BRPI0714987A2 - composiÇÕes e mÉtodos para a prevenÇço do cÂncer com cupredoxina - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA A PREVENÇçO DO CÂNCER COM CUPREDOXINAS. A presente invenção se refere a composições que compreendem peptídeos que podem ser variantes, derivadas e equivalentes estruturais das cupredoxinas, que têm a capacidade de inibir o desenvolvimento de lesões premalignas em células de mamíferos, tecidos e animais. Especificamente, estas composições podem compreender azurina a partir de Pseudomonas aeruginosas e/ou resíduos 50-77 de azurina (p28). A presente invenção se refere ainda a composições que podem compreender cupredoxina(s) e/ou variantes, derivadas ou equivalentes estruturais das cupredoxinas, que têm a capacidade de inibir o desenvolvimento de lesões premalignas em células de mamíferos, tecidos ou animais. Estas composições podem ser, entre outras, peptídeos ou composições farmacêuticas. As composições da invenção podem ser utilizadas na prevenção do desenvolvimento de lesões premalignas em células de mamíferos, tecidos e animais, bem como na prevenção do câncer.

Description

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA A PREVENÇÃO DO CÂNCER COM

CUPREDOXINAS

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS CORRELATOS

Este pedido reivindica prioridade nos termos do 35 U.S.C. §§ 119 e 120 para o Pedido de Patente Provisório dos EUA, Número de Série 60/844.358, depositado em 14 de setembro de 2006, que reivindica prioridade para o Pedido de Patente dos EUA 11/244.105, depositado em 6 de outubro de 2005, que reivindica prioridade para o Pedido de Patente Provisório dos EUA, Número de Série 60/616.782, depositado em 7 de outubro de 2004 e Pedido de Patente Provisório dos EUA, Número de Série 60/680.500, depositado em 13 de maio de 2005, e é uma continuação em parte do Pedido de Patente dos EUA, Número de Série 10/720.603, depositado em 11 de novembro de 2003, que reivindica prioridade pará o Pedido de Patente Provisório dos EUA, Número de Série 60/414.550, depositado em 15 de agosto de 2003 e que é uma continuação em parte do Pedido de Patente dos EUA, Número de Série 10/047.710, depositado em 15 de Janeiro de 2002, que reivindica prioridade para o Pedido de Patente Provisório dos EUA, Número de Série 60/269.133, depositado em 15 de fevereiro de 2001. O teor na íntegra destes pedidos anteriores está incorporado neste documento por referência.

DECLARAÇÃO DE INTERESSE PÚBLICO

O objeto deste pedido foi apoiado por fundos de pesquisa dos Institutos 2 0 Nacionais de Saúde (NIH), Bethesda, Maryland, E.U.A. (Números de Fundos AI 16790- 21, ES 04050-16, AI 45541, CA09432 e N01-CM97567). O governo pode ter determinados direitos sobre esta invenção. CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a composições que compreendem variantes, derivados e equivalentes estruturais de cupredoxinas que inibem o desenvolvimento de lesões pré-malignas em células, tecidos e animais mamíferos. A invenção também se refere ao uso de cupredoxinas e suas variantes, derivados e equivalentes estruturais como agentes quimiopreventivos em mamíferos para inibir o desenvolvimento de lesões pré-malignas e, finalmente, o câncer.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

Quimioprevenção do câncer é o uso de agentes químicos naturais, sintéticos ou biológicos para reverter, suprimir ou prevenir a progressão carcinogênica ao câncer invasivo. Estudos clínicos recentes na prevenção do câncer em populações de alto risco sugerem que a terapia quimiopreventiva é um tratamento real para pacientes de alto risco, sendo baseada nos conceitos de carcinogênese de campo multifocal e carcinogênese de múltiplas etapas. Em carcinogênese de campo, a exposição generalizada do carcinógeno em todo o campo do tecido resulta em lesão epitelial difusa no tecido e proliferação clonal das células de mutação. Estas mutações genéticas em todo o campo aumentam a probabilidade de desenvolvimento de uma ou mais lesões malignas ou pré-malignas. A carcinogênese de múltiplas etapas no acúmulo gradual destas alterações genéticas e fenotípicos. A interrupção de uma ou mais etapas na carcinogênese de múltiplas etapas 2 0 pode impedir ou prevenir o desenvolvimento do câncer. Vide em geral Tsao et al., CA Câncer J Clin 54:150-180 (2004).

A azurina e outras cupredoxinas são células cancerígenas especificamente citotóxicas. A azurina induz apoptose em células do câncer de pulmão J774. Yamada et al., PNAS 99(22): 14098-14103 (2002). Ao entrar nas células do câncer de pulmão J774, a azurina localiza-se nas frações citosol e nuclear, forma um complexo com a proteína supressora de tumor p53 e estabiliza-se aumentando seu nível intracelular. Id. A indução de apoptose mediada por azurina não se limita às células J774. A azurina também entra nas células cancerígenas, tais como as células do câncer de mama humano MCF-7 ou melanoma humano UISO-Mel-2. Yamada et ai., Infect Immun. 70:7054-7062 (2002); Punj et al., Oncogene. 23:2367-2378 (2004). Em ambos os casos, a azurina permitiu a elevação dos níveis intracelulares p53, conduzindo para a formação Bax melhorada e indução de apoptose nessas células. De maneira mais surpreendente, a injeção intraperitoneal de azurina em camundongos nus abrigando cânceres humanos Mel-2 ou MCF-7 xeno- enxertados levou à regressão estatisticamente significativa desses cânceres. Id.

O ensaio de cultura de órgão de glândulas mamárias de camundongos (MMOC) pode ser usado na avaliação dos efeitos inibitórios de potenciais agentes quimiopreventivos tanto na diferenciação estrutural induzida por hormônios de glândulas mamárias como no desenvolvimento de lesões semelhantes a nódulos alveolares hiperplásticos preneoplásticos induzidos por DMBA nas glândulas. As glândulas mamárias de jovens, animais virgens, quando incubadas por 6 dias na presença de insulina (I) + prolactina (P) + aldosterona (A) podem diferenciar-se em glândulas totalmente adultas. Estas glândulas remontam morfologicamente as glândulas obtidas a partir de camundongos prenhes. A aldosterona 2 0 pode ser substituída por estrogênio (E) + progesterona (Pg). A inclusão de hidrocortisona (H) ao meio estimula a diferenciação funcional das glândulas mamárias. Mehta and Banerjee, Acta Endocrinol. 80:501 (1975); Mehta and Moon, Breast Câncer: Treatment and Prognosis 300, 300 (Basil A Stoll ed., Blackwell Press 1986). Desse modo, a diferenciação estrutural e funcional induzida por hormônios, observada neste regime de cultura, imita as respostas aos hormônios observados durante vários estágios fisiológicos do animal.

Os camundongos exibem um estágio preneoplástico distinto antes da formação do câncer em MMOC. As lesões preneoplásticas em camundongos C3H são induzidas pelo vírus do tumor mamário murídeo ou em camundongos BALB/c por DMBA. A exposição das glândulas para DMBA de 2 μg/ml entre os dias 3 e 4 das fases de crescimento seguido pela regressão das glândulas por 2-3 semanas no meio contendo apenas insulina resulta na formação de lesões do alvéolo mamário (MAL). Hawthorne et al., Pharmaceutical Biology 40:70-74 (2002); Mehta et al., Methods in Cell Science 19:19-24 (1997). Além disso, o transplante de células epiteliais, preparado a partir de glândulas contendo as lesões mamárias induzidas por DMBA, em hospedeiro singenéico resultou no desenvolvimento de adenocarcinoma mamário. Telang et al., PNAS 76:5886-5890 (1979). Patologicamente, estes tumores eram similares àqueles observados in vivo, quando os camundongos da mesma cepa são administrados DMBA. Id.

A formação em MMOC de lesão mamária induzida por DMBA pode ser inibida por uma série de classes de agentes quimiopreventivos, tais como retinóides. Estes agentes incluem agentes quimiopreventivos oriundos dos produtos naturais, tais como brassinina e resveretrol, tióis, antioxidantes, inibidores de ornitina decarboxilase, como OFMO e deguelin, inibidores da síntese de prostaglandina, Ca reguladores etc. Jang et al., Science 275:218-220 (1997); Mehta, Eur. J. Câncer 36:1275-1282 (2000); Metha et al., J. Natl. Câncer Inst. 89:212-219 (1997). Estes estudos demonstram claramente que este regime de cultura de órgão oferece um modelo único para determinar a eficácia de compostos contra o carcinogênese mamário. Espera-se que os resultados sejam correlatos na inibição obtida in vivo pela administração desses compostos. A MMOC também pode ser induzida para a formação de lesões do duto mamário (MDL). As MDLs podem ser induzidas se o estrogênio e progesterona, em vez de aldosterona e hidrocortisona, forem incluídas no meio. As estruturas alveolares na presença de esteróides ovarianos são muito pequenas, porém são observadas lesões intraductais em seções histopatológicas. Mehta et al., J. Natl. Câncer Inst. 93:1103-1106 (2001). Os anti- estrogênios, que operam seletivamente sobre cânceres de mama ER+ dependentes de hormônios ovarianos, tais como tamoxifen, a formação de MDL inibida e não MAL. Portanto, este modelo de cultura modificado além do protocolo de indução MAL convencional agora pode ser usado na avaliação dos efeitos de agentes quimiopreventivos

sobre MAL e MOL.

O que é necessário é um agente quimiopreventivo que inibe o desenvolvimento de lesões pré-malignas. Esse agente quimiopreventivo deve ser capaz de prevenir o desenvolvimento inicial de lesões pré-malignas, induzir a morte celular em lesões pré- malignas e/ou prevenir o desenvolvimento de lesões pré-malignas em lesões malignas.

Esse agente quimiopreventivo teria grande utilidade no tratamento, em particular, de pacientes que tenham alto risco de desenvolvimento de câncer devido à presença de características de alto risco, a presença de lesões pré-malignas, ou lesões anteriores ao câncer ou pré-malignas.

RESUMO DAS CONFIGURAÇÕES

2 0 A presente invenção refere-se a composições que compreendem peptídeos que

podem ser variantes, derivados e equivalentes estruturais das cupredoxinas que inibem o desenvolvimento de lesões pré-malignas em células, tecidos e animais mamíferos. Especificamente, estas composições podem compreender azurina de Pseudomonas aeruginosa, e/ou os resíduos 50-77 da azurina (p28). A presente intenção também refere-se a composições que podem compreender cupredoxina(s), e/ou variante(s), derivados ou equivalentes estruturais de cupredoxinas, que conservam a habilidade de inibir o desenvolvimento de lesões pré-malignas em células, tecidos ou animais mamíferos. Essas composições podem ser peptídeos isolados ou composições farmacêuticas, entre outras. As composições da invenção podem ser usadas em métodos de prevenção do desenvolvimento do câncer em pacientes mamíferos.

Um aspecto da invenção é um peptídeo isolado que pode ser uma variante, derivado ou equivalente estrutural de uma cupredoxina e que pode inibir o desenvolvimento de lesões pré-malignas em tecido de mamíferos. A cupredoxina pode ser azurina, pseudoazurina, plastocianina, rusticianina, Laz, auracianina, estelacianina e proteína básica do pepino e, especificamente, pode ser azurina. A cupredoxina pode ser de Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes faecalis, Ulva pertussis, Achromobacter xylosoxidan, Bordetella bronchiseptica, Methylomonas sp., Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhea, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororafis, Xylella fastidiosa e Vibrio parahaemolyticus e, especificamente, Pseudomonas aeruginosa. Em algumas configurações, o peptídeo pode ser parte da SEQ ID NOS: 1, 3-19, ou ser uma seqüência para a qual a SEQ ID NOS: 1, 3-19 tem no mínimo 80% da identidade da seqüência do aminoácido. 2 0 Em algumas configurações, o peptídeo isolado pode ser um truncamento da

cupredoxina. Nesse caso, o peptídeo isolado pode ser mais do que cerca de 10 resíduos e não mais do que cerca de 100 resíduos. O peptídeo isolado pode compreender, ou alternativamente consistir em, azurina de Pseudomonas aeruginosa de 50-77 resíduos, azurina de Pseudomonas aeruginosa de 50-67 resíduos, azurina de Pseudomonas aeruginosa de 36-88 resíduos ou SEQ ID NOS: 20-24.

Outro aspecto da invenção é uma composição farmacêutica que pode compreender, no mínimo, uma ou duas cupredoxinas ou peptídeos isolados da invenção em um veículo farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode ser formulada para administração intravenosa. Em algumas configurações, a cupredoxina na composição farmacêutica pode ser de um organismo tal como Pseudomonas aeruginosa, Ulva pertussis, Alcaligenes faecalis, Achromobacter xylosoxidan, Bordetella bronchiseptica, Methylomonas sp., Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhea, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis, Xylella fastidiosa e Vibrio parahaemolyticus e, especificamente, de Pseudomonas aeruginosa. A cupredoxina pode ser SEQ ID NOS: 1, 3- 19.

Outro aspecto da invenção são os métodos para tratar um paciente mamífero que compreendem a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica da invenção. O paciente pode ser humano e de um risco maior de desenvolver o câncer comparado à população em geral, podendo ser, em algumas configurações, câncer de melanoma, mama, pâncreas, glioblastoma, astrocitoma, pulmão, colorretal, gargante e cabeça, bexiga, próstata, pele ou cervical. Em algumas configurações, o paciente pode ter, no mínimo, uma característica de alto risco, lesões pré- 2 0 malignas ou ter sido curado de câncer ou lesões pré-malignas.

A composição farmacêutica pode ser administrada por via intravenosa, intramuscular, subcutânea, inalação, tópica, transdérmica, supositório, injeção vítrea ou oral, e, especificamente, por injeção intravenosa. A composição farmacêutica pode ser co- administrada com pelo menos um medicamento quimiopreventivo e, especificamente, no mesmo período que outro medicamento quimiopreventivo.

Outro aspecto da invenção é um kit compreendendo a composição farmacêutica da invenção em um frasco. Esse kit pode ser projetado para administração intravenosa. Outro aspecto da invenção é um método para estudar o desenvolvimento do

câncer que consiste em pôr em contato células de mamífero com uma cupredoxina ou peptídeo da invenção e medir o desenvolvimento de células malignas e pré-malignas. Em algumas configurações, as células podem ser humanas e/ou células de mamíferos. Em outras configurações, as células são induzidas a desenvolver lesões pré-malignas. Outro aspecto da invenção é um vetor de expressão que codifica um peptídeo

da invenção.

Esses e outros aspectos, vantagens e características da invenção serão evidenciados a partir das seguintes figuras e da descrição detalhada das configurações específicas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQÜÊNCIAS

SEQ ID NO: 1. Seqüência de aminoácido da azurina de Pseudomonas aeruginosa.

SEQ ID NO: 2. Seqüência de aminoácido de P28, Resíduos 50-77 de azurina de

Pseudomonas aeruginosa.

SEQ ID NO: 3. Seqüência de aminoácido de plastocianina de Phormidium laminosum. 2 0 SEQ ID NO: 4. Seqüência de aminoácido de rusticianina de Thiobacillus ferrooxidans.

SEQ ID NO: 5. Seqüência de aminoácido de pseudoazurina de Aehromobaeter eyeloelastes.

SEQ ID NO: 6. Seqüência de aminoácido de Alcaligenes faecalis. SEQ ID NO: 7. Seqüência de aminoácido de azurina de Achromobacter xylosoxidans ssp. denitriflcans I.

SEQ ID NO: 8. Seqüência de aminoácido de azurina de Bordetella bronehiseptiea. SEQ ID NO: 9. Seqüência de aminoácido de azurina de Methylomonas sp. J. SEQ ID NO: 10. Seqüência de aminoácido de azurina de Neisseria meningitidis Z2491. SEQ ID NO: 11. Seqüência de aminoácido de azurina de Pseudomonas fluorescen. SEQ ID NO: 12. Seqüência de aminoácido de azurina de Pseudomonas chlororaphis. SEQ ID NO: 13. Seqüência de aminoácido de azurina de Xylella fastidiosa 9a5c. SEQ ID NO: 14. Seqüência de aminoácido de estelacianina de Cucumis sativus. SEQ ID NO: 15. Seqüência de aminoácido de auracianina A de Chloroflexus aurantiacus. SEQ ID NO: 16. Seqüência de aminoácido de auracianina B de Chloroflexus aurantiacus. SEQ ID NO: 17. Seqüência de aminoácido de proteína básica de pepino de Cueumis sativus.

SEQ ID NO: 18. Seqüência de aminoácido de Laz de Neisseria gonorrhea F62. SEQ ID NO: 19. Seqüência de aminoácido de azurina de Vibrio parahaemolyticus.

SEQ ID NO: 20. Seqüência de aminoácido dos aminoácidos 57 a 89 de auracianina B de Chloroflexus aurantiacus.

SEQ ID NO: 21. Seqüência de aminoácido dos aminoácidos 51-77 de azurina de Pseudomonas syringae.

SEQ ID NO: 22. Seqüência de aminoácido dos aminoácidos 89-115 de Laz de Neisseria meningitidis.

SEQ ID NO: 23. Seqüência de aminoácido dos aminoácidos 52-78 de azurina de Vibrio parahaemolyticus. SEQ ID NO: 24. Seqüência de aminoácido dos aminoácidos 51-77 de azurina de Bordetella bronchiseptica.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. A Figura 1 mostra fotografias de todas as glândulas avaliadas pela eficácia de p28 e azurina. A Figura IA mostra uma fotografia representativa de lesões alveolares em uma glândula tratada de DMBA e sua comparação com uma glândula que foi tratada com DMBA junto com um agente quimiopreventivo. As Figuras IB-IG mostram fotografias representativas dos efeitos de p28 sobre o desenvolvimento de lesões alveolares.

Figura 2. A Figura 2 mostra um gráfico que demonstra a eficácia de p28 contra lesões do alvéolo mamário induzidas por DMBA.

Figura 3. A Figura 3 mostra fotografias de seções representativas de lesões ductais e o efeito de p28.

Figura 4. A Figura 4 mostra um gráfico que demonstra a eficácia de p28 contra lesões ductais induzidas por DMB A.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições

Conforme usado neste documento, o termo "célula" inclui tanto o singular como o plural do termo, a menos que especificamente descrito como "célula única".

Conforme usados neste documento, os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados de modo trocável para designar um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos se aplicam a polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos são um análogo químico artificial de um aminoácido de ocorrência natural. Os termos também se aplicam para polímeros de ocorrência natural. Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" também são inclusivos de modificações, incluindo, mas não limitados a, glicosilação, anexação lipídica, sulfatação, gama carboxilação de resíduos de ácido glutâmico, hidroxilação e ADP-ribosilação. Será apreciado que os polipeptídeos não são sempre completamente lineares. Por exemplo, os polipeptídeos podem ser ramificados como resultado de ubiquitinização e podem ser circulares (com ou sem ramificação), geralmente como resultado de eventos pós- translação, incluindo evento de processamento natural e eventos provocados por manipulação humana que não ocorrem naturalmente. Os polipeptídeos circulares, ramificados ou polipeptídeos ramificados circulares podem ser sintetizados por processos naturais não-translação, bem como por métodos totalmente sintéticos.

Conforme usado neste documento, o termo "atividade farmacológica" significa o efeito de um medicamento ou outro sistema químico ou biológico. O efeito da substância química pode ser benéfico (terapêutico) ou nocivo (tóxico). Os produtos químicos puros ou misturas podem ser de origem natural (planta, animal ou mineral) ou por compostos sintéticos.

Conforme usado neste documento, o termo "pré-maligno" significa células pré- cancerígenas ou células anormais que se dividem sem controle. 2 0 Conforme usado neste documento, o termo "lesão" significa a área do tecido

abnominal.

Conforme usado neste documento, o termo "condição patológica" inclui desvios anatômicos e fisiológicos da normalidade que constituem um prejuízo do estado normal do animal vivo ou de uma de suas partes, que interrompe ou modifica o desempenho das funções corporais, e é uma resposta a vários fatores (como má nutrição, riscos industriais ou clima), para agentes infecciosos específicos (como vermes, protozoários parasitas, bactérias ou vírus), para defeitos inerentes do organismo (como anomalias genéticas), ou uma combinação destes fatores.

Conforme usado neste documento, o termo "condição" inclui desvios

anatômicos e fisiológicos da normalidade que constituem um prejuízo do estado normal do animal vivo ou de uma de suas partes, que interrompe ou modifica o desempenho das funções corporais.

Conforme usado neste documento, o termo "sofrendo de" inclui a apresentação de sintomas de uma condição patológica, ter uma condição patológica mesmo sem sintomas observáveis, em recuperação de uma condição patológica, ou recuperado de uma condição patológica.

Conforme usado neste documento, o termo "quimioprevenção" é o uso de medicamentos, vitaminas ou outros agentes para tentar reduzir o risco ou retardar o desenvolvimento ou a recorrência do câncer.

Conforme usado neste documento, o termo "tratamento" inclui prevenir, rebaixar, interromper, ou reverter a progressão ou a gravidade de uma condição ou sintomas associados com uma condição que está sendo tratada. Desta forma, o termo "tratamento" inclui a administração médica, terapêutica e/ou profilática, conforme 2 0 apropriado. O tratamento também pode incluir a prevenção ou redução do desenvolvimento do câncer.

Conforme usado neste documento, o termo "inibe o crescimento celular" significa a redução ou desaparecimento de divisão e/ou expansão celular. Este termo também inclui a inibição do desenvolvimento celular ou aumentos na morte celular. "Quantidade terapeuticamente eficaz" é uma quantidade eficaz de prevenir, retardar, interromper ou reverter o desenvolvimento ou aliviar, total ou parcialmente, os sintomas existentes de uma condição particular para a qual o indivíduo está sendo tratado. A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz está bem dentro da capacidade dos especialistas na técnica.

O termo "substancialmente puro", quando usado para modificar uma proteína ou outro produto celular da invenção, refere-se por exemplo a uma proteína isolada do teor celular ou meio de crescimento, em uma forma substancialmente livre de, ou não adulterada por, outras proteínas e/ou compostos inibidores ativos. O termo "substancialmente puro" refere-se a um fator em uma quantidade de pelo menos cerca de 75% por peso seco, da fração isolada, ou pelo menos "75% substancialmente puro". Mais especificamente, o termo "substancialmente puro" refere-se a um composto de pelo menos cerca de 85%, por peso seco, do composto ativo, ou "85% substancialmente puro". Mais especificamente, o termo "substancialmente puro" refere-se a um composto de pelo menos cerca de 95%, por peso seco, do composto ativo, ou pelo menos "95% substancialmente puro". O termo "substancialmente puro" também pode ser usado para modificar uma proteína ou composto da invenção sinteticamente feito, em que, por exemplo, a proteína sintética é isolada dos reagentes e por subprodutos da(s) reação(ões) sintética(s).

O termo "grade farmacêutica", conforme usado aqui, quando se refere a um 2 0 peptídeo ou composto da invenção, é um peptídeo ou composto que é substancial ou essencialmente isolado de componentes que normalmente acompanham o material do modo como é encontrado em seu estado natural, incluindo a síntese de reagentes e subprodutos, e substancial ou essencialmente isolado de componentes que poderiam afetar o seu uso como produto farmacêutico. Por exemplo, um peptídeo de "grade farmacêutica" pode ser isolado de qualquer carcinoma. Em alguns exemplos, a "grade farmacêutica" pode ser modificada pelo método pretendido de administração, tal como "grade farmacêutica intravenosa", a fim de especificar um peptídeo ou composto que é substancial ou essencialmente isolado de qualquer substância que poderia tornar a composição imprópria para administração intravenosa a um paciente. Por exemplo, um peptídeo de "grade farmacêutica intravenosa" pode ser isolado de detergentes, tais como SDS, e agentes anti- bacterianos, tais como azida.

Os termos "isolado", "purificado" ou "biologicamente puro" referem-se a material que é substancial ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham o material do modo que é encontrado em seu estado nativo. Portanto, os peptídeos isolados de acordo com a invenção preferencialmente não contêm materiais normalmente associados com os peptídeos em seu meio ambiente in situ. Uma região "isolada" refere-se a uma região que não inclui a seqüência completa dos polipeptídeos dos quais a região foi derivada. Um ácido nucléico, proteína, ou fragmento respectivo dos mesmos "isolado" foi substancialmente removido de seu meio ambiente in vivo de tal forma que pode ser manipulado pelos especialistas na técnica, tais como, entre outros, o sequenciamento genético, digestão por restrição, mutagênese sitio-direcionada e sub- clonagem em vetores de expressão para um fragmento de ácido nucléico, bem como a obtenção de proteína ou fragmento de proteína em quantidades substancialmente puras. 2 0 O termo "variante", conforme usado neste documento em relação a um

peptídeo, refere-se a variantes da seqüência de aminoácido que pode ter aminoácidos substituídos, suprimidos ou inseridos, comparativamente ao polipeptídeo do tipo natural. As variantes podem ser truncamentos do peptídeo do tipo natural. "Supressão" é a remoção de um ou mais aminoácidos do polipeptídeo, o qual um "truncamento" é a remoção de um ou mais aminoácidos de uma ou ambas as extremidades do polipeptídeo. Portanto, um peptídeo variante pode ser feito por manipulação dos genes que codificam o polipeptídeo. Uma variante pode ser feita por alteração da composição básica ou características do polipeptídeo, mas pelo menos, não em suas atividades fundamentais. Por exemplo, uma "variante" da azurina pode ser uma azurina mutada que retém sua capacidade para inibir o crescimento de células pré-malignas em mamíferos. Em alguns casos, um peptídeo variante é sintetizado com aminoácidos artificiais, tais como resíduos de ε-(3,5- dinitrobenzoil)-Lis. Ghadiri & Fernholz, J. Am. Chem. Soc., 112:9633-9635 (1990). Em algumas configurações, o variante não tem mais de 20 aminoácidos substituídos, suprimidos ou inseridos, comparativamente ao peptídeo do tipo natural. Em algumas configurações, o variante não tem mais de 15 aminoácidos substituídos, suprimidos ou inseridos, comparativamente ao peptídeo do tipo natural. Em algumas configurações, o variante não tem mais de 10 aminoácidos substituídos, suprimidos ou inseridos, comparativamente ao peptídeo do tipo natural. Em algumas configurações, o variante não tem mais de 6 aminoácidos substituídos, suprimidos ou inseridos, comparativamente ao peptídeo do tipo natural. Em algumas configurações, o variante não tem mais de 5 aminoácidos substituídos, suprimidos ou inseridos, comparativamente ao peptídeo do tipo natural. Em algumas configurações, o variante não tem mais de 3 aminoácidos substituídos, suprimidos ou inseridos, comparativamente ao peptídeo do tipo natural. 2 0 O termo "aminoácido", conforme usado neste documento, significa uma parte

de aminoácido que compreende qualquer resíduo de um aminoácido de ocorrência natural ou de ocorrência artificial ou sintético, isto é, qualquer parte compreendendo pelo menos uma carboxila e pelo menos um resíduo amino diretamente ligado por um, dois, três ou mais átomos de carbono, tipicamente um (a) átomo de carbono. O termo "derivado", conforme usado neste documento em relação a um peptídeo, refere-se a um peptídeo que é derivado do peptídeo sujeito. Uma derivação inclui modificações químicas do peptídeo de tal forma que o peptídeo ainda retenha algumas de suas atividades fundamentais. Por exemplo, um "derivado" da azurina pode ser uma azurina modificada quimicamente que retém sua capacidade de inibir a angiogênese em células de mamíferos. As modificações químicas de interesse incluem, entre outras, a amidação, acetilação, sulfatação, modificação polietileno glicol (PEG), fosforilação ou glicosilação do peptídeo. Além disso, um peptídeo derivado pode ser a fusão de um polipeptídeo ou seu fragmento para um composto químico, tal como outro peptídeo, molécula de droga ou outro agente terapêutico ou farmacêutico ou uma sonda detectável.

O termo "percentagem (%) de identidade de seqüência de aminoácido" é definido como a percentagem de resíduos de aminoácidos em um polipeptídeo que são idênticos aos resíduos de aminoácidos em uma seqüência candidata quando duas seqüências são alinhadas. Para determinar a % de identidade de seqüência, as seqüências são alinhadas e, se necessário, são introduzidos intervalos para obter a % de identidade de seqüência máxima; as substituições conservadoras não são consideradas parte da identidade de seqüência. Os procedimentos do alinhamento da seqüência de aminoácidos para determinar a percentagem de identidade são bem conhecidos pelos especialistas na técnica. Freqüentemente, programas de computadores publicamente disponíveis, tais como 2 0 os programas BLAST, BLAST2, ALIGN2 ou Megalign (DNASTAR) são usados para alinhar as seqüências de peptídeos. Em uma configuração específica, o Blastp (disponível pelo Centro Nacional para Informações de Biotecnologia, Bethesda MD) é usado com base nos parâmetros de default de filtro de longa complexidade, expect 10, word size 3, existence lie extension 1. Quando as seqüências de aminoácidos estão alinhadas, a % de identidade de seqüência de aminoácidos de uma dada seqüência de aminoácidos A para, com, ou em comparação com uma dada seqüência B de aminoácidos (que pode ser redigida alternativamente como uma dada seqüência de aminoácidos A que tem ou compreende uma certa % de identidade de seqüência de aminoácidos para, com ou em comparação com uma dada seqüência de aminoácidos B) pode ser calculada como:

% de identidade de seqüência de aminoácidos = X/Y* 100 em que:

X é o número de resíduos de aminoácidos pontuados como pares idênticos pelo programa de alinhamento de seqüências ou alinhamento do algoritmo de A e B, e

Y é o número total de resíduos de aminoácidos em B. Se a extensão da seqüência de aminoácidos A não for igual à extensão da seqüência de aminoácidos B, a % de identidade de seqüência de aminoácidos de A para B não eqüivalerá a % de identidade de seqüência de aminoácidos de B para A. Comparando seqüências mais longas com seqüências mais curtas, a seqüência mais curta será a seqüência "B", a menos que declarado de outra forma. Por exemplo, comparando peptídeos truncados com os correspondentes peptídeos do tipo natural, o peptídeo truncado será a seqüência "B". 2 0 Geral

A presente invenção fornece composições que compreendem cupredoxina e variantes, derivados e equivalentes estruturais de cupredoxina, e métodos para inibir o crescimento de células de câncer em mamíferos. A invenção também se refere a variantes, derivados e equivalentes estruturais de cupredoxina que conservam a habilidade para prevenir o desenvolvimento ou a recorrência do câncer em mamíferos. Mais particularmente, a invenção fornece composições que compreendem azurina de Pseudomonas aeruginosa, variantes, derivados e equivalentes estruturais de azurina, e seu uso no tratamento de pacientes, e especialmente pacientes com maior risco de desenvolvimento de câncer comparado à população em geral. Finalmente, a invenção fornece métodos para estudo do desenvolvimento de câncer em células, tecidos e animais mamíferos através do contato das células com cupredoxina ou variante, derivado ou equivalente estrutural da mesma, antes ou após induzir lesões pré-malignas e observar o desenvolvimento de células pré-malignas e/ou malignas. Anteriormente, sabia-se que uma proteína redox elaborada por Pseudomonas

aeruginosa, a azurina da cupredoxina, entra seletivamente nas células do câncer de pulmão J774, mas não nas células normais e induz apoptose. Zaborina et al.,Microbiology 146:2521-2530 (2000). A azurina pode também entrar seletivamente nas células UISO- Mel-2 de melanoma humano ou MCF-7 de câncer de mama humano. Yamada et al., PNAS 99:14098-14103 (2002); Punj et al., Oncogene 23:2367-2378 (2004). A azurina de P. aeruginosa entra preferencialmente nas células de sarcoma de retículo murídeo J774, forma um complexo com a proteína p53 supressora de tumor e estabiliza a mesma, aumenta a concentração intracelular de p53 e induz apoptose. Yamada et al., Infection and Immunity 70:7054-7062 (2002). Estudos detalhados de vários domínios da molécula de 2 0 azurina mostraram que os aminoácidos 50-77 (P28) (SEQ ID NO: 2) representavam um domínio de transdução da proteína (PTD) crítico para internalização e subseqüente atividade apoptótica. Yamada et al., Cell. Microbial. 7:1418-31 (2005).

Sabe-se agora que a azurina e peptídeos derivados da azurina, tais como p28, possuem propriedades quimiopreventivas. Sabe-se agora que a azurina e p28 previnem a formação de lesões preneoplásticas pré-malignas na cultura de órgão de glândulas mamárias dos camundongos. Verificou-se em um modelo de cultura de órgão de glândulas mamárias dos camundongos que a azurina em 50 μg/ml inibe em até 67% a formação de lesões alveolares. Da mesma forma, verificou-se que p28 em 25 μg/ml inibe em até 67% a formação de lesões alveolares. Vide Exemplo 1. Além disso, verificou-se que a azurina em 50 μ§/πι1 inibe em até 79% a formação de lesões ductais e p28 em 25 μ g/ml inibe em até 71% a formação de lesões ductais. Vide Exemplo 1. A microscopia confocal e FAC demonstraram que a azurina e p28 entraram em células epiteliais mamárias de murídeos normais (MM3MG) e células de câncer mamário (4T1). P28 também entrou em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) de um modo dependente da temperatura, horário e concentração e inibiu a formação de tubo capilar de HUVEC plaqueado em Matrigel® de um modo dependente da dose. Sabe-se, portanto, que a azurina e suas variantes podem ser usadas para inibir a formação de lesões preneoplásticas pré-malignas e, assim, o desenvolvimento do câncer e especificamente o câncer de mama em pacientes humanos.

Devido ao alto grau de semelhança estrutural entre cupredoxinas, é provável que outras cupredoxinas também inibam a formação de lesões pré-malignas em mamíferos e também a azurina. Essas cupredoxinas podem ser encontradas, por exemplo, em bactérias ou plantas. Sabe-se que várias cupredoxinas tenham atividades farmacocinéticas similares àquelas de azurina de Pseudomonas aeruginosa. Por exemplo, a rusticianina de Thiobacillus ferrooxidans também pode entrar em macrófagos e induzir apoptose. Yamada et al., Cell Cycle 3:1182-1187 (2004); Yamada et al., Cell Micro. 7 :1418-1431 (2005). Plastocianina de Phormidium laminosum e pseudoazurina de Achromobacter cycloclastes também são macrófagos citotóxicos. Patente dos Estados Unidos No. 20060040269, publicada em 23 de fevereiro de 2006. Considera-se que essas outras cupredoxinas possam ser usadas nas composições e métodos da invenção. Além disso, variantes, derivados e equivalentes estruturais de cupredoxinas que conservem a habilidade para inibir a formação de câncer em mamíferos possam também ser usados nas composições e métodos da invenção. Essas variantes e derivados podem incluir truncamentos de uma cupredoxina, substituições conservadoras de aminoácidos e modificações de proteínas, como peguilação e stabling 100% em hidrocarboneto de α-hélices, mas sem se limitarem a estes. Composições da Invenção

A invenção fornece peptídeos que são variantes, derivados ou equivalentes estruturais de cupredoxina que inibem o desenvolvimento de lesões pré-malignas em células, tecidos e animais mamíferos. A invenção fornece ainda peptídeos que são variantes, derivados ou equivalentes estruturais de cupredoxina que inibem o desenvolvimento do câncer em células, tecidos e animais mamíferos. Em algumas configurações, o peptídeo é isolado. Em algumas configurações, o peptídeo é substancialmente puro ou de grau farmacêutico. Em outras configurações, o peptídeo é uma composição que compreende ou consiste essencialmente no peptídeo. Em outra configuração específica, o peptídeo é não-antigênico, e não ativa uma resposta imune em um mamífero, e mais especificamente em um humano. Em algumas configurações, o peptídeo é menos do que uma cupredoxina de comprimento completo, e conserva algumas 2 0 das atividades farmacológicas das cupredoxinas. Especificamente em algumas configurações, o peptídeo conserva a habilidade para inibir o desenvolvimento de lesões pré-malignas na cultura de órgão de glândulas mamárias dos camundongos.

A invenção fornece também composições que compreendem no mínimo um peptídeo que é uma cupredoxina, variante, derivado ou equivalente estrutural de uma cupredoxina, especificamente em uma composição farmacêutica. Em configurações específicas, a composição farmacêutica é projetada para uma forma particular de administração, por exemplo, oral, intraperitoneal ou intravenosa. Essas composições podem ser hidratadas em água, podem ser secas (como através de liofilização) para posterior hidratação. Essas composições podem ser em solventes distintos de água como álcool, não se limitando a este.

Devido à alta homologia estrutural entre as cupredoxinas, supõe-se que as cupredoxinas tenham as mesmas propriedades quimiopreventivas que a azurina e p28. Em algumas configurações, a cupredoxina é, mas não se limita a, azurina, pseudoazurina, plastocianina, rusticianina, auracianina, estelacianina, proteína básica do pepino ou Laz. Particularmente em configurações específicas, a azurina é derivada de Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes faecalis, Achromobacter xylosoxidans ssp. denitrifieans I, Bordetella bronehiseptica, Methylomonas sp., Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhea, Pseudomonas fluoreseens, Pseudomonas chlororaphis, Xylella fastidiosa, Ulva pertussis ou Vibrio parahaemolytieus. Em uma configuração muito específica, a azurina é da Pseudomonas aeruginosa. Em outras configurações específicas, a cupredoxina compreende a seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 1, 3-19.

A invenção fornece peptídeos que são variantes da seqüência de aminoácidos que têm aminoácidos substituídos, excluídos ou inseridos em comparação com a 2 0 cupredoxina de tipo natural. Variantes da invenção podem ser truncamentos da cupredoxina de tipo natural. Em algumas configurações, o peptídeo da invenção compreende uma região da cupredoxina que é menor do que o polipeptídeo de tipo natural de comprimento completo. Em algumas configurações, o peptídeo da invenção compreende mais do que cerca de 10 resíduos, mais do que cerca de 15 resíduos ou mais do que cerca de 20 resíduos de uma cupredoxina truncada. Em algumas configurações, o peptídeo compreende não mais do que aproximadamente 100 resíduos, não mais do que aproximadamente 50 resíduos, não mais do que aproximadamente 40 resíduos, não mais do que aproximadamente 30 resíduos ou não mais do que aproximadamente 20 resíduos de uma cupredoxina truncada. Em algumas configurações, a cupredoxina mantém com o peptídeo, e mais especificamente com a SEQ ID NOS: 1, 3-19, no mínimo cerca de 70% de identidade de seqüência de aminoácido, no mínimo cerca de 80% de identidade de seqüência de aminoácido, no mínimo cerca de 90% de identidade de seqüência de aminoácido, no mínimo cerca de 95% de identidade de seqüência de aminoácido ou no mínimo cerca de 99% de identidade de seqüência de aminoácido.

Em configurações específicas, a variante de cupredoxina compreende os resíduos 50-77 de azurina de P. aeruginosa (p28, SEQ ID NO: 2), os resíduos 50-67 de azurina ou os resíduos 36-88 de azurina. Em outras configurações, a variante de cupredoxina consiste nos resíduos 50-77 de azurina de P. aeruginosa, nos resíduos 50-67 de azurina ou os resíduos 36-88 de azurina. Em outras configurações específicas, a variante consiste nos resíduos equivalentes de uma cupredoxina diferente de azurina. Supõe-se que outras variantes de cupredoxina possam ser projetadas, que tenham uma atividade farmacológica semelhante à dos resíduos 50-77 da azurina, dos resíduos 50-67 da azurina ou dos resíduos 36-88 da azurina. Para fazê-lo, a seqüência de aminoácido da cupredoxina em questão será alinhada à seqüência da azurina de Pseudomonas aeruginosa com o uso de BLAST, BLAST2, ALIGN2 ou Megalign (DNASTAR), os resíduos relevantes serão localizados na seqüência de aminoácido da azurina de P. aeruginosa, os resíduos equivalentes serão encontrados na seqüência da cupredoxina em questão e o peptídeo equivalente será assim projetado. Em uma configuração da invenção, a variante da cupredoxina contém no mínimo os aminoácidos 57 a 89 da auracianina B de Chloroflexus aurantiacus (SEQ ID NO: 20). Em outra configuração da invenção, a variante de cupredoxina contém no mínimo os aminoácidos 51-77 da azurina de Pseudomonas syringae (SEQ ID NO: 21). Em outra configuração da invenção, a variante de cupredoxina contém no mínimo os aminoácidos 89-115 de Laz de Neisseria meningitidis (SEQ ID NO: 22). Em outra configuração da invenção, a variante de cupredoxina contém no mínimo os aminoácidos 52-78 da azurina de Vibrio parahaemolyticus (SEQ ID NO: 23). Em outra configuração da invenção, a variante de cupredoxina contém no mínimo os aminoácidos 51 -77 da azurina de Bordetella bronchiseptica (SEQ ID NO: 24).

As variantes também incluem peptídeos feitos com aminoácidos sintéticos que não ocorrem na natureza. Por exemplo, aminoácidos que não ocorrem na natureza podem ser integrados em variantes de peptídeos para estender ou otimizar a meia-vida da composição na corrente sangüínea. Essas variantes incluem, mas não se limitam a, D,L- peptídeos (diastereômero), {por exemplo, Futaki et al., JBiol. Chem. 276(8):5836-40 (2001); Papo et al, Câncer Res. 64(16):5779-86 (2004); Miller et al., Biochem. Pharmacol. 36(l):169-76 (1987); peptídeos contendo aminoácidos incomuns (por exemplo, Lee et al, J. Pept. Res. 63(2):69-84 (2004)); aminoácido não natural contendo olefina seguido por ligação de hidrocarboneto (por exemplo, Schafmeister et al, J. Am. Chem. Soe. 122:5891-5892 (2000); Walenski et al, Science 305:1466-1470 (2004)) e peptídeos compreendendo resíduos s-(3,5-dinitrobenzoil)-lisina.

Em outras configurações, o peptídeo da invenção é um derivado de uma cupredoxina. Os derivados de cupredoxina são modificações químicas do peptídeo tais que o peptídeo conserva ainda algumas de suas atividades fundamentais. Por exemplo, um "derivado" de azurina pode ser uma azurina modificada quimicamente que conserva sua habilidade para inibir o desenvolvimento de lesões pré-malignas em células, tecidos ou animais mamíferos. As modificações químicas de interesse incluem, mas não se limitam a, ligação de hidrocarboneto, amidação, acetilação, modificação com polietileno glicol (PEG), fosforilação e glicosilação do peptídeo. Além disso, um peptídeo derivado pode ser uma fusão de uma cupredoxina, variante, derivado ou equivalente estrutural da cupredoxina com um composto químico tal como, mas não se limitando a estes, um outro peptídeo, uma molécula de medicamento ou outro agente terapêutico ou farmacêutico ou uma sonda detectável. Derivados de interesse incluem modificações químicas pelas quais a meia-vida dos peptídeos e composições da invenção na corrente sangüínea possa ser estendida ou otimizada, como através de vários métodos bem conhecidos dos especialistas, incluindo, mas não se limitando a, peptídeos circularizados (por exemplo, Monk et al, BioDrugs 19(4):261-78 (2005); DeFreest et al., J. Pept. Res. 63(5):409-19 (2004)), modificações terminais N- e C- (por exemplo, Labrie et al., Clin. Invest. Med. 13(5):275-8 (1990)), e aminoácido não natural contendo olefina seguido por ligação de hidrocarboneto (por exemplo, Shafmeister et al, J. Am. Chem. Soe. 122:5891-5892 (2000); Walenski et al, Science 305:1466-1470 (2004)).

Em outra configuração, o peptídeo é um equivalente estrutural de uma cupredoxina. Exemplos de estudos que determinam homologia estrutural significativa entre 2 0 cupredoxinas e outras proteínas incluem Toth et al. (Developmental Cell 1:82-92 (2001)). Especificamente, homologia estrutural significativa entre uma cupredoxina e o equivalente estrutural é determinada usando o algoritmo VAST. Gibrat et al., Curr Opin Struct Biol 6:377-385 (1996); Madej et al., Proteins 23:356-3690 (1995). Em configurações específicas, o valor ρ de VAST de uma comparação estrutural entre uma cupredoxina e o equivalente estrutural é menor do que cerca de IO"3, menor do que cerca de IO"5 ou menor do que cerca de IO"7. Em outras configurações, homologia estrutural significativa entre uma cupredoxina e o equivalente estrutural é determinada usando o algoritmo DALI. Holm & Sander, J. Mol. Biol. 233:123-138 (1993). Em configurações específicas, a pontuação DALI Z para uma comparação estrutural de emparelhamento é no mínimo cerca de 3,5, no mínimo cerca de 7,0 ou no mínimo cerca de 10,0.

Supõe-se que os peptídeos da composição da invenção possam ser mais do que uma variante, derivado e/ou equivalente estrutural de uma cupredoxina. Por exemplo, os peptídeos podem ser um truncamento da azurina que foi peguilada, assim tornando-se tanto uma variante quanto um derivado. Em uma configuração, os peptídeos da invenção são sintetizados com aminoácidos não naturais α,α-dissubstituídos contendo tethers que suportam olefina, seguidos por uma "ligação" inteiramente de hidrocarboneto, através de metátese de olefina catalisada com rutênio. Scharmeister et al, J. Am. Chem. Soe. 122:5891-5892 (2000); Walenski et al, Science 305:1466-1470 (2004). Além disso, os peptídeos que são equivalentes estruturais de azurina podem ser fundidos com outros peptídeos, produzindo assim um peptídeo que é tanto um equivalente estrutural quanto um derivado. Esses exemplos destinam-se meramente a ilustrar e não a limitar a invenção. Variantes, derivados ou equivalentes estruturais podem ou não ligar-se a cobre.

Em algumas configurações, a cupredoxina ou variante, derivado ou equivalente 2 0 estrutural da mesma tem algumas das atividades farmacológicas da azurina de P. aeruginosa, e especificamente p28. Em uma configuração específica, as cupredoxinas e variantes, derivados e equivalentes estruturais de cupredoxinas podem inibir o desenvolvimento de lesões pré-malignas em células, tecidos ou animais mamíferos e, especificamente, não se limitando a, células de glândulas mamárias. A invenção também fornece as cupredoxinas e variantes, derivados e equivalentes estruturais de cupredoxina que possam ter a habilidade de inibir o desenvolvimento de lesões pré-malignas em mamíferos e, especificamente, mas sem se limitar a, células de câncer de melanoma, mama, pâncreas, glioblastoma, astrocitoma, pulmão, colorretal, garganta e cabeça, bexiga, próstata, pele e cervical. A inibição do desenvolvimento de células de câncer é representada por qualquer redução, ou diminuição da velocidade de aumento, do desenvolvimento de lesões pré-malignas que seja estatisticamente significativa em comparação com os tratamentos de controle.

Devido a atualmente se saber que as cupredoxinas podem inibir o desenvolvimento de lesões pré-malignas e finalmente o câncer em células, tecidos ou animais mamíferos, e especificamente células da mama e, mais especificamente, as células de glândulas mamárias de camundongos, é possível agora projetar variantes e derivados de cupredoxina que conservam essa atividade quimiopreventiva. Essas variantes, derivados e equivalentes estruturais podem ser produzidos, por exemplo, criando-se uma "biblioteca" de várias variantes, derivados e equivalentes estruturais de cupredoxinas e então testando cada uma delas quanto à atividade quimiopreventiva, e especificamente a atividade quimiopreventiva na cultura de órgão de células de glândulas mamárias de camundongos, usando um dos muitos métodos conhecidos na técnica, tais como os métodos do Exemplo 1. Supõe-se que as variantes, derivados e equivalentes estruturais de cupredoxinas 2 0 resultantes com atividade quimiopreventiva possam ser usados nos métodos da invenção em vez da adição à azurina ou p28.

Em algumas configurações específicas, a variante, derivado ou equivalente estrutural da cupredoxina pode inibir o desenvolvimento de lesões pré-malignas induzidas por 7,12-dimetilbenz(o) antraceno (DMBA) em uma cultura de órgão de células de glândulas mamárias de camundongos (MMOC) a um grau estatisticamente diferente do controle sem tratamento. Um peptídeo pode ser testado quanto a essa atividade usando o sistema de modelo MMOC descrito no Exemplo 1 ou em Mehta et al. (J. Natl Câncer Inst 93:1103-1106 (2001)) e Mehta et al. (Meth Cell Sci 19:19-24 (1997)). Outros métodos para determinar se o desenvolvimento do câncer é inibido são bem conhecidos na técnica e também podem ser usados.

Em algumas configurações, a variante, derivado ou equivalente estrutural da cupredoxina inibe o desenvolvimento de lesões do alvéolo mamário (MAL) no modelo de um MMOC em um grau que é estatisticamente diferente de um controle sem tratamento. Em algumas configurações, a variante, derivado ou equivalente estrutural da cupredoxina inibe o desenvolvimento de lesões do duto mamário (MDL) no modelo de um MMOC em um grau que é estatisticamente diferente de um controle sem tratamento. Um peptídeo pode ser testado quanto a essas atividades usando o regime do modelo MMOC induzido para formar lesões pré-malignas por DMB A, conforme descrito no Exemplo 1. A avaliação do desenvolvimento de lesões pré-malignas no regime do modelo de MMOC pode ser determinada por análise morfomética ou análise histopatológica, conforme previsto no Exemplo 1. Cupredoxinas

Essas pequenas proteínas de cor azul cobre (cupredoxinas) são proteínas de transferência de elétrons (10-20 kDa) que participam das correntes de transferência eletrônica bacteriana ou que têm funções desconhecidas. O íon de cobre está unicamente ligado pela matriz protéica. Uma disposição especial planar triangular distorcida a dois ligandos histidina e um ligando cisteína à volta do cobre dá origem a propriedades eletrônicas muito peculiares do sítio do metal e a uma coloração azul intensa. Várias cupredoxinas foram caracterizadas cristalograficamente em resoluções média a alta.

As cupredoxinas em geral possuem uma homologia de baixa seqüência, mas uma alta homologia estrutural. Gough & Clothia, Structure 12:917-925 (2004); De Rienzo et al, Protein Science 9:1439-1454 (2000). Por exemplo, a seqüência de aminoácidos da azurina é 31% idêntica à da auracianina B, 16,3% da rusticianina, 20,3 % da plastocianina e 17,3% da pseudoazurina. Vide Tabela 1. Entretanto, a similaridade estrutural dessas proteínas é mais acentuada. O valor ρ VAST para a comparação da estrutura da azurina com a auracianina B é IO"7'4, da azurina com a rusticianina é 10"5, da azurina com a plastocianina é IO"5 6 e da azurina com a psuedoazurina é IO"4'1.

Todas as cupredoxinas possuem um cilindro beta [beta-barrel] grego com oito cepas ou dobra beta-sandwich e possuem uma arquitetura de sítio altamente conservada. De Rienzo et al., Protein Science 9:1439-1454 (2000). Um importante patch hidrofóbico, devido à presença de vários resíduos alifáticos de cadeia longa, como as metioninas e leucinas, está presente à volta do sítio de cobre nas azurinas, amicianinas, plastocianinas cianobacterianas, proteína básica do pepino e, em menor proporção, nas plastocianinas pseudoazurinas e eucarióticas. Id. Os patches hidrofóbicos também são encontrados em menor proporção nos sítios de cobre estelacianina e rusticianina, mas com diferentes características. Id.

2 0 Tabela 1. Seqüência e alinhamento estrutural da azurina (IJZG) de P. aeruginosa a outras proteínas usando o algoritmo VAST.

Comprimen % aa

RMSD Descrição

PDR_to iflenfida Valnr P2 Classificacã_

IAOZ A 2 82 18,3 10 e-7 12,2 1,9 Ascorbatooxidase

IOHQA 113 31 10e-7,4 12,1 1,9 AuracianinaB

1V54B 1 79 20,3 10e-6,0 11,2 2,1 Citocromocoxidase 1GY2A 92 16,3 10e-5,0 11,1 1,8 Rusticianina

3MSPA 74 8,1 10e-6,7 10,9 2,5 Principal Esperma

Proteina5

5

IIUZ 74

IKGY E 90 IPMY 75

20,3 10e-5,6 10,3 5,6 10e-4,6 10,1 17,3 10e-4,l 9,8

2.3 Plastoeianina

3.4 Efrina b2

2,3 Pseudoazurina

'Comprimento Alinhado: O número de pares equivalentes de átomos C-alfa superposto entre as duas estruturas, isto é, quantos resíduos foram usados para calcular a superposição 3D.

2P-VAL: O valor ρ VAST é uma medida da relevância da comparação, expressa como probabilidade. Por exemplo, se o valor ρ for 0,001, então as proporções são 1000 para 1 de ver uma combinação dessa qualidade por pura sorte. O valor ρ do VAST é ajustado para qs efeitos de múltiplas comparações usando a suposição de haver 500 tipos independentes e não relacionados de domínios na base de dados MMDB. O valor ρ mostrado corresponde assim ao valor ρ da comparação pareada de cada par do domínio dividido por 500.

3Classificação: A classificação de similaridade estrutural VAST. Esse número se refere ao número de elementos estruturais secundários superpostos e a qualidade desta superposição. Maiores classificações VAST se correlacionam com uma maior similaridade.

4RMSD: A superposição do valor quadrático médio residual em Angstroms. Esse número é calculado após a superposição ideal de duas estruturas, como a raiz quadrada das distâncias médias quadráticas entre os átomos equivalentes C-alfa. Notar que o valor RMSD se equilibra com o alcance dos alinhamentos estruturais e que essa dimensão deve " ser levada em consideração ao ser usado o RMSD como descritor de similaridade estrutural geral.

A proteína do esperma principal 5C. elegans provou ser um antagonista da efrina na maturação do oócito. Kuwabara, Genes and Development 17:155-161 (2003).

Azurina

As azurinas são proteínas que contêm cobre de 128 resíduos de aminoácidos que pertencem à família das cupredoxinas envolvidas na transferência de elétrons em plantas e determinadas bactérias. As azurinas incluem as de P. aeruginosa (PA) (SEQ ID NO: 1), A. xylosoxidans e A. denitrificans. Murphy et al., J. Mol. Biol. 315:859-871 (2002). A identidade da seqüência de aminoácidos entre as azurinas varia entre 60-90%, e essas proteínas demonstraram uma forte homologia estrutural. Todas as azurinas têm uma característica de β-sandwich com motivo de letra grega e o átomo simples de cobre é colocado sempre na mesma região da proteína. Além disso, as azurinas possuem um patch hidrofóbico essencialmente neutro à volta do sítio de cobre. Id. Plastocianinas

As plastocianinas são proteínas solúveis de cianobactérias, algas e plantas que contêm uma molécula de cobre por molécula e são azuis em suas formas oxidadas. Ocorrem no cloroplasto, onde operam como portadoras de elétrons. Como a determinação da estrutura da plastocianina poplar em 1978, a estrutura das algas (Scenedesmus, 2 0 Enteromorpha, Chlamydomonas) e de plantas (feijão francês) foi determinada tanto por métodos cristalográficos ou métodos NMR, e a estrutura poplar foi refinada para resolução 1,33 Â. A SEQ ID NO: 3 mostra a seqüência de aminoácidos da plastocianina de Phormidium laminosum, uma cianobactéria termofílica. Apesar da divergência de seqüência entre as plastocianinas de algas e de plantas vasculares (ex., 62% de identidade seqüencial entre Chlamydomonas e proteínas poplares), são conservadas as estruturas tridimensionais (ex., 0,76 Á rms de desvio nas posições C alfa entre a Chlamydomonas e as proteínas Poplar). As características estruturais incluem um sítio de ligação de cobre tetraédrico distorcido em uma extremidade de um cilindro beta antiparalelo de oito cepas, um acentuado patch negativo e uma superfície hidrofóbica plana. O sítio de cobre é otimizado para sua função de transferência de elétrons, e os patches negativos e hidrofóbicos são propostos para envolvimento no reconhecimento de associados em reações fisiológicas. Experimentos de modificação química, de reticulações e de mutagênese direcionada para sítio confirmaram a importância dos patches negativos e hidrofóbicos nas interações de ligação com o citocromo f, e validaram o modelo de dois caminhos de transferência de elétrons funcionalmente significativos envolvendo a plastocianina. Um suposto caminho de transferência de elétrons é relativamente curto (aproximadamente 4 Â) e envolve o ligando de cobre exposto a solvente His-87 no patch hidrofóbico, enquanto o outro é mais extenso (aproximadamente 12-15 Â) e envolve o resíduo quase conservado Tyr-83 no patch negativo. Redinbo et al., J. Bioenerg. Biomembr. 26:49-66 (1994). Rusticianinas

As rusticianinas são polipeptídeos de cadeia simples contendo cobre azul 2 0 obtidas a partir de uma Thiobacillus (agora denominada Acidithiobacillus). Foi determinada a estrutura cristalina em raios-X da forma oxidada da rusticianina cupredoxina estável e altamente oxidante da Thiobacillus ferrooxidans (SEQ ID NO: 4) por difração anômala multicomprimento de ondas e refinada para resolução 1,9Â. As rusticianinas são compostas de uma dobra de núcleo beta-sandwich composta de uma folha b com seis e sete cepas. Como as demais cupredoxinas, o íon de cobre é coordenado por um aglomerado de quatro resíduos conservados (His 85, Cysl38, Hisl43, Metl48) dispostos em um tetraedro distorcido. Walter, R.L. etal.,J. Mol. Biol. 263:730-51 (1996). Pseudoazurinas

As pseudoazurinas são uma família de polipeptídeos de cadeia simples

contendo cobre azul. A seqüência aminoácida da pseudoazurina obtida a partir do Achromobacter cycloclastes está mostrada na SEQ ID NO: 5. A análise estrutural de raios- X da pseudoazurina mostra que possui uma estrutura similar à das azurinas, apesar de haver uma homologia de baixa seqüência entre essas proteínas. Existem duas principais diferenças entre a estrutura geral das pseudoazurinas e das azurinas. Existe uma extensão terminal carboxílico nas pseudoazurinas, relativa às azurinas, que consiste em duas hélices alfa. Na região média do peptídeo, as azurinas contêm um Ioop estendido, reduzido nas pseudoazurinas, que forma um flap contendo uma curta hélice a. As únicas principais diferenças no sítio do átomo de cobre são a conformação da cadeia lateral MET e o comprimento da ligação de cobre Met-S, que é significativamente mais curta na pseudoazurina do que na azurina. Fitocianinas

As proteínas que se identificam como fitocianinas incluem, sem limitação, a proteína básica do pepino, a estelacianina, a mavicianina, a umecianina, uma cupredoxina 2 0 da casca do pepino, uma suposta proteína azul cobre nas vagens de ervilhas e uma proteína cobre azul da Arabidopsis thaliana. Em todas, à exceção da proteína básica do pepino e da proteína da vagem da ervilha, o ligando de metionina axial normalmente encontrado nos sítios de cobre azul é substituído pela glutamina. Auracianina

Foram isoladas três pequenas proteínas azul cobre denominadas auracianina A, auracianina B-I e auracianina B-2 a partir da bactéria fotossintética termofílica verde de deslizamento Chloroflexus aurantiacus. As duas formas B são glicoproteínas e possuem propriedades quase idênticas entre si, mas são distintas da forma A. A eletroforese do gel sódio dodecil sulfato poliacrilamida demonstra massas moleculares monoméricas aparentes como 14 (A), 18 (B-2) e 22 (B-I) kDa.

A seqüência aminoácida da auracianina A foi determinada e mostrou que a auracianina A é um polipeptídeo com 139 resíduos. Van Dreissche et al\. Protein Science 8:947-957 (1999). His58, Cysl23, Hisl28 e Metl32 são espaçadas de maneira a se esperar como se fossem os ligandos metálicos evolucionários conservados como nas conhecidas pequenas proteínas de cobre, plastocianina e azurina. A previsão estrutural secundária também indica que a auracianina tem uma estrutura general de cilindro beta grego similar à da azurina da Pseudomonas aeruginosa e da plastocianina de folhas poplares. Entretanto, a auracianina parece ter características seqüenciais de ambas as classes seqüenciais das pequenas proteínas de cobre. A similaridade geral com uma seqüência de consenso da azurina é aproximadamente a mesma que a da seqüência de consenso da plastocianina, isto é 30,5%. A região da seqüência N-terminal 1-18 da auracianina é notavelmente rica em glicina e aminoácidos hidroxílicos. Id. Vide seqüência aminoácida exemplar SEQ ID NO: para a cadeia A da auracianina da Chloroflexus aurantiacus (NCBI Protein Data Bank Accession No. AAM12874).

A molécula da auracianina B tem uma dobra padrão de cupredoxina. Foi estudada a estrutura cristalina da auracianina B da Chloroflexus aurantiacus. (Bond et al., J. Mol. Biol. 306:47-67 (2001).) À exceção de uma cepa N-terminal adicional, a molécula é muito similar à da cupredoxina bacteriana, a azurina. Como nas outras cupredoxinas, um dos ligandos de Cu se situa na cepa 4 do polipeptídeo, e os outros três se situam ao longo de um grande Ioop entre as cepas 7 e 8. A geometria do sítio Cu é discutida com referência ao espaçamento aminoácido entre os últimos três ligandos. O domínio da ligação Cu caracterizado cristalograficamente da auracianina B é provavelmente limitado ao lado periplásmico da membrana citoplásmica por uma cauda N-terminal que demonstra identidade seqüencial significativa com conhecidas restrições em várias outras proteínas de transferência de elétrons associadas a membranas. As seqüências aminoácidas das formas B estão apresentadas em McManus et al. J. Biol. Chem. 267:6531-6540 (1992). Vide seqüência aminoácida exemplar em SEQ ID NO: 16 para a cadeia B de auracianina do Chloroflexus aurantiacus (NCBI Protein Data Bank Accession No. 1 QHQA). EsteIacianina

As estelacianinas são uma subclasse de fitocianinas, uma família onipresente de cupredoxinas plantas. Uma seqüência exemplar de uma estelacianina está ora incluída como SEQ ID NO: 14. Também é conhecida a estrutura cristalina da umecianina, uma estelacianina de raiz-forte (Koch et al, J. Am. Chem. Soe. 127:158-166 (2005)) e estelacianina de pepino (Hart et al., Protein Science 5:2175-2183 (1996)). A proteína tem uma dobra geral similar às demais fitocianinas. A estrutura terciária do ectodomínio da efrina B2 tem uma similaridade significativa com a estelacianina. Toth et al., 2 0 Developmental Cell 1:83-92 (2001). Uma seqüência aminoácida exemplar de uma estelacianina é encontrada no National Center for Biotechnology Information Protein Data Bank as Accession No. 1JER, SEQ ID NO: 14. Proteína básica do pepino

Uma seqüência aminoácida exemplar de uma proteína básica do pepino está ora incluída como SEQ ID NO: 17. A estrutura cristalina da proteína básica do pepino (CBP), uma proteína cobre azul tipo 1, foi refinada com resolução 1,8 Á. A molécula assemelha-se a outras proteínas cobre azul tendo uma estrutura cilindro de beta grego, exceto pelo cilindro estar aberto de um lado, sendo melhor descrito como "beta-sandwich" ou "beta- taco". Guss et al., J. Mol Biol. 262:686-705 (1996). A estrutura terciária do ectodomínio da proteína efrina B2 tem uma grande similaridade (desvio rms 1,5Â para os carbonos 50 a) com a proteína básica do pepino. Toth et al., Developmental Cell 1:83-92 (2001). O átomo de Cu tem a coordenação NNSS' cobre azul normal com

comprimentos de ligação Cu-N(His39) = 1,93 A, Cu-S(Cys79) = 2,16 A, Cu-N(His84) = 1,95 A, Cu-S(Met89) = 2,61 A. Uma ligação dissulfeto, (Cys52)-S-S-(Cys85), parece desempenhar um importante papel na estabilização da estrutura molecular. A dobra polipeptídeo é típica de uma subfamília de proteínas cobre azul (fitocianinas), assim como para a não metaloproteína, alérgeno da ambrosia americana Ra3, com a qual a CBP tem um alto grau de identidade seqüencial. As proteínas atualmente identificáveis como fitocianinas são CBP, estelacianina, mavicianina, umecianina, uma cupredoxina da casca do pepino, uma suposta proteína de cobre azul em vagens de ervilhas e uma proteína de cobre azul da Arabidopsis thaliana. Em todas, à exceção da CBP e a proteína de vagens de 2 0 ervilhas, o ligando de metionina axial normalmente encontrado nos sítios de cobre azul é substituído pela glutamina. Uma seqüência exemplar da proteína básica do pepino é encontrada em NCBI Protein Data Bank Accession No. 2CBP, SEQ ID NO: 17. Métodos de Uso A invenção fornece métodos para prevenir malignidades de novo em outros pacientes saudáveis, compreendendo a administração ao paciente de pelo menos um peptídeo que é uma cupredoxina ou variante, derivado ou equivalente estrutural da mesma, conforme descrito acima. As terapias quimiopreventivas são baseadas na hipótese de que a interrupção dos processos envolvidos no cancergênese impedirá o desenvolvimento de câncer. Sabe-se agora que a cupredoxina da azurina Pseudomonas aeruginosa e o peptídeo p28 da azurina truncada inibem o desenvolvimento de lesões pré-malignas, seja inibindo a formação inicial de lesões pré-malignas ou exterminando ou inibindo o crescimento de lesões pré-malignas que estão presentes. Contempla-se, portanto, que uma cupredoxina, ou sua variante, derivado ou equivalente estrutural, conforme descrito acima, com a habilidade de inibir o desenvolvimento de lesões pré-malignas pode ser utilizado em terapias quimiopreventivas em outros pacientes saudáveis. Esses outros pacientes saudáveis são, em algumas configurações, pacientes com maior risco de desenvolvimento do câncer comparado à população em geral. Os tipos de câncer que podem ser prevenidos pelo tratamento com as composições da invenção incluem, entre outros, câncer de melanoma, mama, pâncreas, glioblastoma, astrocitoma, pulmão, colorretal, garganta e cabeça, bexiga, próstata, pele e cervical. Em algumas configurações, o paciente pode ser humano. Em outras configurações, o paciente não é humano.

A invenção ainda inclui métodos para o estudo do desenvolvimento do câncer, 2 0 compreendendo o contato com células de mamíferos antes e depois da indução de um carcinógeno com uma composição que compreende cupredoxina ou uma variante, derivado ou seu equivalente estrutural, e observando o desenvolvimento das células. Em algumas configurações, as células são células de glândulas mamárias de camundongos, enquanto em outras são células que podem se tornar malignas nos mamíferos. Os pacientes em maior risco de desenvolvimento de câncer comparado à população em geral podem ser pacientes com maiores características de risco, pacientes com lesões pré-malignas e pacientes que tiverem sido curados de seus cânceres iniciais ou definitivamente tratados de suas lesões pré-malignas. Ver geralmente Tsao et al., CA Câncer J Clin 54:150-180 (2004). As características de maior risco podem ser comportamentais, genéticas, ambientais ou fatores psicológicos do paciente. Os fatores comportamentais que predispõem um paciente a várias formas de câncer incluem, sem limitações, o fumo, dieta, consumo de álcool, terapia de reposição hormonal, maior índice de massa corporal, nuliparidade, uso de noz betei, uso freqüente de enxágües bucais, exposição ao papiloma vírus humano, exposição solar na infância ou crônica, idade precoce no primeiro contato sexual, múltiplos parceiros sexuais e uso de contraceptivos orais. Os fatores genéticos que predispõem um paciente a várias formas de câncer incluem, sem limitações, histórico familiar de câncer, condição de portador genético de BRCAl e BRAC2, histórico anterior de neoplasia de mama, polipose adenomatosa familiar (FAP) câncer colorretal não polipósico hereditário (HNPCC), cabelos vermelhos ou louros e fenótipo de pele, xenoderma pigmentosum e etnicidade. As características ambientais que predispõem um paciente a várias formas de câncer incluem, sem limitações, a exposição ao radônio, a hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, níquel, cromatos, arsênico, amianto, éteres clorometílicos, benzo[a]pireno, radiação e aminas aromáticas de exposição ocupacional à borracha ou à tinta. Outros vários fatores que predispõem um paciente a várias formas de câncer incluem, sem limitações, a doença pulmonar obstrutiva crônica com obstrução de fluxo de ar, infecções crônicas de bexiga, esquistossomíase, idade avançada e condição de imunocomprometimento. Além disso, os pacientes com maior risco de desenvolvimento de câncer podem ser determinados pelo uso de vários modelos de risco que foram desenvolvidos para determinados tipos de câncer. Por exemplo, os pacientes predispostos ao câncer de mama podem ser determinados usando o modelo de risco de Gail, ou o modelo de Claus, entre outros. Ver Gail et al., J Natl Câncer Inst 81:1879-1886 (1989); Cuzick, Breast 12:405-411 (2003); Huang et al., Am J Epidemiol 151:703:714 (2000).

Os pacientes com lesões pré-malignas estão em maior risco para o desenvolvimento de câncer do que a população geral. A presença de lesões pré-malignas em um paciente pode ser determinada por vários métodos bem conhecidos na técnica. Marcadores intermediários ou biomarcadores que se originam das lesões pré-malignas podem ser medidos em um paciente para determinar se o paciente abriga lesões pré- malignas. As anormalidades cromossômicas ocorrem em células de tumor e nos tecidos adjacentes histologicamente normais na maioria dos pacientes de câncer. A progressão das anormalidades cromossômicas está em paralelo com a progressão fenotípica da lesão pré- maligna do câncer invasivo. Thiberville et al., Câncer Res. 55:5133-5139 (1995). Portanto, as anormalidades cromossômicas associadas com o câncer podem ser usadas como marcadores intermediários para a detecção de lesões pré-malignas em um paciente. As anormalidades cromossômicas comuns associadas ao câncer incluem, sem limitações, deleções alélicas ou a perda de heterozogosidade (LOH) nos genes de supressão de 2 0 tumores como o 3p (FHIT e outros), 9p (9p21 para pl6INK4, pl5INK4B e pl94RF) 17p (17pl3 para gene p53 e outros,) e 13q (13ql4 para gene retinoblastoma Rb e outros). As deleções em 3p e 9p estão associadas ao fumo e aos primeiros estágios de câncer pulmonar. Mao et al., J. Natl Câncer Inst. 89:857-862 (1997). As deleções que afetam 3p, 5q, 8p, 17pe 18q são a alteração comum nos cânceres epiteliais. Ver geralmente Tsao et al., CA Clin Câncer J. Clin 54:153 (2004). Outras mutações cromossômicas associadas ao câncer incluem aquelas que ativam oncogêneses. Os oncogenes, cuja presença pode ser usada como marcadores intermediários incluem, sem limitações, Ras, c-myc, fator de crescimento epidérmico, erb-B2 e ciclinas E, Dl e BL Ver geralmente id. em 154.

Outros marcadores intermediários podem ser produtos de genes regulados para

cima nas células pré-malignas e nas células de câncer. Os genes que podem estar regulados para cima nas células pré-malignas incluem, sem limitações, ciclooxigenases COX-I e COX-2, telomerase. Outros biomarcadores de células de câncer e de algumas células pré- malignas incluem, sem limitações, p53, receptor do fator de crescimento epidérmico (GFR), antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA), RAS, COX-2, Ki-67, DNA aneuplóide, DNA-polimerase-α, ER, Uerlneu, E-caderina, RARp, hTERT, pl6INK4a, FHIT (3pl4), Bcl-2, VEGF-R, infecção pelo HPV, LOH9p21, LOH 17p, p-AKT, hnKNP A2/B1, RAF, Myc, c-KIT, ciclina Dl, E e BI, IGF1, bcl-2, p!6, LOH3p21.3, LOU3p25, LOH9p21, LOH 17pl3, LOH73q, LOHSp, hMSH2, APC, DCC, DPC4, JYl8, ΒΑΧ, PSA, GSTPl, NF-kB, AP1, D3S2, infecção HPV, LOH3pl4, LOU4q, LOH5p, antígeno do tumor de bexiga (BTA), BTK TRAK (Alidex, Inc. Redmond WA), proteína da matriz do trato urinário 22, produto de degradação da fibrina, receptor do fator de motilidade autodrine, BCLA-4, citoqueratina 20, ácido hialurônico, CYFRA 21-1, BCA, gonadotropina coriônica beta-humana e antígeno polipeptídeo tissular (TPA). Ver 2 0 geralmente id. em 155-157.

Os pacientes que foram curados de seus cânceres iniciais ou que foram tratados definitivamente de suas lesões pré-malignas também estão em maior risco de desenvolvimento de câncer que a população geral. Um segundo tumor primário se refere a um novo câncer primário em uma pessoa com histórico de câncer. Os segundos tumores primários são a principal causa de mortalidade do câncer de garganta e cabeça. Id. em 150. Um segundo tumor primário é diferente de uma metástase, já que o primeiro se origina de novo enquanto o último se origina de um tumor existente. Os pacientes que foram curados de câncer ou de lesões pré-malignas da mama, cabeça e garganta, pulmão e pele estão particularmente em maior risco de desenvolverem segundos tumores primários.

As composições que compreendem uma cupredoxina ou variante, derivado ou seu equivalente estrutural podem ser administradas ao paciente por várias vias e, em muitos regimes bem conhecidos na técnica. Em configurações específicas, a cupredoxina ou variante, derivado ou seu equivalente estrutural é administrada por via intravenosa, intramuscular, subcutânea, tópica, oral ou por inalação. As composições podem ser administradas ao paciente por qualquer meio que induza os peptídeos ao local no paciente que estiver em risco de desenvolvimento do câncer. Em configurações específicas, a cupredoxina ou variante, derivado ou seu equivalente estrutural é administrada por via intravenosa.

Em uma configuração, os métodos podem compreender a coadministração ao

paciente de uma dose unitária de uma composição que compreende uma cupredoxina ou variante, derivado ou um equivalente estrutural da cupredoxina e uma dose unitária de uma composição que compreende outro medicamente quimiopreventivo, em qualquer ordem, administrado ao mesmo tempo ou em determinado tempo após a administração do outro, 2 0 por exemplo, após um minuto a cerca de 60 minutos após a administração do outro medicamento, ou cerca de 1 hora a cerca de 12 horas após a administração do outro medicamento. Os medicamentos quimiopreventivos de interesse incluem, sem limitações, o tamoxifeno, os inibidores de aromatase como a letrozola e anastrozola (Arimidex®), retinóides como o N-[4-hidroxifenil]retinamida (4-HPR, fenretinida), agentes anti- inflamatórios não esteroidais (AINES) como a aspirina e sulindac, celecoxib (inibidor COX-2)difluoro metil ornitina (DFMO), ácido ursodeoxicólico, inibidores de reductase da coenzima A 3-hidroxi-3- metilglutaril, EKI-785 (inibidor EGFR), bevacizumab (anticorpo do receptor VEGF), cetuximab (anticorpo do EGFR), retinol como a vitamina A, beta caroteno, ácido 13-cis retinóico, isitretionina e palmitato de retinil, alfa-tocoferol, interferon, adenovírus oncolítico dll520 (ONYX-O15), gefitinib, etretinato, finasteride, indole-3-carbinol, resveratrol, ácido clorogênico, raloxifeno e oltipraz.

Composições Farmacêuticas Compreendendo Cupredoxina ou suas Variantes, Derivadas ou Equivalentes Estruturais

Composições farmacêuticas compreendendo cupredoxina, ou suas variantes,

derivadas ou equivalentes estruturais podem ser produzidas em qualquer forma convencional, por exemplo, por mistura, dissolução, granulação, formação de drágea, emulsificação, encapsulamento, entrapeamento ou processos liofilizantes. A cupredoxina substancialmente pura ou de grade farmacêutica, ou suas variantes, derivadas e

equivalentes estruturais podem ser prontamente combinadas com portadores farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica. Os referidos portadores possibilitam que a preparação seja formulada como comprimido, pílula, drágea, cápsula, líquido, gel, xarope, pasta semifluida, suspensão e similares. Portadores ou excipientes apropriados podem também incluir, por exemplo, enchimentos e preparações de celulose.

2 0 Outros excipientes podem incluir, por exemplo, agentes aromatizantes, colorantes, detackificantes, espessantes e outros aditivos aceitáveis, inclusive adjuvantes ou ligantes. Em algumas configurações, a preparação farmacêutica é substancialmente livre de conservantes. Em outras configurações, a preparação farmacêutica pode conter pelo menos um conservante. Metodologias gerais em formas de dosagem farmacêuticas são encontradas em Ansel et al, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Lippencott Williams & Wilkins, Baltimore MD (1999)).

A composição compreendendo a cupredoxina, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais usados na invenção, pode ser administrada em diversas formas, inclusive por injeção (por exemplo, intradérmica, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal e similar), por inalação, administração tópica, supositório, patch transdérmico ou por via oral. Informações gerais sobre os sistemas de liberação de medicamento podem ser encontradas em Ansel et al, Id.. Em algumas configurações, a composição compreendendo a cupredoxina, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais, pode ser formulada e usada diretamente como injetáveis, por injeção intravenosa e subcutânea, entre outras. A formulação injetável, em especial, pode ser vantajosamente utilizada para tratar pacientes que corram o risco ou provavelmente tenham uma condição relacionada com angiogênese inadequada. A composição compreendendo uma cupredoxina, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais, pode também ser tomada por via oral após mistura com agentes protetores como polipropileno glicóis ou agentes de revestimento similares.

Quando a administração for por injeção, a cupredoxina, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais, pode ser formulada em soluções aquosas em tampões 2 0 fisiologicamente compatíveis como solução de Hanks, solução de Ringer, ou salina fisiológica tamponada. A solução pode conter agentes formuladores como os de suspensão, estabilização e/ou dispersão. Alternativamente, a cupredoxina, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais, pode ser em forma de pó para a constituição com um veículo apropriado, por exemplo, água livre de pirógeno estéril, antes do uso. Em algumas configurações, a composição farmacêutica não compreende um adjuvante ou qualquer outra substância adicionada para melhorar a resposta imunológica estimulada pelo peptídeo. Em algumas configurações, a composição farmacêutica compreende uma substância que inibe a resposta imunológica ao peptídeo.

Quando a administração for por fluidos intravenosos, a cupredoxina, ou suas

variantes, derivadas ou equivalentes estruturais podem ser compostos de cristalóides ou colóides. Os cristalóides, tais como aqueles utilizados aqui, são soluções aquosas de sais minerais ou outras moléculas solúveis em água. Os colóides como os aqui utilizados contêm grandes moléculas insolúveis, como a gelatina. Os fluidos intravenosos podem ser estéreis.

Os fluidos cristalóides que podem ser usados por administração intravenosa incluem, mas não se limitam à salina normal (uma solução de cloreto de sódio a uma concentração de 0,9%), solução ou lactato de Ringer e a solução aquosa de dextrose a 5%, às vezes chamada de D5W, conforme descrito na Tabela 2. Tabela 2. Composição das soluções cristalóides comuns

Solução Outro Nome [Na+] [Cl] [Glicose] D5W Dextrose a 5% 0 0 252 2/3 e 1/3 Dextrose a 3,3% 51 51 168 / salina a 0,3% Salina NaCl a 0,45% 77 77 0 seminormal Salina normal NaCl a 0,9% 154 154 0 Lactato de Solução de 130 109 0 Ringer* Ringer

* Lactato de Ringer também possui 28 mmol/L de lactato, 4 mmol/L de K+ e 3 mmol/L de Cal+.

Quando a administração for por inalação, a cupredoxina, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais, pode ser liberada em forma de spray de aerossol de volumes pressurizados ou um nebulizador com o uso de propulsor apropriado, por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, dióxido de carbono ou outro gás apropriado. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada fornecendo uma válvula para liberar a quantidade medida. As cápsulas e cartuchos de, por exemplo, gelatina, para uso em um inalador ou insuflador podem ser formuladas contendo a mistura em pó de proteínas e uma base em pó apropriada, como a lactose ou amido.

Quando a administração for tópica, a cupredoxina, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais, pode ser formulada como soluções, géis, ungüentos, cremes, gelatinas, suspensões e similares, como são bem conhecidos na técnica. Em algumas configurações, a administração é feita por meio de patch transdérmico. Quando a administração for por supositório (por exemplo, via retal ou vaginal), a cupredoxina, ou suas variantes, derivadas e equivalentes estruturais, também pode ser formulada em composições contendo bases convencionais de supositório.

Quando a administração for por via oral, a cupredoxina, ou suas variantes, 2 O derivadas ou equivalentes estruturais, pode ser facilmente formulada pela combinação da cupredoxina, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais com portadores farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica. Pode ser empregado um portador sólido, como manitol, lactose, estearato de magnésio e similares; os referidos portadores permitem que a cupredoxina, e suas variantes, derivadas e equivalentes estruturais, seja formulada como comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas semifluidas, suspensões e similares, por ingestão oral pelo paciente a ser tratado. Para formulações orais sólidas como, por exemplo, pós, cápsulas e comprimidos, excipientes apropriados incluem enchimentos como açúcares, preparação de celulose, agentes

granulantes e ligantes.

Outros portadores convenientes, como bem conhecidos na técnica, também incluem portadores polivalentes, polissacarídeos capsulares bacterianos, um dextran ou um vetor geneticamente construído. Além disso, as formulações de liberação prolongada que incluem a cupredoxina, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais permitem a liberação da cupredoxina, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais por longo tempo, tal que sem as formulações de liberação prolongada, a cupredoxina, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais seria eliminada do sistema do paciente e/ou degradada, por exemplo, por proteases e hidrólises simples, antes de produzir ou melhorar um efeito terapêutico.

A meia-vida na corrente sangüínea dos peptídeos da invenção pode ser aumentada ou otimizada por diversos métodos bem conhecidos pelos especialistas na técnica. As variantes de peptídeos da invenção podem incluir, entre outras, diversas variantes que podem aumentar sua estabilidade, atividade específica, longevidade na 2 0 corrente sangüínea e/ou diminuir a imunogenicidade da cupredoxina, mantendo a capacidade do peptídeo de inibir o desenvolvimento de lesões pré-malignas em células, tecidos e animais mamíferos. Essas variantes incluem, mas não se limitam àquelas que reduzem a hidrólise do peptídeo, reduzem a diamidação do peptídeo, reduzem a oxidação, reduzem a imunogenicidade, aumentam a estabilidade estrutural do peptídeo ou aumentam o tamanho do peptídeo. Esses peptídeos também incluem peptídeos circularizados (Monk et al, BioDrugs 19(4):261-78, (2005); DeFreest et al., J. Pept. Res. 63(5):409-19 (2004)), D,L-peptídeos (diastereômero), (Futaki et al, J. Biol. Chem. Feb 23;276(8):5836-40 (2001); Papo et al, Câncer Res. 64(16):5779-86 (2004); Miller et al, Biochem. Pharmacol.

36(1): 169-76, (1987)); peptídeos contendo aminoácidos incomuns (Lee et al, J. Pept. Res. 63(2):69-84 (2004)), modificações de terminais NeC (Labrie et al, Clin. Invest. Med. 13(5):275-8, (1990)), encadeamento de hidrocarbonetos (Schafmeister et al, J. Am. Chem. Soe. 122:5891-5892 (2000); Walenski et al, Science 305:1466-1470 (2004)) e peguilação.

Em várias configurações, a composição farmacêutica inclui portadores e excipientes (incluindo, mas não se limitando a tampões, carboidratos, manitol, proteínas, polipeptídeos ou aminoácidos como glicina, antioxidantes, bacteriostatos, agentes quelantes, agentes de suspensão, espessantes e/ou conservantes), água, óleos, soluções salinas, soluções aquosas de dextrose e glicerol, outras substâncias farmaceuticamente aceitáveis, conforme requerido para aproximar as condições fisiológicas, como agentes de tamponamento, de ajuste de tonicidade, umectantes e similares. Reconhece-se que, embora nenhum portador conhecido pelos especialistas na técnica possa ser empregado para administrar as composições desta invenção, o tipo de portador dependerá do modo de administração. Os compostos podem ser encapsulados com lipossomas usando uma tecnologia bem conhecida. Microesferas biodegradáveis também podem ser empregadas 2 0 como portadores para composições farmacêuticas desta invenção. Microesferas biodegradáveis apropriadas foram reveladas, por exemplo, nas Patentes norte-americanas N2 4.897.268, 5.075.109, 5.928.647, 5.811.128, 5.820.883, 5.853.763, 5.814.344 e 5.942.252. As composições farmacêuticas podem ser esterilizadas por conhecidas técnicas convencionais ou por filtração estéril. As soluções aquosas resultantes podem ser embaladas para uso como tais ou liofilizadas, sendo a preparação IiofIlizada combinada com uma solução estéril antes da administração.

Administração de Cupredoxina, ou suas Variantes, Derivadas e Equivalentes Estruturais

A cupredoxina, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais podem ser administrados formulados como composições farmacêuticas e administrados por quaisquer vias apropriadas, por exemplo, por via oral, bucal, inalação, sublingual, retal, vaginal, trans-uretral, nasal, tópico, percutâneo, ou seja, transdérmico ou parenteral (incluindo administração intravenosa, intramuscular, subcutânea e intracoronária). As suas formulações farmacêuticas podem ser administradas em qualquer quantidade eficaz para atingir seu propósito pretendido. Mais especificamente, a composição é administrada em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Em configurações específicas, a quantidade terapeuticamente eficaz é geralmente cerca de 0,01 a 20 mg/dia/kg de peso corporal.

Os compostos compreendendo a cupredoxina, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais são úteis para a prevenção do câncer, isoladamente ou em combinação com outros agentes ativos. A dosagem apropriada, naturalmente, variará de acordo com, por exemplo, o composto da cupredoxina, ou suas variantes, derivadas ou 2 0 equivalentes estruturais empregadas, do hospedeiro, do modo de administração e da natureza e gravidade do potencial câncer. Entretanto, em geral, resultados satisfatórios em humanos são obtidos em doses diárias de aproximadamente 0,01 a 20 mg/kg de peso corporal. Uma dosagem diária em humanos indicada varia de aproximadamente 0,7 mg a 1400 mg do composto da cupredoxina, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais convenientemente administrada, por exemplo, em doses diárias, doses semanais, doses mensais e/ou dosagem contínua. Doses diárias podem ser discretas de 1 a 12 vezes por dia. Alternativamente, as doses podem ser administradas a cada dois dias, a cada 3 dias, a cada 4 dias, a cada 5 dias, a cada seis dias, a cada semana e similarmente em incrementos diários de áté 31 dias ou mais. Alternativamente, a dosagem poderá ser contínua pelo uso de patches, administração I.V. e similares.

A exata formulação, via de administração e dosagem são determinadas pelo médico atendente tendo em vista a condição do paciente. A quantidade da dose e o intervalo podem ser ajustados individualmente para obter os níveis plasmáticos da cupredoxina ativa, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais que sejam suficientes para manter o efeito terapêutico. Geralmente, a cupredoxina desejada, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais, é administrada em uma mistura com um portador farmacêutico selecionado considerando a via pretendida de administração e prática farmacêutica padrão. Em um aspecto, a cupredoxina ou suas variantes, derivadas ou equivalentes

estruturais é liberado como DNA tal que o polipeptídeo é gerado in situ. Em uma configuração, o DNA é "despido", conforme descrito, por exemplo, em Ulmer et al, (Science 259:1745-1749 (1993)) e revisado por Cohen (Science 259:1691-1692 (1993)). A absorção do DNA despido pode ser aumentada revestindo o DNA em um portador, por 2 0 exemplo, esferas biodegradáveis, que são eficientemente conduzidas nas células. Nos referidos métodos, o DNA pode ser apresentado dentro de qualquer um dos diversos sistemas de liberação conhecidos pelos especialistas na técnica, incluindo sistemas de expressão de ácido nucléico, viral e bacteriana. As técnicas de incorporação de DNA nesses sistemas de expressão são conhecidas pelos especialistas na técnica. Vide, por exemplo, W090/11092, W093/24640, WO 93/17706 e Patente norte-americana N2 5.736.524.

Vetores usados para movimentar material genético de organismo para organismo podem ser divididos em duas classes gerais: vetores de clonagem são fagos ou plasmídeo de replicação com regiões que são essenciais para a propagação em uma célula hospedeira apropriada e no qual o DNA estranho pode ser inserido; o DNA estranho é replicado e propagado como se fosse um componente de um vetor. Um vetor de expressão (como plasmídeo, levedura, ou genoma de vírus de animal) é usado para introduzir material genético estranho em uma célula ou tecido hospedeiro a fim de transcrever e traduzir o DNA estranho, como o DNA da cupredoxina. Em vetores de expressão, o DNA introduzido é operacionalmente ligado aos elementos como promotores que sinalizam à célula hospedeira para alta transcrição do DNA inserido. Alguns promotores são excepcionalmente úteis, como os promotores induzíveis que controlam a transcrição genética em resposta a fatores específicos. Ligando, de forma operável, a cupredoxina e variantes, derivadas ou equivalentes estruturais de seus polinucleotídeos a um promotor induzível, a expressão da cupredoxina e variantes seus derivativos pode ser controlada em resposta a fatores específicos. Exemplos de promotores clássicos induzíveis incluem as que respondem à α-interferona, choque a quente, íons metálicos pesados e esteróides como os glucocorticóides (Kaufman, Methods Enzymol. 185:487-511 (1990)) e tetraciclina. Outros 2 0 promotores induzíveis desejáveis incluem os que não são endógenos às células, nas quais o constructo está sendo introduzido, mas são responsivos nas células em que o agente de indução é exogenamente fornecido. Em geral, vetores de expressão úteis geralmente são os plasmídeos. Entretanto, são contempladas outras formas de vetor de expressão, como os vetores virais (por exemplo, retrovirose de replicação imperfeita, adenovirose e viroses adeno-associadas).

A escolha do vetor é determinada pelo organismo ou células que estão sendo usadas e o destino desejado do vetor. Em geral, os vetores compreendem seqüências de sinais, origens de replicação, genes do marcador, sítios de polylinker, elementos estimuladores, promotores e seqüências de terminação da transcrição. Kits compreendendo Cupredoxina, ou suas Variantes, Derivadas ou Equivalentes Estruturais

Em um aspecto, a invenção fornece kits contendo um ou mais dos seguintes em uma embalagem ou recipiente: (1) uma composição biologicamente ativa compreendendo uma cupredoxina, ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais; (2) uma droga quimiopreventiva, (3) aparelho para administrar a composição biologicamente ativa ao paciente como, por exemplo, seringa, nebulizador etc.

Quando um kit é fornecido, os diferentes componentes da composição podem ser embalados em recipientes separados e imediatamente misturados antes do uso. A referida embalagem de componentes separados pode permitir armazenamento em longo prazo sem perder as funções do princípio ativo.

Os reagentes inclusos nos kits podem ser fornecidos em recipientes de qualquer tipo desde que a vida dos diferentes componentes seja preservada e não seja absorvida ou 2 0 alterada pelos materiais do recipiente. Por exemplo, ampolas de vidro vedadas podem conter cupredoxina e suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais liofilizadas ou tampões que tenham sido embalados por meio de gás não reativo, neutro, como nitrogênio. As ampolas podem consistir de qualquer material apropriado, como vidro, polímeros orgânicos, como policarbonato, polistireno, etc., cerâmica, metal ou qualquer outro material tipicamente empregado para manter os reagentes similares. Outros exemplos de recipientes apropriados incluem frascos simples que podem ser fabricados de substâncias similares às da ampola e invólucros, cujos interiores podem ser metalicamente revestidos com, por exemplo, alumínio ou uma liga. Outros recipientes incluem tubos de teste, frascos, flaconetes, garrafas, seringas ou similares. Os recipientes podem ter uma entrada de acesso estéril, como um frasco com tampa que pode ser perfurada por agulha de injeção hipodérmica. Outros recipientes podem ter dois compartimentos separados por uma membrana facilmente removível, que mediante sua remoção permite que os componentes sejam misturados. As membranas removíveis pode ser de vidro, plástico, borracha etc. Os kits também podem ser fornecidos com materiais de instrução. As instruções

podem ser impressas em papel ou em outra base, e/ou pode ser fornecido em meio eletrônico, como disco flexível, CD-ROM, DVD-ROM, Zip, videotape, audiotape, dispositivo de memória flash, etc. Instruções detalhadas podem não estar fisicamente associadas ao kit, em vez disso, o usuário pode ser encaminhado a uma página da internet especificado pelo fabricante ou distribuidor do kit ou fornecido por correio eletrônico.

Modificação de Cupredoxina e suas Variantes, Derivadas e Equivalentes Estruturais

A cupredoxina ou suas variantes, derivadas ou equivalentes estruturais podem ser quimicamente modificadas ou geneticamente alteradas para produzir variantes e derivadas, conforme acima exposto. As referidas variantes e derivadas podem ser 2 0 sintetizadas por técnicas padrão.

Além das variantes alélicas de ocorrência natural da cupredoxina, alterações podem ser introduzidas por mutação nas seqüências de código da cupredoxina, que incorrem em alterações nas seqüências do aminoácido da cupredoxina codificada, que não altera significativamente a habilidade da cupredoxina de inibir a angiogênese. Um resíduo de aminoácido "não essencial" é aquele que pode ser alterado a partir das seqüências do tipo natural da cupredoxina sem alterar a atividade biológica, sendo que o resíduo "essencial" do aminoácido é necessário para a referida atividade biológica. Por exemplo, os resíduos de aminoácidos que são conservados entre as cupredoxinas são esperados que sejam particularmente pouco sensíveis à alteração, portanto, "essencial".

São bem conhecidos na técnica aminoácidos, para os quais podem ser feitas substituições conservadoras sem alterar a atividade do polipeptídeo. Substituições conservadoras úteis são mostradas na Tabela 3, "Substituições preferidas." Substituições conservadoras por meio dos quais um aminoácido de uma classe é substituído por um outro aminoácido do mesmo tipo fazem parte do escopo da invenção, uma vez que a substituição não altera significativamente a atividade biológica do composto.

Tabela 3. Substituições preferidas

Resíduo original Exemplos de substituição Substituições

preferidas

Ala (A) Vai, Leu, Ile Val Arg (R) Lys, Gln, Asn Lys Asn (N) Gln, His, Lys, Arg Gln Asp (D) Glu Glu Cys (C) Ser Ser Gln (Q) Asn Asn Glu (E) Asp Asp Gly (G) Pro, Ala Ala His (H) Asn, Gln, Lys, Arg Arg Ile (I) Leu, Vai, Met, Ala, Phe, Norleucina Leu Leu (L) Norleucina, lie, Vai, Met, Ala, Phe Ile Lys (K) Arg, Gln, Asn Arg Met (M) Leu, Phe, Ile Leu Phe (F) Leu, Vai, lie, Ala, Tyr Leu Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr(T) Ser Ser Trp (W) Tyr, Phe Tyr Tyr (Y) Trp, Phe, Thr, Ser, Phe Val (V) lie, Leu, Met, Phe, Ala, Norleucina Leu Substituições não conservadoras que afetam (1) a estrutura do suporte principal

do polipeptídeo, como a conformação β-folha ou a-hélice, (2) a carga, (3) hidrofobicidade ou (4) o volume da cadeia lateral do sítio alvo podem modificar a função do fator citotóxico. Os resíduos são divididos em grupos baseados nas propriedades da cadeia lateral, conforme mostrado na Tabela 4. As substituições não conservadoras acarretam na troca de um membro de uma dessas classes para outra classe. As substituições podem ser introduzidas nos sítios de substituição conservadoras ou mais especificamente nos sítios não conservados.

Tabela 4. Classes de aminoácido

Classe Aminoácidos

Hidrofóbica Hidrofílica neutra

Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, Ile Cys, Ser, Thr Acídica

Asp, Glu

Básica

Asn, Gln, His, Lys5 Arg

Conformação de cadeia rompida

Gly, Pro

Aromática

Trp5 Tyr, Phe

Os polipeptídeos variantes podem ser feitos usando métodos conhecidos na técnica como mutagênese mediada por oligonucleotídeo (sítio dirigida), escaneamento de alanina, e mutagênese de PCR. A mutagênese sítio dirigida (Carter, Biochem J. 237:1-7 (1986); Zoller e Smith, Methods Enzymol. 154:329-350 (1987)), cassete mutagênese, mutagênese de seleção restrita (Wells et al, Gene 34:315-323 (1985)) ou outras técnicas conhecidas podem ser realizadas no DNA clonado para produzir o DNA variante da cupredoxina.

Mutações conhecidas de cupredoxinas também podem ser usadas para criar uma cupredoxina variante a fim de que esta seja usada nos métodos da invenção. Por exemplo, os mutantes C112D e M44KM64E da azurina são conhecidos por apresentarem citotóxicos e crescimentos que impedem a atividade que seja diferente da azurina nativa e a referida atividade alterada pode ser útil nos métodos de tratamentos da presente invenção.

Uma compreensão mais completa da presente invenção pode ser obtida por referência aos Exemplos específicos apresentados a seguir. Os exemplos são descritos apenas para fins de ilustração e não pretendem limitar o escopo da invenção. Mudanças na forma e substituição por equivalentes são contempladas de acordo com as oportunidades surgidas ou recursos disponíveis. Embora termos específicos tenham sido aqui empregados, sua intenção é o sentido descritivo e não limitativo. Modificações e variações da invenção conforme estabelecidas anteriormente podem ser feitas sem sair do seu

espírito e escopo.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Efeito do peptídeo P-28 nas lesões mamárias induzidas por DMBA no modelo MMOC

O modelo da cultura de órgão da glândula mamária do camundongo (MMOC) permite a avaliação da eficácia dos agentes potencialmente quimiopreventivos contra o desenvolvimento de lesões alveolares mamárias (MAL)ou de lesões ductais mamárias (MDL) em resposta ao DMBA. O DMBA em condições adequadas de incubação forma o MAL ou MDL com base no ambiente hormonal do meio. Hawthorne et al., Pharmaceutical Biology 40:70-74 (2002): Metha et al.,J. Natl. Câncer Inst. 93:1103-1106 (2001). As glândulas tratadas com estrogênio ou progesterona em cultura desenvolvem lesões ductais, considerando que as glândulas tratadas com aldosterona e hidrocortisona formam lesões alveolares independentes de estrogênio e de progesterona. As glândulas mamárias não expostas a um agentes carcinogeno ou quimiopreventivo passam por regressão estrutural na ausência de hormônios promotores de crescimento, considerando que o tratamento com DMBA pelo período de 24 horas entre os dias 3 e 4 evita a regressão das estruturas provocada pela falta de hormônios. Supõe-se que isto se deve ao fato que as glândulas perderam a responsividade hormonal normal e agora alteraram o curso de 2 0 desenvolvimento. A geração de adenocarcinomas mamários pelo transplante de células transformadas em camundongos sinérgicos provou a natureza pré-neoplásica pré-maligna das áreas não reprimidas.

O par torácico de glândulas mamárias foi retirado de forma asséptica de cada camundongo Balb/c, sendo as glândulas divididas em vários grupos. Os efeitos do p28 foram avaliados em 4 diferentes diluições no meio. As glândulas tratadas com carcinogenio sem o agente de teste serviram de medida para a determinação da incidência porcentual na ausência de um agente quimiopreventivo. Foi incluído um outro controle para servir como controle positivo para a quimioprevenção. A azurina foi incluída no meio em concentração de 5(^g/ml. Para lesões alveolares (MAL) glândulas manchadas foram avaliadas sobre a incidência de lesões (glândulas contendo qualquer lesão quando comparadas ao número total de glândulas em um determinado grupo de tratamento). Para as lesões ductais (MDL) foi adaptado protocolo similar; entretanto, como indicado abaixo na seção de métodos, a combinação hormonal é diferente nas lesões alveolares e ductais. As glândulas foram fixadas em formalina e então processadas para histopatologia. As seções foram manchadas com eosina e hematoxeleno, sendo avaliadas ao microscópio. Aqui, foi comparada a multiplicidade de lesões ductais entre os grupos de controle e de tratamento.

Procedimento de Cultura de Órgão. Os animais experimentais usados nos estudos eram camundongos fêmeas BALB/c, virgens e jovens, com idades entre 3 e 4 semanas, adquiridos de Charles River, Wilmington, MA. Os camundongos foram tratados diariamente com injeções subcutâneas de ^g de estradiol-17p + 1 mg de progesterona por 9 dias. Este tratamento é um pré-requisito, já que os animais não tratados com esteróides não respondem aos hormônios in vitro. Todo o procedimento da cultura é descrito em detalhes. Jang et al. Science 275:218-220 (1997); Mehta, Eu. J. Câncer 36:1275-1282 (2000); Mehta et al., J. Natl. Câncer Inst. 89:212-219 (1997); Mehta et al., J. Natl. Câncer

Inst. 93:1103-1106 (2001).

Em breve, os animais foram mortos por deslocamento cervical, e o par torácico de glândulas mamárias foi dissecado em seda e incubados por 10 dias em meio Waymouth ΜΒ752/1 isento de soro (5 glândulas/5 ml/prato). O meio foi suplementado com glutamina, antibióticos (penicilina e estreptomicina em meio de 100 unidades/ml) e hormônios promotores de crescimento, 5μΒ de insulina (I), 5μ§ de prolactina (P), ^g de aldosterona (A) e ^g de hidrocortisona (H) por ml de meio do protocolo, para induzir as lesões mamárias alveolares (MAL). Para a indução das lesões ductais (MDL), o meio conteve 5μ^πι1, 5μg/ml Ρ, 0,001 μ^πιΐ de estradiol 17β Q ^g/ml de progesterona (Pg). Mehta et al., J. Natl. Câncer Inst. 93:1103-1106 (2001). Foi adicionado o carcinogênio, DMBA ^g/ml) entre os dias 3 e 4. Para o estudo atual, o DMBA foi dissolvido em DMSO em uma concentração final de 4mg/ml e 50μg I foram adicionados a 100 ml do meio, resultando em concentrações finais de 2\ig!m\. Os pratos de controle continham

DMSO como veículo.

No dia 4, o DMBA foi removido do meio, enxaguando as glândulas em meio fresco e transferindo-as para novos pratos contendo meio fresco sem DMB A. Após 10 dias de incubação, as glândulas foram conservadas por mais 14 dias no meio contendo somente I ^g/ml). Durante todo o período da cultura, as glândulas foram conservadas a 37°C sob ambiente de 95% de O2 e 5% de CO2. O agente quimiopreventivo foi incluído no meio durante os primeiros dez dias da fase de promoção de crescimento. O peptídeo de teste p28 foi avaliado em 4 concentrações, que variaram de 12^g/ml a 100 μg/ml. A azurina foi avaliada em 50μg/ml no meio. O peptídeo foi dissolvido em água estéril e filtrado antes do 2 0 uso. O meio foi trocado três vezes por semana (segunda-feira, quarta-feira e sexta-feira). No final da exposição, as glândulas foram fixadas em formalina.

Os resultados foram analisados pela análise de qui-quadrado e pelo Teste Exato

de Fisher. Análise Morfomética de MAL. Para o exame de MAL, as glândulas foram manchadas em alume-carmine e avaliada a presença de lesões. As glândulas foram classificadas quanto à presença ou à ausência de lesões mamárias, severidade das lesões por glândula e toxicidade do agente. Foram avaliadas as glândulas armazenadas em xileno quanto à presença ou à ausência, incidência e severidade de lesões mamárias em cada glândula sob um microscópio de dissecação. As glândulas foram classificadas como positivas ou negativas para lesões mamárias, e a incidência porcentual foi determinada como uma razão das glândulas que demonstraram lesões e o número total de glândulas naquele grupo. A dilatação dos dutos ou a desintegração da estrutura mamária devido ao tratamento com o agente quimiopreventivo foi considerado como efeito tóxico. Os dados foram submetidos à análise estatística quanto à incidência para determinar a efetividade dos agentes quimiopreventivos potenciais.

A Figura IA mostra uma fotografia representativa das lesões alveolares em uma glândula tratada com DMBA e sua comparação com uma glândula que foi tratada com DMBA e um agente quimiopreventivo. Os efeitos do p28 no desenvolvimento da lesão alveolar estão mostrados nas Figuras 1B-1G e resumidos na Figura 2. O peptídeo p28 inibiu a formação MAL em 67% na concentração de 25μg/ml. Aumentar a concentração até 100^ig/ml não ampliou a eficácia do peptídeo. A comparação do peptídeo com a azurina indicou que o p28 foi efetivo como a azurina no desenvolvimento MAL. A azurina 2 0 em concentração de 5(^g/ml resultou em uma inibição de 67%. As análises estatísticas indicaram que o efeito do p28 foi estatisticamente significativa quando comparada com o controle DMBA em concentrações maiores que 12^g/ml (p<0,01, Teste Exato de Fisher; análise qui-quadrado). Avaliação Histopatológica do MDL. No MDL, as glândulas foram processadas para avaliações histopatológicas. As glândulas foram seccionadas longitudinalmente em seções de 5 microns e manchadas com hematoxilina eosina. A seção longitudinal de cada glândula foi dividida em vários campos, sendo cada campo avaliado com relação a lesões ductais.

Mehta et al.,J. Natl. Câncer Inst. 93:1103-1106 (2001). Em breve, toda a glândula é avaliada no microscópio; glândulas menores têm menos campos totais quando comparadas a glândulas maiores. Assim, cada glândula terá um número variável de campos. Em geral, o número de seções pelos dutos também varia muito de glândula a glândula. Isto resulta em um número variável de grupo a grupo. Foram determinados os campos contendo hiperplasias ou atipias ductais e comparados com o número total de campos avaliados em cada glândula. Não é feita discriminação entre a hiperplasia ou a atipia e entre glândulas severamente ocluídas. Qualquer campo que contiver qualquer um desses padrões histológicos foi considerado como positivo para a lesão. Os grupos de tratamento foram comparados com os controles com relação à severidade, sendo calculada a inibição porcentual.

A Figura 3 mostra uma lesão ductal representativa. O DMBA induz lesões ductais que variam da hiperplasia, atipia até a oclusão completa dos dutos. Foi determinada uma razão das lesões ductais/número totais de seções ductais. Novamente, a concentração de 12^g/ml de p28 suprimiu somente 15% da formação MDL. Entretanto, em 25μg/ml 2 0 houve uma significativa inibição das lesões comparável à observada com 50μg/ml de azurina. A eficácia do p28 em concentrações maiores que 12^g/ml foi estatisticamente significativa (p<0,01, Teste Exato de Fisher). Esses resultados estão resumidos na Figura 4. Em geral, os efeitos dos agentes quimiopreventivos podem ser diferenciados entre MAL e MDL. Por exemplo, o tamoxifeno inibiu o desenvolvimento do MDL, mas não do MAL. E interessante notar que a azurina e o p28 inibiram tanto as lesões ductais dependentes de estrogênio como as dependentes de progesterona, assim como as lesões alveolares independentes.

Este exemplo indica que tanto o p28 como a azurina podem evitar o desenvolvimento de lesões pré-cancerosas no tecido mamário. Assim, o p28 e a azurina podem ser usados como agentes quimiopreventivos em mamíferos.

Claims (36)

1. Peptídeo isolado, caracterizado por ser uma variante, derivado ou equivalente estrutural de uma cupredoxina, e que pode inibir o desenvolvimento de lesões premalignas em células de mamíferos.

2. Peptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cupredoxina é selecionada do grupo que consiste em azurina, pseudoazurina, plastocianina, rusticianina, Laz, auracianina, estelacianina e proteína básica do pepino.

3. Peptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a cupredoxina é azurina.

4. Peptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cupredoxina se origina de um organismo selecionado do grupo que consiste em Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes faecalis, Achromobacter xylosoxidan, Bordetella bronchiseptica, Methylomonas sp., Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhea, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis, Xylella fastidiosa e Vibrio parahaemolyticus.

5. Peptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que se origina de Pseudomonas aeruginosa.

6. Peptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser parte de um peptídeo selecionado do grupo que consiste da SEQ ID NOS: 1, 3-19.

7. Peptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma seqüência selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NOS: 1, 3-19 tem pelo menos 80% da identidade de seqüência de aminoácidos.

8. Peptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser um truncamento de cupredoxina.

9. Peptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é mais do que cerca de 10 resíduos e não mais do que cerca de 100 resíduos.

10. Peptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o peptídeo compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste em resíduos 50-77 de azurina Pseudomonas aeruginosa, resíduos 50-67 de azurina Pseudomonas aeruginosa, resíduos 36-88 de azurina Pseudomonas aeruginosa e SEQ ID NOS: 20-24.

11. Peptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o peptídeo compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste em resíduos 50-77 de azurina Pseudomonas aeruginosa, resíduos 50-67 de azurina Pseudomonas aeruginosa, resíduos 36-88 de azurina Pseudomonas aeruginosa e SEQ ID NOS: 20-24. .

12. Peptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peptídeo compreende resíduos equivalentes de uma cupredoxina como uma região de azurina Pseudomonas aeruginosa selecionada do grupo que consiste em resíduos 50-77, resíduos 50-67 e resíduos 36-88.

13. Composição farmacêutica, caracterizada por compreender pelo menos uma cupredoxina, ou peptídeo da reivindicação 1 em um veículo farmaceuticamente aceitável.

14. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos duas das cupredoxinas ou peptídeos.

15. Composição, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica é formulada para administração intravenosa.

16. Composição, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a cupredoxina se origina de um organismo selecionado do grupo que consiste em Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes faecalis, Achromobacter xylosoxidan, Bordetella bronchiseptica, Methylomonas sp., Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhea, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis, Xylella fastidiosa e Vibrio parahaemolyticus.

17. Composição, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a cupredoxina é da Pseudomonas aeruginosa.

18. Composição, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a cupredoxina é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 1, 3-19.

19. Método para tratar um paciente mamífero, caracterizado por compreender a administração ao paciente, de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição da reivindicação 13.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o paciente é humano.

21. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o paciente está em um grupo de maior risco de desenvolvimento do câncer comparado à população geral.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado de melanoma, mama, pâncreas, glioblastoma, atrocitoma, pulmão, colorretal, cabeça e pescoço, bexiga, próstata, pele e câncer cervical.

23. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o paciente possui pelo menos uma característica de alto risco.

24. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o paciente tem lesões premalignas.

25. Método, de acordo corn a reivindicação 19, caracterizado pelo fato que o paciente foi curado de câncer ou lesões premalignas.

26. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é administrada por um método selecionado a partir do grupo que consiste em injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção subcutânea, inalação, administração tópica, via transdérmica, supositório, injeção vítrea e por via oral.

27. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o método de administração é por injeção intravenosa.

28. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é administrada em conjunto com pelo menos outro medicamento quimiopreventivo.

29. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é administrada ao mesmo tempo com outro medicamento quimiopreventivo.

30. Kit, caracterizado por compreender a composição da reivindicação 13 em uma ampola.

31. Kit, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o kit é destinado para administração intravenosa.

32. Método para estudo do desenvolvimento do câncer, caracterizado por compreender a colocação de células de mamíferos em contato com uma cupredoxina ou peptídeo da reivindicação 1; e a medição do desenvolvimento de células premalignas e malignas.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que as células são de humanos.

34. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que as células são de glândulas mamárias.

35. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que as células são induzidas para desenvolver o câncer.

36. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de codificar o peptídeo da reivindicação 1.