JP2009502797A - 血管形成をキュプレドキシンで制御するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、哺乳類の細胞、組織、および動物の血管形成を、特に腫瘍発生を伴う血管形成（特にヒトにおける）を阻害するためのキュプレドキシンを含んでいる組成物及びその使用に関する。特に、本発明は、キュプレドキシンを含んでいる組成物および／または哺乳類の細胞、組織、または動物の血管形成を阻害する能力を保持しているキュプレドキシンのバリアント、誘導体、または構造上の均等物であるペプチドに関する。これらの組成物は、とりわけペプチドまたは薬学的組成物であってもよい。本発明の組成物を使用して、不適切な血管形成および腫瘍発生に関連する不適切な血管形成の症状または原因を有する任意の病理学的なコンディションを治療しえる。

Description

[関連出願]
本出願は、米国特許仮出願第60/700,297（2005年7月19日に出願）、および米国特許出願第11/436,592（2006年5月19日に出願され、2006年2月3日に出願された米国特許仮出願第60/764,749の優先権を主張する）；および米国特許出願第11/244,105（2005年10月6日に出願され、2004年10月7日に出願された米国特許仮出願第60/616,782の優先権を主張する）、および米国特許仮出願第60/680,500（2005年5月13日に出願、本出願は、2003年11月11日に出願された米国特許出願第10/720,603の一部継続出願であり、これは2003年8月15日に出願された米国特許仮出願第60/414,550の優先権を主張し、2002年1月15日に出願された米国特許出願第10/047,710の一部継続出願であり、2001年2月15日に出願された米国特許仮出願第60/269,133の優先権を主張する）に関して35 U.S.C. §§119および120の優先権を主張する出願である。これらの出願の内容の全体は、参照によって本明細書中に完全に援用される。

［政府の利益に関する陳述］
本出願の主題は、米国メリーランド州ベセスダの国立衛生研究所（NIH）からの研究助成金（助成金番号AI 16790-21, ES 04050-16, AI 45541, CA09432 およびN01-CM97567）によって助成された。米国政府は、本発明に特定の権利を有している。

［発明の分野］
本発明は、特に緑膿菌アズリン（Pseudomonas aeruginosa azurin）などのキュプレドキシンおよびキュプレドキシンのバリアント, 誘導体および構造上の均等物に関し、哺乳類の不適切な血管形成（angiogenesis）に関するコンディションを治療するための哺乳類の血管形成の阻害における、特に腫瘍発生に関連する血管形成の阻害におけるその使用に関する。また、本発明は、哺乳類の患者（特に血管形成を阻害するために）に投与できるキュプレドキシンおよびキュプレドキシンのバリアント、誘導体、および構造上の均等物を含んでいる薬学的組成物に関する。

［背 景］
血管形成は、既存の内皮の脈管構造（vasculature）からの新しい血管の形成である〔Folkman, et al., J. Exp. Med. 133:275-288, (1971)〕。大抵の腫瘍は、栄養分および代謝物の供給が拡散的な交換の制限により不十分となる場合に、臨界的な体積の1-2 mmをこえて成長を持続するために血管形成を必要とする〔Folkman, J. Nat. Cancer Inst. 82:4-6 (1990)〕。血管形成が失われている腫瘍は、無期限に休眠したままであり、血液供給が要求されたときのみ急速に成長する〔Brem et al., Cancer Res.36:2807-2812 (1976)〕。血管形成の度合は、しばしば腫瘍の進行とともに増加する〔Dome et al., J. Pathol. 197:355-362 (2002)〕。更に、腫瘍の浸潤性および転移性の伝播は、血管形成依存性のイベントであると考えられる〔Folkman, Ann Surg. 175:409-416 (1972)〕。新しく形成された血管によって、癌細胞が循環系に進入し、体の遠い部位に伝播する経路が提供される〔Fidler and Ellis, Cell 79:185-188 (1994)〕。

というのも、血管形成は、腫瘍の成長および伝播における複合的なプロセスであり、癌治療の重要な焦点である。抗血管形成治療は、固形腫瘍のみならず、造血性の腫瘍、白血病およびミエローマにも効果的である〔Bellamy et al., Cancer Res. 59:728-733 (1999); Rajkumar et al., Leukemia. 13:469-472 (1999)〕。内皮細胞は、腫瘍細胞よりもより良い治療の標的であると考えられる。というのも、それらは腫瘍細胞よりも長い世代時間を有し、より遺伝的な安定だからである。従って、内皮細胞は、治療上の投与に対して薬剤抵抗性を生じることによって治療を「回避（escape）」する可能性は低い〔Boehn-Vaiswanathan, Curr. Opin. Oncol. 12:89-94 (2000)〕。

また、哺乳類が罹患する他のコンディションは、不適切な血管形成に関する。湿性黄斑変性症（Wet macular degeneration）は、毛細血管が不適切に網膜に成長する場合に生じる。また、不適切な血管形成は、他の疾患のなかでも糖尿病性網膜症、乾癬、および関節リウマチの基礎的な特徴として関与している〔Bussolino et al., Trends Biochem. Sci. 22:251-256 (1997); Folkman, Nat. Med. 1: 27-31 (1995)〕。

必要なことは、不適切な血管形成（特に、腫瘍形成の間に発生するもの）に関する付加的な療法である。係る療法は、新しい血管の不適切な又は望まれない形成を示す多くのコンディションに有用であろう。

［発明の概要］
本発明は、哺乳類の細胞、組織、および動物の血管形成を、特に腫瘍発生を伴う血管形成（特にヒトにおける）を阻害するためのキュプレドキシンを含んでいる組成物及びその使用に関する。特に、本発明は、キュプレドキシンを含んでいる組成物および／または哺乳類の細胞、組織、または動物の血管形成を阻害する能力を保持しているキュプレドキシンのバリアント、誘導体、または構造上の均等物であるペプチドに関する。これらの組成物は、とりわけペプチドまたは薬学的組成物であってもよい。本発明の組成物を使用して、不適切な血管形成および腫瘍発生に関連する不適切な血管形成の症状（symptom）または原因（cause）を有する任意の病理学的なコンディションを治療しえる。

本発明の一側面は、キュプレドキシンのバリアント、誘導体、または構造上の均等物である単離されたペプチドであって、哺乳類細胞において血管形成を阻害できる単離されたペプチドである。キュプレドキシンは、アズリン, シュードアズリン, プラストシアニン, ラスティシアニン, Lazおよびアウラシアニン, および特にアズリンであってもよい。キュプレドキシンは、Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes faecalis, Achromobacter xylosoxidan, Bordetella bronchiseptica, Methylomonas sp., Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhea, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis, Xylella fastidiosa およびVibrio parahaemolyticus, および特にPseudomonas aeruginosaからのものであってもよい。前記単離されたペプチドは、配列番号1, 3〜19の一部または配列番号1, 3〜19が少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する配列であってもよい。
前記単離されたペプチドは、キュプレドキシンの短縮（truncation）であってもよい。これらの場合において、前記単離されたペプチドは、約 10 残基以上で約 100 残基以下であってもよい。前記単離されたペプチドは、緑膿菌のアズリン残基50〜77、残基50〜67または残基36〜88または配列番号20〜24を含む。さらに、前記単離されたペプチドは、緑膿菌の残基50〜77、残基50〜67または残基36〜88または配列番号20〜24からなっていてもよい。最終的に、前記単離されたペプチドは、緑膿菌アズリンの残基50〜77, 残基50〜67または残基36〜88の均等な残基（equivalent residues）を含んでもよい。

本発明の別の側面は、少なくとも１つのキュプレドキシンまたは単離されたペプチドを薬学的に許容される担体中に含む薬学的組成物である。この薬学的組成物は、少なくとも２つのキュプレドキシンまたは単離されたペプチドを含んでもよい。さらに、前記薬学的組成物は、静脈内投与のために製剤化されてもよい。幾つかの態様において、前記キュプレドキシンは、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）, Alcaligenes faecalis, Achromobacter xylosoxidan, Bordetella bronchiseptica, Methylomonas sp., Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhea, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis, Xylella fastidiosa またはVibrio parahaemolyticusからのもの、特に緑膿菌からのものである。前記キュプレドキシンは、配列番号1, 3〜19であってもよい。

本発明の別の側面は、不適切な血管形成に関するコンディションに罹患している哺乳類の患者を治療するための方法であって、前記患者に治療上効果的な量の薬学的組成物を投与することを備える方法である。ある態様において、前記患者はヒトである。前記患者は、癌を、特にメラノーマ, 乳房, 膵臓, グリア芽細胞腫, 星細胞腫, または肺癌に罹患している患者であってもよい。他の態様において、前記患者は、黄斑変性症, 糖尿病性網膜症, 乾癬または関節リウマチからなる群から選択されるコンディションに罹患している患者であってもよい。これらの方法において、前記薬学的組成物は、静脈内注射, 筋肉内注射, 皮下注射, 吸入, 局所的投与, 経皮性のパッチ, 坐剤, 硝子体注射（vitreous injection）または経口投与で、特に静脈内注射で投与される。
本発明の方法の幾つかの態様において、前記薬学的組成物は、少なくとも１つの他の抗癌薬を、別の抗癌薬と凡そ同時に共投与（co-administered）される。本発明の方法の他の態様において、前記薬学的組成物は、抗黄斑変性症薬, 抗糖尿病性網膜症薬, 抗乾癬薬または抗関節リウマチ薬と共投与される。

本発明の別の側面は、前記薬学的組成物をバイアル中に含んでいるキットである。このキットを、静脈内投与のために設計してもよい。

本発明の別の側面は、血管形成または不適切な血管形成に関するコンディションを研究するための方法であって、血管形成する能力を有する哺乳類細胞をキュプレドキシンまたはキュプレドキシンのバリアント、誘導体、または構造上の均等物と接触させることと、血管形成の伸長（extend）を測定することを備える方法である。一態様において、前記細胞は、ヒト細胞である。他の態様において、前記哺乳類細胞は、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVECs；Human Umbilical Vascular Endothelium Cells)である。

本発明の別の側面は、キュプレドキシンのバリアント、誘導体、または構造上の均等物をコード化する発現ベクターである。

本発明のこれらの及び他の側面、効果、および特性は、添付される図面および特定の態様の詳細な記述から明らかである。

［配列の簡単な説明］
配列番号1； Pseudomonas aeruginosaからのアズリンのアミノ酸配列。
配列番号2； P28, 緑膿菌のアズリン残基50〜77のアミノ酸配列。
配列番号3； Phormidium laminosumからのプラストシアニンのアミノ酸配列。
配列番号4； Thiobacillus ferrooxidansからのラスティシアニンのアミノ酸配列。
配列番号5； Achromobacter cycloclastesからのシュードアズリンのアミノ酸配列。
配列番号6； Alcaligenes faecalisからのアミノ酸配列。
配列番号7； Achromobacter xylosoxidans ssp. denitrificans Iからのアズリンのアミノ酸配列。
配列番号8； Bordetella bronchisepticaからのアズリンのアミノ酸配列。
配列番号9； Methylomonas sp. Jからのアズリンのアミノ酸配列。
配列番号10； Neisseria meningitidis Z2491からのアズリンのアミノ酸配列。
配列番号11； Pseudomonas fluorescenからのアズリンのアミノ酸配列。
配列番号12； Pseudomonas chlororaphisからのアズリンのアミノ酸配列。
配列番号13； Xylella fastidiosa 9a5cからのアズリンのアミノ酸配列。
配列番号14； Cucumis sativusからのステラシアニンのアミノ酸配列。
配列番号15； Chloroflexus aurantiacusからのアウラシアニンAのアミノ酸配列。
配列番号16； Chloroflexus aurantiacusからのアウラシアニンBのアミノ酸配列。
配列番号17； Cucumis sativusからのキュウリ塩基性タンパク質（cucumber basic protein）のアミノ酸配列。
配列番号18； Neisseria gonorrhoeae F62からのLazのアミノ酸配列。
配列番号19； Vibrio parahaemolyticusからのアズリンのアミノ酸配列。
配列番号20； Chloroflexus aurantiacusのアウラシアニンBのアミノ酸57〜89のアミノ酸配列。
配列番号21； Pseudomonas syringaeのアズリンのアミノ酸51〜77のアミノ酸配列。
配列番号22； Neisseria meningitidis Lazのアミノ酸89〜115のアミノ酸配列。
配列番号23； Vibrio parahaemolyticusのアズリンのアミノ酸52〜78のアミノ酸配列。
配列番号24； Bordetella bronchisepticaのアズリンのアミノ酸51〜77のアミノ酸配列。
［発明の詳細な記述］
定義
本明細書中に使用される「細胞」の用語には、特に「単一細胞（single cell）」として記載されないかぎり、該用語の単数形または複数形が含まれる。

本明細書中に使用される、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」の用語は、アミノ酸残基のポリマーを意味させるために互換的に使用される。前記用語は、1以上のアミノ酸残基が対応する天然のアミノ酸の人工的な化学的アナログであるアミノ酸ポリマーに適用される。前記用語は、天然のアミノ酸ポリマーにも適用される。「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」の用語は、糖鎖形成、脂質付着（lipid attachment）、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ-カルボキシル化、ヒドロキシル化、およびADP-リボシル化を含む修飾をも包括的に含むが、これらに限定されない。ポリペプチドは、必ずしも全体的に直線状であるとはかぎらない。一例を挙げると、ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分枝してもよく、環状であってもよく（分枝の有無）、これは一般的には天然のプロセシングを含む翻訳後修飾イベントおよび天然では生じないヒトの操作によって生じるイベントの結果である。環状の、分枝状の、および分枝環状（branched circular）のポリペプチドは、非翻訳的な天然のプロセスによって及び完全に合成的な方法によって合成しえる。

本明細書中に使用される「病理学的コンディション（pathological condition）」の用語には、生きている動物又はその一部の正常状態を失うこと、身体機能の実行の中断または修正、および様々な因子（栄養不良, 工業災害, または気候）への、特定の感染性の因子（寄生虫, 寄生性の原生動物, 細菌, またはウイルス）への、生物体の遺伝性の欠陥（遺伝的な異常）への、又はこれらの因子の組み合わせへの応答から構成される正常からの解剖的な及び生理的な逸脱（deviations）が含まれる。

本明細書中に使用される「コンディション」の用語には、生きている動物又はその一部の正常状態を失うこと、身体機能の実行の中断または修正から構成される正常からの解剖的な及び生理的な逸脱が含まれる。

本明細書中に使用される「に罹患している（suffering from）」の用語には、病理学的コンディションからの回復における又は病理学的コンディションから回復した、現在観察可能な症状（symptoms）なしであっても病理学的コンディションを有している病理学的コンディションの症状を呈していることが含まれる。

本明細書中に使用される「治療（treatment）」の用語には、前記コンディションの又は治療されるコンディションに関連している症状の進行または重症度を、予防すること（preventing）、低下させること（lowering）、停止させること（stopping）、又は好転させること（reversing）が含まれる。同様に、本明細書中に使用される「治療」の用語には、必要に応じて、医療的（medical）な、療法的（therapeutic）な、および／または予防的（prophylactic ）な投与が含まれる。

本明細書中に使用される「細胞成長を阻害する（inhibit cell growth）」の用語は、細胞分裂および／または細胞増大（cell expansion）の緩徐化または中止（ceasing）を意味する。本用語には、細胞発生の阻害または細胞死の増加も含まれる。

本明細書中に使用される「血管形成を阻害する（inhibit angiogenesis）」の用語は、身体の特定の細胞、組織、または位置の血管の形成を、緩徐化すること、中止すること、または好転させることを意味する。血管形成の阻害は、内皮細胞への直接または間接的な効果によってもよい。前記阻害は、血管形成プロセスの任意の段階であってもよい。例えば、前記阻害は、血管内皮成長因子(VEGF)の産生、内皮の細胞の増殖および／または遊走の直接的な抑制、血管形成成長因子のアンタゴニストとしての作用、内皮特異的なインテグリン/生存シグナル伝達（survival signaling）の阻害、または銅のキレート化から腫瘍を予防することによるものであってもよい。血管形成の阻害は、血管の形成が低下する、中止する、又は逆転（reversed）する任意の手段によるものであってもよく、これには開発中の又は販売されている任意の抗血管形成薬によって現在使用される任意の手段が含まれる。

本明細書中に使用される「不適切な血管形成（inappropriate angiogenesis）」の用語は、任意の望ましくない血管形成の出現を意味する。不適切な血管形成は、哺乳類におけるコンディションに関連する血管形成であってもよい。不適切な血管形成は、係るコンディションの原因または症状であってもよい。最大限の広い意味で、不適切な血管形成は、任意の望まれない血管形成であってもよく、正常な哺乳類の生理学の範囲内のものであってもよい。

「治療上効果的な量（therapeutically effective amount）」は、被験者が治療される特定のコンディションの発生を効果的に予防する、低下させる、停止させる、又は好転させるために或いは係るコンディションに存在している症状を部分的に又は全体的に軽減するために効果的な量である。治療上効果的な量の決定は、当業者の能力の範囲内である。

本発明のタンパク質または他の細胞の産物を修飾するために使用する場合、本明細書中に使用される「実質的に純粋（substantially pure）」の用語は、例えば、増殖培地または細胞内容物（cellular contents）から単離され、他のタンパク質および／または活性な阻害化合物から実質的に遊離されるか又は混ぜられていない（unadulterated）形態のタンパク質を意味する。「実質的に純粋」の用語は、単離された分画の少なくとも約 75%の乾燥重量または少なくとも「75%実質的に純粋」な量の因子を意味する。より具体的には、「実質的に純粋」の用語は、活性な化合物の乾燥重量の少なくとも約 85%の又は少なくとも「85%の実質的に純粋」な化合物を意味する。最も具体的には、「実質的に純粋」の用語は、活性な化合物の乾燥重量の少なくとも約 95%の又は少なくとも「95%の実質的に純粋」な化合物を意味する。また、「実質的に純粋」の用語は、例えば、合成タンパク質が試薬から単離される及び合成反応の副産物である場合、合成的に作出された本発明のタンパク質または化合物を修飾するためにも使用しえる。

本発明のペプチドまたは化合物を意味する場合、本明細書中に使用される「医薬品グレード（pharmaceutical grade）」の用語は、通常その天然の状態で見出される物質に伴う成分から実質的（substantially）に又は本質的（essentially）に単離されたペプチドまたは化合物（合成試薬および副産物が含まれる）であり、医薬品としての使用を損なわれないだろう成分から実質的に又は本質的に単離される。例えば、「医薬品グレード」のペプチドは、発癌物質から単離してもよい。幾つかの例において、「医薬品グレード」は、患者への静脈内投与に不適切な組成物を与えるだろう任意の物質から実質的に又は本質的に単離されたペプチドまたは化合物を特定するための、意図した投与する方法によって修飾されてもよい（例えば、静脈内医薬品グレード）。例えば、「静脈内医薬品グレード」のペプチドは、洗剤（例えば、SDS）、および抗細菌剤（例えば、アジド）から単離されてもよい。

「単離された（isolated）」、「精製された（purified）」、または「生物学的に純粋（biologically pure）」の用語は、通常本来の状態（native state）で見出される物質にともなう成分から実質的に又は本質的に遊離した物質を意味する。従って、本発明の単離されたペプチドは、好ましくは前記ペプチドとそれらのインサイチュー環境で通常関連する物質を含有しない。「単離された」領域は、前記領域が由来するポリペプチドの全配列（whole sequence）を含まない領域を意味する。「単離された」核酸、タンパク質、またはそれぞれのその断片は、当業者にヌクレオチドシークエンシング, 制限消化, 部位特異的突然変異誘発, および核酸断片の発現ベクターへのサブクローニング、同様に、タンパク質またはタンパク質フラグメントの実質的に純粋な品質での取得など（しかし、限定されない）によって操作されえるように、そのインビボ環境から実質的に除去される。

ペプチドに関連して本明細書中に使用される「バリアント（variant）」の用語は、野生型ポリペプチドと比較して、置換され、欠失され、または挿入されたアミノ酸を有しえるアミノ酸配列バリアントを意味する。バリアントは、野生型ペプチドの短縮型（truncations）であってもよい。従って、バリアントペプチドは、前記ポリペプチドをコード化している遺伝子を操作することによって作出されてもよい。バリアントは、基礎の組成物またはポリペプチドの特性を、変更させることで作出しえる（少なくとも幾つかのその基本的な活性ではない）。例えば、アズリンの「バリアント」は、哺乳類の癌細胞の成長を阻害する能力を保持している変異アズリンであってもよい。幾つかのケースにおいて、バリアントペプチドは、ε-(3,5-ジニトロベンゾイル)-Lys残基などの非天然のアミノ酸で合成される〔Ghadiri & Fernholz, J. Am. Chem. Soc., 112:9633-9635 (1990)〕。幾つかの態様において、前記バリアントは、野生型ペプチドと比較して20アミノ酸以下が置換され、欠失され、または挿入される。幾つかの態様において、前記バリアントは、野生型ペプチドと比較して15アミノ酸以下が置換され、欠失され、または挿入される。幾つかの態様において、前記バリアントは、野生型ペプチドと比較して10アミノ酸以下が置換され、欠失され、または挿入される。幾つかの態様において、前記バリアントは、野生型ペプチドと比較して6アミノ酸以下が置換され、欠失され、または挿入される。幾つかの態様において、前記バリアントは、野生型ペプチドと比較して5アミノ酸以下が置換され、欠失され、または挿入される。幾つかの態様において、前記バリアントは、野生型ペプチドと比較して3アミノ酸以下が置換され、欠失され、または挿入される。

本明細書で使用される「アミノ酸」の用語は、任意の天然の又は非天然の又は合成のアミノ酸残基〔即ち、直接的に１、２、３以上の炭素原子、典型的には１つの(α)炭素原子によって連結された少なくとも１つのカルボキシルおよび少なくとも１つのアミノ残基を含んでいる任意の部分〕を含むアミノ酸部分（amino acid moiety）を意味する。

ペプチドに関連して本明細書中に使用される「誘導体（derivative）」の用語は、被験者のペプチドに由来するペプチドを意味する。誘導（derivation）には、なおも前記ペプチドがある程度の基礎的な活性を維持するようなペプチドの化学的な修飾が含まれる。例えば、アズリンの「誘導体」は、例えば、哺乳類細胞の血管形成を阻害する能力を保持している化学的に修飾されたアズリンであってもよい。所望の化学的な化学的な修飾には、ペプチドのアミド化, アセチル化, 硫酸化（sulfation）, ポリエチレングリコール(PEG)修飾, リン酸化またはグリコシル化が含まれるが、これらに限定されない。加えて、誘導体ペプチドは、化学物質（chemical compound）にポリペプチド又はその断片を融合させたものであってもよく、例えば、別のペプチド, 薬分子（drug molecule）または他の療法的なもしくは薬学的な剤又は検出可能なプローブであるが、これらに限定されない。

「パーセント（％）アミノ酸配列同一性〔percent (%) amino acid sequence identity〕」の用語は、２つの配列が整列された場合に、候補配列中のアミノ酸残基と同一であるポリペプチド中のアミノ酸残基のパーセンテージとして規定される。%アミノ酸同一性を決定するために、配列が必要に応じて整列される。ギャップは、最大%配列同一性を達成するために導入される；保存された置換は、配列同一性の一部として考慮されない。パーセント同一性を決定するためのアミノ酸配列アライメント処理は、当業者に周知である。しばしば、公共で利用可能なコンピュータソフトウェア〔例えば、BLAST, BLAST2, ALIGN2またはMegalign(DNASTAR)ソフトウェア〕を使用して、ペプチド配列が整列される。特定の態様において、Blastp（National Center for Biotechnology Information, Bethesda MDから利用可能）を、初期設定パラメータ〔long complexity filter, expect 10, word size 3, existence 11 and extension 1〕で使用した。

アミノ酸配列が整列される場合に、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂと（所与のアミノ酸配列Ｂで、又は、所与のアミノ酸配列Ｂに対して）の％アミノ酸配列同一性〔これは、所与のアミノ酸配列Ｂと（所与のアミノ酸配列Ｂで、又は、所与のアミノ酸配列Ｂに対して）特定の％アミノ酸配列同一性を有する又は具備する所与のアミノ酸配列Ａとして、代替的に表現してもよい〕は、以下のように計算することができる：
%アミノ酸配列同一性=X/Y*100
式中で
Xは、配列アラインメントプログラムの又はアルゴリズムのAおよびBのアライメントによって、同一性マッチ（identical matches）であると評価されたアミノ酸残基の数であり、
Yは、B中のアミノ酸残基の総数である。

アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡとＢとの％アミノ酸同一性はＢとＡとの％アミノ酸同一性と等しくない。長配列（longer sequences）と短配列（shorter sequences）とを比較する場合、短配列は「B」配列である。例えば、短縮型ペプチド（truncated peptides）を対応する野生型ポリペプチドと比較する場合、短縮型ペプチドが「B」配列である。

一般
本発明は、キュプレドキシン、およびキュプレドキシンのバリアント、誘導体、および構造上の均等物を含んでいる組成物、並びに哺乳類における血管形成を阻害する及び／又は癌細胞の成長を阻害する方法を提供する。特に、本発明は、キュプレドキシンを含んでいる組成物、並びに癌および他のコンディションに関連する不適切な血管形成の阻害におけるその使用に関する。また、本発明は、哺乳類の血管形成（特に、腫瘍発生に関連する血管形成）を阻害する能力を保持するキュプレドキシンのバリアント、誘導体、および構造上の均等物、並びに同じものを含んでいる組成物に関する。最も具体的には、緑膿菌アズリン、およびアズリンのバリアント、誘導体、および構造上の均等物含んでいる組成物を、並びに不適切な血管形成および腫瘍発生に関連する血管形成に関連するコンディションの患者を処置するため又は感染の危険があるものの感染を予防するためのその使用を提供する。最終的に、本発明は、血管形成を誘導する及び血管発生における変動を決定する前または後に、細胞をキュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物と接触させることによって、哺乳類の細胞、組織、および動物の血管形成を研究するための方法を提供する。

以前に、Pseudomonas aerugisnosaによって同化された酸化還元タンパク質（キュプレドキシンアズリン）が、選択的にJ774細胞に進入するが、正常細胞に進入しないことが知られていた〔Zaborina et al., Microbiology 146: 2521-2530 (2000)〕。また、アズリンは、選択的にヒトメラノーマUISO-Mel-2またはヒト乳癌MCF-7細胞に進入できる〔Yamada et al., PNAS 99:14098-14103 (2002); Punj et al., Oncogene 23:2367-2378 (2004)〕。P. aeruginosaからのアズリンは、優先的にJ774マウス細網肉腫細胞に進入し、腫瘍抑制因子タンパク質p53と複合体を形成し、安定化し、p53の細胞内濃度を増加させ、アポトーシスを誘導する〔Yamada et al., Infection and Immunity 70:7054-7062 (2002)〕。アズリン分子の様々なドメインの詳細な研究によって、次の事項が示された；その事項とは、アミノ酸50-77(P28)(配列番号2)が、インターナリゼーションおよび引き続くアポトーシス活性に重大な意味を持つタンパク質伝達ドメイン(PTD)を表すことである〔Yamada et al., Cell. Microbial. 7:1418-31, (2005)〕。

驚くことに、次の事項が今回示された；その事項とは、合成されたP28が、種々の悪性の細胞株〔とりわけメラノーマ(Mel-2), MCF-7, 膵臓性（pancreatic）, 星細胞腫, グリア芽細胞腫〕のみならず、非癌性のヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)にも進入することである。例1を参照されたい。P28はこれらの細胞に温度依存的な様式で進入するが、正常細胞(線維芽細胞, 正常な乳房の上皮)に進入しない。HUVEC細胞はヒト胚の血管形成を刺激することが知られていたので、P28がHUVEC細胞に侵入（entry）することによって血管形成におけるP28の効果の検査が促される。HUVEC細胞（20,000細胞）を、Matrigel（登録商標）被覆ウェルにまいて、0-75μMのP28を含有している培地でインキュベーションした。培養物を、処理後4hおよび24hで光学顕微鏡下で検査した。P28ペプチドはHUVECの毛細管形成を用量依存的な様式で阻害し、P28が血管形成の毛細管形成工程を阻害することを示唆している。例2を参照されたい。さらに、P28は、Matrigel（登録商標）上のHUVEC細胞の遊走を、ひっかき創傷遊走アッセイ（scratch wound migration assay）において阻害した（この結果は、P28が血管形成の遊走工程をも阻害することを示している）。例3を参照されたい。従って、樹立された血管形成のモデル系でのインビトロ試験において〔Matrigel（登録商標）上のHUVEC細胞〕、P28は血管形成、毛細管形成、および細胞遊走における２つの重大な意味を持つ工程を阻害する。

更に、HUVECsの細胞形態は、驚くことに成長培地へのP28の添加により変化した。Matrigel（登録商標）において成長しているHUVECsへのP28の添加によって、細胞骨格および細胞遊走に関連する他のタンパク質における正常な血管形成に関連する変化が予防された。例4を参照されたい。パキシリン検出細胞において、パキシリンは、主に対照細胞の細胞表面に局在した。しかしながら、それは、P28処理細胞中のF-アクチン線維に比較的頻繁に認められた（図4B）。Fak検出細胞において、Fakは、主に対照細胞の細胞表面に局在した。他方で、それは、P28処理細胞のF-アクチン線維に比較的頻繁に認められ、そのため可動性が低く、移動性が低い細胞が作出される。細胞間付着タンパク質CD-31/PECAM-1は、HUVECsがP28で処理された場合に、過剰発現し、細胞間結合に別々に局在して、細胞間接触を奨励する。血管形成をしているHUVECsの細胞表面に正常に認められるアクチン核形成および分枝促進因子WASP（Wiskott Aldrich症候群タンパク質）は、P28処理細胞の核に局在し、アクチンの枝分れおよび核形成を変化させる。最終的に、P28は、核へのβ-カテニン局在化を阻害し、さらにHIVECsの増殖および細胞遊走を阻害した。従って、幾つかのHUVECsの血管形成の形態学的な特徴（hallmarks）は、P28の存在によって減少または排除され、P28が血管形成している細胞に直接的な効果を有していることを指摘している。

P28は、特異的にMel-2メラノーマ細胞の成長をインビトロで濃度依存的に阻害できる。図5を参照されたい。従って、P28は、癌細胞が特異的な様式で進入する能力を有するのみならず、それらの成長を直接的に阻害する能力をも有する。腫瘍の発生は、血管形成と関連して進行する。P28は、胸腺欠損マウス（athymic mice）の皮下に移植されたMel-2細胞の成長を用量依存的に阻害した。例6を参照されたい。8および16mg/kg wt i.p.を処理後３０日の測定可能(>2mm直径)な腫瘍の発生率は、対照と比較して、治療群で有意に低かった。さらに、腫瘍体積も、16mg/kg P28を投与された動物では対照と比較して有意に低かった。以上より、P28は、その選択的な腫瘍細胞への進入による有意な抗腫瘍効果を有し、彼等の増殖を阻害し、腫瘍発生に関連する血管形成を抑制する。

キュプレドキシン間の高度の構造的な類似性によって、他のキュプレドキシンも同様に哺乳類における血管形成を阻害するであろう。係るキュプレドキシンは、例えば、細菌または植物において見出される。これらの他のキュプレドキシンを本発明の組成物および方法に使用することが企図される。また、哺乳類細胞の血管形成を阻害する能力を保持するキュプレドキシンのバリアント、誘導体、および構造上の均等物を、本発明の組成物および方法に使用しえる。これらのバリアントおよび誘導体には、キュプレドキシンの短縮型、アミノ酸およびタンパク質修飾（例えば、PEG化）の保存された置換、αヘリックスの全炭化水素の安定化が含まれえるが、これらに限定されない。

そして、不適切な血管形成に関連する他のコンディションは、特にキュプレドキシンおよびアズリンで治療できる。例えば、アバスチン（登録商標）（bevacizumab, Genentech, South San Francisco, CA）〔ヒト血管内皮成長因子(VEGF)に結合し、生物学的な活性を阻害する組換え型のヒト化モノクローン性IgG1抗体〕は、転移性の結腸直腸癌に関連した血管形成の減少に効果的であるのみならず、新生血管性で年齢関連性の黄斑変性症（neovascular age-related macular degeneration）に関連した不適切な血管形成の治療にも非常に効果的である〔Bashshur et al., Am J Ophthalmol. 142:1-9 (2006)〕。従って、P28, および他のキュプレドキシンおよびキュプレドキシンのバリアント, 誘導体および構造上の均等物が、癌以外のコンディション（例えば、新生血管性で年齢関連性の黄斑変性症に関連するもの）における不適切な血管形成も阻害する。また、キュプレドキシンおよびキュプレドキシンのバリアント、誘導体および構造上の均等物が、不適切な血管形成に関連する他のコンディション（例えば、糖尿病性網膜症, 乾癬および関節リウマチであるが、これらに限定されない）の治療に効果的である。

［発明の組成物］
本発明は、哺乳類の細胞, 組織および動物の血管形成を阻害するキュプレドキシンのバリアント、誘導体、または構造上の均等物であるペプチドを提供する。本発明は、哺乳類の癌細胞の成長を阻害するキュプレドキシンのバリアント、誘導体、または構造上の均等物であるペプチドを提供する。本発明は、哺乳類の癌細胞に特異的に進入するキュプレドキシンのバリアント、誘導体、または構造上の均等物であるペプチドを提供する。ある態様において、前記ペプチドは単離される。ある態様において、前記ペプチドは、実質的に純粋または医薬品グレードである。他の態様において、前記ペプチドは、前記ペプチドを含む又は前記ペプチドから本質的になる（consists essentially of）組成物に存在する。別の特定の態様において、前記ペプチドは、哺乳類（より具体的には、ヒト）の免疫応答を生じさせない。幾つかの態様において、前記ペプチドは、完全長キュプレドキシン未満であり、幾つか前記キュプレドキシンの機能的な特性を保持する。具体的には、幾つかの態様において、前記ペプチドは、Matrigel（登録商標）上のHUVECsの血管形成を阻害する能力を保持する。

また、本発明は、キュプレドキシンまたはキュプレドキシンのバリアント、誘導体、または構造上の均等物である少なくとも１つのペプチドを（特に、薬学的組成物中に）含んでいる組成物を提供する。特定の態様において、前記薬学的組成物は、経口, 腹腔内, 静脈内, または眼内などの特定の投与の様式（mode）で設計されるが、これらに限定されない。係る組成物を、水で水和してもよい又は水和の後で乾燥（例えば、凍結乾燥で）してもよい。係る組成物は、アルコールなどの水以外の溶媒に存在してもよいが、これに限定されない。

キュプレドキシンの間での高い構造上の相同性のために、キュプレドキシンはP28と同じ抗血管形成活性を有することが企図される。幾つかの態様において、前記キュプレドキシンは、アズリン, シュードアズリン, プラストシアニン, ラスティシアニン（rusticyanin）, アウラシアニン（auracyanin）またはLazであるが、これらに限定されない。幾つかの態様において、前記アズリンは、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）, Alcaligenes faecalis, Achromobacter xylosoxidans ssp.denitrificans I, Bordetella bronchiseptica, Methylomonas sp., Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhea, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis, Xylella fastidiosa またはVibrio parahaemolyticusから由来するものである。特定の態様において、前記アズリンは、緑膿菌からのものである。他の特定の態様において、前記キュプレドキシンは、配列番号1, 3〜19のアミノ酸配列を含む。

本発明は、野生型キュプレドキシンと比較して、置換され、欠失され、または挿入されたアミノ酸を有するアミノ酸配列バリアントであるペプチドを提供する。本発明のバリアントは、野生型キュプレドキシンの短縮型であってもよい。幾つかの態様において、本発明のペプチドは、完全長の野生型ポリペプチド未満であるキュプレドキシンの領域を含む。幾つかの態様において、本発明のペプチドは、短縮型キュプレドキシンの約10残基以上、約15残基以上、または約20残基以上を含む。幾つかの態様において、前記ペプチドは、短縮型キュプレドキシンの約100残基以下, 約50残基以下, 約40残基以下, 約30残基以下または約20残基以下を含む。幾つかの態様において、キュプレドキシンは、前記ペプチド（より具体的には、配列番号1, 3〜19）に対し、少なくとも約 70% アミノ酸配列同一性, 少なくとも約 80% アミノ酸配列同一性, 少なくとも約 90% アミノ酸配列同一性, 少なくとも約 95% アミノ酸配列同一性または少なくとも約 99% アミノ酸配列同一性を有する。

特定の態様において、キュプレドキシンのバリアントは、緑膿菌のアズリン残基50〜77, アズリン残基50〜67, またはアズリン残基36〜88を含む。他の態様において、キュプレドキシンのバリアントは、緑膿菌のアズリン残基50〜77, アズリン残基50〜67, またはアズリン残基36〜88からなる。他の特定の態様において、前記バリアントは、そのアズリンではないキュプレドキシンの均等な残基からなる。他のキュプレドキシンバリアントがアズリン残基50〜77, アズリン残基50〜67, またはアズリン残基36〜88と類似する活性を有するように設計できることが企図される。これを行うために、BLAST, BLAST2, ALIGN2 またはMegalign (DNASTAR)を用いて、対象のキュプレドキシンのアミノ酸配列を緑膿菌のアズリン配列と整列させ、緑膿菌アズリンのアミノ酸配列に局在する関連性のある残基、および対象のキュプレドキシン配列に見出される均等な残基、および均等なペプチドがこのように設計される。

本発明の一態様において、キュプレドキシンバリアントは、Chloroflexus aurantiacusのアウラシアニンBの少なくともアミノ酸57〜89を含む(配列番号20)。本発明の別の態様において、キュプレドキシンバリアントは、Pseudomonas syringaeのアズリンの少なくともアミノ酸51〜77(配列番号21)を含む。本発明の別の態様において、キュプレドキシンバリアントは、髄膜炎菌Lazの少なくともアミノ酸89〜115(配列番号22)を含む。本発明の別の態様において、キュプレドキシンバリアントは、腸炎ビブリオ菌のアズリンの少なくともアミノ酸52〜78(配列番号23)を含む。本発明の別の態様において、キュプレドキシンバリアントは、Bordetella bronchisepticaのアズリンの少なくともアミノ酸51〜77(配列番号24)を含む。

前記バリアントには、合成のアミノ酸で作出された天然ではないペプチドも含まれる。例えば、非天然のアミノ酸をバリアントペプチドへと統合して、血流中の組成物の半減期を延長又は至適化しえる。係るバリアントには、D,L-ペプチド類(ジアステレオマー), (例えば、Futaki et al., J. Biol. Chem. 276(8):5836-40 (2001); Papo et al., Cancer Res. 64(16):5779-86 (2004); Miller et al, Biochem. Pharmacol. 36(1):169-76, (1987).;異常なアミノ酸を含んでいるペプチド(例えば、Lee et al., J. Pept. Res. 63(2):69-84 (2004)), オレフィンを含有している非天然アミノ酸を炭化水素ステープリング（hydrocarbon stapling）したもの(例えば、Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Walenski et al., Science 305:1466-1470 (2004)), およびε-(3,5-ジニトロベンゾイル)-Lys残基を含んでいるペプチドが含まれるが、これらに限定されない。

他の態様において、本発明のペプチドは、キュプレドキシンの誘導体である。キュプレドキシンの誘導体は、なおも前記ペプチドがある程度の基礎的な活性を維持するようなペプチドの化学的な修飾体である。例えば、アズリンの「誘導体」は、哺乳類の細胞、組織、または動物の血管形成を阻害する能力を保持している化学的に修飾されたアズリンであってもよい。所望の化学的な化学的な修飾には、ペプチドの炭化水素ステープリング, アミド化, アセチル化, 硫酸化（sulfation）, ポリエチレングリコール(PEG)修飾, リン酸化およびグリコシル化が含まれるが、これらに限定されない。加えて、誘導体ペプチドは、化学物質（chemical compound）にキュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物を融合させたものであってもよく、例えば、別のペプチド, 薬分子（drug molecule）または他の療法的なもしくは薬学的な剤又は検出可能なプローブであるが、これらに限定されない。所望の誘導体には、本発明のペプチドおよび組成物の血流中の半減期が当業者に周知の幾つかの方法などによって延長させる又は至適化することができる化学的な修飾体が含まれ、これには環状化ペプチド〔例えば、Monk et al., BioDrugs 19(4):261-78, (2005); DeFreest et al., J. Pept. Res. 63(5):409-19 (2004)〕, N-およびC末端の修飾〔例えば、Labrie et al., Clin. Invest. Med. 13(5):275-8, (1990)〕, およびオレフィン含有非天然アミノ酸（olefin-containing non-natural amino acid）を炭化水素ステープリングしたもの〔例えば、Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Walenski et al., Science 305:1466-1470 (2004)〕が含まれるが、これらに限定されない。

別の態様において、前記ペプチドは、キュプレドキシンの構造上の均等物である。キュプレドキシンおよび他のタンパク質の間の有意な構造上の相同性を決定する試験の例には、Toth等〔Developmental Cell 1:82-92 (2001)〕が含まれる。具体的には、キュプレドキシンおよび前記構造上の均等物の間の有意な構造上の相同性は、VASTアルゴリズム〔Gibrat et al., Curr Opin Struct Biol 6:377-385 (1996); Madej et al., Proteins 23:356-3690 (1995)〕を用いて決定される。特定の態様において、キュプレドキシンおよび前記構造上の均等物の構造比較からのVAST p値は、約10^-3未満、約10^-5未満、または約10^-7未満である。他の態様において、キュプレドキシンおよび前記構造上の均等物の間の有意な構造上の相同性は、DALIアルゴリズム〔Holm & Sander, J. Mol. Biol. 233:123-138 (1993)〕を用いて決定される。特定の態様において、ペアワイズ構造比較に関するDALI Zスコアは、少なくとも約3.5, 少なくとも約7.0, または少なくとも約10.0である。

本発明の組成物のペプチドが、２以上のキュプレドキシンのバリアント、誘導体、および／または構造上の均等物であってもよいことが企図される。例えば、前記ペプチドは、ＰＥＧ化されているアズリンの短縮型であってもよく、このようにしてバリアントおよび誘導体の双方が作出される。一態様において、本発明のペプチドは、オレフィン含有拘束鎖（olefin-bearing tethers）を含んでいるα,α-二置換型の非天然のアミノ酸で合成され、そしてルテニウム触媒性オレフィンメタセシス（ruthenium catalyzed olefin metathesis）による全炭化水素ステープリングが行われる〔Scharmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Walensky et al., Science 305:1466-1470 (2004)〕。加えて、アズリンの構造上の均等物であるペプチドは他のペプチドに融合されて、構造上の均等物および誘導体の双方であるペプチドが作出される。これらの例は、説明のために記載であり、本発明を限定するものではない。キュプレドキシンのバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、銅に結合しても結合しなくてもよい。

幾つかの態様において、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、幾つかの緑膿菌アズリン（特に、P28）の機能的な特性を有する。特定の態様において、キュプレドキシンおよびキュプレドキシンのバリアント、誘導体および構造上の均等物は、具体的にはHUVECsであるが限定されない哺乳類の細胞、組織、または動物の血管形成を阻害しえる。また、本発明は、具体的にはメラノーマ, 乳房, 膵臓, グリア芽細胞腫, 星細胞腫, または肺癌細胞であるが、これらに限定されない哺乳類の癌細胞の成長を阻害する能力を有しえるキュプレドキシンおよびキュプレドキシンのバリアント、誘導体および構造上の均等物を提供する。また、本発明は、対応する非癌細胞と比較して、哺乳類の癌細胞（具体的にはメラノーマ, 乳房, 膵臓, グリア芽細胞腫, 星細胞腫, または肺癌細胞であるが、これらに限定されない）に進入する能力を有しえるキュプレドキシンおよびキュプレドキシンのバリアント、誘導体および構造上の均等物を提供する。血管形成または癌細胞の成長の阻害は、対照の処理と比較して統計的に有意な活性の任意の減少または増加の割合の軽減（lessening）である。細胞への侵入は、任意の対応する正常細胞への侵入の割合と比較した場合に、統計的に有意である細胞への侵入の割合である。

現在、キュプレドキシンが哺乳類の細胞、組織、または動物の血管形成を阻害できることが知られているので（特に、MatrigelRでのHUVECsの成長）、この抗血管形成活性を保持しているキュプレドキシンのバリアントおよび誘導体を設計することが可能である。係るバリアント、誘導体、および構造上の均等物は、例えば、キュプレドキシンの様々なバリアント、誘導体、および構造上の均等物の「ライブラリ（library）」を作ること、および次に各々を抗血管形成活性（特にHUVECsにおける抗血管形成）を当該技術分野において既知の多くの方法（例2および3の方法に例示されているような）の１つを用いて試験することによって作出できる。生じる抗血管形成活性を有するキュプレドキシンのバリアントおよび誘導体を、キュプレドキシンの代わりに又はキュプレドキシンに加えて本発明の方法に使用できることが企図される。

幾つかの特定の態様において、前記キュプレドキシンまたはバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、無処置の対照と統計学的に異なる度合（degree）までHUVEC細胞の毛細管形成を阻害する。ペプチドを、この活性に関して、例3またはSulochana等〔Sulochana et al., J. Biol. Chem. 280:27936-27948 (2005)〕に記載の毛細管形成検査を用いることによって試験できる。毛細管形成が別のものに阻害されるかどうかを決定するための他の方法は、当該技術分野において周知であり、同様に使用しえる。

幾つかの特定の態様において、前記キュプレドキシンまたはバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、無処置の対照と統計学的に異なる度合までひっかき創傷遊走アッセイにおけるHUVEC遊走を阻害する。ペプチドを、この活性に関して、例4に記載の毛細管形成検査を用いることによって試験できる。HUVEC遊走が阻害されるかどうかを決定するための他の方法は、当該技術分野において周知であり、同様に使用しえる。

キュプレドキシン
これらの小さい青色銅タンパク質（キュプレドキシン）は、電子伝達タンパク質(10-20kDa)であり、細菌の電子伝達鎖に関与する又は未知の機能のものである。銅イオンは、タンパク質マトリックスに単独で結合する。銅の周囲の２つのヒスチジンおよび１つのシステインのリガンドに対する、特殊な歪んだ三方晶系の平面配置によって、金属部位の非常に特有な電気的特性を生じ、そして強度の青色を生じる。いくつかのキュプレドキシンは、中等度から高度の分解能で結晶学的に特徴づけられている。

通常、キュプレドキシンは、低い配列相同性ではあるが、高い構造上の相同性を有する〔Gough & Clothia, Structure 12:917-925 (2004); De Rienzo et al., Protein Science 9:1439-1454 (2000)〕。例えば、アズリンのアミノ酸配列は、アウラシアニンBの配列と31%同一であり、ラスティシアニンの配列と16.3%、プラストシアニンの配列と20.3%、シュードアズリンの配列と17.3%同一である。表1を参照されたい。しかしながら、これらのタンパク質の構造上の類似度は、明白である。アズリンとアウラシアニンBとの構造の比較に関するVASTp値は10^-7.4であり、アズリンとラスティシアニンとでは10^-5であり、アズリンとプラストシアニンとでは10^-5.6であり、アズリンとシュードアズリンとでは10^-4.1である。

全てのキュプレドキシンは、８鎖のグリークキーβバレルまたはβサンドイッチフォールドを所有し、高度に保存された部位構造を有する〔De Rienzo et al., Protein Science 9:1439-1454 (2000)〕。多くの長鎖脂肪族残基（例えば、メチオニンおよびロイシン）の存在による顕著に疎水性のパッチが、アズリン, アミシアニン（amicyanins）, ラン藻のプラストシアニン, キュウリ塩基性タンパク質、および、低い程度で、シュードアズリンおよび真核生物のプラストシアニン中の銅部位の周囲に存在する（Id）。また、疎水性のパッチは、ステラシアニンおよびラスティシアニンの銅部位に低い程度で見出される、しかし、異なる特性を有している（Id）。

¹整列長（Aligned Length）： ２つの構造間で重ね合わせたC-アルファ原子の対応対（equivalent pairs）の数（即ち、如何に多くの残基が、3Dの重ね合わせを計算に使用されているか）。

²P-VAL： VAST p値は、比較の有意性の測定値である（確率としてあらわされる）。例えば、前記p値が0.001である場合、見込み（odds）はこの程度の適合を偶然に観察することに対し1000対1の確率である。VASTからのp値は、次の仮定を用いて複数の比較の影響に関して調整される；その仮定とは、500のMMDBデータベース中のドメインの非依存性（independent）および無関係（unrelated）のタイプが存在することである。従って、示されるp値は、各ドメイン対のペアワイズ比較に関して500で除したp値に対応する。

³スコア： VAST構造類似度スコア。この数は、重ね合わせた二次構造要素の数と、その重ね合わせの質に関する。高いVASTスコアは、高い類似度と相関する。

⁴RMSD： 2乗平均平方根の重ね合わせ残基のオングストローム表示。この数は、２つの構造の至適な重ね合わせ後に均等なC-アルファ原子間の2乗平均距離（mean square distances）の平方根として計算された。RMSD値は構造アラインメントの程度で概算（scales）されること及びRMSDを全体の構造上の類似度のディスクリプタ（descriptor）として用いる場合にこのサイズを考慮しなければならないことが注意される。

⁵線虫（C.elegans）の主要精子タンパク質は、卵成熟のエフリンのアンタゴニストであることが証明された〔Kuwabara, Genes and Development 17:155-161 (2003)〕。

アズリン
アズリンは、128アミノ酸残基の銅含有タンパク質であり、特定の細菌における電子伝達に関与するキュプレドキシンファミリーに属する。アズリンには、緑膿菌（PA）(配列番号1)(「wt-アズリン」), A. xylosoxidans, およびA. denitrificans〔Murphy et al., J. Mol. Biol. 315:859-871 (2002)〕からのものが含まれる。アズリン間のアミノ酸配列同一性は60-90%の間で変動し、これらのタンパク質は強い構造上の相同性を示した。全てのアズリンは、ギリシャキーモチーフ（Greek key motif）を有する特徴的なβ-サンドイッチを有し、単一の銅原子はタンパク質の同じ領域に常に配置される。加えて、アズリンは、銅部位を取り囲む基本的に中性で疎水性のパッチを所有する（Id）。
プラストシアニン
プラストシアニンは分子あたり１分子の銅を含有するシアノバクテリア、藻類および植物の可溶性タンパク質であり、彼等の酸化型において青色である。彼等は、彼等が電子伝達体として機能する葉緑体中で生じる。ポプラのプラストシアニンの構造が1978に決定されてから、藻類(セネデスムス, アオノリ, コナミドリムシ)および植物(フランスマメ)のプラストシアニンの構造が結晶学又はNMR法によって決定されている（ポプラの構造は1.33Åの解像度で示されている）。配列番号3は、Phormidium laminosum（好熱性のシアノバクテリア）のプラストシアニンのアミノ酸配列を表す。

藻類および維管束植物の間の配列多様性（例えば、コナミドリムシおよびポプラのタンパク質間で62%の配列同一性）が存在するにもかかわらず、３次構造は保存されている（例えば、コナミドリムシおよびポプラのタンパク質間でCαポジションにおいて、0.76Å rmsの偏差）。構造上の特性には、８鎖の逆平行β-バレルの一端での歪んだ四面体の銅結合部位（distorted tetrahedral copper binding site）、明白な陰性のパッチ、および平坦な疎水性表面が含まれる。前記銅部位は、電子伝達機能に至適化されている。また、陰性の及び疎水性のパッチは、生理的な反応パートナーの認識に関与することが提案されている。化学修飾、クロス-リンキング、および部位特異的突然変異誘発実験によって、チトクロムfとの結合相互作用における陰性及び疎水性のパッチの重要性が確認され、プラストシアニンが関与する２つの機能上の意味ある電子伝達経路のモデルが確認された。１つの推定上の電子伝達経路は、相対的に短く(約4Å)、疎水性パッチ中の溶媒に暴露された銅リガンド His-87が関与する；他方で、他のものは、より長く（約12〜15Å）、陰性パッチにおいてほぼ保存されている残基Tyr-83が関与する〔Redinbo et al., J. Bioenerg. Biomembr. 26:49-66 (1994)〕。

ラスティシアニン
ラスティシアニンは、硫黄菌属（現在ではAcidithiobacillusと称される）から得られた青色銅含有単一鎖ポリペプチドである。Thiobacillus ferrooxidansの極度に安定で高度に酸化されているキュプレドキシンラスティシアニンの酸化型（配列番号4）のＸ線結晶構造は、多波長異常分散法（multiwavelength anomalous diffraction）で1.9Åの解像度で決定された。ラスティシアニンは、６および７鎖のbシートから構成されるコアベータ-サンドイッチフォールド（a core beta-sandwich fold）から構成される。他のキュプレドキシンのように、銅イオンは、特殊な歪んだ四面体に配置された４つの保存された残基（His 85, Cys138, His143, Met148）のクラスターによって配位される〔Walter, R.L. et al., J. Mol. Biol. 263:730-51 (1996)〕。

シュードアズリン
シュードアズリンは、青色銅含有単一鎖ポリペプチドのファミリーである。Achromobacter cycloclastesから得られたシュードアズリンのアミノ酸配列は、配列番号5に示される。シュードアズリンのＸ線構造分析によって、次の事項が示される；その事項とは、これらのタンパク質間の配列相同性が低いにもかかわらず、シュードアズリンはアズリンと類似する構造を有することである。２つの主な差は、シュードアズリンおよびアズリンの全体構造の間に存在する。アズリンと比較して、シュードアズリン中には２つのα-ヘリックスからなるカルボキシル末端の伸展が存在する。中間のペプチド領域（mid-peptide region）中に、アズリンは、短いα-ヘリックスを含んでいるフラップを形成する伸展したループを含有する（シュードアズリンでは短くなっている）。銅原子部位での唯一の大きな差異は、MET側鎖のコンホメーションおよびMet-S銅結合長（シュードアズリンではアズリンよりも有意に短い）である。

フィトシアニン（Phytocyanins）
フィトシアニンとして同定可能なタンパク質には、キュウリ塩基性タンパク質, ステラシアニン（stellacyanin）, マビシアニン（mavicyanin）, ウメシアニン（umecyanin）, キュウリピーリングキュプレドキシン（cucumber peeling cupredoxin）, エンドウ豆の鞘の推定上の青色銅タンパク質, およびシロイヌナズナの青色銅タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。キュウリ塩基性タンパク質およびエンドウマメ鞘タンパク質以外の全てにおいて、青色銅部位に通常見つけられる軸性メチオニンリガンド（axial methionine ligand）はグルタミンで置換される。

アウラシアニン
アウラシアニンA, アウラシアニンB-1、およびアウラシアニンB-2と称される３つの小さい青色銅タンパク質は、好熱性の緑色グライディング光合成細菌（Chloroflexus aurantiacus）から分離された。２つのB型は、糖タンパク質であり、互いにほとんど同一の特性を有しているが、A型とは別である。ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、14(A), 18(B-2), および22(B-1)kDaの見かけ上の単量体分子量が示される。

アウラシアニンAのアミノ酸配列が決定され、アウラシアニンAが139残基のポリペプチドであることが示された〔Van Dreissche et al., Protein Science 8:947-957 (1999)〕。His58, Cys123, His128, およびMet132は、それらが既知の小銅タンパク質（small copper proteins）プラストシアニンおよびアズリンとして進化上で保存された金属リガンドである場合、予想される様式で配置（spaced）される。また、二次構造予測によって、アウラシアニンが、緑膿菌からのアズリンおよびポプラ葉からのプラストシアニンのものと類似する全β-バレル構造を有することが指摘される。しかしながら、アウラシアニンは、両方の小銅タンパク質配列クラスの特性を有していると思われる。アズリンの共通配列との全体の類似度（overall similarity）は、プラストシアニンの共通配列とのものと大まかに同じである（すなわち、30.5%）。アウラシアニンのＮ末端配列領域1〜18には、グリシンおよびヒドロキシアミノ酸が著しく豊富に存在する（Id.）。Chloroflexus aurantiacusからのアウラシアニンの鎖Aに関して、例示的なアミノ酸配列 配列番号15を参照されたい（NCBIタンパク質データバンクアクセッションNo.AAM12874）。

アウラシアニンB分子は、標準的なキュプレドキシンフォールドを有する。Chloroflexus aurantiacusからのアウラシアニンBの結晶構造が、試験された〔Bond et al., J. Mol. Biol. 306:47-67 (2001)〕。付加的なＮ末端鎖を例外として、前記分子は、細菌性のキュプレドキシン（アズリン）のものと非常に類似している。他のキュプレドキシンでのように、Cuリガンドの１つは前記ポリペプチドの鎖4に存在し、他の３つは鎖7および8の間の大きいループに沿って存在する。Cu部位の配置は、後者の３つのリガンド間のアミノ酸スペーシングを参照して議論される。アウラシアニンBの結晶学的に特徴づけされたCu-結合ドメインは、おそらく幾つかの他の膜関連電子伝達タンパク質における既知の係留（tethers）と有意な配列同一性を呈するＮ末端尾部によって細胞質膜の周辺腔側へ係留される。B型のアミノ酸配列は、McManus等に記載される〔McManus et al. J. Biol. Chem. 267:6531-6540 (1992)〕。Chloroflexus aurantiacusからのアウラシアニンの鎖Bに関して、例示的なアミノ酸配列 配列番号16を参照されたい（NCBIタンパク質データバンクアクセッションNo.1QHQA）。

ステラシアニン
ステラシアニンは、フィトシアニンのサブクラスである（植物のキュプレドキシンのユビキタスファミリー）。ステラシアニンの例示的な配列は、本願に配列番号14として含まれる。ウメシアニン、西洋わさびの根(Koch et al., J. Am. Chem. Soc. 127:158-166 (2005))からのステラシアニンおよびキュウリステラシアニン(Hart el al., Protein Science 5:2175-2183 (1996))の結晶構造も、知られている。前記タンパク質は、他のフィトシアニンと全体的なフォールド類似性を有する。エフリンB2タンパク質外部ドメイン三次構造は、ステラシアニンと有意な類似性を有する〔Toth et al., Developmental Cell 1:83-92 (2001)〕。ステラシアニンの例示的なアミノ酸配列は、全米バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）のタンパク質データバンクにアクセッション番号 1JER, 配列番号14として見つけられる。

キュウリ塩基性タンパク質
キュウリ塩基性タンパク質の例示的なアミノ酸配列は、本願に配列番号17として含まれる。キュウリ塩基性タンパク質(CBP)の結晶構造（１型の青色銅タンパク質）は、1.8Åの解像度で決定された。前記分子はグリークキーβバレル構造を有している他の青色銅タンパク質と類似している、但し前記バレルは１つの側で開き、「ベータ-サンドイッチ」または「ベータ-タコ（beta-taco）」として記載されることが適切である〔Guss et al., J. Mol. Biol. 262:686-705 (1996)〕。エフリンB2タンパク質のエクトドメイン（ectodomian）の三次構造は、キュウリ塩基性タンパク質に対して高い類似度（50のα炭素に対しrms偏差1.5Å）を有する〔Toth et al., Developmental Cell 1:83-92 (2001)〕。

Cu原子は、Cu-N(His39) = 1.93 A, Cu-S(Cys79) = 2.16 A, Cu-N(His84) = 1.95 A, Cu-S(Met89) = 2.61 Aの結合長（bond lengths）を有する正常な青色銅NNSS'配位を有する。ジスルフィド連結(Cys52)-S-S-(Cys85)は、分子構造の安定化に重要な役割を担っていると思われる。前記ポリペプチドフォールドは、CBPが高度の配列同一性を有する青色銅タンパク質(phytocyanins)のサブファミリーおよび非金属タンパク質（ブタクサアレルゲンRa3）に典型的である。フィトシアニンとして同定可能なタンパク質は、CBP, ステラシアニン, マビシアニン, ウメシアニン, キュウリピーリングキュプレドキシン, エンドウ豆の鞘の推定上の青色銅タンパク質, およびシロイヌナズナの青色銅タンパク質である。CBPおよびエンドウマメ鞘タンパク質以外の全てにおいて、青色銅部位に通常見つけられる軸性メチオニンリガンドはグルタミンで置換される。キュウリ塩基性タンパク質の例示的な配列は、NCBIタンパク質データバンクアクセッション番号 2CBP, 配列番号17に見つけられる。

使用の方法
本発明は、癌を罹患している、癌から回復中の、癌から回復した又は癌を発生する危険のある哺乳類の患者を治療するための方法を提供し、該方法は前記患者に上記のキュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、又は構造上の均等物である少なくとも１つの ポリペプチドを投与することを備える。具体的には、本発明の組成物で治療しえる癌には、メラノーマ, 乳房癌, 膵臓癌, グリア芽細胞腫, 星細胞腫, または肺癌が含まれるが、これらに限定されない。さらに、本発明は、不適切な血管形成に関連する他のコンディションを罹患している、該コンディションから回復中の、該コンディションから回復した又は該コンディションを発生する危険のある患者を治療するための方法を提供し、該方法は前記患者にキュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、又はその構造上の均等物である少なくとも１つの ポリペプチドを投与することを備える。これらのコンディションには、新生血管性で年齢関連性の黄斑変性症, 糖尿病性網膜症, 乾癬および関節リウマチが含まれるが、これらに限定されない。特定の態様において、前記患者はヒトである。

さらに、本発明には血管形成を研究するための方法が含まれ、該方法は哺乳類細胞をキュプレドキシン、又はそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物を含んでいる組成物と接触させることを備える。幾つかの態様において、前記細胞はHUVECsであり、他ではそれらは血管形成をしている他の細胞である。さらに、本発明には不適切な血管形成に関連する他のコンディションを研究するための方法が含まれ、該方法は哺乳類細胞をキュプレドキシン、又はそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物を含んでいる組成物と接触させることを備える。これらの方法において、細胞は、前記コンディションに罹患している哺乳類の患者において血管形成しているものであってもよい。

キュプレドキシン、又はそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物を含んでいる組成物を、当業者に周知の多くの経路および多くの措置（regimens）によって前記患者に投与できる。特定の態様において、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、静脈内, 筋肉内, 皮下または眼内（intraoccularly）に投与される。前記組成物は、ペプチドを不適切な血管形成の部位に送達する任意の手段によって患者に投与されてもよい。

一態様において、前記方法は、患者にキュプレドキシンまたはキュプレドキシンのバリアント、誘導体、または構造上の均等物を含んでいる１単位用量の組成物および別の抗癌薬を含んでいる１単位用量の組成物を共投与することを備えてもよく、いずれかの順序で、他のものを投与後におよそ同時又はおよそ所与の時間内（例えば、他の薬の投与後の約1分間〜約60分間または他の薬の投与後の約1時間〜約12時間）に投与される。係る薬物は、本明細書中にリストされているものであり、具体的には5-フルオロウラシル;インターフェロンα;メトトレキセート;タモキシフェン;およびビンクリスチンである。上記の例は説明の目的でのみ記載され、多くの他の係る化合物は当業者に知られている。本発明の化合物は、放射線療法および手術と共に使用されてもよい。

癌を治療するために適切な他の薬物には、アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素、エチレンイミン、およびトリアゼン（triazenes）; 抗代謝剤、例えば、葉酸アンタゴニスト、プリンアナログ、およびピリミジンアナログ;抗生物質、例えば、アントラサイクリン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ダクチノマイシン、およびプリカマイシン;酵素、例えば、L−アスパラギナーゼ;ファルネシル-タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤;5.α.-レダクターゼ阻害剤;17.β.-水酸化ステロイドデヒドロゲナーゼ３型の阻害剤;ホルモン剤、例えば、糖質コルチコイド、エストロゲン/抗エストロゲン、アンドロゲン/抗アンドロゲン、プロゲスチン、および黄体形成ホルモン放出ホルモンアンタゴニスト、酢酸オクトレオチド（octreotide acetate）;微小管破壊剤、例えば、エクテイナスチジン（ecteinascidins）又はそのアナログおよび誘導体;微小管安定化剤、例えば、タキサン、例えば、パクリタキセル(タキソール ^TM)、ドセタキセル(タキソテール ^TM)、及びそのアナログ、およびエポチロン（epothilones）、例えば、エポチロンA-F及びそのアナログ;植物由来産物、例えば、ビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、タキサン;およびトポイソメラーゼ阻害剤;プレニルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤;および種々の剤、例えば、ヒドロキシ尿素、プロカルバジン、ミトタン、ヘキサメチルメラミン、プラチナ配位複合体（platinum coordination complexes）、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン;および抗癌および細胞毒性剤として使用される他の剤、例えば、生物学的応答調節剤（biological response modifiers）、成長因子;免疫調整剤（immune modulators）およびモノクローナル抗体が含まれるが、これらに限定されない。

これらのクラスの抗癌および細胞毒性剤の代表的な例には、塩酸メクロレタミン, シクロホスファミド, クロランブシル, メルファラン, イホスファミド, ブスルファン, カルムスチン, ロムスチン, セムスチン, ストレプトゾシン, チオテパ, ダカルバジン, メトトレキセート, チオグアニン, メルカプトプリン, フルダラビン（fludarabine）, ペンタスタチン（pentastatin）, クラドリビン（cladribin）, シタラビン, フルオロウラシル, 塩酸ドキソルビシン, ダウノルビシン, イダルビシン, 硫酸ブレオマイシン, マイトマイシンC, アクチノマイシンD, サフラシン（safracins）, サフラマイシン（saframycins）, キノカルシン（quinocarcins）, ディスコデルモライド（discodermolides）, ビンクリスチン, ビンブラスチン, 酒石酸ビノレルビン（vinorelbine tartrate）, エトポシド, リン酸エトポシド, テニポシド, パクリタキセル, タモキシフェン, エストラムスチン, リン酸エストラムスチンナトリウム, フルタミド, ブセレリン, ロイプロリド, プテリジン, ダイネース（diyneses）, レバミゾール, アフラコン（aflacon）, インターフェロン, インターロイキン, アルデスロイキン, フィルグラスチム, サルグラモスチム, リツキシマブ, BCG, トレチノイン, 塩酸イリノテカン, ベタメゾン（betamethosone）, 塩酸ゲムシタビン, アルトレタミン, およびトポテカ（topoteca）並びにその任意のアナログまたは誘導体が含まれるが、これらに限定されない。

これらのクラスの好適なメンバーには、パクリタキセル, シスプラチン, カルボプラチン, ドキソルビシン, カルミノマイシン, ダウノルビシン, アミノプテリン, メトトレキセート, メトプテリン, マイトマイシン C, エクテナサイジン743, またはポフィロマイシン（pofiromycin）, 5-フルオロウラシル, 6-メルカプトプリン, ゲムシタビン, シトシンアラビノシド, ポドフィロトキシンまたはポドフィロトキシン誘導体、例えば、エトポシド, リン酸エトポシドまたはテニポシド, メルファラン, ビンブラスチン, ビンクリスチン, リューロシジン（leurosidine）, ビンデシンおよびリューロシン（leurosine）が含まれるが、これらに限定されない。

本発明の組成物と共投与するために有用な抗癌及び他の細胞毒性剤には、以下のものが含まれる：次の文献に記載のエポチロン（epothilone）誘導体、独国特許第4138042.8; WO97/19086, WO98/22461, WO98/25929, WO98/38192, WO99/01124, WO99/02224, WO99/02514, WO99/03848, WO99/07692, WO99/27890, WO99/28324, WO99/43653, WO99/54330, WO99/54318, WO99/54319, WO99/65913, WO99/67252, WO99/67253およびWO00/00485; WO99/24416(米国特許第6,040,321号をも参照されたい)に記載のサイクリン依存性キナーゼインヒビター;およびWO97/30992およびWO98/54966に記載のプレニル-タンパク質トランスフェラーゼインヒビター;および米国特許第6,011,029号に包括的かつ具体的に記載されている薬剤〔任意のARモジュレーター, ERモジュレーターなどのNHRモジュレーター（本発明のものを含むが、これらに限定されない）を、LHRHモジュレーターと又は外科的な技術と共に、実施することができる化合物〕などである。

別の態様において、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、新生血管性で年齢関連性の黄斑変性症を治療するための薬と共投与されてもよい。係る薬物には、Lucentis（登録商標）(Genetech, South San Francisco CA, Ranibizumab, 硝子体注射), Macugen（登録商標） (OSI Pharmaceuticals, Melville NY, pegaptanib, 硝子体注射), Retaane（登録商標） (Alcon, Fort Worth TX, Anecortave, 後強膜近傍注射), AdPEDF (GenVec, Gaithersburg MD, 抗血管原性の遺伝子治療, 硝子体内またはsub-Tenon注射), EVIZON（登録商標） (Genaera, Plymouth Meeting, PA, 抗血管原性のアミノステロール, スクアラミン, 静脈内注射), Combretastatin AAdPEDF4プロドラッグ (OXiGENE, Waltham MA, CA4P, 脈管性ターゲティング剤c), Cand5 (Acuity Pharmaceuticals, Inc., Philadelphia PA, siRNAターゲティング血管内皮成長因子(VEGF), Sirna-027（登録商標） (Sirna Therapeutics, San Francisco, CA, siRNAターゲティング血管内皮成長因子レセプター1(VEGFR-1)), CelecoxibおよびPDT (Celebrex（登録商標）, 口の抗炎症剤), およびEnvision（登録商標） TD (Control Delivery Systems, Watertown, MA, 硝子体におけるフルオシノロン移植片徐放性ステロイド移植片)が含まれるが、これらに限定されない。

別の態様において、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、糖尿病性網膜症（diabetic retinopathy）を治療するための薬と共投与されてもよい。外科療法も、本発明の組成物との共治療（co-treatment）として企図される。

別の態様において、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、乾癬（psoriasis）を治療するための薬と共投与されてもよい。係る薬物には、Amevive（登録商標）, Raptiva（登録商標）, Enbrel（登録商標）, Humira（登録商標）, Remicade（登録商標）, シクロスポリン, Neoral（登録商標）, メトトレキセート, Soriatane（登録商標）, Accutane（登録商標）, Hydrea（登録商標）, マイコフェノレート モフェティル（mycophenolate mofetil）, スルファサラジン, および6-チオグアニンが含まれるが、これらに限定されない。

別の態様において、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、関節リウマチ（rheumatoid arthritis）を治療するための薬と共投与されてもよい。係る薬物には、メトトレキセート (Rheumatrex（登録商標）, Folex PFS（登録商標）), スルファサラジン (Azulfidine（登録商標）), Leflunomide (Arava（登録商標）), 金塩(金チオリンゴ酸塩, オーラノフィン [Ridaura（登録商標）]), D-ペニシラミン, ヒドロキシクロロキン(Plaquenil（登録商標）), アザチオプリン (Imuran（登録商標）), シクロスポリン (Neoral（登録商標）), Etanercept (Enbrel（登録商標）), Infliximab (Remicade（登録商標）), Adalimumab (Humira（登録商標）), Anakinra (Kineret（登録商標）), Abatacept (Orencia（登録商標）), プレドニゾン (Deltasone（登録商標）, Meticorten（登録商標）, Orasone（登録商標）), ベタメタゾン (Celestone（登録商標）), 非ステロイド性の抗炎症性薬(NSAIDs), および COX-2インヒビター (celecoxib, Celebrex（登録商標）)が含まれるが、これらに限定されない。

キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物を含んでいる薬学的組成物
キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物を含んでいる薬学的組成物は、従来の混合、溶解、顆粒化、ドラジェー作出（dragee-making）、乳化、封入（encapsulating）、エントラッピング（entrapping）、または凍結乾燥処理などの任意の従来の様式にしたがって製造することができる。実質的に純粋または医薬品グレードのキュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、当該技術分野において周知の薬学的に認容される担体と容易に組み合わせることができる。係る担体によって、錠剤, ピル, ドラジェー, カプセル剤, 液体, ゲル, シロップ, スラリー, 懸濁液などとして製剤化する調製が可能となる。適切な担体または賦形剤には、充填剤およびセルロース調製物なども含まれてもよい。他の賦形剤には、香味剤（flavoring agents）、発色剤、粘着防止剤（detackifiers）、増粘剤（thickeners）、および他の認容される添加物、アジュバント、または結合剤などが含まれてもよい。ある態様において、薬学的調製物（pharmaceutical preparation）は、実質的に保存剤なしである。他の態様において、前記薬学的調製物は、少なくとも１つの保存剤を含有してもよい。薬学的剤形（pharmaceutical dosage forms）の一般的な方法論は、Ansel等(Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Lippencott Williams & Wilkins, Baltimore MD (1999))に見つけられる。

本発明に使用されるキュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物を含んでいる組成物は、注射(例えば、皮内, 皮下, 筋肉内, 腹腔内など)による、吸入による、局所的投与による、坐剤による、経皮性パッチによる又は口による様式を含む様々な様式で投与しえる。薬物送達システム（drug delivery systems）の一般的な方法論は、Ansel等(Ansel et al., Id.)に見つけられる。幾つかの態様において、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、又は構造上の均等物を含んでいる組成物は、とりわけ、皮下および静脈内注射のために製剤化し、直接的に注射可能剤（injectibles）として使用できる。特に、注射可能剤は、不適切な血管形成に関連するコンディションを有すると思われる又は有する危険がある患者を治療するために効果的に使用できる。また、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、又は構造上の均等物を含んでいる組成物は、保護剤（例えば、ポリプロピレングリコールまたは類似のコーティング剤）と混合した後に経口的に摂取できる。

投与が注射によるものの場合、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、水溶液中に製剤化され、具体的には生理学的に適合する緩衝液（例えば、ハンクス液、リンゲル溶液、または生理食塩緩衝液（physiological saline buffer）中に製剤化しえる。前記溶液は、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの製剤化の薬剤を含有してもよい。或いは、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、使用前に、滅菌したパイロジェンが存在しない水などの適切なビヒクルで構成するための粉末形態であってもよい。幾つかの態様において、前記薬学的組成物は、前記ペプチドによって刺激される免疫応答を増強するために添加されるアジュバントまたは任意の他の物質を含まない。幾つかの態様において、前記薬学的組成物は、前記ペプチドに対する免疫応答を阻害する物質を含む。

投与が静脈内流体（intravenous fluids）による場合、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物の投与に使用する静脈内流体は、クリスタロイド（crystalloids）またはコロイド（colloids）から構成されてもよい。本明細書中に使用されるクリスタロイドは、ミネラル塩または他の水溶性の分子の水溶液（aqueous solutions）である。本明細書中に使用されるコロイドは、大きな不溶性の分子（例えば、ゼラチン）を含む。静脈内流体は、無菌（sterile）であってもよい。

静脈内投与に使用しえるクリスタロイド流体には、表2に記載される通常の生理食塩水(0.9%の濃度の塩化ナトリウム溶液), リンゲル乳酸またはリンゲル溶液, および5%デキストロース水溶液（時々、D5Wと称される）が含まれるが、これらに限定されない。

投与が吸入によるものである場合、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、適切な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、二酸化炭素または他の適切なガス）を使用することによって、加圧パックからのエアロゾルスプレーまたはネブライザーの形態で送達しえる。加圧されたエアロゾルの場合、投与量単位（dosage unit）は、一定量を送達するためのバルブを提供することによって決定されてもよい。吸入器（inhaler）または注入器（insufflator）に使用するためのゼラチンなどのカプセルまたはカートリッジを、タンパク質の粉末混合物および適切な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプン）を含有するよう製剤化しえる。

投与が局所的投与によるものである場合、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物を、当該技術分野において周知の溶液剤、ゲル、軟膏、クリーム、ゼリー、懸濁剤などとして製剤化してもよい。幾つかの態様において、投与は経皮パッチ（transdermal patch）の手段による。投与が坐剤(例えば、直腸または膣)である場合、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、従来の坐剤基剤を含有している組成物に製剤化してもよい。

投与が経口である場合、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、容易にキュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物を当該技術分野において周知の薬学的に認容される担体と組み合わせることによって容易に製剤化できる。固形担体（例えば、マンニトール, ラクトース, マグネシウムステアラート, など）を用いてもよい；係る担体によって、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物を、治療される対象による経口摂取のための、錠剤、丸剤、ドラジェー剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして製剤化することが可能となる。経口の固形製剤（例えば、粉剤、カプセル、および錠剤）に関して、適切な賦形剤には、充填剤（例えば、糖、セルロース調製物、顆粒化剤、および結合剤）が含まれる。

当該技術において周知の他の便利な担体には、多価担体、例えば、細菌性のカプセル性のポリサッカライド、デキストラン、または遺伝的に操作されたベクターも含まれる。加えて、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物を含む徐放性製剤によって、長時間にわたるキュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物の放出が許容される；持続性放出製剤無しでは、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、対象の系から排出される、および／または治療効果を惹起する又は増強する前にプロテアーゼおよび単純な加水分解などによって分解される。

本発明のペプチドの血流中の半減期は、当業者に周知の幾つかの方法によって延長または至適化できる。本発明のペプチドバリアントには、哺乳類の癌細胞に進入するため及び／又は哺乳類の癌細胞の成長を阻害するために血管形成を阻害するペプチドの能力を保持している間に、血流中の安定性、比活性、長命性（longevity）を増加および／またはキュプレドキシンの免疫原性を減少しえる様々なバリアントが含まれえるが、これらに限定されない。係るバリアントには、ペプチドの加水分解を減少させる、ペプチドの脱アミドを減少させる、酸化を減少させる、免疫原性を減少させる、ペプチドの構造上の安定性を増加させる、またはペプチドのサイズを増加させるものが含まれるが、これらに限定されない。係るペプチドには、環状化ペプチド(Monk et al., BioDrugs 19(4):261-78, (2005); DeFreest et al., J. Pept. Res. 63(5):409-19 (2004)を参照されたい), D,L-ペプチド(ジアステレオマー), Futaki et al., J. Biol. Chem. Feb 23;276(8):5836-40 (2001); Papo et al., Cancer Res. 64(16):5779-86 (2004); Miller et al., Biochem. Pharmacol. 36(1):169-76, (1987)); 異常アミノ酸を含んでいるペプチド(Lee et al., J. Pept. Res. 63(2):69-84 (2004)を参照されたい), NおよびC末端の修飾体(Labrie et al., Clin. Invest. Med. 13(5):275-8, (1990)を参照されたい), 炭化水素ステープリング(Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Walenski et al., Science 305:1466-1470 (2004)を参照されたい)およびPEG化も含まれる。特に注目されるものは、D-置換またはL-アミノ酸置換を介した、d-異性化（置換）およびペプチド安定性の修飾である。

様々な態様において、前記薬学的組成物は、担体および賦形剤(緩衝剤, 炭水化物, マンニトール, タンパク質, ポリペプチドまたはアミノ酸、例えば、 グリシン, 抗酸化剤, 静菌剤, キレート剤, 懸濁剤, 増粘剤および／または保存剤を含むが、これらに限定されない), 水, 油, 生理食塩水, 水性のデキストロースおよびグリセロール溶液, 生理的なコンディションに近づけるために必要とされる他の薬学的に許容される補助的な物質（例えば、緩衝作用剤、張性調整剤、湿潤剤など）を含む。当業者に既知の適切な任意の担体を本発明の組成物を投与するために使用できるが、担体のタイプは投与のモード（mode）に依存して変化するだろうことが認識されている。化合物を、周知の技術を用いてリポソーム内に被包（encapsulated）させてもよい。生分解性ミクロスフェアを、本発明の薬学的組成物のための担体として用いてもよい。適切な生分解性ミクロスフェアは、米国特許第4,897,268; 5,075,109; 5,928,647; 5,811,128; 5,820,883; 5,853,763; 5,814,344および5,942,252号などに開示される。

前記薬学的組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌してもよい又は濾過滅菌してもよい。生じる水溶液は、使用のためにパックされるか、又は無菌条件下で濾過して凍結乾燥され、凍結乾燥された調製物は投与の前に滅菌水溶液と混合されてもよい。

キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物の投与
キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物を、薬学的組成物として製剤化し、口、頬、吸入、舌下、直腸、膣、尿道、鼻、局所、経皮（percutaneous）、即ち、経皮（transdermal）または非経口〔静脈内、筋肉内、皮下および冠内（intracoronary）を含む〕または硝子体投与などの任意の適切な経路によって投与することができる。その薬学的製剤（pharmaceutical formulation）は、その意図する目的を達成するために効果的な任意の量で投与することができる。より具体的には、前記組成物は、治療上効果的な量で投与される。特定の態様において、治療上効果的な量は、一般的に約0.01〜20mg/日/kg体重である。

キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物を含んでいる化合物は、不適切な血管形成に関連するコンディションを、単独または他の活性剤（active agents）と組み合わせた治療および／または予防のために有用である。適切な投与量は、使用するキュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物、宿主、投与のモード、および治療されるコンディションの性質および重症度などに応じて変化するだろう。しかしながら、一般に、ヒトで満足な結果は、約 0.01-20 mg/kg体重の1日投与量（daily dosages）で得られることが指摘された。ヒトで指摘された1日投与量は、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物の化合物の約0.7mg〜約1400mgの範囲であり、一日用量（daily doses）、週用量（weekly doses）、月用量（monthly doses）、および／または連続的な投薬などで便利に投与される。一日用量は、1〜12回／日の別々の投与量であってもよい。或いは、用量は、隔日、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、３日毎、週毎、及び31日以上まで同様に日を増加させて投与することができる。代わりに、投薬（dosing）には、パッチ, i.v.投与などを用いる連続的なものであってもよい。

正確な製剤化、投与の経路、及び投与量は、患者のコンディションに応じて主治医によって決定される。投与量およびインターバルを個々に調整して、治療効果を維持するために十分である活性なキュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物の血漿レベルを提供することができる。一般に、所望のキュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、意図する投与経路および標準的な薬務（pharmaceutical practice）に関して選択される薬学的な担体との混合物として投与される。

一側面において、キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、ＤＮＡとして送達されて、ポリペプチドがインサイチューで産生される。一態様において、例えば、Ulmer等〔Science 259:1745-1749 (1993)〕に記載され、Cohen〔Science 259:1691-1692 (1993)〕で議論されたように、前記DNAは「裸（naked）」である。裸のDNAの取り込みは、担体（例えば、生分解性ビーズ）に前記DNAをコーティングすることによって増加され、これは次に細胞に効率的に輸送される。係る方法において、前記DNAは、当業者に既知の任意の様々な送達システムに存在させてもよく、これには核酸発現系、細菌性の及びウイルス性の発現系が含まれる。DNAを係る発現系に導入するための技術は、当業者に公知である（例えば、WO90/11092、WO93/24640、WO93/17706、および米国特許第5,736,524号を参照されたい）。

遺伝物質を生物体から生物体へとシャトルさせるために使用されるベクターは、２つの一般的なクラスに分けることができる：クローニングベクターは、適切な宿主細胞中での増幅に必須の領域（この中に外来ＤＮＡを挿入することができる）を有している複製するプラスミドまたはファージである；外来ＤＮＡは、ベクターの構成要素であるかのように複製し、増殖する。発現ベクター(例えば、プラスミド、酵母、または動物ウイルスゲノム)を使用して、外来ＤＮＡ（例えば、キュプレドキシンのＤＮＡ）を転写する及び翻訳するために、外来性の遺伝物質を宿主の細胞または組織へと導入する。発現ベクターにおいて、導入されたＤＮＡは、宿主細胞にシグナルを与えて挿入されたＤＮＡを高度に転写させるプロモーターなどの因子に動作可能に連結されている。幾つかのプロモーターは、特別に有用である（例えば、特定の因子に応答して、遺伝子転写を制御する誘導性プロモーター）。キュプレドキシン及びそのバリアントおよび誘導体を誘導性プロモーターと動作可能に連結することによって、特異的な因子に応じてキュプレドキシン及びそのバリアントおよび誘導体の発現を制御することができる。伝統的な誘導性プロモーターの例には、α-インターフェロン、熱ショック、重金属イオン、およびステロイド、例えば、糖質コルチコイド〔Kaufman, Methods Enzymol. 185:487-511 (1990)〕およびテトラサイクリンに反応性のものが含まれる。他の望ましい誘導性プロモーターには、構築物が導入されている細胞に内在性（endogenous）ではないものが含まれる。しかし、誘導剤が外因的（exogenously）に供給される場合、それらのプロモーターはそれらの細胞中で反応性である。一般的には、有用な発現ベクターは、プラスミドである。しかしながら、発現ベクターの他の形態、例えば、ウイルス性のベクター(例えば、複製欠陥性レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルス)も企図される。

ベクターの選択は、使用される生物体（organism）または細胞およびベクターの望まれる運命（fate）によって決定される。一般的には、ベクターは、シグナル配列、複製の起点、マーカー遺伝子、ポリリンカー部位、エンハンサー因子、プロモーター、および転写終結配列を具備する。

キュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物を含んでいるキット
一側面において、本発明は、1以上の次のパッケージまたは容器を含んでいる措置（regimens）またはキットを提供する：（1）少なくとも１つのキュプレドキシン、またはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物を含んでいる生物学的に活性な組成物；（2）抗ウイルス性または抗細菌性の薬, 特異的な抗癌薬, 抗黄斑変性症薬, 抗乾癬薬または抗関節リウマチ薬。

キットが供給される場合、前記組成物の異なる構成要素を別々の容器にパッケージし（適切な場合）、使用前に直ちに混合してもよい。構成要素のこのようなパッケージングによって、活性成分の機能を失うことなく、長期間の保存が別々に許容される。

キットに含まれる試薬を、異なる要素の寿命が長くなり、容器の材料によって吸収させられる又は変化させられることがない任意の種類の容器に供給することができる。例えば、封止されたガラスアンプルは、凍結乾燥されたキュプレドキシン及びそのバリアント、誘導体および構造上の均等物を、又は中性で非反応性のガス（例えば、窒素）でパッケージされている緩衝剤を含有してもよい。アンプルは、任意の適切な材料からなるものでよく、例えば、ガラス、有機物ポリマー、例えば、ポリカーボネート、ポリスチレンなど、セラミック、金属、または類似する試薬を保持するために典型的に用いられる他の材料である。適切な容器の他の例には、アンプルなどの類似する物質から製造されえる単純なボトルおよびアルミニウムまたは合金などのホイル裏打ちされた内装を備えるエンベロープが含まれる。他の容器には、検査チュウブ、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジなどが含まれる。容器は、無菌のアクセスポートを有してもよく、例えば、皮下注射針で突き刺すことが可能なストッパーを有しているボトルである。他の容器は、除去する際に構成要素が混合されることを許容する容易に除去可能な膜によって分離された２つの区画を有してもよい。除去可能な膜は、ガラス、プラスチック、ゴムなどであってもよい。

キットには、説明用物品（instructional materials）が供給されていてもよい。説明書は、紙または他の物質に印刷されてもよく及び／又はフロッピ―ディスク（登録商標）, CD-ROM, DVD-ROM, Zipディスク, ビデオテープ, 録音テープ, フラッシュメモリー装置などの電子的に読み込み可能な媒体として提供されてもよい。詳細な説明書は、キットに物理的に付属していなくてもよい；代わりに、使用者がキットの製造者またはディストリビューターによって特定されたインターネットウェブサイトに接続してもよい又は電子メールとして供給されてもよい。

キュプレドキシン及びそのバリアント、誘導体、および構造上の均等物の修飾
キュプレドキシンまたはそのバリアント、誘導体、または構造上の均等物は、化学的に修飾されて又は遺伝子的に改変されて、上記のバリアントおよび誘導体を産生してもよい。係るバリアントおよび誘導体は、標準の技術によって合成されえる。

キュプレドキシンの天然の対立形質バリアント（allelic variants）に加えて、血管形成を阻害するキュプレドキシンの能力を有意に変化させないキュプレドキシンをコード化しているアミノ酸配列の変更を生じるキュプレドキシンコード配列への変異によって変化を導入することができる。「非必須（non-essential）」なアミノ酸残基は、キュプレドキシンの野生型配列から生物活性を変更させることなく変更できる残基である。他方で、「必須（essential）」なアミノ酸残基は、係る生物活性に必要とされるものである。例えば、キュプレドキシンの間で保存されているアミノ酸残基は、特に変化を受け入れられないことが予想されるので、「必須」である。

ポリペプチドの活性をを変化させない「保存的（conservative）」な置換を施すことができるアミノ酸は、当該技術分野において周知である。有用な保存的な置換は、表3の「好適な置換」に示される。１つのクラスのアミノ酸が同じタイプの別のアミノ酸で置換される保存的な置換は、該置換が前記化合物の生物活性を実質的に変更しないかぎり、本発明の範囲内である。

（１）ポリペプチドバックボーンの構造（例えば、βシートまたはαヘリックス コンホメーション）、（２）荷電、（３）疎水性、又は（４）標的部位の側鎖のバルクに影響する「非保存的（Non-conservative）」な置換によって、細胞毒性機能を修飾することができる。残基は、表4に記載の共通の側鎖特性に基づいてグループに分けられる。非保存的な置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスへと交換することを伴う。置換を、保存された置換部位（又は、より具体的には、非保存部位に）に導入しえる。

バリアントポリペプチドは、当該技術分野において既知の方法〔例えば、オリゴヌクレオチド媒介性(部位特異的な)突然変異誘発, アラニンスキャンニング, およびPCR突然変異誘発〕を用いて作出することができる。部位特異的突然変異誘発(Carter, Biochem J. 237:1-7 (1986); Zoller and Smith, Methods Enzymol. 154:329-350 (1987)), カセット突然変異誘発（cassette mutagenesis）, 制限選択突然変異誘発(Wells et al., Gene 34:315-323 (1985))または他の既知の技術を、クローン化したＤＮＡに使用して、キュプレドキシンバリアントＤＮＡを産生することができる。

キュプレドキシンの既知の変異を使用して、本発明の方法に使用されるバリアントキュプレドキシンを創造することができる。例えば、アズリンのC112DおよびM44KM64E突然変異体は、本来（native）のアズリンと異なる細胞毒性および成長アレストの活性を有することが知られる。また、このような変更された活性は、本発明の治療方法に有用であるはずである。本発明の方法の一態様は、血管形成を阻害する能力を保持しているキュプレドキシン及びそのバリアントおよび誘導体を利用する。別の態様において、本発明の方法は、細胞の成長アレストを生じる能力を有しているキュプレドキシンバリアント（例えば、M44KM64E突然変異体）を利用する。

本発明の更に完全なる理解は、以下の特定の例を参照することによって得ることができる。例は、説明の目的でのみ記載され、本発明の範囲を限定するものではない。形態における変化および均等物での置換は、状況（circumstances）が手段（expedient）を示唆（suggest）する又は与える（render）ものとして企図される。特定の用語が本明細書中に用いられるが、係る用語は、説明の意味が企図され、限定することを目的としていない。本明細書中に記載した本発明の修飾およびバリエーションは、本発明の精神および範囲から逸脱せずになされる。従って、係る限定は、単に付属の態様によって指摘されるものとしてなされるべきである。

［例］
例1； P28のヒト臍静脈内皮細胞への侵入。

P28は、20μMのAlexafluor（登録商標）568（Molecular Probes, Eugene, OR）で標識される。指摘の細胞株を、細胞培養被覆カバースリップ（cell culture coated cover slips）で一晩37゜Cで培養した。標識ペプチドを含有している事前に温めた培地を、指摘の濃度で添加した。標識ペプチドでインキュベーション後、カバースリップを、PBSで3X洗浄し、ホルマリンで5分間固定した。カバースリップを、次に核染色のための1.5 μg ml^-1 DAPIを含有している媒体にマウントした〔VECTASHIELD（登録商標）, Vector Laboratories, Burlingame, CA〕。分析は、共焦点顕微鏡(Model LC510, Carl Zeiss, Thornwood, NY)で行った。

P28は、メラノーマ, 乳房, 膵臓, グリア芽細胞腫, 星細胞腫, および肺から由来する悪性の細胞株に効率的に進入した（図1A）。また、P28は、HUVEC細胞に効率的に進入した（図1C）。有意な侵入が、皮膚の線維芽細胞, 乳房および膵臓から由来する他の「正常な」細胞株において観察された（図1B）。従って、哺乳類の癌細胞に特異的に進入することに加えて、P28はHUVEC細胞にも特異的に進入する。

本実験によって、緑膿菌のアズリン50〜77ペプチドが、内皮細胞における毛細管形成を阻害する活性を有することが示された（血管形成において一段階）。従って、緑膿菌アズリンの50〜77ペプチドを使用して、血管形成を制御することができる、それ故、癌治療および不適切な血管形成に関する他のコンディションの治療として利用される。

例2； P28のMatrigel（登録商標）上でのHUVEC毛細管形成の効果。

Matrigel（登録商標）マトリックス(Becton Dickinson Biosciences, San Jose CA)は、EHSマウス肉腫（ECMタンパク質が豊富な腫瘍）から抽出された可溶化基底膜調製物（solubulized basement membrane preparation）である。その主要な成分は、ラミニンであり、続いてコラーゲン IV, へパラン硫酸プロテオグリカン, およびエンタクチン1（entactin 1）である。室温で、Matrigel（登録商標）マトリックスは、重合して、哺乳類細胞の基底膜に類似する生物学的に活性なマトリックス材料を産生する。Matrigel（登録商標）マトリックスで培養した場合に、細胞はインビボで彼らが振る舞うとおりに振る舞う。それによって、細胞の形態学, 生化学的な機能, 遊走または浸潤, および遺伝子発現の試験のための生理的に関連性のある環境が提供される。Matrigel（登録商標）マトリックスは、インビトロでの内皮細胞の浸潤および管形成アッセイ（tube formation assays）の基質（substrate）として働く。

HUVEC細胞の毛細管形成におけるP28の効果を、Matrigel（登録商標）を用いて調査した。HUVEC細胞を、20ng/mlのVEGFを有し、Matrigel（登録商標）で被覆した8ウェルチャンバースライドにペプチドの存在または非存在下に配置（15,000 細胞/ウェル）した。0μM(対照), 0.10μM, 0.30μM, 0.92μM, 2.77μM, 8.33μM, 25μM および 75μMの濃度のP28を使用した。細胞をカルセインAMでの4hおよび24hの後処理の後に染色し、毛細管形成を蛍光顕微鏡を用いて検査した（図2A）。結果は、0.10μM程度によってHUVEC細胞による毛細管形成が約50%まで予防されたことを示す（図2A）。従って、P28は、HUVEC細胞の管形成を阻害し、血管形成に関連する毛細管形成も阻害する。

例3； P28のHUVECの運動性における効果。

P28のHUVECの運動性における効果を、ひっかき創傷遊走アッセイで調査した。HUVEC細胞を、60mmの組織培養皿に配置し、90%集密にさせた。培地を除去した後に、細胞層を、1 mlの無菌のプラスチックピペットチップを用いて創傷をつけた。プレートを、培養培地でリンスした。20ng/mlのVEGF単独を有する培地または20ng/mlのVEGFおよびP28ペプチドを含有している培地を、次に前記プレートに添加した。１つの皿を、上記のとおりひっかき、正確な創傷領域をマークするためにすぐに固定した（図3A）。24h後、培養物を固定し、ファロイジンおよびヘキスト染色を用いてF-アクチンおよび核を染色した。ひっかいた領域を、蛍光顕微鏡を用いて検査し、写真をとった。ひっかいた領域へと遊走した細胞の数を、対照（図3B）およびペプチド処理皿（図3C）において計数した。

P28で処理した細胞でのひっかき創傷へと遊走したHUVECsの数は、対照におけるひっかき創傷へと遊走したものの数の約半分であった（図D）。従って、P28の存在によって、血管形成しているHUVECsの運動性が阻害される。

例4； P28のHUVECの構造タンパク質における効果。

P28のHUVECの構造タンパク質における効果を、P28がこれらの細胞に影響する様式の理解を得るために試験した。Matrigel（登録商標）被覆カバースリップに配置されたHUVEC細胞を、25μMのP28ペプチドの存在または非存在下で20ng/mlのVEGFと4hまたは24hインキュベーションした。インキュベーション後、細胞を、PBSでリンスし、緩衝ホルマリン（buffered formalin）で固定し、0.2%トリトンを含有するPBSで透過処理（permeablized）した。細胞を表示の抗体と90minインキュベートし（必要であれば、特異的な二次抗体とインキュベーションした）、マウンティングメディアを含有しているDAPIにマウントした。分析は、共焦点顕微鏡(model LC510, Carl Zeiss)で行った。検査したタンパク質は次のとおりである：CD-31(細胞間の接着に必要な細胞間ジャンクションに存在するタンパク質), Fak(接着斑キナーゼ), パキシリン, ビンキュリン(重要な接着会合タンパク質), WASP(Fアクチン線維の核形成および伸長に必要とされる、Wiskottアルドリッチ症候群タンパク質), β-カテニン(細胞の生存、細胞表面タンパク質の制御に必要とされる)。

対照と比較してCD31/PECAM1検出細胞中で、明白なCD31/PECAM局在化が、P28処理細胞における細胞間ジャンクションで見出された（図4A）。パキシリン検出細胞において、パキシリンは、主に対照細胞の細胞表面に局在した。しかしながら、それは、P28処理細胞でF-アクチン線維に頻繁に認められた（図4B）。Fak検出細胞において、Fakは、主に対照細胞の細胞表面に局在した。他方で、それは、P28処理細胞でF-アクチン線維に比較的頻繁に認められた（図4C）。4hでWASP検出細胞において、WASP局在化は対照細胞でほとんどは核であり、他方でWASPはP28処理細胞で核および細胞表面に局在した（図4D）。24hでWASPは、対照細胞で細胞表面にほとんど局在し、他方でP28処理細胞で核にほとんど局在した（図4D）。ビンキュリン検出細胞において、ビンキュリンは、主に対照細胞で細胞表面に局在した。他方で、ビンキュリンは、P28処理細胞でF-アクチン線維に比較的頻繁に局在した（図4E）。4hでβカテニン検出細胞において、βカテニン局在は、対照細胞の主に細胞質と若干は細胞表面であった。他方で、βカテニンは、P28処理細胞で主に細胞膜に局在し、若干は核周囲空間（perinuclear space）に局在した。24hで、βカテニン局在は、対照細胞で主に細胞膜および核であった。他方で、βカテニンは、P28処理細胞で細胞膜および核周囲領域（perinuclear area）に局在した。従って、P28が存在することによって、血管形成しているHUVECsにおいて通常見出される構造変化が予防される。

例5； ヒトメラノーマ細胞のP28によるインビトロ成長阻害。

ヒトメラノーマMel-2細胞の成長をインビトロで阻害するP28の能力を決定した。Mel-2細胞を、24ウェルの培養プレートに10,000〜12,000細胞/ウェルで配置し、プレートに一晩付着させた。細胞を、次に37゜Cで培地単独(MEM-Eに10%FBSを有する)またはP28ペプチドを含有している培地でインキュベーションした。P28を、5 μM, 50μM, および100 μMで添加した。各ウェル中の細胞数を、0h, 24h, 48h および 72hで計数した。各ウェル中の細胞数を、Coulterカウンターを用いて表示した時間に計数した。

P28がMel-2細胞の成長を濃度依存的な様式で阻害することを結果は示している。P28はMel-2細胞成長を100 μMおよび24hで約 50%まで阻害した（図5）。これらの結果は、P28が癌細胞（具体的には、ヒトメラノーマ2細胞）の成長を阻害することを示している。

例6； P28ペプチドのインビボ抗腫瘍活性。

100万のmel-2細胞を、3〜4週齡の胸腺欠損マウス（n=13／群）の背部側腹（dorsal flank）へと皮下で注射した。動物は、PBSのみ又はP28ペプチド（PBS中）を8mgまたは16mg／kg体重(b.w.)を受けた。動物を、触診可能な腫瘍（palpable tumors）の発生に関して毎日検査した。一旦、腫瘍が発生したら、腫瘍サイズをキャリパーを用いて測定し、腫瘍体積を決定した。

P28は、マウスにおける腫瘍の発生および成長を阻害した。16mg/kgのb.w.の治療で、約 50%の動物が、mel-2細胞を注射後40日間腫瘍無しであった。他方で、約 95%の対照動物は、mel-2細胞を注射後22日間腫瘍を有していた（図6A）。また、P28は、腫瘍の成長を、16 mg/kg b.w.のP28で治療後20日間で約 30%まで阻害した（図6B）。これらの結果は、P28が腫瘍の成長を遅くし、腫瘍の発生を予防し、存在している腫瘍のインビボでの成長を遅くすることができ、ヒトにおいて癌の予防および治療のための効果的な治療が行われることを指摘している。

図1は、Alexafluor（登録商標）568で標識したP28でインキュベーションし、DAPIで染色した悪性および正常細胞の共焦点顕微鏡観察のイメージを示す。表示の細胞株を、20μMのAlexafluor（登録商標）568標識化P28の非存在(負の対照)または存在(P28)する条件で2h、37゜Cインキュベーションした。イメージは、観察された細胞侵入の量を示している。図1Aは、ヒトのメラノーマ, 膵臓癌, 乳房癌(BCA-1), 乳房癌(MCF-7), グリア芽細胞腫, 星細胞腫, 肺および前立腺の癌細胞のAlexafluor（登録商標）568の蛍光および対照の蛍光を表している。図1Bは、ヒトの正常な線維芽細胞、膵臓、および乳房細胞のAlexafluor（登録商標）568の蛍光および対照の蛍光を表している。図1Cは、ヒトの臍静脈内皮細胞(HUVEC)のAlexafluor（登録商標）568の蛍光および対照の蛍光を表している。 図2は、P28の存在または非存在の条件で、Matrigel（登録商標）上に配置したHUVEC細胞による毛細管形成を表している。培養培地は、20ng/mlのVEGFを含有していた。図2Aは、0.10μM, 0.30μM, 0.92μM, 2.77μM, 8.33μM, 25μMおよび75μMのP28で4h、37゜Cでインキュベーションし、カルセインAMで染色し、蛍光顕微鏡で視覚化したHUVEC細胞のイメージを示す。図2B中で、グラフは、ペプチド処理および対照（無処置）の細胞において形成された管の平均数を示す。 図3は、ひっかき創傷HUVEC遊走アッセイの結果を示す。図3A〜Cにおいて、Fアクチンおよび核を染色した固定した細胞を示す。図3Aにおいて、90%集密のHUVEC細胞が、1mlのプラスチックピペットチップでひっかかれた。図3Bにおいて、HUVEC細胞がひっかかれ、20ng/mlのVEGFを含有している培養培地中でP28の非存在下で24h、37゜Cでインキュベーションした。図3Cにおいて、HUVEC細胞がひっかかれ、25μMのP28の存在下で24h、37゜Cでインキュベーションした。図3A〜Cの挿入図は、スコアをつけた領域から離れた領域の細胞密度を示す。図3Dにおいて、棒グラフは、対照およびP28処理したウェルのひっかいた領域の20の異なるフィールド(20X)の細胞の平均数（average #）を示す（図3BおよびC）。データは、平均値±SEMを表す。*は、差異が統計的に有意であることを示す。 図4は、P28処理の有り無しでの細胞の構造タンパク質の局在のイメージを示す。HUVEC細胞を、Matrigel（登録商標）被覆カバースリップに配置し、20ng/mlのVEGFを含有している培養培地中でP28ペプチド（25μM）の存在または非存在の条件で、4および24hインキュベーションし、固定し、CD31/PECAM-1, パキシリン, Fak (接着斑キナーゼ), ビンキュリン, WASP(Wiskottアルドリッチ症候群タンパク質)およびβカテニンで染色した。各図は、特定の構造タンパク質の検出に関する、つまり： 図4Aは、CD31/PECAM-1であり； 図4Bは、パキシリンであり； 図4Cは、Fakであり； 図4Dは、WASPであり； 図4Eは、ビンキュリンであり；および図4Fは、βカテニンである。各図は、使用した蛍光マーカーの局在化のイメージを示す４つの枠（panes）に分けられる。各枠は、検出した蛍光マーカーを示すために数字をつけた、つまり：1 = F-アクチン; 2 = DAPI; 3 = 対象のFITC-タンパク質; 4 = 重ね合わせたイメージである。矢印は、対象のタンパク質の局在を示す。 図4は、P28処理の有り無しでの細胞の構造タンパク質の局在のイメージを示す。HUVEC細胞を、Matrigel（登録商標）被覆カバースリップに配置し、20ng/mlのVEGFを含有している培養培地中でP28ペプチド（25μM）の存在または非存在の条件で、4および24hインキュベーションし、固定し、CD31/PECAM-1, パキシリン, Fak (接着斑キナーゼ), ビンキュリン, WASP(Wiskottアルドリッチ症候群タンパク質)およびβカテニンで染色した。各図は、特定の構造タンパク質の検出に関する、つまり： 図4Aは、CD31/PECAM-1であり； 図4Bは、パキシリンであり； 図4Cは、Fakであり； 図4Dは、WASPであり； 図4Eは、ビンキュリンであり；および図4Fは、βカテニンである。各図は、使用した蛍光マーカーの局在化のイメージを示す４つの枠（panes）に分けられる。各枠は、検出した蛍光マーカーを示すために数字をつけた、つまり：1 = F-アクチン; 2 = DAPI; 3 = 対象のFITC-タンパク質; 4 = 重ね合わせたイメージである。矢印は、対象のタンパク質の局在を示す。 図4は、P28処理の有り無しでの細胞の構造タンパク質の局在のイメージを示す。HUVEC細胞を、Matrigel（登録商標）被覆カバースリップに配置し、20ng/mlのVEGFを含有している培養培地中でP28ペプチド（25μM）の存在または非存在の条件で、4および24hインキュベーションし、固定し、CD31/PECAM-1, パキシリン, Fak (接着斑キナーゼ), ビンキュリン, WASP(Wiskottアルドリッチ症候群タンパク質)およびβカテニンで染色した。各図は、特定の構造タンパク質の検出に関する、つまり： 図4Aは、CD31/PECAM-1であり； 図4Bは、パキシリンであり； 図4Cは、Fakであり； 図4Dは、WASPであり； 図4Eは、ビンキュリンであり；および図4Fは、βカテニンである。各図は、使用した蛍光マーカーの局在化のイメージを示す４つの枠（panes）に分けられる。各枠は、検出した蛍光マーカーを示すために数字をつけた、つまり：1 = F-アクチン; 2 = DAPI; 3 = 対象のFITC-タンパク質; 4 = 重ね合わせたイメージである。矢印は、対象のタンパク質の局在を示す。 図5は、P28の濃度を増加させて24、48、および72時間処理したMel-2細胞を示す。処理および対照のウェル中の細胞数を、Coulterカウンターを用いて計数した。データは、タイムポイントにおいて対照と比較した場合の細胞成長阻害のパーセンテージを表す。 図6は、Mel-2細胞を皮下で左横腹へ注射（約100万細胞/動物）した場合の結果を表す。動物は、P28を表示の用量で注射時に受け取った。図6Aは、治療開始後の腫瘍出現の発生率を示す。グラフは、Mel-2細胞での治療後に腫瘍がない動物の%を示している。図6Bは、治療開始後の腫瘍サイズを示す。グラフは、Mel-2細胞での治療後に腫瘍の平均体積（cm³）を示している。

Claims (34)

1. キュプレドキシンのバリアント、誘導体、または構造上の均等物である単離されたペプチドであって、哺乳類細胞において血管形成を阻害できる単離されたペプチド。
2. 請求項1に記載の単離されたペプチドであって、前記キュプレドキシンが、アズリン, シュードアズリン, プラストシアニン, ラスティシアニン, Lazおよびアウラシアニンからなる群から選択される単離されたペプチド。
3. 請求項2に記載の単離されたペプチドであって、前記キュプレドキシンがアズリンである単離されたペプチド。
4. 前記キュプレドキシンは緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）, Alcaligenes faecalis, Achromobacter xylosoxidan, Bordetella bronchiseptica, Methylomonas sp., Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhea, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis, Xylella fastidiosaおよびVibrio parahaemolyticusからなる群から選択される生物体に由来する、請求項1に記載の単離されたペプチド。
5. 請求項4に記載の単離されたペプチドであって、緑膿菌に由来する単離されたペプチド。
6. 請求項1に記載の単離されたペプチドであって、配列番号1、3〜19からなる群から選択されるペプチドの部分である単離されたペプチド。
7. 配列番号1、3〜19からなる群から選択される配列が少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する、請求項1に記載の単離されたペプチド。
8. キュプレドキシンの短縮型である、請求項1に記載の単離されたペプチド。
9. 請求項8に記載の単離されたペプチドであって、前記ペプチドは、約 10 残基以上で約 100 残基以下である単離されたペプチド。
10. 緑膿菌のアズリン残基50〜77, 緑膿菌のアズリン残基50〜67, 緑膿菌のアズリン残基36〜88, および配列番号20〜24からなる群から選択される配列を含む、請求項8に記載の単離されたペプチド。
11. 緑膿菌のアズリン残基50〜77, 緑膿菌のアズリン残基50〜67, 緑膿菌のアズリン残基36〜88, および配列番号20〜24からなる群から選択される配列からなる、請求項10に記載の単離されたペプチド。
12. キュプレドキシンの均等物の残基を残基50〜77, 残基50〜67および残基36〜88からなる群から選択される緑膿菌アズリンの領域として含む、請求項1に記載の単離されたペプチド。
13. 少なくとも１つのキュプレドキシンまたは請求項1に記載のペプチドを薬学的に許容される担体中に含んでいる薬学的組成物。
14. 少なくとも２つのキュプレドキシンまたはペプチドを含む、請求項13に記載の薬学的組成物。
15. 前記薬学的組成物が静脈内投与のために製剤化される、請求項13に記載の薬学的組成物。
16. 前記キュプレドキシンは緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）, Alcaligenes faecalis, Achromobacter xylosoxidan, Bordetella bronchiseptica, Methylomonas sp., Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhea, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis, Xylella fastidiosaおよびVibrio parahaemolyticusからなる群から選択される生物体に由来する、請求項13に記載の薬学的組成物。
17. 前記キュプレドキシンが緑膿菌に由来する、請求項15に記載の薬学的組成物。
18. 請求項13に記載の薬学的組成物であって、前記キュプレドキシンが配列番号1、3〜19からなる群から選択される薬学的組成物。
19. 不適切な血管形成に関するコンディションに罹患している哺乳類の患者を治療するための方法であって、前記患者に治療上効果的な量の請求項13に記載の薬学的組成物を投与することを備える方法。
20. 前記患者がヒトである、請求項19に記載の方法。
21. 前記患者が癌に罹患している、請求項19に記載の方法。
22. 前記癌がメラノーマ, 乳房癌, 膵臓癌, グリア芽細胞腫, 星細胞腫および肺癌から選択される、請求項21に記載の方法。
23. 前記患者は黄斑変性症, 糖尿病性網膜症, 乾癬および関節リウマチからなる群から選択されるコンディションに罹患している、請求項19に記載の方法。
24. 請求項19に記載の方法であって、前記薬学的組成物が静脈内注射, 筋肉内注射, 皮下注射, 吸入, 局所的投与, 経皮性のパッチ, 坐剤, 硝子体注射および経口投与からなる群から選択される様式で投与される方法。
25. 投与の様式が静脈内注射である、請求項24に記載の方法。
26. 請求項21に記載の方法であって、前記薬学的組成物は少なくとも１つの他の抗癌薬と共投与される方法。
27. 請求項24に記載の方法であって、前記薬学的組成物は別の抗癌薬とおよそ同時に投与される方法。
28. 請求項19に記載の方法であって、前記薬学的組成物は、抗黄斑変性症薬, 抗糖尿病性網膜症薬, 抗乾癬薬および抗関節リウマチ薬からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤と共投与される方法。
29. 請求項13に記載の薬学的組成物をバイアル中に含んでいるキット。
30. 前記キットが静脈内投与のために設計される、請求項29に記載のキット。
31. 血管形成または不適切な血管形成に関するコンディションを研究するための方法であって、血管形成する能力がある哺乳類細胞をキュプレドキシンまたは請求項1に記載のペプチドと接触させることと；血管形成の程度を測定することとを備える方法。
32. 前記細胞がヒト細胞である、請求項31に記載の方法。
33. 前記細胞がHUVECsである、請求項30に記載の方法。
34. 請求項1に記載のペプチドをコード化する発現ベクター。

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