KR20080024124A - 쿠프레독신과 시토크롬 ｃ로 ｈｉｖ 감염을 치료하기 위한조성물과 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 쿠프레독신(cupredoxin), 구체적으로, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린 및/또는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 시토크롬(cytochrome) c₅₅₁ 및 바이러스 감염, 특히, 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에 의한 포유동물 세포의 감염의 저해에서 이들의 용도에 관계한다. 본 발명은 또한, 바이러스 감염, 특히, 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에 의한 감염을 저해하는 능력을 유지하는 쿠프레독신과 시토크롬 c₅₅₁의 변이체와 유도체에 관계한다. 본 발명은 또한, 포유동물 세포에서 바이러스와 세균 감염을 조사하기 위한 연구 방법에 관계한다

쿠프레독신과 시토크롬 c551

Description

쿠프레독신과 시토크롬 Ｃ로 ＨＩＶ 감염을 치료하기 위한 조성물과 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING HIV INFECTION WITH CUPREDOXIN AND CYTOCHROME C}

관련된 출원

본 출원은 35 U.S.C. §§ 119와 120 하에, 2006년 5월 19일자 제출된 동시-제출된 U.S. 특허 출원 No. 11/436,591, “Compositions and Methods for Treating HIV Infection with Cupredoxin and Cytochrome c”; 2006년 5월 19일자 제출된 U.S. 특허 출원 No. 11/436,590; “Compositions and Methods for Treating Malaria with Cupredoxins and Cytochrome”; 2006년 5월 10일자 제출된 U.S. 가출원 No. 60/780,868; 2005년 5월 20일자 제출된 U.S. 가출원 No. 60/682,833; 2004년 10월 7일자 제출된 U.S. 가출원 No. 60/616,782 및 2005년 5월 13일자 제출된 U.S. 가출원 No. 60/680,500에 우선권을 주장하고 2003년 11월 11일자 제출된 U.S. 특허 출원 No. 10/720,603의 일부 계속 출원인 2005년 10월 6일자 제출된 U.S. 특허 출원 No. 11/244,105에 우선권을 주장하고, 상기 U.S. 특허 출원 No. 10/720,603은 2003년 8월 15일자 제출된 U.S. 가출원 No. 60/414,550에 우선권을 주장하고 2002년 1월 15일자 제출된 U.S. 특허 출원 No. 10/047,710의 일부 계속 출원이며, 상기 U.S. 특허 출원 No. 10/047,710은 2001년 2월 15일자 제출된 U.S. 가출원 No. 60/269,133에 우선권을 주장한다. 이들 선행 출원의 전체 내용은 순전히 참조로서 편입된다.

정부 권리의 진술

본 출원의 요부는 National Institutes of Health (NIH), Bethesda, Maryland, U.S.A.로부터 연구 기금(Grant Number AI 16790-21, ES 04050-16, AI 45541, CA 09432, N01-CM97567)을 지원받았다. 정부는 본 발명에 일부 권리를 주장할 수 있다.

본 발명의 기술 분야

본 발명은 쿠프레독신(cupredoxin), 구체적으로, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린 및/또는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 시토크롬(cytochrome) c₅₅₁ 및 바이러스 감염, 특히, 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에 의한 포유동물 세포의 감염의 저해에서 이들의 용도에 관계한다. 본 발명은 또한, 바이러스 감염, 특히, 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에 의한 감염을 저해하는 능력을 유지하는 쿠프레독신과 시토크롬 c₅₅₁의 변이체와 유도체에 관계한다. 본 발명은 또한, 포유동물 세포에서 바이러스와 세균 감염을 조사하기 위한 연구 방법에 관계한다.

AIDS를 유발하는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 감염은 인간 개체군에서 상대적으로 새로운 감염임에도 불구하고, 전세계적으로 가장 주요한 건강 문제로서 빠 르게 부상하였다. HIV/AIDS는 현재, 사하라 사막 이남에서 첫 번째 사망 원인이고, 전세계적으로 4번째 사망 원인이다. 2001년 말에, 전세계적으로 4천만 명이 HIV에 감염된 것으로 추산되었다. 질병 통제 센터(Centers for Disease Control, CDC)에서는 미국에서 거의 800,000명이 AIDS에 감염되고, 매년 40,000건의 새로운 사례가 진단되는 것으로 추산하고 있다. 현재, 더욱 효과적인 치료 방법이 HIV 감염 환자의 수명을 연장시키는 것으로 알려져 있긴 하지만, 치료제는 여전히 존재하지 않는다.

현대의 항-HIV 약제는 HIV 수명 주기(life cycle)의 여러 상이한 단계 및 HIV가 복제하고 생존하기 위하여 필요로 하는 여러 효소를 표적한다. 통상적으로 이용되는 항-HIV 약제의 일부 실례에는 뉴클레오시드 역전사효소 전해물질(reverse transcriptase inhibitor), 예를 들면, AZT, ddI, ddC, d4T, 3TC, 아바카비르(abacavir); 뉴클레오티드 역전사효소 전해물질, 예를 들면, 테노포비르(tenofovir); 비-뉴클레오시드 역전사효소 저해물질(non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor), 예를 들면, 네비라핀(nevirapine), 에파비렌즈(efavirenz), 델라비리딘(delavirdine); 프로테아제 저해물질, 예를 들면, 사퀴나비르(saquinavir), 리토나비르(ritonavir), 인디나비르(indinavir), 넬피나비르(nelfinavir), 암프리나비르(amprinavir), 로피나비르(lopinavir), 아타자나비르(atazanavir); 융합 저해물질(fusion inhibitor), 예를 들면, 엔푸비르티드(enfuvirtide)가 포함된다. 하지만, 많은 HIV 감염된 환자에서, 단독으로 또는 조합으로 이들 항바이러스는 만성 감염의 진행을 예방하거나 급성 AIDS를 치료하는 데 무효하다. HIV 바이러스의 높은 돌연변이 비율(mutation rate) 및 이로 인한 약제 내성 HIV 균주의 출현은 HIV 감염의 효과적인 치료를 불가능하게 하는 한가지 주요 인자이다. 더욱 효과적인 새로운 치료제가 요구된다.

본 발명의 요약

본 발명은 포유동물 세포에서 바이러스 감염, 특히, HIV 감염을 저해하기 위하여 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁을 이용하는 조성물과 방법에 관계한다. 구체적으로, 본 발명은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린 및/또는 시토크롬 c₅₅₁ 펩티드, 또는 이의 변이체 또는 유도체를 함유하는 조성물 및 포유동물 세포와 환자에서 HIV-1 감염의 성장을 저해하기 위하여 이들 조성물과 펩티드를 이용하는 방법에 관계한다. 본 발명은 또한, 바이러스 감염, 특히, HIV에 의한 감염의 성장을 저해하는 능력을 유지하는 쿠프레독신과 시토크롬 c₅₅₁의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체에 관계한다.

본 발명의 한 측면은 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체이고, 포유동물 세포 내에서 HIV-1 감염의 성장을 저해할 수 있는 분리된 펩티드에 관계한다. 일부 구체예에서, 쿠프레독신은 아주린(azurin), 슈도아주린(pseudoazurin), 플라스토시아닌(plastocyanin), 루스티시아닌(rusticyanin), Laz, 또는 아우라시아닌(auracyanin), 구체적으로, 아주린 또는 Laz이다. 다른 구체예에서, 쿠프레독신은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 알칼리게네스 파이칼리스(Alcaligenes faecalis), 아크로모박터 실로속시단(Achromobacter xylosoxidan), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 메틸로모나스 종(Methylomonas sp .), 수막염균(Neisseria meningitidis), 임균(Neisseria gonorrhoeae), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis), 포도피어슨병균(Xylella fastidiosa), 또는 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus), 구체적으로, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 또는 임균(Neisseria gonorrhoeae)으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 이러한 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1-17에서 선택되는 서열의 일부이다. 일부 구체예에서, 상기 펩티드는 SEQ ID NO: 1-17에서 선택되는 서열과 적어도 90% 아미노산 서열 동일성(identity)을 갖는다.

일부 구체예에서, 분리된 펩티드는 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁의 절두이다. 이러한 펩티드는 10개 이상의 잔기 및 100개 이하의 잔기를 보유한다. 일부 구체예에서, 이러한 분리된 펩티드는 아주린 잔기 36-128, 잔기 36-88 또는 잔기 88-113의 영역을 포함한다. 다른 구체예에서, 이러한 분리된 펩티드는 아주린 잔기 36-128, 잔기 36-88 또는 잔기 88-113의 영역으로 구성된다. 다른 구체예에서, 상기 펩티드는 아주린 잔기 36-128, 잔기 36-88 또는 잔기 88-113의 한 영역과 등가의 표적 쿠프레독신 잔기를 포함한다.

본 발명의 다른 측면은 포유동물 세포 내에서 HIV-1 감염의 성장을 저해할 수 있는 적어도 하나의 쿠프레독신, 시토크롬 c₅₅₁, 또는 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체인 분리된 펩티드를 함유하는 제약학적 조성물이다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 정맥내 투여용으로 제조된다. 다른 구체예에서, 쿠프레독신은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 알칼리게네스 파이칼리스(Alcaligenes faecalis), 아크로모박터 실로속시단(Achromobacter xylosoxidan), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 메틸로모나스 종(Methylomonas sp .), 수막염균(Neisseria meningitidis), 임균(Neisseria gonorrhoeae), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis), 포도피어슨병균(Xylella fastidiosa), 또는 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus), 구체적으로, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 또는 임균(Neisseria gonorrhoeae)으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 일부 구체예에서, 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁은 SEQ ID NO: 1-17에서 선택된다.

본 발명의 다른 측면은 바이러스 또는 세균으로 감염된 환자를 치료하는 방법인데, 상기 방법은 적어도 하나의 쿠프레독신, 시토크롬 c₅₅₁, 또는 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체인 분리된 폴리펩티드를 함유하고 포유동물 세포 내에서 HIV-1 감염의 성장을 저해할 수 있는 제약학적 조성물의 치료 효과량을 환자에 투여하는 단계를 포함한다. 환자는 HIV-1, 단순 포진 바이러스(Herpes simplex virus, HSV), 에볼라 바이러스(Ebola virus), 시토메갈로바이러스(cytomeglovirus, CMV), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus) 타입 A, B, C; 간염 바이러스(hepatitis virus) A, B, C, G; 델타 간염 바이러 스(delta hepatitis virus, HDV), 유행성 이하선염 바이러스(mumps virus), 홍역 바이러스(measles virus), 호흡기 합포체 바이러스(respiratory syncytial virus), 변야바이러스(bunyavirus), 아레나 바이러스(arena virus), 도리 바이러스(Dhori virus), 소아마비 바이러스(poliovirus), 풍진 바이러스(rubella virus), 뎅기열 바이러스(dengue virus), SIV 또는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis), 구체적으로, HIV-1로 감염된다. 일부 구체예에서, 환자는 인간이다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 정맥내 주사, 근육내 주사, 피하 주사, 흡입, 국소 투여, 경피 패치, 좌약, 또는 경구, 구체적으로, 정맥내 주사에 의해 환자에 투여된다. 제약학적 조성물은 다른 항-HIV 약제의 투여와 동시에 내지 이러한 투여후 1주 이내에, 구체적으로, 다른 항-바이러스제, 항균제 및/또는 항-HIV 약제와 거의 동시에 투여될 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 분리된 쿠프레독신, 시토크롬 c₅₅₁, 또는 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체 중에서 적어도 2개를 함유하고 조성물이다. 일부 구체예에서, 조성물은 제약학적 조성물이다.

본 발명의 다른 측면은 바이알에 내에, 적어도 하나의 쿠프레독신, 시토크롬 c₅₅₁, 또는 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체인 분리된 펩티드를 함유하고 포유동물 세포에서 HIV-1 감염의 성장을 저해할 수 있는 제약학적 조성물을 포함하는 키트이다. 일부 구체예에서, 이러한 키트는 정맥내 투여용으로 설계된다.

본 발명의 다른 측면은 포유동물 세포를 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체와 접촉시키고, 이들 세포를 세균 또는 바이러스와 접촉시키고, 이러한 바이러스 또는 세균의 감염의 성장을 측정하는 단계를 포함하는, 포유동물 세포 내에서 바이러스와 세균 감염을 조사하는 방법이다. 일부 구체예에서, 포유동물 세포를 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체와 접촉시키는 단계는 이들 세포를 세균 또는 바이러스와 접촉시키는 단계 이전에 진행된다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포를 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체와 접촉시키는 단계는 이들 세포를 세균 또는 바이러스와 접촉시키는 단계 이후에 진행된다. 다른 구체예에서, 세포는 림프종 세포(lymphoma cell) 또는 말초혈 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell)이다. 다른 구체예에서, 바이러스 또는 세균은 HIV-1, 단순 포진 바이러스(Herpes simplex virus, HSV), 에볼라 바이러스(Ebola virus), 시토메갈로바이러스(cytomeglovirus, CMV), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus) 타입 A, B, C; 간염 바이러스(hepatitis virus) A, B, C, G; 델타 간염 바이러스(delta hepatitis virus, HDV), 유행성 이하선염 바이러스(mumps virus), 홍역 바이러스(measles virus), 호흡기 합포체 바이러스(respiratory syncytial virus), 변야바이러스(bunyavirus), 아레나 바이러스(arena virus), 도리 바이러스(Dhori virus), 소아마비 바이러스(poliovirus), 풍진 바이러스(rubella virus), 뎅기열 바이러스(dengue virus), SIV 또는 결핵 균(Mycobacterium tuberculosis), 구체적으로, HIV-1이다.

본 발명의 다른 측면은 포유동물 세포 내에서 HIV-1 감염의 성장을 저해할 수 있는 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체인 펩티드를 인코딩하는 발현 벡터이다.

본 발명의 이와 같은 측면, 이점, 특징은 아래의 도면 및 특정한 구체예의 상세한 설명으로부터 명백할 것이다.

서열에 관한 간단한 설명

SEQ ID NO: 1. 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 아주린의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 2. 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 시토크롬 c₅₅₁의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 3. 포르미디움 라미노섬(Phormidium laminosum)으로부터 플라스토시아닌의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 4. 티오바실루스 페로옥시단스(Thiobacillus ferrooxidans)로부터 루스티시아닌의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 5. 아크로모박터 사이클로클라스테스(Achromobacter cycloclastes)로부터 슈도아주린의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 6. 알칼리게네스 파이칼리스(Alcaligenes faecalis)로부터 아주린의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 7. 아크로모박터 실로속시단(Achromobacter xylosoxidan) ssp . 데니트리피칸스( denitrificans ) I로부터 아주린의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 8. 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica)로부터 아주린의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 9. 메틸로모나스 종(Methylomonas sp .) J로부터 아주린의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 10. 수막염균(Neisseria meningitidis) Z2491로부터 아주린의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 11. 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)로부터 아주린의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 12. 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis)로부터 아주린의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 13. 포도피어슨병균(Xylella fastidiosa) 9 a5c로부터 아주린의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 14. 오이(Cucumis sativus)로부터 스텔라시아닌(stellacyanin)의 아미노산 서열

SEQ ID NO: 15. 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터 아우라시아닌 A의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 16. 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터 아우라시아닌 B의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 17. 오이(Cucumis sativus)로부터 오이 기초 단백질(cucumber basic protein)의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 18. 임균(Neisseria gonorrhoeae) F62로부터 Laz의 H.8 영역의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 19. 임균(Neisseria gonorrhoeae) F62로부터 Laz의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 20은 임균(Neisseria gonorrhoeae)의 Laz-인코딩 유전자(laz)를 PCR 증폭하기 위한 정방향 프라이머다.

SEQ ID NO: 21은 임균(Neisseria gonorrhoeae)의 Laz-인코딩 유전자(laz)를 PCR 증폭하기 위한 역방향 프라이머다.

SEQ ID NO: 22는 pUC18-laz의 3.1 kb 단편을 PCR 증폭하기 위한 정방향 프라이머다.

SEQ ID NO: 23은 puc18-laz의 3.1 kb 단편을 PCR 증폭하기 위한 역방향 프라이머다.

SEQ ID NO: 24는 pUC19-paz의 0.4 kb 단편을 PCR 증폭하기 위한 정방향 프라이머다.

SEQ ID NO: 25는 pUC19-paz의 0.4 kb 단편을 PCR 증폭하기 위한 역방향 프라이머다.

SEQ ID NO: 26은 pGST-azu 36-128에 대한 정방향 프라이머다.

SEQ ID NO: 27은 pGST-azu 36-128에 대한 역방향 프라이머다.

SEQ ID NO: 28은 pGST-azu 36-89에 대한 정방향 프라이머다.

SEQ ID NO: 29는 pGST-azu 36-89에 대한 역방향 프라이머다.

SEQ ID NO: 30은 pGST-azu 88-113에 대한 정방향 프라이머다.

SEQ ID NO: 31은 pGST-azu 88-113에 대한 역방향 프라이머다.

SEQ ID NO: 32는 pGST-azu 88-113의 제조에서 특정 부위 돌연변이유발(site directed mutagenesis)을 위한 올리고뉴클레오티드다.

SEQ ID NO: 33은 pGST-azu 88-113의 제조에서 특정 부위 돌연변이유발을 위한 올리고뉴클레오티드다.

도 1. 도 1에서는 아주린, H.8-아주린(H.8-Az), Laz에 의한 HIV-1 바이러스 성장의 저해를 도시한다. 이들 3가지 단백질은 PBMC와 함께 상이한 농도에서 배양하고, 이후 HIV-1의 3가지 아류형을 추가하였다. 2시간 배양이후, 상기 바이러스는 제거하지만 이들 단백질은 실시예 3에 기술된 바와 같이 다시 추가하였다. 바이러스 성장의 억제는 p24의 ELISA 측정검사로 결정하였다.

도 2. 도 2에서는 쿠프레독신의 CD4 및 HIV-1 gp120과의 결합 패턴(binding pattern)을 보여주는 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance) 결합 곡선을 도시한다. (A) 카르복시메틸덱스트란(carboxymethyldextran) 코팅된 골드 센서 칩(CD4-CM5) 상에서 아주린 및 GST-Azu 36-128(삽화(inset)로 표시됨)의 고정된 CD4와의 새롭고 특이적인 결합을 보여주는 SPR 적정 곡선(titration curve). HIV-1 gp120, HIV-1 gag, HIV-1 nef는 각각, 양성 대조(positive control)와 음성 대 조(negative control)로서 기능하였다. 상대적인 결합 친화성(relative binding affinity)은 이들 데이터를 방정식 Req = Rmax/(1 + Kd/C)에 맞춤함으로써 결정하였는데, 이들 곡선 맞춤(curve fit)은 상기 데이터 포인트(data point)를 연결한다. CD4 결합 Kd 수치는 아래와 같다: 36.9± 2.0 nM(아주린), 0.34 ± 0.04 nM(GST-Azu 36-128), 48.1 ± 3.1 nM(HIV-1 gp120). (B) 고정된 아주린(Az-CM5)이 HIV 단백질과 접촉할 때 결합 적정. 노출된 Au-CM5 칩에 대한 광범위한 비특이적인 결합으로 인하여, CM5를 용리제(eluent)로서 작업 완충액(running buffer)에 추가하였다(HBS-EP 완충액에 1 ㎎/㎖ CM5). 곡선 맞춤(curve fit)은 25.1 ± 3.1 nM(CD4)과 8.9 ± 0.8 nM(HIV-1 gp120)의 Kd’를 제공하였다. (C) ICAM(ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, NCAM, 삽화)의 고정된 아주린과의 결합에 대한 SPR 곡선은 (B)에서 실험에서와 유사한 조건하에 결정되었다. ICAM-1 또는 ICAM-2가 아닌 ICAM-3으로 아주린의 선별적인 인식(selective recognition)이 관찰되는데, 결합 강도(binding strength)가 19.5 ± 5.4 nM이었다. 삽화에서 관찰되는 바와 같이, NCAM과 아주린의 결합에 대한 Kd는 20 +5.0nM이었다. (D) CM5 센서 칩 상에 고정된 CD4로 SPR 결합 경쟁 연구. 아주린 + HIV-1 gp120 용액을 상이한 아주린 농도(0-4500 nM, [HIV-1 gp120]은 242 nM이다)로 센서 표면에 추가하고, 이들 데이터는 공명의 비율, 전체 반응 %[Req(아주린+HIV-1gp120)/(Req/(HIV-1 gp120))]로서 도면에 기입되었다. GST-Azu 36-128은 고정된 CD4에 대하여 HIV-1 gp120으로 적정하고, 유사한 방식으로 분석하였다. 경쟁 데이터는 고정된 CD4에 대한 아주린 결합과 GST-Azu 36-128 결합 사이의 1:1 화학량(stoichiometry)을 암시한다.

도 3. 도 3에서는 아주린 및 GST-아주린 융합체의 DC-SIGN과의 상호작용을 보여주는 표면 플라스몬 공명 결합 적정을 도시한다. (A) 아주린, ICAM-3, GST-Azu 36-89의 DC-SIGN와의 농도 의존성 결합(concentration dependent binding)은 DC-SIGN 변형된 CM5 센서 표면 상에 이들 단백질을 상이한 농도(0 - 100 nM)로 주입하여 결정하고, 결합의 정도는 공명 단위(resonance unit, RU)로 측정된 평형 공명 반응(equilibrium resonance response) 수치의 함수로서 평가하였다. (B) (A)에서 아주린에 대하여 기술된 바와 동일한 센서 칩과 프로토콜을 이용한, GST-Azu 88-113과 DC-SIGN의 결합 적정 곡선. GST-Azu 88-113과 DC-SIGN의 파지티브 상호작용(positive interaction)은 아주린에 대한 인식 서열(recognition sequence)로서 이의 잠재적인 역할을 암시한다. 아주린, ICAM-3, GST-Azu 88-113에 대한 결합 친화성(binding affinity, Kd)은 상기 데이터를 Req = Rmax/(1+(Kd/C))에 맞춤함으로써 결정하고, 이들 곡선 맞춤(curve fit)은 도면 내에서 데이터 포인트(data point)를 연결한다. 추정된 Kd 수치는 0.83 ± 0.05 nM(아주린), 0.93 ± 0.39 nM(ICAM-3), 5.98 ± 1.13 nM(GST-Azu 88-113)이다.

정의

본 명세서에서, “세포”는 “단일 세포”로서 구체적으로 명시되지 않는 경우에, 상기 용어의 단수와 복수를 모두 포괄한다.

본 명세서에서, “폴리펩티드”, “펩티드”, “단백질”은 동일한 의미로서 이용되고, 아미노산 잔기의 중합체를 지시한다. 상기 용어는 하나이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공적인 화학 유사체인 아미노산 중합체에 적용된다. 상기 용어는 자연 발생 아미노산 중합체에도 적용된다. “폴리펩티드”, “펩티드”, “단백질”은 당화(glycosylation), 지질 부착(lipid attachment), 황화(sulfation), 글루탐산(glutamic acid) 잔기의 감마-카르복실화(gamma-carboxylation), 하이드록실화(hydroxylation), ADP-리보실화(ribosylation)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 변형 역시 포함한다. 폴리펩티드가 항상 완전하게 선형인 것은 아니다. 가령, 폴리펩티드는 유비퀴틴화(ubiquitination)의 결과로써 분지화되고, 이들은 일반적으로, 자연적인 처리 현상(natural processing event) 및 자연적으로 발생하지 않고 인간 조작에 의해 유발되는 현상을 비롯한 번역후 현상(post-translation event)의 결과로써 환형(분지화되거나 분지화되지 않음)이다. 환형 폴리펩티드, 분지화된 폴리펩티드, 분지화된 환형 폴리펩티드는 비-번역 자연 과정 및 전적으로 합성 방법에 의해 합성될 수도 있다.

본 명세서에서, “병리학적 장애(pathological condition)”는 생존 동물 또는 이의 일부분의 정상 상태(normal state)의 손상을 구성하고; 신체 기능의 수행을 교란시키거나 변형하고; 다양한 인자(가령, 영양실조(malnutrition), 산업재해(industrial hazards), 또는 기후), 특정한 감염성 병원체(가령, 벌레, 기생 원충, 세균 또는 바이러스), 생물체의 유전적 결함(가령, 유전적 이형(genetic anomaly)), 또는 이들 인자의 조합에 대응하는, 정상으로부터 해부학적 이탈과 생리학적 이탈을 포괄한다.

본 명세서에서, “장애”는 생존 동물 또는 이의 일부분의 정상 상태의 손상을 구성하고, 신체 기능의 수행을 교란시키거나 변형하는, 정상으로부터 해부학적 이탈과 생리학적 이탈을 포괄한다.

본 명세서에서, “고통받는”은 현재 병리학적 장애의 증상을 나타내고, 관찰가능 증상이 없음에도 병리학적 장애를 앓고, 병리학적 장애로부터 회복하고, 병리학적 장애로부터 회복된 것을 포괄한다.

본 명세서에서 “치료”는 치료하려는 장애 또는 이러한 장애와 연관된 증상의 진행 또는 심각도를 예방, 저하, 중단 또는 반전시키는 것을 포괄한다. 따라서, “치료”에는 적절한 의학적, 치료적 및/또는 예방적 투여가 포함된다.

본 명세서에서, “HIV 감염의 성장 저해”는 인체 내에서 HIV 감염을 감소시키거나 이의 증가를 예방하는 임의의 수단을 의미한다. 이들 수단에는 HIV 게놈의 복제 저해, HIV 외피 단백질의 합성 및/또는 조립의 저해, 감염되지 않은 세포 내로 HIV 침입의 저해가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이러한 정의는 현재 공지된 임의의 HIV 치료제의 작용 방법을 포괄한다. HIV 감염의 성장이 저해되는 지를 결정하는 한 가지 방법이 실시예 3에서 기술된다.

“치료 효과량”은 치료되는 개체에서 특정한 장애의 발생을 예방 또는 지연시키고, 또는 이러한 장애에서 기존 증상을 완전하게 완화시키는데 효과적인 양이다. 치료 효과량의 결정은 당업자의 능력 범위 내에 속한다.

본 명세서에서, 폴리펩티드 또는 다른 화합물을 수식하는데 이용되는“실질적으로 순수한”은 활성 저해제(active inhibitory agent)가 실질적으로 존재하지 않거나 섞이지 않은 형태의 폴리펩티드 또는 화합물, 예를 들면, 성장 배지로부터 분리된 폴리펩티드를 지시한다. “실질적으로 순수한”은 분리된 분획물의 건물 중량(dry weight)당 적어도 75%의 화합물, 또는 적어도“75% 실질적으로 순수한” 화합물을 의미한다. 더욱 적절하게는, “실질적으로 순수한”은 활성 화합물의 건물 중량당 적어도 85%의 화합물, 또는 적어도“85% 실질적으로 순수한” 화합물을 의미한다. 가장 적절하게는, “실질적으로 순수한”은 활성 화합물의 건물 중량당 적어도 95%의 화합물, 또는 적어도“95% 실질적으로 순수한” 화합물을 의미한다. 실질적으로 순수한 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체 또는 유도체는 실질적으로 순수한 한 가지이상의 다른 화합물 또는 분리된 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁과 병용될 수 있다.

“분리된”, “정제된” 또는 “생물학적으로 순수한”은 자연 상태에서 통상적으로 수반되는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 존재하지 않는 물질을 지시한다. 따라서, 본 발명에 따른 분리된 펩티드는 가급적, in situ 환경에서 이들 펩티드와 통상적으로 연관되는 물질을 포함하지 않는다. “분리된” 영역은 이러한 영역이 유래되는 폴리펩티드의 전체 서열을 보유하지 않는 영역을 의미한다. “분리된” 핵산, 단백질, 또는 이의 개별 단편은 뉴클레오티드 염기서열분석(nucleotide sequencing), 제한 절단(restriction digestion), 특정 부위 돌연변이유발(site-directed mutagenesis), 핵산 단편에 대한 발현 벡터로의 서브클로닝(subcloning) 및 실질적으로 순수한 양으로 단백질 또는 단백질 단편의 획득이 포함되지만 이들이 국한되지 않는 당업자에 의한 조작으로 생체내 환경으로부터 실질적으로 이전된다.

펩티드와 관련하여 본 명세서에서, “변이체”는 야생형 폴리펩티드와 비교하여, 아미노산이 치환된, 결실된, 또는 삽입된 아미노산 서열 변이체를 의미한다. 변이체는 야생형 펩티드의 절두(truncation)일 수도 있다. 따라서, 변이체 펩티드는 이러한 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자의 조작으로 만들어진다. 변이체는 폴리펩티드의 근본적인 활성의 적어도 일부에는 변화 없이 기본적인 조성이나 특성을 변화시킴으로써 만들어진다. 가령, 아주린의 “변이체”는 포유동물 세포에서 HIV 감염의 성장을 저해하는 능력을 유지하는 돌연변이된 아주린일 수 있다. 일부 사례에서, 변이체 펩티드는 비-자연 아미노산, 예를 들면, ε-(3,5-디니트로벤조일)-Lys 잔기로 합성된다(Ghadiri & Fernholz, J. Am. Chem. Soc., 112:9633-9635 (1990)). 일부 구체예에서, 변이체는 야생형 펩티드와 비교하여 20개 이하의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된다. 일부 구체예에서, 변이체는 야생형 펩티드와 비교하여 15개 이하의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된다. 일부 구체예에서, 변이체는 야생형 펩티드와 비교하여 10개 이하의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된다. 일부 구체예에서, 변이체는 야생형 펩티드와 비교하여 6개 이하의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된다. 일부 구체예에서, 변이체는 야생형 펩티드와 비교하여 5개 이하의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된다. 일부 구체예에서, 변이체는 야생형 펩티드와 비교하여 3개 이하의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된다.

본 명세서에서, “아미노산”은 임의의 자연-발생 또는 비-자연 발생 또는 합성 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 모이어티(moiety), 다시 말하면, 적어도 하나의 카르복실 잔기 및 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 탄소 원자, 전형적으로, 1개의 (α) 탄소 원자에 의해 직접적으로 연결된 적어도 하나의 아미노 잔기를 포함하는 임의의 모이어티를 의미한다.

펩티드와 관련하여 본 명세서에서 “유도체”는 표적 펩티드로부터 유래된 펩티드를 의미한다. 유래(derivation)는 펩티드가 근본적인 활성의 일부를 여전히 유지하도록 하는 상기 펩티드의 화학적 변형을 포함한다. 가령, 아주린의 “유도체”는 포유동물 세포에서 HIV 감염의 성장을 저해하는 능력을 유지하는 화학적으로 변형된 아주린일 수 있다. 목적하는 화학적 변형에는 펩티드의 아미드화(amidation), 아세틸화(acetylation), 황화(sulfation), 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 변형, 인산화(phosphorylation) 또는 당화(glycosylation)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이에 더하여, 유도체 펩티드는 화학적 화합물, 예를 들면, 다른 펩티드, 약제 분자 또는 다른 치료제 또는 조제약, 또는 탐지가능 프로브에 폴리펩티드 또는 이의 단편의 융합체(fusion)일 수도 있다.

본 명세서에서 “아미노산 서열 동일성 비율(%)”은 두 서열을 정렬하는 경우에 후보 서열에서 아미노산 잔기와 일치하는 폴리펩티드에서 아미노산 잔기의 비율로서 정의된다. 아미노산 동일성 비율(%)을 결정하기 위하여, 서열은 정렬하고, 필요한 경우, 최대 서열 동일성 비율(％)을 확보하기 위하여 갭(gap)을 도입한다; 보존성 치환은 서열 동일성의 일부로서 간주되지 않는다. 동일성 비율(％)을 측정하기 위한 아미노산 서열 정렬 절차는 당업자에게 공지되어 있다. 공개적으로 가용한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들면, BLAST, BLAST2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어가 펩티드 서열을 정렬하는데 이용된다. 특정한 구체예에서, Blastp(National Center for Biotechnology Information, Bethesda MD로부터 입수가능)는 long complexity filter, expect 10, word size 3, existence 11, extension 1의 디폴트 모수에서 이용된다.

아미노산 서열을 정렬하는 경우에, 일정한 아미노산 서열 B에 대한 일정한 아미노산 서열 A(또는, 일정한 아미노산 서열 B에 대한 특정 아미노산 서열 동일성(％)을 갖거나 포함하는 일정한 아미노산 서열 A)의 아미노산 서열 동일성 비율(%)은 아래와 같이 산정될 수 있다:

아미노산 서열 동일성 비율(%) = X/Y * 100

여기서, X는 서열 정렬 프로그램 또는 알고리즘 정렬에 의해 A와 B의 동일한 정합(match)으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고,

Y는 B에서 아미노산 잔기의 총수이다.

아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동등하지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 비율(％)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 비율(％)과 일치하지 않을 것이다. 더욱 짧은 서열에 더욱 긴 서열을 비교하는 경우에, 더욱 짧은 서열은 “B” 서열이 될 것이다. 가령, 상응하는 야생형 폴리펩티드에 절두된 폴리펩티드를 비교하는 경우에, 절두된 펩티드는 “B” 서열이 될 것이다.

총론

본 발명에서는 포유동물 세포와 포유동물 환자 내에서 바이러스와 세균 감염을 저해하기 위하여 쿠프레독신 및/또는 시토크롬 c₅₅₁을 이용하는 조성물과 방법을 제시한다. 구체적으로, 본 발명에서는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 감염의 성장을 을 저해하기 위하여 쿠프레독신 및/또는 시토크롬 c₅₅₁을 이용하는 조성물과 방법을 제시한다. 본 발명은 또한, 바이러스 감염, 특히, HIV에 의한 감염의 성장을 저해하는 능력을 유지하는 쿠프레독신과 시토크롬 c₅₅₁의 변이체, 유도체와 기능적 등가체 및 이들을 함유하는 조성물에 관계한다. 가장 구체적으로, 본 발명에서는 바이러스 또는 세균 감염, 특히, HIV-1 감염으로 고통받는 환자를 치료하거나, 또는 이러한 위험이 있는 개체에서 감염을 예방하기 위하여 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린과 시토크롬 c₅₅₁, 또는 아주린 또는 시토크롬 c₅₅₁의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 이용하는 조성물과 방법을 제시한다. 최종적으로, 본 발명에서는 포유동물 세포가 감염되기 전후에 이들 세포를 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체와 접촉시키고, 감염의 성장을 측정함으로서 바이러스 또는 세균에 의한 포유동물 세포의 감염을 조사하는 방법을 제시한다.

이전에, 녹농균(P. aeruginosa)에 의해 만들어지는 2가지 산화환원 단백질, 쿠프레독신 아주린과 시토크롬 c₅₅₁(Cyt c₅₅₁)은 둘 모두 J774 세포 내로 들어가고 정상 세포에 비하여 인간 암 세포에 대하여 현저한 세포독성 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다(Zaborina et al., Microbiology 146: 2521-2530 (2000)). 아주린은 또한, 인간 흑색종 UISO-Mel-2 또는 인간 유방암 MCF-7 세포 내로 들어갈 수도 있다(Yamada et al., PNAS 99:14098-14103(2002); Punj et al., Oncogene 23:2367-2378(2004)). 녹농균(P. aeruginosa)으로부터 아주린은 J774 뮤린 세망 세포(reticulum cell) 육종 세포(sarcoma cell) 내로 우선적으로 들어가고, 종양 억제 단백질 p53과 복합체를 형성하여 이를 안정화시키고, p53의 세포내 농도를 강화시키고, 아폽토시스를 유도한다(Yamada et al., Infection and Immunity, 70:7054-7062(2002)).

놀랍게도, 아주린은 말초혈 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 내에서 HIV-1 성장의 대략 90% 억제를 유도할 수 있다(실시예 3 참조). 아주린은 HIV-1의 3가지 균주, Bal(미국과 서유럽에 유포된 가장 우성의 클레이드(clade) B), 클레이드 B African 분리물 RW/92/008/RE1, 클레이드 C Indian 분리물 IN/2167 D15의 성장을 저해하는 것으로 밝혀졌다(실시예 3 참조). 부가적으로, 나이세리균(Neisseria)으로부터 쿠프레독신-유사 단백질(Laz) 및 Laz 단백질의 H.8 영역과 녹농균(P. aeruginosa) 아주린의 융합체 역시 이들 3가지 HIV-1 균주의 성장을 저해하는 것으로 밝혀졌다(실시예 3 참조). 최종적으로, 녹농균(P. aeruginosa)으로부터 아주린과 시토크롬 c₅₅₁의 M44KM64E 돌연변이체가 HIV-감염된 인간 혈액 림프구 내에서 HIV 감염을 저해할 수 있는 것으로 밝혀졌다(실시예 1 참조).

녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 아주린은 ICAM-1(HIV-1 입자에서 관찰되고 HIV-1 감염성(infectivity)을 강화시키는 것으로 알려져 있음), ICAM-2, CD4(HIV-1에 대한 일차 세포 표면 수용체)와 구조적 유사성을 갖는 것으로 밝혀졌다(실시예 2 참조). 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance) 실험에서, 시험관내 아주린이 세포 표면 수용체 CD4에 현저한 결합을 나타내고, 또한 HIV-1 표면 리간드 gp120에 비하여 CD4에 놀랍도록 높은 친화성을 나타내는 것으로 밝혀졌다(실시예 4 참조). 더 나아가, 아주린 아미노산 36-128에 글루타티온 S-트랜스퍼라아제(GST) 융합체인 GST-Azu 36-128은 아주린 자체보다 CD4에 더욱 강한 결합을 나타내는 반면, GST-Azu 88-113은 CD4에 결합을 나타내지 않는데, 이는 이러한 아주린 단백질의 일부만 CD4에 대한 결합에 관여한다는 것을 암시한다(실시예 4 참조). gp120은 CD4에 비하여 아주린에 다소 강한 결합을 나타내는데, 이는 아주린이 gp120과 CD4 모두에 결합한다는 것을 암시한다. 더 나아가, ICAM-3과 NCAM은 시험관내 표면 플라스몬 공명 측정검사에서 아주린에 강한 결합을 나타냈다(실시예 5 참조). 최종적으로, 아주린은 HIV-1의 다른 수용체, 수상돌기 세포-특이적 유착 수용체(dendritic cell-specific adhesion receptor, DC-SIGN)에 결합하는 것으로 밝혀졌다(실시예 7 참조). 숙주 세포, 예를 들면, gp41 내로 HIV-1 침입에 관여하는 다른 단백질은 아주린에 결합을 나타내지 않았다(실시예 4 참조).

경쟁 실험(competition experiment)을 통하여, 아주린은 시험관내에서 gp120과 이의 동족 수용체 CD4의 결합을 간섭할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, GST-Azu 36-128은 CD4 결합에 대하여 gp120과 경쟁하는 현저한 능력을 나타내는 반면, GST-Azu 88-113은 경쟁 능력을 거의 나타내지 못하였다(실시예 6 참조). 나이세리균(Neisseria)으로부터 아주린 유사 단백질, Laz는 HIV-1 감염 이전에 추가되는 경우에 PBMC 배양액 내에서 HIV-1 감염의 성장을 73% 정도 저해하지만 HIV-1 감염 이후에 추가되는 경우에 거의 저해하지 못하는 것으로 밝혀졌다(실시예 8 참조). 본 발명의 효력은 임의의 한 생물체에 한정되지 않지만, 아주린은 HIV 및 세포 표면 수용체, 예를 들면, ICAM, CD4와 DC-SIGN 사이의 상호작용을 간섭하여 HIV가 세포 내로 침입하여 이를 감염시키는 것을 예방함으로써 말초혈 단핵 세포 내에서 HIV-1 감염의 성장을 저해하는 것으로 보인다.

따라서, 쿠프레독신 사이에 높은 수준의 구조적 유사성(structural similarity)으로 인하여, 다른 쿠프레독신 역시 포유동물 혈액 세포 내에서 HIV-1 감염의 성장을 저해할 것이다. 가령, 쿠프레독신은 HIV 감염 이외에, ICAM, DC-SIGN과 CD4에 구조적으로 유사한 세포 표면 수용체에 결합하는 바이러스의 다른 감염 역시 억제할 것이다. 가령, DC-SIGN은 C형 간염 바이러스(hepatitis C virus, HCV), 에볼라 바이러스(Ebola virus), 시토메갈로바이러스(cytomeglovirus, CMV), 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)을 비롯한 다른 바이러스와 세균 병원체의 결합 수용체이다(Wang et al., Chin. Med. J. 117:1395-1400(2004)).

본 발명의 조성물

본 발명에서는 쿠프레독신 또는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 시토크롬 c₅₅₁의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체인 펩티드를 제시한다. 일부 구체예에서, 펩티드는 실질적으로 순수하다. 다른 구체예에서, 펩티드는 이러한 펩티드를 함유하거나, 또는 이러한 펩티드로 본질적으로 구성되는 조성물 내에 존재한다. 다른 구체예에서, 펩티드는 분리된다. 일부 구체예에서, 펩티드는 전장 이하의 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁이고, 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁의 기능적 특징의 일부를 유지한다. 일부 구체예에서, 펩티드는 말초혈 단핵 세포 내에서 바이러스 또는 세균 감염, 구체적으로, HIV-1 감염의 성장을 저해하는 능력을 유지한다. 특정한 구체예에서, 시토크롬 c₅₅₁은 SEQ ID NO:2이다. 다른 특정한 구체예에서, 펩티드는 포유동물, 더욱 바람직하게는, 인간에서 면역 반응을 유발하지 않는다.

본 발명에서는 또한, 적어도 하나의 쿠프레독신, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 시토크롬 c₅₅₁, 또는 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 함유하는 조성물을 제시한다. 본 발명에서는 또한, 적어도 하나의 쿠프레독신, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 시토크롬 c₅₅₁, 또는 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 함유하는 제약학적 조성물을 제시한다.

쿠프레독신 사이에 높은 구조적 상동성으로 인하여, 다른 쿠프레독신이 HIV-1 감염의 성장 저해와 관련하여 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린과 동일한 항-IV 활성을 나타낼 것으로 고려된다. 일부 구체예에서, 쿠프레독신에는 아주린, 슈도아주린, 플라스토시아닌, 루스티시아닌, Laz 또는 아우라시아닌이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 특정한 구체예에서, 아주린은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa); 알칼리게네스 파이칼리스(Alcaligenes faecalis); 아크로모박터 실로속시단 ssp . 데니트리피칸스(denitrificans) I; 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica); 메틸로모나스 종(Methylomonas sp .); 수막염균(Neisseria meningitidis) Z2491; 임균(Neisseria gonorrhoeae); 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens); 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis); 포도피어슨병균(Xylella fastidiosa) 9 a5c, 또는 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus)로부터 유래된다. 더욱 특정한 구체예에서, 아주린은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 유래된다. 다른 특정한 구체예에서, 쿠프레독신은 SEQ ID NO: 1, 3-17인 아미노산 서열을 포함한다. 다른 특정한 구체예에서, 쿠프레독신은 수막염균(Neisseria meningitidis) 또는 임균(Neisseria gonorrhoeae)으로부터 Laz 단백질이다.

본 발명에서는 야생형 폴리펩티드와 비교하여 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁의 아미노산 서열 변이체를 제시한다. 본 발명의 변이체는 야생형 폴리펩티드의 절두일 수도 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 전장 이하의 야생형 폴리펩티드인 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁의 한 영역으로 구성되는 펩티드를 함유한다. 일부 구체예에서, 조성물은 절두된 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁의 10개 이상의 잔기, 15개 이상의 잔기 또는 20개 이상의 잔기로 구성되는 펩티드를 함유한다. 일부 구체예에서, 조성물은 절두된 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁의 100개 이하의 잔기, 50개 이하의 잔기, 40개 이하의 잔기 또는 30개 이하의 잔기로 구성되는 펩티드를 함유한다. 일부 구체예에서, 조성물은 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 더욱 구체적으로, SEQ ID NO: 1-17과 적어도 90% 아미노산 서열 동일성, 적어도 95% 아미노산 서열 동일성 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 펩티드를 함유한다.

특정한 구체예에서, 쿠프레독신의 변이체는 녹농균(P. aeruginosa) 아주린 잔기 36-128, 아주린 잔기 36-88 또는 아주린 잔기 88-113을 포함한다. 다른 구체예에서, 쿠프레독신의 변이체는 녹농균(P. aeruginosa) 아주린 잔기 36-128, 아주린 잔기 36-88 또는 아주린 잔기 88-113으로 구성된다. 다른 특정한 구체예에서, 쿠프레독신의 변이체는 아주린 이외의 쿠프레독신의 등가 잔기(equivalent residue)로 구성된다. 또한, 아주린 잔기 36-128, 아주린 잔기 36-88 또는 아주린 잔기 88-113과 유사한 활성을 갖는 다른 쿠프레독신 변이체가 설계될 수도 있다. 이를 위하여, 표적 쿠프레독신 아미노산 서열은 BLAST, BLAST2, ALIGN2 또는 Megalign(DNASTAR)을 이용하여 녹농균(P. aeruginosa) 아주린 서열, 녹농균(P. aeruginosa) 아주린 아미노산 서열 상에서 발견되는 관련된 잔기, 표적 쿠프레독신 서열에서 발견되는 등가 잔기에 정렬되고, 따라서, 등가의 절두된 변이체가 설계된다.

변이체에는 자연적으로 발생하지 않는 합성 아미노산으로 만들어진 펩티드 역시 포함된다. 가령, 비-자연 발생 아미노산은 혈류(bloodstream) 내에서 조성물의 반감기(half-life)를 연장하거나 최적화하기 위하여 변이체 펩티드 내로 편입된다. 이런 변이체에는 D,L-펩티드(부분입체이성질체(diastereomer))(Futaki et al., J. Biol. Chem. 276(8):5836-40(2001); Papo et al., Cancer Res. 64(16):5779-86(2004); Miller et al, Biochem. Pharmacol. 36(1):169-76, (1987)); 특수한 아미노산을 보유하는 펩티드(Lee et al., J. Pept. Res. 63(2):69-84(2004)), 탄화수소 스테이플링(hydrocarbon stapling)이 후행하는 올레핀-보유 비-자연 아미노산의 통합(Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892(2000); Walenski et al., Science 305:1466-1470(2004)), ε-(3,5-디니트로벤조일)-Lys 잔기를 포함하는 펩티드가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

다른 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁의 유도체이다. 쿠프레독신 및/또는 시토크롬 c₅₅₁의 유도체는 펩티드가 근본적인 활성 중에서 일부를 여전히 유지하도록 하는 상기 펩티드의 화학적 변형(chemical modification)이다. 가령, 아주린의 “유도체”는 포유동물 세포 내에서 HIV 감염의 성장을 저해하는 능력을 유지하는 화학적으로 변형된 아주린일 수 있다. 목적하는 화학적 변형에는 펩티드의 아미드화(amidation), 아세틸화(acetylation), 황화(sulfation), 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 변형, 인산화(phosphorylation) 또는 당화(glycosylation)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이에 더하여, 유도체 펩티드는 화학적 화합물, 예를 들면, 다른 펩티드, 약제 분자 또는 다른 치료제 또는 조제약, 또는 탐지가능 프로브에 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체의 융합체(fusion)일 수도 있다. 목적하는 유도체는 예로써, 원형화된 펩티드(Monk et al., BioDrugs 19(4):261-78,(2005); DeFreest et al., J. Pept. Res.63(5):409-19(2004)), N-과 C-말단 변형(Labrie et al., Clin. Invest. Med. 13(5):275-8,(1990)), 탄화수소 스테이플링(hydrocarbon stapling)이 후행하는 올레핀-보유 비-자연 아미노산의 통합(Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892(2000); Walenski et al., Science 305:1466-1470(2004))이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 당업자에게 널리 공지된 여러 방법에 의해, 혈류 내에서 본 발명의 펩티드와 조성물의 반감기가 연장되거나 최적화될 수 있는 화학적 변형을 보유한다.

본 발명의 조성물의 펩티드는 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁의 변이체, 유도체 및/또는 구조적 등가체일 수 있다. 가령, 이들 펩티드는 PEG화된 아주린의 절두이고, 따라서, 변이체와 유도체가 모두 가능하다. 한 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 올레핀-보유 사슬(olefin-bearing tether)을 보유하고, 루테늄(ruthenium) 촉매된 올레핀 메타세시스(olefin metathesis)에 의한 전체-탄화수소 “주요소(staple)”가 후행하는 α,α-이중치환된 비-자연 아미노산으로 합성된다(Scharmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892(2000); Walensky et al., Science 305:1466-1470(2004)). 부가적으로, 아주린의 구조적 등가체인 펩티드는 다른 펩티드에 융합되고, 따라서, 구조적 등가체와 유도체가 모두 가능한 펩티드를 산출한다. 이들 실례는 본 발명을 예시할 뿐이며 한정하지 않는다. 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 구리에 결합하거나 결합하지 않을 수 있다.

다른 구체예에서, 펩티드는 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁의 구조적 등가체이다. 쿠프레독신과 다른 단백질 사이에 현저한 구조적 상동성을 결정하는 연구의 실례에는 Toth et al., Developmental Cell 1:82-92(2001)가 포함된다. 구체적으로, 쿠프레독신과 구조적 등가체 사이에 현저한 구조적 상동성은 VAST 알고리즘을 이용함으로써 결정된다(Gibrat et al., Curr Opin Struct Biol 6:377-385(1996); Madej et al., Proteins 23:356-3690(1995)). 특정한 구체예에서, 구조적 등가체에 대한 쿠프레독신의 구조적 비교로부터 VAST p 값은 대략 10^-3 이하, 대략 10^-5 이하, 또는 대략 10^-7 이하이다. 다른 구체예에서, 쿠프레독신과 구조적 등가체 사이에 현저한 구조적 상동성은 DALI 알고리즘을 이용함으로써 결정된다(Holm & Sander, J. Mol. Biol. 233:123-138 (1993)). 특정한 구체예에서, 쌍별 구조적 비교(pairwise structural comparison)에 대한 DALI Z 스코어는 적어도 3.5, 적어도 7.0, 또는 적어도 10.0이다.

일부 구체예에서, 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 녹농균(P. aeruginosa) 아주린 또는 시토크롬 c₅₅₁의 기능적 특징 중에서 일부를 갖는다. 특정한 구체예에서, 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁은 포유동물 세포, 더욱 구체적으로, HIV로 감염된 말초혈 단핵 세포 내에서 바이러스 또는 세균 감염, 특히, HIV 감염의 성장을 저해한다. 본 발명에서는 또한, 포유동물 세포 내에서 바이러스 또는 세균 감염, 특히, HIV 감염의 성장을 저해하는 능력을 유지하는 쿠프레독신과 시토크롬 c₅₅₁의 변이체, 유도체와 기능적 등가체를 제시한다. 세포 내에서 HIV-1 감염의 성장은 상업적인 p24 효소 면역검사법(PerkinElmer Life Sciences, Inc., Wellseley,Mass.)으로, 세포 배양 상층액 내에서 HIV-1 p24 항원의 생산에서 변화를 측정함으로써 결정된다. 감염 성장의 저해는 대조 치료(control treatment)와 비교하여 통계학적으로 유의한, 상기 감염의 감소 또는 증가 속도의 완화이다.

쿠프레독신과 시토크롬 c₅₅₁이 포유동물 세포 내에서 바이러스 또는 세균 감염, 특히, HIV 감염의 성장을 저해할 수 있는 것으로 알려져 있기 때문에, 예로써, 이러한 항바이러스 또는 항균 활성, 특히, 항-HIV 활성을 유지하는 쿠프레독신의 변이체, 유도체, 구조적 등가체를 설계하는 것이 가능하다. 이런 변이체, 유도체, 구조적 등가체는 예로써, 쿠프레독신과 시토크롬 c₅₅₁의 다양한 변이체, 유도체, 구조적 등가체의 “라이브러리(library)”를 만들고, 이후 예로써, 당분야에 공지된 방법, 예를 들면, 실시예 3에 기술된 전형적인 방법을 이용하여 이들 각각에서 항바이러스 또는 항균 활성, 특히, 항-HIV 활성을 조사함으로써 제조될 수 있다. 항바이러스 또는 항균 활성, 특히, 항-HIV 활성을 갖는 쿠프레독신의 생성된 변이체, 유도체, 구조적 등가체는 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁ 대신에, 또는 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁에 추가하여 본 발명의 방법에 이용될 수 있다.

일부 특정한 구체예에서, 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 비-결합 대조 단백질과 통계학적으로 상이한 결합 상수(binding constant)로 CD4에 결합한다. 펩티드는 실시예 4에 기술된 바와 같이 표면 플라스몬 공명 분석을 이용함으로써 이런 활성을 조사할 수 있다. 한 단백질이 다른 단백질에 결합하는 지를 결정하는 당분야에 공지된 다른 방법 역시 이용될 수 있다.

일부 특정한 구체예에서, 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 비-결합 대조 단백질과 통계학적으로 상이한 결합 상수(binding constant)로 gp120에 결합한다. 펩티드는 실시예 4에 기술된 바와 같이 표면 플라스몬 공명 분석을 이용함으로써 이런 활성을 조사할 수 있다. 한 단백질이 다른 단백질에 결합하는 지를 결정하는 당분야에 공지된 다른 방법 역시 이용될 수 있다.

일부 특정한 구체예에서, 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 비-결합 대조 단백질과 통계학적으로 상이한 결합 상수(binding constant)로 ICAM3에 결합한다. 펩티드는 실시예 4와 5에 기술된 바와 같이 표면 플라스몬 공명 분석을 이용함으로써 이런 활성을 조사할 수 있다. 한 단백질이 다른 단백질에 결합하는 지를 결정하는 당분야에 공지된 다른 방법 역시 이용될 수 있다.

일부 특정한 구체예에서, 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 비-결합 대조 단백질과 통계학적으로 상이한 결합 상수(binding constant)로 DC-SIGN에 결합한다. 펩티드는 실시예 4와 5에 기술된 바와 같이 표면 플라스몬 공명 분석을 이용함으로써 이런 활성을 조사할 수 있다. 한 단백질이 다른 단백질에 결합하는 지를 결정하는 당분야에 공지된 다른 방법 역시 이용될 수 있다.

일부 특정한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 포유동물 암 세포, 더욱 구체적으로, J774 세포에서 아폽토시스(apoptosis)를 유도한다. 아폽토시스를 유도하는 쿠프레독신 또는 다른 폴리펩티드의 능력은 MITOSENSOR^TM APOLERT^TM 미토콘드리아 막 센서 키트(Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, California, U.S.A)를 이용한 미토센서 ApoAlert 공초점 현미경에 의해, Zou et al., J. Biol . Chem . 274:11549-11556(1999)에 기술된 방법을 이용하여 카스파제-8, 카스파제-9, 카스파제-3을 측정함으로써, 그리고 예로써, APOLERT^TM DNA 단편화 키트(Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, California, U.S.A.)를 이용하여 아폽토시스-유도된 핵 DNA 단편화를 탐지함으로써 관찰될 수 있다.

다른 특정한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 포유동물 암 세포, 더욱 구체적으로, J774 세포에서 세포 성장 정지(cellular growth arrest)를 유도한다. 세포 성장 정지는 예로써, Yamada et al., PNAS 101:4770-4775(2004)에 기술된 방법으로, 세포 주기 진행(cell cycle progression)의 저해 정도를 측정함으로써 결정될 수 있다. 다른 특정한 구체예에서, 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 포유동물 암 세포, 더욱 구체적으로, J774 세포에서 세포 주기 진행을 저해한다.

쿠프레독신

이들 작은 청동(blue copper) 단백질(쿠프레독신)은 세균 전자 전달 연쇄(electron transfer chain)에 참여하거나, 또는 기능이 알려지지 않은 전자 전달 단백질(10-20 kDa)을 이다. 구리 이온은 단백질 매트릭스(단백질 matrix)에 의해서만 결합된다. 구리 주변에 2개의 히스티딘과 1개의 시스테인에 독특한 뒤틀린 삼각형 2차원 정렬은 금속 부위의 매우 고유한 전자 특성 및 강렬한 푸른색을 발생시킨다. 다수의 쿠프레독신이 중간 내지 높은 해상도(resolution)에서 결정학적으로 특성화되었다.

쿠프레독신은 일반적으로, 서열 상동성(sequence homology)이 낮은 반면 구조 상동성(structural homology)이 높다(Gough & Clothia, Structure 12:917-925 (2004); De Rienzo et al., Protein Science 9:1439-1454 (2000)). 가령, 아주린의 아미노산 서열은 아우라시아닌 B의 아미노산 서열에 31%, 루스티시아닌의 아미노산 서열에 16.3%, 플라스토시아닌의 아미노산 서열에 20.3%, 슈도아주린의 아미노산 서열에 17.3% 동일하다(표 1 참조). 하지만, 이들 단백질의 구조 유사성(structural similarity)은 더욱 현저하다. 아주린 대 아우라시아닌 B의 구조 비교에 대한 VAST p 값은 10^-7.4이고, 아주린 대 루스티시아닌의 구조 비교에 대한 VAST p 값은 10^-5이고, 아주린 대 플라스토시아닌의 구조 비교에 대한 VAST p 값은 10^-5.6이고, 아주린 대 슈도아주린의 구조 비교에 대한 VAST p 값은 10^-4.1이다.

모든 쿠프레독신은 8개-가닥 그리스 열쇠 베타-배럴(beta-barrel) 또는 베타-샌드위치(beta-sandwich) 접힘(fold)을 공유하고, 고도로 보존된 부위 구조(site architecture)를 보유한다(De Rienzo et al., Protein Science 9:1439-1454 (2000)). 많은 장쇄 지방족 잔기, 예를 들면, 메티오닌(methionine)과 루이신(leucine)의 존재로 인한 현저한 소수성 패치(hydrophobic patch)가 아주린, 아미시아닌(amicyanin), 시아노박테리아(cyanobacterial) 플라스토시아닌, 오이 기초 단백질 및 정도가 덜하지만, 슈도아주린과 진핵생물 플라스토시아닌 내에서 구리 부위 주변에 존재한다(Id.). 소수성 패치는 정도가 덜하지만 스텔라시아닌과 루스티시아닌 구리 부위 내에서도 관찰되는데, 하지만 특징이 상이하다(Id.).

VAST 알고리즘을 이용하여, 다른 단백질에 대한 녹농균(P. aeruginosa)으로부터 아주린(1JZG)의 서열과 구조 정렬

PDB	정렬 길이 1	aa 동일성 %	P- 값 2	스코어 3	RMSD 4	설명
1AOZ A 2	82	18.3	10e-7	12.2	1.9	아스코르브산 산화효소
1QHQ_A	113	31	10e-7.4	12.1	1.9	아우라시아닌B
1V54 B 1	79	20.3	10e-6.0	11.2	2.1	시토크롬 c 산화효소
1GY2 A	92	16.3	10e-5.0	11.1	1.8	루스티시아닌
3MSP A	74	8.1	10e-6.7	10.9	2.5	운동성 주요 정자 단백질5
1IUZ	74	20.3	10e-5.6	10.3	2.3	플라스토시아닌
1KGY E	90	5.6	10e-4.6	10.1	3.4	ephrinB2
1PMY	75	17.3	10e-4.1	9.8	2.3	슈도아주린

¹정렬된 길이: 2개의 구조 사이에 중첩된 C-알파 원자의 동등 쌍(equivalent pair)의 총수, 다시 말하면, 3D 중첩을 산정하기 위하여 이용되는 잔기의 총수.

²P-VAL: VAST p 값은 확률(probability)로서 표시되는, 이러한 비교의 유의성(significance)의 척도(measure)이다. 가령, p 값이 0.001이면, 우연히 이러한 특성(quality)의 매치(match)를 볼 가능성(odds)은 1000 대 1이다. VAST로부터 p 값은 MMDB 데이터베이스 내에 500개의 독립되고 무관한 유형의 도메인이 존재한다는 가설을 이용하여 복수 비교의 효과에 대하여 조정된다. 이렇게 도출된 p 값은 500으로 나눠진, 각 도메인 쌍의 쌍별 비교에 대한 p 값에 상응한다.

³스코어: VAST 구조-유사성 스코어(structure-similarity score). 이 숫자는 중첩된 이차 구조 요소의 총수 및 이러한 중첩의 특성에 관련된다. 더욱 높은 VAST 스코어는 더욱 높은 유사성과 상관한다.

⁴RMSD: 제곱 평균 제곱근(root mean square) 중첩 잔기(옹스트롬(Angstrom) 단위). 이 숫자는 두 구조의 최적 중첩이후, 동등한 C-알파 원자 사이의 평균 제곱 거리의 제곱근(square root)으로서 산정된다. 주목할 점은 RMSD 수치가 구조적 정렬의 정도에 비례하고, 이러한 크기가 전체 구조 유사성의 서술자(descriptor)로서 RMSD를 이용하는 경우에 고려되어야 하는 것이다.

⁵난모세포(oocyte) 성숙에서 에프린 길항제인 것으로 입증된 꼬마선충(C. elegans) 주요 정자 단백질(Kuwabara, 2003 “The multifaceted C.elegans major sperm Protein: an ephrin signalling antagonist in oocyte maturation” Genes and Development, 17:155-161).

아주린

아주린은 특정 세균에서 전자 전달에 관여하는 쿠프레독신 집단에 속하는 128개의 아미노산 잔기로 구성되는 구리-보유 단백질이다. 아주린에는 녹농균(P. aeruginosa)(SEQ ID NO: 1), 알칼리게네스 자일로족시단스(Alcaligenes xylosoxidans), 알칼리게네스 데니트리피칸(Alcaligenes denitrifican)으로부터 유래된 것들이 포함된다(Murphy et al., J. Mol. Biol. 315:859-71 (2002)). 아주린 사이에 아미노 서열 동일성이 60-90% 사이에서 변하긴 하지만, 이들 단백질은 강한 구조적 상동성을 나타낸다. 모든 아주린은 그리스 열쇠 모티프를 포함하는 특징적인 β-샌드위치를 보유하고, 단일 구리 원자는 상기 단백질의 동일 영역에 항상 위치한다. 이에 더하여, 아주린은 구리 부위를 둘러싸는 본질적으로 중성의 소수성 패치를 본질적으로 보유한다(Murphy et al.).

플라스토시아닌

플라스토시아닌은 한 분자당 하나의 구리 분자를 보유하고 산화된 형태에서 푸른빛을 띠는 시아노박테리아(cyanobacteria), 조류(algae), 식물의 가용성 단백질이다. 이들은 엽록소(chloroplast)에서 생성되는데, 여기서 이들은 전자 운반체(electron carrier)로서 기능한다. 1978년에 포플러 플라스토시아닌 구조의 결정이후, 조류(떼목말(Scenedesmus), 파래속(Enteromorpha), 클라미도모나스(Chlamydomonas))와 식물(강낭콩(French bean)) 플라스토시아닌의 구조가 결정학적 방법 또는 NMR 방법으로 결정되었는데, 이러한 포플러 구조는 1.33 Å 해상도에서 세밀히 구별되었다. SEQ ID NO: 3에서는 호열성 시아노박테리아, 포르미디움 라미노섬(Phormidium laminosum)으로부터 플라스토시아닌의 아미노산 서열을 도시한다.

조류와 관속 식물(vascular plants)의 플라스토시아닌 사이에 서열 불일치(sequence divergence)(가령, 클라미도모나스(Chlamydomonas)와 포플러 단백질 사이에 62% 서열 동일성)에도 불구하고, 이들 3차원 구조가 보존되었다(가령, 클라미도모나스(Chlamydomonas)와 포플러 단백질 사이에 C 알파 위치에서 0.76 Å rms 편차). 구조적 특징에는 8개-가닥 역평행 베타-배럴(beta-barrel)의 한 단부에서 뒤틀린 4배위자리(tetrahedral) 구리 결합 부위, 현저한 네거티브 패치(negative patch), 평평한 소수성 표면(hydrophobic surface)이 포함된다. 구리 부위는 전자 전달 기능을 위하여 최적화되고, 네거티브와 소수성 패치는 생리학적 반응 파트너의 인식에 관여하는 것으로 제안된다. 화학적 변형, 교차-결합, 특정부위 돌연변이 유발 실험은 시토크롬 f와의 결합 상호작용에서 네거티브와 소수성 패치의 중요성을 확인하고, 플라스토시아닌이 관여하는 2가지 기능적으로 중요한 전자 전달 통로의 모형을 확인하였다. 첫 번째 추정 전자 전달 통로는 상대적으로 짧고(대략 4 Å) 소수성 패치 내에 용제-노출된 구리 리간드 His-87을 수반하는 반면, 다른 통로는 더욱 길고(대략 12-15 Å) 네거티브 패치 내에 거의 보존된 잔기 Tyr-83을 수반한다(Redinbo et al., J. Bioenerg. Biomembr. 26(1):49-66 (1994)).

루스티시아닌

루스티시아닌은 티오바실루스(Thiobacillus)(현재, Acidithiobacillus)로부터 획득된 청동-보유 단일-사슬 폴리펩티드이다. 티오바실루스 페로옥시단스(Thiobacillus ferrooxidans)로부터 극히 안정한 고도 산성화 쿠프레독신 루스티시아닌(SEQ ID NO: 4)의 산화된 형태의 X-레이 결정 구조는 다파장 비정상 회절(multiwavelength anomalous diffraction)로 결정되었고 1.9 Å 해상도에서 세밀히 구별되었다. 루스티시아닌은 6-개와 7-개 가닥 β-시트로 구성되는 코어 베타-샌드위치 접힘(core beta-sandwich fold)으로 구성된다. 다른 쿠프레독신과 유사하게, 구리 이온은 뒤틀린 4배위자리 내에 정렬된 4개의 보존된 잔기의 클러스터(His85, Cys138, His143, Met148)에 의해 동위(coordination)된다(Walter et al., J. Mol. Biol. 263:730-51 (1996)).

슈도아주린

슈도아주린은 청동-보유 단일-사슬 폴리펩티드 집단이다. 아크로모박터 시클로클라스테스(Achromobacter cycloclastes)로부터 획득된 슈도아주린의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 5에서 열거된다. 슈도아주린의 X-레이 구조 분석 결과는 슈도아주린이 아주린과의 서열 상동성(sequence homology)이 낮긴 하지만 아주린에 유사한 구조를 갖는다는 것을 보여준다. 2가지 주요한 차이는 슈도아주린과 아주린의 전체 구조 사이에 존재한다. 아주린과 비교하여 슈도아주린에는 2개의 알파-나선으로 구성되는 카르복시 말단 신장이 존재한다. 중간-펩티드 영역에서, 아주린은 슈도아주린에 비하여 연장된 루프를 보유하는데, 이는 짧은 α-나선을 보유하는 플랩(flap)을 형성한다. 구리 원자 부위에서 유일한 주요 차이점은 MET 측쇄의 형태(conformation)와 Met-S 구리 결합 길이인데, 상기 길이는 아주린에서보다 슈도아주린에서 훨씬 짧다.

피토시아닌

피토시아닌(phytocyanin)으로 확인된 단백질에는 오이 기초 단백질, 스텔라시아닌, 마비시아닌(mavicyanin), 우메시아닌(umecyanin), 오이 껍질(cucumber peeling) 쿠프레독신, 피 파드(pea pod)에서 추정 청동 단백질, 애기장대(Arabidopsis thaliana)로부터 청동 단백질이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 오이 기초 단백질과 피-파드 단백질을 제외하고, 청동 부위에서 통상적으로 관찰되는 축 메티오닌 리간드(axial methionine ligand)가 글루타민(glutamine)으로 대체된다.

아우라시아닌

아우라시아닌 A, 아우라시아닌 B-1, 아우라시아닌 B-2로 명명된 3개의 작은 청동 단백질이 호열성 녹색 활주 광합성 세균(thermophilic green gliding photosynthetic bacterium) 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터 분리되었다. 이들 2가지 B 형태는 당단백질이고 서로 거의 동일한 특성을 갖지만 A 형태와는 상이하다. 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에서, 겉보기 단량체 분자질량(apparent monomer molecular mass)이 14(A), 18(B-2), 22(B-1) kDa인 것으로 확인되었다.

아우라시아닌 A의 아미노산 서열은 139개 잔기의 폴리펩티드인 것으로 밝혀졌다(Van Dreissche et al, Protein Science 8:947-957 (1999)). His58, Cys123, His128, Met132는 이들이 공지된 소형 구리 단백질 플라스토시아닌과 아주린에서처럼 진화적으로 보존된 금속 리간드인 경우에 예상되는 방식으로 일정한 거리를 두고 위치한다. 2차 구조 예측 역시 아우라시아닌이 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 아주린 및 포플러 잎으로부터 플라스토시아닌의 베타-배럴 구조와 전반적으로 유사한 베타-배럴 구조를 갖는다는 것을 암시한다. 하지만, 아우라시아닌은 양쪽 소형 구리 단백질 서열의 서열 특징을 모두 갖는 것으로 보인다. 아주린의 공통 서열과 전반적인 유사성은 플라스토시아닌의 공통 서열과의 유사성과 거의 동일하다(다시 말하면, 30.5%). 아우라시아닌의 N-말단 서열 영역 1-18은 글리신과 하이드록시 아미노산이 눈에 띄게 풍부하다(Id). 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터 아우라시아닌의 사슬 A에 대한 전형적인 아미노산 서열 SEQ ID NO: 15(NCBI Protein Data Bank Accession No. AAM12874)를 참조한다.

아우라시아닌 B 분자는 표준 쿠프레독신 접힘을 보유한다. 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터 아우라시아닌 B의 결정 구조가 조사되었다(Bond et al., J. Mol. Biol. 306:47-67 (2001)). 부가적인 N-말단 가닥을 제외하고, 상기 분자는 세균 쿠프레독신, 아주린과 매우 유사하다. 다른 쿠프레독신에서처럼, Cu 리간드 중에서 하나는 상기 폴리펩티드의 가닥 4에 위치하고, 다른 3개는 가닥 7과 8 사이의 대형 루프를 따라서 위치한다. Cu 부위 기하학은 3개의 후자 리간드 사이에 아미노산 간격(amino acid spacing)을 참조하여 논의된다. 아우라시아닌 B의 결정학적으로 특성화된 Cu-결합 도메인은 아마도, 막-결합된 여러 다른 전자-전달 단백질 내에서 공지된 사슬(tether)과 현저한 서열 동일성을 보이는 N-말단 꼬리에 의해 세포질 막의 주변질 부분(periplasmic side)에 속박된다. B 형태의 아미노산 서열은 McManus et al., J Biol Chem. 267:6531-6540 (1992)에서 제시된다. 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터 아우라시아닌의 사슬 B에 대한 전형적인 아미노산 서열 SEQ ID NO: 16(NCBI Protein Data Bank Accession No. 1QHQA)을 참조한다.

스텔라시아닌

스텔라시아닌은 식물 쿠프레독신의 편재성 집단, 피토시아닌의 하위분류이다. 본 명세서에서 스텔라시아닌의 전형적인 서열은 SEQ ID NO: 14에서 열거된다. 양고추냉이 뿌리로부터 스텔라시아닌, 우메시아닌(umecyanin)(Koch et al., J. Am. Chem . Soc. 127:158-166(2005))과 오이 스텔라시아닌(Hart et al., Protein Science 5:2175-2183(1996))의 결정 구조 역시 공지되어 있다. 상기 단백질은 다른 피토시아닌과 유사한 전체 접힘을 보유한다. ephrinB2 단백질 엑토도메인 3차 구조는 스텔라시아닌에 현저한 유사성을 갖는다(Toth et al., Developmental Cell1 :83-92(2001)). 스텔라시아닌의 전형적인 아미노산 서열은 SEQ ID NO:14(National Center for Biotechnology Information Protein DataBank Accession No. 1JER)에서 확인된다.

오이 기초 단백질

오이 기초 단백질로부터 전형적인 아미노산 서열은 본 명세서에서 SEQ ID NO: 17에서 열거된다. 1형 청동 단백질, 오이 기초 단백질(CBP)의 결정 구조는 1.8 해상도에서 세밀히 구별되었다. 상기 분자는 그리스 열쇠 베타-배럴 구조를 보유하는 점에서 다른 청동 단백질과 유사하지만, 상기 배럴은 한 측면에서 개방되고 “베타-샌드위치(beta-sandwich)” 또는 “베타-타코(beta-taco)”로서 기술된다(Guss et al., J. Mol. Biol. 262:686-705 (1996)). 이러한 ephrinB2 단백질 엑토도메인 3차 구조는 오이 기초 단백질에 높은 유사성을 갖는다(50 α 탄소에 대한 rms 편차 1.5)(Toth et al., Developmental Cell 1: 83-92(2001)).

Cu 원자는 결합 길이 Cu-N(His39) = 1.93 , Cu-S(Cys79) = 2.16 , Cu-N(His84) = 1.95 , Cu-S(Met89) = 2.61 로, 정상적인 청동 NNSS' 동위(co-ordination)를 갖는다. 이황화 연결, (Cys52)-S-S-(Cys85)는 이러한 분자 구조를 안정화시키는데 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 폴리펩티드 접힘은 청동 단백질(피토시아닌)의 부분집합(sub-family) 및 CBP가 높은 서열 상동을 갖는 비-금속단백질(non-metalloprotein), 돼지풀 알레르겐(ragweed allergen) Ra3에 전형적이다. 현재 피토시아닌으로 확인된 단백질은 CBP, 스텔라시아닌, 마비시아닌, 우메시아닌, 오이 껍질 쿠프레독신, 피 파드에서 추정 청동 단백질, 애기장대(Arabidopsis thaliana)로부터 청동 단백질이다. CBP와 피-파드 단백질을 제외하고, 청동 부위에서 통상적으로 관찰되는 축 메티오닌 리간드가 글루타민으로 대체된다. 오이 기초 단백질에 대한 전형적인 서열은 SEQ ID NO: 17(NCBI Protein Data Bank Accession No. 2CBP)에서 확인된다.

이용 방법

본 발명에서는 바이러스 또는 세균, 특히, HIV-1로 감염된 환자를 치료하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체인 적어도 하나의 폴리펩티드를 상기 환자에 투여하는 단계를 포함한다. 또한, 상기 방법은 단순 포진 바이러스(Herpes simplex virus, HSV), 에볼라 바이러스(Ebola virus), 시토메갈로바이러스(cytomeglovirus, CMV), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus) 타입 A, B, C; 간염 바이러스(hepatitis virus) A, B, C, G; 델타 간염 바이러스(delta hepatitis virus, HDV), 유행성 이하선염 바이러스(mumps virus), 홍역 바이러스(measles virus), 호흡기 합포체 바이러스(respiratory syncytial virus), 변야바이러스(bunyavirus), 아레나 바이러스(arena virus), 도리 바이러스(Dhori virus)로 불리는 오르소믹소(orthomyxo)-유사 곤충 바이러스, 소아마비 바이러스(poliovirus), 풍진 바이러스(rubella virus), 뎅기열 바이러스(dengue virus), SIV 또는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다른 바이러스 또는 세균으로 감염된 환자를 치료하는데 효과적일 것이다.

또한, 쿠프레독신 또는 시토크롬 c는 동시-제출된 출원에서 개시된 바와 같이, 말라리아 감염에도 효과적인 것으로 밝혀졌다. 더 나아가, HIV와 말라리아로 동시-감염은 전세계 여러 지역, 특히, 사하라 사막 이남 지역에서 매우 흔하게 발생한다. 일부 구체예에서, HIV 감염 환자는 말라리아 기생충에도 감염된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 치료 방법은 항-말라리아제를 투여하는 단계 역시 포함한다. 일부 구체예에서, 항-말라리아제가 공동-투여된다.

본 발명의 이들 방법은 포유동물 세포를 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 함유하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 포유동물 세포는 바이러스 또는 세균, 예를 들면, HIV-1로 감염된다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 바이러스 또는 세균, 예를 들면, HIV-1에 노출된다.

쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 함유하는 조성물은 당업자에게 널리 공지된 여러 경로에 의해 다양한 섭생으로 환자에 투여될 수 있다. 특정한 구체예에서, 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 정맥내, 근육내 또는 피하 투여된다.

한 구체예에서, 이들 방법은 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 함유하는 조성물의 1 단위 용량(unit dose) 및 다른 항바이러스제 또는 항균제, 특히, 항-HIV 약제 및/또는 항-말라리아제를 함유하는 조성물의 1 단위 용량을 순차적으로, 거의 동시에, 또는 다른 약제의 투여이후 일정한 시간 이내에, 예를 들면, 다른 약제의 투여이후 대략 1분 내지 60분 이내에, 또는 다른 약제의 투여이후 대략 1시간 내지 12시간 이내에 환자에 공동-투여하는 단계를 포함한다.

이에 더하여, 본 발명에는 바이러스와 세균 감염을 조사하는데 유용한 방법이 포함된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 바이러스 또는 세균으로 감염된 포유동물 세포를 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체와 접촉시키고, 감염의 성장을 측정하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 포유동물 세포를 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체와 접촉시키고, 이들 세포를 세균 또는 바이러스와 접촉시키고, 이들 세포 내에서 감염의 성장을 측정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 세균 또는 바이러스는 HIV, 단순 포진 바이러스(HSV), 에볼라 바이러스, 시토메갈로바이러스(CMV), 파라인플루엔자 바이러스 타입 A, B, C; 간염 바이러스 A, B, C, G; 델타 간염 바이러스(HDV), 유행성 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 변야바이러스, 아레나 바이러스, 도리 바이러스(Dhori virus)로 불리는 오르소믹소(orthomyxo)-유사 곤충 바이러스, 소아마비 바이러스, 풍진 바이러스, 뎅기열 바이러스, SIV 또는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)이다. 특정한 구체예에서, 바이러스는 HIV-1, 특히, 균주 Bal, 2167, 또는 RW/92/008/RE1이다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 인간이다. 다른 구체예에서, 세포는 혈액 림프구 또는 말초혈 단핵 세포이다. 다양한 구체예에서, 이들 세포는 동물 내에서(생체내에서), 또는 동물 외부에서(시험관내에서) 접촉된다. 일부 구체예에서, 세포는 시험관내에서 접촉되고 동물 내로 도입된다.

쿠프레독신 또는 시토크롬 c ₅₅₁ , 또는 이의 변이체 , 유도체 또는 구조적 등가체를 함유하는 제약학적 조성물

쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 함유하는 제약학적 조성물은 임의의 통상적인 방식, 예를 들면, 통상적인 혼합, 분해, 과립화, 당의정-만들기, 에멀젼화, 캡슐화, 포획, 또는 냉동 건조 과정으로 제조될 수 있다. 실질적으로 순수한 쿠프레독신 및/또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 당분야에 공지된 제약학적으로 허용되는 담체와 쉽게 혼합될 수 있다. 이들 담체는 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액체, 젤, 시럽, 슬러리, 현탁액 등의 형태로 제조를 가능하게 한다. 적절한 부형제에는 예로써, 충전제와 셀룰로오스 제조물이 포함될 수 있다. 다른 부형제에는 예로써, 향료, 착색제, 디태크피어(detackifier), 농후제(thickness) 및 다른 허용되는 첨가제, 어쥬번트 또는 결합제가 포함될 수 있다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 보존제가 실질적으로 존재하지 않는다. 다른 구체예에서, 제약학적 조성물은 적어도 하나의 보존제를 함유한다. 제약학적 제형(dosage form)에 관한 전반적인 방법은 Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Lippencott Williams & Wilkins, Baltimore MD (1999))에서 확인된다.

본 발명에 이용되는 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 함유하는 조성물은 주사(가령, 피내, 피하, 근육내, 복강내 등), 흡입, 국소 투여, 좌약, 경피 패치 또는 경구를 비롯한 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 약제 전달 시스템에 관한 전반적인 정보는 Ansel et al.,Id..에서 확인할 수 있다. 일부 구체예에서, 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 함유하는 조성물은 특히, 피하 주사와 정맥내 주사를 위한 주사가능물질(njectible)로서 제조되고 직접 이용될 수 있다. 이러한 주사가능 제제는 특히, 바이러스 또는 세균 감염, 특히, HIV-감염의 위험이 있는, 이러한 감염에 걸릴 가능성이 높은, 또는 이러한 감염에 걸린 환자를 치료하는데 유익하게 이용될 수 있다. 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 함유하는 조성물은 또한, 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol)과 같은 보호제(protective agent) 또는 유사한 코팅제(coating agent)와의 혼합이후 경구 복용될 수 있다.

주사로 투여되는 경우에, 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 수용액, 바람직하게는, 생리 적합성 완충제, 예를 들면, Hanks 용액, 링거액, 또는 생리 식염수 내에서 제조된다. 용액은 제제 약물(formulatory agent), 예를 들면, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유한다. 대안으로, 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 사용에 앞서, 적절한 운반제, 예를 들면, 발열원 없는 무균수로 구성(constitution)을 위한 분말 형태로 조제된다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 어쥬번트(adjuvant) 또는 이러한 펩티드에 의해 자극되는 면역 반응을 강화시키기 위하여 추가되는 임의의 다른 물질을 함유하지 않는다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 이러한 펩티드에 면역 반응을 저해하는 물질을 함유한다.

정맥액(intravenous fluid)으로 투여되는 경우에, 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 투여하기 위하여 이용되는 정맥액은 결정질(crystalloid) 또는 콜로이드(colloid)로 구성될 수 있다. 본 명세서에서 결정질은 무기 염 또는 다른 수용성 분자의 수용액이다. 본 명세서에서 콜로이드에는 젤라틴(gelatin)과 같은 대형 불용성 분자가 포함된다. 정맥액은 무균이다.

정맥내 투여에 이용되는 결정질액(crystalloid fluid)에는 표 2에 기술된 바와 같이, 정상 염수(0.9% 농도에서 염화나트륨 용액), 링거 락테이트(Ringer's lactate) 또는 링거액(Ringer's solution), 물에 녹인 5% 덱스트로스 용액(일명, D5W)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

공통 결정질 용액의 조성

용액	다른 명칭	[Na + ]	[Cl - ]	[글루코오스]
D5W	5% 덱스트로스	0	0	252
2/3 & 1/3	3.3% 덱스트로스/ 0.3% 염수	51	51	168
반-정상 염수	0.45% NaCl	77	77	0
정상 염수	0.9% NaCl	154	154	0
링거 락테이트*	링거액	130	109	0

^*링거 락테이트는 28 mmol/ℓ 락테이트, 4 mmol/ℓ K⁺, 3 mmol/ℓ Ca^{2 +} 역시 함유한다.

흡입으로 투여되는 경우에, 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 적절한 추진제(propellant), 예를 들면, 디클로로디플루오르메탄, 트리클로로플루오르메탄, 이산화탄소 또는 다른 적절한 가스를 이용한, 가압된 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이의 형태로 전달된다. 가압된 에어로졸의 경우에, 투약 단위(dosage unit)는 정량을 전달하는 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 예로써, 흡입기 또는 취입기에 이용되는 젤라틴의 캡슐과 카트리지는 단백질 및 적절한 분말 기부(base), 예를 들면, 락토오스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하도록 제조된다.

국소 투여되는 경우에, 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 당분야에 널리 공지된 바와 같이, 용액, 겔, 연고, 크림, 현탁액 등으로 제조된다. 일부 구체예에서, 투여는 경피 패치에 의해 달성된다. 좌약(가령, 직장 또는 질)으로 투여되는 경우에, 쿠프레독신 및/또는 시토크롬 c, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 통상적인 좌약 기부를 함유하는 조성물 형태로 제조된다.

경구 투여되는 경우에, 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 이러한 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 당분야에 널리 공지된 제약학적으로 허용되는 담체와 혼합함으로써 용이하게 제조될 수 있다. 고형 담체, 예를 들면, 만니톨, 락토오스, 스테아르산마그네슘 등이 이용된다; 이들 담체는 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체가 치료되는 개체에 의한 경구 섭취를 위한 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제조될 수 있도록 한다. 경구 고형 제제, 예를 들면, 분말, 캡슐, 정제에 적합한 부형제에는 충전제(가령, 당), 셀룰로오스 제조물, 과립화제, 결합제 등이 포함된다.

당분야에 널리 공지된 다른 통상적인 담체에는 다가 담체, 예를 들면, 세균 캡슐 다당류, 덱스트란 또는 유전자 조작된 벡터 역시 포함된다. 이에 더하여, 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 함유하는 서방 제제는 연장된 기간 동안 이러한 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 방출하는데, 이런 서방 제제가 없는 경우에 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 치료 효과를 유도하거나 강화하기에 앞서, 예로써 프로테아제 및 단순한 가수분해에 의해 개체의 조직으로부터 제거되고 및/또는 분해된다.

본 발명의 조성물의 혈류에서 반감기는 원형화된 펩티드(circularized peptide)(Monk et al., BioDrugs 19(4):261-78, (2005); DeFreest et al., J. Pept. Res. 63(5):409-19 (2004)), D,L-펩티드(부분입체이성질체)(Futaki et al., J. Biol. Chem. Feb 23;276(8):5836-40 (2001); Papo et al., Cancer Res. 64(16):5779-86 (2004); Miller et al, Biochem. Pharmacol. 36(1):169-76, (1987)), 특수한 아미노산을 보유하는 펩티드(Lee et al., J. Pept. Res. 63(2):69-84 (2004)), N-과 C-말단 변형(Labrie et al., Clin. Invest. Med. 13(5):275-8, (1990)), 탄화수소 스테이플링(hydrocarbon stapling)(Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892(2000); Walenski et al., Science 305:1466-1470(2004))을 비롯한 당업자에게 널리 공지된 여러 방법으로 연장되거나 최적화될 수 있다. 특히, d-이성질화(isomerization)(치환) 및 D-치환 또는 L-아미노산 치환에 의한 펩티드 안정성의 변형이 주목된다.

다양한 구체예에서, 제약학적 조성물은 담체와 부형제(완충제, 탄수화물, 만니톨, 단백질, 폴리펩티드 또는 아미노산(가령, 글리신), 항산화제, 세균발육 저해제, 킬레이트화제, 현탁제, 농후제 및/또는 보존제 포함), 물, 오일, 염수 용액, 수성 덱스트로스와 글리세롤 용액, 생리 조건을 근사하기 위하여 요구되는 다른 제약학적으로 허용되는 보조 물질(가령, 완충제, 긴장도 조절제(tonicity adjusting agent), 적심제(wetting agent) 등)을 함유한다. 당업자에게 공지된 임의의 담체가 본 발명의 조성물을 투여하는데 이용될 수 있긴 하지만, 담체의 유형은 투여 방식에 따라 달라진다. 화합물은 널리 공지된 기술을 이용하여 리포좀 내에 피포될 수도 있다. 생물분해성 마이크로스피어 역시 본 발명의 제약학적 조성물에 대한 담체로서 이용될 수 있다. 적절한 생물분해성 마이크로스피어는 예로써, U.S. Patent No. 4,897,268; 5,075,109; 5,928,647; 5,811,128; 5,820,883; 5,853,763; 5,814,344; 5,942,252에서 기술된다.

이들 제약학적 조성물은 널리 공지된 통상적인 멸균 기술로 멸균되거나, 또는 멸균 여과될 수 있다. 생성된 수용액은 원상태로 포장되거나, 또는 냉동 건조되는데, 이러한 냉동 건조된 제조물은 투여에 앞서 무균 용액과 혼합된다.

쿠프레독신 또는 시토크롬 c ₅₅₁ , 또는 이의 변이체 , 유도체 또는 구조적 등가체의 투여

쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 예로써, 임의의 적절한 루트에 의해, 예를 들면, 경구, 협측, 흡입, 설하, 직장, 질, 경요도(transurethral), 비강, 국소, 경피, 다시 말하면, 경피 또는 비경구(정맥내, 근육내, 피하, 관상동맥내 포함) 투여될 수 있다. 이의 제약학적 제제는 의도된 목적을 달성하는 효과량으로 투여될 수 있다. 더욱 구체적으로, 조성물은 치료 효과량으로 투여된다. 특정한 구체예에서, 치료 효과량은 일반적으로, 체중 ㎏당 대략 0.01-20 ㎎/day이다.

쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 포함하는 화합물은 단독으로 또는 다른 활성제와의 조합으로, HIV 감염, 또는 다른 바이러스 또는 세균 감염의 치료 및/또는 예방에 유용하다. 적절한 용량은 예로써, 이용된 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체의 화합물, 호스트, 투여 방식, 치료되는 질환의 특성과 심각도에 따라 달라질 것이다. 하지만, 일반적으로, 인간에서 만족스런 결과는 체중 ㎏당 대략 0.01 내지 20 ㎎의 일일 용량(daily dosage)에서 달성되는 것으로 지시된다. 인간에서 지시된 일일 용량은 예로써, 1일 분량, 1주일 분량, 1개월 분량 및/또는 연속 투약(continuous dosing)으로 편의하게 투여되는 대략 0.7 ㎎ 내지 1400 ㎎ 범위의 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체의 화합물이다. 1일 분량은 1일 1회 내지 12회 불연속적으로 투약될 수 있다. 대안으로, 분량은 2일마다, 3일마다, 4일마다, 5일마다, 6일마다, 1주일마다, 이와 유사하게 최대 31일 이상까지 하루씩 증가하여 투약될 수 있다. 대안으로, 투약은 패치, i.v. 투여 등을 이용한 연속 투약일 수 있다.

쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 환자에 도입하는 방법은 일부 구체예에서, 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체와 항-HIV 약제, 예를 들면, 프로테아제-저해물질-함유 칵테일을 동시에 도입하는 것이다. 이들 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다. 특정한 구체예에서, 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 다른 항-HIV 치료제를 포함하는 칵테일의 일부이거나, 또는 이들 치료제와 공동-투여된다. 다른 항-HIV 약제에는 역전사효소 전해물질(reverse transcriptase inhibitor): AZT(지도부딘(zidovudine)[Retrovir]), ddC(잘시타빈(zalcitabine)[Hivid], 디데옥시이노신(dideoxyinosine)), d4T(스타부딘(stavudine)[Zerit]), 3TC(라미부딘(lamivudine)[Epivir]), 비-뉴클레오시드 역전사효소 저해물질(nonnucleoside reverse transcriptase inhibitor)(NNRTIS): 델라비르딘(delavirdine)(Rescriptor)과 네비라핀(nevirapine)(Viramune), 프로테아제 저해물질(protease inhibitor): 리토나비르(ritonavir)(Norvir), 알로피나브르(alopinavir)와 리토나비르(ritonavir) 조합(Kaletra), 사퀴나비르(saquinavir)(Invirase), 인디나비르 설페이트(indinavir sulphate)(Crixivan), 암프레나비르(amprenavir)(Agenerase), 넬피나비르(nelfinavir)(Viracept)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 현재, HIV 환자를 치료하기 위하여 고도 활성 항레트로바이러스 치료제(highly active antiretroviral therapy, HAART)라 불리는, 여러 약제의 조합이 이용되고 있다.

쿠프레독신 또는 시토크롬, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 환자에 도입하는 방법은 일부 구체예에서, 쿠프레독신 또는 시토크롬, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체와 말라리아 치료에 이용되는 약제의 공동-투여(co-administration)이다. 이들 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다. 특정한 구체예에서, 쿠프레독신 및/또는 시토크롬 c는 말라리아 치료제를 포함하는 칵테일의 일부이거나, 또는 이들 치료제와 공동-투여된다. 말라리아 치료제에는 프로구아닐(proguanil), 클로르프로구아닐(chlorproguanil), 트리메토프림(trimethoprim), 클로로퀸(chloroquine), 메플로퀸(mefloquine), 루메판트린(lumefantrine), 아토바큐온(atovaquone), 피리메타민-설파독신(pyrimethamine-sulfadoxine), 피리메타민-다프손(pyrimethamine-dapsone), 할로판트린(halofantrine), 퀴닌(quinine), 퀴니딘(quinidine), 아모디아퀸(amodiaquine), 아모피로퀸(amopyroquine), 설폰아마이드(sulphonamide), 아르테미시닌(artemisinin), 아르테플렌(arteflene), 아르테메테르(artemether), 아르테수네이트(artesunate), 프리마퀸(primaquine), 피로나리딘(pyronaridine), 프로구아닐(proguanil), 클로로퀸(chloroquine), 메플로퀸(mefloquine), 피리메타민-설파독신(pyrimethamine-sulfadoxine), 피리메타민-다프손(pyrimethamine-dapsone), 할로판트린(halofantrine), 퀴닌(quinine), 프로구아닐(proguanil), 클로로퀸(chloroquine), 메플로퀸(mefloquine), 1,16-헥사데카메틸렌비스(N-메틸피롤리디늄)디브로마이드, 이들의 조합이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

정확한 제제, 투여 루트, 용량은 환자의 상태를 고려하여 담당 의사에 의해 결정된다. 용량과 휴지기는 치료 효과를 유지할 만큼 충분한 혈장 수준의 활성 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 제공하기 위하여 개별적으로 조정될 수 있다. 일반적으로, 원하는 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 의도된 투여 루트와 표준 제약학적 관례에 따라 선택된 제약학적 담체와의 혼합물로 투여된다.

한 측면에서, 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 DNA로서 전달되고, 이러한 폴리펩티드가 in situ에서 산출된다. 한 구체예에서, DNA는 예로써, Ulmer et al., Science, Vol.259, pp-1745-49(1993)에 기술되고 Cohen, Science, vol.259, pp-1691-92(1993)에서 논의된 바와 같이 “나신(naked)”이다. 나신 DNA의 흡수는 DNA를 담체, 예를 들면, 세포 내로 효과적으로 수송되는 생분해가능 비드 상에 피복함으로써 증가될 수 있다. 이런 방법에서, DNA는 핵산 발현 시스템, 세균 발현 시스템, 바이러스 발현 시스템을 비롯한 당업자에게 공지된 다양한 전달 시스템 내에 존재한다. DNA를 이런 발현 시스템 내로 통합하는 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다(WO90/11092, WO93/24640, WO93/17706, U.S. Pat. No. 5,736,524).

생물체로부터 생물체로 유전 물질을 이동시키는데 사용되는 벡터는 크게 2가지 부류로 구분될 수 있다: 클로닝 벡터는 적합한 숙주 세포 내에서 증식에 필수적이고 외래 DNA가 삽입될 수 있는 영역을 보유하는 복제 플라스미드 또는 파지이다; 외래 DNA는 벡터의 구성요소인 것처럼 복제되고 증식된다. 발현 벡터(가령, 플라스미드, 효모 또는 동물 바이러스 게놈)는 외래 DNA, 예를 들면, 쿠프레독신의 DNA를 전사하고 번역하기 위하여 숙주 세포 또는 조직 내로 외래 유전물질을 도입하는데 이용된다. 발현 벡터에서, 도입된 DNA는 삽입된 DNA를 고도로 전사하도록 숙주 세포에 신호하는 프로모터와 같은 요소에 작동가능하게 연결된다. 특정 인자에 대응하여 유전자 전사를 조절하는 유도성 프로모터와 같은 일부 프로모터가 특히 유용하다. 쿠프레독신 또는 시토크롬 c, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체 폴리뉴클레오티드를 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결하면, 특정 인자에 대응하여 쿠프레독신 및/또는 시토크롬 c 및 이의 변이체와 유도체의 발현을 조절할 수 있다. 고전적인 유도성 프로모터의 실례는 α-인터페론, 열 충격, 중금속 이온 및 스테로이드, 예를 들면, 글루코코르티코이드(Kaufman, Methods Enzymol. 185:487-511 (1990))와 테트라사이클린에 반응하는 프로모터이다. 다른 바람직한 유도성 프로모터는 이러한 구조체가 삽입되는 세포에 내인성이 아니지만 유도 인자(induction agent)가 외부로부터 공급되면 이들 세포에서 반응하는 프로모터이다. 일반적으로, 유용한 발현 벡터는 주로 플라스미드이다. 하지만, 다른 형태의 발현 벡터, 예를 들면, 바이러스 벡터(가령, 복제 결함성 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스) 역시 고려된다.

벡터 선택은 이용되는 생물체 또는 세포 및 벡터의 원하는 목적에 좌우된다. 일반적으로, 벡터는 신호 서열, 복제 기점, 마커 유전자, 폴리링커 부위(polylinker site), 인헨서 요소, 프로모터, 전사 종결 서열을 포함한다.

쿠프레독신 또는 시토크롬 c ₅₅₁ , 또는 이의 변이체 , 유도체 또는 구조적 등가체를 포함하는 키트

한 측면에서, 본 발명에서는 포장 또는 용기 내에 (1) 적어도 하나의 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체를 함유하는 생물학적 활성 조성물; (2) 역전사효소 전해물질: AZT(지도부딘(zidovudine)[Retrovir]), ddC(잘시타빈(zalcitabine)[Hivid], 디데옥시이노신(dideoxyinosine)), d4T(스타부딘(stavudine)[Zerit]), 3TC(라미부딘(lamivudine)[Epivir]), 비-뉴클레오시드 역전사효소 저해물질(NNRTIS): 델라비르딘(delavirdine)(Rescriptor)과 네비라핀(nevirapine)(Viramune), 프로테아제 저해물질: 리토나비르(ritonavir)(Norvir), 알로피나브르(alopinavir)와 리토나비르(ritonavir) 조합(Kaletra), 사퀴나비르(saquinavir)(Invirase), 인디나비르 설페이트(indinavir sulphate)(Crixivan), 암프레나비르(amprenavir)(Agenerase), 넬피나비르(nelfinavir)(Viracept)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 항바이러스제 또는 항균제, 특히, 항-HIV 약제; (3) 제약학적으로 허용되는 부형제; (4) 투여용 운반기(vehicle), 예를 들면, 주사기; (5) 투약을 위한 사용설명서 중에서 한가지이상을 포함하는 키트를 제시한다. 구성요소 (1)-(5) 중에서 2가지 이상이 동일 포장 또는 용기 내에서 발견되는 구체예 역시 고려된다.

일부 구체예에서, 이들 키트는 항-말라리아 치료제를 더욱 포함한다. 항-말라리아 치료제에는 프로구아닐(proguanil), 클로르프로구아닐(chlorproguanil), 트리메토프림(trimethoprim), 클로로퀸(chloroquine), 메플로퀸(mefloquine), 루메판트린(lumefantrine), 아토바큐온(atovaquone), 피리메타민-설파독신(pyrimethamine-sulfadoxine), 피리메타민-다프손(pyrimethamine-dapsone), 할로판트린(halofantrine), 퀴닌(quinine), 퀴니딘(quinidine), 아모디아퀸(amodiaquine), 아모피로퀸(amopyroquine), 설폰아마이드(sulphonamide), 아르테미시닌(artemisinin), 아르테플렌(arteflene), 아르테메테르(artemether), 아르테수네이트(artesunate), 프리마퀸(primaquine), 피로나리딘(pyronaridine), 프로구아닐(proguanil), 클로로퀸(chloroquine), 메플로퀸(mefloquine), 피리메타민-설파독신(pyrimethamine-sulfadoxine), 피리메타민-다프손(pyrimethamine-dapsone), 할로판트린(halofantrine), 퀴닌(quinine), 프로구아닐(proguanil), 클로로퀸(chloroquine), 메플로퀸(mefloquine), 1,16-헥사데카메틸렌비스(N-메틸피롤리디늄)디브로마이드가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

키트가 공급되는 경우에, 조성물의 서로 다른 구성요소는 별개의 용기 내에 포장되고 사용 직전에 혼합될 수 있다. 이들 구성요소의 이와 같은 개별적인 포장은 활성 구성요소의 기능 상실 없이 장기적인 저장을 가능하게 한다.

키트에 포함되는 반응물은 일정한 용기에 담아 공급함으로써, 서로 다른 구성요소의 수명이 보존되고 용기 재료에 의해 흡수되거나 변형되지 않도록 한다. 가령, 밀봉된 유리 앰풀은 냉동 건조된 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체, 또는 중성의 비-활성 가스, 예를 들면, 질소 하에 포장된 완충제를 포함한다. 앰풀은 임의의 적절한 재료, 예를 들면, 유리, 유기 중합체(가령, 폴리카보네이트, 폴리스트렌 등), 세라믹, 금속, 또는 유사한 반응물을 유지시키는데 전형적으로 이용되는 임의의 다른 물질로 구성된다. 적절한 용기의 다른 실례는 앰풀과 유사한 물질로부터 제조되는 간단한 병 및 알루미늄이나 합금과 같은 박을 입힌 내부를 보유하는 덮개이다. 다른 용기에는 검사 튜브, 바이알, 플라스크, 병, 주사기 등이 포함된다. 용기는 무균 접근 포트(access port), 예를 들면, 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개가 달린 병을 보유한다. 다른 용기는 쉽게 제거가능하고 제거 이후에 구성요소들이 혼합될 수 있도록 하는 막에 의해 분리되는 2개의 구획을 보유한다. 제거가능 막은 유리, 플라스틱, 고무 등이다.

키트에는 사용설명서 역시 제공될 수 있다. 사용설명서는 종이 또는 다른 기질에 인쇄되고 및/또는 전자-판독가능 매체, 예를 들면, 플로피 디스크, CD-ROM, DVD-ROM, Zip 디스크, 비디오테이프, 오디오테이프, 플래시 메모리 장치 등으로 제공될 수 있다. 상세한 사용설명서는 키트에 물리적으로 부착되지 않을 수도 있다; 대신에, 사용자는 이러한 키트의 제조업체 또는 유통업체에 의해 특정된 인터넷 웹 사이트를 안내받거나, 또는 사용설명서를 전자 메일로서 제공받을 수도 있다.

쿠프레독신 및/또는 시토크롬 c ₅₅₁ 및 이의 변이체 , 유도체 또는 구조적 등가체의 변형

쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체는 앞서 기술된 바와 같은 변이체와 유도체를 생산하기 위하여 화학적으로 변형되거나 유전적으로 변화될 수 있다. 이런 변이체와 유도체는 표준 기술에 의해 합성될 수 있다.

쿠프레독신 및 시토크롬 c₅₅₁의 자연-발생 대립형질 변이체 이외에, 인코딩된 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁의 아미노산 서열에서 변형을 유발하지만 포유동물 세포 내에서 바이러스 또는 세균 감염, 특히, HIV 감염의 성장을 저해하는 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁의 능력을 현저하게 변화시키지 않는 변화가 돌연변이에 의해 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁ 코딩 서열 내로 도입될 수 있다. “비-필수”아미노산 잔기는 생물학적 활성의 변화 없이 쿠프레독신의 야생형 서열로부터 변형될 수 있는 잔기인 반면, “필수” 아미노산 잔기는 이런 생물학적 활성에 반드시 필요하다. 가령, 쿠프레독신 사이에 보존되는 아미노산 잔기는 특히, 변형되지 않고, 따라서 “필수”일 것으로 예측된다.

폴리펩티드의 활성을 변화시키지 않는 보존성 치환이 달성될 수 있는 아미노산은 당분야에 널리 공지되어 있다. 유용한 보존성 치환은 표 3, “바람직한 치환”에 도시된다. 한 부류의 아미노산이 동일 유형의 다른 아미노산으로 치환되는 보존성 치환은 이런 치환이 화합물의 생물학적 활성을 물리적으로 변화시키지 않는다면, 본 발명의 범위 내에 속한다.

바람직한 치환

최초 잔기	전형적인 치환	바람직한 치환
Ala (A)	Val, Leu, Ile	Val
Arg (R)	Lys, Gln, Asn	Lys
Asn (N)	Gln, His, Lys, Arg	Gln
Asp (D)	Glu	Glu
Cys (C)	Ser	Ser
Gln (Q)	Asn	Asn
Glu (E)	Asp	Asp
Gly (G)	Pro, Ala	Ala
His (H)	Asn, Gln, Lys, Arg	Arg
Ile (I)	Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleucine	Leu
Leu (L)	Norleucine, Ile, Val, Met, Ala, Phe	Ile
Lys (K)	Arg, Gln, Asn	Arg
Met (M)	Leu, Phe, Ile	Leu
Phe (F)	Leu, Val, Ile, Ala, Tyr	Leu
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Ser	Ser
Trp (W)	Tyr, Phe	Tyr
Tyr (Y)	Trp, Phe, Thr, Ser	Phe
Val (V)	Ile, Leu, Met, Phe, Ala, Norleucine	Leu

(1) 폴리펩티드 골격의 구조, 예를 들면, β-시트 또는 α-나선 구조, (2) 전하, (3) 소수성, 또는 (4) 표적 부위 측쇄의 크기에 영향을 주는 비-보존성 치환은 세포독성 인자 기능을 변화시킬 수 있다. 잔기는 표 4에 제시된 바와 같이, 공통적인 측쇄 특성에 기초하여 여러 군으로 구분된다. 비-보존성 치환은 한 부류의 구성원을 다른 부류의 구성원으로 교체하는 과정을 수반한다. 치환은 보존성 치환 부위, 또는 더욱 구체적으로, 비-보존된 부위 내로 도입될 수 있다.

아미노산 부류

부류	아미노산
소수성	Norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile
중성 친수성	Cys, Ser, Thr
산성	Asp, Glu
염기성	Asn, Gln, His, Lys, Arg
교란된 사슬 구조	Gly, Pro
방향족	Trp, Tyr, Phe

변이체 폴리펩티드는 당분야에 공지된 방법, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드-매개된(특정 부위) 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝, PCR 돌연변이유발을 이용하여 만들 수 있다. 특정 부위 돌연변이유발(Carter, Biochem J. 237:1-7(1986); Zoller and Smith, Methods Enzymol., 154:329-50(1987)), 카세트 돌연변이유발(cassette mutagenesis), 제한 선별 돌연변이유발(restriction selection mutagenesis)(Wells et al., Gene 34:315-23 (1985)), 또는 다른 공지된 기술을 클론된 DNA에서 수행하여 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁ 변이체 DNA를 산출할 수 있다.

쿠프레독신과 시토크롬 c₅₅₁의 공지된 돌연변이는 본 발명의 방법에 이용되는 변이체 쿠프레독신과 시토크롬 c₅₅₁을 산출하는 데에도 이용될 수 있다. 가령, 아주린의 C112D와 M44KM64E 돌연변이체는 고유 아주린과 상이한 세포독성 활성과 성장 정지 활성을 나타내는 것으로 알려져 있는데, 이런 변형된 활성은 본 발명의 치료 방법에서 유용할 수 있다. 본 발명의 이들 방법의 한 가지 구체예에서는 쿠프레독신 및/또는 시토크롬 c₅₅₁ 및 포유동물 세포 내에서 바이러스 또는 세균 감염, 특히, HIV 감염의 성장을 저해하는 능력을 유지하는 이의 변이체와 유도체를 이용한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 방법에서는 세포 성장 정지(cellular growth arrest)를 유도하는 능력을 갖는 쿠프레독신 변이체, 예를 들면, M44KM64E 변이체를 이용한다.

본 발명의 더욱 완전한 이해는 아래의 구체적인 실시예를 참조함으로써 달성될 수 있다. 이들 실시예는 예시의 목적으로만 기술되고, 본 발명의 범위를 한정하지 않는다. 형태에서 변화 및 등가물의 치환은 편법으로 간주된다. 본 명세서에서 특정한 용어가 이용되긴 했지만, 이들 용어는 설명을 목적으로 하고 본 발명을 제한하지 않는다. 본 발명의 기술적 사상과 범주를 벗어나지 않는 본 발명의 개변이 가능하고, 따라서, 본 발명은 첨부된 특허청구범위에 의해서만 한정된다.

실시예 1: 아주린 돌연변이체와 시토크롬C ₅₅₁ 에 의한 림프구의 HIV 감염의 생체내 저해.

아주린의 M44KM64E 돌연변이체는 1:1 기초(1아주린: 1시토크롬 c₅₅₁)로 시토크롬 c₅₅₁과 혼합하였다. HIV-감염된 인간 혈액 림프구는 7일 동안 0, 500 내지 1000 ㎍/㎖의 농도로, 혼합된 아주린/시토크롬 c₅₅₁ 단백질과 함께 배양하였다. 이후, 감염된 림프구 내에서 HIV p24 수준을 측정하였다. p24 수준은 감염된 혈액 내 에서 HIV 바이러스 수준과 공선적인 것으로 알려져 있다. 혈액 내에서 p24 농도 변화의 측정은 혈액 내에서 HIV 바이러스 역가(virus titer)의 변화를 암시한다. 병렬 방식으로, 비-감염된 인간 혈액 림프구로 대조 역시 적용되었다. 7일 배양후, 감염된 림프구 내에서 HIV p24 수준은 0 ㎍/㎖ 아주린과 시토크롬 c₅₅₁의 대조 감염된 림프구에 비하여 25% 내지 90% 감소하였다. 비-감염된 대조 세포 내에서, 단백질 혼합물과 함께 7일 배양후, 세포 사멸(cell death) 및 세포독성(cytotoxicity)이 관찰되지 않았다.

실시예 2. 아주린은 HIV1 로부터 ICAM -1과 구조적 유사성을 나타낸다.

기존 연구(Gough & Chothia, Structure 12:917-925 (2004); Stevens et al., J. Mol. Recognit. 18:150-157 (2005))에서, 쿠프레독신은 면역글로불린 대과 구성원의 가변 도메인에 구조적 유사성(structural similarity)을 나타내는 것으로 밝혀졌다. DALI 알고리즘(Holm & Park, Bioinformatics 16:566-567 (2000))을 이용하여, 녹농균(P. aeruginosa)으로부터 아주린(1JZG)의 구조적 동족체(structural homolog)에 대하여 3D 데이터베이스를 검색하였다(표 5 참조). 아주린은 PfMSP1-19와 복합(complexation)되는 단클론 항체의 Fab 단편뿐만 아니라 대뇌 말라리아(cerebral malaria)에 관여하는 ICAM-1(표 5)에도 구조적 유사성을 나타낸다(Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:1766-1771 (2000); Franke-Fayard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:11468-11473 (2005)).

ICAM-1은 열대열 말라리아(P. falciparum)-감염된 적혈구를 격리하기 위한, 뇌의 미소혈관계(microvasculture) 및 다른 조직 내에 내피세포(endothelial cell) 상에서 수용체로서 기능할 뿐만 아니라 숙주 세포를 통한 HIV-1 입자의 이주(passage) 동안 이들 입자 내에서도 관찰되고, 바이러스 물질의 시토졸 전달(cytosolic delivery)을 강화시킴으로써 HIV-1 감염성을 강화시키는 것으로 알려져 있다(Fortin et al., J. Virol.71:3588-3596 (1997); Tardif & Tremblay, J. Virol. 77:12299-12309 (2003)). ICAM-1은 또한, 리노바이러스(rhinovirus)와 콕사키 바이러스(coxsackie virus)의 주요 군에 대한 수용체로서 반전되는 것으로 알려져 있다(Bella & Rossmann, J. Struct. Biol. 128:69-74 (1999)).

아주린은 HIV-1에 대한 일차적인 숙주 세포 표면 수용체, CD4(표 5)에 구조적 유사성을 나타낸다(Maddon et al., Cell 47:333-348 (1986)). 본 실시예에서는 아주린을 비롯한 쿠프레독신이 마주보게 묶여있고, 면역글로불린 대과 구성원의 가변 도메인 및 세포간 유착 분자(intercellular adhesion molecule, ICAM)와 이들의 리간드의 세포외 도메인에 이황화 가교(disulfide bridge)에 의해 연결된 2개의 역평행 β 시트를 보유한다는 점에서 구조적 유사성을 나타낸다는 것을 입증한다.

녹농균(P. aeruginosa) 아주린과 다양한 병인-관련된 단백질의 구조적 유사성

PDB	주석	참조	아주린(1 jzg )
			DALI z 스코어 (1)	아주린에 RMSD (2)	정렬 길이
1VCA B1	인간 혈관 세포 유착	17	3.5	3.2	80
1CDH	CD4(D1D2 단편) 타입 I 결정 형태	18	3.4	2.8	73
1ZXQ1	ICAM2의 결정 구조	19	3.3	2.9	80
1IAM1	2가지 아미노-말단 유착 분자-1, ICAM-1의 구조	20	3.3	3.1	74
1OB1 A1	열대열 말라리아(Plasmodium falciparum) MSP1-19와의 Fab 복합체의 결정 구조	21	2.9	3.7	84

¹아주린의 구조 정렬은 DALI를 이용하여 수행하였다(Holm & Park, Bioinformatics 16:566-567 (2000)). DALI z 스코어<2를 갖는 구조 쌍(structure pair)은 상이한 것으로 간주된다.

²RMSD 구조 쌍의 정렬된 부분 사이에서 골격 잔기의 평균 평방근 편차(root-mean-square deviation)(옹스트롬(angstrom) 단위).

실시예 3. HIV-1 침입과 바이러스 성장에 대한 아주린 , H.8- 아주린 , Laz 의 효과.

말초혈 단핵 세포(PBMC) 내에서 HIV-1의 3가지 아류형, Bal, RW/92/008/RE1 클레이드 A, IN/2167 D15클레이드 C의 성장에 대한 다양한 농도의 아주린, H.8-아주린, Laz의 효과

paz와 laz 유전자의 클로닝과 발현 . 임균(Neisseria gonorrhoeae)으로부터 laz 유전자는 이의 공지된 서열(SEQ ID NO:19)에 기초하여 클론하였다. 녹농균(P. aeruginosa) 아주린 유전자(SEQ ID NO: 1)(paz) 및 임균(N. gonnerrhoeae)으로부터 laz의 H.8 에피토프의 서열(SEQ ID NO:18)은 H.8-paz를 산출하기 위하여 paz의 5'-말단 내에, 또는 paz-H.8을 산출하기 위하여 paz의 3'-말단 내에 H.8 에피토프 유전자를 인 프레임(inframe) 클론하는데 이용되었다. 본 실시예 및 관련된 실시예에 이용되는 세균 균주와 유전자 구조체는 표 6을 참조한다.

세균 균주와 유전자 구조체

세포/균주/ 플라스미드	관련된 특성*	참고 문헌
녹농균(P. aeruginosa) PAO1	원영양체, FP-(성별 인자 마이너스)	Holloway, et al., Microbiol. Rev. 43: 73-102(1979)
대장균(E. coli) JM109	클로닝과 아주린 발현 균주	Yanisch-Perron, et al., Gene 33: 103-119(1985)
대장균(E. coli) BL21 (DE3)	GST 발현 균주	Novagen
임균(N. gonorrhoeae) F62	DNA 분리에 이용되는 원영양체	American Type Culture Collection
pUC18	일반적인 클로닝 벡터, Apr	Yanisch-Perron, et al., id.
pUC19	일반적인 클로닝 벡터, Apr	Yanisch-Perron, et al., id.
pUC18-laz	pUC18 내로 클론된 임균(N. gonorrhoeae) F62의 게놈 DNA로부터 1 kb PCR 단편	본 명세서
pUC19-paz	HindIII과 PstI 절단된 pUC19 내로 클론된 녹농균(P. aeruginosa) PAO1로부터 0.55 kb PCR 단편, Apr	Yamada, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:14098-14103(2002); Yamada, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:4770-4775(2004)
pUC18-H.8-paz	임균(N. gonorrhoeae)으로부터 H.8 및 녹농균(P. aeruginosa) PAO1로부터 아주린을 인코딩하는 융합 플라스미드, Apr	본 명세서
pGEX-5X-3	GST 유전자 융합 벡터, Apr	Amersham
pET29a	대장균(E. coli) 발현 벡터, Kmr	Novagen
pET29a-gst	gst 유전자를 보유하는 pET29a 유도체, Kmr	본 명세서
pGEX-5X-3-H.8	H.8-인코딩 영역을 보유하는 pGEX-5X-3 유도체, Apr	본 명세서
pET29a-gst-H.8	gst-H.8 유전자를 보유하는 pET29a 유도체, Kmr	본 명세서

*Ap, 암피실린(ampicillin); Km, 카나마이신(kanamycin); GST, 글루타티온 S-트랜스퍼라아제(glutathione S-transferase).

아주린 유전자의 클로닝과 과다발현(hyperexpression)은 기존 문헌(Yamada, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:14098-14103(2002); Punj, et al., Oncogene 23:2367-2378(2004))에서 기술되었다. 임균(Neisseria gonorrhoeae)의 Laz-인코딩 유전자(laz)는 임균(N. gonorrhoeae) 균주 F62의 게놈 DNA를 주형 DNA로 하는 PCR로 증폭하였다. 이용된 정방향과 역방향 프라이머는 5'CCGGAATTCCGGCAGGGATGTTGTAAATATCCG-3'(SEQ ID NO: 20)과 5'GGGGTACCGCCGTGGCAGGCATACAGCATTTCAATCGG-3'(SEQ ID NO:21)인데, 여기서 EcoRI와 KpnI 부위의 부가적으로 도입된 제한 부위는 각각 밑줄로 표시된다. EcoRI와 KpnI로 절단된 1.0 kb의 증폭된 DNA 단편은 pUC18 벡터(Yanisch-Perron, et al., Gene 33:103-119(1985))의 상응하는 부위 내로 삽입하여 laz 유전자를 lac 프로모터의 하류에 배치함으로써 발현 플라스미드 pUC18-laz를 산출하였다(표 6).

임균(N. gonorrhoeae) Laz의 H.8과 녹농균(P. aeruginosa)의 아주린(Paz)의 융합체를 발현하는 플라스미드는 pUC19-paz와 pUC18-laz를 주형으로 하는 PCR로 작제하였다. H.8-Paz 융합체의 경우에, 3.1 kb 단편은 주형으로서 pUC18-laz 및 프라이머, 5'(인산화된)GGCAGCAGGGGCTTCGGCAGCATCTGC-3'(SEQ ID NO:22)과 5'CTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCG-3'(SEQ ID NO:23)으로 증폭하였는데, 여기서 SalI 부위는 밑줄로서 표시된다. PCR 증폭된 0.4 kb 단편은 주형으로서 pUC19-paz 및 프라이머, 5'(인산화된)GCCGAGTGCTCGGTGGACATCCAGG-3'(SEQ ID NO:24)과 5'TACTCGAGTCACTTCAGGGTCAGGGTG-3'(SEQ ID NO:25)로부터 획득하였는데, 여기서 XhoI 부위는 밑줄로서 표시된다. pUC18-laz로부터 SalI 절단된 PCR 단편 및 pUC19-paz로부터 XhoI 절단된 PCR 단편을 클론하여 발현 플라스미드 pUC18-H.8-paz를 산출하였다(표 6).

대장균(E. coli) JM109는 아주린과 이의 유도체 유전자의 발현을 위한 숙주 균주(host strain)로서 이용하였다. 재조합 대장균(E. coli) 균주는 100 ㎍/㎖ 암피실린, 0.1 mM IPTG, 0.5 mM CuSO₄를 포함하는 2X YT 배지 내에서 37℃에서 16시간 동안 배양하여 아주린 단백질을 생산하였다.

이들 플라스미드를 보유하는 대장균(E. coli) 균주를 IPTG의 존재에서 성장시키고, 세포를 용해시키고, 단백질을 아주린에서 기술된 바와 같이 정제하면(Yamada, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:14098-14103(2002); Punj, et al., Oncogene 23:2367-2378(2004); Yamada, et al.,Cell.Microbiol.7:1418-1431(2005)), 기존 문헌(Cannon, Clin. Microbiol. Rev. 2:S1-S4 (1989); Fisette, et al., J. Biol. Chem. 278:46252-46260(2003))에서 기술된 바와 같이 변칙적인 이동을 보이는 H.8 보유 단백질(대략 17 kDa)을 제외하고, 다양한 아주린 유도체가 SDS-PAGE 상에서 단일 성분으로서 이동하였다

HIV-1 억제 측정검사. 아주린, H.8-아주린, Laz는 0.45 필터를 통하여 여과 멸균하였다. 말초혈 단핵 세포(PBMC)는 1시간 동안 폴리브렌(polybrene)(5 ㎍/㎖)으로 처리하고, 마이크로역가 평판 내에 250,000개 세포/웰로 접종하였다. 평판은 800 rpm에서 5분간 회전시켜 세포를 수집하였다. 상층액은 따라버리고, 단백질(0.3, 0.6, 1.2, 6.0, 30 의 농도에서)을 포함하는 배지를 추가하였다(100 ㎕). 이후, 이들 세포는 1시간 동안 배양하였다. AZT(25 )는 대조(control)로서 이용하였다. 이들 단백질을 세포 상에 방치하고, 100 ㎕의 바이러스(Bal, 2167, 또는 RW/92/008/RE1)를 추가하고 2시간 동안 배양하였다. 평판은 800 rpm에서 5분간 다시 회전시키고 단백질과 바이러스를 제거하였다. 단백질과 배지를 100 ㎕의 전체 용적(total volume)으로 다시 추가하고 5일 동안 배양하였다. 5일 기간의 종결 시점에서, 배양 상층액은 ELISA로 HIV/p24를 조사하였다.

도 1에서 결과는 6.0 μM의 농도에서 아주린이 Bal(미국과 서유럽에 유포된 가장 우성의 클레이드 B), 클레이드 B African 분리물 RW/92/008/RE1, 클레이드 C Indian 분리물 IN/2167 D15의 성장의 대략 90% 억제를 나타낸다는 것을 입증한다. 하지만, H.8-아주린(N-말단에 H.8 에피토프를 보유하는 아주린)은 0.3 μM의 낮은 농도에서 3가지 모든 아류형, 특히, African 아류형과 Indian 아류형에 대하여 높은 저해 활성을 나타냈다(도 1).

나이세리균(Neisserial) 아주린 동족체(Gotschlich & Seiff FEMS Microbiol . Lett . 43:253-255 (1987); Kawula et al., Mol. Microbiol. 1:179-185 (1987))의 N-말단 부분에 H.8에피토프를 보유하는 나이세리균(Neisserial) 단백질 Laz는 이들 3가지 아류형, 특히, African 아류형과 Indian 아류형에 대하여 유사한 저해 활성을 나타내는데(도 1), 이는 아주린에 의한 강화된 항-HIV-1 활성을 촉진하는데 있어 H.8 에피토프의 역할을 입증한다. 모든 농도의 이들 3가지 단백질에서 숙주 세포(PBMC) 사멸에 대한 효과는 MTT 측정검사(Yamada et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA99:14098-14103 (2002); Punj et al., Oncogene 23:2367-2378 (2004))에 의해 식별되지 않는데, 이는 HIV-1 성장의 저해가 숙주 세포의 사멸에 기인하지 않는다는 것을 암시한다.

실시예 4. 표면 플라스몬 공명에 의해 조사된 아주린의 gp120 과 CD4 와의 결합.

표면 플라스몬 공명(Surface Plasmon Resonance) 실험은 CD4뿐만 아니라 HIV-1 침입에 관여하는 것으로 알려져 있는 HIV-1 표면 단백질, 예를 들면, gp120 또는 gp41 및 세포내 바이러스 증폭(intracellular virus multiplication)에 관여하는 다른 단백질, 예를 들면, Nef 또는 Gag에 대한 아주린 결합의 정도를 결정하기 위하여 수행하였다.

융합 GST 단백질에 대한 플라스미드 작제 . 융합 글루타티온 S-트랜스퍼라아제(GST)-절두된 wt-아주린(azu) 유도체를 발현하는 플라스미드는 교정(proofreading) DNA 중합효소를 이용한 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)으로 작제하였다. pGST-azu 36-128의 경우에, 증폭된 PCR 단편은 상업적인 GST 발현 벡터 pGEX-5X(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)의 BamHl과 EcoRl 부위 내로 도입하였다. 이러한 단편은 주형으로서 pUC19-azu 및 프라이머, 5'-CGGGATCC CCG GCA ACC TGC CGA AGA ACG TCA TGG GC-3'(SEQ ID NO:26)과 5'-CGGAATTC GCA TCA CTT CAG GGT CAG GG-3'(SEQ ID NO:27)로 증폭하였는데, 여기서 부가적으로 도입된 BamHl과 EcoRI 부위는 각각 밑줄로서 표시된다. azu 유전자의 카르복시-말단 절두는 QuickChange 특정 부위 돌연변이유발 키트(Stratagene, LaJolla, CA)를 이용하여 종결 코돈(stop codon)을 도입함으로써 누적적으로 수행되었다.

pGST-azu 36-89의 경우에, 종결 코돈이 Gly90 내로 도입되었다. pGST-azu 36-128을 보유하는 플라스미드는 주형 DNA로서 이용되었다. 특정 부위 돌연변이유발을 위한 3가지 세트의 올리고뉴클레오티드는 아래와 같다. pGST-azu 36-89의 경우: 5'-CCA AGC TGA TCG GCT CGT GAG AGA AGG ACT CGG TGA CC-3'(SEQ ID NO: 28)과 5'-GGT CAC CGA GTC CTT CTC TCA CGA GCC GAT CAG CTT GG-3'(SEQ ID NO: 29).

pGST-azu 88-113에서, azu 유전자의 카르복시-말단 절두는 QuickChange 특정 부위 돌연변이유발 키트(Stratagene, LaJolla, CA)를 이용하여 종결 코돈(stop codon)을 도입함으로써 누적적으로 수행되었다. pGST-azu 88-113의 경우에, 종결 코돈이 Phe114 내로 도입되었다. pGST-azu 88-128을 보유하는 플라스미드는 주형으로서 이용되었다. pGST-azu 88-128의 경우에, 증폭된 PCR 단편이 상업적인 GST 발현 벡터 pGEX-5X(AmershamBiosciences)의 BamH1과 EcoR1 부위 내로 도입되었다. 이러한 단편은 주형으로서 pUC19-azu 및 프라이머, 5'-CGGGGATCC CCG GCT CGG GCG AGA AGG AC-3'(SEQ ID NO:30)과 5'-CGGGAATTC TCC ACT TCA GGG TCA GGG TG-3'(SEQ ID NO:31)로 증폭하였는데, 여기서 부가적으로 도입된 BamH1과 EcoR1 부위는 각각 밑줄로 표시된다.

pGST-azu 88-113의 제조를 가능하게 하는 특정 부위 돌연변이유발을 위한 한 세트의 올리고뉴클레오티드는 아래와 같다: 5'-GTT CTT CTG CAC CTA GCC GGG CCA CTC CG-3'(SEQ ID NO: 32)과 5'-CGG AGT GGC CCG GCT AGG TGC AGA AGA AC-3'(SEQ ID NO: 33). pGST-azu 88-113을 이용하여 대장균(E. coli) XL-1 Blue 균주를 형질전환(transformation)시켰다. 상업적 키트(Qiagen, Venlo, The Netherlands)를 이용하여 플라스미드 추출을 수행하고, PCR 염기서열분석을 수행하여 플라스미드 삽입과 형질감염(transfection)을 평가하였다.

대장균(E. coli) BL21(DE3)은 gst와 이의 융합 유도체의 발현을 위한 숙주 균주로서 이용하였다. pGST-azu 플라스미드로 형질전환된 대장균(E. coli) 균주 XL1-Blue는 암피실린을 포함하는 LB 배지 내에서 37℃에서 3시간 동안 성장시키고, 이후 발현 수준을 극대화시키기 위하여 IPTG 유도(0.4 mM)를 수행하고 37℃에서 2-4시간 동안 추가 배양하였다. 세포는 원심분리로 분리하고, 25 ㎖의 1X PBS 완충액 내에서 재현탁시켰다. 후속 세포 용해는 아세톤-드라이아이스 전해조(적절한 프로테아제 저해물질을 이용하여) 내에서 초음파처리(얼음 상에서 20분)와 가열-냉각 쇼크(heat-cold shock)를 통한 세포 현탁액의 2가지 순차적 처리를 수반하였다. 세포 용해 혼합물의 상층액은 분리하고, 새로이 충전되고 PBS 평형화된 1 ㎖ 글루타티온-세파로오스 4B(Amersham Biosciences) 칼럼에 통과시켰다. 20 mM Tris-HCl pH 8에 녹인 10 mM 글루타티온을 이용한 GST-azu 산물의 칼럼 세척과 후속 용리이후, Coomassie Brilliant Blue R 시약으로 염색된 10% SDS-PAGE Tris-Gly 겔을 이용한 전기영동(electrophoresis)을 통하여 GST-Azu 88-113 순도를 조사하였다. 단백질 농도는 Bradford 방법을 이용하여 결정하였다.

표면 플라스몬 공명( SPR ) 연구. 시험관내 단백질-단백질 상호작용은 Biacore AB International(Uppsala,Sweden)로부터 Biacore X 분광계를 이용하여 평가하였다. 모든 실험은 25℃에서 HBS-EP 작업 완충액(0.01 M HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% v/v Surfactant P20)) 내에서, Biacore로부터 구입된 Au-CM5 센서 칩을 이용하여 수행하였다. 상기 완충액을 미리 농축하고 교체하기 위한 G-75 칼럼 상에서 탈염(desalting) 및 냉동 건조(lyophilizaiton)이후, PBS에서 단백질 저장 용액(stock solution)을 제조하였다.

CM5 칩 상에서 단백질 고정화(immobilization)는 아민 커플링 절차(amine coupling procedure)에 따라 수행하였다. 단백질 가교결합 효율에서 차이로 인하여, 단백질은 CM5 표면의 NHS/EDC 전활성화(preactivation)이후 다양한 조건 하에 고정되었다: 아주린(510 )의 50 ㎕ 주입, 또는 CD4(25 , 2x) 또는 HIV-1 gp120(10 )의 35 ㎕ 주입. 에탄올아민(1M, pH 8.8)으로 CM5 표면의 후속 처리는 결합 연구에 앞서, 비-가교결합된 단백질을 제거하였다. 결합 연구는 단백질-CM5 표면 상에서 30 ㎕/min의 유속으로 단백질 용리제(50 ㎕)를 주입함으로써 수행되었는데, 이들 주입은 종결 시점에서 120초 시간 지연(time delay)이 병행되었다. 단백질 용리제는 CD4(Protein Sciences Corp., Meriden, CT), HIV-1 gp120 (Immunodiagnostics Inc., Woburn, MA), HIV-1 gp41(Bioclone Inc., San Diego, CA), HIV-1 개그(gag)와 HIV-1-nef(Chemicon International, Temecula, CA), GST-아주린 융합 단백질(발명자의 실험실에서 발현된 GST, GST-Azu 36-128, GST-Azu 36-89, GST-Azu 88-113)을 포함하였다. 센서 칩 표면은 100 mM NaOH(10 ㎕ 주입 펄스(injection pulse))를 이용하여 단백질 주입 간에 재생시켰다. 모든 결합 연구는 비특이적인 결합을 보정하기 위하여 노출된 Au CM5를 보유하는 네거티브 흐름 채널을 대상으로 수행되었다. CD4와 HIV-1 gp120이 용리제(고정되지 않음)로서 기능하는 결합 검사의 경우에, 노출된 Au-CM5 흐름 채널 표면에 대한 비특이적인 단백질 결합을 감소시키기 위하여 1 ㎎/㎖의 카르복시메틸덱스트란(CarboMer Inc., San Diego CA)을 작업 완충액에 추가하였다.

결합 상수 데이터를 산출하기 위하여, 증가하는 농도(0.05-2000 nM)의 단백질 용리제의 주입을 통한 적정 실험을 설계하고 데이터를 수집하였다. 이들 SPR 데이터는 랭뮤어 평형 결합 모형(Langmuir equilibrium binding model)[Req = Rmax/(1 + Kd/C)]에 맞춤될 수 있는데, 상기 모형으로부터 결합 상수(Kd)가 결정되었다. 앞서 기술된 결합 경쟁 연구와 유사하게, HIV-1 gp120 + 경쟁 단백질(아주린, GST-Azu 36-128, GST-Azu 88-113)의 주입을 제외하고 유사한 프로토콜을 이용하여 CD4-CM5와의 경쟁 연구를 수행하였다.

CD4가 센서 칩 내에 고정되는 경우에, 아주린과 gp120 둘 모두 CD4에 현저한 결합을 나타냈다(도 2A). 아주린은 HIV-1 리간드 gp120(Kd = 48.1 nM)보다 CD4(Kd = 36.9 nM)에 대하여 더욱 높은 결합 친화성을 나타냈다. GST-Azu 88-113과 같은 GST-아주린 융합체는 결합을 보이지 않는 반면(도 2A), 다른 GST-아주린 융합 단백질, GST-Azu 36-128은 0.34 nM의 Kd 수치로, 아주린 자체보다 훨씬 강한 결합을 보이는데(도 4A 삽화), 이는 아주린의 단편이 전장 단백질보다 강한 결합 친화성을 유지한다는 것을 암시한다. 아주린이 센서 칩 상에 고정되는 경우에, gp120은 아주린에 대하여, CD4보다 다소 강한 결합을 보이는데(도 2B), 이는 아주린이 높은 친화성으로 gp120과 CD4 둘 모두에 결합한다는 사실을 명백하게 뒷받침한다. 흥미롭게도, HIV-1의 숙주 세포 내로의 침입에 관여하는 gp41은 아주린에 결합을 전혀 보이지 않았다(도 2B). Gag와 Nef에서도 이와 유사한 결합 부재가 관찰되었다.

실시예 5. 표면 플라스몬 공명으로 조사된, 아주린의 ICAM 과 CD5 와의 결합.

수용체로서 HIV-1 감염에 관여하는 것으로 알려져 있는 아주린과 ICAM 사이에는 구조적 유사성이 존재한다(표 5) (Liao et al.,. AIDS Res. Hum. Retroviruses 16:355-366 (2000); Hioe et al., J. Virol. 75:1077-1082 (2001)). ICAM-3은 HIV-1 전사와 바이러스 생산을 촉진하는데 관여하고, 따라서, 세포내 바이러스 성장에 부가적으로 기여한다(Barat et al., J. Virol.78,6692-6697(2004)).

이런 이유로, 아주린 및 ICAM, 예를 들면, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, NCAM 사이에서 SPR로 측정된 단백질-단백질 상호작용을 조사하였다. 아주린이 CM5 칩 상에 고정되는 경우에, ICAM-3(도 2C, K_d = 19.5+5.4 nM)과 NCAM(도 2C, 삽화)은 강한 결합을 보이는 반면, ICAM-1과 ICAM-2는 그렇지 않았다. 임의의 한 메커니즘에 제한됨 없이, HIV-1 성장의 아주린 억제는 부분적으로, 이의 ICAM-3 또는 NCAM과의 상호작용을 통하여 매개될 수도 있다.

실시예 6. 표면 플라스몬 공명으로 조사된, CD4 에 대한 아주린과 gp120 의 경쟁

gp120에 비하여 CD4에 대한 아주린의 더욱 높은 결합 친화성(도 2A)으로 인하여, 아주린이 gp120과 이의 동족 수용체 CD4의 결합을 간섭할 수 있는 지를 살펴보기 위하여 경쟁 실험을 수행하였다. 고정된 CD4 칩에 흡수되는 일정한 농도의 gp120의 존재에서 경쟁 단백질(아주린, GST-Azu 36-128 또는 GST-Azu 88-113)의 농도가 증가함에 따라, 아주린과 GST-Azu 36-128 둘 모두 CD4-CM5 칩으로부터 gp120의 전체 단백질 결합(total protein binding)에서 현저한 감소를 나타냈다(도 2D). 칩으로부터 gp120의 이런 명백한 이동은 GST-Azu 88-113의 경우에 관찰되지 않았다(도 2D). GST-Azu 88-113은 CD4에 결합하지 않는 것으로 밝혀졌다(도 2A). 임의의 한 메커니즘에 한정됨 없이, 이는 아주린 또는 GST-Azu 36-128 융합 단백질이 gp120과 CD4 사이에 복합체 형성을 성공적으로 저해할 수 있음을 암시한다.

실시예 7. 표면 플라스몬 공명으로 조사된, 아주린과 ICAM -3의 DC-SIGN과의 결합.

아주린의 gp120, CD4, ICAM-3과의 강한 결합(도 2)은 DC-SIGN(DC-특이적 세포간 유착 분자 3-그래빙 논인테그린(grabbing nonintegrin))으로 알려져 있는 수상돌기 세포(dendritic cell, DC) 및 DC-SIGN/R로 불리는 관련된 단백질의 표면 상에 존재하는 다른 매우 중요한 HIV-1 결합 단백질의 결합을 모방한다. DC-SIGN은 DC 상에서 풍부하게 발현되는 반면, DC-SIGN/R은 시누소이드 세포(sinusoidal cell)와 내피세포 상에서 주로 발현된다. DC-SIGN은 전문적인 항원 제시 세포(antigen presenting cell)인 DC가 HIV-1을 비롯한 병원체를 포획하고, T 세포 표면 상에서 ICAM-3과의 상호작용을 통하여 휴면(resting) T 세포에 이들 병원체를 제시할 수 있도록 함으로써 HIV-1 면역병인(immunopathogenesis)에서 중요한 역할을 수행한다(Geijtenbeek et al., Cell 100, 575-585(2000); Soilleux, Clin. Sci. 104, 437-446(2003); Geijtenbeek et al., Placenta 22, S19-S23(2001)). DC-SIGN은 또한, HIV-1 외피 단백질 gp120에 강하게 결합하여 HIV-1을 포획하고 이를 CD4⁺ T 세포로 수송하는 것으로 밝혔는데, 이들 세포 내에서 HIV-1은 자유롭게 복제할 수 있다(Snyder et al., J. Virol. 79:4589-4598(2005)). 센서 칩 상에서 고정된 DC-SIGN을 이용한 SPR 실험에서, 아주린(K_d=0.83± 0.05 nM)과 ICAM-3(K_d=0.93± 0.39 nM) 둘 모두 DC-SIGN에 강하게 결합하였다(도 3A). GST-융합 유도체 GST-Azu 36-89는 결합을 거의 나타내지 않는 반면(도 3A), 다른 GST-융합 유도체 GST-Azu 88-113은 상대적으로 강한 결합(K_d=5.98± 1.13nM)을 나타내는데, 이는 DC-SIGN 결합에서 아주린의 C-말단 부분의 관여(involvement)를 뒷받침한다(도 3B). 하지만, GST-Azu 88-113은 CD4와 결합하지 않는데(도 2A), 이는 아주린의 서로 다른 부분이 상이한 결합 특이성(binding specificity)을 갖는다는 것을 암시한다.

임의의 한 메커니즘에 한정됨 없이, DC-SIGN와의 이런 결합은 HIV-1과 DC의 결합을 간섭하는 아주린의 잠재적 능력을 뒷받침한다. 따라서, 점막 세포(mucosal cell)로부터 림프성 T 세포로 HIV-1의 전파를 주도하는, DC 표면 상에서 핵심적인 분자인 DC-SIGN은 gp120, CD4, ICAM-3에 강하게 결합할 수 있는 아주린 또는 Laz로부터 강한 경쟁에 직면할 것이다.

실시예 8. 아주린 / Laz 는 HIV-1 감염의 침입 단계에서 기능한다 .

아주린이 HIV-1 감염의 침입 단계 또는 침입 이후 단계에서 기능하는 지를 결정하기 위하여, HIV-1의 Indian 분리물 IN/2167에 대한 Laz의 효과를 조사하였다. 한 실험에서, 활성화된 PBMC(25,000개 세포/웰)를 6.0 μM Laz 및 HIV-1과 함께 2시간 동안 배양하였다. 혼합물은 원심분리하여 Laz와 HIV-1을 제거하고, Laz가 없는 새로운 배지를 다시 추가하며, 배양액은 5일 동안 성장시켰다. HIV-1 성장은 배양 상층액 내에서 p24의 측정으로 모니터하였다. 이러한 조건 하에, Laz(6.0 μM)는 HIV-1 성장을 43% 저해하였다. 더욱 높은 농도(30 μM)의 Laz에서, 억제 정도는 76%이었다. 병렬 실험에서, HIV-1 감염과 제거이후에 Laz(6 또는 30 μM)가 PBMC에 추가되는 경우에, 바이러스 성장의 억제는 거의 관찰되지 않았다. 양성 대조(positive control)로서, Laz(6.0 μM)가 감염 동안 및 새로운 배지로 상기 바이러스의 제거이후 5일간의 배양 동안에 모두 존재하는 경우에, 저해 정도는 대략 93%이었다. 임의의 한 메커니즘에 한정됨 없이, 이들 데이터는 아주린 또는 Laz가 감염의 초기 단계에서 주로 효과를 발휘한다는 것을 명백하게 암시한다.

실시예 9: 아주린으로 HIV-감염된 환자의 치료

24명의 AIDS 환자는 PCR 기술에 의한 측정에서 혈장 내에서 낮은 또는 검출되지 않는 HIV 바이러스 하중(virus load)(RNA PCR) 및 증가된 CD4+ 카운트를 나타낸다. 이후, CD4+RO+ 세포는 자기 분리(magnetic separation)와 FACS 분류(sorting)에 의해 농축되고, 고유와 감염되지 않은 세포 공동-배양 실험과 관련하여 감염성(infectivity)을 결정하기 위하여 분석된다. CD4+RO+ 기억 세포의 이러한 분석에서, 감염성 HIV의 존재가 확인된다.

이런 이유로, 아주린은 기억 세포(memory cell)를 비롯한 CD4+ 세포가 낮은 수준으로 존재할 때까지 3개월 기간 동안 매2주마다 한 번씩 정맥내 주입(intravenous infusion)으로 4 ㎎/㎡의 용량으로 20명의 환자에 투여된다. 4명의 환자는 위약(placebo)을 복용한다. 아주린의 투여 동안 및 투여 이후 대략 1-2개월의 기간 동안, 또는 CD4+ 세포가 회복될 때까지, 이들 환자는 항생제와 항진균제가 계속 제공된다. 골수 이식(bone marrow transplant)과 사이토킨 요법(cytokine therapy)을 통하여 줄기 세포 또는 전구 세포 대체물이 제공되는데, 이들 둘 모두 통상적인 기술에 따라 수행된다.

치료 동안과 치료 이후, 이들 환자는 빈번한 간격으로 추적되고 CD34 세포 수준, CD4+ 세포의 재확립(reestablishment), CD4+RO+ 세포의 정량(quantitation)이 모니터된다. 부가적으로, 이들 환자의 혈장은 세포 공동-배양(co-culture) 실험으로 바이러스 하중이 분석된다. 활동 CD4+ T 세포와 기억 CD4+ T 세포 내에서 바이러스 하중이 낮은 또는 검출되지 않는 농도로 감소하면, 이들 환자는 아주린 투여가 중단된다. 3개월후, 이들 환자는 항생제와 항진균제 투여가 중단된다. 이후, 이들 환자는 6개월 간격으로 추적되고 바이러스 함량이 분석된다. 이들 결과는 HIV 감염된 환자에 대한 아주린 요법의 효능을 입증한다.

SEQUENCE LISTING <110> The Board of Trustees of the University of Illinois Chakrabarty, Ananda Das Gupta, Tapas Chaudhari, Anita Fialho, Arsenio Hong, Chang Soo Yamada, Tohru <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING HIV INFECTION WITH CUPREDOXIN AND CYTOCHROME C <130> 51282-00059 <150> 60/780,868 <151> 2006-03-10 <150> 60/682,833 <151> 2005-04-20 <150> 11/244,105 <151> 2005-10-06 <150> 60/616,782 <151> 2004-10-07 <150> 60/680,500 <151> 2005-05-13 <150> 10/720,603 <151> 2003-11-11 <150> 60/414,550 <151> 2003-08-15 <150> 10/047,710 <151> 2002-01-15 <150> 60/269,133 <151> 2001-02-15 <160> 33 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 128 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 1 Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn 1 5 10 15 Thr Asn Ala Ile Thr Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn 20 25 30 Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp 35 40 45 Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met 50 55 60 Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val 65 70 75 80 Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr 85 90 95 Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys 100 105 110 Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys 115 120 125 <210> 2 <211> 82 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 2 Glu Asp Pro Glu Val Leu Phe Lys Asn Lys Gly Cys Val Ala Cys His 1 5 10 15 Ala Ile Asp Thr Lys Met Val Gly Pro Ala Tyr Lys Asp Val Ala Ala 20 25 30 Lys Phe Ala Gly Gln Ala Gly Ala Glu Ala Glu Leu Ala Gln Arg Ile 35 40 45 Lys Asn Gly Ser Gln Gly Val Trp Gly Pro Ile Pro Met Pro Pro Asn 50 55 60 Ala Val Ser Asp Asp Glu Ala Gln Thr Leu Ala Lys Trp Val Leu Ser 65 70 75 80 Gln Lys <210> 3 <211> 105 <212> PRT <213> Phormidium laminosum <400> 3 Glu Thr Phe Thr Val Lys Met Gly Ala Asp Ser Gly Leu Leu Gln Phe 1 5 10 15 Glu Pro Ala Asn Val Thr Val His Pro Gly Asp Thr Val Lys Trp Val 20 25 30 Asn Asn Lys Leu Pro Pro His Asn Ile Leu Phe Asp Asp Lys Gln Val 35 40 45 Pro Gly Ala Ser Lys Glu Leu Ala Asp Lys Leu Ser His Ser Gln Leu 50 55 60 Met Phe Ser Pro Gly Glu Ser Tyr Glu Ile Thr Phe Ser Ser Asp Phe 65 70 75 80 Pro Ala Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Cys Ala Pro His Arg Gly Ala Gly 85 90 95 Met Val Gly Lys Ile Thr Val Glu Gly 100 105 <210> 4 <211> 155 <212> PRT <213> Thiobacillus ferrooxidans <400> 4 Gly Thr Leu Asp Thr Thr Trp Lys Glu Ala Thr Leu Pro Gln Val Lys 1 5 10 15 Ala Met Leu Glu Lys Asp Thr Gly Lys Val Ser Gly Asp Thr Val Thr 20 25 30 Tyr Ser Gly Lys Thr Val His Val Val Ala Ala Ala Val Leu Pro Gly 35 40 45 Phe Pro Phe Pro Ser Phe Glu Val His Asp Lys Lys Asn Pro Thr Leu 50 55 60 Glu Ile Pro Ala Gly Ala Thr Val Asp Val Thr Phe Ile Asn Thr Asn 65 70 75 80 Lys Gly Phe Gly His Ser Phe Asp Ile Thr Lys Lys Gly Pro Pro Tyr 85 90 95 Ala Val Met Pro Val Ile Asp Pro Ile Val Ala Gly Thr Gly Phe Ser 100 105 110 Pro Val Pro Lys Asp Gly Lys Phe Gly Tyr Thr Asp Phe Thr Trp His 115 120 125 Pro Thr Ala Gly Thr Tyr Tyr Tyr Val Cys Gln Ile Pro Gly His Ala 130 135 140 Ala Thr Gly Met Phe Gly Lys Ile Val Val Lys 145 150 155 <210> 5 <211> 124 <212> PRT <213> Achromabacter cycloclastes <400> 5 Ala Asp Phe Glu Val His Met Leu Asn Lys Gly Lys Asp Gly Ala Met 1 5 10 15 Val Phe Glu Pro Ala Ser Leu Lys Val Ala Pro Gly Asp Thr Val Thr 20 25 30 Phe Ile Pro Thr Asp Lys Gly His Asn Val Glu Thr Ile Lys Gly Met 35 40 45 Ile Pro Asp Gly Ala Glu Ala Phe Lys Ser Lys Ile Asn Glu Asn Tyr 50 55 60 Lys Val Thr Phe Thr Ala Pro Gly Val Tyr Gly Val Lys Cys Thr Pro 65 70 75 80 His Tyr Gly Met Gly Met Val Gly Val Val Gln Val Gly Asp Ala Pro 85 90 95 Ala Asn Leu Glu Ala Val Lys Gly Ala Lys Asn Pro Lys Lys Ala Gln 100 105 110 Glu Arg Leu Asp Ala Ala Leu Ala Ala Leu Gly Asn 115 120 <210> 6 <211> 128 <212> PRT <213> Alcaligenes faecalis <400> 6 Ala Cys Asp Val Ser Ile Glu Gly Asn Asp Ser Met Gln Phe Asn Thr 1 5 10 15 Lys Ser Ile Val Val Asp Lys Thr Cys Lys Glu Phe Thr Ile Asn Leu 20 25 30 Lys His Thr Gly Lys Leu Pro Lys Ala Ala Met Gly His Asn Val Val 35 40 45 Val Ser Lys Lys Ser Asp Glu Ser Ala Val Ala Thr Asp Gly Met Lys 50 55 60 Ala Gly Leu Asn Asn Asp Tyr Val Lys Ala Gly Asp Glu Arg Val Ile 65 70 75 80 Ala His Thr Ser Val Ile Gly Gly Gly Glu Thr Asp Ser Val Thr Phe 85 90 95 Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Asp Tyr Ala Phe Phe Cys Ser 100 105 110 Phe Pro Gly His Trp Ser Ile Met Lys Gly Thr Ile Glu Leu Gly Ser 115 120 125 <210> 7 <211> 129 <212> PRT <213> Achromobacter xylosoxidans ssp. denitrificans I <400> 7 Ala Gln Cys Glu Ala Thr Ile Glu Ser Asn Asp Ala Met Gln Tyr Asn 1 5 10 15 Leu Lys Glu Met Val Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val His 20 25 30 Leu Lys His Val Gly Lys Met Ala Lys Val Ala Met Gly His Asn Trp 35 40 45 Val Leu Thr Lys Glu Ala Asp Lys Gln Gly Val Ala Thr Asp Gly Met 50 55 60 Asn Ala Gly Leu Ala Gln Asp Tyr Val Lys Ala Gly Asp Thr Arg Val 65 70 75 80 Ile Ala His Thr Lys Val Ile Gly Gly Gly Glu Ser Asp Ser Val Thr 85 90 95 Phe Asp Val Ser Lys Leu Thr Pro Gly Glu Ala Tyr Ala Tyr Phe Cys 100 105 110 Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Met Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Ser 115 120 125 Asn <210> 8 <211> 129 <212> PRT <213> Bordetella bronchiseptica <400> 8 Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Ala Gly Thr Asp Gln Met Gln Phe Asp 1 5 10 15 Lys Lys Ala Ile Glu Val Ser Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn 20 25 30 Leu Lys His Thr Gly Lys Leu Pro Arg Asn Val Met Gly His Asn Trp 35 40 45 Val Leu Thr Lys Thr Ala Asp Met Gln Ala Val Glu Lys Asp Gly Ile 50 55 60 Ala Ala Gly Leu Asp Asn Gln Tyr Leu Lys Ala Gly Asp Thr Arg Val 65 70 75 80 Leu Ala His Thr Lys Val Leu Gly Gly Gly Glu Ser Asp Ser Val Thr 85 90 95 Phe Asp Val Ala Lys Leu Ala Ala Gly Asp Asp Tyr Thr Phe Phe Cys 100 105 110 Ser Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Val 115 120 125 Asp <210> 9 <211> 129 <212> PRT <213> Methylomonas sp. J. <400> 9 Ala Ser Cys Glu Thr Thr Val Thr Ser Gly Asp Thr Met Thr Tyr Ser 1 5 10 15 Thr Arg Ser Ile Ser Val Pro Ala Ser Cys Ala Glu Phe Thr Val Asn 20 25 30 Phe Glu His Lys Gly His Met Pro Lys Thr Gly Met Gly His Asn Trp 35 40 45 Val Leu Ala Lys Ser Ala Asp Val Gly Asp Val Ala Lys Glu Gly Ala 50 55 60 His Ala Gly Ala Asp Asn Asn Phe Val Thr Pro Gly Asp Lys Arg Val 65 70 75 80 Ile Ala Phe Thr Pro Ile Ile Gly Gly Gly Glu Lys Thr Ser Val Lys 85 90 95 Phe Lys Val Ser Ala Leu Ser Lys Asp Glu Ala Tyr Thr Tyr Phe Cys 100 105 110 Ser Tyr Pro Gly His Phe Ser Met Met Arg Gly Thr Leu Lys Leu Glu 115 120 125 Glu <210> 10 <211> 166 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 10 Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ala Ala 1 5 10 15 Glu Ala Pro Ala Ser Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro Ala Asp 20 25 30 Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Gly Asn Cys Ala Ala Thr Val Glu Ser 35 40 45 Asn Asp Asn Met Gln Phe Asn Thr Lys Asp Ile Gln Val Ser Lys Ala 50 55 60 Cys Lys Glu Phe Thr Ile Thr Leu Lys His Thr Gly Thr Gln Pro Lys 65 70 75 80 Thr Ser Met Gly His Asn Ile Val Ile Gly Lys Thr Glu Asp Met Asp 85 90 95 Gly Ile Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys 100 105 110 Pro Asp Asp Ala Arg Val Val Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Gly Gly 115 120 125 Glu Glu Ser Ser Leu Thr Leu Asp Pro Ala Lys Leu Ala Asp Gly Glu 130 135 140 Tyr Lys Phe Ala Cys Thr Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Asn Gly 145 150 155 160 Lys Val Thr Leu Val Asp 165 <210> 11 <211> 128 <212> PRT <213> Pseudomomas fluorescens <400> 11 Ala Glu Cys Lys Thr Thr Ile Asp Ser Thr Asp Gln Met Ser Phe Asn 1 5 10 15 Thr Lys Ala Ile Glu Ile Asp Lys Ala Cys Lys Thr Phe Thr Val Glu 20 25 30 Leu Thr His Ser Gly Ser Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Leu 35 40 45 Val Ile Ser Lys Gln Ala Asp Met Gln Pro Ile Ala Thr Asp Gly Leu 50 55 60 Ser Ala Gly Ile Asp Lys Asn Tyr Leu Lys Glu Gly Asp Thr Arg Val 65 70 75 80 Ile Ala His Thr Lys Val Ile Gly Ala Gly Glu Lys Asp Ser Leu Thr 85 90 95 Ile Asp Val Ser Lys Leu Asn Ala Ala Glu Lys Tyr Gly Phe Phe Cys 100 105 110 Ser Phe Pro Gly His Ile Ser Met Met Lys Gly Thr Val Thr Leu Lys 115 120 125 <210> 12 <211> 128 <212> PRT <213> Pseudomonas chlororaphis <400> 12 Ala Glu Cys Lys Val Asp Val Asp Ser Thr Asp Gln Met Ser Phe Asn 1 5 10 15 Thr Lys Glu Ile Thr Ile Asp Lys Ser Cys Lys Thr Phe Thr Val Asn 20 25 30 Leu Thr His Ser Gly Ser Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp 35 40 45 Val Leu Ser Lys Ser Ala Asp Met Ala Gly Ile Ala Thr Asp Gly Met 50 55 60 Ala Ala Gly Ile Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Gly Asp Ser Arg Val 65 70 75 80 Ile Ala His Thr Lys Ile Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr 85 90 95 Phe Asp Val Ser Lys Leu Thr Ala Gly Glu Ser Tyr Glu Phe Phe Cys 100 105 110 Ser Phe Pro Gly His Asn Ser Met Met Lys Gly Ala Val Val Leu Lys 115 120 125 <210> 13 <211> 129 <212> PRT <213> Xylella fastidiosa 9a5c <400> 13 Lys Thr Cys Ala Val Thr Ile Ser Ala Asn Asp Gln Met Lys Phe Asp 1 5 10 15 Gln Asn Thr Ile Lys Ile Ala Ala Glu Cys Thr His Val Asn Leu Thr 20 25 30 Leu Thr His Thr Gly Lys Lys Ser Ala Arg Val Met Gly His Asn Trp 35 40 45 Val Leu Thr Lys Thr Thr Asp Met Gln Ala Val Ala Leu Ala Gly Leu 50 55 60 His Ala Thr Leu Ala Asp Asn Tyr Val Pro Lys Ala Asp Pro Arg Val 65 70 75 80 Ile Ala His Thr Ala Ile Ile Gly Gly Gly Glu Arg Thr Ser Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Thr Asn Thr Leu Ser Lys Asn Val Ser Tyr Thr Phe Phe Cys 100 105 110 Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Asn Phe Gly 115 120 125 Gly <210> 14 <211> 138 <212> PRT <213> Cucumis sativus <400> 14 Met Gln Ser Thr Val His Ile Val Gly Asp Asn Thr Gly Trp Ser Val 1 5 10 15 Pro Ser Ser Pro Asn Phe Tyr Ser Gln Trp Ala Ala Gly Lys Thr Phe 20 25 30 Arg Val Gly Asp Ser Leu Gln Phe Asn Phe Pro Ala Asn Ala His Asn 35 40 45 Val His Glu Met Glu Thr Lys Gln Ser Phe Asp Ala Cys Asn Phe Val 50 55 60 Asn Ser Asp Asn Asp Val Glu Arg Thr Ser Pro Val Ile Glu Arg Leu 65 70 75 80 Asp Glu Leu Gly Met His Tyr Phe Val Cys Thr Val Gly Thr His Cys 85 90 95 Ser Asn Gly Gln Lys Leu Ser Ile Asn Val Val Ala Ala Asn Ala Thr 100 105 110 Val Ser Met Pro Pro Pro Ser Ser Ser Pro Pro Ser Ser Val Met Pro 115 120 125 Pro Pro Val Met Pro Pro Pro Ser Pro Ser 130 135 <210> 15 <211> 162 <212> PRT <213> Chloroflexus aurantiacus <400> 15 Met Lys Ile Thr Leu Arg Met Met Val Leu Ala Val Leu Thr Ala Met 1 5 10 15 Ala Met Val Leu Ala Ala Cys Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser 20 25 30 Thr Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Pro Val Thr Ile Glu Ile Gly Ser 35 40 45 Lys Gly Glu Glu Leu Ala Phe Asp Lys Thr Glu Leu Thr Val Ser Ala 50 55 60 Gly Gln Thr Val Thr Ile Arg Phe Lys Asn Asn Ser Ala Val Gln Gln 65 70 75 80 His Asn Trp Ile Leu Val Lys Gly Gly Glu Ala Glu Ala Ala Asn Ile 85 90 95 Ala Asn Ala Gly Leu Ser Ala Gly Pro Ala Ala Asn Tyr Leu Pro Ala 100 105 110 Asp Lys Ser Asn Ile Ile Ala Glu Ser Pro Leu Ala Asn Gly Asn Glu 115 120 125 Thr Val Glu Val Thr Phe Thr Ala Pro Ala Ala Gly Thr Tyr Leu Tyr 130 135 140 Ile Cys Thr Val Pro Gly His Tyr Pro Leu Met Gln Gly Lys Leu Val 145 150 155 160 Val Asn <210> 16 <211> 140 <212> PRT <213> Chloroflexus aurantiacus <400> 16 Ala Ala Asn Ala Pro Gly Gly Ser Asn Val Val Asn Glu Thr Pro Ala 1 5 10 15 Gln Thr Val Glu Val Arg Ala Ala Pro Asp Ala Leu Ala Phe Ala Gln 20 25 30 Thr Ser Leu Ser Leu Pro Ala Asn Thr Val Val Arg Leu Asp Phe Val 35 40 45 Asn Gln Asn Asn Leu Gly Val Gln His Asn Trp Val Leu Val Asn Gly 50 55 60 Gly Asp Asp Val Ala Ala Ala Val Asn Thr Ala Ala Gln Asn Asn Ala 65 70 75 80 Asp Ala Leu Phe Val Pro Pro Pro Asp Thr Pro Asn Ala Leu Ala Trp 85 90 95 Thr Ala Met Leu Asn Ala Gly Glu Ser Gly Ser Val Thr Phe Arg Thr 100 105 110 Pro Ala Pro Gly Thr Tyr Leu Tyr Ile Cys Thr Phe Pro Gly His Tyr 115 120 125 Leu Ala Gly Met Lys Gly Thr Leu Thr Val Thr Pro 130 135 140 <210> 17 <211> 96 <212> PRT <213> Cucumis sativus <400> 17 Ala Val Tyr Val Val Gly Gly Ser Gly Gly Trp Thr Phe Asn Thr Glu 1 5 10 15 Ser Trp Pro Lys Gly Lys Arg Phe Arg Ala Gly Asp Ile Leu Leu Phe 20 25 30 Asn Tyr Asn Pro Ser Met His Asn Val Val Val Val Asn Gln Gly Gly 35 40 45 Phe Ser Thr Cys Asn Thr Pro Ala Gly Ala Lys Val Tyr Thr Ser Gly 50 55 60 Arg Asp Gln Ile Lys Leu Pro Lys Gly Gln Ser Tyr Phe Ile Cys Asn 65 70 75 80 Phe Pro Gly His Cys Gln Ser Gly Met Lys Ile Ala Val Asn Ala Leu 85 90 95 <210> 18 <211> 39 <212> PRT <213> Neisseria gonnorrhoeae <400> 18 Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ala Gly 1 5 10 15 Glu Ala Pro Ala Ser Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro Ala Asp 20 25 30 Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala 35 <210> 19 <211> 166 <212> PRT <213> Neisseria gonorrhoeae F62 <400> 19 Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ala Gly 1 5 10 15 Glu Ala Pro Ala Ser Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro Ala Asp 20 25 30 Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Gly Asn Cys Ala Ala Thr Val Glu Ser 35 40 45 Asn Asp Asn Met Gln Phe Asn Thr Lys Asp Ile Gln Val Ser Lys Ala 50 55 60 Cys Lys Glu Phe Thr Ile Thr Leu Lys His Thr Gly Thr Gln Pro Lys 65 70 75 80 Ala Ser Met Gly His Asn Leu Val Ile Ala Lys Ala Glu Asp Met Asp 85 90 95 Gly Val Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys 100 105 110 Pro Asp Asp Ala Arg Val Val Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Gly Gly 115 120 125 Glu Glu Ser Ser Leu Thr Leu Asp Pro Ala Lys Leu Ala Asp Gly Asp 130 135 140 Tyr Lys Phe Ala Cys Thr Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Asn Gly 145 150 155 160 Lys Val Thr Leu Val Asp 165 <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> forward primer for Laz <400> 20 ccggaattcc ggcagggatg ttgtaaatat ccg 33 <210> 21 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 21 ggggtaccgc cgtggcaggc atacagcatt tcaatcgg 38 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 22 ggcagcaggg gcttcggcag catctgc 27 <210> 23 <211> 26 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 23 ctgcaggtcg actctagagg atcccg 26 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 24 gccgagtgct cggtggacat ccagg 25 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 25 tactcgagtc acttcagggt cagggtg 27 <210> 26 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> forward primer for pGST-azu 36-128 <400> 26 cgggatcccc ggcaacctgc cgaagaacgt catgggc 37 <210> 27 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> reverse primer for pGST-azu 36-128 <400> 27 cggaattcgc atcacttcag ggtcaggg 28 <210> 28 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> forward oligonucleotide for pGST-azu 36-89 <400> 28 ccaagctgat cggctcgtga gagaaggact cggtgacc 38 <210> 29 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> reverse oligonucleotide for pGST-azu 36-89 <400> 29 ggtcaccgag tccttctctc acgagccgat cagcttgg 38 <210> 30 <211> 29 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 30 cggggatccc cggctcgggc gagaaggac 29 <210> 31 <211> 29 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 31 cgggaattct ccacttcagg gtcagggtg 29 <210> 32 <211> 29 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 32 gttcttctgc acctagccgg gccactccg 29 <210> 33 <211> 29 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 33 cggagtggcc cggctaggtg cagaagaac 29

Claims (38)

1. 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체이고, 포유동물 세포 내에서 HIV-1 감염의 성장을 저해할 수 있는 분리된 펩티드.
2. 청구항 1에 있어서, 쿠프레독신은 아주린(azurin), 슈도아주린(pseudoazurin), 플라스토시아닌(plastocyanin), 루스티시아닌(rusticyanin), Laz, 또는 아우라시아닌(auracyanin)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
3. 청구항 2에 있어서, 쿠프레독신은 아주린 또는 Laz인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
4. 청구항 1에 있어서, 쿠프레독신은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 알칼리게네스 파이칼리스(Alcaligenes faecalis), 아크로모박터 실로속시단(Achromobacter xylosoxidan), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 메틸로모나스 종(Methylomonas sp .), 수막염균(Neisseria meningitidis), 임균(Neisseria gonorrhoeae), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis), 포도피어슨병균(Xylella fastidiosa), 또는 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus)에서 선택되는 생물체로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
5. 청구항 4에 있어서, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 또는 임균(Neisseria gonorrhoeae)으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
6. 청구항 1에 있어서, SEQ ID NO: 1-17에서 선택되는 서열의 일부인 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
7. 청구항 1에 있어서, SEQ ID NO: 1-17에서 선택되는 서열과 적어도 90% 아미노산 서열 동일성(identity)을 갖는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
8. 청구항 1에 있어서, 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁의 절두인 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
9. 청구항 1에 있어서, 10개 이상의 잔기 및 100개 이하의 잔기를 보유하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
10. 청구항 9에 있어서, 잔기 36-128, 잔기 36-88 또는 잔기 88-113에서 선택되는 아주린의 한 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
11. 청구항 10에 있어서, 잔기 36-128, 잔기 36-88 또는 잔기 88-113에서 선택되는 아주린의 한 영역으로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
12. 청구항 1에 있어서, 잔기 36-128, 잔기 36-88 또는 잔기 88-113에서 선택되는 아주린의 한 영역과 등가의 쿠프레독신 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
13. 적어도 하나의 쿠프레독신, 시토크롬 c₅₅₁, 또는 청구항 1의 펩티드를 함유하는 제약학적 조성물.
14. 청구항 13에 있어서, 정맥내 투여용으로 제조되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
15. 청구항 13에 있어서, 쿠프레독신은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 알칼리게네스 파이칼리스(Alcaligenes faecalis), 아크로모박터 실로속시단(Achromobacter xylosoxidan), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 메틸로모나스 종(Methylomonas sp .), 수막염균(Neisseria meningitidis), 임균(Neisseria gonorrhoeae), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis), 포도피어슨병균(Xylella fastidiosa), 또는 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus)에서 선택되는 생물체로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
16. 청구항 15에 있어서, 쿠프레독신은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 또는 임균(Neisseria gonorrhoeae)으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
17. 청구항 13에 있어서, 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁은 SEQ ID NO: 1-17에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
18. 바이러스 또는 세균으로 감염된 환자를 치료하는 방법에 있어서, 청구항 13의 제약학적 조성물의 치료 효과량을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
19. 청구항 18에 있어서, 환자는 HIV-1, 단순 포진 바이러스(Herpes simplex virus, HSV), 에볼라 바이러스(Ebola virus), 시토메갈로바이러스(cytomeglovirus, CMV), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus) 타입 A, B, C; 간염 바이러스(hepatitis virus) A, B, C, G; 델타 간염 바이러스(delta hepatitis virus, HDV), 유행성 이하선염 바이러스(mumps virus), 홍역 바이러스(measles virus), 호흡기 합포체 바이러스(respiratory syncytial virus), 변야바이러스(bunyavirus), 아레나 바이러스(arena virus), 도리 바이러스(Dhori virus), 소아마비 바이러스(poliovirus), 풍진 바이러스(rubella virus), 뎅기열 바이러스(dengue virus), SIV 또는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에서 선택되는 병원체로 감염되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
20. 청구항 19에 있어서, 환자는 HIV-1로 감염되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
21. 청구항 18에 있어서, 환자는 인간인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
22. 청구항 18에 있어서, 제약학적 조성물은 정맥내 주사, 근육내 주사, 피하 주사, 흡입, 국소 투여, 경피 패치, 좌약, 또는 경구에서 선택되는 방식으로 투여되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
23. 청구항 22에 있어서, 투여 방식은 정맥내 주사인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
24. 청구항 18에 있어서, 제약학적 조성물은 항-바이러스제, 항균제 또는 항-HIV 약제에서 선택되는 적어도 하나의 약제의 투여와 동시에 내지 이러한 투여후 1주 이내에 투여되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
25. 청구항 24에 있어서, 제약학적 조성물은 다른 항-HIV 약제와 동시에 투여되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
26. 쿠프레독신, 시토크롬 c₅₅₁, 또는 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체에서 선택되는 적어도 2개의 분리된 폴리펩티드를 함유하는 조성물.
27. 청구항 26에 있어서, 제약학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
28. 바이알에 담긴 청구항 13의 조성물을 포함하는 키트.
29. 청구항 28에 있어서, 정맥내 투여용으로 설계된 것을 특징으로 하는 키트.
30. 포유동물 세포를 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체와 접촉시키고, 이들 세포를 세균 또는 바이러스와 접촉시키고, 이러한 바이러스 또는 세균의 감염의 성장을 측정하는 단계를 포함하는, 포유동물 세포 내에서 바이러스와 세균 감염을 조사하는 방법
31. 청구항 30에 있어서, 포유동물 세포를 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체와 접촉시키는 단계는 이들 세포를 세균 또는 바이러스와 접촉시키는 단계 이전에 진행되는 것을 특징으로 하는 방법.
32. 청구항 30에 있어서, 포유동물 세포를 쿠프레독신 또는 시토크롬 c₅₅₁, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체와 접촉시키는 단계는 이들 세포를 세균 또는 바이러스와 접촉시키는 단계 이후에 진행되는 것을 특징으로 하는 방법.
33. 청구항 30에 있어서, 세포는 인간 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
34. 청구항 30에 있어서, 세포는 림프종 세포(lymphoma cell) 또는 말초혈 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell)인 것을 특징으로 하는 방법.
35. 청구항 30에 있어서, 바이러스 또는 세균은 HIV-1, 단순 포진 바이러 스(Herpes simplex virus, HSV), 에볼라 바이러스(Ebola virus), 시토메갈로바이러스(cytomeglovirus, CMV), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus) 타입 A, B, C; 간염 바이러스(hepatitis virus) A, B, C, G; 델타 간염 바이러스(delta hepatitis virus, HDV), 유행성 이하선염 바이러스(mumps virus), 홍역 바이러스(measles virus), 호흡기 합포체 바이러스(respiratory syncytial virus), 변야바이러스(bunyavirus), 아레나 바이러스(arena virus), 도리 바이러스(Dhori virus), 소아마비 바이러스(poliovirus), 풍진 바이러스(rubella virus), 뎅기열 바이러스(dengue virus), SIV 또는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
36. 청구항 35에 있어서, 바이러스는 HIV-1인 것을 특징으로 하는 방법.
37. 청구항 1의 펩티드를 인코딩하는 발현 벡터.
38. 쿠프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가체이고, CD4, gp120, ICAM3, DC-SIGN에서 선택되는 단백질에 결합할 수 있는 분리된 폴리펩티드.

Images