KR20080034905A

KR20080034905A - 쿠프레독신으로 혈관신생을 제어하는 조성물과 방법

Info

Publication number: KR20080034905A
Application number: KR1020087002477A
Authority: KR
Inventors: 라제스와리 메타; 브라드 테일러; 토루 야마다; 크레이그 베아티에; 타파스 다스 구프타; 아난다 차카라바티
Original assignee: 더 보드 오브 트러스티즈 오브 더 유니버시티 오브 일리노이
Priority date: 2005-07-19
Filing date: 2006-07-19
Publication date: 2008-04-22
Also published as: EP1904081A4; EP1904081A2; CA2615560A1; BRPI0615555A2; AU2006284490A8; JP2009502797A; IL188691A0; NO20080829L; MX2008000993A; WO2007024368A2; WO2007024368A3; AU2006284490A1

Abstract

본 발명은 쿠프레독신을 함유하는 조성물 및 포유동물 세포, 조직, 동물에서 혈관신생(angiogenesis), 특히, 인간에서 종양 발달(tumor development)에 동반되는 혈관신생의 저해에서 이들의 용도에 관계한다. 구체적으로, 본 발명은 포유동물 세포, 조직 또는 동물에서 혈관신생을 저해하는 능력을 유지하는 쿠프레독신, 또는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 기능적 등가체인 펩티드를 함유하는 조성물에 관계한다. 이들 조성물은 특히, 펩티드 또는 제약학적 조성물이다. 본 발명의 조성물은 증상 또는 원인으로서, 부적절한 혈관신생, 특히, 종양 발달에 관련된 부적절한 혈관신생과 연관된 임의의 병리학적 장애를 치료하는데 이용될 수 있다.

혈관신생

Description

쿠프레독신으로 혈관신생을 제어하는 조성물과 방법{Compositions and Methods to Control Angiogenesis with Cupredoxins}

관련된 출원

본 출원은 35 U.S.C. §§ 119와 120 하에, 2005년 7월 19일자 제출된 U.S. 가출원 60/700,297 및 2006년 5월 19일자 제출된 U.S. 특허 출원 11/436,592에 우선권을 주장하고, 상기 U.S. 특허 출원 11/436,592는 2006년 2월 3일자 제출된 U.S. 가출원 No. 60/764,749 및 2005년 10월 6일자 제출된 U.S. 특허 출원 No. 11/244,105에 우선권을 주장하고, 상기 U.S. 특허 출원 No. 11/244,105는 2004년 10월 7일자 제출된 U.S. 가출원 No. 60/616,782 및 2005년 5월 13일자 제출된 U.S. 가출원 No. 60/680,500에 우선권을 주장하고 2003년 11월 11일자 제출된 U.S. 특허 출원 No. 10/720,603의 일부 계속 출원이며, 상기 U.S. 특허 출원 No. 10/720,603은 2003년 8월 15일자 제출된 U.S. 가출원 No. 60/414,550에 우선권을 주장하고 2002년 1월 15일자 제출된 U.S. 특허 출원 No. 10/047,710의 일부 계속 출원이며, 상기 U.S. 특허 출원 No. 10/047,710은 2001년 2월 15일자 제출된 U.S. 가출원 No. 60/269,133에 우선권을 주장한다. 이들 선행 출원의 전체 내용은 본 명세서에서 순전히 참조로서 편입된다.

정부 권리의 진술

본 출원의 요부는 National Institutes of Health (NIH), Bethesda, Maryland, U.S.A.로부터 연구 기금(Grant Number AI 16790-21, ES 04050-16, AI 45541, CA 09432, N01-CM97567)을 지원받았다. 정부는 본 발명에 일부 권리를 주장할 수 있다.

본 발명의 기술 분야

본 발명은 쿠프레독신, 또는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체, 특히, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린 및 포유동물에서 혈관신생(angiogenesis)을 저해하고, 포유동물에서 부적절한 혈관신생에 관련된 장애를을 치료하고, 특히, 종양 발달과 연관된 혈관신생을 저해하기 위한 이들의 용도에 관계한다. 또한, 본 발명은 포유동물 환자에 투여될 수 있고, 구체적으로, 혈관신생을 저해하기 위하여 투여될 수 있는 쿠프레독신, 또는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 함유하는 제약학적 조성물에 관계한다.

혈관신생(angiogenesis)은 기존의 내피 혈관(endothelial vasculature)으로부터 새로운 혈관의 형성이다(Folkman, et al., J. Exp. Med. 133:275-288, (1971)). 대부분의 종양은 확산성 교환(diffusional exchange)의 한계로 인하여 영양분과 대사물질의 공급이 불충해지면, 1-2 ㎜의 임계 부피(critical volume)를 초과하여 성장을 지속시키기 위하여 혈관신생을 필요로 한다(Folkman, J. Nat. Cancer Inst. 82:4-6 (1990)). 혈관신생이 결핍된 종양은 무한히 잠복 상태로 존재하고, 혈액 공급이 달성될 때에만 급속하게 성장한다(Brem et al., Cancer Res.36:2807-2812 (1976)). 혈관신생의 정도는 종종, 종양 진행(tumor progression)에 비례하여 증가한다(Dome et al., J. Pathol. 197:355-362 (2002)). 더 나아가, 종양의 침입(invasion)과 전이성 확산(metastatic spread) 역시 혈관신생-의존성 현상(angiogenesis-dependant event)인 것으로 생각된다(Folkman, Ann Surg. 175:409-416 (1972)). 새로 형성된 혈관은 암 세포가 순환계(circulatory system)로 진입하고 멀리 떨어진 신체 부분까지 확산될 수 있도록 하는 경로를 제공한다(Fidler and Ellis, Cell 79:185-188 (1994)).

혈관신생은 종양의 성장과 확산에서 필수적인 과정이기 때문에, 암 요법의 중요한 초점이다. 항-혈관신생 요법(anti-angiogenesis therapy)은 고형 종양(solid tumor) 뿐만 아니라 조혈성 종양(hematopoietic tumor), 백혈병(leukemia)과 골수종(myeloma)에도 유효하다(Bellamy et al., Cancer Res. 59:728-733 (1999); Rajkumar et al., Leukemia. 13:469-472 (1999)). 내피 세포는 종양 세포보다 우수한 치료 표적인 것으로 생각되는데, 그 이유는 이들이 종양 세포보다 더욱 긴 세대 시간(generation time) 및 더욱 높은 유전적 안정성(genetic stability)을 보유하기 때문이다. 이런 이유로, 내피 세포는 투여된 치료제에 대한 약제 내성(drug resistance)을 나타냄으로써 치료를 “회피”할 가능성이 낮다(Boehn-Vaiswanathan, Curr. Opin. Oncol. 12:89-94 (2000)).

포유동물에서 발병하는 다른 질환 역시 부적절한 혈관신생에 관련된다. 모세혈관이 망막 내로 부적절하게 성장하면 습성 황반 변성(wet macular degeneration)이 발생한다. 또한, 부적절한 혈관신생은 특히, 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 건선(psoriasis), 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis)의 근본적인 특징으로서 관련된다(Bussolino et al., Trends Biochem. Sci. 22:251-256 (1997); Folkman, Nat. Med. 1: 27-31 (1995)).

부적절한 혈관신생, 특히, 종양 형성(tumor formation) 동안 발생하는 혈관신생에 대한 추가적인 치료제가 요구된다. 이들 치료제는 새로운 혈관의 부적절한 또는 바람직하지 않은 형성을 나타내는 여러 질환에서 유용할 것이다.

본 발명의 요약

본 발명의 한 측면은 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체이고, 포유동물 세포 내에서 혈관신생을 저해할 수 있는 분리된 펩티드에 관계한다. 이러한 쿠프레독신은 아주린(azurin), 플라스토시아닌(plastocyanin), 슈도아주린(pseudoazurin), 루스티시아닌(rusticyanin), Laz 또는 아우라시아닌(auracyanin), 구체적으로, 아주린이다. 쿠프레독신은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 알칼리게네스 파이칼리스(Alcaligenes faecalis), 아크로모박터 실로속시단(Achromobacter xylosoxidan), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 메틸로모나스 종(Methylomonas sp .), 수막염균(Neisseria meningitidis), 임균(Neisseria gonorrhoeae), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis), 포도피어슨병균(Xylella fastidiosa), 또는 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus), 구체적으로, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 유래된다. 이러한 분리된 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1, 3-19에서 선택되는 서열의 일부이거나, 또는 SEQ ID NO: 1, 3-19에서 선택되는 서열과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성(sequence identity)을 갖는다.

분리된 펩티드는 쿠프레독신의 절두일 수 있다. 이들 사례에서, 분리된 펩티드는 10개 이상의 잔기 및 100개 이하의 잔기를 보유한다. 이러한 분리된 펩티드는 녹농균(P. aeruginosa) 아주린 잔기 50-77, 잔기 50-67 또는 잔기 36-88, 또는 SEQ ID NO:20-24를 포함한다. 더 나아가, 분리된 펩티드는 녹농균(P. aeruginosa) 아주린 잔기 50-77, 잔기 50-67 또는 잔기 36-88, 또는 SEQ ID NO:20-24로 구성될 수도 있다. 최종적으로, 분리된 펩티드는 녹농균(P. aeruginosa) 아주린 잔기 50-77, 잔기 50-67 또는 잔기 36-88의 등가의 잔기를 포함한다.

본 발명의 다른 측면은 제약학적으로 허용되는 담체 내에 적어도 하나의 쿠프레독신 또는 분리된 펩티드를 함유하는 제약학적 조성물이다. 이러한 제약학적 조성물은 적어도 2개의 쿠프레독신 또는 분리된 펩티드를 함유한다. 더 나아가, 제 약학적 조성물은 정맥내 투여용으로 제조된다. 일부 구체예에서, 쿠프레독신은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 알칼리게네스 파이칼리스(Alcaligenes faecalis), 아크로모박터 실로속시단(Achromobacter xylosoxidan), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 메틸로모나스 종(Methylomonas sp .), 수막염균(Neisseria meningitidis), 임균(Neisseria gonorrhoeae), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis), 포도피어슨병균(Xylella fastidiosa), 또는 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus), 구체적으로, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 유래된다. 쿠프레독신은 SEQ ID NO: 1, 3-19에서 선택된다.

본 발명의 다른 측면은 부적절한 혈관신생에 관련된 병리학적 장애로 고통받는 포유동물 환자를 치료하는 방법인데, 상기 방법은 제약학적 조성물의 치료 효과량을 환자에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 환자는 인간이다. 환자는 암, 특히, 흑색종(melanoma), 유방암, 췌장암, 아교모세포종(glioblastoma), 별아교세포종(astrocytoma), 또는 폐암으로 고통받는다. 다른 구체예에서, 환자는 황반 변성(macular degeneration), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 건선(psoriasis) 또는 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis)에서 선택되는 장애로 고통받는다. 이들 방법에서, 제약학적 조성물은 정맥내 주사, 근육내 주사, 피하 주사, 흡입, 국소 투여, 경피 패치(transdermal patch), 좌약, 유리체 주입(vitreous injection) 또는 경구, 특히, 정맥내 주사로 투여된다.

이들 방법의 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 적어도 하나의 다른 항암 제와 함께, 상기 다른 항암제와 거의 동시에 공동-투여된다. 이들 방법의 다른 구체예에서, 제약학적 조성물은 항-황반 변성 약제, 항-당뇨병성 망막증 약제, 항-건선 약제 또는 항-류머티스 관절염 약제와 공동-투여된다.

본 발명의 다른 측면은 바이알 내에 제약학적 조성물을 포함하는 키트이다. 이러한 키트는 정맥내 투여용으로 설계된다.

본 발명의 다른 측면은 혈관신생 또는 부적절한 혈관신생에 관련된 장애를 조사하는 방법인데, 상기 방법은 혈관신생이 진행될 수 있는 포유동물 세포를 쿠프레독신, 또는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체와 접촉시키고, 혈관신생의 연장을 측정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 세포는 인간 세포이다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 인간 제대 혈관 내피 세포(Human Umbilical Vascular Endothelium Cell, HUVEC)이다.

본 발명의 다른 측면은 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 인코딩하는 발현 벡터이다.

본 발명의 이와 같은 측면, 이점, 특징은 아래의 도면 및 특정한 구체예의 상세한 설명으로부터 명백할 것이다.

서열에 관한 간단한 설명

SEQ ID NO: 1. 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 아주린의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 2. P28, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린 잔기 50-77의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 3. 포르미디움 라미노섬(Phormidium laminosum)으로부터 플라스토시아닌의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 4. 티오바실루스 페로옥시단스(Thiobacillus ferrooxidans)로부터 루스티시아닌의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 5. 아크로모박터 사이클로클라스테스(Achromobacter cycloclastes)로부터 슈도아주린의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 6. 알칼리게네스 파이칼리스(Alcaligenes faecalis)로부터 아주린의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 7. 아크로모박터 실로속시단(Achromobacter xylosoxidan) ssp . 데니트리피칸스( denitrificans ) I로부터 아주린의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 8. 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica)로부터 아주린의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 9. 메틸로모나스 종(Methylomonas sp .) J로부터 아주린의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 10. 수막염균(Neisseria meningitidis) Z2491로부터 아주린의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 11. 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)로부터 아주린의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 12. 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis)로부터 아주린의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 13. 포도피어슨병균(Xylella fastidiosa) 9 a5c로부터 아주린의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 14. 오이(Cucumis sativus)로부터 스텔라시아닌(stellacyanin)의 아미노산 서열

SEQ ID NO: 15. 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터 아우라시아닌 A의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 16. 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터 아우라시아닌 B의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 17. 오이(Cucumis sativus)로부터 오이 기초 단백질(cucumber basic protein)의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 18. 임균(Neisseria gonorrhoeae) F62로부터 Laz의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 19. 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus)로부터 아주린의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 20. 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)의 아우라시아닌 B의 아미노산 57 내지 89의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 21. 슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae) 아주린의 아미노산 51-77의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 22. 수막염균(Neisseria meningitidis) Laz의 아미노산 89-115의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 23. 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus) 아주린의 아미노산 52-78의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 24. 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica) 아주린의 아미노산 51-77의 아미노산 서열.

도 1에서는 Alexafluor 568로 표지된 P28과 함께 배양되고, 이후 DAPI로 염색된 악성 세포와 정상 세포의 공초점 현미경(confocal microscopy) 영상을 도시한다. 지정된 세포주는 37℃에서 2시간동안, 20μM Alexafluor 568 표지된 P28의 부재(음성 대조(negative control)) 또는 존재(P28)에서 배양하였다. 이들 영상은 관찰된 세포 침투(cellular entry)의 양을 지시한다. 도 1A에서는 인간 흑색종, 췌장암, 유방암(BCA-1), 유방암(MCF-7), 아교모세포종, 별아교세포종, 폐암, 전립선암의 Alexafluor 568 형광과 대조 형광을 도시한다. 도 1B에서는 정상적인 인간 섬유아세포, 췌장 세포, 유방 세포의 Alexafluor 568 형광과 대조 형광을 도시한다. 도 1C에서는 인간 제대 정맥 내피 세포((HUVEC)의 Alexafluor 568 형광과 대조 형광을 도시한다.

도 2에서는 P28의 존재 또는 부재에서 Matrigel상에 도말된 HUVEC 세포에 의한 모세관 형성(capillary tube formation)을 도시한다. 배양 배지는 20 ng/㎖ VEGF를 포함하였다. 도 2A에서는 37℃에서 4시간동안, 0.10, 0.30, 0.92, 2.77, 8.33, 25, 75의 P28과 함께 배양되고, 이후 칼세인(calcein) AM으로 염색되고 형광 현미경(fluorescence microscopy) 하에 가시화된 HUVEC 세포의 영상을 도시한다. 도 2B에서, 그래프는 펩티드 처리된 세포와 대조(처리되지 않은 세포)에서 형성된 관의 평균 수치를 도시한다.

도 3에서는 긁힌 상처 HUVEC 이동 측정검사의 결과를 도시한다. 도 3A-C에서는 F-액틴(F-actin)과 핵이 염색된 고정된 세포를 도시한다. 도 3A에서, 90% 합류수준(confluence)에서 HUVEC 세포는 1㎖ 플라스틱 피펫 팁(pipette tip)을 이용하여 긁었다. 도 3B에서, HUVEC 세포는 긁고, 이후 P28의 부재에서 37℃에서 24시간동안, 20 ng/㎖ VEGF를 포함하는 배양 배지에서 배양하였다. 도 3C에서, HUVEC 세포는 긁고, 이후 25μM P28의 존재에서 37℃에서 24시간동안 배양하였다. 도 3A-C의 삽입사진(inset)에서는 기록된 부위(scored area)로부터 멀리 떨어진 부위에서 세포 밀도(cell density)를 도시한다. 도 3D에서, 막대그래프는 대조 웰과 P28 처리된 웰 내에서 긁힌 부위(도 3B와 C)의 20 시야(different field)(20X)에서 세포의 평균 #을 지시한다. 데이터는 평균±SEM을 나타낸다. *는 차이가 통계학적으로 유의함을 표시한다.

도 4에서는 P28 처리의 존재와 부재에서, 세포 구조 단백질의 국지화의 영상을 도시한다. HUVEC 세포는 Matrigel-코팅된 커버 슬립 상에 도말하고, 4시간과 24시간 동안 P28 펩티드(25μM)의 존재 또는 부재에서 20 ng/㎖ VEGF를 포함하는 배양 배지에서 배양하고, 고정시키고, CD31/PECAM-1, 팍실린(paxillin), Fak(국소 부착 키나아제, focal adhesion kinase), 빈쿨린(vinculin), WASP(Wiskott Aldrich Syndrome protein, 위스콧-알드리치 증후군 단백질), β-카테닌(β-catenin)으로 염색 처리하였다. 각 도면은 특정한 구조 단백질의 탐지에 관계한다: 도 4A는 CD31/PECAM-1이다; 도 4B는 팍실린이다; 도 4C는 Fak이다; 도 4D는 WASP이다; 도 4E는 빈쿨린이다; 도 4F는 β-카테닌이다. 각 도면은 4개의 구획으로 분할되는데, 이들 구획은 이용된 형광 마커(fluorescent marker)의 국지화 영상을 도시한다. 각 구획은 탐지된 형광 마커를 표시하도록 번호가 매겨진다: 1 = F-액틴; 2 = DAPI; 3 = FITC-목적 단백질; 4 = 합쳐진 영상. 화살표는 목적 단백질의 국소 위치를 표시한다.

도 5에서는 24시간, 48시간, 72시간 동안 증가하는 농도의 P28로 처리된 Mel-2 세포를 도시한다. 처리된 웰과 대조 웰 내에서 세포의 총수는 Coulter 계수기를 이용하여 계산하였다. 데이터는 이들 시점에서 대조 배양액과 비교하여 세포 성장 저해의 비율을 나타낸다.

도 6에서는 Mel-2 세포(대략 1백만 개 세포/동물)를 왼쪽 옆구리에 피하 주입하는 경우에 결과를 도시한다. 동물은 주입 시점에 지정된 용량으로 P28이 투여되었다. 도 6A에서는 처리 개시이후 종양 발생의 빈도를 도시하는데, 여기서 그래프는 Mel-2 세포로 처리후 일자(day)에서 종양 없는 동물의 %를 나타낸다. 도 6B에서는 처리 개시이후 종양 크기(tumor size)를 도시하는데, 여기서 그래프는 Mel-2 세포로 처리후 일자(day)에서 종양의 평균 용적(average volume)(㎤)을 나타낸다.

정의

본 명세서에서, “세포”는 “단일 세포”로서 구체적으로 명시되지 않는 경우에, 상기 용어의 단수와 복수를 모두 포괄한다.

본 명세서에서, “폴리펩티드”, “펩티드”, “단백질”은 동일한 의미로서 이용되고, 아미노산 잔기의 중합체를 지시한다. 상기 용어는 하나이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공적인 화학 유사체인 아미노산 중합체에 적용된다. 상기 용어는 자연 발생 아미노산 중합체에도 적용된다. “폴리펩티드”, “펩티드”, “단백질”은 당화(glycosylation), 지질 부착(lipid attachment), 황화(sulfation), 글루탐산(glutamic acid) 잔기의 감마-카르복실화(gamma-carboxylation), 하이드록실화(hydroxylation), ADP-리보실화(ribosylation)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 변형 역시 포함한다. 폴리펩티드가 항상 완전하게 선형인 것은 아니다. 가령, 폴리펩티드는 유비퀴틴화(ubiquitination)의 결과로써 분지화되고, 일반적으로, 자연적인 처리 현상(natural processing event) 및 자연적으로 발생하지 않고 인간 조작에 의해 유발되는 현상을 비롯한 번역후 현상(post-translation event)의 결과로써 환형(분지화되거나 분지화되지 않음)이다. 환형 폴리펩티드, 분지화된 폴리펩티드, 분지화된 환형 폴리펩티드는 비-번역 자연 과정 및 전적으로 합성 방법에 의해 합성될 수도 있다.

본 명세서에서, “병리학적 장애(pathological condition)”는 생존 동물 또는 이의 일부분의 정상 상태(normal state)의 손상을 구성하고; 신체 기능의 수행을 교란시키거나 변형하고; 다양한 인자(가령, 영양실조(malnutrition), 산업재해(industrial hazards), 또는 기후), 특정한 감염성 병원체(가령, 벌레, 기생 원충, 세균 또는 바이러스), 생물체의 유전적 결함(가령, 유전적 이형(genetic anomaly)), 또는 이들 인자의 조합에 대응하는, 정상으로부터 해부학적 이탈과 생리학적 이탈을 포괄한다.

본 명세서에서, “장애”는 생존 동물 또는 이의 일부분의 정상 상태의 손상을 구성하고, 신체 기능의 수행을 교란시키거나 변형하는, 정상으로부터 해부학적 이탈과 생리학적 이탈을 포괄한다.

본 명세서에서, “고통받는”은 현재 병리학적 장애의 증상을 나타내고, 관찰가능 증상이 없음에도 병리학적 장애를 앓거나, 병리학적 장애로부터 회복 중이거나, 또는 병리학적 장애로부터 회복된 것을 포괄한다.

본 명세서에서, “치료”는 치료하려는 장애 또는 이러한 장애와 연관된 증상의 진행 또는 심각도를 예방, 저하, 중단 또는 반전시키는 것을 포괄한다. 따라서, “치료”에는 적절한 의학적, 치료적 및/또는 예방적 투여가 포함된다.

본 명세서에서, “세포 성장의 저해”는 세포 분열(cell division) 및/또는 세포 팽창(cell expansion)의 지연 또는 중지를 의미한다. 상기 용어는 세포 발달의 저해 또는 세포 사멸의 증가 역시 의미한다.

본 명세서에서, “혈관신생의 저해”는 특정 세포, 조직, 또는 신체 부위 내에서 혈관 형성의 지연, 중지 또는 반전을 의미한다. 혈관신생의 저해는 내피 세포에 대한 직접적인 또는 간접적인 효과에 기인할 수 있다. 또한, 이러한 저해는 혈관신생 과정의 임의의 단계에서 수행될 수도 있다. 가령, 이러한 저해는 종양에서 혈관 내피 성장 인자(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) 생산의 예방, 내피 세포 증식 및/또는 이동의 직접적인 저해, 혈관신생 성장 인자(angiogenesis growth factor)의 길항제로서 기능, 내피세포-특이적 인테그린(integrin)/생존 신호전달의 저해, 또는 구리의 킬레이트화(chelation)에 기인할 수 있다. 혈관신생의 저해는 현재 개발 중이거나 시판 중인 임의의 항-혈관신생 약제(anti-angiogenesis drug)에 의해 현재 이용되고 있는 임의의 수단을 비롯한, 혈관 형성을 지연, 중지 또는 반전시키는 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다.

본 명세서에서, “부적절한 혈관신생”은 바람직하지 않은 혈관신생의 발생을 의미한다. 부적절한 혈관신생은 포유동물 내에서 임의의 장애와 연관된 혈관신생이다. 부적절한 혈관신생은 이런 장애의 원인이거나 증상이다. 더욱 넓은 의미에서, 부적절한 혈관신생은 정상적인 포유동물 생리의 범위 이내이지만 바람직하지 않은 임의의 혈관신생이다.

“치료 효과량”은 치료되는 개체에서 특정한 장애의 발생을 예방, 지연, 중단 또는 반전시키고, 또는 이러한 장애의 기존 증상을 부분적으로 또는 완전하게 완화시키는데 효과적인 양이다. 치료 효과량의 결정은 당업자의 능력 범위 내에 속한다.

본 명세서에서, 본 발명의 단백질 또는 다른 세포 산물을 수식하는데 이용되는“실질적으로 순수한”은 예로써, 다른 단백질 및/또는 활성 저해 화합물이 실질적으로 존재하지 않거나 섞이지 않은 형태로 성장 배지 또는 세포 내용물로부터 분리된 단백질을 지시한다. “실질적으로 순수한”은 분리된 분획물의 건물 중량(dry weight)당 적어도 75%의 인자(factor), 또는 적어도“75% 실질적으로 순수한” 인자를 의미한다. 더욱 적절하게는, “실질적으로 순수한”은 활성 화합물의 건물 중량당 적어도 85%의 화합물, 또는 적어도“85% 실질적으로 순수한” 화합물을 의미한다. 가장 적절하게는, “실질적으로 순수한”은 활성 화합물의 건물 중량당 적어도 95%의 화합물, 또는 적어도“95% 실질적으로 순수한” 화합물을 의미한다. “실질적으로 순수한”은 본 발명의 합성된 단백질 또는 화합물을 수식하는 데에도 이용될 수 있는데, 여기서 예로써, 이러한 합성 단백질은 합성 반응의 반응물과 부산물로부터 분리된다.

본 발명의 펩티드 또는 단백질과 관련하여, 본 명세서에서, “제약학적 등급(pharmaceutical grade)”은 합성 반응물과 부산물을 비롯한, 자연 상태에서 통상적으로 수반되는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 분리되고, 약제로서 이의 활용을 제약하는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 분리된 펩티드 또는 화합물을 지시한다. 가령, “제약학적 등급” 펩티드는 임의의 암종(carcinogen)으로부터 분리된다. 일부 사례에서, “제약학적 등급”은 조성물을 환자에 대한 정맥내 투여에 부적합하도록 만드는 임의의 물질로부터 실질적으로 또는 본질적으로 분리된 펩티드 또는 화합물을 명시하기 위하여, 의도된 투여 방법, 예를 들면, “정맥내 제약학적 등급(intravenous pharmaceutical grade)”으로 변경될 수 있다. 가령, “정맥내 제약학적 등급” 펩티드는 SDS와 같은 세정제(detergent) 및 아지드(azide)와 같은 항균제(anti-bacterial agent)로부터 분리된다.

“분리된”, “정제된” 또는 “생물학적으로 순수한”은 자연 상태에서 통상적으로 수반되는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 존재하지 않는 물질을 지시한다. 따라서, 본 발명에 따른 분리된 펩티드는 가급적, in situ 환경에서 이들 펩티드와 통상적으로 연관되는 물질을 포함하지 않는다. “분리된” 영역은 이러한 영역이 유래되는 폴리펩티드의 전체 서열을 보유하지 않는 영역을 의미한다. “분리된” 핵산, 단백질, 또는 이의 개별 단편은 뉴클레오티드 염기서열분석(nucleotide sequencing), 제한 절단(restriction digestion), 특정 부위 돌연변이유발(site-directed mutagenesis), 핵산 단편에 대한 발현 벡터로의 서브클로닝(subcloning) 및 실질적으로 순수한 양으로 단백질 또는 단백질 단편의 획득이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 당업자에 의한 조작으로 생체내 환경으로부터 실질적으로 이전된다.

펩티드와 관련하여, 본 명세서에서, “변이체”는 야생형 폴리펩티드와 비교하여, 아미노산이 치환된, 결실된, 또는 삽입된 아미노산 서열 변이체를 의미한다. 변이체는 야생형 펩티드의 절두(truncation)일 수도 있다. 따라서, 변이체 펩티드는 이러한 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자의 조작으로 만들어진다. 변이체는 폴리펩티드의 근본적인 활성의 적어도 일부에는 변화 없이 기본적인 조성이나 특성을 변화시킴으로써 만들어진다. 가령, 아주린의 “변이체”는 포유동물 암 세포의 성장을 저해하는 능력을 유지하는 돌연변이된 아주린일 수 있다. 일부 사례에서, 변이체 펩티드는 비-자연 아미노산, 예를 들면, ε-(3,5-디니트로벤조일)-Lys 잔기로 합성된다(Ghadiri & Fernholz, J. Am. Chem. Soc., 112:9633-9635 (1990)). 일부 구체예에서, 변이체는 야생형 펩티드와 비교하여 20개 이하의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된다. 일부 구체예에서, 변이체는 야생형 펩티드와 비교하여 15개 이하의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된다. 일부 구체예에서, 변이체는 야생형 펩티드와 비교하여 10개 이하의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된다. 일부 구체예에서, 변이체는 야생형 펩티드와 비교하여 6개 이하의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된다. 일부 구체예에서, 변이체는 야생형 펩티드와 비교하여 5개 이하의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된다. 일부 구체예에서, 변이체는 야생형 펩티드와 비교하여 3개 이하의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된다.

본 명세서에서, “아미노산”은 임의의 자연-발생 또는 비-자연 발생 또는 합성 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 모이어티(moiety), 다시 말하면, 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 탄소 원자, 전형적으로, 1개의 (α) 탄소 원자에 의해 직접적으로 연결된 적어도 하나의 카르복실 잔기와 적어도 하나의 아미노 잔기를 포함하는 임의의 모이어티를 의미한다.

펩티드와 관련하여, 본 명세서에서, “유도체”는 표적 펩티드로부터 유래된 펩티드를 의미한다. 유래(derivation)는 펩티드가 근본적인 활성 중에서 일부를 여전히 유지하도록 하는 상기 펩티드의 화학적 변형을 포함한다. 가령, 아주린의 “유도체”는 예로써, 포유동물 세포에서 혈관신생을 저해하는 능력을 유지하는 화학적으로 변형된 아주린일 수 있다. 목적하는 화학적 변형에는 펩티드의 아미드화(amidation), 아세틸화(acetylation), 황화(sulfation), 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 변형, 인산화(phosphorylation) 또는 당화(glycosylation)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이에 더하여, 유도체 펩티드는 화학적 화합물, 예를 들면, 다른 펩티드, 약제 분자 또는 다른 치료제 또는 조제약, 또는 탐지가능 프로브에 폴리펩티드 또는 이의 단편의 융합체(fusion)일 수도 있다.

본 명세서에서, “아미노산 서열 동일성 비율(%)”은 두 서열을 정렬하는 경우에 후보 서열에서 아미노산 잔기와 일치하는 폴리펩티드에서 아미노산 잔기의 비율로서 정의된다. 아미노산 동일성 비율(%)을 결정하기 위하여, 서열은 정렬하고, 필요한 경우, 최대 서열 동일성 비율(％)을 확보하기 위하여 갭(gap)을 도입한다; 보존성 치환은 서열 동일성의 일부로서 간주되지 않는다. 동일성 비율(％)을 측정하기 위한 아미노산 서열 정렬 절차는 당업자에게 공지되어 있다. 공개적으로 가용한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들면, BLAST, BLAST2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어가 펩티드 서열을 정렬하는데 이용된다. 특정한 구체예에서, Blastp(National Center for Biotechnology Information, Bethesda MD로부터 입수가능)는 long complexity filter, expect 10, word size 3, existence 11, extension 1의 디폴트 파라미터에서 이용된다.

아미노산 서열을 정렬하는 경우에, 일정한 아미노산 서열 B에 대한 일정한 아미노산 서열 A(또는, 일정한 아미노산 서열 B에 대한 특정의 아미노산 서열 동일성(％)을 갖거나 포함하는 일정한 아미노산 서열 A)의 아미노산 서열 동일성 비율(%)은 아래와 같이 산정될 수 있다:

아미노산 서열 동일성 비율(%) = X/Y * 100

여기서, X는 서열 정렬 프로그램 또는 알고리즘 정렬에 의해 A와 B의 동일한 정합(match)으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고,

Y는 B에서 아미노산 잔기의 총수이다.

아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동등하지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 비율(％)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 비율(％)과 일치하지 않을 것이다. 더욱 짧은 서열에 더욱 긴 서열을 비교하는 경우에, 더욱 짧은 서열은 “B” 서열이 될 것이다. 가령, 상응하는 야생형 폴리펩티드에 절두된 폴리펩티드를 비교하는 경우에, 절두된 펩티드는 “B” 서열이 될 것이다.

총론

본 발명에서는 쿠프레독신, 또는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 함유하는 조성물 및 포유동물에서 혈관신생(angiogenesis)을 저해하고 및/또는 암 세포의 성장을 저해하는 방법을 제시한다. 구체적으로, 본 발명은 쿠프레독신을 함유하는 조성물 및 암과 다른 장애에 연관된 부적절한 혈관신생의 저해에서 이들의 용도에 관계한다. 본 발명은 또한, 포유동물에서 혈관신생, 특히, 종양 발달과 연관된 혈관신생을 저해하는 능력을 유지하는 쿠프레독신의 변이체, 유도체, 기능적 등가체 및 이들을 함유하는 조성물에 관계한다. 가장 구체적으로, 본 발명에서는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린, 또는 아주린의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 함유하는 조성물 및 부적절한 혈관신생에 관련된 장애와 종양 발달에 관련된 혈관신생으로 고통받는 환자를 치료하거나 이러한 위험이 있는 개체에서 감염을 예방하기 위한 이들의 용도를 제시한다. 최종적으로, 본 발명에서는 혈관신생의 유도 전후에, 포유동물 세포, 조직과 동물을 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체와 접촉시키고, 혈관 발생에서 변화를 측정함으로서 혈관신생을 연구하는 방법을 제시한다.

이전에, 녹농균(P. aeruginosa)에 의해 만들어지는 산화환원 단백질, 쿠프레독신 아주린은 J774 세포에만 선택적으로 들어가고 정상 세포에는 들어가지 못하는 것으로 밝혀졌다(Zaborina et al., Microbiology 146: 2521-2530 (2000)). 아주린은 또한, 인간 흑색종 UISO-Mel-2 또는 인간 유방암 MCF-7 세포 내로 선택적으로 들어갈 수 있다(Yamada et al., PNAS 99:14098-14103(2002); Punj et al., Oncogene 23:2367-2378(2004)). 녹농균(P. aeruginosa)으로부터 아주린은 J774 뮤린 세망세포(reticulum cell) 육종 세포(sarcoma cell) 내로 우선적으로 들어가고, 종양 억제 단백질 p53과 복합체를 형성하여 이를 안정화시키고, p53의 세포내 농도를 강화시키고, 아폽토시스를 유도한다(Yamada et al., Infection and Immunity, 70:7054-7062(2002)). 아주린 분자의 다양한 도메인의 상세한 연구에서, 아미노산 50-77(P28)(SEQ ID NO: 2)은 내부화(internalization) 및 차후의 아폽토시스 활성(apoptotic activity)에 매우 중요한 단백질 형질도입 도메인(protein transduction domain, PTD)을 대표한다(Yamada et al., Cell. Microbial. 7:1418-31, (2005)).

놀랍게도, 현재, 합성된 P28은 다양한 악성 세포주(특히, 흑색종(Mel-2), MCF-7, 췌장, 별아교세포종(astrocytoma), 아교모세포종(glioblastoma)) 내로 침투할 뿐만 아니라 비-암성 인간 제대 정맥 내피 세포(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)에도 침투한다(실시예 1 참조). P28은 온도 의존성 방식(temperature dependent manner)으로 이들 세포에 침투하지만, 정상적인 세포(섬유아세포(fibroblast), 정상적인 유선 상피(mammary epithelium)) 내로는 들어가지 못한다. HUVEC 세포가 인간 태아에서 혈관신생을 유인하는 것으로 알려져 있기 때문에, HUVEC 세포 내로 P28의 침투는 혈관신생에 대한 P28의 효과에 관한 조사를 촉발시켰다. HUVEC 세포(20,000개 세포)는 Matrigel 코팅된 웰에 도말하고 0-75μM의 P28을 포함하는 배지에서 배양하였다. 배양액은 처리후 4h와 24h 시점에 광학 현미경(light microscopy) 하에서 조사하였다. 상기 P28 펩티드는 용량 의존성 방식으로 HUVEC의 모세관 형성(capillary tube formation)을 저해하였는데, 이는 P28이 혈관신생의 모세관 형성 단계를 저해한다는 것을 암시한다(실시예 2 참조). 더 나아가, P28은 긁힌 상처 이동 측정검사(scratch wound migration assay)에서 Matrigel상에서 HUVEC 세포의 이동을 저해하였는데, 이는 P28이 혈관신생의 이동 단계 역시 저해한다는 것을 암시한다(실시예 3 참조). 따라서, Matrigel상에서 확립된 혈관신생 모형 시스템, HUVEC로 시험관내 연구에서, P28은 혈관신생에서 2가지 핵심적인 단계, 모세관 형성 및 세포 이동을 저해한다.

더 나아가, HUVEC의 세포 형태(cell morphology) 역시 성장 배지에 P28의 추가에 의해 놀랍도록 변하였다. Matrigel상에서 성장하는 HUVEC에 P28의 추가는 세포 이동과 연관되는 세포골격(cytoskeleton)과 다른 단백질에서 정상적인 혈관신생-관련된 변화를 예방하였다(실시예 4 참조). 팍실린(paxillin) 탐지된 세포 내에서, 팍실린은 대조 세포의 세포 표면에서 주로 관찰되는 반면, P28 처리된 세포에서는 F-액틴 섬유(F-actin fiber)에서 더욱 빈번하게 관찰되었다(도 4B). Fak 탐지된 세포 내에서, Fak는 대조 세포의 세포 표면에서 주로 관찰되는 반면, P28 처리된 세포의 F-액틴 섬유에서 더욱 빈번하게 관찰되고, 따라서 유연성과 이동성이 덜한 세포를 산출한다. 세포-세포 유착 단백질(cell-cell attachment protein) CD-31/PECAM-1은 HUVEC를 P28로 처리하는 경우에 과다-발현되고 세포-세포 접점(cell-cell junction)으로 명백하게 국지화되며, 따라서 세포-세포 접촉(cell-cell contact)을 촉진한다. 액틴 핵형성(actin nucleation)과 분지화(branching) 촉진 인자 WASP(Wiskott Aldrich Syndrome Protein)는 혈관신생이 진행되는 HUVEC 내에서 세포 표면 상에서 정상적으로 관찰되는 반면, P28 처리된 세포 내에서 핵으로 국지화되고, 따라서, 액틴 분지화와 핵형성을 변화시킨다. 최종적으로, P28은 핵으로 β-카테닌 국지화(β-catenin localization)를 저해하고, 따라서 HIVEC 내에서 증식과 세포 이동을 저해하였다. 이런 이유로, HUVEC 내에서 혈관신생의 여러 형태학적 징표가 P28의 존재에 의해 감소되거나 제거되는데, 이는 혈관신생이 진행되는 세포에 P28이 직접적인 영향을 준다는 것을 더욱 암시한다.

P28은 농도 의존성 방식(concentration dependant manner)으로 시험관내에서 Mel-2 흑색종 세포의 성장을 특이적으로 저해할 수 있다(실시예 5 참조). 이런 이유로, P28은 특이적인 방식으로 암 세포 내로 침투할 수 있을 뿐만 아니라 이들의 성장을 직접적으로 저해할 수도 있다. 종양 발달은 혈관신생과 연관하여 진행된다. P28은 용량 의존성 방식(dose dependent manner)으로, 무흉선 생쥐 내로 피하 이식된 Mel-2 세포의 성장을 저해하였다(실시예 6 참조). 8과 16 ㎎/㎏ wt i.p. 처리후 30일 시점에 측정가능(>2㎜ 직경) 종양의 발생률은 대조에 비하여, 처리 군에서 현저하게 낮았다. 더 나아가, 종양 용적(tumor volume) 역시 대조에 비하여, 16㎎/㎏ P28이 투여된 동물에서 현저하게 낮았다. 종합하면, P28은 종양 세포 내로의 선택적인 침투로 인하여 현저한 항-종양 효과를 나타내고, 이들의 증식을 저해하며, 종양 발달에 관련된 혈관신생을 억제한다.

쿠프레독신 사이에 높은 구조적 유사성으로 인하여, 다른 쿠프레독신 역시 포유동물에서 혈관신생을 저해할 가능성이 높다. 이들 쿠프레독신은 예로써, 세균 또는 식물에서 발견될 수 있다. 이들 다른 쿠프레독신은 본 발명의 조성물과 방법에 이용될 수 있을 것으로 고려된다. 더 나아가, 포유동물 세포에서 혈관신생을 저해하는 능력을 유지하는, 쿠프레독신의 변이체, 유도체, 구조적 등가체 역시 본 발명의 조성물과 방법에 이용될 수 있다. 이들 변이체와 유도체에는 쿠프레독신의 절두, 아미노산의 보존성 치환 및 PEG화(PEGylation)와 α-나선의 전체-탄화수소 스테이플링(all-hydrocarbon stapling)과 같은 단백질 변형이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

또한, 부적절한 혈관신생에 관련된 다른 장애 역시 쿠프레독신, 특히, 아주린으로 치료될 수 있다. 가령, Avastin(bevacizumab, Genentech, South San Francisco, CA), 인간 혈관 내피 성장 인자(human vascular endothelial growth factor, VEGF)에 결합하고 이의 생물학적 활성을 저해하는 재조합 인간화 단클론 IgG1 항체는 전이성 결장직장암(metastatic colorectal cancer)과 연관된 혈관신생을 감소시키는데 유효할 뿐만 아니라 신생혈관성 연령-관련 황반 변성(neovascular age-related macular degeneration)과 연관된 부적절한 혈관신생을 치료하는 데에도 매우 유효하다(Bashshur et al., Am J Ophthalmol. 142:1-9 (2006)). 이런 이유로, P28 및 다른 쿠프레독신, 또는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 신생혈관성 연령-관련 황반 변성과 연관된 것들과 같은 암 이외의 질환에서도 부적절한 혈관신생을 저해할 가능성이 높다. 더 나아가, 쿠프레독신, 또는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 건선(psoriasis), 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis)과 같은, 부적절한 혈관신생에 관련된 다른 질환을 치료하는 데에도 유효할 가능성이 높다.

본 발명의 조성물

본 발명에서는 포유동물 세포, 조직과 동물에서 혈관신생을 저해하는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체인 펩티드를 제시한다. 더 나아가, 본 발명에서는 포유동물 암 세포의 성장을 저해하는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체인 펩티드를 제시한다. 더 나아가, 본 발명에서는 포유동물 암 세포 내로 특이적으로 침투하는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체인 펩티드를 제시한다. 일부 구체예에서, 펩티드는 분리된다. 일부 구체예에서, 펩티드는 실질적으로 순수하거나 제약학적 등급이다. 다른 구체예에서, 펩티드는 이러한 펩티드를 포함하거나, 또는 이러한 펩티드로 본질적으로 구성되는 조성물 내에 존재한다. 다른 특정한 구체예에서, 펩티드는 포유동물, 더욱 바람직하게는, 인간에서 면역 반응을 유발하지 않는다. 일부 구체예에서, 펩티드는 전장 이하의 쿠프레독신이고, 쿠프레독신의 기능적 특징의 일부를 유지한다. 구체적으로, 일부 구체예에서, 펩티드는 Matrigel상에서 HUVEC에서 혈관신생을 저해하는 능력을 유지한다.

본 발명에서는 또한, 쿠프레독신, 또는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체인 적어도 하나의 펩티드를 함유하는 제약학적 조성물을 제시한다. 특정한 구체예에서, 제약학적 조성물은 경구(oral), 복강내(intraperitoneal), 정맥내(intravenous), 또는 안구내(intraocular)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 특정한 투여 방식에 적합하도록 설계된다. 이들 조성물은 물에서 수화되거나, 또는 후기 수화(hydration)를 위하여 건조된다(가령, 냉동 건조(lyophilization)에 의해). 이들 조성물은 물 이외의 용매, 예를 들면, 알코올에 용해될 수도 있다.

쿠프레독신 사이에 높은 구조적 상동성으로 인하여, 쿠프레독신은 P28과 동일한 항-혈관신생 활성을 보유할 것으로 고려된다. 일부 구체예에서, 쿠프레독신에는 아주린, 슈도아주린, 플라스토시아닌, 루스티시아닌, 아우라시아닌 또는 Laz가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 특정한 구체예에서, 아주린은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa); 알칼리게네스 파이칼리스(Alcaligenes faecalis); 아크로모박터 실로속시단 ssp . 데니트리피칸스(denitrificans) I; 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica); 메틸로모나스 종(Methylomonas sp .); 수막염균(Neisseria meningitidis); 임균(Neisseria gonorrhoeae); 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens); 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis); 포도피어슨병균(Xylella fastidiosa), 또는 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus)로부터 유래된다. 더욱 특정한 구체예에서, 아주린은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 유래된다. 다른 특정한 구체예에서, 쿠프레독신은 SEQ ID NO: 1, 3-19인 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명에서는 야생형 쿠프레독신과 비교하여 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된 아미노산 서열 변이체인 펩티드를 제시한다. 본 발명의 변이체는 야생형 쿠프레독신의 절두일 수도 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 전장 이하의 야생형 폴리펩티드인 쿠프레독신의 한 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 절두된 쿠프레독신의 10개 이상의 잔기, 15개 이상의 잔기, 또는 20개 이상의 잔기를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 절두된 쿠프레독신의 100개 이하의 잔기, 50개 이하의 잔기, 40개 이하의 잔기, 30개 이하의 잔기 또는 20개 이하의 잔기를 포함한다. 일부 구체예에서, 쿠프레독신은 상기 펩티드, 더욱 구체적으로, SEQ ID NO: 1, 3-19에 적어도 70% 아미노산 서열 동일성, 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 적어도 90% 아미노산 서열 동일성, 적어도 95% 아미노산 서열 동일성 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 보유한다.

특정한 구체예에서, 쿠프레독신의 변이체는 녹농균(P. aeruginosa) 아주린 잔기 50-77, 아주린 잔기 50-67, 또는 아주린 잔기 36-88을 포함한다. 다른 구체예에서, 쿠프레독신의 변이체는 녹농균(P. aeruginosa) 아주린 잔기 50-77, 아주린 잔기 50-67, 또는 아주린 잔기 36-88로 구성된다. 다른 특정한 구체예에서, 쿠프레독신의 변이체는 아주린 이외의 쿠프레독신의 등가 잔기(equivalent residue)로 구성된다. 또한, 아주린 잔기 50-77, 아주린 잔기 50-67, 또는 아주린 잔기 36-88과 유사한 활성을 갖는 다른 쿠프레독신 변이체가 설계될 수도 있다. 이를 위하여, 표적 쿠프레독신 아미노산 서열은 BLAST, BLAST2, ALIGN2 또는 Megalign(DNASTAR)을 이용하여 녹농균(P. aeruginosa) 아주린 서열, 녹농균(P. aeruginosa) 아주린 아미노산 서열 상에서 발견되는 관련된 잔기, 표적 쿠프레독신 서열 상에서 발견되는 등가 잔기에 정렬되고, 따라서, 등가의 변이체가 설계된다.

본 발명의 한 구체예에서, 쿠프레독신 변이체는 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)의 아우라시아닌 B의 아미노산 57 내지 89(SEQ ID NO: 20)를 적어도 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 쿠프레독신 변이체는 슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae) 아주린의 아미노산 51-77(SEQ ID NO: 21)을 적어도 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 쿠프레독신 변이체는 수막염균(Neisseria meningitidis) Laz의 아미노산 89-115(SEQ ID NO: 22)를 적어도 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 쿠프레독신 변이체는 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus) 아주린의 아미노산 52-78(SEQ ID NO: 23)을 적어도 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 쿠프레독신 변이체는 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica) 아주린의 아미노산 51-77(SEQ ID NO: 24)을 적어도 포함한다.

변이체에는 자연적으로 발생하지 않는 합성 아미노산으로 만들어진 펩티드 역시 포함된다. 가령, 비-자연 발생 아미노산은 혈류(bloodstream) 내에서 조성물의 반감기(half-life)를 연장하거나 최적화하기 위하여 변이체 펩티드 내로 편입된다. 이런 변이체에는 D,L-펩티드(부분입체이성질체(diastereomer))(가령, Futaki et al., J. Biol. Chem. 276(8):5836-40(2001); Papo et al., Cancer Res. 64(16):5779-86(2004); Miller et al, Biochem. Pharmacol. 36(1):169-76, (1987)), 특수한 아미노산을 보유하는 펩티드(가령, Lee et al., J. Pept. Res. 63(2):69-84(2004)), 탄화수소 스테이플링(hydrocarbon stapling)이 후행하는 올레핀-보유 비-자연 아미노산(가령, Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892(2000); Walenski et al., Science 305:1466-1470(2004)), ε-(3,5-디니트로벤조일)-Lys 잔기를 포함하는 펩티드가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

다른 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 쿠프레독신의 유도체이다. 쿠프레독신의 유도체는 펩티드가 근본적인 활성 중에서 일부를 여전히 유지하도록 하는 상기 펩티드의 화학적 변형(chemical modification)이다. 가령, 아주린의 “유도체”는 포유동물 세포, 조직 또는 동물에서 혈관신생을 저해하는 능력을 유지하는 화학적으로 변형된 아주린일 수 있다. 목적하는 화학적 변형에는 펩티드의 탄화수소 스테이플링, 아미드화(amidation), 아세틸화(acetylation), 황화(sulfation), 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 변형, 인산화(phosphorylation) 또는 당화(glycosylation)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이에 더하여, 유도체 펩티드는 화학적 화합물, 예를 들면, 다른 펩티드, 약제 분자 또는 다른 치료제 또는 조제약, 또는 탐지가능 프로브에 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체의 융합체(fusion)일 수도 있다. 목적 유도체는 예로써, 원형화된 펩티드(가령, Monk et al., BioDrugs 19(4):261-78,(2005); DeFreest et al., J. Pept. Res.63(5):409-19(2004)), N-과 C-말단 변형(가령, Labrie et al., Clin. Invest. Med. 13(5):275-8,(1990)), 탄화수소 스테이플링(hydrocarbon stapling)이 후행하는 올레핀-보유 비-자연 아미노산의 통합(가령, Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892(2000); Walenski et al., Science 305:1466-1470(2004))이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 당업자에게 널리 공지된 여러 방법에 의해, 혈류 내에서 본 발명의 펩티드와 조성물의 반감기가 연장되거나 최적화될 수 있는 화학적 변형을 보유한다.

다른 구체예에서, 펩티드는 쿠프레독신의 구조적 등가체이다. 쿠프레독신과 다른 단백질 사이에 현저한 구조적 상동성을 결정하는 연구의 실례에는 Toth et al., Developmental Cell 1:82-92(2001)가 포함된다. 구체적으로, 쿠프레독신과 구조적 등가체 사이에 현저한 구조적 상동성은 VAST 알고리즘을 이용함으로써 결정된다(Gibrat et al., Curr Opin Struct Biol 6:377-385(1996); Madej et al., Proteins 23:356-3690(1995)). 특정한 구체예에서, 구조적 등가체에 대한 쿠프레독신의 구조적 비교(structural comparison)로부터 VAST p 값은 대략 10^-3이하, 대략 10^-5 이하, 또는 대략 10^-7이하이다. 다른 구체예에서, 쿠프레독신과 구조적 등가체 사이에 현저한 구조적 상동성은 DALI 알고리즘을 이용함으로써 결정된다(Holm & Sander, J. Mol. Biol. 233:123-138 (1993)). 특정한 구체예에서, 쌍별 구조적 비교(pairwise structural comparison)에 대한 DALI Z 스코어는 적어도 3.5, 적어도 7.0, 또는 적어도 10.0이다.

본 발명의 조성물의 펩티드는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 및/또는 구조적 등가체 중에서 한 가지 이상일 수 있다. 가령, 이들 펩티드는 PEG화된 아주린의 절두이고, 따라서, 변이체와 유도체가 모두 가능하다. 한 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 올레핀-보유 사슬(olefin-bearing tether)을 보유하고, 루테늄(ruthenium) 촉매된 올레핀 메타세시스(olefin metathesis)에 의한 전체-탄화수소 “주요소(staple)”가 후행하는 α,α-이중치환된 비-자연 아미노산으로 합성된다(Scharmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892(2000); Walensky et al., Science 305:1466-1470(2004)). 부가적으로, 아주린의 구조적 등가체인 펩티드는 다른 펩티드에 융합되고, 따라서, 구조적 등가체와 유도체가 모두 가능한 펩티드를 산출한다. 이들 실례는 본 발명을 예시할 뿐이며 한정하지 않는다. 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 구리에 결합하거나 결합하지 않을 수 있다.

일부 구체예에서, 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 녹농균(P. aeruginosa) 아주린, 구체적으로, P28의 기능적 특징 중에서 일부를 갖는다. 특정한 구체예에서, 쿠프레독신 및 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 포유동물 세포, 조직 또는 동물, 구체적으로, HUVEC 내에서 혈관신생을 저해한다. 본 발명에서는 또한, 포유동물 암 세포, 구체적으로, 흑색종, 유방암, 췌장암, 아교모세포종(glioblastoma), 별아교세포종(astrocytoma), 또는 폐암 세포의 성장을 저해하는 능력을 갖는 쿠프레독신 및 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 제시한다. 본 발명에서는 또한, 등가의 비-암성 세포에 비하여 포유동물 암 세포, 구체적으로, 흑색종, 유방암, 췌장암, 아교모세포종, 별아교세포종, 또는 폐암 세포 내로 침투하는 능력을 갖는 쿠프레독신 및 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 제시한다. 혈관신생 또는 암 세포 성장의 저해는 대조 치료(control treatment)와 비교하여 통계학적으로 유의한 활성의 감소, 또는 증가 속도의 완화이다. 세포 내로의 침투는 등가의 정상적인 세포 내로의 침투 비율과 비교하여 통계학적으로 유의한 세포 내로의 침투 비율이다.

쿠프레독신이 포유동물 세포, 조직 또는 동물, 구체적으로, Matrigel상에서 성장하는 HUVEC 내에서 혈관신생을 저해할 수 있는 것으로 알려져 있기 때문에, 이러한 항-혈관신생 활성을 유지하는 쿠프레독신의 변이체와, 유도체, 구조적 등가체를 설계하는 것이 가능하다. 이런 변이체, 유도체, 구조적 등가체는 예로써, 쿠프레독신의 다양한 변이체, 유도체, 구조적 등가체의 “라이브러리(library)”를 만들고, 이후 당분야에 공지된 방법, 예를 들면, 실시예 2와 3에 기술된 전형적인 방법을 이용하여 이들 각각에서 항-혈관신생 활성, 구체적으로, HUVEC 내에서 항-혈관신생을 조사함으로써 제조될 수 있다. 항-혈관신생 활성을 갖는 쿠프레독신의 생성된 변이체, 유도체, 구조적 등가체는 쿠프레독신대신에, 또는 쿠프레독신에 추가하여 본 발명의 방법에 이용될 수 있다.

일부 특정한 구체예에서, 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 처리되지 않은 대조와 통계학적으로 상이한 수준으로, HUVEC 세포 내에서 모세관 형성을 저해한다. 펩티드는 실시예 3 또는 Sulochana et al., J. Biol. Chem. 280:27936-27948 (2005)에 기술된 모세관 형성 검사(capillary tube formation test)를 이용함으로써 이러한 활성을 조사할 수 있다. 모세관 형성이 저해되는 지를 결정하는, 당분야에 널리 공지된 다른 방법 역시 이용될 수 있다.

일부 특정한 구체예에서, 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 처리되지 않은 대조와 통계학적으로 상이한 수준으로, 긁힌 상처 이동 측정검사(scratch wound migration assay)에서 HUVEC 이동을 저해한다. 펩티드는 실시예 4에 기술된 모세관 형성 검사를 이용함으로써 이러한 활성을 조사할 수 있다. HUVEC 이동이 저해되는 지를 결정하는, 당분야에 널리 공지된 다른 방법 역시 이용될 수 있다.

쿠프레독신

이들 작은 청동(blue copper) 단백질(쿠프레독신)은 세균 전자 전달 연쇄(electron transfer chain)에 참여하거나, 또는 기능이 알려지지 않은 전자 전달 단백질(10-20 kDa)을 이다. 구리 이온은 단백질 매트릭스(단백질 matrix)에 의해서만 결합된다. 구리 주변에 2개의 히스티딘과 1개의 시스테인에 독특한 뒤틀린 삼각형 2차원 정렬은 금속 부위의 매우 고유한 전자 특성 및 강렬한 푸른색을 발생시킨다. 다수의 쿠프레독신이 중간 내지 높은 해상도(resolution)에서 결정학적으로 특성화되었다.

쿠프레독신은 일반적으로, 서열 상동성(sequence homology)이 낮은 반면 구조 상동성(structural homology)이 높다(Gough & Clothia, Structure 12:917-925 (2004); De Rienzo et al., Protein Science 9:1439-1454 (2000)). 가령, 아주린의 아미노산 서열은 아우라시아닌 B의 아미노산 서열에 31%, 루스티시아닌의 아미노산 서열에 16.3%, 플라스토시아닌의 아미노산 서열에 20.3%, 슈도아주린의 아미노산 서열에 17.3% 동일하다(표 1 참조). 하지만, 이들 단백질의 구조 유사성(structural similarity)은 더욱 현저하다. 아주린 대 아우라시아닌 B의 구조 비교에 대한 VAST p 값은 10^-7.4이고, 아주린 대 루스티시아닌의 구조 비교에 대한 VAST p 값은 10^-5이고, 아주린 대 플라스토시아닌의 구조 비교에 대한 VAST p 값은 10^-5.6이고, 아주린 대 슈도아주린의 구조 비교에 대한 VAST p 값은 10^-4.1이다.

모든 쿠프레독신은 8개-가닥 그리스 열쇠 베타-배럴(beta-barrel) 또는 베타-샌드위치(beta-sandwich) 접힘(fold)을 공유하고, 고도로 보존된 부위 구조(site architecture)를 보유한다(De Rienzo et al., Protein Science 9:1439-1454 (2000)). 많은 장쇄 지방족 잔기, 예를 들면, 메티오닌(methionine)과 루이신(leucine)의 존재로 인한 현저한 소수성 패치(hydrophobic patch)가 아주린, 아미시아닌(amicyanin), 시아노박테리아(cyanobacterial) 플라스토시아닌, 오이 기초 단백질 및 정도가 덜하지만, 슈도아주린과 진핵생물 플라스토시아닌 내에서 구리 부위 주변에 존재한다(Id.). 소수성 패치는 정도가 덜하지만 스텔라시아닌과 루스티시아닌 구리 부위 내에서도 관찰되는데, 하지만 특징이 상이하다(Id.).

VAST 알고리즘을 이용하여, 다른 단백질에 대한 녹농균(P. aeruginosa)으로부터 아주린(1JZG)의 서열과 구조 정렬

PDB	정렬 길이 ¹	aa 동일성 %	P- 값 ²	스코어 ³	RMSD ⁴	설명
1AOZ A 2	82	18.3	10e-7	12.2	1.9	아스코르브산 산화효소
1QHQ_A	113	31	10e-7.4	12.1	1.9	아우라시아닌B
1V54 B 1	79	20.3	10e-6.0	11.2	2.1	시토크롬 c 산화효소
1GY2 A	92	16.3	10e-5.0	11.1	1.8	루스티시아닌
3MSP A	74	8.1	10e-6.7	10.9	2.5	운동성 주요 정자 단백질⁵
1IUZ	74	20.3	10e-5.6	10.3	2.3	플라스토시아닌
1KGY E	90	5.6	10e-4.6	10.1	3.4	ephrinB2
1PMY	75	17.3	10e-4.1	9.8	2.3	슈도아주린

¹정렬된 길이: 2개의 구조 사이에 중첩된 C-알파 원자의 동등 쌍(equivalent pair)의 총수, 다시 말하면, 3D 중첩을 산정하기 위하여 이용되는 잔기의 총수.

²P-VAL: VAST p 값은 확률(probability)로서 표시되는, 이러한 비교의 유의성(significance)의 척도(measure)이다. 가령, p 값이 0.001이면, 우연히 이러한 특성(quality)의 매치(match)를 볼 가능성(odds)은 1000 대 1이다. VAST로부터 p 값은 MMDB 데이터베이스 내에 500개의 독립되고 무관한 유형의 도메인이 존재한다는 가설을 이용하여 복수 비교의 효과에 대하여 조정된다. 이렇게 도출된 p 값은 500으로 나눠진, 각 도메인 쌍의 쌍별 비교에 대한 p 값에 상응한다.

³스코어: VAST 구조-유사성 스코어(structure-similarity score). 이 숫자는 중첩된 이차 구조 요소의 총수 및 이러한 중첩의 특성에 관련된다. 더욱 높은 VAST 스코어는 더욱 높은 유사성과 상관한다.

⁴RMSD: 제곱 평균 제곱근(root mean square) 중첩 잔기(옹스트롬(Angstrom) 단위). 이 숫자는 두 구조의 최적 중첩이후, 동등한 C-알파 원자 사이의 평균 제곱 거리의 제곱근(square root)으로서 산정된다. 주목할 점은 RMSD 수치가 구조적 정렬의 정도에 비례하고, 이러한 크기가 전체 구조 유사성의 서술자(descriptor)로서 RMSD를 이용하는 경우에 고려되어야 하는 것이다.

⁵난모세포(oocyte) 성숙에서 에프린 길항제인 것으로 입증된 꼬마선충(C. elegans) 주요 정자 단백질(Kuwabara, Genes and Development, 17:155-161(2003)).

아주린

아주린은 특정 세균에서 전자 전달에 관여하는 쿠프레독신 집단에 속하는 128개의 아미노산 잔기로 구성되는 구리-보유 단백질이다. 아주린에는 녹농균(P. aeruginosa)(SEQ ID NO: 1), 알칼리게네스 자일로족시단스(Alcaligenes xylosoxidans), 알칼리게네스 데니트리피칸(Alcaligenes denitrifican)으로부터 유래된 것들이 포함된다(Murphy et al., J. Mol. Biol. 315:859-71 (2002)). 아주린 사이에 아미노 서열 동일성이 60-90% 사이에서 변하긴 하지만, 이들 단백질은 강한 구조적 상동성을 나타낸다. 모든 아주린은 그리스 열쇠 모티프를 포함하는 특징적인 β-샌드위치를 보유하고, 단일 구리 원자는 상기 단백질의 동일 영역에 항상 위치한다. 이에 더하여, 아주린은 구리 부위를 둘러싸는 본질적으로 중성의 소수성 패치를 본질적으로 보유한다(Murphy et al.).

플라스토시아닌

플라스토시아닌은 한 분자당 하나의 구리 분자를 보유하고 산화된 형태에서 푸른빛을 띠는 시아노박테리아(cyanobacteria), 조류(algae), 식물의 가용성 단백질이다. 이들은 엽록소(chloroplast)에서 생성되는데, 여기서 이들은 전자 운반체(electron carrier)로서 기능한다. 1978년에 포플러 플라스토시아닌 구조의 결정이후, 조류(떼목말(Scenedesmus), 파래속(Enteromorpha), 클라미도모나스(Chlamydomonas))와 식물(강낭콩(French bean)) 플라스토시아닌의 구조가 결정학적 방법 또는 NMR 방법으로 결정되었는데, 이러한 포플러 구조는 1.33 Å 해상도에서 세밀히 구별되었다. SEQ ID NO: 3에서는 호열성 시아노박테리아, 포르미디움 라미노섬(Phormidium laminosum)으로부터 플라스토시아닌의 아미노산 서열을 도시한다.

조류와 관속 식물(vascular plants)의 플라스토시아닌 사이에 서열 불일치(sequence divergence)(가령, 클라미도모나스(Chlamydomonas)와 포플러 단백질 사이에 62% 서열 동일성)에도 불구하고, 이들 3차원 구조가 보존되었다(가령, 클라미도모나스(Chlamydomonas)와 포플러 단백질 사이에 C 알파 위치에서 0.76 Å rms 편차). 구조적 특징에는 8개-가닥 역평행 베타-배럴(beta-barrel)의 한 단부에서 뒤틀린 4배위자리(tetrahedral) 구리 결합 부위, 현저한 네거티브 패치(negative patch), 평평한 소수성 표면(hydrophobic surface)이 포함된다. 구리 부위는 전자 전달 기능을 위하여 최적화되고, 네거티브와 소수성 패치는 생리학적 반응 파트너의 인식에 관여하는 것으로 제안된다. 화학적 변형, 교차-결합, 특정부위 돌연변이 유발 실험은 시토크롬 f와의 결합 상호작용에서 네거티브와 소수성 패치의 중요성을 확인하고, 플라스토시아닌이 관여하는 2가지 기능적으로 중요한 전자 전달 통로의 모형을 확인하였다. 첫 번째 추정 전자 전달 통로는 상대적으로 짧고(대략 4 Å) 소수성 패치 내에 용제-노출된 구리 리간드 His-87을 수반하는 반면, 다른 통로는 더욱 길고(대략 12-15 Å) 네거티브 패치 내에 거의 보존된 잔기 Tyr-83을 수반한다(Redinbo et al., J. Bioenerg. Biomembr. 26(1):49-66 (1994)).

루스티시아닌

루스티시아닌은 티오바실루스(Thiobacillus)(현재, Acidithiobacillus)로부터 획득된 청동-보유 단일-사슬 폴리펩티드이다. 티오바실루스 페로옥시단스(Thiobacillus ferrooxidans)로부터 극히 안정한 고도 산성화 쿠프레독신 루스티시아닌(SEQ ID NO: 4)의 산화된 형태의 X-레이 결정 구조는 다파장 비정상 회절(multiwavelength anomalous diffraction)로 결정되었고 1.9 Å 해상도에서 세밀히 구별되었다. 루스티시아닌은 6-개와 7-개 가닥 β-시트로 구성되는 코어 베타-샌드위치 접힘(core beta-sandwich fold)으로 구성된다. 다른 쿠프레독신과 유사하게, 구리 이온은 뒤틀린 4배위자리 내에 정렬된 4개의 보존된 잔기의 클러스터(His85, Cys138, His143, Met148)에 의해 동위(coordination)된다(Walter et al., J. Mol. Biol. 263:730-51 (1996)).

슈도아주린

슈도아주린은 청동-보유 단일-사슬 폴리펩티드 집단이다. 아크로모박터 시클로클라스테스(Achromobacter cycloclastes)로부터 획득된 슈도아주린의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 5에서 열거된다. 슈도아주린의 X-레이 구조 분석 결과는 슈도아주린이 아주린과의 서열 상동성(sequence homology)이 낮긴 하지만 아주린에 유사한 구조를 갖는다는 것을 보여준다. 2가지 주요한 차이는 슈도아주린과 아주린의 전체 구조 사이에 존재한다. 아주린과 비교하여 슈도아주린에는 2개의 알파-나선으로 구성되는 카르복시 말단 신장이 존재한다. 중간-펩티드 영역에서, 아주린은 슈도아주린에 비하여 연장된 루프를 보유하는데, 이는 짧은 α-나선을 보유하는 플랩(flap)을 형성한다. 구리 원자 부위에서 유일한 주요 차이점은 MET 측쇄의 형태(conformation)와 Met-S 구리 결합 길이인데, 상기 길이는 아주린에서보다 슈도아주린에서 훨씬 짧다.

피토시아닌

피토시아닌(phytocyanin)으로 확인된 단백질에는 오이 기초 단백질, 스텔라시아닌, 마비시아닌(mavicyanin), 우메시아닌(umecyanin), 오이 껍질(cucumber peeling) 쿠프레독신, 피 파드(pea pod)에서 추정 청동 단백질, 애기장대(Arabidopsis thaliana)로부터 청동 단백질이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 오이 기초 단백질과 피-파드 단백질을 제외하고, 청동 부위에서 통상적으로 관찰되는 축 메티오닌 리간드(axial methionine ligand)가 글루타민(glutamine)으로 대체된다.

아우라시아닌

아우라시아닌 A, 아우라시아닌 B-1, 아우라시아닌 B-2로 명명된 3개의 작은 청동 단백질이 호열성 녹색 활주 광합성 세균(thermophilic green gliding photosynthetic bacterium) 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터 분리되었다. 이들 2가지 B 형태는 당단백질이고 서로 거의 동일한 특성을 갖지만 A 형태와는 상이하다. 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에서, 겉보기 단량체 분자질량(apparent monomer molecular mass)이 14(A), 18(B-2), 22(B-1) kDa인 것으로 확인되었다.

아우라시아닌 A의 아미노산 서열은 139개 잔기의 폴리펩티드인 것으로 밝혀졌다(Van Dreissche et al, Protein Science 8:947-957 (1999)). His58, Cys123, His128, Met132는 이들이 공지된 소형 구리 단백질 플라스토시아닌과 아주린에서처럼 진화적으로 보존된 금속 리간드인 경우에 예상되는 방식으로 일정한 거리를 두고 위치한다. 2차 구조 예측 역시 아우라시아닌이 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 아주린 및 포플러 잎으로부터 플라스토시아닌의 베타-배럴 구조와 전반적으로 유사한 베타-배럴 구조를 갖는다는 것을 암시한다. 하지만, 아우라시아닌은 양쪽 소형 구리 단백질 서열의 서열 특징을 모두 갖는 것으로 보인다. 아주린의 공통 서열과 전반적인 유사성은 플라스토시아닌의 공통 서열과의 유사성과 거의 동일하다(다시 말하면, 30.5%). 아우라시아닌의 N-말단 서열 영역 1-18은 글리신과 하이드록시 아미노산이 눈에 띄게 풍부하다(Id). 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터 아우라시아닌의 사슬 A에 대한 전형적인 아미노산 서열 SEQ ID NO: 15(NCBI Protein Data Bank Accession No. AAM12874)를 참조한다.

아우라시아닌 B 분자는 표준 쿠프레독신 접힘을 보유한다. 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터 아우라시아닌 B의 결정 구조가 조사되었다(Bond et al., J. Mol. Biol. 306:47-67 (2001)). 부가적인 N-말단 가닥을 제외하고, 상기 분자는 세균 쿠프레독신, 아주린과 매우 유사하다. 다른 쿠프레독신에서처럼, Cu 리간드 중에서 하나는 상기 폴리펩티드의 가닥 4에 위치하고, 다른 3개는 가닥 7과 8 사이의 대형 루프를 따라서 위치한다. Cu 부위 기하학은 3개의 후자 리간드 사이에 아미노산 간격(amino acid spacing)을 참조하여 논의된다. 아우라시아닌 B의 결정학적으로 특성화된 Cu-결합 도메인은 아마도, 막-결합된 여러 다른 전자-전달 단백질 내에서 공지된 사슬(tether)과 현저한 서열 동일성을 보이는 N-말단 꼬리에 의해 세포질 막의 주변세포질(periplasmic) 부분에 속박된다. B 형태의 아미노산 서열은 McManus et al., J Biol Chem. 267:6531-6540 (1992)에서 제시된다. 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터 아우라시아닌의 사슬 B에 대한 전형적인 아미노산 서열 SEQ ID NO: 16(NCBI Protein Data Bank Accession No. 1QHQA)을 참조한다.

스텔라시아닌

스텔라시아닌은 식물 쿠프레독신의 편재성 집단, 피토시아닌의 하위분류이다. 본 명세서에서 스텔라시아닌의 전형적인 서열은 SEQ ID NO: 14에서 열거된다. 양고추냉이 뿌리로부터 스텔라시아닌, 우메시아닌(umecyanin)(Koch et al., J. Am. Chem . Soc. 127:158-166(2005))과 오이 스텔라시아닌(Hart et al., Protein Science 5:2175-2183(1996))의 결정 구조 역시 공지되어 있다. 상기 단백질은 다른 피토시아닌과 유사한 전체 접힘을 보유한다. ephrinB2 단백질 엑토도메인 3차 구조는 스텔라시아닌에 현저한 유사성을 갖는다(Toth et al., Developmental Cell1 :83-92(2001)). 스텔라시아닌의 전형적인 아미노산 서열은 SEQ ID NO:14(National Center for Biotechnology Information Protein DataBank Accession No. 1JER)에서 확인된다.

오이 기초 단백질

오이 기초 단백질로부터 전형적인 아미노산 서열은 본 명세서에서 SEQ ID NO: 17에서 열거된다. 1형 청동 단백질, 오이 기초 단백질(CBP)의 결정 구조는 1.8 해상도에서 세밀히 구별되었다. 상기 분자는 그리스 열쇠 베타-배럴 구조를 보유하는 점에서 다른 청동 단백질과 유사하지만, 상기 배럴은 한 측면에서 개방되고 “베타-샌드위치(beta-sandwich)” 또는 “베타-타코(beta-taco)”로서 기술된다(Guss et al., J. Mol. Biol. 262:686-705 (1996)). 이러한 ephrinB2 단백질 엑토도메인 3차 구조는 오이 기초 단백질에 높은 유사성을 갖는다(50 α 탄소에 대한 rms 편차 1.5)(Toth et al., Developmental Cell 1: 83-92(2001)).

Cu 원자는 결합 길이 Cu-N(His39) = 1.93 , Cu-S(Cys79) = 2.16 , Cu-N(His84) = 1.95 , Cu-S(Met89) = 2.61 로, 정상적인 청동 NNSS' 동위(co-ordination)를 갖는다. 이황화 연결, (Cys52)-S-S-(Cys85)는 이러한 분자 구조를 안정화시키는데 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 폴리펩티드 접힘은 청동 단백질(피토시아닌)의 부분집합(sub-family) 및 CBP가 높은 서열 상동을 갖는 비-금속단백질(non-metalloprotein), 돼지풀 알레르겐(ragweed allergen) Ra3에 전형적이다. 현재 피토시아닌으로 확인된 단백질은 CBP, 스텔라시아닌, 마비시아닌, 우메시아닌, 오이 껍질 쿠프레독신, 피 파드에서 추정 청동 단백질, 애기장대(Arabidopsis thaliana)로부터 청동 단백질이다. CBP와 피-파드 단백질을 제외하고, 청동 부위에서 통상적으로 관찰되는 축 메티오닌 리간드가 글루타민으로 대체된다. 오이 기초 단백질에 대한 전형적인 서열은 SEQ ID NO: 17(NCBI Protein Data Bank Accession No. 2CBP)에서 확인된다.

이용 방법

본 발명에서는 암으로 고통받거나, 암으로부터 회복 중이거나, 암으로부터 회복되었거나, 또는 암에 걸릴 위험이 있는 포유동물 환자를 치료하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 앞서 기술된 바와 같이, 쿠프레독신, 또는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체인 적어도 하나의 폴리펩티드를 상기 환자에 투여하는 단계를 포함한다. 구체적으로, 본 발명의 조성물로 치료되는 암에는 흑색종, 유방암, 췌장암, 아교모세포종, 별아교세포종, 또는 폐암이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 더 나아가, 본 발명에서는 부적절한 혈관신생에 관련된 다른 질환으로 고통받거나, 이런 질환으로부터 회복 중이거나, 이런 질환으로부터 회복되었거나, 또는 이런 질환에 걸릴 위험이 있는 포유동물 환자를 치료하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 쿠프레독신, 또는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체인 적어도 하나의 폴리펩티드를 상기 환자에 투여하는 단계를 포함한다. 이들 질환에는 신생혈관성 연령-관련 황반 변성(neovascular age-related macular degeneration), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 건선(psoriasis), 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 특정 구체예에서, 환자는 인간이다.

이에 더하여, 본 발명에는 혈관신생을 조사하는 방법이 포함되는데, 상기 방법은 포유동물 세포를 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 함유하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 세포는 HUVEC이고, 다른 구체예에서, 세포는 혈관신생이 진행되는 다른 세포이다. 더 나아가, 본 발명의 방법에는 부적절한 혈관신생에 관련된 장애를 조사하는 방법이 포함되는데, 상기 방법은 포유동물 세포를 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 함유하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 이들 방법에서, 세포는 이러한 장애로 고통받는 포유동물 환자에서 혈관신생이 진행되는 세포이다.

쿠프레독신, 또는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 함유하는 조성물은 당업자에게 널리 공지된 여러 경로에 의해 다양한 섭생(regimen)으로 환자에 투여될 수 있다. 특정한 구체예에서, 쿠프레독신, 또는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 기능적 등가체는 정맥내, 근육내, 피하 또는 안구내 투여된다. 이들 조성물은 부적절한 혈관신생의 부위에 이들 펩티드를 전달하는 임의의 수단으로 환자에 투여될 수 있다.

한 구체예에서, 이들 방법은 쿠프레독신, 또는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 함유하는 조성물의 1 단위 용량(unit dose) 및 다른 항암제를 함유하는 조성물의 1 단위 용량을 순차적으로, 거의 동시에, 또는 다른 약제의 투여이후 일정한 시간 이내에, 예를 들면, 다른 약제의 투여이후 대략 1분 내지 60분 이내에, 또는 다른 약제의 투여이후 대략 1시간 내지 12시간 이내에 환자에 공동-투여하는 단계를 포함한다. 이런 약제에는 예로써, 본 명세서에 기술된 것들, 구체적으로, 5-플루오르우라실(fluorouracil); 인터페론 α; 메토트렉세이트(Methotrexate); 타목시펜(Tamoxifen); 빈크리스틴(Vincrinstine)이 포함된다. 이들 실례는 예시의 목적으로 제공되며, 이와 같은 많은 다른 화합물이 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명의 화합물은 방사선 요법 및 수술과 병용될 수도 있다.

암을 치료하는데 적합한 다른 약제에는 알킬화제(alkylating agent), 예를 들면, 질소 겨자(nitrogen mustard), 알킬 설포네이트(alkyl sulfonate), 니트로소우레아(nitrosourea), 에틸렌이민(ethylenimine), 트리아젠(triazene); 대사길항물질(antimetabolite), 예를 들면, 엽산염 길항제(folate antagonist), 퓨린 유사체(purine analogue), 피리미딘 유사체(pyrimidine analogue); 항생제, 예를 들면, 안트라사이클린(anthracycline), 블레오마이신(bleomycin), 미토마이신(mitomycin), 닥티노마이신(dactinomycin), 플리카마이신(plicamycin); 효소, 예를 들면, L-아스파라기나아제; 파르네실(farnesyl)-단백질 이전효소 저해물질; 5.알파.-환원효소 저해물질; 17.베타.-하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제(hydroxysteroid dehydrogenase) 타입 3의 저해물질; 호르몬제, 예를 들면, 글루코코르티코이드(glucocorticoid), 에스트로겐(estrogen)/항에스트로겐(antiestrogen), 안드로겐(androgen)/항안드로겐(antiandrogen), 프로제스틴(progestin), 황체 형성 호르몬-방출 호르몬 길항제(luteinizing hormone-releasing hormone) 길항제, 옥트레오티드 아세테이트(octreotide acetate); 미세소관-교란제(microtubule-disruptor agent), 예를 들면, 엑티나시딘(ecteinascidin) 또는 이들의 유사체와 유도체; 미세소관-안정화제(microtubule-stabilizing agent), 예를 들면, 파클리탁셀(paclitaxel)(Taxol™), 도세탁셀(docetaxel)(Taxotere™), 이들의 유사체와 같은 탁산(taxane) 및 에포틸론(epothilone) A-F와 이들의 유사체와 같은 에포틸론; 식물-유래된 산물, 예를 들면, 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid), 에피포도필로톡신(epipodophyllotoxin), 탁산; 위상이성질화효소(topoisomerase) 저해물질; 프레닐(prenyl)-단백질 이전효소 저해물질; 기타 약제, 예를 들면, 하이드록시우레아(hydroxyurea), 프로카르바진(procarbazine), 미토탄(mitotane), 헥사메틸멜라민(hexamethylmelamine), 백금 배위 착화물(platinum coordination complex), 예를 들면, 시스플라틴(cisplatin)과 카보플라틴(carboplatin); 항암제와 세포독성제로서 이용되는 다른 약제, 예를 들면, 생물 반응 조절제(biological response modifier), 성장 인자(growth factor); 면역조절제(immune modulator)와 면역 항체(monoclonal antibody)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

이들 부류의 항암제와 세포독성제의 대표적인 실례에는 메클로레타민 하이드로클로라이드(mechlorethamine hydrochloride), 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 클로람부실(chlorambucil), 멜팔란(melphalan), 이포스파마이드(ifosfamide), 부설판(busulfan), 카르무스틴(carmustin), 로무스틴(lomustine), 세무스틴(semustine), 스트렙토조신(streptozocin), 티오테파(thiotepa), 다카르바진(dacarbazine), 메토트렉세이트(methotrexate), 티오구아닌(thioguanine), 메르캅토퓨린(mercaptopurine), 플루다라빈(fludarabine), 펜타스타틴(pentastatin), 클라드리빈(cladribin), 시타라빈(cytarabine), 플루오르우라실(fluorouracil), 독소루비신 하이드로클로라이드(doxorubicin hydrochloride), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin), 블레오마이신 설페이트(bleomycin sulfate), 미토마이신(mitomycin) C, 악티노마이신(actinomycin) D, 사프라신(safracin), 사프라마이신(saframycin), 퀴노카르신(quinocarcin), 디스코데르몰리드(discodermolide), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 비노렐빈 주석산염(vinorelbine tartrate), 에토포시드(etoposide), 에토포시드 인산염(etoposide phosphate), 테니포시드(teniposide), 파클리탁셀(paclitaxel), 타목시펜(tamoxifen), 에스트라무스틴(estramustine), 에스트라무스틴 인산염 나트륨(estramustine phosphate sodium), 플루타마이드(flutamide), 부세렐린(buserelin), 레우프롤리드(leuprolide), 프테리딘(pteridine), 디에네세스(diyneses), 레바미솔(levamisole), 아플라콘(aflacon), 인터페론(interferon), 인터루킨(interleukin), 알데스루킨(aldesleukin), 필그라스팀(filgrastim), 사르그라모스팀(sargramostim), 리툭시맙(rituximab), BCG, 트레티노인(tretinoin), 이리노테칸 하이드로클로라이드(irinotecan hydrochloride), 베타메타손(betamethosone), 젬시타빈 하이드로클로라이드(gemcitabine hydrochloride), 알트레타민(altretamine), 토포테카(topoteca), 이들의 유사체 또는 유도체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

이들 부류의 선호되는 구성원에는 파클리탁셀(paclitaxel), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 독소루비신(doxorubicin), 카르미노마이신(carminomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 아미노프테린(aminopterin), 메토트렉세이트(methotrexate), 메토프테린(methopterin), 미토마이신(mitomycin) C, 엑틴아시딘(ecteinascidin) 743, 또는 포피로마이신(pofiromycin), 5-플루오르우라실(fluorouracil), 6-메르캅토퓨린(mercaptopurine), 젬시타빈(gemcitabine), 시토신 아라비노시드(cytosine arabinoside), 포도필로톡신(podophyllotoxin) 또는 포도필로톡신 유도체, 예를 들면, 에포토시드(etoposide), 에토포시드 인산염(etoposide phosphate) 또는 테니포시드(teniposide), 멜팔란(melphalan), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 레우로시딘(leurosidine), 빈데신(vindesine), 레우로신(leurosine)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

본 발명의 조성물과의 공동-투여에 유용한 항암제와 다른 세포독성제의 실례는 German Patent No. 4138042.8; WO 97/19086, WO 98/22461, WO 98/25929, WO 98/38192, WO 99/01124, WO 99/02224, WO 99/02514, WO99/03848, WO 99/07692, WO 99/27890, WO 99/28324, WO 99/43653, WO 99/54330, WO 99/54318, WO 99/54319, WO 99/65913, WO 99/67252, WO 99/67253, WO 00/00485에 기술된 에포틸론(epothilone) 유도체; WO 99/24416(참조: U.S. Pat. No. 6,040,321)에 기술된 사이클린 의존성 키나아제(cyclin dependent kinase) 저해물질; WO 97/30992와 WO 98/54966에 기술된 프레닐-단백질 이전효소 저해물질; U.S. Pat. No. 6,011,029(상기 U.S. 특허의 화합물은 임의의 NHR 조절제(본 발명에 기술된 것들 포함), 예를 들면, AR 조절제, ER 조절제 또는 LHRH 조절제와 함께, 또는 외과적 기술과 함께 이용될 수 있다)에 포괄적으로/구체적으로 기술된 것들과 같은 작용제 등이다.

다른 구체예에서, 쿠프레독신, 또는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 기능적 등가체는 신생혈관성 연령-관련 황반 변성의 치료를 위한 약제와 공동-투여된다. 이런 약제에는 Lucentis(Genetech, South San Francisco CA, 라니비주맙(Ranibizumab), 유리체 주입), Macugen(OSI Pharmaceuticals, Melville NY, 페가프타닙(pegaptanib), 유리체 주입), Retaane(Alcon, Fort Worth TX, 아네코르타베(Anecortave), 측공막 후부(posterior juxtascleral) 주입), AdPEDF(GenVec, Gaithersburg MD, 항-혈관신생 유전자 치료제(anti-angiogenic gene therapy), 근주(intravitreal) 또는 서브-테논(sub-Tenon) 주입), EVIZON(Genaera, Plymouth Meeting, PA, 항-혈관신생 아미노스테롤(anti-angiogenic aminosterol), 스쿠알라민(Squalamine), 정맥내 주입), 콤브레타스타틴(Combretastatin) AAdPEDF4 프로드러그(OXiGENE, Waltham MA, CA4P, 혈관 표적화제(Vascular Targeting agent)), Cand5(Acuity Pharmaceuticals, Inc., Philadelphia PA, 혈관 내피 성장 인자(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)를 표적하는 siRNA), Sirna-027(Sirna Therapeutics, San Francisco, CA, 혈관 내피 성장 인자 수용체-1(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1, VEGFR-1)을 표적하는 siRNA), PDT를 포함하는 셀레콕시브(Celecoxib)(Celebrex, 경구 소염제), Envision TD(Control Delivery Systems, Watertown, MA, 유리체 내에 플루오시놀론(fluocinolone) 이식 서방 스테로이드 이식물)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

다른 구체예에서, 쿠프레독신, 또는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 기능적 등가체는 당뇨병성 망막증의 치료를 약제와 공동-투여된다. 외과적 처리(surgical treatment) 역시 본 발명의 조성물과의 공동-치료(co-treatment)로서 고려된다.

다른 구체예에서, 쿠프레독신, 또는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 기능적 등가체는 건선 치료를 위한 약제와 공동-투여된다. 이런 약제에는 Amevive, Raptiva, Enbrel, Humira, Remicade, 사이클로스포린(Cyclosporine), Neoral, 메토트렉세이트(Methotrexate), Soriatane, Accutane, Hydrea, 마이코페놀레이트 모페틸(Mycophenolate Mofetil), 설파살라진(sulfasalazine), 6-티오구아닌(6-Thioguanine)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

다른 구체예에서, 쿠프레독신, 또는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 기능적 등가체는 류머티스 관절염의 치료를 위한 약제와 공동-투여된다. 이런 약제에는 메토트렉세이트(Methotrexate)(Rheumatrex, Folex PFS), 설파살라진(Sulfasalazine)(Azulfidine), 레플루노미드(Leflunomide)(Arava), 금염(Gold salt)(aurothiomalate, auranofin [Ridaura]), D-페니실라민(D-penicillamine), 하이드록시클로로퀸(Hydroxychloroquine)(Plaquenil), 아자티오프린(Azathioprine)(Imuran), 사이클로스포린(Cyclosporine)(Neoral), 에타네르셉트(Etanercept)(Enbrel), 인플릭시맙(Infliximab)(Remicade), 아달리무맙(Adalimumab)(Humira), 아나킨라(Anakinra)(Kineret), 아바타셉트(Abatacept)(Orencia), 프레드니손(Prednisone)(Deltasone, Meticorten, Orasone), 베타메타손(Betamethasone)(Celestone), 비-스테로이드성 소염제(Nonsteroidal anti-inflammatory drug, NSAID), COX-2 저해물질(celecoxib, Celebrex)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

쿠프레독신 , 또는 쿠프레독신의 변이체 , 유도체 또는 구조적 등가체를 함유하는 제약학적 조성물

쿠프레독신, 또는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 함유하는 제약학적 조성물은 임의의 통상적인 방식, 예를 들면, 통상적인 혼합, 분해, 과립화, 당의정-만들기, 에멀젼화, 캡슐화, 포획, 또는 냉동 건조 과정으로 제조될 수 있다. 실질적으로 순수한 또는 제약학적 등급 쿠프레독신, 또는 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 당분야에 공지된 제약학적으로 허용되는 담체와 용이하게 혼합될 수 있다. 이들 담체는 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액체, 젤, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로의 제조를 가능하게 한다. 적절한 담체 또는 부형제에는 예로써, 충전제와 셀룰로오스 제조물이 포함될 수 있다. 다른 부형제에는 예로써, 향료, 착색제, 디태크피어(detackifier), 농후제(thickness) 및 다른 허용되는 첨가제, 어쥬번트 또는 결합제가 포함될 수 있다. 일부 구체예에서, 제약학적 제조물은 보존제가 실질적으로 존재하지 않는다. 다른 구체예에서, 제약학적 제조물은 적어도 하나의 보존제를 함유한다. 제약학적 제형(dosage form)에 관한 전반적인 방법은 Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Lippencott Williams & Wilkins, Baltimore MD (1999))에서 확인된다.

본 발명에 이용되는 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 함유하는 조성물은 주사(가령, 피내, 피하, 근육내, 복강내 등), 흡입, 국소 투여, 좌약, 경피 패치 또는 경구를 비롯한 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 약제 전달 시스템에 관한 전반적인 정보는 Ansel et al.,Id..에서 확인할 수 있다. 일부 구체예에서, 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 함유하는 조성물은 특히, 피하 주사와 정맥내 주사를 위한 주사가능물질(njectible)로서 제조되고 직접 이용될 수 있다. 이러한 주사가능 제제는 특히, 부적절한 혈관신생에 관련된 장애의 위험이 있거나, 이런 질환에 걸릴 가능성이 있거나, 또는 이런 질환에 걸린 화자를 치료하는데 유익하게 이용될 수 있다. 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 함유하는 조성물은 또한, 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol)과 같은 보호제(protective agent), 또는 유사한 코팅제(coating agent)와의 혼합이후 경구 복용될 수 있다.

주사로 투여되는 경우에, 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 수용액, 바람직하게는, 생리 적합성 완충제, 예를 들면, Hanks 용액, 링거액, 또는 생리 식염수 내에서 제조된다. 용액은 제제 약물(formulatory agent), 예를 들면, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유한다. 대안으로, 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 사용에 앞서, 적절한 운반제, 예를 들면, 발열원 없는 무균수로 구성(constitution)을 위한 분말 형태로 조제된다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 어쥬번트(adjuvant) 또는 이러한 펩티드에 의해 자극되는 면역 반응을 강화시키기 위하여 추가되는 임의의 다른 물질을 함유하지 않는다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 이러한 펩티드에 면역 반응을 저해하는 물질을 함유한다.

정맥액(intravenous fluid)으로 투여되는 경우에, 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 투여하기 위하여 이용되는 정맥액은 결정질(crystalloid) 또는 콜로이드(colloid)로 구성될 수 있다. 본 명세서에서 결정질은 무기 염 또는 다른 수용성 분자의 수용액이다. 본 명세서에서 콜로이드에는 젤라틴(gelatin)과 같은 대형 불용성 분자가 포함된다. 정맥액은 무균이다.

정맥내 투여에 이용되는 결정질액(crystalloid fluid)에는 표 2에 기술된 바와 같이, 정상 염수(0.9% 농도에서 염화나트륨 용액), 링거 락테이트(Ringer's lactate) 또는 링거액(Ringer's solution), 물에 녹인 5% 덱스트로스 용액(일명, D5W)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

공통 결정질 용액의 조성

용액	다른 명칭	[Na ⁺ ]	[Cl ^- ]	[글루코오스]
D5W	5% 덱스트로스	0	0	252
2/3 & 1/3	3.3% 덱스트로스/ 0.3% 염수	51	51	168
반-정상 염수	0.45% NaCl	77	77	0
정상 염수	0.9% NaCl	154	154	0
링거 락테이트*	링거액	130	109	0

^*링거 락테이트는 28 mmol/ℓ 락테이트, 4 mmol/ℓ K⁺, 3 mmol/ℓ Ca² ⁺역시 함유한다.

흡입으로 투여되는 경우에, 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 적절한 추진제(propellant), 예를 들면, 디클로로디플루오르메탄, 트리클로로플루오르메탄, 이산화탄소 또는 다른 적절한 가스를 이용한, 가압된 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이의 형태로 전달된다. 가압된 에어로졸의 경우에, 투약 단위(dosage unit)는 정량을 전달하는 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 예로써, 흡입기 또는 취입기에 이용되는 젤라틴의 캡슐과 카트리지는 단백질 및 적절한 분말 기부(base), 예를 들면, 락토오스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하도록 제조된다.

국소 투여되는 경우에, 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 당분야에 널리 공지된 바와 같이, 용액, 겔, 연고, 크림, 젤리, 현탁액 등으로 제조된다. 일부 구체예에서, 투여는 경피 패치에 의해 달성된다. 좌약(가령, 직장 또는 질)으로 투여되는 경우에, 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 통상적인 좌약 기부(suppository base)를 함유하는 조성물 형태로 제조된다.

경구 투여되는 경우에, 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 이러한 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 당분야에 널리 공지된 제약학적으로 허용되는 담체와 혼합함으로써 용이하게 제조될 수 있다. 고형 담체, 예를 들면, 만니톨, 락토오스, 스테아르산마그네슘 등이 이용된다; 이들 담체는 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체가 치료되는 개체에 의한 경구 섭취용으로 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제조될 수 있도록 한다. 경구 고형 제제, 예를 들면, 분말, 캡슐, 정제에 적합한 부형제에는 충전제(가령, 당), 셀룰로오스 제조물, 과립화제, 결합제 등이 포함된다.

당분야에 널리 공지된 다른 통상적인 담체에는 다가 담체, 예를 들면, 세균 캡슐 다당류, 덱스트란 또는 유전자 조작된 벡터 역시 포함된다. 이에 더하여, 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 함유하는 서방 제제는 연장된 기간 동안 이러한 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 방출하는데, 이런 서방 제제가 없는 경우에 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 치료 효과를 유도하거나 강화하기에 앞서, 예로써 프로테아제 및 간단한 가수분해에 의해 개체의 조직으로부터 제거되고 및/또는 분해된다.

본 발명의 펩티드의 혈류에서 반감기는 당업자에게 널리 공지된 여러 방법으로 연장되거나 최적화될 수 있다. 본 발명의 펩티드 변이체에는 혈관신생을 저해하고, 포유동물 암 세포 내로 침투하고 및/또는 포유동물 암 세포의 성장을 저해하는 쿠프레독신의 능력을 유지하면서, 상기 펩티드의 안정성(stability), 비활성(specific activity), 혈류 내에서 수명(longevity)을 증가시키고 및/또는 면역원성(immunogenicity)을 감소시키는 다양한 변이체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이런 변이체에는 펩티드의 가수분해(hydrolysis)를 감소시키거나, 펩티드의 탈아민화(deamidation)를 증가시키거나, 산화(oxidation)를 감소시키거나, 면역원성을 감소시키거나, 펩티드의 구조적 안정성(structural stability)을 증가시키거나, 또는 펩티드의 크기를 증가시키는 변이체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이런 펩티드에는 원형화된 펩티드(circularized peptide)(Monk et al., BioDrugs 19(4):261-78, (2005); DeFreest et al., J. Pept. Res. 63(5):409-19 (2004)), D,L-펩티드(부분입체이성질체)(Futaki et al., J. Biol. Chem. Feb 23;276(8):5836-40 (2001); Papo et al., Cancer Res. 64(16):5779-86 (2004); Miller et al, Biochem. Pharmacol. 36(1):169-76, (1987)), 특수한 아미노산을 보유하는 펩티드(Lee et al., J. Pept. Res. 63(2):69-84 (2004)), N-과 C-말단 변형(Labrie et al., Clin. Invest. Med. 13(5):275-8, (1990)), 탄화수소 스테이플링(hydrocarbon stapling)(Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892(2000); Walenski et al., Science 305:1466-1470(2004)), PEG화(PEGylation) 역시 포함된다. 특히, d-이성질화(isomerization)(치환) 및 D-치환 또는 L-아미노산 치환에 의한 펩티드 안정성(peptide stability)의 변형이 주목된다.

다양한 구체예에서, 제약학적 조성물은 담체와 부형제(완충제, 탄수화물, 만니톨, 단백질, 폴리펩티드 또는 아미노산(가령, 글리신), 항산화제, 세균발육 저해제, 킬레이트화제, 현탁제, 농후제 및/또는 보존제 포함), 물, 오일, 염수 용액, 수성 덱스트로스와 글리세롤 용액, 생리 조건을 근사하기 위하여 요구되는 다른 제약학적으로 허용되는 보조 물질(가령, 완충제, 긴장도 조절제(tonicity adjusting agent), 적심제(wetting agent) 등)을 함유한다. 당업자에게 공지된 임의의 담체가 본 발명의 조성물을 투여하는데 이용될 수 있긴 하지만, 담체의 유형은 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 화합물은 널리 공지된 기술을 이용하여 리포좀 내에 피포될 수도 있다. 생물분해성 마이크로스피어 역시 본 발명의 제약학적 조성물에 대한 담체로서 이용될 수 있다. 적절한 생물분해성 마이크로스피어는 예로써, U.S. Patent No. 4,897,268; 5,075,109; 5,928,647; 5,811,128; 5,820,883; 5,853,763; 5,814,344; 5,942,252에서 기술된다.

이들 제약학적 조성물은 널리 공지된 통상적인 멸균 기술로 멸균되거나, 또는 멸균 여과될 수 있다. 생성된 수용액은 원상태로 포장되거나, 또는 냉동 건조되는데, 이러한 냉동 건조된 제조물은 투여에 앞서 무균 용액과 혼합된다.

쿠프레독신 , 또는 이의 변이체 , 유도체 또는 구조적 등가체의 투여

쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 제약학적 조성물로서 제조되고, 임의의 적절한 경로에 의해, 예를 들면, 경구, 협측, 흡입, 설하, 직장, 질, 경요도(transurethral), 비강, 국소, 경피, 다시 말하면, 경피 또는 비경구(정맥내, 근육내, 피하, 관상동맥내 포함), 또는 유리체 투여에 의해 투여될 수 있다. 이의 제약학적 제제는 의도된 목적을 달성하는 효과량으로 투여될 수 있다. 더욱 구체적으로, 조성물은 치료 효과량으로 투여된다. 특정한 구체예에서, 치료 효과량은 일반적으로, 체중 ㎏당 대략 0.01-20 ㎎/㎏이다.

쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 포함하는 화합물은 단독으로 또는 다른 활성제와의 조합으로, 부적절한 혈관신생에 관련된 장애의 치료 및/또는 예방에 유용하다. 적절한 용량은 예로써, 이용된 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체의 화합물, 호스트(host), 투여 방식, 치료되는 질환의 특성과 심각도에 따라 달라질 것이다. 하지만, 일반적으로, 인간에서 만족스런 결과는 체중 ㎏당 대략 0.01 내지 20 ㎎의 일일 용량(daily dosage)에서 달성되는 것으로 지정된다. 인간에서 지정된 일일 용량은 예로써, 1일 분량, 1주일 분량, 1개월 분량 및/또는 연속 투약(continuous dosing)으로 편의하게 투여되는 대략 0.7 ㎎ 내지 1400 ㎎ 범위의 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체의 화합물이다. 1일 분량은 1일 1회 내지 12회 불연속적으로 투약될 수 있다. 대안으로, 분량은 2일마다, 3일마다, 4일마다, 5일마다, 6일마다, 1주일마다, 이와 유사하게 최대 31일 이상까지 하루씩 증가하여 투약될 수 있다. 대안으로, 투약은 패치, i.v. 투여 등을 이용한 연속 투약일 수 있다.

정확한 제제, 투여 경로, 용량은 환자의 상태를 고려하여 담당 의사에 의해 결정된다. 용량과 휴지기는 치료 효과를 유지할 만큼 충분한 혈장 수준의 활성 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 제공하기 위하여 개별적으로 조정될 수 있다. 일반적으로, 원하는 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 의도된 투여 경로와 표준 제약학적 관례에 따라 선택된 제약학적 담체와의 혼합물로 투여된다.

한 측면에서, 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 DNA로서 전달되고, 이러한 폴리펩티드가 in situ에서 산출된다. 한 구체예에서, DNA는 예로써, Ulmer et al., Science, Vol.259, pp-1745-49(1993)에 기술되고 Cohen, Science, vol.259, pp-1691-92(1993)에서 검토된 바와 같이 “나신(naked)”이다. 나신 DNA의 흡수는 DNA를 담체, 예를 들면, 세포 내로 효과적으로 운반되는 생물분해성 비드 상에 코팅함으로써 증가될 수 있다. 이런 방법에서, DNA는 핵산 발현 시스템, 세균 발현 시스템, 바이러스 발현 시스템을 비롯한 당업자에게 공지된 다양한 전달 시스템 내에 존재한다. DNA를 이런 발현 시스템 내로 통합하는 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다(참조: WO90/11092, WO93/24640, WO93/17706, U.S. Pat. No. 5,736,524).

생물체로부터 생물체로 유전 물질을 이동시키는데 사용되는 벡터는 크게 2가지 부류로 구분될 수 있다: 클로닝 벡터는 적합한 숙주 세포 내에서 증식에 필수적이고 외래 DNA가 삽입될 수 있는 영역을 보유하는 복제 플라스미드 또는 파지이다; 외래 DNA는 벡터의 구성요소인 것처럼 복제되고 증식된다. 발현 벡터(가령, 플라스미드, 효모 또는 동물 바이러스 게놈)는 외래 DNA, 예를 들면, 쿠프레독신의 DNA를 전사하고 번역하기 위하여 숙주 세포 또는 조직 내로 외래 유전물질을 도입하는데 이용된다. 발현 벡터에서, 도입된 DNA는 삽입된 DNA를 고도로 전사하도록 숙주 세포에 신호하는 프로모터와 같은 요소에 작동가능하게 연결된다. 특정 인자에 대응하여 유전자 전사를 조절하는 유도성 프로모터와 같은 일부 프로모터가 특히 유용하다. 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체 폴리뉴클레오티드를 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결하면, 특정 인자에 대응하여 쿠프레독신 및 이의 변이체와 유도체의 발현을 조절할 수 있다. 고전적인 유도성 프로모터의 실례는 α-인터페론, 열 충격, 중금속 이온 및 스테로이드, 예를 들면, 글루코코르티코이드(Kaufman, Methods Enzymol. 185:487-511 (1990))와 테트라사이클린에 반응하는 프로모터이다. 다른 바람직한 유도성 프로모터는 이러한 구조체가 삽입되는 세포에 내인성이 아니지만 유도 인자(induction agent)가 외부로부터 공급되면 이들 세포에서 반응하는 프로모터이다. 일반적으로, 유용한 발현 벡터는 주로 플라스미드이다. 하지만, 다른 형태의 발현 벡터, 예를 들면, 바이러스 벡터(가령, 복제 결함성 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스) 역시 고려된다.

벡터 선택은 이용되는 생물체 또는 세포 및 벡터의 원하는 목적에 좌우된다. 일반적으로, 벡터는 신호 서열, 복제 기점, 마커 유전자, 폴리링커 부위(polylinker site), 인헨서 요소, 프로모터, 전사 종결 서열을 포함한다.

쿠프레독신 , 또는 이의 변이체 , 유도체 또는 구조적 등가체를 포함하는 키트

한 측면에서, 본 발명에서는 포장 또는 용기 내에 (1) 적어도 하나의 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 함유하는 생물학적 활성 조성물; (2) 항-바이러스제 또는 항균제, 구체적으로, 항암제, 항-황반 변성 약제, 항-건선 약제 또는 항-류머티스 관절염 약제 중에서 한가지이상을 포함하는 섭생 또는 키트를 제시한다.

키트가 공급되는 경우에, 조성물의 서로 다른 구성요소는 별개의 용기 내에 포장되고 사용 직전에 혼합될 수 있다. 이들 구성요소의 이와 같은 개별 포장은 활성 구성요소의 기능 상실 없이 장기적인 저장을 가능하게 한다.

키트에 포함되는 반응물은 일정한 용기에 담아 공급함으로써, 서로 다른 구성요소의 수명이 보존되고 용기 재료에 의해 흡수되거나 변화되지 않도록 한다. 가령, 밀봉된 유리 앰풀은 냉동 건조된 쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체, 또는 중성의 비-활성 가스, 예를 들면, 질소 하에 포장된 완충제를 포함한다. 앰풀은 임의의 적절한 재료, 예를 들면, 유리, 유기 중합체(가령, 폴리카보네이트, 폴리스트렌 등), 세라믹, 금속, 또는 유사한 반응물을 유지시키는데 전형적으로 이용되는 임의의 다른 물질로 구성된다. 적절한 용기의 다른 실례는 앰풀과 유사한 물질로부터 제조되는 간단한 병 및 알루미늄이나 합금과 같은 박을 입힌 내부를 보유하는 덮개이다. 다른 용기에는 검사 튜브, 바이알, 플라스크, 병, 주사기 등이 포함된다. 용기는 무균 접근 포트(access port), 예를 들면, 피하 주사 바늘이 관통할 수 있는 마개가 달린 병을 보유한다. 다른 용기는 용이하게 제거가능하고 제거 이후에 구성요소들이 혼합될 수 있도록 하는 막에 의해 분리되는 2개의 구획(compartment)을 보유한다. 제거가능 막은 유리, 플라스틱, 고무 등이다.

키트에는 사용설명서 역시 제공될 수 있다. 사용설명서는 종이 또는 다른 기질에 인쇄되고 및/또는 전자-판독가능 매체, 예를 들면, 플로피 디스크, CD-ROM, DVD-ROM, Zip 디스크, 비디오테이프, 오디오테이프, 플래시 메모리 장치 등으로 제공될 수 있다. 상세한 사용설명서는 키트에 물리적으로 부착되지 않을 수도 있다; 대신에, 사용자는 이러한 키트의 제조업체 또는 유통업체에 의해 특정된 인터넷 웹 사이트를 안내받거나, 또는 사용설명서를 전자 메일로서 제공받을 수도 있다.

쿠프레독신 및 이의 변이체 , 유도체 또는 구조적 등가체의 변형

쿠프레독신, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 앞서 기술된 바와 같은 변이체와 유도체를 생산하기 위하여 화학적으로 변형되거나 유전적으로 변화될 수 있다. 이런 변이체와 유도체는 표준 기술에 의해 합성될 수 있다.

쿠프레독신의 자연-발생 대립형질 변이체 이외에, 혈관신생을 저해하는 쿠프레독신의 능력을 현저하게 변화시키지 않는, 인코딩된 쿠프레독신의 아미노산 서열 내에서 변형을 유도하는 변화가 돌연변이에 의해 쿠프레독신 코딩 서열 내로 도입될 수 있다. “비-필수”아미노산 잔기는 생물학적 활성의 변화 없이 쿠프레독신의 야생형 서열로부터 변형될 수 있는 잔기인 반면, “필수” 아미노산 잔기는 이런 생물학적 활성에 반드시 필요하다. 가령, 쿠프레독신 사이에 보존되는 아미노산 잔기는 특히, 변형되지 않고, 따라서 “필수”일 것으로 예측된다.

폴리펩티드의 활성을 변화시키지 않는 보존성 치환이 달성될 수 있는 아미노산은 당분야에 널리 공지되어 있다. 유용한 보존성 치환은 표 3, “바람직한 치환”에 도시된다. 한 부류의 아미노산이 동일 유형의 다른 아미노산으로 치환되는 보존성 치환은 이런 치환이 화합물의 생물학적 활성을 물리적으로 변화시키지 않는다면, 본 발명의 범위 내에 속한다.

바람직한 치환

최초 잔기	전형적인 치환	바람직한 치환
Ala (A)	Val, Leu, Ile	Val
Arg (R)	Lys, Gln, Asn	Lys
Asn (N)	Gln, His, Lys, Arg	Gln
Asp (D)	Glu	Glu
Cys (C)	Ser	Ser
Gln (Q)	Asn	Asn
Glu (E)	Asp	Asp
Gly (G)	Pro, Ala	Ala
His (H)	Asn, Gln, Lys, Arg	Arg
Ile (I)	Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleucine	Leu
Leu (L)	Norleucine, Ile, Val, Met, Ala, Phe	Ile
Lys (K)	Arg, Gln, Asn	Arg
Met (M)	Leu, Phe, Ile	Leu
Phe (F)	Leu, Val, Ile, Ala, Tyr	Leu
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Ser	Ser
Trp (W)	Tyr, Phe	Tyr
Tyr (Y)	Trp, Phe, Thr, Ser	Phe
Val (V)	Ile, Leu, Met, Phe, Ala, Norleucine	Leu

(1) 폴리펩티드 골격의 구조, 예를 들면, β-시트 또는 α-나선 구조, (2) 전하, (3) 소수성, 또는 (4) 표적 부위 측쇄의 크기에 영향을 주는 비-보존성 치환은 세포독성 인자 기능을 변화시킬 수 있다. 잔기는 표 4에 제시된 바와 같이, 공통적인 측쇄 특성에 기초하여 여러 군으로 구분된다. 비-보존성 치환은 한 부류의 구성원을 다른 부류의 구성원으로 교체하는 과정을 수반한다. 치환은 보존성 치환 부위, 또는 더욱 구체적으로, 비-보존된 부위 내로 도입될 수 있다.

아미노산 부류

부류	아미노산
소수성	Norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile
중성 친수성	Cys, Ser, Thr
산성	Asp, Glu
염기성	Asn, Gln, His, Lys, Arg
교란된 사슬 구조	Gly, Pro
방향족	Trp, Tyr, Phe

변이체 폴리펩티드는 당분야에 공지된 방법, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드-매개된(특정 부위) 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝, PCR 돌연변이유발을 이용하여 만들 수 있다. 특정 부위 돌연변이유발(Carter, Biochem J. 237:1-7(1986); Zoller and Smith, Methods Enzymol., 154:329-50(1987)), 카세트 돌연변이유발(cassette mutagenesis), 제한 선별 돌연변이유발(restriction selection mutagenesis)(Wells et al., Gene 34:315-23 (1985)), 또는 다른 공지된 기술을 클론된 DNA에서 수행하여 쿠프레독신 변이체 DNA를 산출할 수 있다.

쿠프레독신의 공지된 돌연변이는 본 발명의 방법에 이용되는 변이체 쿠프레독신을 산출하는 데에도 이용될 수 있다. 가령, 아주린의 C112D와 M44KM64E 돌연변이체는 고유 아주린과 상이한 세포독성 활성과 성장 정지 활성을 나타내는 것으로 알려져 있는데, 이런 변형된 활성은 본 발명의 치료 방법에서 유용할 수 있다. 본 발명의 이들 방법의 한 가지 구체예에서는 혈관신생을 저해하는 능력을 유지하는 쿠프레독신의 변이체와 유도체를 이용한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 방법에서는 세포 성장 정지(cellular growth arrest)를 유도하는 능력을 갖는 쿠프레독신 변이체, 예를 들면, M44KM64E 변이체를 이용한다.

본 발명의 더욱 완전한 이해는 아래의 구체적인 실시예를 참조함으로써 달성될 수 있다. 이들 실시예는 예시의 목적으로만 기술되고, 본 발명의 범위를 한정하지 않는다. 형태에서 변화 및 등가물의 치환은 편법으로 간주된다. 본 명세서에서 특정한 용어가 이용되고 있긴 했지만, 이들 용어는 설명을 목적으로 하고 본 발명을 제한하지 않는다. 본 발명의 기술적 사상과 범주를 벗어나지 않는 본 발명의 개변이 가능하고, 따라서, 본 발명은 첨부된 특허청구범위에 의해서만 한정된다.

실시예 1. 인간 제대 정맥 내피 세포 내로 P28 의 침투.

P28은 20Alexafluor 568(Molecular Probes, Eugene, OR)로 표지하였다. 지정된 세포주는 37℃에서 세포 배양 코팅된 커브 슬립 상에서 하룻밤동안 배양하였다. 표지된 펩티드를 보유하는 미리-데워진 배지를 지정된 농도로 추가하였다. 표지된 펩티드와 함께 배양한 이후, 이들 커브 슬립은 PBS로 3X 세척하고, 포르말린에서 5분간 고정시켰다. 이후, 커브 슬립은 핵 염색(nuclear staining)을 위하여 1.5 ㎍㎖^-1 DAPI를 포함하는 배지(VECTASHIELD, Vector Laboratories, Burlingame, CA) 내에 올려놓았다. 분석은 공초점 현미경(confocal microscope)(Model LC510, Carl Zeiss, Thornwood, NY)으로 수행하였다.

P28은 흑색종, 유방, 췌장, 아교모세포종, 별아교세포종, 폐로부터 기원하는 악성 세포주 내로 효과적으로 침투하였다(도 1A). P28은 또한, HUVEC 세포 내로 효과적으로 침투하였다(도 1C). 피부 섬유아세포, 유방, 췌장으로부터 기원하는 다른 “정상” 세포주에서는 현저한 침투가 관찰되지 않았다(도 1B). 이런 이유로, P28은 포유동물 암 세포 내로 특이적으로 침투할 뿐만 아니라 HUVEC 세포에도 특이적으로 침투한다.

본 실험에서는 녹농균(P. aeruginosa) 아주린 50-77 펩티드가 혈관신생에서 한 단계인, 내피 세포 내에서 모세관 형성을 저해하는 활성을 갖는다는 것을 입증한다. 이런 이유로, 녹농균(P. aeruginosa) 아주린 50-77 펩티드는 혈관신생을 제어하는데 이용될 수 있고, 따라서, 암 치료제 및 부적절한 혈관신생에 관련된 다른 질환의 치료제로서 이용될 수 있다.

실시예 2. Matrigel 상에서 HUVEC 모세관 형성에 대한 P28 의 효과.

Matrigel Matrix(Becton Dickinson Biosciences, San Jose CA)는 ECM 단백질이 풍부한 종양인 EHS 생쥐 육종(mouse sarcoma)으로부터 적출된 용해된 기저 막 제조물(basement membrane preparation)이다. 이의 주요 성분은 라미닌(laminin)이고, 그 외에 콜라겐(collagen) IV, 황산 헤파란 프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycan), 엔탁틴(entactin)이 존재한다. 실온에서, Matrigel Matrix는 중합되어 포유동물 세포 기저 막(cellular basement membrane)과 유사한 생물학적 활성 매트릭스 물질(matrix material)을 생산한다. 세포는 Matrigel Matrix 상에서 배양되면, 생체내에서처럼 행동한다. 이는 세포 형태(cell morphology), 생화학적 기능(biochemical function), 이동이나 침입, 유전자 발현(gene expression)의 연구를 위한 생리학적으로 적절한 환경을 제공한다. Matrigel Matrix는 시험관내 내피 세포 침입과 관 형성 검사를 위한 기질(substrate)로서 기능한다.

HUVEC 세포의 모세관 형성에 대한 P28의 효과는 Matrigel을 이용하여 조사하였다. HUVEC 세포는 펩티드의 존재 또는 부재에서, 20 ng/㎖ VEGF를 포함하는 Matrigel 코팅된 8 웰 챔버 슬라이드(chamber slide) 상에 도말하였다(15,000개 세포/웰). 0(대조), 0.10, 0.30, 0.92, 2.77, 8.33, 25, 75의 P28 농도가 이용되었다. 세포는 처리후 4시와 24시 시점에, 칼세인(calcein) AM로 염색하고, 모세관 형성은 형광 현미경을 이용하여 조사하였다(도 2A). 이들 결과는 적게는 0.10이 HUVEC 세포에 의한 모세관 형성을 대략 50% 정도 예방하였다(도 2A). 이런 이유로, P28은 HUVEC 세포의 관 형성을 저해하고, 따라서, 혈관신생에 관련된 모세관 형성을 저해한다.

실시예 3. HUVEC 이동성(motility)에 대한 P28 의 효과.

HUVEC 이동성에 대한 P28의 효과는 긁힌 상처 이동 측정검사(scratch wound migration assay)로 조사하였다. HUVEC 세포는 60㎜ 조직 배양 접시 내에 도말하고, 90% 합류수준에 도달시켰다. 배지를 제거한 이후, 세포 층(cell layer)은 1 ㎖ 무균 플라스틱 피펫 팁(pipette tip)을 이용하여 상처 입혔다. 평판은 배양 배지로 헹구었다. 이후, 20 ng/㎖ VEGF 단독을 포함하는 배지, 또는 20 ng/㎖ VEGF와 P28 펩티드를 포함하는 배지를 이들 평판에 추가하였다. 한 접시는 상기와 같이 상처 입히고, 정확한 상처 부위를 구분하기 위하여 직후에 고정시켰다(도 3A). 24시간후, 배양액은 고정시키고, 팔로이딘(Phalloidin)과 훽스트(Hoechst)를 이용하여 F-액틴과 핵을 염색하였다. 긁힌 부위는 형광 현미경을 이용하여 조사하고, 사진 촬영하였다. 긁힌 부위 내로 이동한 세포의 총수는 대조(도 3B)와 펩티드 처리된 접시(도 3C) 내에서 계산하였다.

P28로 처리된 세포 내에서 긁힌 상처 내로 이동한 HUVEC 총수는 대조 내에서 긁힌 상처 내로 이동한 HUVEC 총수의 대략 절반이었다(도 D). 이런 이유로, P28의 존재는 혈관신생이 진행되는 HUVEC의 이동성(motility)을 저해하였다.

실시예 4. HUVEC 구조 단백질에 대한 P28 의 효과.

P28이 이들 세포에 영향을 주는 방식에 관한 충분한 이해를 얻기 위하여, HUVEC 구조 단백질에 대한 P28의 효과를 조사하였다. Matrigel코팅된 커브 슬립 상에 도말된 HUVEC 세포는 25P28 펩티드의 존재 또는 부재에서, 4시간 또는 24시간동안 20 ng/㎖ VEGF와 함께 배양하였다. 배양후, 세포는 PBS에 헹구고, 완충된 포르말린 내에 고정시키고, PBS에 담긴 0.2% 트리톤(triton) 내에서 투과시켰다. 세포는 지정된 항체와 함께 90분간 배양하고, 필요한 경우에, 특이적인 이차 항 체(secondary antibody)와 함께 배양하고, 이후 DAPI 포함 적재 배지(mounting media) 내에 올려놓았다. 분석은 공초점 현미경(모형 LC510, Carl Zeiss)으로 수행하였다. 조사된 단백질은 아래와 같다: CD-31(세포-세포 부착에 필요한 세포간 접점(intercellular junction)에 존재하는 단백질), Fak(국소 부착 키나아제), 팍실린(Paxillin), 빈쿨린(vinculin, 핵심적인 부착 조합 단백질), WASP(F-액틴 섬유의 핵화(nucleation)와 신장(elongation)에 요구되는 위스콧-알드리치 증후군 단백질), β-카테닌(세포 생존, 세포 표면 단백질의 조절에 요구됨).

CD31/PECAM1 탐지된 세포에서, 대조에 비하여 P28 처리된 세포 내에 세포/세포 접점에서 현저한 CD31/PECAM 국지화가 관찰되었다(도 4A). 팍실린 탐지된 세포에서, 팍실린은 대조 세포 내에서 세포 표면에서 주로 관찰되는 반면, P28 처리된 세포 내에서 F-액틴 섬유에서 주로 관찰되었다(도 4B). Fak 탐지된 세포에서, Fak는 대조 세포 내에서 세포 표면에서 주로 관찰되는 반면, P28 처리된 세포 내에서 F-액틴 섬유에서 주로 관찰되었다(도 4C). WASP 탐지된 세포에서, 4h에서 WASP는 대조 세포 내에서 핵에서 주로 관찰되는 반면, P28 처리된 세포 내에서 핵과 세포 표면에서 관찰되었다(도 4 D). 24h에서 WASP는 대조 세포 내에서 세포 표면에서 주로 관찰되는 반면, P28 처리된 세포 내에서 핵에서 주로 관찰되었다(도 4D). 빈쿨린 탐지된 세포에서, 빈쿨린은 대조 세포 내에서 세포 표면에서 주로 관찰되는 반면, P28 처리된 세포 내에서 F-액틴 섬유에서 주로 관찰되었다(도 4E). β-카테닌 탐지된 세포에서, 4h에서, β-카테닌은 대조 세포 내에서 세포질에서 주로 관찰되고 세포 표면에서 일부 관찰되며, P28 처리된 세포 내에서 세포 막에서 주로 관찰 되고 핵막간극(perinuclear space)에서 일부 관찰되었다. 24h에서, β-카테닌은 대조 세포 내에서 세포 막과 핵에서 주로 관찰되고, P28 처리된 세포 내에서 세포 막과 핵주변 부위(perinuclear area)에서 관찰되었다. 이런 이유로, P28의 존재는 혈관신생이 진행되는 HUVEC 내에서 정상적으로 관찰되는 구조적 변화를 예방하였다.

실시예 5. P28 에 의한 인간 흑색종 세포의 시험관내 성장 저해.

시험관 내에서 인간 흑색종 Mel-2 세포의 성장을 저해하는 P28의 능력을 결정하였다. Mel-2 세포는 10,000-12,000개 세포/웰로 24 웰 배양 평판 내에 도말하고, 하룻밤동안 평판에 부착되도록 하였다. 이후, 세포는 37℃에서 배지 단독(10% FBS를 포함하는 MEM-E) 또는 P28 펩티드를 포함하는 배지 내에서 배양하였다. P28을 5 , 50, 100 농도로 추가하였다. 각 웰에서 세포의 총수는 0h, 24h, 48h, 72h에서 계산하였다. 각 웰에서 세포의 총수는 지정된 시점에서, Coulter 계산기를 이용하여 계산하였다.

이들 결과는 P28이 농도 의존성 방식으로 Mel-2 세포의 성장을 저해한다는 것을 입증한다. P28은 100 과 24h에서 Mel-2 세포 성장을 대략 50% 정도 저해하였다(도 5). 이들 결과는 P28이 암 세포, 구체적으로, 인간 흑색종-2 세포의 성장을 저해한다는 것을 암시한다.

실시예 6. P28 펩티드의 생체내 항-종양 활성.

1백만 개의 mel-2 세포를 3-4주령 무흉선 생쥐(n=13/군)의 등쪽 옆구리 내로 피하 주입하였다. 이들 동물에는 PBS 단독, 또는 PBS에 담긴 8㎎ 또는 16㎎/체중 ㎏(b.w.)의 P28 펩티드가 매일 i.p. 주입되었다. 이들 동물은 촉진할 수 있 는(palpable) 종양의 발생을 매일 검사하였다. 종양이 발생되면, 캘리퍼스(caliper)를 이용하여 종양 크기(tumor size)를 측정하고, 종양 용적(tumor volume)을 결정하였다.

P28은 생쥐에서 종양 발생률(tumor incidence)과 종양 성장을 저해하였다. 16 ㎎/㎏ b.w.로 처리된 동물은 mel-2 세포가 주입된 이후 40일 시점에, 대략 50%가 종양이 부재하는 반면, 대조 동물은 mel-2 세포가 주입된 이후 22일 시점에, 대략 95%가 종양을 보유하였다(도 6A). 또한, P28은 16 ㎎/㎏ b.w. P28로 처리후 20일 시점에, 종양 성장을 대략 30% 정도 저해하였다(도 6B). 이들 결과는 P28이 생체내에서 종양의 발생을 예방하고 기존 종양의 성장을 지연시킬 수 있으며, 따라서 인간에서 암 예방과 치료를 위한 효과적인 치료제가 될 수 있음을 암시한다.

SEQUENCE LISTING <110> The Board of Trustees of the University of Illinois Mehta, Rajeshwari Taylor, Brad Yamada, Tohru Beattie, Craig Das Gupta, Tapas Chakrabarty, Ananda <120> COMPOSITIONS AND METHODS TO CONTROL ANGIOGENESIS WITH CUPREDOXINS <130> 51282-00069 <150> 11/244,105 <151> 2005-10-06 <150> 60/700,297 <151> 2005-07-19 <150> 11/436,592 <151> 2006-05-19 <150> 60/764,749 <151> 2006-02-03 <150> 60/616,782 <151> 2004-10-07 <150> 60/680,500 <151> 2005-05-13 <150> 10/720,603 <151> 2003-11-11 <150> 60/414,550 <151> 2003-08-15 <150> 10/047,710 <151> 2002-01-15 <150> 60/269,133 <151> 2001-02-15 <160> 25 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 128 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 1 Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn 1 5 10 15 Thr Asn Ala Ile Thr Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn 20 25 30 Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp 35 40 45 Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met 50 55 60 Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val 65 70 75 80 Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr 85 90 95 Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys 100 105 110 Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys 115 120 125 <210> 2 <211> 28 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 2 Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala 1 5 10 15 Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 3 <211> 105 <212> PRT <213> Phormidium laminosum <400> 3 Glu Thr Phe Thr Val Lys Met Gly Ala Asp Ser Gly Leu Leu Gln Phe 1 5 10 15 Glu Pro Ala Asn Val Thr Val His Pro Gly Asp Thr Val Lys Trp Val 20 25 30 Asn Asn Lys Leu Pro Pro His Asn Ile Leu Phe Asp Asp Lys Gln Val 35 40 45 Pro Gly Ala Ser Lys Glu Leu Ala Asp Lys Leu Ser His Ser Gln Leu 50 55 60 Met Phe Ser Pro Gly Glu Ser Tyr Glu Ile Thr Phe Ser Ser Asp Phe 65 70 75 80 Pro Ala Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Cys Ala Pro His Arg Gly Ala Gly 85 90 95 Met Val Gly Lys Ile Thr Val Glu Gly 100 105 <210> 4 <211> 155 <212> PRT <213> Thiobacillus ferrooxidans <400> 4 Gly Thr Leu Asp Thr Thr Trp Lys Glu Ala Thr Leu Pro Gln Val Lys 1 5 10 15 Ala Met Leu Glu Lys Asp Thr Gly Lys Val Ser Gly Asp Thr Val Thr 20 25 30 Tyr Ser Gly Lys Thr Val His Val Val Ala Ala Ala Val Leu Pro Gly 35 40 45 Phe Pro Phe Pro Ser Phe Glu Val His Asp Lys Lys Asn Pro Thr Leu 50 55 60 Glu Ile Pro Ala Gly Ala Thr Val Asp Val Thr Phe Ile Asn Thr Asn 65 70 75 80 Lys Gly Phe Gly His Ser Phe Asp Ile Thr Lys Lys Gly Pro Pro Tyr 85 90 95 Ala Val Met Pro Val Ile Asp Pro Ile Val Ala Gly Thr Gly Phe Ser 100 105 110 Pro Val Pro Lys Asp Gly Lys Phe Gly Tyr Thr Asp Phe Thr Trp His 115 120 125 Pro Thr Ala Gly Thr Tyr Tyr Tyr Val Cys Gln Ile Pro Gly His Ala 130 135 140 Ala Thr Gly Met Phe Gly Lys Ile Val Val Lys 145 150 155 <210> 5 <211> 124 <212> PRT <213> Achromabacter cycloclastes <400> 5 Ala Asp Phe Glu Val His Met Leu Asn Lys Gly Lys Asp Gly Ala Met 1 5 10 15 Val Phe Glu Pro Ala Ser Leu Lys Val Ala Pro Gly Asp Thr Val Thr 20 25 30 Phe Ile Pro Thr Asp Lys Gly His Asn Val Glu Thr Ile Lys Gly Met 35 40 45 Ile Pro Asp Gly Ala Glu Ala Phe Lys Ser Lys Ile Asn Glu Asn Tyr 50 55 60 Lys Val Thr Phe Thr Ala Pro Gly Val Tyr Gly Val Lys Cys Thr Pro 65 70 75 80 His Tyr Gly Met Gly Met Val Gly Val Val Gln Val Gly Asp Ala Pro 85 90 95 Ala Asn Leu Glu Ala Val Lys Gly Ala Lys Asn Pro Lys Lys Ala Gln 100 105 110 Glu Arg Leu Asp Ala Ala Leu Ala Ala Leu Gly Asn 115 120 <210> 6 <211> 128 <212> PRT <213> Alcaligenes faecalis <400> 6 Ala Cys Asp Val Ser Ile Glu Gly Asn Asp Ser Met Gln Phe Asn Thr 1 5 10 15 Lys Ser Ile Val Val Asp Lys Thr Cys Lys Glu Phe Thr Ile Asn Leu 20 25 30 Lys His Thr Gly Lys Leu Pro Lys Ala Ala Met Gly His Asn Val Val 35 40 45 Val Ser Lys Lys Ser Asp Glu Ser Ala Val Ala Thr Asp Gly Met Lys 50 55 60 Ala Gly Leu Asn Asn Asp Tyr Val Lys Ala Gly Asp Glu Arg Val Ile 65 70 75 80 Ala His Thr Ser Val Ile Gly Gly Gly Glu Thr Asp Ser Val Thr Phe 85 90 95 Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Asp Tyr Ala Phe Phe Cys Ser 100 105 110 Phe Pro Gly His Trp Ser Ile Met Lys Gly Thr Ile Glu Leu Gly Ser 115 120 125 <210> 7 <211> 129 <212> PRT <213> Achromobacter xylosoxidans ssp. denitrificans I <400> 7 Ala Gln Cys Glu Ala Thr Ile Glu Ser Asn Asp Ala Met Gln Tyr Asn 1 5 10 15 Leu Lys Glu Met Val Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val His 20 25 30 Leu Lys His Val Gly Lys Met Ala Lys Val Ala Met Gly His Asn Trp 35 40 45 Val Leu Thr Lys Glu Ala Asp Lys Gln Gly Val Ala Thr Asp Gly Met 50 55 60 Asn Ala Gly Leu Ala Gln Asp Tyr Val Lys Ala Gly Asp Thr Arg Val 65 70 75 80 Ile Ala His Thr Lys Val Ile Gly Gly Gly Glu Ser Asp Ser Val Thr 85 90 95 Phe Asp Val Ser Lys Leu Thr Pro Gly Glu Ala Tyr Ala Tyr Phe Cys 100 105 110 Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Met Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Ser 115 120 125 Asn <210> 8 <211> 129 <212> PRT <213> Bordetella bronchiseptica <400> 8 Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Ala Gly Thr Asp Gln Met Gln Phe Asp 1 5 10 15 Lys Lys Ala Ile Glu Val Ser Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn 20 25 30 Leu Lys His Thr Gly Lys Leu Pro Arg Asn Val Met Gly His Asn Trp 35 40 45 Val Leu Thr Lys Thr Ala Asp Met Gln Ala Val Glu Lys Asp Gly Ile 50 55 60 Ala Ala Gly Leu Asp Asn Gln Tyr Leu Lys Ala Gly Asp Thr Arg Val 65 70 75 80 Leu Ala His Thr Lys Val Leu Gly Gly Gly Glu Ser Asp Ser Val Thr 85 90 95 Phe Asp Val Ala Lys Leu Ala Ala Gly Asp Asp Tyr Thr Phe Phe Cys 100 105 110 Ser Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Val 115 120 125 Asp <210> 9 <211> 129 <212> PRT <213> Methylomonas sp. J. <400> 9 Ala Ser Cys Glu Thr Thr Val Thr Ser Gly Asp Thr Met Thr Tyr Ser 1 5 10 15 Thr Arg Ser Ile Ser Val Pro Ala Ser Cys Ala Glu Phe Thr Val Asn 20 25 30 Phe Glu His Lys Gly His Met Pro Lys Thr Gly Met Gly His Asn Trp 35 40 45 Val Leu Ala Lys Ser Ala Asp Val Gly Asp Val Ala Lys Glu Gly Ala 50 55 60 His Ala Gly Ala Asp Asn Asn Phe Val Thr Pro Gly Asp Lys Arg Val 65 70 75 80 Ile Ala Phe Thr Pro Ile Ile Gly Gly Gly Glu Lys Thr Ser Val Lys 85 90 95 Phe Lys Val Ser Ala Leu Ser Lys Asp Glu Ala Tyr Thr Tyr Phe Cys 100 105 110 Ser Tyr Pro Gly His Phe Ser Met Met Arg Gly Thr Leu Lys Leu Glu 115 120 125 Glu <210> 10 <211> 166 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 10 Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ala Ala 1 5 10 15 Glu Ala Pro Ala Ser Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro Ala Asp 20 25 30 Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Gly Asn Cys Ala Ala Thr Val Glu Ser 35 40 45 Asn Asp Asn Met Gln Phe Asn Thr Lys Asp Ile Gln Val Ser Lys Ala 50 55 60 Cys Lys Glu Phe Thr Ile Thr Leu Lys His Thr Gly Thr Gln Pro Lys 65 70 75 80 Thr Ser Met Gly His Asn Ile Val Ile Gly Lys Thr Glu Asp Met Asp 85 90 95 Gly Ile Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys 100 105 110 Pro Asp Asp Ala Arg Val Val Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Gly Gly 115 120 125 Glu Glu Ser Ser Leu Thr Leu Asp Pro Ala Lys Leu Ala Asp Gly Glu 130 135 140 Tyr Lys Phe Ala Cys Thr Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Asn Gly 145 150 155 160 Lys Val Thr Leu Val Asp 165 <210> 11 <211> 128 <212> PRT <213> Pseudomomas fluorescens <400> 11 Ala Glu Cys Lys Thr Thr Ile Asp Ser Thr Asp Gln Met Ser Phe Asn 1 5 10 15 Thr Lys Ala Ile Glu Ile Asp Lys Ala Cys Lys Thr Phe Thr Val Glu 20 25 30 Leu Thr His Ser Gly Ser Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Leu 35 40 45 Val Ile Ser Lys Gln Ala Asp Met Gln Pro Ile Ala Thr Asp Gly Leu 50 55 60 Ser Ala Gly Ile Asp Lys Asn Tyr Leu Lys Glu Gly Asp Thr Arg Val 65 70 75 80 Ile Ala His Thr Lys Val Ile Gly Ala Gly Glu Lys Asp Ser Leu Thr 85 90 95 Ile Asp Val Ser Lys Leu Asn Ala Ala Glu Lys Tyr Gly Phe Phe Cys 100 105 110 Ser Phe Pro Gly His Ile Ser Met Met Lys Gly Thr Val Thr Leu Lys 115 120 125 <210> 12 <211> 128 <212> PRT <213> Pseudomonas chlororaphis <400> 12 Ala Glu Cys Lys Val Asp Val Asp Ser Thr Asp Gln Met Ser Phe Asn 1 5 10 15 Thr Lys Glu Ile Thr Ile Asp Lys Ser Cys Lys Thr Phe Thr Val Asn 20 25 30 Leu Thr His Ser Gly Ser Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp 35 40 45 Val Leu Ser Lys Ser Ala Asp Met Ala Gly Ile Ala Thr Asp Gly Met 50 55 60 Ala Ala Gly Ile Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Gly Asp Ser Arg Val 65 70 75 80 Ile Ala His Thr Lys Ile Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr 85 90 95 Phe Asp Val Ser Lys Leu Thr Ala Gly Glu Ser Tyr Glu Phe Phe Cys 100 105 110 Ser Phe Pro Gly His Asn Ser Met Met Lys Gly Ala Val Val Leu Lys 115 120 125 <210> 13 <211> 129 <212> PRT <213> Xylella fastidiosa 9a5c <400> 13 Lys Thr Cys Ala Val Thr Ile Ser Ala Asn Asp Gln Met Lys Phe Asp 1 5 10 15 Gln Asn Thr Ile Lys Ile Ala Ala Glu Cys Thr His Val Asn Leu Thr 20 25 30 Leu Thr His Thr Gly Lys Lys Ser Ala Arg Val Met Gly His Asn Trp 35 40 45 Val Leu Thr Lys Thr Thr Asp Met Gln Ala Val Ala Leu Ala Gly Leu 50 55 60 His Ala Thr Leu Ala Asp Asn Tyr Val Pro Lys Ala Asp Pro Arg Val 65 70 75 80 Ile Ala His Thr Ala Ile Ile Gly Gly Gly Glu Arg Thr Ser Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Thr Asn Thr Leu Ser Lys Asn Val Ser Tyr Thr Phe Phe Cys 100 105 110 Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Asn Phe Gly 115 120 125 Gly <210> 14 <211> 138 <212> PRT <213> Cucumis sativus <400> 14 Met Gln Ser Thr Val His Ile Val Gly Asp Asn Thr Gly Trp Ser Val 1 5 10 15 Pro Ser Ser Pro Asn Phe Tyr Ser Gln Trp Ala Ala Gly Lys Thr Phe 20 25 30 Arg Val Gly Asp Ser Leu Gln Phe Asn Phe Pro Ala Asn Ala His Asn 35 40 45 Val His Glu Met Glu Thr Lys Gln Ser Phe Asp Ala Cys Asn Phe Val 50 55 60 Asn Ser Asp Asn Asp Val Glu Arg Thr Ser Pro Val Ile Glu Arg Leu 65 70 75 80 Asp Glu Leu Gly Met His Tyr Phe Val Cys Thr Val Gly Thr His Cys 85 90 95 Ser Asn Gly Gln Lys Leu Ser Ile Asn Val Val Ala Ala 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PRT <213> Chloroflexus aurantiacus <400> 16 Ala Ala Asn Ala Pro Gly Gly Ser Asn Val Val Asn Glu Thr Pro Ala 1 5 10 15 Gln Thr Val Glu Val Arg Ala Ala Pro Asp Ala Leu Ala Phe Ala Gln 20 25 30 Thr Ser Leu Ser Leu Pro Ala Asn Thr Val Val Arg Leu Asp Phe Val 35 40 45 Asn Gln Asn Asn Leu Gly Val Gln His Asn Trp Val Leu Val Asn Gly 50 55 60 Gly Asp Asp Val Ala Ala Ala Val Asn Thr Ala Ala Gln Asn Asn Ala 65 70 75 80 Asp Ala Leu Phe Val Pro Pro Pro Asp Thr Pro Asn Ala Leu Ala Trp 85 90 95 Thr Ala Met Leu Asn Ala Gly Glu Ser Gly Ser Val Thr Phe Arg Thr 100 105 110 Pro Ala Pro Gly Thr Tyr Leu Tyr Ile Cys Thr Phe Pro Gly His Tyr 115 120 125 Leu Ala Gly Met Lys Gly Thr Leu Thr Val Thr Pro 130 135 140 <210> 17 <211> 96 <212> PRT <213> Cucumis sativus <400> 17 Ala Val Tyr Val Val Gly Gly Ser Gly Gly Trp Thr Phe Asn Thr Glu 1 5 10 15 Ser Trp Pro Lys Gly Lys Arg Phe Arg Ala Gly Asp Ile Leu Leu Phe 20 25 30 Asn Tyr Asn Pro Ser Met His Asn Val Val Val Val Asn Gln Gly Gly 35 40 45 Phe Ser Thr Cys Asn Thr Pro Ala Gly Ala Lys Val Tyr Thr Ser Gly 50 55 60 Arg Asp Gln Ile Lys Leu Pro Lys Gly Gln Ser Tyr Phe Ile Cys Asn 65 70 75 80 Phe Pro Gly His Cys Gln Ser Gly Met Lys Ile Ala Val Asn Ala Leu 85 90 95 <210> 18 <211> 166 <212> PRT <213> Neisseria gonorrhoeae F62 <400> 18 Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ala Gly 1 5 10 15 Glu Ala Pro Ala Ser Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro Ala Asp 20 25 30 Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Gly Asn Cys Ala Ala Thr Val Glu Ser 35 40 45 Asn Asp Asn Met Gln Phe Asn Thr Lys Asp Ile Gln Val Ser Lys Ala 50 55 60 Cys Lys Glu Phe Thr Ile Thr Leu Lys His Thr Gly Thr Gln Pro Lys 65 70 75 80 Ala Ser Met Gly His Asn Leu Val Ile Ala Lys Ala Glu Asp Met Asp 85 90 95 Gly Val Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys 100 105 110 Pro Asp Asp Ala Arg Val Val Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Gly Gly 115 120 125 Glu Glu Ser Ser Leu Thr Leu Asp Pro Ala Lys Leu Ala Asp Gly Asp 130 135 140 Tyr Lys Phe Ala Cys Thr Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Asn Gly 145 150 155 160 Lys Val Thr Leu Val Asp 165 <210> 19 <211> 150 <212> PRT <213> Vibrio parahaemolyticus <400> 19 Met Ser Leu Arg Ile Leu Ala Ala Thr Leu Ala Leu Ala Gly Leu Ser 1 5 10 15 Phe Gly Ala Gln Ala Ser Ala Glu Cys Glu Val Ser Ile Asp Ala Asn 20 25 30 Asp Met Met Gln Phe Ser Thr Lys Thr Leu Ser Val Pro Ala Thr Cys 35 40 45 Lys Glu Val Thr Leu Thr Leu Asn His Thr Gly Lys Met Pro Ala Gln 50 55 60 Ser Met Gly His Asn Val Val Ile Ala Asp Thr Ala Asn Ile Gln Ala 65 70 75 80 Val Gly Thr Asp Gly Met Ser Ala Gly Ala Asp Asn Ser Tyr Val Lys 85 90 95 Pro Asp Asp Glu Arg Val Tyr Ala His Thr Lys Val Val Gly Gly Gly 100 105 110 Glu Ser Thr Ser Ile Thr Phe Ser Thr Glu Lys Met Thr Ala Gly Gly 115 120 125 Asp Tyr Ser Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Ile Met Gln 130 135 140 Gly Lys Phe Glu Phe Lys 145 150 <210> 20 <211> 33 <212> PRT <213> Chloroflexus aurantiacus <400> 20 His Asn Trp Val Leu Val Asn Gly Gly Asp Asp Val Ala Ala Ala Val 1 5 10 15 Asn Thr Ala Ala Gln Asn Asn Ala Asp Ala Leu Phe Val Pro Pro Pro 20 25 30 Asp <210> 21 <211> 28 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <400> 21 Leu Thr Lys Thr Ala Asp Met Gln Ala Val Glu Lys Asp Gly Ile Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Asp Asn Gln Tyr Leu Lys Ala Gly Asp 20 25 <210> 22 <211> 27 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 22 Ile Gly Lys Thr Glu Asp Met Asp Gly Ile Phe Lys Asp Gly Val Gly 1 5 10 15 Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 23 <211> 27 <212> PRT <213> Pseudomonas syringae <400> 23 Ser Lys Lys Ala Asp Ala Ser Ala Ile Thr Thr Asp Gly Met Ser Val 1 5 10 15 Gly Ile Asp Lys Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 24 <211> 27 <212> PRT <213> Vibrio parahaemolyticus <400> 24 Ala Asp Thr Ala Asn Ile Gln Ala Val Gly Thr Asp Gly Met Ser Ala 1 5 10 15 Gly Ala Asp Asn Ser Tyr Val Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 25 <211> 27 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <400> 25 Thr Lys Thr Ala Asp Met Gln Ala Val Glu Lys Asp Gly Ile Ala Ala 1 5 10 15 Gly Leu Asp Asn Gln Tyr Leu Lys Ala Gly Asp 20 25

Claims

쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체이고, 포유동물 세포 내에서 혈관신생을 저해할 수 있는 분리된 펩티드.
청구항 1에 있어서, 쿠프레독신은 아주린(azurin), 슈도아주린(pseudoazurin), 플라스토시아닌(plastocyanin), 루스티시아닌(rusticyanin), Laz, 아우라시아닌(auracyanin)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
청구항 2에 있어서, 쿠프레독신은 아주린인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
청구항 1에 있어서, 쿠프레독신은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 알칼리게네스 파이칼리스(Alcaligenes faecalis), 아크로모박터 실로속시단(Achromobacter xylosoxidan), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 메틸로모나스 종(Methylomonas sp.), 수막염균(Neisseria meningitidis), 임균(Neisseria gonorrhoeae), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis), 포도피어슨병균(Xylella fastidiosa), 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus)에서 선택되는 생물체로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 분리 된 펩티드.
청구항 4에 있어서, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
청구항 1에 있어서, SEQ ID NO: 1, 3-19에서 선택되는 펩티드의 일부인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
청구항 1에 있어서, SEQ ID NO: 1, 3-19에서 선택되는 서열과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
청구항 1에 있어서, 쿠프레독신의 절두인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
청구항 8에 있어서, 10개 이상의 잔기 및 100개 이하의 잔기를 보유하는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
청구항 8에 있어서, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린 잔기 50-77, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린 잔기 50-67, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린 잔기 36-88, SEQ ID NO:20-24에서 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
청구항 10에 있어서, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린 잔기 50-77, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린 잔기 50-67, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린 잔기 36-88, SEQ ID NO:20-24에서 선택되는 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
청구항 1에 있어서, 아주린 잔기 50-77, 잔기 50-67, 잔기 36-88에서 선택되는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린의 한 영역과 등가의 쿠프레독신 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제약학적으로 허용되는 담체 내에 적어도 하나의 쿠프레독신 또는 청구항 1의 펩티드를 함유하는 제약학적 조성물.
청구항 13에 있어서, 적어도 2개의 쿠프레독신 또는 펩티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
청구항 13에 있어서, 정맥내 투여용으로 제조되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
청구항 13에 있어서, 쿠프레독신은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 알칼리게네스 파이칼리스(Alcaligenes faecalis), 아크로모박터 실로속시단(Achromobacter xylosoxidan), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 메틸로모나스 종(Methylomonas sp.), 수막염균(Neisseria meningitidis), 임균(Neisseria gonorrhoeae), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis), 포도피어슨병균(Xylella fastidiosa), 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus)에서 선택되는 생물체로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
청구항 15에 있어서, 쿠프레독신은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
청구항 13에 있어서, 쿠프레독신은 SEQ ID NO: 1, 3-19에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
부적절한 혈관신생에 관련된 장애로 고통받는 포유동물 환자를 치료하는 방법에 있어서, 청구항 13의 조성물의 치료 효과량을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 19에 있어서, 환자는 인간인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 19에 있어서, 환자는 암으로 고통받는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 21에 있어서, 암은 흑색종, 유방암, 췌장암, 아교아세포종, 별아교세포종, 폐암에서 선택되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 19에 있어서, 환자는 황반 변성, 당뇨병성 망막증, 건선, 류머티스 관절염에서 선택되는 질환으로 고통받는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 19에 있어서, 제약학적 조성물은 정맥내 주사, 근육내 주사, 피하 주사, 흡입, 국소 투여, 경피 패치, 좌약, 유리체 주입, 경구에서 선택되는 방식으로 투여되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 24에 있어서, 투여 방식은 정맥내 주사인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 21에 있어서, 제약학적 조성물은 적어도 하나의 다른 항암제와 동시-투여되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 24에 있어서, 제약학적 조성물은 다른 항암제와 동시에 투여되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
청구항 19에 있어서, 제약학적 조성물은 항-황반 변성 약제, 항-당뇨병성 망막증 약제, 항-건선 약제 또는 항-류머티스 관절염 약제에서 선택되는 적어도 하나의 약제와 공동-투여되는 것을 특징으로 하는 치료 방법..
바이알에 담긴 청구항 13의 조성물을 포함하는 키트.
청구항 29에 있어서, 정맥내 투여용으로 설계된 것을 특징으로 하는 키트.
혈관신생, 또는 부적절한 혈관신생에 관련된 장애를 조사하는 방법에 있어서, 혈관신생이 진행될 수 있는 포유동물 세포를 청구항 1의 쿠프레독신 또는 펩티드와 접촉시키고, 혈관신생의 정도를 측정하는 단계를 포함하는 조사 방법.
청구항 31에 있어서, 세포는 인간 세포인 것을 특징으로 하는 조사 방법.
청구항 30에 있어서, 세포는 HUVEC인 것을 특징으로 하는 조사 방법.
청구항 1의 펩티드를 인코딩하는 발현 벡터.