genes de N. meningitidis que codifican las proteínas tales como vellos tipo IV, Opc, Ops, etc, y las proteínas virales tales como la proteina superficial del VIH gpl20, permiten la invasión efectiva y el cruce de la BBB para provocar infecciones. En el caso de los patógenos bacterianos extracelulares, se cree que tales proteínas permiten tanto la adhesión y el traspaso subsecuente de la BBB para la invasión de las meninges. (Nassif et al., id; Hung & Jong, id.), no se ha demostrado que alguna proteina de superficie bacteriana individual facilite el rompimiento de las uniones estrechas para permitir el cruce de la BBB. Un gen similar a azurina existe en muchos gonococos y meningococos, tales como Neisseria gonorrhoeae y N. meningitidis . (Gotschlich & Seiff, FEMS Microbiol. Lett. 43:253-255 (1987); Kawula, et al., Mol. Microbiol. 1:179-185 (1987)). La azurina se produce por un número de bacterias patógenas y existe una homología de secuencia significativa entre tales genes. (Yamada, et al., Cell Microbiol. 7:1418- 1431 (2005)). Un epitope proteinico llamado "H.8" se conserva entre las especies patógenas de ?eisseria y se detecta por el enlazamiento de un anticuerpo monoclonal designado H.8. Dos genes distintos de gonococco, laz y lip, codifican proteínas que reaccionan de manera cruzada con el anticuerpo monoclonal H.8. (Hayashi & u, J. Bioenerg. Biomembr. 22:451-471 (1990)).
Muchos patógenos tienen proteínas similares a azurina, pero la Neisseria es única por tener la región H.8 unida a estas. Laz y Lip son proteínas de superficie externa de gonoccocos que contienen una secuencia consenso lipoproteica del péptido señal que es reconocida por la señal enzimatica bacteriana peptidasa II, la cual procesa la secuencia para resultar en la acilación de N-terminal de un residuo de cisteina con ácidos grasos y glicerol. (Hayasehi & Wu, id.; Yamada, et al., Cell. Microbiol. 7:1418-1431 (2005)). La lipoproteina Lip, de aproximadamente 6.3 kDa, consiste casi completamente de repeticiones pentapeptidicas del motivo o radical Ala-Ala-Glu-Ala-Pro (AAEAP (SEC ID NO:25)), en tanto que la lipoproteina Laz, de aproximadamente 17 kDa, incluye una región de 39 aminoácidos en la N-terminal que contiene repeticiones AAEAP imperfectas (SEC ID NO:25).
(Gotschlich $ Seiff, id; Kawula, et al., id; oods et al., Mol. Microbiiol. 3:43-48 (1989)). Más allá de esta región N-terminal de 39 aminoácidos en Laz se encuentra una región de 127 aminoácidos que es altamente homologa con azurina de P. aeruginosa . (Cannon. Clin. Microbiol. Reivindicación. 2:S1-S4 (1989) ) . Laz está involucrada en la defensa contra la tensión oxidante y la toxicidad del cobre y aumenta la esperanza de vida en el ensayo epitelial ectocervical humano primario ex vivo. (Wu, Et al., Infect. Immun. 73:8444-8448 (2005)). Una tercera proteina de membrana externa de N. gonorrhoeae, Pan 1, también tiene el motivo o radical de repeticiones pentapeptidicas AAEAP (SEC ID NO: 25) . (Hoehn y Clark, Infection and Immunity, 60: 4704-4708 (1992)). El tamaño de Lip varia en las diferentes cepas de Neisseria . En la cepa FA1090, Lip tiene 71 aminoácidos de longitud con 13 repeticiones de AAEAP (SEC ID NO: 25) y seis aminoácidos que no son parte de las repeticiones. En la cepa R10, Lip tiene 76 aminoácidos de longitud con 14 repeticiones de AAEAP (SEC ID NO:25). (Cannon, id.). El péptido Lip purificado es un potente mediador inflamatorio capaz de inducir la liberación de la quimiocina interleucina-8 (IL-8) y la citocina IL-6 por células inmortalizadas del endotelio endocervical humano, y la producción de IL-8 y la activación del factor de transcripción NF-kB por células de riñones embrionarios humanos 293 transfectadas con el receptor 2 similar al toll. (Fisette, et al., J. Biol. Chem. 278:46252-46260 (2003)). A la luz del gran número de pacientes alrededor del mundo con serios trastornos del cerebro y la medula espinal, lo que es necesario es un sistema de trasporte que pueda conducir moléculas hidrofili.cas y moléculas grandes a través de la BBB. Preferiblemente, este sistema de administración tendría un alto grado de especificidad, para permitir que los fármacos sean dirigidos al cerebro sin tener que permeabilizar la BBB en términos generales. Además, un sistema de administración exitoso seria benigno en términos generales y permitirla el uso repetido del sistema en el paciente sin efectos secundarios indeseables. En algunos casos, un sistema de administración exitoso dosificarla un fármaco a todas las áreas del cerebro por igual. En otros casos, el sistema de administración dosificarla los fármacos de manera especifica a las células de cáncer cerebral.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención proporciona péptidos de trasporte derivados de proteínas de la membrana exterior de Neisseria que puede facilitar el trasporte de compuestos de carga enlazados o asociados hacia el interior de las células de cáncer cerebral y/o a través de la barrera sangre cerebro. También se proporcionan complejos de los péptidos de trasporte y sus compuestos de carga, asi como los métodos para usar tanto los complejos y los péptidos de transporte para diagnosticar y tratar el cáncer cerebral, asi como para diagnosticar y tratar otras condiciones relacionadas con el cerebro. Finalmente, la invención proporciona estuches que comprender los péptidos de transporte y/o los complejos, y/o los ácidos nucleicos que codifican los mismos. Un aspecto de la invención lo constituyen péptidos de trasporte aislados los cuales son una variante, derivados o equivalentes estructurales de Laz, Lip o Pan 1 de Neisseria , y los cuales facilitan la entrada de moléculas enlazadas hacia el interior de las células del cáncer cerebral de los mamíferos o a través de la barrera hematoencefálica. La regio H.8 de Laz (SEC ID NO:24) puede tener al menos 90% de identidad de la secuencia de aminoácidos con estos péptidos de transporte. En algunas modalidades, el péptido de tránsito tiene la SEC ID N024. En otras modalidades, los péptidos de transporte se puede modificar para extender u optimizar la vida media del péptido en el flujo sanguíneo. Otro aspecto de la invención lo constituyen péptidos de transporte, los cuales comprender una región de al menos 4 repeticiones imperfectas o perfectas de Ala-Ala-Glu-Ala-Pro (SEC ID NO:25), y los cueles tienen al menos aproximadamente 50% de repeticiones del pentapéptido AAEAP (SEC ID NO: 25) en la longitud total. En algunas modalidades, la región de las repeticiones imperfectas o perfectas es al menos aproximadamente 90% idéntica con un péptido que comprende un número igual de repeticiones de Ala-Ala-Glu-Ala-Pro (SEC ID NO:25). En algunas modalidades, estos péptidos de transporte son sintéticos. En otras modalidades, estos péptidos de tránsito se pueden modificar para extender u optimizar la vida media del péptido en el flujo sanguíneo. Otro aspecto de la invención lo constituyen complejos que comprenden al menos un compuesto de carga enlazado a los péptidos de transporte que comprenden una región que consiste de al menos 4 repeticiones imperfectas o perfectas de Ala-Ala-Glu-Ala-Pro (SEC ID NO: 25), donde esta región no comprende menos de aproximadamente 50% del péptido. Otro aspecto de la invención lo constituyen complejos que comprenden al menos un compuesto de carga enlazado a una variante, derivado o equivalente estructural de Laz, Lip p Pan 1 de Neisseria, y el cual facilita la entrada de una molécula enlazada hacia el interior de las células de cáncer cerebral de los mamíferos o a través de la barrera hematoencefálica. En algunas modalidades, el compuesto de carga es una cupredoxina, tal como azurina, plastocianina, rusticianina, seudoazurina, auracianina y proteina similar a azurina, y específicamente azurina de Pseudomonas aeruginosa. En otras modalidades, el complejo se modifica para extender u optimizar la vida media del péptido en el flujo sanguíneo. Este complejo puede comprender adicionalmente un péptido de transporte derivado de cupredoxina. El compuesto de carga de este complejo puede ser una proteina, lipoproteina, polisacárido, ácido nucleico, tinte, microparticulas, nanoparticulas, toxina y fármaco. En algunas modalidades, el compuesto de cargo es una proteina y el complejo es una proteina de fusión. En otras modalidades, el compuesto de carga es una toxina. El compuesto de cargo puede ser un agente terapéutico para el tratamiento de la depresión trastornos emocionales, dolor crónico, epilepsia, la enfermedad de Alzheimer, apoplejia/neuroprotección, lesiones del cerebro y de la medula espinal, cáncer cerebral, infección del cerebro por VIH, varios trastornos que producen ataxia, esclerosis lateral amiotrófica (ALS) , la enfermedad de Huntington, errores genéticos congénitos que afectan el cerebro durante la infancia, la enfermedad de Parkinson y/o esclerosis múltiple. El compuesto de carga puede ser una substancia detectable, tal como una detectable por fluorimetria, microscopía, CT de rayos X. MRI y/o ultrasónico. En algunas modalidades, el complejo es un portador adecuado farmacéuticamente. El portador adecuado farmacéuticamente puede ser para administración intravenosa. En otras modalidades, el portador aceptable farmacéuticamente es apropiado para inyección intracerebroventricular o intracerebral. Otro aspecto de la invención es un método que comprende poner en contacto una célula o las células con un complejo que comprende al menos un compuesto de carga enlazado a una variante, derivado o equivalente estructural de Laz, Lip o Pan 1 de Neisseria, y el cual facilita la entrada de una molécula enlazada hacia el interior de las células de cáncer cerebral de los mamíferos o a través de la barrera sangre cerebro. Las células pueden ser de un tumor del sistema nervioso central, específicamente de astrocitoma, glioblastoma, maningioma, oligodentroglioma, oligoastrocitoma, glio a, ependimoma, tumores de la medula espinal, gangioglioma, neurocitoma o meduloblastoma. Otro aspecto de la invención es un método para tratar a un paciente con cáncer, en donde el complejo de la invención se administra a un paciente en una cantidad efectiva terapéuticamente. En algunas modalidades, el complejo se administra de manera intravenosa, de manera tópica, de manera subcutánea, o de manera intramuscular o dentro de las células o el tumor. En otras modalidades, el complejo se co-ad inistra con otros tratamientos para el cáncer. Otro aspecto de la invención es un método para generar imágenes del cáncer en un paciente, que comprende administra un complejo con un compuesto de carga detectable a un paciente, y detectar la ubicación del compuesto de carga dentro del paciente. En algunos casos, el compuesto de carga es un agente de contraste de rayos X, el cual se puede detectar por CT de rayos X. En otros casos, el compuesto de carga es un agente de contraste para generación de imágenes por resonancia magnética, el cual se detecta por MRI . En otros casos, el compuesto de carga es un agente de contraste de ultrasonido, el cual se detecta mediante generación de imágenes por ultrasónico. Otro aspecto de la invención es un método para diagnosticas el cáncer, que comprende poner en contacto las células con un complejo de la invención con un compuesto de carga detectable y detectar el compuesto de carga. Otro aspecto de la invención es un estuche médico que comprende un reactivo con un péptido de tránsito aislado, el cual es una variante, derivado o equivalente estructural de Laz, Lip o Pan 1 de Neisseria, y el cual facilita la entrada de una molécula enlazada a las células de cáncer cerebral de mamíferos o a través de la barrera hematoencefálica. En algunas modalidades, el estuche médico comprende además un reactivo que comprende un portador aceptable farmacéuticamente. En otras modalidades, el estuche médico comprende un vehículo para la administración del reactivo. Otro aspecto de la invención lo constituyen moléculas de ácidos nucleicos. En algunas modalidades, los ácidos nucleicos codifican un péptido de tránsito aislado el cual es una variante, derivado o equivalente estructural de Laz, Lip o Pan 1 de Neisseria, y el cual facilita la entrada de una molécula enlazada a las células de cáncer cerebral de mamíferos o a través de la barrera hematoencefálica. En otras modalidades, los ácidos nucleicos codifican péptidos de tránsito que comprenden una región que consiste de al menos 4 repeticiones imperfectas o perfectas de Ala-Ala-Glu-Ala-Pro (SEC ID NO:25), donde esta región no comprende menos de aproximadamente 50% del péptido. En otras modalidades, los ácidos nucleicos codifican complejos que comprenden una proteina de fusión que comprende al menos un compuesto de carga proteinico enlazado con un péptido de tránsito. Otro aspecto de la invención lo constituye un método para tratar o diagnosticar a los pacientes con una condición relacionada con el cerebro, que comprende co-administrar a dichos pacientes el péptido de tránsito de la invención y al menos un compuesto de carga. En otras modalidades, un péptido de transporte derivado de cupredoxina se co-administra con el péptido de tránsito y/o el compuesto de carga.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS La SEC ID NO:l es el ADN geonómico que codifica la secuencia del gen laz de Neisseria gonorrhoeae, No. de acceso al Genbank: Y00530. La SEC ID NO: 2 es el ADN geonómico que codifica la secuencia del gen de azurina de Pseudomonas aeruginosa . La SEC ID NO: 3 es el ADN geonómico que codifica la secuencia de la región H.8 del gen laz de Neisseria gonorrhoeae. La SEC ID NO: 4 es el cebador hacia adelante para amplificar por PCR el gen codificante de Laz (laz) de Nisseria gonorrhoeae. La SEC ID NO: 5 es el cebador inverso para amplificar por PCR el gen codificante de Laz (laz) de Neisseria gonorrhoeae. La SEC ID NO: 6 es el cebador hacia adelante para amplificar por PCR un fragmento de 3.1 kb de pUC18-laz La SEC ID NO: 7 es el cebador inverso para amplificador PCR un fragmento de 3.1 kb de pUC18-laz. La SEC ID NO: 8 es el cebador hacia adelante para amplificar por PCR un fragmento de 0.4 kb de pUC19-paz. La SEC ID NO: 9 es el cebador inverso para amplificar por PCR un fragmento de 0.4 kb de pUC19-paz. La SEC ID NO: 10 es el cebador hacia adelante para amplificar por PCR un fragmento de 3.3 kb de pUC19-paz. La SEC ID NO: 11 es el cebador inverso para amplificar por PCR un fragmento de 3.3 kb de pUC19-paz. La SEC ID NO: 12 es el cebador hacia adelante para amplificar por PCR un fragmento de 0.13 kb de pUC18-laz. La SEC ID NO: 13 es el cebador inverso para amplificar por PCR un fragmento de 0.13 kb de pUC18-laz. La SEC ID NO: 14 es el cebador hacia adelante para amplificar por PCR el gen codificante por GST de pGEX-5X-3. La SEC ID NO: 15 es el cebador inverso para codificar por PCR el gen codificante por GST de pGEX-5X-3.
La SEC ID NO: 16 es el cebador hacia adelante para amplificar por PCR el péptido de señalización y la región codificante de H.8 de laz desde pUC18-laz. La SEC ID NO: 17 es el cebador inverso para amplificar por PCR el péptido de señalización y la región codificante de H.8 de laz a partir de pUC18-laz. La SEC ID NO: 18 es el cebador hacia adelante para amplificar por PCR la región codificante de H.8 a partir de pUC18-laz. La SEC ID NO: 19 es el cebador inverso para amplificar por PCR la región codificante de H.8 a partir de pUC18-laz. La SEC ID NO: 20 es el cebador hacia adelante para amplificar por PCR la región de fusión de GST-H.8 a partir de pGEX-5X-3-H.8. La SEC ID NO: 21 es el cebador inverso para amplificar por PCR la región de fusión de GST-H.8 a partir de pGEX-5X-3-H.8. La SEC ID NO: 22 es la secuencia de aminoácidos de la proteina Laz de la cepa F62 de Neisseria gonorrhoeae, No. de Acceso al Genbank: Y00530. La SEC ID NO: 23 es la secuencia de aminoácidos de la azurina de Pseudomonas aeruginosa . La SEC ID NO: 24 es la secuencia de aminoácidos de la región H.8 de la proteina Laz de Neisseria gonorrhoeae F62. La SEC ID NO: 25 es la secuencia de aminoácidos de un motivo o radical pentapeptidico.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. La Figura 1 describe una representación esquemática de laz de Neisseria gonorrhoeae (A) y paz de Pseudomonas aeruginosa (B) . El gen de P. aeruginosa para la clonación e hiperexpresión en E. coli consiste del gen de azurina en si (paz) y la secuencia del péptido señal (psp) que determina su ubicación periplasmática (B) . La región de H.8 se clonó en fase ya sea en el extremo 5' del gen pz (C) que incluye la secuencia nsp de la señal de Neisseria (pUCld-H.8-paz) o en el extremo 3' del gen paz (D) (pUC19-paz-H.8) . los procedimientos detallados para preparar las construcciones se dan en el Ejemplo 1. naz, la secuencia similar a azurina de Neisseria gonorrhoeae presente en el gen laz; nsp, secuencia del péptido señal de Neisseria. La secuencia del péptido de señal en ambos casos se corta para producir las proteínas Paz madura (periplasmática) y Laz (expuesta en la superficie) , (E) , SDS-PAGE de las proteínas Laz, Paz y de fusión. La migración anómala de las proteínas de fusión de H.8 tales como Laz, H.8-Paz o Paz-H.8 (todas de aproximadamente 17 kDa) se ha notado previamente para las proteínas que contienen H.8 lapidado (Cannon, Clin.
Microbiol. Rev., 2:S1-S4 (1989); Fissette, et al., J. Biol. Chem. 278:46252-46260 (2003)). Figura 2. La Figura 2 representa las gráficas que ilustran el grado en el cual las proteínas de fusión h8-paz son citotóxicas para varias células cancerosas. (A) citotoxicidad del péptido H.8 sintético, fusiones de Paz, Laz y H.8 en el extremo carboxi terminal de Paz (Paz-H.8) y el extremo amino terminal de Paz (H.8-Paz) hacia las células de glioblastoma LN-229. Las células se trataron con las proteínas a 3 concentraciones diferentes (10, 20 u 40 µM) por 6. 12 y 24 h. EL ensayo MMT se hizo para medir la extensión de células vivas, para explicar la citotoxidad (muerte celular porcentual) . Para calcular la citotoxidad porcentual, se asumió que el valor de las células viables no tratadas era el 100% y el número de células viables se determinó en las muestras tratadas con las proteínas de fusión Paz, Laz y H.8. La extensión de la citotoxicidad (%) se determinó entonces a partir del número de células muertas (B) Citotoxidad del péptido H.8, Paz, Paz-H.8, H.8-Paz y Laz hacia el cáncer de pecho humano. Todas las condiciones del tratamiento son similares a (A) de arriba. Figura 3. La Figura 3 representa la entrada de varias proteínas etiquetadas de manera fluorescente en las células de glioblastoma LN-229 y de cáncer de pecho MCF-7. (A) el péptido H.8, Paz-H.8, H.8-paz y Laz (20 µM) conjugadas con Alexa flúor® 568 se incubaron con las células de LN-229 sobre una cubierta de vidrio a 37 °C durante 30 minutos, después de lo cual se tomaron imágenes. (B) Internalización en las células MCF-7 de varias proteínas conjugadas con Alexa flúor® 568 cuando se observan por medio de microscopía confocal y como se describe para (A) . (C) La internalización de Laz se observó por microscopía confocal. Varias concentraciones (2, 4, 8 y 16 µM) de Laz etiquetada de manera fluorescente se incubaron con las células LN-229 durante 30 min a 37 °C. Los núcleos se etiquetaron en azul con DAPI (4,6-diamino-2-fenilindol) . (D) Laz (10 µM) conjugada con Alexa flúor® se incubó con células LN-229 durante varios periodos de tiempo (5, 10, 20 y 30 min) a 37°C) . La internalización de observó por medio de microscopía confocal. (E) Paz (10 µM) conjugada con Alexa fl or® se incubó con células LN-229 sobre una cubierta de vidrio a 37 °C durante varios tiempos, después de lo cual se tomaron imágenes. se detectó muy poca fluorescencia medible en (E) . Figura 4. La Figura 4 representa gráficas de barras que indican la cuantificación de la fluorescencia encontrada en las imágenes de microscopio confocal en las Figuras 3A-3D. (A) Cuantificación de la fluorescencia en la imágenes de la Figura 3A. La cuantificación de la fluorescencia en las proteínas de azurina se hizo usando Adobe® Photoshop®. Las barras de error representan la desviación estándar de la fluorescencia en tres diferentes células en una sola muestra. (B) Cuantificación de la fluorescencia en las imágenes de la Figura 3B. La cuantificación se llevó a cabo como en la Figura 4A. (C) Cuantificación de las fluorescencia en las imágenes de la Figura 3C. La cuantificación se llevó a cabo como en la Figura 4A. (D) Cuantificación de la fluorescencia en las imágenes de la Figura 3D. La cuantificación se llevó a cabo como en la Figura 4A. Figura 5. El tratamiento combinado con las proteina de fusión H.8-GST facilita la asimilación de Paz etiquetada con Alexa fl or® en células de glioblastoma LN-229. Sin etiquetar, 20 µM de (A) H.8, (B)GST, (C)GST-H.d, (D)H.8-GST, (E) amortiguador de PBS y 20 µM de Paz conjugada con Alexa flúor® 568 se incubaron con células de LN-229 por 30 min a 37 °C. La internalización se observó por medio de microscopía confocal. (F) Citotoxiciddad del péptido de H.8 sintético, GST y derivados de fusión de GST-H.8/H.8-GST con o sin Paz. Aproximadamente 5xl03 células de LN-229 se cultivaron en placas de cultivo de 96 pozos y se trataron con 20 µM de cada uno del péptido H.8, GST-H.8, H.8-GST o el mismo volumen de amortiguador durante 24 h (+Paz) o sin (-Paz) 20 µM de Paz. Figura 6. La Figura 6 ilustra imágenes de cerebros de ratón inyectados con Paz, H.8-Paz y Laz conjugados con IRdye® 800CW (LI-COR Biotechnology, Lincoln Nebraska) . (A) Imágenes del cerebro de ratones vivos. Quinientos µg de Paz, H.8-Paz y Laz conjugadas con IRdye® 800CW se inyectaron de manera intraperitoneal en ratones desnudos vivos. Después de 24 h, los ratones se sacrificaron, se sacaron sus cerebros y se detectó y se midió la fluorescencia con el sistema de Imágenes Infrarrojas Li-COR Odyssey®. (B) Imágenes de la región del mesencéfalo rostral de cerebros de ratones desnudos tratados como en (A) . Los cerebros de los ratones se cortaron horizontalmente y se tomaron las imágenes. Figura 7. La Figura 8 representa imágenes de ds-PAGE, transferencia Western y de microscopio confocal de las proteínas de fusión H.8-GST en E. coli . (A) Células de E. coli BL21 (D33) que se clonaron con los genes gst, H.8-gst o gst-H.8 se cultivaron a 37 °C con IPTG 1 mM. Los aglomerados celulares se lavaron con PBS dos veces, y los Usados celulares se sometieron a SDS-PAGE. Se usó teñido con azul de Coomassie para la detección de las proteínas. (B) EL procedimiento de arriba se repitió pero esta vez tanto los Usados celulares completos y los contenidos del espacio periplasmático se aislaron, se sometieron a SDS-PAGE (20 µg) y las proteínas de fusión de GST y H.8-GST se detectaron por transferencia Western con anticuerpo monoclonal anti-GST para determinar las concentraciones total y periplasmática de las proteínas. (C) Células de la cepa BL21(DE) de E. coli que hospedan los genes clonados GST, H.8-gst o gst-H.8 (Tabla 5) se cultivaron a 37°C con IPTG 0.4 mM. Un mL de cada uno de estos cultivos bacterianos se sometió a centrifugación y los aglomerados celulares resultantes se recolectaron. Después del lavar dos veces con PBS, se aplicó un mL de FBS-PBS al 1% conteniendo el anticuerpo anti-GST (1:2000) . Las suspensiones celulares e incubaron por 1 h y después se lavaron dos veces con PBS. Las células bacterianas se incubaron con igG anticonejo conjugado con FITC en FBS-PBS al 1% por 30 min. Para eliminar el anticuerpo no enlazado, las células se lavaron otra vez, y se fijaron con etanol en hielo. Las muestras de E. coli tratadas con DAPI (que imparte coloración azul) se observaron bajo un microscopio confocal (Objetivo xlOO), y también se fotografiaron células individuales. (D) Células de E. coli que alojan el pUC19-paz (azurina de P. aeruginosa) , pUC19-laz (Neisseria), pUC18-H.8-paz o pUC18-paz-H.8 se cultivaron a 37 °C durante toda la noche en presencia de IPTG 1 mM. 0.5 mL de cada uno de tales cultivos se sometió a centrifugación y los aglomerados bacterianos resultantes se lavaron dos veces con PBS enfriado. El anticuerpo anti-azurina (1:500) en 1 mL de FBS-PBS al 1% se aplicó y se incubó en hielo por 1 h. Después del lavado con PBS dos veces, se aplicó el anticuerpo anti-conejo conjugado con FITC, se incubó en hielo por 30 min, se lavó dos veces con PBS y se fijó con etanol frió. Las muestras bacterianas se observaron por medio de microscopía confocal (objetivo xlOO) .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES Definiciones Como se usa aquí, el término "célula" incluye tanto el singular o el plural del término, a menos que se describa específicamente como una "célula individual". Como se usa aqui, los términos "polipéptido", "péptido", y "proteina", se usan de manera intercambiable para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a los polímeros de aminoácidos en los cuales uno o más residuos de aminoácidos son análogos químicos artificiales de un aminoácido de formación natural correspondiente. Los términos también se aplican a los polímeros de aminoácidos de formación natural. Los términos "polipéptido", "péptido", y "proteina" también incluyen las modificaciones que incluyen, pero no se limitan a, glicolisación, enlazamiento a lipidos, gamma-carboxilación de residuos de ácido glutámico, hidroxilación y ribosilación por ADP. Se apreciará que los polipéptidos no siempre son completamente lineales. Por ejemplo, los polipéptidos pueden ser ramificados como resultados de la ubiquitinación y estos pueden ser circulares (con o sin ramificaciones) por lo general como resultado de eventos de post-traducción, incluyendo un evento de procesamiento natural y eventos provocados por la manipulación humana, los cuales no ocurren de manera natural. Los polipéptidos circulares, ramificados o circulares ramificados pueden ser sintetizados por procesos de naturales de introducción y por métodos completamente sintéticos también. Un péptido sintético es uno fabricado sin la ayuda de componentes celulares. Los métodos sintéticos para fabricar péptidos son bien conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente. Además, esta invención contempla el uso de las variantes de las proteínas de la invención, de las amino terminales que contienen metionina y sin metionina. Como se usa aqui, el término "condición" incluye derivaciones anatómicas o fisiológicas de lo que es normal, que constituyen un deterioro del estado normal de los animales vivientes o una de sus partes, lo que interrumpe o modifica el funcionamiento de las funciones corporales. Como se usa aqui, el término "inhibir el crecimiento celular" significa el retardo o la detención de la división celular y/o la expansión celular. Este término también incluye la inhibición del crecimiento de las células o el aumento de la muerte celular. Como se usa. aqui, el término "que sufre de" incluye, el que se exhiban actualmente los síntomas de una condición, que se tenga una condición aun sin síntomas observables, en recuperación de una condición, y recuperado de una condición. Como se usa aqui, el término "tratamiento incluye prevenir, reducir, detener o invertir el avance o la severidad de la condición o los síntomas asociados con una condición que se este tratando. En si, el término "tratamiento" incluye la administración médica, terapéutica, y/o profiláctica, según sea apropiado. Una "cantidad efectiva terapéuticamente" es una cantidad efectiva para evitar, reducir, detener o invertir el desarrollo de, o aliviar parcialmente o totalmente los síntomas existentes de una condición particular por la cual se este tratando a un sujeto. La determinación de una condición efectiva terapéuticamente también está dentro de las capacidades de aquellas personas experimentadas en la técnica. El término "substancialmente puro", como se usa aqui, cuando se usa para modificar una proteina u otros productos celulares de la invención, se refiere a, por ejemplo, una proteina aislada del medio de cultivo o los contenidos celulares, en una forma substancialmente libre de, sin adulteración por, otras protecciones y/o compuestos inhibidores activos. El término "substancialmente puro" se refiere a un factor en una cantidad de al menos aproximadamente 75%, en peso seco, de fracción aislada, o al menos "substancialmente 75% puro". Más específicamente, el término "substancialmente puro" se refiere a un compuesto con al menos 85%, en peso seco, de compuesto activo, o al menos "substancialmente 85% puro". Más específicamente, el término "substancialmente puro" se refiere a un compuesto con al menos aproximadamente 95%, en peso seco, de compuesto activo, o al menos "substancialmente 95% puro". El término "substancialmente puro" también se puede usar para modificar una proteina o compuesto de la invención preparado sintéticamente, donde, por ejemplo, la proteina sintética se aisla de los reactivos y subproductos de la o las reacciones de síntesis. El término "grado farmacéutico", como se usa aqui, cuando se refiere a un péptido o compuesto de la invención, es un péptido o compuesto que está substancialmente o esencialmente aislado de los componentes que acompañan normalmente a los materiales cuando estos se encuentran en su estado natural, incluyendo los reactivos y subproductos de la síntesis, y substancialmente o esencialmente asilados de los componentes que perjudicarían su uso como fármacos. Por ejemplo, un péptido de "grado farmacéutico" puede ser un aislado de cualquier carcinógeno. En algunos casos, "grado farmacéutico" puede ser modificado por el método de administración deseado, tal como "grado farmacéutico intravenoso", con el fin de especificar que un péptido o compuesto está aislado substancialmente o esencialmente de cualquier sustancia que pudiera volver la composición inadecuada para la administración intravenosa a un paciente.
Por ejemplo, un péptido "grado farmacéutico intravenoso" puede ser aislado de los detergentes, tales como el SDS, y los agentes antibacterianos, tales como la azida. Las frases" aislado", "purificado" o "biológicamente puro" se refiere a los materiales que están substancialmente o esencialmente libres de los componentes que acompañan normalmente a los materiales cuando estos se encuentran en su estado natural. Por lo tanto, los péptidos aislados, de acuerdo con la invención, preferiblemente no contienen los materiales asociados normalmente con los péptidos en sus ambientes in situ. Una región "aislada" se refiere a una región que no incluye la secuencia completa del polipéptido del cual se derivó la región. Un ácido nucleico, proteina "asilado" o los fragmentos respectivos de los mismos, han sido extraídos substancialmente de su ambiente in vivo, de manera que estos pueden ser manipulados por los artesanos experimentados, tales como pero no limitado a, secuenciamiento de nucleótidos, digestión de restricción, mutagénesis dirigida al sitio, y subclonación en vectores de expresión para un fragmento de ácido nucleico, si como obtención de la proteina o fragmentos de la proteina en cantidades substancialmente puras. El término "variante" como se usa aqui con respecto a un péptido, se refiere a las variantes de una secuencia de aminoácidos la cual puede tener aminoácidos reemplazados, eliminados, o insertados en comparación con el polipéptido del tipo silvestre. Las variantes puede ser truncamientos del péptido de tipo silvestre. Una "adición" es la remoción de uno o más aminoácidos desde el interior de la proteina de tipo silvestre, en tanto que un "truncamiento" es la eliminación de uno o o más aminoácidos de uno o más extremos de la proteina de tipo silvestre. Por lo tanto un péptido variante puede hacerse por manipulación de los genes que codifican el polipéptido. Una variante se puede preparar alterando la composición o las características básicas del polipéptido, pero al menos no alguna de sus actividades fundamentales. Por ejemplo, una "variante", del péptido de tránsito de Neisseira puede ser un péptido de tránsito de Neisseria mutado que retiene su habilidad para cruzar la BBB y/o entrar a las células de cáncer cerebral. An algunos casos, un péptido variante se sintetiza con aminoácidos no naturales, tales como los residuos de e- (3, 5-dinitrobensoil) -Lys. (Ghadiri & Ferholz, J. Am. Chem. Soc. 112 112:9633-9635 (1990) ) . En algunas modalidades, la variante no tiene más de 20, 19, 18, 17 o 16 aminoácidos reemplazados, eliminados o insertados, en comparación con el péptido de tipo silvestre. En algunas modalidades, la variante no tiene más de 15, 14, 13, 12, u 11 aminoácidos reemplazados, eliminados o insertados, en comparación con el péptido del tipo silvestre. En algunas modalidades, la variante no tiene más de 10, 9, 8 o 7 amino ácidos reemplazados, eliminados o insertados, en comparación con el péptido de tipo silvestre. En algunas modalidades, la variante no tiene más de 6 aminoácidos reemplazados, eliminados o insertados, en comparación con el péptido de tipo silvestre. En algunas modalidades, la variante no tiene más de 5 o 4 aminoácidos reemplazados, eliminados o insertados, en comparación con el péptido de tipo silvestre. N algunas modalidades, las variante no tiene más de 3, 2, o 1 aminoácido reemplazados, eliminados o insertados, en comparación con el péptido de tipo silvestre. El término "aminoácidos", como se usa aqui, significa una porción aminoacidica que comprende cualquier residuo aminoacidico de formación natural, de formación no natural o sintético, es decir, cualquier porción que comprenda al menos un carboxilo y al menos un residuo de amino enlazado directamente por uno, dos, tres o más átomos de carbono, típicamente un(a) átomo de carbono. El término "derivado" como se usa aqui con respecto a un péptido, se refiere a un péptido que se deriva del péptido objetivo. Una derivación incluye las modificaciones químicas del péptido, de manera tal que el péptido retiene aun algunas de sus actividades fundamentales. Por ejemplo, un "derivado" de un péptido de tránsito de Neisseria puede ser un péptido de tránsito de Neisseria modificado químicamente, el cual retiene su habilidad para cruzar la BBB y/o entrar a las células de cáncer cerebral. Las modificaciones químicas incluyen, pero no se limitan a amidación, acetilación, sulfación, modificación por polietilenglicol, fosforilación o glicosilación del péptido. Además, un péptido derivado puede ser una fusión de un polipéptido o fragmento del mismo a un compuesto químico, tales como, pero no limitados a, otros péptidos, moléculas farmacológicas u otros agentes terapéuticos o farmacéuticos o una sonda detectable. El término "identidad porcentual (%) de la secuencia de aminoácidos" se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en un polipéptido que son idénticos con los residuos de aminoácidos en una secuencia candidata cuando las dos secuencia se alinean. Para determinar el % de identidad de aminoácidos, las secuencias se alinean y si es necesario, se introducen huecos para lograr el % máximo de identidad de la secuencia; las substituciones conservativas no se consideran como parte de la identidad de la secuencia. Los de alineación de las secuencias de aminoácidos para determinar la identidad porcentual son bien conocidos por aquellas personas experimentadas en la técnica. Con frecuencia se usan programas de computadora que se pueden conseguir públicamente, tales como los programas BLAST, BLAST2, ALIGN2 o Megalign (DNASTAR) , para alinear las secuencias peptidicas. En una modalidad especifica, se usa el Blastp (disponible del National Center for Biotechnology Information, Beteshda MD) , usando los parámetros por defecto de filtro de complejidad larga, expectación 10, tamaño de la palabra 3, existencia 11, y extensión 1. Cuando se alinean las secuencias de aminoácidos, el % de identidad de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A, a, con, o contra una secuencia de aminoácidos dada B (la cual se puede expresar alternativamente como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o que comprende un cierto % de identidad de la secuencia de aminoácidos a, con, o contra una secuencia de aminoácidos dada B) se puede calcular como: % de identidad de la secuencia de aminoácidos = X/Y*100 donde X es el número de residuos de aminoácidos calificados como coincidencias idénticas por la alineación del programa o el algoritmo de alineación de secuencias de A y B, e Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Si la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de la secuencia de aminoácidos de a y B no será igual al % de identidad de la secuencia de aminoácidos de B a A. Cuando se comparan secuencias más largas con secuencias más cortas, la secuencia más corta será la secuencia "B". por ejemplo, cuando se comparan péptidos truncados con el polipéptido correspondiente de tipo silvestre, el péptido truncado será la secuencia "B".
General La presente invención se refiere a métodos y materiales para suministrar un compuesto de carga a través de la barrera hematoencefálica (BBB) y/o hacia dentro de las células de cáncer cerebral, y los materiales y métodos para el tratamiento del cáncer del cerebro de mamíferos, asi como otras condiciones del cerebro y el sistema nervioso central. Como se describe aqui, se sabe ahora que las regiones peptidicas compuestas de repeticiones del motivo o radical AAEAP (SEC ID NO: 25) permitirán que los péptidos asociados o fusionados sean transportados a través de la barrera hematoencefálica y/o hacia el interior de células de cáncer cerebral de mamíferos. Más específicamente, la región H.8 de la proteina Laz de Neisseria gonorrhoeae puede ser usada para transportar las proteínas asociadas o fusionadas y otros compuestos a través de la BBB y/o hacia el interior de las células de cáncer cerebral. Además, se contempla que los péptidos similares a la región H.8 en el uso de las repeticiones pentapeptidicas AAEAP (SEC ID NO:25), puedan ser usados para transportar proteínas y otros compuestos de carga a través de la BBB y/o hacia el interior de las células de cáncer cerebral, tal como parte o toda la proteina Lip y parte de o toda la proteina Pan 1, ambas de Neisseria gonorrhoeae. Los compuestos de carga suministrados por la presente invención incluyen, pero no se limitan a, proteínas, lipoproteinas, polisacáridos, ácidos nucleicos, incluyendo ácidos nucleicos antisentido, tintes, etiquetas fluorescentes o radioactivas, microparticulas o nanoparticulas, toxinas, moléculas inorgánicas y orgánicas, moléculas pequeñas, y fármacos. En algunas modalidades, los fármacos y/o las toxinas matan las células tumorales. En otras modalidades, los compuestos de carga tratan varias condiciones del cerebro. Se sabe que muchas proteínas de cupredoxina, tales como la azurina de Pseudomonas aeruginosa, tienen la habilidad de entrar específicamente en, y matar muchos tipos de células cancerosas de mamíferos (Yamada et al., Cell.
Biol. 7:1418-1431 (2005); Hiraoka et al., PNAS 101:6427-6432 (2004); Hiraoka et al., Biochem. Biophys . Red. Co m. 338:1284-1290 (2005)). También se sabe que la azurina de P. aeruginosa no es citotóxica hacia las células cancerígenas del cerebro, tales como las células de glioblastoma. Véase el Ejemplo 2. Sorprendentemente, se sabe ahora que la proteina Laz, una proteina similar a azurina de Neisseria gonorrhoeae y otras especies de Neisseria pueden entrar específicamente en, y matar las células cancerígenas del cerebro tales como las células de glioblastoma, asi como otros tumores. Véanse los Ejemplos 2 y 7. Además, se sabe ahora que la región H.8 de la proteina Laz puede conferir a la azurina de P. aeruginosa , cuando se fusiona ya sea con su N-terminal o su C-terminal, la habilidad de entrar y matar las células de glioblastoma. Véanse los Ejemplos 2 y 3. También de manera sorprendente se sabe ahora que la región H.8 no debe estar enlazada físicamente a una proteina coadministrada, tal como la azurina, para conferir a esa proteina la habilidad de entrar a las células de glioblastoma. Véase el Ejemplo 5. la H.8 y la H.8 fusionada con la N-terminal de GST aumentan ambos la entrada de la azurina no enlazada físicamente, hacia el interior de las células, en comparación con la azurina a solas, sin embargo, la H.8 fusionada con la C-terminal de GST fue inefectiva. Además, la H.8 y la H.8 fusionada con la n-terminal de GST cuando se coadministra con la azurina, mejoran ambos la citotoxicidad de la azurina hacia las células de glioblastoma. Véase el Ejemplo 5. De manera sorprendente, se sabe ahora que el dominio de H.8 de Laz confiere a las proteínas con las cuales de fusiona, la habilidad de cruzar la barrera sangre cerebro en ratones vivos y de confinarse en un sitio en el cerebro. Véase el Ejemplo 6.
Finalmente, se sabe ahora que la región H.8 es responsable del despliegue superficial de proteínas fusionadas en E. coli. Véase el Ejemplo 7. Aunque la GST y la GST con H.8 fusionada en la C-terminal se acumulan ambas en el espacio periplasmático de la E. coli que las expresa. La GST con H.8 fusionada en la N-terminal se transporta a la superficie de las células de E. coli . Aunque no se desea limitar la invención a ningún mecanismo de acción, la habilidad de la región H.8 para provocar- el transporte de una proteina fusionada a la superficie de las células bacterianas se puede relacionar con la habilidad de la región H.8 para permitir que las proteínas fusionadas crucen la BBB. Ya que los meningococos tales como N. Meningi tidis cruzan la BBB para invadir las meninges cerebrales (Nassif, et al., id, Huang & Jong, id.), es probable que tales bacterias usen los componentes celulares expuestos en la superficie para alterar la BBB. Las vellosidades tipo IV de N. meningitidis están implicados en la formación de las prominencias membranas similares a microvellosidades, y se sabe que la retracción de tales vellosidades . juega un papel central en las interacciones entre la Neisseria y las células humanas. (Pujol et al., P?AS 96:4017-4022 (1999); Merz et al., ?ature 407:98-102 (2002)). Sin embargo, se sabe que las vellosidades tipo IV se retraen enseguida de la formación de contactos mediada por vellosidades con otras células y se piensa que otros componentes superficiales desconocidos de la N. meningitidis son responsable del cruce de la BBB. (Nassif et al., id.), es posible por lo tanto que la región H.8 desplegada en la superficie, este involucrada directamente para permitir que la Neisseria cruce la BBB e interactúe con las células cancerígenas del cerebro. La región H.8 de Laz es la región de 39 aminoácidos en la N-terminal de Laz, la cual contiene repeticiones pentapeptidicas AAEAP (SEC ID NO: 25) imperfectas. Se contempla que esta unidad de repetición AAEAP (SEC ID NO: 25) pueda ser usada para diseñar péptidos que transportarán cargas a través de la BBB y/o hacia el interior de células cancerosas cerebrales. Además, se contempla que la secuencia de aminoácidos de otras proteínas de la membrana externa de Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningi tis con las repeticiones de AAEAP (SEC ID NO: 25) puedan ser usadas para diseñar péptidos que transportaran cargas a través de la BBB y/o hacia el interior de células cancerosas cerebrales. Otras proteínas de interés de la membrana exterior de Neisseria incluyen, pero no se limitan a Lip y Pan 1. (Trees et al., J. clin. Microbiol. 38:2914-2916 (2000); Hoehn y Clark, Infection and Immunity 60:4704-4708 (1992)). La presente invención se refiere a métodos y materiales para suministrar compuestos de carga a través de la barrera hematoencefálica hacia el interior de . las células cancerosas cerebrales. El suministro de los compuestos de carga de acuerdo con esta invención se realiza por medio del uso de un péptido de tránsito adecuado. En una modalidad de la invención, el compuesto de cargo está enlazado con un péptido de tránsito de Neisseria o AAEAP de la invención. En otra modalidad, el compuesto de carga se co-administra con un péptido de tránsito de Neisseria o AAEAP de la invención, en otra modalidad, el compuesto de carga está enlazado con un péptido de transporte derivado de cupredoxina y un péptido de tránsito de Neisseria o AAEAP de la invención. En una modalidad, un compuesto de carga se suministra para inhibir el crecimiento celular en células cancerosas, tales como las células cancerosas cerebrales. Tales células cancerosas pueden ser parte de, por ejemplo, un astrocitoma, glioblastoma, meningio a, oligodentroglioma, oligoastrocitoma, glioma, ependioma, tumores de la medula espinal, ganglioma, neurocitoma y meduloblastoma. Por ejemplo, el compuesto de carga puede ser una proteina de control del ciclo celular, tal como p53; un inhibidor de cinasa dependiente de ciclina, tales como pl6, p21, o p27; una proteina suicida, tales como timidina cinasa o nitroreductasa; una citocina u otras proteínas inmunomoduladoras tales como interleucina 1, interleucina 2 o el factor estimulante de la colonia de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) ; o una toxina, tales como la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, entre otros. En algunas modalidades se suministra un fragmento biológicamente activo de una o más de las clases anteriores. En otras modalidades, el compuesto de carga se suministra con el fin de generar una imagen del tejido objetivo. Por ejemplo, el tejido objetivo puede ser un cáncer y el compuesto de carga puede ser uno usado comúnmente para generar una imagen para la detección por tomografia computarizada de rayos X (CT) , Exploración por Resonancia Magnética (MRI) y ultrasónico. En estas modalidades, el compuesto de carga puede ser um radioisótopo que emita rayos gamma o positrones, un agente de contraste de para formación de imágenes por resonancia magnética, un agente de contraste de rayos X, y/o un agente de contraste de ultrasónico. En otras modalidades, el compuesto de carga se puede suministrar para tratar una condición relacionada con el cerebro.
Péptidos de Tránsito de Neisseria y AAEAP La invención da lugar a péptidos de tránsito que permiten el transporte de cargas enlazadas o asociadas hacia el interior de células cancerosas cerebrales de mamífero pero no a las células no cancerosas, y/o a través de la BBB. Se ha descubierto que las proteínas • de la membrana externa de Neisseria y otras, tales como Laz, comprender un dominio de tránsito de proteínas, el dominio H.8, el cual facilita la entrada de cargas enlazadas hacia el interior de células cancerosas cerebrales de mamíferos y/o a través de la BBB. La invención proporciona péptidos de tránsito de Neisseria derivados de las proteínas de la membrana exterior de Neisseria. La invención proporciona además dominios de tránsito naturales o sintéticos que comprender repeticiones del pentapeptido AAEAP (SEC ID NO:25), que se pueden usar para transportar cargas enlazadas o asociadas hacia el interior de las células cancerosas cerebrales de mamíferos y/o a través de la BBB. El término "péptido de tránsito de Neisseria" se refiere a todos los fragmentos de una proteina de la membrana exterior de Neisseria que incluyan la secuencia de amino que se requiere para la entrada de una carga hacia el interior de las células cancerosas cerebrales y/o a través de la BBB. Las proteínas de la membrana exterior de Neisseria adecuadas incluyen, pero no se limitan a Laz, Lip o Pan 1 de N. gonorrhoeae. La proteina Laz de N. meningitidis y de N. gonorrhoeae son de particular interés. La determinación de cuáles proteínas de la membrana exterior que incluyen la secuencia de amino que se requiere para la entrada de una carga hacia el interior de las células cancerosas cerebrales y/o a través de la BBB se puede llevar a cabo por cualquier método que identifique esos péptidos requeridos para la entrada hacia el interior de una célula cancerosa cerebral o el paso a través de la BBB. En uno de tales métodos, toda o un fragmento de una proteina de la membrana exterior de Neisseria se enlaza a una sustancia marcadora y se lleva a cabo un ensayo para determinar si toda o un fragmento de una proteina de la membrana exterior de Neisseria entra a una célula cancerosa cerebral y/o cruza la BBB. Los métodos que pueden ser usados para identificar las proteínas de la membrana exterior de Neisseria o los fragmentos de las mismas, se encuentran en los Ejemplos 4 y 7. Las proteínas de la membrana exterior de Neisseria las cuales se pueden usar en la invención incluyen las proteínas de la membrana exterior de una especie de Neisseria que son reconocidas por el anticuerpo de H.8 y/o se componen de varias repeticiones perfectas o imperfectas del motivo o radical AAEAP (SEC ID NO:25). En algunas modalidades, los péptidos de tránsito de Neisseria son reconocidos por el anticuerpo de H.8. La metodología y los parámetros para determinar se una proteina o péptido es reconocido por el anticuerpo de H.8 se describen en Cannon et al., Infection and Immunity 43:994-999(1984). La invención también proporciona péptidos de tránsito de AAEAP, los cuales son péptidos que se componen de varias repeticiones perfectas o imperfectas del motivo o radical AAEAP (SEC ID NO: 25) que pueden transportar compuestos de carga enlazados o asociados hacia el interior de las células cancerosa cerebrales de mamíferos y/o a través de la BBB. Una repetición "imperfecta" como se usa aqui, se define como una repetición del pentapéptido AAEAP (SEC ID NO: 25) donde al menos uno de los cinco aminoácidos no es parte del motif AAEAP (SEC ID NO:25). En otras modalidades, la repetición imperfecta puede tener o no más de 1, 2, 3, o 4 aminoácidos que no son parte del pentapéptido de AAEAP (SEC ID NO:25). En algunas modalidades, el péptido de tránsito de Neisseria constituye los aminoácidos 1 a 39 de la proteina Laz (SEC ID NO:24). En algunas modalidades, el péptido de tránsito de Neisseria tiene al menos aproximadamente 20 aminoácidos de longitud, al menos aproximadamente 40 aminoácidos de longitud, al menos aproximadamente 60 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 80 aminoácidos de longitud. En otras modalidades, el péptido de tránsito de Neisseria no tiene más de 40 aminoácidos de longitud, no más de aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, no más de aproximadamente 200 aminoácidos de longitud, o no más de aproximadamente 400 aminoácidos de longitud. En algunas modalidades, el péptido de tránsito de Neisseria tiene al menos 90% de identidad de la secuencia de aminoácidos, al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia de aminoácidos o al menos aproximadamente 99% de identidad de la secuencia de aminoácidos con una proteina de la membrana exterior de Neisseria, tal como la SEC ID NO: 22. El término "péptido de tránsito de AAEAP (SEC ID NO:25)" se refiere a un péptido que se compone de una región de repeticiones pentapeptidicas de AAEAP (SEC ID NO: 25) perfectas o imperfectas) . El péptido de tránsito de AAEAP (SEC ID NO: 25) puede ser sintetizado por medio de los métodos estándar, o puede ser reproducido por medio de sistemas de expresión basados en células. En algunas modalidades, el péptido de tránsito de AAEAP (SEC ID NO: 25) se compone de al menos 2 repeticiones pentapeptidicas de AAEAP (SEC ID NO:25), al menos 4 repeticiones pentapeptidicas de AAEAP (SEC ID NO:25), al menos 6 repeticiones pentapeptidicas de AAEAP (SEC ID NO: 25), al menos 8 repeticiones pentapeptidicas de AAEAP (SEC ID NO:25), al menos 10 repeticiones pentapeptidicas de AAEAP (SEC ID NO:25), al menos 15 repeticiones pentapeptidicas de AAEAP (SEC ID NO:25), o al menos 20 repeticiones pentapeptidicas de AAEAP (SEC ID NO:25). Enm algunas modalidades, el péptido de tránsito de AAEAP (SEC ID NO: 25) se compone de no más de 10 repeticiones pentapeptidicas de AAEAP (SEC ID NO: 25), no más de 20 repeticiones pentapeptidicas de AAEAP (SEC ID NO: 25), no más de 30 repeticiones pentapeptidicas de AAEAP (SEC ID NO: 25), o no más de 40 repeticiones pentapeptidicas de AAEAP (SEC ID NO: 25) . En algunas modalidades, el péptido de tránsito de AAEAP (SEC ID NO: 25) se compone sólo de repeticiones pentapeptidicas perfectas de AAEAP (SEC ID NO: 25), sólo de repeticiones pentapeptidicas perfectas de AAEAP (SEC ID NO: 25) , o de una mezcla de repeticiones pentapeptidicas perfectas o imperfectas de AAEAP (SEC ID NO: 25) . En algunas modalidades, el péptido de tránsito de AAEAP (SEC ID NO: 25) consiste sólo de repeticiones pentapeptidicas de AAEAP (SEC ID NO: 25) . En otras modalidades, el péptido de tránsito de AAEAP (SEC ID NO: 25) consiste de al menos aproximadamente 95% de repeticiones pentapeptidicas de AAEAP (SEC ID NO: 25) a través de la longitud total, al menos aproximadamente 90% de repeticiones pentapeptidicas de AAEAP (SEC ID NO: 25) a través de la longitud total, aproximadamente 80% de repeticiones pentapeptidicas de AAEAP (SEC ID NO: 25) a través de la longitud total, al menos aproximadamente 50% de repeticiones pentapeptidicas de AAEAP (SEC ID NO: 25) a través de la longitud total. En algunas modalidades, la región de repeticiones es al menos aproximadamente 70% idéntica, al menos aproximadamente 80% idéntica, al menos aproximadamente 90% idéntica, o al menos aproximadamente 95% idéntica con un péptido que comprende un número igual de repeticiones de Ala-Ala-Glu-Ala-Pro (SEC ID NO:25). En algunas modalidades, el péptido de tránsito de Neisseria y/o el péptido de tránsito de AAEAP (SEC ID NO: 25) se puede usar para facilitar el trasporte de la carga enlazada selectivamente hacia el interior de las células cancerosa cerebrales de mamíferos y/o a través de la BBB. En otras modalidades, el péptido de tránsito de Neisseria y/o el péptido de tránsito de AAEAP (SEC ID NO: 25) se puede usar para transportar cargas coadministradas, hacia el interior de las células cancerosa cerebrales de o a través de la BBB.
Modificación de un Dominio de Tránsito de Nßisser±a o AAEAP En otras modalidades de la presente invención, un péptido de tránsito de Neisseria o un péptido de tránsito de AAEAP (SEC ID NO: 25) se modifica químicamente o se altera genéticamente para producir variantes y derivados que retienen la habilidad para transportar compuestos de carga hacia el interior de las células cancerosa cerebrales de mamíferos o a través de la BBB. Las variantes de un péptido de tránsito de Neisseria o de un péptido de tránsito de AAEAP (SEC ID NO: 25) se pueden sintetizar por medio de las técnicas estándar. Los derivados de las secuencias de aminoácidos se forman de aminoácidos nativos ya sea directamente o por modificación o substitución parcial. Las variantes pueden ser análogos, los cuales son secuencias de aminoácidos que tienen una estructura similar, pero no idéntica con el compuesto nativo, sin que difieren de esta con respecto a ciertos componentes o cadenas laterales. Los análogos se pueden sintetizar de o a partir de un origen evolutivo diferente. Las variantes pueden ser de longitud completa o diferentes a la longitud completa, si los derivados o análogos contienen un aminoácido modificado. La invención da lugar a variantes de la secuencia de aminoácidos del péptido de tránsito de Neisseria, las cuales tienen aminoácidos reemplazados, o insertados, en comparación con el polipéptido de tipo silvestre. Las variantes de la invención pueden ser truncamientos del péptido de tránsito de Neisseria . Como se usa aqui, un "truncamiento" de un polipéptido es el péptido que resulta de la eliminación de al menos un residuo de aminoácido de al menos un extremo de la secuencia polipeptidica. En algunas modalidades, el péptido de truncamiento resulta de al menos la remoción de al menos un residuo de aminoácido, al menos cinco residuos de aminoácidos, al menos 10 residuos de aminoácidos, al menos 50 residuos de aminoácidos, al menos 100 residuos de aminoácidos, al menos 120 residuos de aminoácidos o al menos 150 residuos de aminoácidos de cualquiera o ambos extremos de la secuencia polipeptidica. En algunas modalidades, la composición comprende un péptido que consiste de una región del péptido de tránsito de Neisseria que es menor que la longitud del péptido de tránsito de Neisseria . En algunas modalidades, la composición comprende un péptido que consiste de más de aproximadamente 10 residuos, más de aproximadamente 15 residuos o más de aproximadamente 20 residuos de un péptido de tránsito de Neisseria truncado. En algunas modalidades, la composición comprende un péptido que consiste de no más de aproximadamente 100 residuos, no más de 70 residuos, no más de aproximadamente 50 residuos, no más de aproximadamente 40 residuos, o no más de aproximadamente 30 residuos de un péptido de tránsito de Neisseria . Las variantes de un péptido de tránsito de Neisseria o un péptido de tránsito de AAEAP (SEC ID NO: 25) incluyen, pero no se limitan a, moléculas que comprenden las regiones que son substancialmente análogas con el péptido de tránsito de Neisseria (SEC ID NO: 24) o el péptido de tránsito de AAEAP (SEC ID NO: 25) en al menos aproximadamente 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad sobre la secuencia de aminoácidos de tamaño idéntico o cuando se compara con una secuencia alineada en la cual la alineación se lleva a cabo mediante un algoritmo de homología. El término porcentaje (%) de identidad la secuencia de aminoácidos" entre un péptido de tránsito de Neisseria o un péptido de tránsito de AAEAP (SEC ID NO: 25) y una secuencia candidata se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en un péptido de tránsito de Neisseria o un péptido de tránsito de AAEAP (SEC ID NO: 25) que son idénticos con los residuos de aminoácidos en una secuencia candidata, cuando las dos secuencias se alinean. Las variantes también incluyen los péptidos preparados con aminoácidos sintéticos que no son de formación natural. Por ejemplo, los aminoácidos que no son de formación natural se pueden integrar en el péptido variante para extender u optimizar la vida media de la composición en el flujo sanguíneo. Tales variantes incluyen, pero no se limitan a, D,L-péptidos (diastereómeros), (Futaki et al., Biol. Chem. 276(8) :5836-40 (2001); Papo et al., Cáncer Red. 64(16) :5779-86 (2004); Miller et al, Biochem. Pharmacol. 36(1) :169-76,(1987)); péptidos que contienen aminoácidos inusuales (Lee et al., J. Pept. Red 63 (2): 69-84 (2004)), y aminoácidos sintéticos que contienen olefinas seguido por encadenamiento de hidrocarburos (Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892(2000); Walenski et al., Science 305:1466-1470 (2004)), y polipéptidos que comprenden residuos de e-(3,5-dinitrobenzoil) -Lys . En otras modalidades, el péptido de la invención es un derivado de un péptido de tránsito de Neisseria o un péptido de tránsito de AAEAP (SEC ID NO: 25) . Los derivados de los péptidos de tránsito son modificaciones químicas del péptido de manera tal que el péptido retinen aun algunas de sus actividades fundamentales. Por ejemplo, un "derivado" de un péptido de tránsito puede ser un péptido de tránsito modificado químicamente que retiene su habilidad para cruzar la BBB y/o entran en las células cancerígenas cerebrales. Las derivaciones que resultan en la actividad alterada de los péptidos de tránsito de Neisseria alterados o péptidos de tránsito de AAEAP, se contemplan como parte de la invención siempre y cuando tales pérdidas de actividad no sean apreciables. Como se usa aqui, "pérdida apreciable" es aproximadamente más del 50% de la actividad en comparación con el péptido no alterado. Las modificaciones químicas de interés incluyen, pero no se limitan a, amidación, acetilación, sulfatación, modificación por polietilenglicol (PEG) , fosforilación y glicosilación del péptido. Además, un péptido derivado puede ser una fusión de un péptido de tránsito, o una variante, derivado o equivalente estructural del mismo con un compuesto químico, tales como, pero no limitados a otros péptidos, moléculas de fármacos u otros agentes terapéuticos o farmacéuticos o una sonda detectable. Los derivados de interés incluyen modificaciones químicas mediante las cuales se puede extender u optimizar la vida media en el flujo sanguíneo de los péptidos y las composiciones de la invención, tales como mediante los varios métodos bien conocidos por aquellas personas en la técnica, incluyendo, pero no limitados a, péptidos circularizados (Monk et al., BioDrugs 19 (4) :261-78, (2005); DeFreest et al., J. Pept. Red. 63 (5) : 409-129 (2004)), modificaciones de la N-y la C-terminal (Labrie et al., Clin. Invest. Med. 13(5) :275-8 (1990)), y aminoácidos sintéticos que contienen definas seguido por encadenamiento de hidrocarburos (Schafmeister et al., J. Am, Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000)); Walenski et al., Science 305:1466-1470 (2004)). Se contempla que los péptidos de tránsito de la invención pueden ser variantes derivados y/o equivalentes estructurales de un péptido de tránsito de Neisseria o un péptido de tránsito de AAEAP (SEC ID NO: 25) . Por ejemplo, los péptidos pueden ser truncamientos del péptido de tránsito de Neisseria que ha sido PEGilado, haciendo por lo tanto una variante y un derivado. En una modalidad, los péptidos de la invención se sintetizan con aminoácidos no naturales a, -disubstituidos que contienen ataduras que llevan olefina, seguido por un "encadenamiento" de todos los hidrocarburos por metátesis de olefina catalizada por rutenio.
(Scharmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Walensky et al., Science 305:1466-1470 (2004)).
Adicionalmente, los péptidos que son equivalentes estructurales de un péptido de tránsito de Neisseria se pueden fusionar con otros péptidos, haciéndolo por lo tanto un péptido que es tanto un equivalente estructural y un derivado. Estos ejemplos son solamente para ilustrar y no para limitar la invención. Se pueden introducir cambios en un péptido de tránsito de Neisseria o un péptido de tránsito de AAEAP (SEC ID NO: 25) , los cuales incurren en alteraciones en la secuencia de aminoácidos de un péptido de tránsito de Neisseria o un péptido de tránsito de AAEAP (SEC ID NO: 25) que no nulifican la habilidad del péptido de tránsito de Neisseria o el péptido de tránsito de AAEAP (SEC ID NO: 25) para transportar un compuesto de carga hacia el interior de las células cancerosas cerebrales y/o a través de la BBB. Un residuo de aminoácidos "no esencial" es un residuo que puede ser alterado de la secuencia de un péptido de tránsito de Neisseria o el péptido de tránsito de AAEAP (SEC ID NO: 25) sin nulificar su habilidad para transportar un compuesto de cargo hacia el interior de las células y/o a través de la BBB en tanto que un residuo de aminoácido "esencial" se requiere para tal actividad. Los aminoácidos para los cuales se pueden hacer substituciones "conservativas" son bien conocidos en la técnica. Las substituciones conservativas útiles se muestran en la Tabla 1, "Substituciones Preferidas". Las substituciones conservativas por medio de las cuales un aminoácido de una clase se reemplaza con otro aminoácido de la misma clase están dentro del ámbito de la invención siempre que las substituciones no nulifiquen la actividad del péptido de tránsito de Neisseria/AAEAP . Tales intercambios que resultan en la actividad alterada del péptido de transito de Neisseria/AAEAP se contemplan como parte de la invención, siempre y cuando tal pérdida de la actividad no sea apreciable. Como se usa aqui, una "pérdida apreciable" es aproximadamente más del 50% de la actividad, en comparación con el péptido no alterado. Tabla 1 Substituciones preferidas Residuo original Substituciones Substituciones Ejemplificantes Preferidas Ala (A) Val, Leu, He Val Arg (R) Lys, Gln, Asn Lys Asn (N) Gln, His, Lys, Arg Gln Asp (D) Glu Glu Cys (C) Ser Ser Gln (Q) Asn Asn Glu H?) Asp Asp Gly (G) Pro, Ala Ala His (H) Asn, Gln, Lys, Arg Arg Leu, Val, Met, Ala, Phe, He (I) Leu Norleucina Norleucina, He, Val, Met, Ala, Leu (L) He Phe Lys (K) Arg, Gln, Asn Arg Met (M) Leu, Phe, He Leu Phe (F) Leu, Val, He, Ala, Tyr Leu Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Ser Ser Trp (W) Tyr, Phe Tyr Tyr (Y) Trp, Phem Thr, Ser Phe He, Leu, Met, Phe, Ala Val íV) Leu Norleucina Las substituciones "no conservativas" que afectan (1) la estructura de esqueleto polipeptidico, tales como una conformación ß-laminar o a-helicoidal, (2) la carga, (3) la hidrofobicidad, o (4) el volumen de la cadena lateral del sitio objetivo pueden modificar la función del péptido de tránsito de Neisseria/AAEAP . Los residuos se dividen en grupos basados en las propiedades comunes de la cadena lateral como se denota en la Tabla 2. Las substituciones no conservativas implican intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. Las substituciones no conservativas por medio de las un aminoácido de una clase se reemplaza con otro aminoácido de una case diferente están dentro del ámbito de la invención siempre y cuando la substitución no nulifique la actividad del péptido de tránsito de Neisseria o el péptido de tránsito de AAEAP (SEC ID NO: 25) . Tales intercambios que resultan en la actividad alterada del péptido de tránsito de Neisseria o el péptido de tránsito de AAEAP (SEC ID NO: 25) se contemplan como parte de la invención, siempre y cuando tales pérdidas en la actividad no sean apreciables. Tabla 2 Clases de Aminoácidos Clase Aminoácidos Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Hidrofóbico He Neutro hidrofílico Cys, Ser, Thr Ácido Asp, Glu Básico Asn, Gln, His, Lys, Arg De cadena alterada Gly, Pro Confirmación aromático Trp, Tyr, Phe En otras modalidades, la invención contempla los equivalentes estructurales de péptidos de tránsito de Neisseria o de péptidos de tránsito de AAEAP (SEC ID NO: 25) los cuales tienen una similitud estructural significativa con los residuos de aminoácidos 1 a 39 (SEC ID NO: 24) de Laz de Neisseria gonorrhoeae. Específicamente, la homología estructural entre una equivalente estructural del péptido de tránsito de Neisseria y los residuos de aminoácidos 1 a 39 (SEC ID NO: 24) de Laz de Neisseria gonorrhoeae se puede determinar usando el algoritmo VAST (Gibrat et al., Curr Opin Struct Biol 6:377-385 (1996); Madej et al., Proteins 23:356-3690 (1995) ) . En las modalidades especificas, el valor p de VAST de una comparación estructural de un equivalente estructural de un péptido de tránsito de Neisseria o el péptido de tránsito de AAEAP (SEC ID NO: 25) y los residuos de aminoácidos 1 a 39 (SEC ID NO: 24) de Laz de Neisseria gonorrhoeae es menor a aproximadamente 10-3, aproximadamente menor de 10~5, o aproximadamente menor a 10~7. En otras modalidades, la homología estructural significativa entre un equivalente estructural del péptido de tránsito de Neisseria y los residuos de aminoácidos 1 a 39 (SEC ID NO: 24) de Laz de Neisseria gonorrhoeae se puede determinar usando el algoritmo DALÍ (Holm & Sander, J. Mol. Biol. 233:123:138 (1993)). En modalidades especificas, la puntuación de DALÍ Z para una comparación estructural en pares es de al menos 3.5, al menos aproximadamente 7.0, o al menos aproximadamente 10.0. Las modificaciones a un péptido de tránsito de Neisseria o un péptido de tránsito de AAEAP (SEC ID NO: 25) se pueden hacer usando los métodos conocidos en la técnica, tal como mutagénesis mediada por oligonucleótidos (dirigida al sitio) , exploración de alanina, y mutagénesis de PCR. La mutagénesis dirigida al sitio (Cárter, Biochem. J. 237:1-7 (1986); Zoller y Smith, Methods Enzymol. 154:239-50 (1987)), mutagénesis de cartucho, mutagénesis por selección de restricción (Wells et al., Gene 34:315-23 (1985)) u otras técnicas conocidas se pueden llevar a cabo sobre el ADN clonado para producir un ácido nucleico que codifique la variante del péptido de tránsito de Neisseria/AAEAP . Además, los nucleótidos que codifican las variantes del péptido de tránsito de ?eisseria o un péptido de tránsito de AAEAP (SEC ID ?O: 25) se pueden sintetizar mediante los métodos que son bien conocidos en la técnica.
Complejo Péptido de Tránsito de ?eisseria/AAEAP (SEC ID ?O: 25) En otro aspecto de la invención, se proporcionan complejos de péptido de tránsito-carga, donde el péptido de cargo de Neisseria o un péptido de tránsito de AAEAP se enlazan en un complejo con al menos un compuesto de carga.
Los péptidos de tránsito de estos complejos pueden ser ya sea un péptido de tránsito de Neisseria , un péptido de tránsito de AAEAP (SEC ID ?O: 25) , o las variantes, derivados o equivalentes estructurales de cualquiera de estos. Los compuestos de carga suministrados por la presente invención incluyen, pero no se limitan a, proteínas, lipoproteinas, polisacáridos, ácidos nucleicos, incluyendo ácidos nucleicos antisentido, tintes, microparticulas o nanoparticulas, toxinas, moléculas orgánicas e inorgánicas, moléculas pequeñas y fármacos. Tales complejos de péptido de tránsito-carga se pueden usar para suministrar fármacos hacia el cerebro, y/o al interior de las células cancerosas cerebrales, y las células cancerosas en general, para propósitos terapéuticos, para suministrar compuestos de formación de imágenes a las células cancerosas cerebrales, y a las células cancerosas en general, para propósitos de diagnóstico, y cualquier otro propósito que requiera la administración de un compuesto especifico hacia el interior del cerebro, y/o al interior de las células cancerosas del cerebro. Los compuestos de carga se pueden enlazar a la C-terminal o la N-terminal del péptido de tránsito. En algunas modalidades, el péptido de tránsito de Neisseria o el péptido de tránsito de AAEAP se unen en un complejo con un péptido de transporte derivado de cupredoxina. Los péptidos de transporte derivados de cupredoxina se proporcionan en la Solicitud de Patente Norteamericana No. 11/244,105 presentada el 6 de octubre del 2005, la cual se incorpora expresamente aqui como referencia. En algunas modalidades, el péptido de transporte derivado de cupredoxina es, comprende la región de los aminoácidos 50-77 de la azurina de Pseudomonas aeruginosa, o es una variante, derivado o equivalente estructural de la misma. Como se usa aqui, los términos "enlazado en un complejo", "complejo" o "Enlazado" se refieren a la asociación física entre los componentes que se enlazan en el complejo. En algunos casos, la asociación física puede no ser directa sino mediada por un grupo enlazante u otro componente. Los componentes pueden ser proteínas, otras moléculas orgánicas o molecular inorgánicas, entre otros. La asociación física entre los componentes puede ser mediante enlaces covalentes, enlaces hidrofóbicos y/o fuerzas de van der waals, o cualquier otro medio que mantenga los componentes en asociación física. En varias modalidades de la presente invención, el compuesto de carga puede comprender una cupredoxina, la cual es citotóxica para las células cancerosas, tales como la azurina: de P. aeruginosa (SEC ID NO:24) ("wt-azurina") ; la plastocianina de la cianobacteria Phormidium laminosum; rusticianina de Thiobacillus ferrooxidans; la seudoazurina de Achromabacter cycloclastes, las azurinas de Pseudomonas syringa , Neisseria meningitidis, Bordetella bronchiseptica, auracianina a y B de Chloroflexus aurantiacus o Neisseria gonorrhoeae, entre otras azurinas y proteínas similares a azurina. En otras modalidades, el compuesto de carga puede ser un citocromo c, tal como el citocromo C55? de P. aeruginosa. En otras modalidades, el compuesto de carga puede ser una variante de cualquiera de los de arriba que retenga su citotoxicidad en las células cancerosas.
En una modalidad, el compuesto de carga puede ser una sustancia detectable, por ejemplo, una sustancia fluorescente, tales como la proteina fluorescente verde; una sustancia luminiscente; una enzima, tal como la ß-galactosidasa; o una proteina radioetiquetada o administrada para conferir un fenotipo detectable a las ce lulas. De manera similar, se pueden administrar microparticulas o nanoparticulas etiquetadas con una sustancia detectable, por ejemplo, una sustancia fluorescente. Un ejemplo de las nanoparticulas adecuadas se encuentra en la Patente Norteamericana No. 6,383,500, publicada el 7 de mayo del 2002, la cual se incorpora aqui como referencia expresamente por este motivo. Muchas de tales substancias detectables se conocen por aquellas personas experimentadas en la técnica. En algunas modalidades, el compuesto de carga puede ser una sustancia detectable que sea adecuada para la tomografia computarizada de rayos X, exploración por resonancia magnética, exploración por ultrasónico o escintigrafia de radionúclidos. En estas modalidades, el compuesto de carga se administra al paciente para propósitos de diagnóstico. Un agente de contraste se administra como un compuesto de carga para mejorar las imágenes obtenidas por CT de rayos X, MRI y ultrasónico. En varias modalidades, el compuesto de carga es un radioisótopo que emite rayos gamma o positrones, un agente de contraste de exploración por resonancia magnética, un agente de contraste de rayos X, y/o un agente de contraste de ultrasónico. La administración de un compuesto de carga radionúclido que se focaliza en el tejido tumoral del cerebro via un péptido de tránsito de Neisseria/AAEAP (SEC ID ?O:25), con o sin un péptido de transporte derivado de de cupredoxina, se puede usar para la escintigrafia de radionúclidos. En algunas modalidades, un péptido de tránsito de Neisseria/AAEAP (SEC ID ?O: 25) puede contener el radionúclido con o sin un compuesto de carga. La Publicación de la Patente Norteamericana No. 2006/0039861 proporciona agentes de contraste multiméricos, focalizados por péptidos para usarse como agentes de contraste radionúclidos. Los compuestos de carga disponibles comercialmente, adecuados para la formación de imágenes de rayos X incluyen, pero no se limitan a Visipaque® (yodixanol) , Omipaque® (yohexol) e Imagopaque®, disponibles de GE Healthcare (Chalfont St . Giles, Reino Unido) . La administración de un compuesto de carga agente de contraste de ultrasonido que se focaliza en el tejido tumoral del cerebro por medio de un péptido de tránsito de Neisseria/AAEAP (SEC ID NO: 25) , con o sin un péptido de transporte derivado de cuprodoxina, se puede usar para la formación de imágenes ultrasónicas. Los agentes de contraste de ultrasónico adecuados para usarse como compuestos de carga incluyen, pero no se limitan a, microburbujas de gas biocompatible, portadores líquidos, y microesferas de tensoactivo, que comprende además una porción de enlazamiento opcional, Ln, entre las porciones objetivo y las microburbujas. Las microburbujas de interés incluyen, pero no se limitan a, aquellas proporcionadas en la Tabla 3. En este contexto, el término portador liquido significa una solución acuosa y el término tensoactivo significa cualquier material anfifilico el cual produce una reducción en la tensión interfacial en una solución. Una lista de los tensoactivos adecuados para formar las microesferas tensoactivas se describe en EP07272225 A, incorporada expresamente aqui como referencia. El término microesfera tensoactiva incluye nanoesferas, liposomas, vesículas y las similares. En algunas modalidades, el agente de contraste de ultrasónico es una liposoma o dextran. El gas biocompatible puede ser aire, o un fluorocarbono, tal como C3-C5-perfluoroalcano, los cuales proporcionan la diferencia en la ecogenicidad y por lo tanto el contraste en la formación de imágenes por ultrasónico. El gas puede ser encapsulado o contenido en las microesferas a las cuales se enlaza el péptido de tránsito de Neisseria/AAEAP (SEC ID NO: 25) , opcionalmente via un grupo enlazante. El enlazamiento puede ser covalente, iónico o por fuerzas de van der waals.
Tabla 3. Microburbujas y sus composición para ser usadas como agentes de contraste de ultrasonido. Microburbujas Gas Cubierta estabilizante Primera generación no- transpulmonar vascular Microburbujas libres Aire Ninguna Echovist® (SHU 454) aire Ningunaq Segunda Generación, transpulmonar vascular, vida media corta (< 5 min) Albunex® Aire Albúmina Levovist (SHU 508 A) Aire Acido palmitico Tercera generación, transpulmonar vascular, vida media más larga (> 5 min) Aerosomas (Definity, Perfluoropropano Fosfolipidos MRX115, DMP115) Echogen (QW3600) Dodecafluoropentano Tensoactivo Optison® (FSO 69) Octafluoropropano Albúmina PESDA Perfluorobutano Albúmina Quantison Aire Albúmina QW7437 Perfluorocarbono Tensoactivo Imavist® (Imagent, AFO150) Perfluorocarbono Tensoactivo Sonovue® (BRl) Hexafluoruro de azufre Fosfolípidos Transpulmonar con fase específica del órgano (hígado, bazo) BR14 Levovist (SHU 508 A) Perfluorobutano Fosfolipidos Sonavist® (SHU 563 A) Aire Cianoacrilato Sonazoid® (NC 100100) Perfluorocarbono Tensoactivo La administración de un compuesto de carga agente de contraste de rayos X que se focaliza en el tejido tumoral del cerebro via un péptido de tránsito de Neisseria/AAEAP (SEC ID ?O: 25) , con o sin un péptido de transporte derivado de cupredoxina, se puede usar para la tomografia computarizada de rayos X, y otras formas de formación de imágenes por rayos X. los agentes de contraste de rayos X comerciales actuales, adecuados para ser usados como compuestos de carga se pueden clasificar en dos categorías: 1) agentes de contraste iónicos, que tienen un grupo carboxilo iónico y 2) agentes de contraste no iónicos, los cuales no contienen ningún grupo iónico. Los ejemplos de agentes de contraste iónicos disponibles comercialmente incluyen Hypaque® (Diatrizoato) y Hexabrix® (Yoxaglato) , en tanto que los agentes no iónicos incluyen Omnipaque® (Yohexol) , Isovue® (Yopamidol) , Optiray® (Yoversol) , y Visipaque® (Yodixanol) . Otros agentes de contraste de rayos x adecuados para usarse como compuestos de carga incluyen, pero no se limitan a, uno o más átomos que absorben rayos X o "pesados" con número atómico 20 o mayor, que comprenden además una porción enlazante iónica, Ln, entre el péptido de tránsito de Neisseria/AAEAP (SEC ID ?O: 25) y los átomos que absorben rayos X. Los átomos pesados usados frecuentemente en los agentes de contraste de rayos X son de yodo. Se han descrito agentes de contraste de rayos X compuestos de quelatos metálicos (por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,417,959) y los poliquelatos compuestos de una pluralidad de iones metálicos (por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,679,810). Los complejos de racimos multinucleares han sido descritos como agentes de contraste de rayos X (por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,804,161, PCT WO91/14460, y PCT WO 92/17215). Otros agentes de contraste de rayos X serán bien conocidos por aquellas personas experimentadas en la técnica y se pueden usar también como compuestos de carga en la presente invención. La administración de un compuesto de carga agente de contraste de MRI, que se focaliza en el tejido tumoral del cerebro via un péptido de tránsito de Neisseria/AAEAP (SEC ID ?O: 25) , con o sin un péptido de trasporte derivado de cupredoxina, se puede usar para la formación de imágenes de MRI . Los agentes de contraste de MRI adecuados para usarse como compuestos de carga incluyen, pero no se limitan a, uno o más iones metálicos paramagnéticos, que comprenden además una porción de enlazamiento opcional, Ln, entre el péptido de tránsito de Neisseria/AAEAP (SEC ID ?O: 25) y los iones metálicos paramagnéticos. Los iones metálicos de los quelatos metálicos pueden ser iones paramagnéticos. Los iones metálicos adecuados incluyen aquellos que tienen números atómicos de 22-29 (inclusive) , 42, 44 y 58-70 (inclusive) y que tienen estados de oxidación +2 o +3. Los ejemplos de tales iones metálicos son cromo (III), manganeso (II), fierro (II), fierro (III), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), praseodimio (II), neodimio (III), samario (III), gadolinio (III), terbio (III), disprosio (III), holmio (III), erbio (III) e iterbio (III) . Los agentes de contraste de MRI disponibles comercialmente, adecuados para usarse como compuestos de carga incluyen, pero no se limitan a Omniscan® (gadodia ida) y Teslascan® de GE Healthcare (Chalfont St Giles, Reino unido) . En otra modalidad, un compuesto de carga se suministra para matar inhibir el crecimiento de las células, tales como las células cancerosas cerebrales u otras células cancerosas. Por ejemplo, el compuesto de carga puede ser una proteina de control del ciclo celular, tal como P53; un inhibidor de cinasa dependiente de ciclina, tales como P16, 921 o p27; una proteina suicida tales como la timidina cinasa o la nitrorreductasa; una citocina u otras proteínas inmunomoduladoras tales como la interleucina 1, interleucina 2 o el factor estimulante de la colonia de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) ; o una toxina, tal como la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa . En otras modalidades, se puede administrar un fragmento biológicamente activo de una o más de las clases de compuestos de arriba. En aun otra modalidad, el compuesto de carga es un fármaco usado para tratar el cáncer. Tales fármacos incluyen, por ejemplo, 5-fluorouracilo; Inferieron a, Metotrexate; Tamoxifen; y Vincristina. Otros compuestos de carga adecuados para tratar el cáncer incluyen, pero no se limitan a los agentes alquilantes tales como mostazas nitrogenadas, sulfonatos de alquilo, nitrosoureas, etileniminas y triazenos; antimetabolitos tales como antagonistas de folato, análogos de purina, y análogos de pirimidina; antibióticos tales como antraciclinas, bleomicinas, mitomicina, dactinomicina, y plicamicina; enzimas tales como L-asparaginasa; inhibidores de la farnesil proteina transferasa; inhibidores de la 5alfa-reductasa; inhibidores de la 17beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 3; agentes hormonales tales como glucocorticoides, estrógenos/antiestrogenos, andrógenos/antiandrógenos, progestinas, y antagonistas de la hormona de liberación de la hormona luteinizante, acetato de octretoide; agentes desestabilizantes de microtubos, tales como ecteinascindinas i sus análogos y derivados; agentes estabilizantes de microtubos tales como taxanos, por ejemplo paclitaxel (Taxol™) , docetaxel (taxotere™) , y sus análogos, y epotilonas, tales como epotilonas A-F y sus análogos; productos derivados de plantas, tales como vinca alcaloides, epipodofilotoxinas, taxanos; e inhibidores de toposiomerasa; inhibidores de la prenil-proteina transferasa; y agentes misceláneos tales como hidroxiurea, procarbazina, mitotano, hexametilmelamina, complejos de coordinación de platino tales como cisplatina y carboplatina; y otros agentes usados como agentes anticancerigenos o citotóxicos tales como modificadores de respuestas biológicas, factores de crecimiento; moduladores inmunológicos y anticuerpos monoclonales. Los ejemplos representativos de estas clases de agentes anticancerigenos y citotóxicos incluyen, pero no se limitan a clorhidrato de mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucilo, melfalam, ifosfamida, busulfan, carnustina, lomustina, semustina, streptozocina, tiotepa, dacarbazina, metotrexate, tioguanina, mercaptopurina, fludarabina, pentastatina, cladribina, citarabina, clorhidrato de doxorubicina, daunorubicina, idarubicina, sulfatoi de bleomicina, mitomicina C, actinomicina D, safracinas, saframicinas, quinocarcinas, discodermolidas, vincristina, vinblastina, tartrato de vinorelbina, fosfato de etoposide, teniposide, paclitaxel, tamoxifen, estramustina, fosfato sodio de estramustina, flutamida, buserelina, leuprolide, pteridinas, diinasas, levamisol, aflacon, interferon, interleucinas, aldesleucina, filgrastim, sargramostim, rituximab, BCG, tretinoina, clorhidrato de irinotecan, betametosona, clorhidrato de gemcitabina, altretamina, y topoteca y cualquier análogo o derivado de los mismos. Los ejemplos de agentes anticancerigenos y otros citotóxicos útiles como compuestos de carga incluyen los siguientes: derivados de apotilona como se encuentran en la Patente Alemana no. 4138042.8; WO 97/19086, WO 98/22461, WO 98/25929, WO 98/38192, WO 99/01124, WO 99/02224, WO 99/02514, WO 99/03848, WO 99/07692, WO 99/27890, WO 99/28324, WO 00/43653, WO 99/54330, WO 99/54318, WO 99/54319, WO 99/65913, WO 99/67252, WO 99/67253, y WO 00/00485; inhibidores de cinasa dependientes de ciclina como se encuentras en WO 99/24416 (véase la Patente Norteamericana No. 6,040,321); e inhibidores de prenil-proteina transferasa como se encuentran en WO 97/30992 y WO 98/54966; y los agentes tales como aquellos descritos genéricamente y específicamente en la Patente Norteamericana No. 6,011,029, los compuestos de la cual se pueden emplear junto con cualquier modulador, tales como los moduladores AR, los moduladores ER, con los moduladores LHRH, en especial en el tratamiento del cáncer. Otros ejemplos de compuestos de carga incluyen aquellos que pueden ser administrados ventajosamente al cerebro. Tales compuestos de carga incluyen fármacos y otros terapéuticos para tratar las condiciones relacionadas con el cerebro. Tales condiciones relacionadas con el cerebro incluyen, pero no se limitan a, depresión, trastornos emocionales, dolor crónico, epilepsia, la enfermedad de Alzheimer, apoplejia/neuroprotección, lesiones del cerebro y la medula espinal, cáncer cerebral, infección del cerebro por VIH, varios trastornos que producen ataxia, esclerosis lateral amiotrófica (ALS) , enfermedad de Huntington, errores genéticos congénitos que afectan el cerebro durante la infancia, la enfermedad de Parkinson y esclerosis múltiple. Los agentes antidepresivos que pueden ser usados como compuestos de carga para tratar la depresión y los trastornos emocionales incluyen, pero no se limitan a antidepresivos triciclicos tales como nortriptilina, venlafaxina (Effexor®) y nefazadona (Serzone®); inhibidores selectivos para la reabsorción de serotonina (SSRI), tales como fluoxetina (Prozac®) , sertralina (Zoloft®), fluvoxamina (Luvox®) , paroxetina (Paxil®) , y citalopram (Celexa®) mirtazepina se dante (Remeron®) y el bupropion (Wellbutrin®) más activante. También son de interés los medicamentos para dolor de cabeza y migraña incluyendo pero no limitados a ergotamina, dihidroergotamina, cetoprofen, propranolol, timolol, atenolol, metoprolol y nadolol. Los fármacos que pueden ser usados como compuestos de carga para tratar el dolor crónico incluyen, pero no se limitan a, los paliativos comunes para el dolor tales como acetaminofen (Tylenol®) ; fármacos antiinflamatorios tales como aspirina; fármacos antiinflamatorios no esferoides (NSAID) tales como ibuprofen (Advil®, Motrin(r) y naproxeno (Aleve®) ; los medicamentos opiáceos para el dolor tales como los opiáceos similares a morfina; medicamentos antidepresivos y anticonvulsivos. Los fármacos que pueden ser usados como cargas para tratar la epilepsia incluyen, pero no se limitan a fenobarbital, difenilhidantoina, trimetadiona (Tridiona®) diazepam (Valium®) , carbamazepina (Tegretol®) , ácido valpropico (Depakene®) Emesida® (etosuximida) , Zarontin® (etosuximida) , trileptal, carbamazepina, Keppra® (levetiracetam) , lamictal, acetazolamida, triagabina, valproato de sodio, pregabalina, clonazepam, carbamazepina, topiramato, ácido valproico, lamotrigina, etosuximida, clobazam, vigabatrin, levetiracetam, gabapentin, zonisamida, primidona, fenitoin, y oxcarbazepina. Los fármacos que pueden ser usados como compuestos de carga para tratar la enfermedad de Alzheimer incluyen, pero no se limitan a inhibidores de colinesterasa, tales como Razadyne® (conocido primero como Reminyl®) (galantamina) , Exelon® (rivastigmina) , Aricept® (donapezil), Cognex® (tacrina) , y un antagonista de N-metil D-aspartato (NMDA) , Namenda® (memantina) . Los fármacos que pueden ser usados como compuestos de carga para tratar la apoplejía o para neuroproteccion incluyen, pero no se limitan a Gavestinel®, eritropoyetina (EPO) , trombopoyetina, TNF-alfa, estrógenos, melatonina, y canabinoides. Los fármacos que pueden ser usados como compuestos de carga para tratar la infección del cerebro por VIH incluyen, pero no se limitan a inhibidores no nucleósidos de la transcriptasa inversa (NNRTI) tales como delavardina, efavirenz, y nevirapina; inhibidores nucleósidos de la trabnscriptasa inversa (NRTI) tales como abacavir, abacavir, lamivudina, abacavir, lamivudina, zidoiudina, didanosina, emtricitabina, emtricitabina, tenofovir DF, lamivudina, lamivudina, zidovudina, estavudina, tenofovir DF, zalcitabina, y zidovudina; inhibidores de protesasa (PI) tales como amprenavir, atazanavir, fosamprenavir, indinavir, lopinavir, ritonavir, nelfinavir, ritonavir, saquinavir, y tipranavir; e inhibidores de fusión tales como enfuvirtida Los fármacos que pueden ser usados como compuestos de carga para tratar la esclerosis lateral amiotrófica (ALS) incluyen, pero no se limitan a creatina, Myotrophin®, Celebrex® Neotrogin®, NAALADasa, neurodex, Rilutek®, oxandrolona, coenzima Q10, topiramato (Topamax®) , xaliproden, indinavir, minociclina, y buspirona. Los fármacos que pueden ser usados como compuestos de carga para tratar la enfermedad de Huntington incluyen, pero no se limitan a fármacos antisicóticos, tales como haloperidol, u otros fármacos tales como clonazepam, antidepresivos tales como fluoxetina, sertralina y nortriptilina; tranquilizantes y litio; minociclina, citalopram, y Etil-EPA (Miraxion®) . Los fármacos que pueden ser usados como compuestos de carga para tratar la enfermedad de Parkinson incluyen, perop no se limitan a anticolinérgicos o amantadina, levodopa (L-dopa) , bromocriptina, pergolida, pramipexol, ropinirol, selegilina, y amantadina. Los fármacos que pueden ser usados como compuestos de carga para tratar la esclerosis múltiples incluyen, pero no se limitan a la hormona adrenocorticotropica (mejor conocida como ACT) , prednisona, prednisolona, metilprednisolona, betametasona, dexametasona, beta inferieron (Avonex®) , Betaseron® y Rebif®) , alfa inferieron, Novantrone® (mitoxantrona) , ciclosporina (Sandimmune®) ciclofosfamida (Citoxan®) , metotrexato, azatioprina (Imuran®) y cladribina (Leustatin®) . En aun otra modalidad, el compuesto de carga es un ácido nucleico que codifica una o más clases de compuestos. Los ejemplos de arriba se proporcionan para ilustración solamente, muchos otros compuestos son conocidos por aquellas personas experimentadas en la técnica. Ácidos Nucleicos que codifican un dominio de Tránsito de Neísser±a o el Dominio de Tránsito de AAEAP, o Cualquiera Enlazado a un Compuesto de Carga En un aspecto, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican los péptidos de tránsito de Neisseria/AAEAP (SEC ID ?O: 25) y las variantes de los mismos, o proteínas de fusión que comprenden un péptido de tránsito de Neisseria/AAEAP (SEC ID ?O: 25) enlazado con un compuesto de carga, donde el compuesto de carga es una proteina. Las moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención se pueden preparar por una combinación de las técnicas conocidas en la técnica. Las secuencias codificantes usadas en estos ácidos nucleicos pueden ser aquellas encontradas en el AD? geonómico que codifica el péptido particular, o se pueden diseñar a partir de los codons conocidos. Estas secuencias codificantes también se pueden diseñar para tener en cuenta el uso del codon alternativo y el uso del codon preferido del organismo en el cual se debe expresar el péptido. Las secuencias de ácidos nucleicos para el péptido de tránsito de Neisseria/AAEAP (SEC ID ?O: 25) y los complejos de péptido de tránsito-carga se pueden preparar individualmente por síntesis química o clonación. Las secuencias de ácidos nucleicos se pueden ligar entonces con ligasa con el fin de dar una molécula de ácido nucleico de interés Métodos para Suministrar un Compuesto de carga usando un Dominio de Tránsito de Neísserla o AAEAP Las composiciones de la invención se pueden usar en, por ejemplo, la detección o formación de imágenes de un tipo de células, en el tratamiento del cáncer, en particular del sistema nervioso central o el cerebro, o en el tratamiento de una condición relacionada con el cerebro. Las composiciones se pueden administrar en una cantidad efectiva terapéuticamente. Típicamente, el organismo anfitrión es un mamífero, tal como un humano o animal. En algunas modalidades, el compuesto de carga se administra enlazado en un complejo con un péptido de transito de Neisseria/AAEAP (SEC ID ?O: 25) , en tanto que e otras modalidades, el compuesto de carga se coadministra con el péptido de tránsito de Neisseria/AAEAP (SEC ID NO: 25), pero no se enlaza en un complejo con este. Más de un compuesto de carga se puede coadministrar con un péptido de tránsito de Neisseria/AAEAP . La co-administración del compuesto de carga puede ser contemporánea con la administración del péptido de tránsito, ya sea en la misma preparación farmacéutica o en otra preparación farmacéutica administrada en un plazo de una hora de administrar el . péptido de tránsito. Además, la coadministración de péptido de tránsito de Neisseria/AAEAP (SEC ID ?O:25) y el compuesto de carga puede incluir la administración del péptido de tránsito de Neisseria/AAEAP (SEC ID ?O:25) que tiene lugar aproximadamente más de una hora pero aproximadamente menos de dos horas, cuatro horas, seis horas, doce horas, o veinticuatro horas después de la administración del compuesto de carga. En algunas modalidades, un péptido de transito de Neisseria/AAEAP, el o los compuestos de carga y un péptido de transporte derivado de cupredoxina se pueden coadministrar. En otras modalidades, un péptido de transito de Neisseria/AAEAP se puede coadministrar con un péptido de transporte derivado de cupredoxina enlazado en un complejo con el o los compuestos de carga. En otras varias modalidades de la presente invención, un péptido de transito de Neisseria/AAEAP (SEC ID ?O:25) suministra un compuesto de cargo en el interior de las células in vitro, ex vivo, o in vivo. Por ejemplo, la administración se puede lograr in vitro agregando un complejo del péptido de tránsito de Neisseria/AAEAP (SEC ID ?O:25) y un compuesto de carga a un cultivo de células, tal como una biopsia. Alternativamente, la administración se puede lograr ex vivo agregando el complejo a una muestra extraída de un paciente, por ejemplo, sangre, tejido, o medula ósea, y regresando la muestra tratada al paciente. La administración también puede ser lograda por la administración del complejo directamente a un paciente. Los métodos de la presente invención se pueden usar para propósitos terapéuticos profilácticos, de diagnóstico o de investigación. Las composiciones que contienen el péptido de tránsito de Neisseria/AAEAP (SEC ID ?O:25) se pueden administrar por e cualquier ruta adecuada, por ejemplo, oral, bucal, inhalación, sublingual, rectal, vaginal, transuretral, nasal, tópica, percutánea, es decir, inyección transdérmica o parenteral (incluyendo intravenosa, intramuscular, subcutánea e intracoronaria) o por cualquier inyección intracerebroventricular o intracerebral. Las composiciones de la invención y las formulaciones farmacéuticas de las mismas se pueden administrar en cualquier cantidad efectiva para lograr este propósito pretendido. Cuando se administran para tratar el cáncer, o cualquier otra condición que requiera el tratamiento, la composición de administra en una cantidad efectiva terapéuticamente. La guia para la dosificación y el plan de administración de varios compuestos de carga se puede obtener de muchas referencias, las cuales escriben el uso de tales compuestos en el tratamiento o el diagnóstico, tales como el Physicians' Desk Reference (PDR) o como se determina de otra manera por una persona con experiencia en la técnica. Las composiciones de la invención se pueden esterilizar por las técnicas de esterilización bien conocidas, convencionales, o pueden ser filtradas estériles. Las soluciones acuosas resultantes se pueden empacar para usarse como están, o se someten a liofilización, la preparación liofilizada que se combina con una solución estéril antes de la administración. Cuando se administran los péptidos de tránsito de Neisseria/AAEAP (SEC ID ?O:25), los compuestos de carga y/o los complejos de péptido de tránsito-carga de acuerdo con la presente invención en una manera intravenosa, la administración puede ser por goteo intravenoso o infusión intermitente. La formulación exacta, la ruta de administración, y la dosificación se determinan por el proveedor de servicios médicos encargado o el doctor, en vista de la condición del paciente. La cantidad de dosificación se puede ajustar individualmente para proporcionar niveles de plasma de las composiciones de la invención, los cuales sean suficientes para mantener el efecto terapéutico. Por lo general, la composición deseada se administra en una mezcla con un portador farmacéutico seleccionado con respecto a la ruta de administración deseada y la practica farmacéutica estándar. La dosificación apropiada puede variar dependiendo de, por ejemplo, el compuesto que contiene el péptido de transito de Neisseria/AAEAP (SEC ID ?O:25) empleado, el o los compuestos de carga, el anfitrión, el modo de administración y la naturaleza y la severidad de las condiciones que se están tratando o diagnosticando. Sin embargo, en una modalidad de los métodos de la presente invención, se indica que los resultados satisfactorios del tratamiento en humanos se obtienen a dosis diarias de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal del compuesto que contiene un péptido de transito de Neisseria/AAEAP (SEC ID ?O:25), o un complejo del péptido de tránsito de Neisseria/AAEAP . En una modalidad, una dosis diaria indicada para el tratamiento en humanos, puede estar en el rango de aproximadamente 0.7 mg a aproximadamente 2400 mg de un compuesto que contiene el péptido de transito de Neisseria/AAEAP (SEC ID ?O:25) o un complejo del péptido de transito ?eisseria/AAEAP administrado convenientemente, por ejemplo, en dosis diarias, dosis semanales, dosis mensuales, y/o dosificación continua. Las dosis diarias pueden ser dosificaciones discretas de 1 a 12 veces por dia o más.
Alternativamente, las dosis se pueden administrar cada tercer dia, cada cuarto dia, cada quinto dia, cada sexto dia, cada semana, y de manera similar en incrementos de dias hasta de 31 dias o más. La dosificación puede ser continua, intermitente o en una dosis única, usando cualquier forma de dosificación aplicable, incluyendo comprimidos, administración por parches i.v., y los similares. Más específicamente, la composición se administra en una cantidad efectiva terapéuticamente. En modalidades especificas, la cantidad efectiva terapéuticamente es desde aproximadamente 0.01-20 mg/kg de peso corporal. En modalidades especificas, el nivel de dosificación es aproximadamente 10 mg/kg/dia, aproximadamente 15 mg/kg/dia, aproximadamente 20 mg/kg/dia, aproximadamente 25 mg/kg/dia, aproximadamente 30 mg/kg/dia, aproximadamente 35 mg/kg/dia, aproximadamente 40 mg/kg/dia, aproximadamente 45 mg/kg/dia, o aproximadamente 50 mg/kg/dia. El método para introducir las composiciones que contienen el o los péptidos de tránsito de Neisseria/AAEAP (SEC ID ?O:25) o un complejo del péptido de transito de Neisseria/AAEAP en los pacientes es, en algunas modalidades, la co-administración con otros fármacos conocidos por tratar el cáncer. Tales métodos son bien conocidos en la técnica. En una modalidad especifica, las composiciones que contienen el péptido de transito de Neisseria/AAEAP (SEC ID ?O:25) o un complejo del péptido de transito de Neisseria/AAEAP son parte de un combinado o co-dosificación que contiene, o con otros fármacos para tratar el cáncer. Tales fármacos incluyen cualquiera de los compuestos de carga listados aqui para el tratamiento del cáncer. Las composiciones farmacéuticas que comprenden las composiciones de la invención, las cuales se pueden usar de acuerdo con la presente invención, se pueden formular en una manera convencional usando uno o más portadores aceptables fisiológicamente, que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan en procesamiento de la composición, agentes activos, para inhibir o estimular la secreción de la composición, o una mezcla de estos en preparaciones las cuales se pueden usar terapéuticamente. Las moléculas de ácido nucleico que codifican un péptido de transito de Neisseria/AAEAP o una proteina de fusión que combina ya sea un péptido de transito y un compuesto o compuestos de carga y/o un péptido de transporte derivado de cupredoxina, se pueden insertar en vectores y se usan como vectores de terapia- génica. Los vectores de terapia génica se pueden administrar a un sujeto, por ejemplo, por inyección intravenosa, administración local Patente Norteamericana No. 5,328,470), o por inyección estereotactica (Chen et al., Poc Nati Acad Sci EEUU, 91:3054-57 (1994)). La preparación farmacéutica de un vector de terapia génica puede incluir un diluyente aceptable o puede comprender una matriz de liberación lenta en la cual se integra el vehículo de administración del gen. Alternativamente, cuando el vector de administración génica se puede producir intacto a partir de células recombinantes, por ejemplo, vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que producen el sistema de administración del gen. En un aspecto, la composición de administra como ADN, de manera tal que el complejo se genera in situ. En una modalidad, el ADN está "desnudo", como se describe por ejemplo en Ulmer et al., Science 259:1745-49 (1993) y revisado por Cohén, Science 259 1691-92 (1993) . La absorción del ADN desnudo se puede incrementar revistiendo el ADN sobre un portador, por ejemplo, perlas biodegradables, las cuales se transportan de manera eficiente dentro de las células. En tales métodos, el ADN puede estar presente dentro de cualquiera de una variedad de sistemas de administración conocidos por aquellas personas con experiencia ordinaria en la técnica, incluyendo sistemas de expresión de ácidos nucleicos, sistemas de expresión bacterianos y virales. Las técnicas para la incorporación del ADN en tales sistemas de expresión son bien conocidos por aquellas personas con experiencia ordinaria en la técnica. Véase, por ejemplo WO90/11092, WO93/24640, y la Patente Norteamericana No. 5,736,525. Los vectores usados para transbordar el material genético de organismo a orgánicos, se puede dividir en dos clases generales; Vectores de clonación son plásmidos de replicación o fagos con regiones que son no esenciales para la propagación en células hospederas apropiadas y en el interior de las cuales se puede insertar el ADN extraño; el ADN extraño se replica y se propaga como si fuera un componente del vector. Un vector de expresión (tales como un plásmido, levadura, o el genoma de un virus animal) se usa para introducir material genético extraño en células hospederas o tejidos con el fin de transcribir o traducir el ADN extraño, tal como el ADN de la composición. En los vectores de expresión. En los vectores de expresión, el ADN introducido se enlaza operablemente a los elementos tales como los promotores que indican a las células hospederas para transcribir el ADN insertado. Algunos promotores son excepcionalmente útiles, tales como los promotores inducibles que controlar la trascripción génica en respuesta a factores específicos. Enlazar operablemente un polinucleótido de la composición a un promotor inducible puede controlar la expresión del polipéptido de la composición de péptido de transito de Neisseria/AAEAP o los fragmentos. Los ejemplos de promotores inducibles clásicos incluyen aquellos que son responsivos al a-interferon, choque térmico, iones de metales pesados, y esferoides tales como glucocorticoides (Kaufman, Methods Enzymol. 185:487-511 (1990)) y tetraciclina. Otros promotores inducibles deseables incluyen aquellos que son no endónenos a las células en las cuales se está introduciendo la construcción, pero sin embargo, son responsivos en esas células cuando el agente de inducción se suministra de manera erógena. En general, los vectores de expresión útiles son frecuentemente plásmidos. Sin embargo, se contemplan otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y virus adeno-asociados) . La elección del vector se estipula por el organismo o las células que son usadas y el destino deseado del vector. En general, los vectores comprenden secuencias señal, orígenes de replicación, genes marcadores, elementos mejoradores, promotores, y secuencias de terminación de la trascripción.
Composiciones Farmacéuticas que Contienen un dominio de Tránsito de Nelsserla. Las composiciones farmacéuticas de la invención que contienen un péptido de transito de Neisseria/AAEAP (SEC ID ?O:25) o un complejo de un péptido de transito de Neisseria/AAEAP (SEC ID ?O:25) enlazado con un compuesto de carga se pueden fabricar en cualquier manera convencional, por ejemplo, por los procesos convencionales de mezclado, disolución, granulación, fabricación de grageas, emulsificación, encapsulamiento, atrapamiento o liofilización. El complejo de péptido de transito de Neisseria/AAEAP se puede combinar fácilmente con un portador aceptable farmacéuticamente, bien conocido en la técnica. Tales portadores permiten que la preparación sea formulada como comprimidos, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones, y las similares. Los excipientes adecuados también pueden incluir, por ejemplo, rellenadores y preparaciones de celulosa. Otros excipientes pueden incluir, por ejemplo, agentes saborizantes, agentes colorantes, eliminadores de viscosidad y otros aditivos, auxiliares o adherentes aceptables. En varias modalidades, la composición incluye portadores y excipientes (incluyendo, pero no se limitados a, amortiguadores, carbohidratos, manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos tales como glicina, antioxidantes, bacteriostáticos, agentes quelantes, agentes de suspensión, agentes espesantes y/o conservadores) , agua, aceites, soluciones salinas, soluciones acuosas de dextrosa y glicerol, otras substancias auxiliares aceptables farmacéuticamente según se requieran para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes amortiguadores, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes y los similares. Se recocerá que, aunque se puede empelar cualquier portador adecuado conocido por aquellas personas con experiencia ordinaria en la técnica, para administrar las composiciones de esta invención, el tipo del portador variará dependiendo del modo de administración. Los compuestos también pueden ser encapsulados dentro de liposomas usando la tecnología bien conocida. También se pueden usar microesferas biodegradables como portadores para las composiciones de esta invención. las microesferas biodegradables adecuadas se muestran, por ejemplo, en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,897,268, 5,075,109, 5,928,647, 5,811,128, 5,820,883, 5,853,763, 5,814,344 y 5,942,252. "Compuestos" como se usa aqui, incluye los péptidos, secuencias de aminoácidos, los compuestos de carga y los complejos, y los ácidos nucleicos de la presente invención. Los fluidos intravenosos para usarse al preparar las composiciones para administrar los péptidos de tránsito de Neisseria/AAEAP (SEC ID ?O:25), los complejos de péptido de tránsito-carga y los ácidos nucleicos, se pueden componer de cristaloides o coloides. "Cristaloides" como se usa aqui, son soluciones acuosas de sales minerales u otras moléculas solubles. Los coloides, como se usan aqui, contienen moléculas insolubles grandes, tales como gelatina, fluidos. Los fluidos intravenosos pueden ser estériles. Los fluidos cristaloides que pueden ser usados para la administración intravenosa incluyen, pero no se limitan a, solución salina normal (una solución de cloruro de sodio a una concentración del 0.9%), lactato de Ringer o solución de Ringer, y una solución de 5% de dextrosa en agua, llamada algunas veces D5W, como se describe en la Tabla 4. Tabla 4: Com osiciones de Soluciones Cristaloides Comunes * El lactato de Ringer también tiene 28 mmol/L de Lactato, 4 mmol/L K+ y 3 mmol/L Ca 2+ La vida media de las composiciones de la invención en el flujo sanguíneo se puede extender u optimizar por varios métodos conocidos por aquellas personas experimentadas en la técnica, incluyendo pero no limitados a, péptidos circularizados (Monk et al., BioDrugs 19 (4) : 261-78, (2995); DeFreest et al., J. Pept. Red. 63(5):409-19 (2004)), D,L-péptidos (diastereómeros), (Futaki et al., Biol. Chem. 23 de febrero; 276 (8) : 583-40 (2001); Papo et al, Cáncer Red. 64 (16) :5779-86 (2004); Miller et al, Biochem. Pharmacol. 36(1) : 169-76, (1987)); péptidos que contienen aminoácidos inusuales (Lee et al., J. Pept. Res. 63(2): 69-84 (2004)), y modificaciones de la N- y la C-terminal (Labrie et al., Clin.
Invest. Med. 13(5):275-8, (1990)). De particular interés son la isomerización d (substitución) y la modificación de la estabilidad del péptido via substitución D o substitución L de aminoácidos. Cuando la administración es por inyección, la composición se puede formular en soluciones acuosas, preferiblemente en amortiguadores compatibles fisiológicamente, tales como la solución de Hanks, solución de Ringer, o amortiguador salino fisiológico. La solución puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, agentes estabilizadores y/o agentes de dispersión. Alternativamente, la composición puede estar en forma de polvo para su constitución antes del uso con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos. Cuando la administración es por inhalación, la composición se puede administrar en forma de un rociador de aerosol de paquetes presurizados o un nebulizador con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorofuorometano, triclorofluorometano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Se pueden formular cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para usarse en un inhalador o insuflador, las cuales contienen una mezcla en polvo de las proteínas y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón. Cuando es la administración es por administración tópica, la composición se puede formular como soluciones, geles, ungüentos, cremas, suspensiones y los similares, como son bien conocidos en la técnica. En algunas modalidades, la administración es por medio de un parche transdérmico. Cuando la administración es por supositorio (por ejemplo, rectal o vaginal) , la composición también se puede formular en composiciones que contienen bases de supositorios convencionales . Cuando la administración es oral, la composición se puede formular fácilmente en combinación con los portadores aceptables farmacéuticamente, bien conocidos en la técnica. Se puede un portador sólido, tal como manitol, lactosa, estearato de magnesio, y los similares; tales portadores permiten que la quimiotaxina sea formulada como comprimidos, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones y los similares, para la ingestión oral por un sujeto a ser tratado. Para las formulaciones sólidas tales como, por ejemplo, polvos, cápsulas y comprimidos, los excipientes adecuados incluyen rellenadores tales como azucares, preparación de celulosa. Agentes de granulación, y agentes de aglutinamiento. Otros portadores convenientes, como son bien conocidos en la técnica, también incluyen portadores multivalentes, tales como polisacáridos capsulares de bacterias, un dextran o un vector diseñado por ingeniería genética. Además, las formulaciones de liberación prolongada que incluyen la composición permiten la liberación de la composición durante periodos de tiempo prolongados, de manera tal que sin la formulación de liberación prolongada, la composición seria eliminada del sistema de un sujeto, y/o se degradarla, por ejemplo, por las proteasas y la hidrólisis simple antes de provocar o mejorar un efecto terapéutico.
Kits o Estuches Médicos que Comprenden un Dominio de Tránsito de Neisseria/AAEAP (SEC ID NO:25) En otro aspecto, la invención proporciona estuches médicos que contienen uno o más de los siguientes en un empaque o recipiente: (1) un reactivo que comprende un complejo de un péptido de transito de Neisseria o AAEAP (SEC ID NO: 25) enlazado con un compuesto de carga; (2) un reactivo ue contiene un auxiliar o excipiente aceptable farmacéuticamente; (3) un vehículo para la administración, tal como una jeringa; (4) instrucciones para la administración. También se contemplan modalidades en las cuales dos o más de los componentes (l)-(4) se encuentran en el mismo recipiente. En otras modalidades, los componentes del estuche médico pueden incluir un reactivo que comprende un péptido de transito de Neisseria o AAEAP (SEC ID NO:25), y un reactivo separado que comprende el compuesto de carga. En otras modalidades, el estuche médico comprende un reactivo que comprende el péptido de transito de Neisseria o de AAEAP (SEC ID NO:25), pero no un reactivo que comprenda el compuesto de carga. En otras modalidades, los reactivos se formulan para administración intravenosa, y/o el vehículo de administración es apropiado para la administración intravenosa. En algunas modalidades, el estuche puede comprender un péptido de tránsito derivado de cupredoxina, específicamente azurina de Pseudomonas aeruginosa. En otras modalidades, los estuches pueden comprender reactivos para enlazar un compuesto de carga a un péptido de transito de Neisseria/AAEAP, o un péptido de transporte derivado de cupredoxina. Cuando se suministra un estuche, los diferentes componentes de la composición puede ser empacados en recipientes separados y se mezclan inmediatamente antes del uso. Tal empacado de los componentes por separado puede permitir el almacenaje a largo plazo sin perder las funciones del componente activo. Los reactivos incluidos en el estuche se pueden suministrar en recipientes de cualquier tipo, de manera tal que la vida de los diferentes componentes se preserva y no son adsorbidos por los materiales del recipiente. Por ejemplo, ampolletas de vidrio selladas pueden contener el polipéptido o el polinucleótido liofilizado, o amortiguadores que hayan sido empacados en un gas no reactivo, neutro, tal como nitrógeno. Las ampolletas se pueden componer de cualquier material adecuado, tal como vidrio, polímeros orgánicos, tales como policarbonato, poliestireno, etc., cerámica, metales u otros materiales empleados típicamente para contener reactivos similares. Otros ejemplos de recipientes adecuados incluyen botellas simples que pueden ser fabricados de substancias similares como ampolletas, y sobres, que pueden comprender interiores forrados con una hoja fina de metal, tal como aluminio o una aleación. Otros recipientes incluyen tubos de ensayo, frascos, matraces, botellas, jeringas, o los similares. Los recipientes pueden tener un orificio de acceso estéril, tal como una botella que tenga un tapón que puede ser perforado por una aguja de inyección hipodérmica. Otros recipientes pueden tener dos componentes que están separados por una membrana que se puede retirar fácilmente, que tras la remoción permiten que los componentes se mezclen. Las membranas removibles pueden ser de vidrio, plástico, caucho, etc. Los estuches también se pueden suministrar con materiales adicionales. Las instrucciones se pueden imprimir en papel u otros substratos, y/o se pueden suministrar como un medio legible por computadora, tal como un disco flexible, CD-ROM, DVD-ROM, disco Zip, videocinta, cinta de audio, dispositivo de memoria fugaz, etc. Las instrucciones detalladas pueden no estar asociadas físicamente con el estuche; más bien, un usuario puede ser dirigido a un sitio de red de la Red internacional especificada por el fabricante o el distribuidor del estuche, o suministrada como un correo electrónico. Un entendimiento más completo de la presente invención se puede obtener por la referencia a los siguientes Ejemplos específicos. Los Ejemplos se describen solamente para propósitos de ilustración, y no tienen como fin limitar el ámbito de la invención. Los cambios en la forma y la substitución de los equivalentes se contemplan como circunstancias que se pueden sugerir un volverse convenientes. Aunque se han empleado términos específicos aqui, tales términos están hechos en un sentido descriptivo y no para propósitos de limitación. Se pueden hacer modificaciones y variaciones de la invención como se definen de aqui en adelante, sin apartarse del espíritu y el ámbito de la misma, y por lo tanto, sólo tales limitaciones se deben imponer cuando se indican por las modalidades anexas.
EJEMPLOS Ejemplo 1, Clonación y Expresión de los Genes de fusión de Laz y H.8-Azurina El gen laz de Neisseria gonorrhoeae se clonó (Fig. 1A) basado en su secuencia conocida (SEC ID NO:l). El gen de azurina de P. aeruginosa (SEC ID NO:2), llamado paz (Fig. IB), y la secuencia del epitope de H.8 de laz de N. gonnerrhoeae (SEC ID ?O:3), se usaron para clonar en fase el gen del epitope de H.8 en el extremo 5' de paz, para producir H.8-paz (Fig. 1C) o en el extremo 3' de paz para generar paz-H.8 (Fig. ID), como se describe a continuación.
Lineas Celulares y Reactivos. Las células cancerosas humanas, las cepas bacterianas y los plásmidos se listan en la Tabla 5. Las células humanas de cáncer de pecho MCF-7 y las células de tumor cerebral L?-229 son de la colección de cultivos de reserva del Departamento de Oncológica Quirúrgica, University of Illinois, Chicago (UIC) . Las células se cultivaron en MEM con sal Eagle conteniendo L-glutamina a mM, aminoácidos esenciales de MEM 0.1 M, y complementado con 10% de suero de bovino fetal desactivado por calor, 100 unidades/m de penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina. Todas las células se cultivaron a 37 °C en 5% de C02. (Yamada, et al., Proc Nati. Acad, Sci, EEUU 99:14098-14103 (2002); Punj et al., Oncogene 23:2367-2378 (2004)9.
Tabla 5 Células cancerosas, cepas bacterianas y construcciones genéticas Células/cepas/plásmidos Características relevantes* Referencia LN-229 Glioblastoma de cerebro humano Ishii et al., Brain Pathol. 9:469-479 (1999) MCF-7 Adenocarcinoma de pecho humano Soule, et al., J. Nati, Cáncer Inst. 51:1409- 1416 (1973); Puni et al., Oncogene 23:2367- 2378 (2004) P. aeruginosa PAOl Prototrofo FP- (factor sexual negativo) Holloway et al., Microbiol. Reivindicación. 43:73- 102 (1979) E. coli JM 109 Cepa de clonación y expresión de Yanisch-Perron, et al., azurina Gene 33:103-119 (1985) E. coli BL21 Cepa de expresión de GST Novagen (DE3) N. gonorrhoeae F62 Prototrofo usado para el aislamiento de American Type Culture ADN Collection pUC18 Vector de clonación general, Apr Yanisch-Perron, et al., id. pUC19 Vector de clonación general, Apr Yanisch-Perron, et al. Id. pUC19-laz Un fragmento de PCR de 1 kb de ADN En este documento. geonómico de N. gonorrhoeae F62 clonado en pUC18 pUC19-paz Un fragmento de PCR de 0.55 kb de P. Yamada, et al., Proc. aeruginosa PAOl clonado en pUC19 Nati. Acad. Sci. EEUU digerido en HindIII y PstI, Ap' 99:14098-14103 (2002); Yamada, et al., Proc. Nati. Acad. Sci EEUU 101:4770-4775 (2004) pUC18-H.8 Plásmido de fusión que codifica H.8 de En este documento N. gonorrhoeae y azarina de P. aeruginosa PAOl, Apr pUC19-paz-H.8 Plásmido de fusión que codifica la En este documento azurina de P. aeruginosa PAOl y H.8 de N. gonorrhoeae, Apr pGEX-5X-3 Vectores de fusión del gen de GST, Apr Amersham pET29a Vector de expresión de E. coli. Km' Novagen pET29a-gst Derivado de pET29a que contiene el En este documento gen de gst, Km' pET29a-H.8-GST Derivado de pET29a que contiene el En este documento gen de H.8-GST, Km' pGEX-5X-3-H.8 Derivado de pGEX-5X-3 que contiene En este documento la región codificante de H.8, Apr pET29a-gst-H.8 Derivado de pET29a que contiene el En este documento gen de gst-H.8, Kmr * Ap. Ampicilina, Km, canamicina; GST, Glutationa S-transferasa Clonación y Expresión de los Genes de paz y laz. Se ha descrito la clonación y la hiperexpresión del gen de azurina (Yamada, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EEUU 99:14098-14103 (2002); Punj , et al., Oncogene 23:2367-2378 (2004)). El gen que codifica a Laz (laz) de Neisseria gonorrhoeae se amplificó por PCR con ADN geonómico de la cepa F62 de N. gonorrhoeae como AD? de plantilla. Los cebadores hacia adelante e inverso usados fueron 5'-CCGGAATTCCGGCAGGGATGTTGTAAATATCCG-3' (SEC ID ?O: 4) y 5'-GGGGTACCGCCGTGGCAGGCATACAGCATTTCAATCGG-3 ' (SEC ID ?O:5) donde los sitios de restricción introducidos adicionalmente de EcoRI y Kpnl están subrayados respectivamente. El fragmento de AD? amplificado de l.o kb, digerido con EcoRI y Kpnl, se insertó en los sitios correspondientes del vector de pUC18 (Yanish-Perron, et al., Gene 33:103-119 (1985)) de manera que el gen laz de colocó corriente abajo del prometo de laz para dar un plásmido de expresión pUC18-laz (Tabla 5, Figura 1) • Los plásmidos que expresan la H.8 de fusión de Laz de N. gonorrhoeae y azurina de P. aeruginosa (Paz) se construyeron por PCR con pUC19-paz y pUC18-laz como plantillas. Para la fusión de H.8-Paz, un fragmento de 3.1 kb se amplificó con pUC18-laz como una plantilla y los cebadores 5'-(f?spforilado)GGCAGCAGGGGCTTCGGCAGCATCTGC.3' (SEC ID ?O: 6) y 5' -CTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCG-3 ' (SEC ID ?O: 7) donde un sitio de Salí está subrayado. Un fragmento de 0.4 kb amplificado por PCR se obtuvo a partir de pUC19-paz como una plantilla y los cebadores, 5'-(fosforilado)GCCGAGTGCTCGGTGGACATCCAGG-3' (SEC ID NO: 8) y 5'-TACTCGAGTCACTTCAGGGTCAGGGTG-3' (SEC ID NO: 9) donde se subraya un sitio de Xhol. Un fragmento de pUC18-18 de PCR digerido por Salí y el fragmento de PCR digerido por Xhol de pUC19-paz se clonaron para dar un plásmido de expresión pUC18-H.8-paz (Tabla 5, Figura 1). Para la fusión de paz-H.8, un fragmento de 3.3 kb se amplificó con pUC19-paz como una plantilla y los cebadores, 5' -CTTCAGGGTCAGGGTGCCCTTCATC-3' (SEC ID NO: 10) y 5' -CTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCG-3' (SEC ID NO: 11) donde se subraya un sitio de BamHI. Un fragmento de 0.13 kb se amplificó con pUC18-laz como una plantilla y los cebadores, 5'-(f?SforÍlad?)TGCTCTCAAGAACCTGCCGCGCCTGC-3' (SEC ID NO: 12) y 5'-TAGGATCCTTAGGCAGCAGGGGCTTCGGCAGCATCTGC-3' (SEC ID NO: 13) donde se subraya un sitio BamHI y el TTa introducido, correspondiente al codon de detención del gen bacteriano, está en itálicas. Dos fragmentos de PCR digeridos por BamHI se clonaron para dar un plásmido de expresión pUC19-paz-H.8 (Tabla 5) . E. coli JM109 se usó como una cepa anfitriona para la expresión de la azurina y sus genes derivados. Las cepas de E. coli recombinantes se cultivaron en medio 2 X YT conteniendo 100 µg/1 de ampicilina IPGT 0.1 mM y CuS04 0.5 mM, durante 16 h a 37 °C para producir las proteínas de azurina Construcción de Plásmidos para las Proteínas de Fusión de GST. El gen que codifica la glutationa S-transferasa (GST) se amplificó por PCR con pGEX-5X-3 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ) como ADN de plantilla. Los cebadores hacia adelante e inverso usados fueron 5 ' -CGAGCTCATGTCCCCTATACTAGGTIATIGG-3 ' (SEC ID NO: 14) y 5'-CCCAAGCITTCAGGGGATCCCACGACCTTCGATCAGATCC-3' (SEQ ID NO: 15) donde se subrayan los sitios de restricción introducidos adicionalmente de Sacl y HindIII y el TCA introducido adicionalmente, el codon de detención del gen bacteriano correspondiente, están en itálicas respectivamente. El fragmento de ADN amplificado de 1.0 kb, digerido con Sacl y HindIII, se insertó en los sitios correspondientes del ventor pET29a para dar un plásmido de expresión pET29a-gst (Tabla 5) . Para la fusión de H.8-GST, el péptido señal y la región codificante de H.8 se laz se amplificaron por PCR con pUC18-laz como plantilla. Los cebadores hacia adelante e inverso usados fueron 5' -GGAATTCATATGAAAGCTIATCTGGC-3' (SEC ID NO: 16) y 5' -CCGGAATTCGGCAGCAGGGGCTICGGC-3' (SEC ID NO: 17) donde se subrayan respectivamente los sitios de restricción introducidos adicionalmente de Ndel y EcoRI. El fragmento de ADN amplificado de 0.14 kb, digerido con Ndel y EcoRI, se inserto en los sitios correspondientes del vector pET29a-gst para dar un plásmido de expresión pet20a-g8-gst (Tabla 5) . Para la fusión de GST-H.8, la región codificante de H.8 se amplificó por PCR con pUC18-laz como ADN de plantilla. Los cebadores hacia adelante e inverso usados fueron 5'-CGGGATCCCCTGCTCTCAAGAACCTGCCGCGCC-3' (SEC ID NO: 18) y 5'-CGGAATICTGAGGCAGCAGGGGCTTCGGCAGCATCTGCAGG -3' (SEC ID NO: 19) ' donde se subrayan respectivamente los sitios de restricción introducidos adicionalmente de BamHI y EcoRI y el TTA del codon de detención del gen bacteriano introducido está en itálicas. El fragmento de ADN amplificado de 0.14 kb, digerido con BamHI y EcoRI, se insertó en los sitios correspondientes del vector pGEX-5x-3 para dar un pGEX-5x-3-H.8. La región de fusión de GST-H.8 se amplificó entonces por PCR con pGEX-5x-3-H.8 como un ADN de plantilla. Los cebadores hacia adelante e inverso usados fueron 5'-CGAGCTCATGTCCCCTATACTAGGTIATTGG-3' (SEC ID NO: 20) y 5'-CCGCTCGAGTC?GGCAGCAGGGGCTTCGGCAG-3' (SEC ID NO: 21) donde se subrayan los sitios de restricción introducidos adicionalmente de Sacl y Xhol y el codon de detención del gen bacteriano TCA está en itálicas. El fragmento de ADN amplificado de 1.1 kb, digerido con Sacl y Xhol se insertó en los sitios correspondientes del vector pET29a-gst-H.8 (Tabla 5) . Se usó E. coli BL21 (DE3) como una cepa anfitriona para la expresión del gst y sus derivados de fusión. Cuando las cepas de E. coli que alojan estos plásmidos se cultivaron en presencia de IPTG, las células Usadas y las proteínas purificadas como se describe para la azurina (Yamada, et al., Proc. Nati. Acad. Sci EEUU 99:14098-14103 (2002); Punj , et al., Oncogene 23:2367-2378 (2004); Yamada et al., Cell. Microbiol. 7:1418-1431 (2005)), los varios derivados de azurina migraron el SDS-PAGE como componentes individuales (Fig. 1E) , aunque las proteínas que contenían H.8 (aproximadamente 17 kDa) mostraron migraciones anómalas, como se señaló antes (Cannon et al., Fisette et al., id) Ejemplo 2. El H.8 mejora la citotoxicidad de la Azurina de F. aerag±nosa hacia las células de glioblastoma pero para las células de cáncer de pecho Se ha reportado la entrada preferencial de Paz hacia las células cancerosas (Yamada, et al., Cell. Microbiol. 7:1418-1431 (2005)) y su citotoxicidad, tanto in vitro e in vivo hacia el melanoma humano (Yamada, et al., Proc. Nati. Acad. Sci EEUU 99:14098-13103 (2002)) y el cáncer de pecho (Punj, et al., Oncogene 23:2367-2378 (2004)). Sin embargo, no se conoce ningún efecto de Paz o Laz hacia los tumores cerebrales tales como el glioblastoma. Aqui se estudió el efecto de Paz y Laz, H.8-Paz (el epitope H.8 en la N-terminal de Paz) y Paz-H.8 (el epitope H.8 en la C-terminal de Paz) tanto en el glioblastoma (linea celular LN-229) y el cáncer de pecho (linea celular MCF-7) .
Preparación de las proteínas. La azurina (Paz) de P. aeruginosa, Laz de N. gonorrhoeae, Paz-H.8 y H.8-Paz se purificaron como se describe previamente. (Yamada, et al., Proc. Nati. Acad. Sci EEUU 99:14098-14103 (2002); Punj , et al., Oncogene 23:2367-2378 (2004); Yamada, et al., Cell.
Microbiol. 7:1418-1431 (2005)). Todos los derivados de fusión recombinantes de GST se purificaron como se describió antes (Yamada et al., Cell. Microbiol. 7:1418-1431 (2005)). Se compró un péptido de H.8 de 39 aminoácidos sintetizado químicamente .
Ensayo de Citotoxicidad. Se llevó cabo un ensayo de bromuro de 3- (4-4, 5-dimetiltiazol-2-il-2, 5-difenil) tetrazolio para determinar la citotoxicidad hacia las células canceross.
Las células (5xl03 por pozo) se sembraron en placas de cultivo de 96 pozos en 100:1 del medio a 37°C con 5% de C02.
Después de incubación durante toda la noche, el sobrenadante se extrajo y a las células enlazadas se agregó medio conteniendo las proteínas a varias concentraciones como se especifica. Estas células se incubaron durante varios periodos de tiempo como se especifica antes de que se determinará el número de células vivas por ensayo de MTT agregando 10 µl de solución de 5 mg/ml de MTT (Sigma-Aldrich, St Louis MO) al cultivo, e incubando por 2 h a 37 °C. La reacción de MTT se determinó agregando 100 µl de HCl 40 mM en isopropanol. Se midió por espectrometría el formazán de MTT formado, de acuerdo con el método descrito por Mosmann 8J. Immunol. Methods 65:55-63 (1983)). El péptido de H.8 sintético tuvo muy poca citotoxicidad hacia las células de glioblastoma LN-229 (Fig. 2a) o bien de cáncer de pecho MCF-7 (Fig. 2B) . El efecto de la azurina (Paz) fue dependiente de la dosis, aunque bajo, en las células de glioblastoma (Fig. 2A) pero no en las células de cáncer de pecho (Fig. 2B) con citotoxicidad creciente cuando la concentración de azurina se elevó de 10 µM a 40 µM. La citotoxicidad aumento sólo marginalmente más allá de un periodo de incubación de 6 h. más notable fue la diferencia en la citotoxicidad de Paz, Paz-H.8, H.8-Paz y Laz en las células de glioblastoma y de cáncer de pecho. Aunque Paz, Paz-H.8, H.8-Paz y Laz tuvieron citotoxicidades esencialmente idénticas a todas las dosis en las células MCF-2 para los diferentes periodos de incubación (Fig. 2B) , Paz tuvo mucho menor citotoxicidad que Paz-H.8, H.8-Paz o Laz para las células de glioblastoma, en particular en periodos de tiempo más cortos de incubación (6 h) . Por lo tanto, la porción de H.8, aunque carente de citotoxicidad en si, parece aumentar la citotoxicidad de Paz, pero sólo hacia las células de glioblastoma y no hacia las células de cáncer de pecho.
Ejemplo 3. Epitope H.8 presente en Paz o Laz facilita la absorción de la Azurina en las células de glioblastoma La citotoxicidad aumentada de Paz-H.8, H.8.-Paz y Laz hacia las células de glioblastoma en comparación con Paz, da lugar a la cuestión de si la porción H.8 facilita de algún modo la absorción de la azurina en las células de glioblastoma. Las proteínas fluorescentes rojas etiquetadas con Alexa flúor® (Invitrogen-Molecular Probes Corp., Carlsbad CA) se usaron para determinar la internalización de estas proteínas dentro de las células de glioblastoma y de cáncer de pecho. Esta técnica se usó previamente para demostrar la internalización de la azurina en células MCF-7 (Punj, et al., Oncogene 23:2367-2378 (2004); Yamada et al., Cell. Microbiol. 7:1418-1431 (2005)).
Microscopía Confocal. Para la preparación de las muestras microscópicas, las células se cultivaron sobre cubiertas de vidrio durante toda la noche a 37 °C bajo 5% de C02. Medio fresco precalentado a 37°C se mezcló azurina o derivados de fusión de GST con etiquetas fluorescentes rojas (Alexa fl or® 568), y se incubaron con las células por los tiempos indicados. Las células se lavaron con PBS, y se fijaron con metanol a -20°C por 5 min. Después del lavado con PBS tres veces y la adición de medio de montaje conteniendo 1.5 mg/ml de 4, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (DAPI) para teñir los núcleos (VECTASHIELD®, Vector Laboratories, Burlingame CA) , las imágenes se tomaron usando un microscopio confocal de barrido láser Cari Zeiss LSM510. (Yamada, et al., Cell. Microbiol. 7:1418-1431 (2005)). La azurina se internalizó con una eficiencia mas reducida que Paz-H.8, H.8-Paz y Laz, demostrando una barrera para la entrada de Paz en las células de gioblastoma LN-229 (Figs. 3A y 4A) . En contraste, Paz se internalizó eficientemente en las células MCF-7 de cáncer de pecho como se reportó previamente, con una eficiencia igual o algo mayor que Paz-H.8, H.8-Paz o Laz (Figs. 3B y 4B) (Punj, et al., Oncogene 23:2367-2378 (2004); Yamada, et al., Cell. Microbiol. 7:1418-1431 (2005)). Una dependencia de la dosis de la entrada de Laz en las células LN-229 demuestra una concentración óptima de aproximadamente 16 µM durante un periodo de incubación de 30 min. a 37°C (Figs. 3C y 3D) más allá de lo cual no hubo ninguna mejora (no se muestran los datos. A la concentración de 10 µM, en tanto que la masa de Laz se internalizó en las células LC-229 en aproximadamente 10 a 20 minutos (Figs. 3D y 4D) , la internalización de Paz fue mínima durante tales condiciones (Fig. 3E) , sugiriendo que la internalización de Paz fue inherentemente ineficiente en las células LC-229. La Internalización significativa de Paz-H.8 y H.8-Paz, similar a Laz pero en contrate con Paz en las células LN-229 (Fig. 3A y 4A) parece sugerir que la ubicación relativa de la porción de H.8, ya sea en la N-terminal o en la C-terminal de Paz, no afectó su habilidad para promover la Internalización de la porción de Paz en las células de glioblastoma.
Ejemplo 4. La porción de H.8 promueve la entrada de Paz en las células de glioblastoma pero no en las de cáncer de pecho. Con el fin de determinar si el epitope de H.8 necesita ser una parte de Paz, como en Laz, o podria funcionar sólo para promover la entrada de Paz en las células de glioblastoma, se usaron varias proteínas de fusión de H.8, además del H.8 sólo. Como los péptidos pequeños tales como la porción de H.8 de 39 aminoácidos, tienen solubilidad baja en solución, construimos fusiones de glutationa S-transferasa (GST) dentro de la porción de H.8, similares a Paz-H.8 o H.8- Paz, de manera tal que la H.8 se incorporó en la N-terminal de la GST (H.8-GST) o en la C-terminal de GST (GST-H.8=. la construcción de los péptidos de fusión de GST se describe bajo el Ejemplo 1. Paz conjugada con Alexa flúor®, con fluorescencia roja, se incubó con el péptido de H.8 sintético sin etiquetar, GST, GST-H.8 y H-GST y las proteínas de fusión, por separado, junto con solución salina amortiguada por fosfato (PBS) como un control, y se determinó la internalización de una mezcla de Paz 20 µm n las células LN-229 después de la incubación a 37°C por 30 min. El péptido de H.8 sintético, cuando se introduce por separado junto con Paz, mejora la internalización de Paz (Fig. 5A) en comparación con el PBS (Fig. 5E) , la GSt (Fig. 5B) o GST-H.8 (Fig. 5C) . La cuantificación de la fluorescencia mostró que el péptido de H.8 estimula la entrada de Paz en un factor de 2.1. La presencia de H.8-GST, sin embargo, mejora significativamente (más de tres veces) la internalización de Paz (Fig. 5D) . GST-H.8, por otro lado, sólo mostró una estimulación ligera (Fig. 5C) . Paz por si sólo, entró sólo lentamente (Fig. 5E) en las células de glioblastoma demostrando que la entrada en las células tumorales del cerebro está mediada por H.8. H.8 sola no entró en las células de glioblastoma (Fig. 3A) pero su habilidad para estimular la internalización de Paz (Fig. 5A) refleja su habilidad para facilitar la entrada de las proteínas hacia las células tumorales del cerebro.
Ejemplo 5. La internalización mejorada de Paz en presencia de H.8-GST en células de glioblastoma lleva a una mayor citotoxicidad en tales células Incubamos el péptido de H.8 sintético, y las proteínas GST, GST-H.8 y H.8-GST (20 µM de cada uno) en ausencia o presencia de Paz 20 µM con células LN-229, por 24 h y después se midió la extensión de la citotoxicidad midiendo las células de glioblastoma viables por el ensayo MTT después de 24 horas. En ausencia de Paz, ninguno del péptido de H.8, GST o las proteínas de fusión de GST demostraron ninguna citotoxicidad significativa (Fig. 5F, -Paz) . En presencia de Paz 20 µM, la cual por si sola demostró una citotoxicidad baja en presencia del péptido de H.8 o el PBS (Fig. 5F, +Paz) , se observó una mejora considerable de la citotoxicidad sólo en presencia de H.8-GST (Fig. 5F, +Paz) , aunque, la GST por si sola, o el GST-H.8 no mostraron ninguna mejora de la citotoxicidad (Fig. 5F, +Paz) . Tomados juntos, estos datos sugieren que la porción de H.8, cuando está presente como parte o en presencia de una proteina tal como Paz, facilita el transporta hacia tales células, resultando en una citotoxicidad mejorada.
Ejemplo 6. El cruce de la BBB Mediado por H.8 permite la Entrada al Cerebro La habilidad del epitope de H.8 para permitir la internalización mejorada de una proteina de fusión o individual en las células de glioblastoma LN-229 (Figs. 3A y 4A) da lugar a la cuestión de si la H.8 como parte de la N-terminal de H.8-Paz o Laz, promueve el cruce de la BBB y permite el transporte de estas proteínas desde la circulación periférica a las venas pequeñas del cerebro. Ensayo de Odyssey®. Todas las proteínas se etiquetaron usando IRDye® 800CW (LI-COR Biosciences, Lincoln, Nebraska) bajo las condiciones recomendadas por los fabricantes. Quinientos µg de Paz, H.8-Paz y Laz conjugadas con IRdye® 800 CW se inyectaron intraperitonealmente en ratones desnudos. Después de 24 h, los ratones de sacrificaron, sus cerebros de extrajeron y se tomaron imágenes de los cerebros, con el Sistema de Exploración Infrarroja Odyssey® (resolución de 84 µm, desviación de 1 mm) . Los cerebros de los ratones se cortaron horizontalmente entonces y se tomaron imágenes del mesencéfalo rostral para detectar la presencia de las proteínas etiquetadas.
Cuantificación de la Fluorescencia en las Proteínas de Azurina. La cuantificación de la fluorescencia se midió usando Adobe® Photoshop® como sigue, se seleccionó una célula mediante la herramienta Lasso de Photoshop®, y se tomo el valor promedio del histograma rojo del menú imagen. Se midieron al menos tres diferentes células para una muestra y se calculó la desviación estándar. Quinientos µg de las proteínas Paz, H.8-Paz, y Laz, etiquetadas con el tinte infrarrojo IRdye® 800CW (LI-COR Bioscience) se inyectaron intraperitonealmente en ratones desnudos vivos. Después de 24 h, los ratones se sacrificaron, los cerebros se aislaron y se tomaron imágenes, usando el sistema de Exploración Infrarroja Odyssey® de Li-Cor. Aunque se encontró que Paz entró en las venas pequeñas del cerebro en pequeñas cantidades, se detectó mucho más las, en partículas H.8-Paz (más de 4 veces) dentro de los cerebros bajo tales condiciones (Fig. 6) , demostrando un papel claro del epitope de H.8 para permitir la entrada de las proteínas de fusión en el cerebro.
Ejemplo 7. El epitope de H.8, cuando está presente en la N-terminal, permite el despliegue en la superficie bacteriana de las proteínas periplasmáticas . Para investigar si la localización en la N-terminal del epítope de H.8 en Laz contribuye a su despliegue superficial, se construyeron derivados de fusión de H.8 en las terminales N y C de GST (Fig. 5) y Paz (Fig. 2 y Figs. 3A/B y 4A/B) , como se describe en el ejemplo 1.
Localización de las proteínas expuestas en la superficie en E. coli. La cepa de E. coli BL21 (DE3) que aloja a pET29a-gst, pET29a-H.8.gst o pET29a-gst-H.8 y la cepa de E. coli JM109 que aloja a pUC19-paz, pcul9-paz-H.8, pUC18-H.8-paz o pUC18-laz se cultivaron a 37°C con Isopropil ß-D-tiogalactosidada 0.4 nM (IPTG) . Un mi de cada uno de estos cultivos bacterianos se sometió a centrifugación y los aglomerados resultantes se recolectaron. Después del lavado con PBS dos veces, se agregó un mi de FBS-PBS al 5% conteniendo anticuerpo anti-GST (1:2000) para derivados de GST o anticuerpo anti-azurina (1:500) para derivados de azurina. Se aplicó IgG anti-conejo conjugado con FITC para los derivados de GST o anticuerpo anti-conejo conjugado con FITC para los derivados de azurina, y se incubó en hielo por 30 min. Para extraer el anticuerpo no enlazado, las células se lavaron con PBS dos veces, y se fijaron con etanol en hielo. Las muestras de E. coli tratadas con DAPI se observaron entonces bajo el microscopio confocal. Las proteínas de fusión de H.8 se purificaron (Fig. 1E y Fig. 7A) . Las localizaciones celulares de GST, así como de las dos fusiones de H.8 en la terminal N u C (H.8-GST y GST-H.8) se muestran en la Fig. 7B. Las tres proteínas se hiperexpresaron en E. coli y se presentan en todos los usados de células completas de E. coli, cuando se detectan por transferencia Western usando anticuerpo anti-GST (Fig. 7B) . Cuando se aislaron las fracciones periplasmáticas de E. coli y se verificó la presencia de las tres proteínas, las proteínas GST y GST-H.8 se detectaron en cantidades significativas (Fig. 7B, trayectorias 1 y 3 bajo la fracción periplasmática) pero sólo cantidades pequeñas del H.8-GST (Fig. 7B, trayectoria 2 bajo la fracción periplasmática) se podrían detectar en tales fracciones periplasmáticas. Para examinar si el resto de las proteína de fusión H.8-GST podría haber sido transportada a la superficie de la E. coli , las células que hiperexpresan las tres proteínas se cultivaron y se cosecharon, se lavaron, se trataron con anticuerpo anti-GST para enlazar cualquier GST expuesta en la superficie, se lavaron otra vez y se trataron con anticuerpos secundarios conjugados con FITC. Si la GST está expuesta en la superficie, los anticuerpos anti-GST podrían enlazarse a esta, lo cual se podría detectar por los anticuerpos secundarios conjugados con FITC. En realidad, sólo la E. coli que aloja al H.8-GST mostró la fluorescencia verde generada por la FITC (Fig. 7C, H.8-GST), sugiriendo que la presencia del epítope de H.8 en la N-terminal de la GST promueve su transporte a la superficie celular. La presencia de la porción H.8 en la C-terminal de GST (GST-H.8), así como de la GST por si sola, permanecen en gran parte periplasmática e intracelular sin ningún despliegue superficial (Fig. 7C, GST y GST H.8) . Usando la misma técnica como se describe arriba, determinamos que la paz y Paz-H.8 permanecieron intracelulares (Fig. 7D paz y Paz-H.8) en tanto que tanto H.8-Paz y laz mostraron despliegue superficial, confirmando que la presencia de H.8 en la N-terminal, quizás requiriendo una cisteína libre para la lipidación, es importante para el transporte de las proteínas de fusión a través de la membrana externa para alcanzar la superficie.
Ejemplo 8. Tratamiento de los pacientes que sufren de cáncer Se llevará a cabo un ensayo clínico de Fase I/II de una fusión de H.8-Paz (Fármaco de Estudio), en los pacientes que sufren de cáncer. Específicamente, el dominio H.8. del gen que codifica a Laz (laz) de Neisseria gonorrhoeae y el compuesto de carga es la azurina de Pseudomonas aeruginosa (paz), haciendo la proteína de fusión "H.8-paz". Esta proteína de fusión se construirá como se ilustra en el Ejemplo 1. Cuarenta y nueve pacientes adultos con canceres el cerebro verificados histológicamente, quienes demostraron avance clínico y radiográfico o recurrencia enseguida del tratamiento adecuado por los fármacos y regímenes quimioterapéuticos aprobados por la FDA, disponibles actualmente, se enlistarán en un estudio prospectivo de etiqueta abierta administrando el Fármaco de Estudio. Para ser elegible para el enlistamiento en el estudio, todos los pacientes demostraron un volumen creciente del tumor medible después de la terminación del curso aprobado de los regímenes quimioterapéuticos. La evidencia de depósitos metastáticos persistentes y/o el aumento continuo en el tamaño del volumen se debe establecer histológicamente. Esta prueba histológica se puede obtener por una biopsia de aspiración con aguja fina (FNA) . El programa de tratamiento se instituirá después de obtener el consentimiento informado de todos los pacientes, de acuerdo con el Institutional Review Board of the University of Illinois, Chicago y la FDA. Los pacientes no tendrán enfermedades concurrentes tales como otras malignidades, historial de malignidades previas, discrasias sanguíneas, diabetes dependiente de insulina u otras enfermedades cardiovasculares serias que podrían interferir en la evaluación apropiada de los efectos de la terapia propuesta. Se llevará a cabo un trabajo sanguíneo de referencia (Conteo completo de la Sangre [CBC] y química del Suero) incluyendo estudios de la función hepática (LFT) , antes del inicio de la terapia. Todos los pacientes elegibles no deben recibir ninguna quimioterapia para el cáncer durante el periodo de la prueba. El o los fármacos de estudio se administrarán por inyección intravenosa diaria de una preparación aceptable farmacéuticamente del Fármaco de Estudio por 12 semanas, y los sujetos serán observados por cualquier toxicidad limitante de la dosis. Habrá 7 niveles de dosificación iniciando con 10 mg/kg/día y aumentando 5 mg/kg/día hasta una dosis máxima de 50 mg/kg/día. La eficacia de cada nivel de dosificación se registrará en 7 pacientes con cánceres medibles avanzados. La respuesta se estimará midiendo el tumor medible en 2 dimensiones (a y b) . 1) La desaparición total de los tumores objetivos se considerará como una respuesta completa (CR) ; 2) Una reducción del 75% se considerará una respuesta parcial excelente (PR) ; y 3) Una respuesta buena (PR) será la reducción por el tratamiento del tamaño en 50%. 4) La reducción del 50% en el tamaño se considerará como enfermedad estable (SD) y 5) < 25% se considerará como sin respuesta (NR) . A los pacientes que demuestran una progresión de la enfermedad se les deberá descontinuar al tratamiento pero será continuado por 12 semanas adicionales. La desaparición total, y cualquier reducción en el tamaño de los tumores objetivo indicarán que el tratamiento de H.8-azurina es efectivo para tratar el cáncer. Otras indicaciones de que el tratamiento de H.8-azurina es efectivo son una tasa reducida en la aparición de nuevos tumores cerebrales y una reducción en la angiogénesis asociada con los tumores. Varias modificaciones y variaciones de los ejemplos descritos y los sistemas de la invención serán aparentes para aquellas personas experimentadas en la técnica, sin apartarse del ámbito y el espíritu de la invención. Aunque la invención ha sido descrita en conexión con las modalidades específicas, se debe entender que la invención como se reivindica no debe estar limitada indebidamente a tales modalidades especificas. De hecho, varias modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención, las cuales son obvias para aquellas personas experimentadas en la técnica, tienen como objeto estar dentro del ámbito de las siguientes reivindicaciones

Claims (44)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.
1. Un péptido de tránsito aislado, caracterizado porque es una variante, derivado o equivalente estructural de Laz, Lip o Pan 1 de Neisseria, el cual facilita la entrada de una molécula enlazada a las células cancerosas cerebrales de mamíferos o a través de la barrera hematoencefálica.
2. El péptido de tránsito de la reivindicación 1, caracterizado porque para el cual la región H.8 de Laz (SEC ID NO: 24) tiene una identidad de la secuencia de aminoácidos de al menos 90%.
3. El péptido de tránsito de la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido tiene la SEC ID NO: 24
4. El péptido de tránsito de la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido de tránsito se modifica para extender u optimizar la vida media del péptido en el flujo sanguíneo.
5. Un péptido de tránsito, caracterizado porque comprende una región que consiste de al menos 4 repeticiones imperfectas o perfectas de Ala-Ala-Glu-Ala-Pro (SEC ID NO: 25), u el cual tiene al menos aproximadamente 50% de repeticiones pentapeptídicas de AAEAP (SEC ID NO: 25) a través de la longitud total.
6. Un péptido de tránsito de la reivindicación 5, caracterizado porque la región de repeticiones es al menos aproximadamente 90% idéntica con un péptido que comprende un número igual de repeticiones de Ala-Ala-Glu-Ala-Pro (SEC ID NO:25) .
7. El péptido de tránsito de la reivindicación 5, caracterizado porque es sintético.
8. El péptido de tránsito de la reivindicación 5, caracterizado porque el péptido de tránsito se modifica para extender u optimizar la vida media del péptido en el flujo sanguíneo.
9. Un complejo que comprende al menos un compuesto de carga y un péptido de transito, caracterizado porque el péptido de transito es el péptido de la reivindicación 5, y el péptido de transito se enlaza al compuesto de carga.
10. Un complejo que comprende al menos un compuesto de carga y un péptido de transito, caracterizado porque el péptido de transito es el péptido de la reivindicación 1 y el péptido de transito se enlaza con el compuesto de carga.
11. El complejo de la reivindicación 10, caracterizado porque el compuesto de carga es una cupredoxina seleccionada del grupo que consiste de azurina, plastocianina, rusticianina, seudoazurina, auracianina y la proteína similar a azurina.
12. El complejo de la reivindicación 11, caracterizado porque el compuesto de carga es la azurina de Pseudomonas aeruginosa .
13. El complejo de la reivindicación 10, caracterizado porque el complejo se modifica para extender u optimizar la vida media del péptido en el flujo sanguíneo.
14. El complejo de la reivindicación 10, caracterizado porque comprende un péptido de transporte derivado de cupredoxina.
15. El complejo de la reivindicación 10, caracterizado porque el compuesto de carga se selecciona del grupo que consiste de una proteína, lipoproteínas, polisacáridos, ácido nucleicos, tintes, micropartículas, nanopartículas, toxinas y fármacos.
16. El complejo de la reivindicación 10, caracterizado porque el compuesto de cargo es una proteína y el péptido de tránsito se enlaza con el compuesto de carga para formar una proteína de fusión.
17. El complejo de la reivindicación 15, caracterizado porque el compuesto de carga es una toxina.
18. el complejo de la reivindicación 10, caracterizado porque el compuesto de carga es un agente terapéutico para el tratamiento de las condiciones seleccionadas del grupo que consiste de depresión, trastornos emocionales, dolor crónico, epilepsia, la enfermedad de Alzheimer, apoplejía/neuroprotección, lesiones del cerebro y la medula espinal, cáncer cerebral, infecciones del cerebro por el VIH, varios trastornos que producen ataxia, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), la enfermedad de Huntington, errores genéticos congénitos que afectan el cerebro durante la infancia, la enfermedad de Parkinson y esclerosis múltiple.
19. El complejo de la reivindicación 10, caracterizado porque el compuesto de cargo es una sustancia detectable.
20. El complejo de la reivindicación 19, caracterizado porque la sustancia detectables es detectable por un método seleccionado del grupo que consiste de fluorimetría, microscopía, CT de rayos X, MRI y ultrasonido.
21. Una composición farmacéutica, caracterizada en que comprende el complejo de la reivindicación 10 en un portador adecuado farmacéuticamente.
22. La composición farmacéutica de la reivindicación 21, caracterizada en que el portador aceptable farmacéuticamente es apropiado para la administración intravenosa.
23. La composición farmacéutica de la reivindicación 2i, caracterizada en que el portador aceptable farmacéuticamente es apropiado para inyección intracerebroventricular o intracerebral.
24. Un método caracterizado porque comprende poner en contacto las células con el complejo de la reivindicación 10.
25. El método de la reivindicación 24, caracterizado en ue las células son de un tumor del sistema nervioso central.
26. El método de la reivindicación 24, caracterizado porque las células son células cancerosas seleccionadas del grupo que consiste de astrocitoma, glioblastoma, meningioma, oligodentroglioma, oligogastrocitoma, glioma, ependimoma, tumores de la medula espinal, ganglioglioma, neurocitoma y meduloblastoma.
27. Un método para tratar a un paciente con cáncer, caracterizado porque comprende administrar a dicho paciente el complejo de la reivindicación 10 una cantidad efectiva terapéuticamente .
28. El método de la reivindicación 27, caracterizado porque el complejo se administra en una manera seleccionada del grupo que consiste de intravenosamente, tópicamente, subcutáneamente, intramuscularmente, y dentro del tumor.
29. El método de la reivindicación 27, caracterizado porque comprende además co-administrar otro tratamiento para el cáncer.
30. Un método para formar imágenes del cáncer en un paciente, caracterizado porque comprende administrar el complejo de la reivindicación 19 a dicho paciente, y detectar la ubicación del compuesto de carga dentro de dicho paciente.
31. El método de la reivindicación 30, caracterizado porque el compuesto de carga es un agente de contraste de rayos X y la ubicación del compuesto de carga se detecta por CT de rayos X.
32. El método de la reivindicación 30, caracterizado porque el compuesto de carga es un agente de contraste de exploración por resonancia magnética y la ubicación del compuesto de carga se detecta por MRI.
33. El método de la reivindicación 30, caracterizado porque el compuesto de carga es un agente de contrate de ultrasónico y la ubicación del compuesto de carga se detecta por exploración ultrasónica.
34. Un método para diagnosticar el cáncer, caracterizado porque comprende poner en contacto las células con el complejo de la reivindicación 19, y detectar la ubicación celular de las moléculas de carga.
35. Un kit o estuche médico, caracterizado porque comprende un reactivo que comprende el péptido de tránsito de la reivindicación 1.
36. El kit o estuche médico de la reivindicación 35, caracterizado porque comprende un reactivo que comprende un portador aceptable farmacéuticamente.
37. El kit o estuche de la reivindicación 35, caracterizado porque comprende además un vehículo para la administración del reactivo.
38. Una molécula de ácido nucleico la cual, se caracteriza en que codifica el péptido de tránsito de la reivindicación 1.
39. Una molécula de ácido nucleico la cual, se caracteriza en que codifica el péptido de tránsito de la reivindicación 5.
40. Una molécula de ácido nucleico la cual, se caracteriza en que codifica el péptido de tránsito de la reivindicación 10.
41. Un método para tratar o diagnosticar a un paciente con una condición relacionada con el cerebro, caracterizado porque comprende co-administrar a dicho paciente el péptido de tránsito de la reivindicación 1 y al menos un compuesto de carga.
42. El método de la reivindicación 41, caracterizado porque se coadministra adicionalmente un péptido de transporte derivado de cupredoxina.
43. Un método para tratar o diagnosticar a un paciente con una condición relacionada con el cerebro, caracterizado porque comprende co-administrar a dicho paciente el péptido de tránsito de la reivindicación 5 y al menos un compuesto de carga.
44. El método de la reivindicación 43, caracterizado porque se co-administra adicionalmente un péptido de transporte derivado de cupredoxina.
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